KR102223933B1

KR102223933B1 - 인삼열매의 복합공정 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 및 인지능력 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102223933B1
Application number: KR1020200036307A
Authority: KR
Inventors: 박명애; 박진영; 주성수; 장수길
Original assignee: 주식회사 한국지네틱팜
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2021-03-05

Abstract

본 발명은 증포 및 발효공정을 통해 진세노사이드 등의 유효성분 함량이 증대되고 장내 흡수력도 향상되어 기억력 및 인지능력 개선 효과가 우수한 인삼열매의 복합공정 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 및 인지능력 개선용 조성물을 제공한다.

Description

인삼열매의 복합공정 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 및 인지능력 개선용 조성물{A composition for improving memory and cognitive function comprising complex processed ginseng berry extract as an active ingredient}

본 발명은 기억력 및 인지능력 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 인삼열매의 복합공정 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 및 인지능력 개선용 조성물에 관한 것이다.

인삼(ginseng)은 잘 알려진 약용소재로 특히 사포닌(진세노사이드, ginsenoside) 성분은 인체의 중추신경계, 면역계, 대사계 등에 작용하여 신체기능 조절에 다양한 효과가 있음이 입증되었다. 그러나 인삼 사포닌의 약리효과에도 불구하고 화학 구조적으로 비당부분(4환상 또는 5환상)에 당류가 결합된 배당체를 형성하고 있어 장내 흡수를 매우 어렵게 하는 요인이 되기도 한다. 따라서 체내로 흡수될 때 사람의 장내 세균총에 의해 분해된 후 흡수가 되나 인삼 사포닌을 분해하는 장내 미생물들은 사람의 체질 및 식습관에 따라 그 존재의 유무와 보유하고 있는 수준에 따라 달라 인삼 사포닌의 효과에 차이가 있어 이러한 인삼 사포닌의 장내 흡수율 차이를 배제하기 위해 생체친화균에 의한 발효 과정을 통해 비당화가 요구된다.

한편, 최근 연구를 통해 인삼뿌리보다 인삼열매에 더 많은 양의 진세노사이드가 존재하는 것이 보고된 바 있으며, 특정 진세노사이드(Re 등)는 수십 배 가량 함유되어 있는 것으로 보고되었다. 본초강목습유(本草綱目拾遺)에 따르면 인삼열매(약재명: 인삼자)는 콩팥과 같은 것으로 날 것은 푸르고, 익으면 붉은 색이 되며, 작은 노랑 콩모양과 같고, 천연두가 부풀어 돋아나지 않게 하려면 즙을 내어 약중에 인삼열매를 첨가하면 후일 양탑(가려움)의 환이 없다고 명시되어 있다. 또한 중국 국가중의약관리국의 자료에 따르면 인삼열매는 원기를 북돋우고, 신체를 강하게 하며, 노화를 지연하는 효과가 있고, 일반적으로 신체허약과 기력부족, 어지러움과 불면증, 흉부압박과 숨가쁨 등에 주요한 것으로 알려져 있다. 그러나 인삼열매의 수확기가 짧고 특정 생장기(4년 삼 이상)에만 성숙한 열매를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 농가에서는 파종을 위한 열매 채종이 아니면 뿌리부로의 영양분 집중을 위해 열매를 제거하고 있어 천연물소재로서 활용도가 낮은 상황이다. 이와 관련하여 일본 공개특허 제2017-0019399호는 인삼 열매 추출물을 함유하는 퇴행성 신경장애 치료용 조성물에 대해 개시하고 있다.

그러나 상기 선행기술의 경우, 인삼 열매 추출물에 발효공정이 포함되지 않아 장내 흡수력이 떨어지는 단점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 미성숙 인삼열매를 증포 후 인삼열매 추출물 제조 시 발효공정을 통해 진세노사이드 등의 유효성분 함량이 증대되고 장내 흡수력도 향상된 인삼열매의 복합공정 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 및 인지능력 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 증포 인삼열매 추출물 및 상기 증포 인삼열매 추출물을 유산균으로 발효시킨 발효 증포 인삼열매 추출물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 기억력 및 인지능력 개선용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 증포 인삼열매 추출물 및 상기 증포 인삼열매 추출물을 유산균으로 발효시킨 발효 증포 인삼열매 추출물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 증포 인삼열매 추출물 및 상기 증포 인삼열매 추출물을 유산균으로 발효시킨 발효 증포 인삼열매 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지능력 개선용 건강기능식품이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 미성숙 인삼열매를 3 내지 5회 증포하여 제1증포 인삼열매를 제조하는 단계; 미성숙 인삼열매를 6 내지 8회 증포하여 제2증포 인삼열매를 제조하는 단계; 상기 제1증포 인삼열매 및 상기 제2증포 인삼열매를 동량으로 혼합한 후 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 상기 저급알코올의 수용액으로 추출하여 증포 인삼열매 추출물을 제조하는 단계; 상기 증포 인삼열매 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계; 상기 발효시킨 추출물을 여과 후 감압농축 및 동결건조함으로써 발효 증포 인삼열매 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 증포 인삼열매 추출물 및 상기 발효 증포 인삼열매 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는, 증포 인삼열매 추출물 및 상기 증포 인삼열매 추출물을 유산균으로 발효시킨 발효 증포 인삼열매 추출물의 혼합물의 제조방법이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 증포 인삼열매의 복합공정 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 및 인지능력 개선용 조성물은 증포 및 발효공정을 통해 진세노사이드 등의 유효성분 함량이 증대되고 장내 흡수력도 향상되어 기억력 및 인지능력 개선 효과가 우수하므로 학습 및 인지장애 예방 및 개선을 위한 건강기능식품 소재로 활용가능하다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 최종 공정을 통해 확보된 증포 인삼열매 유래 원료에 대한 진세노사이드 6종의 HPLC 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 증포 인삼열매 유래 시험물질인 FSGC(인삼열매발효분말)의 확보를 위한 실험실 규모(Lab. scale)의 최종 공정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 3은 대량생산 규모(plant scale)를 적용한 최종 공정을 통해 확보된 증포 인삼열매 추출물의 발효 전/후 진세노사이드 6종의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것으로 a)는 발효 전 그래프이고 b)는 발효 후 그래프이다.
도 4는 증포 인삼열매 유래 시험물질인 FSGC(인삼열매발효분말)의 확보를 위해 대량생산 규모(plant scale)를 적용한 최종 공정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 5는 최종 원료 내 함유 지표성분인 진세노사이드 6종의 HPLC 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 FSGC 처리에 의한 아세틸콜린분해효소(AChE) 활성 억제 효과를 분석한 그래프이다(●, vehicle; ○, FSGC 0.01 μg/mL; ▼, FSGC 0.1 μg/mL; △, FSGC 1 μg/mL; ■, FSGC 10 μg/mL).
도 7은 본 발명의 FSGC를 농도별 처리에 따른 세포 활성 저해 수준을 분석한 그래프이다.
도 8은 F3.ChAT 인간 신경줄기세포주에 Aβ1-42(7 μM) 및 본 발명의 FSGC(0.1-500 μg/mL)를 처리 후 세포 독성을 분석한 그래프이다(*P<0.05).
도 9는 F3.ChAT 인간 신경줄기세포주에 Aβ1-42(15 μM) 및 본 발명의 FSGC(0.1-50 μg/mL)를 처리 후 세포 독성을 분석한 그래프이다(*P<0.05).
도 10은 유전자 발현 조절 효과를 분석한 것으로 A)는 본 발명의 FSGC를 농도별 처리에 따른 ChAT mRNA 발현량을 분석한 그래프이고 B)는 FSGC에 함유된 주요 진세노사이드(Re, Rd 및 Rg3) 처리 시 ChAT mRNA 발현량을 분석한 그래프이다. 결과는 3개의 개별 실험으로부터의 평균±표준편차로 표현된다. * p <0.05; ** p <0.01 대 대조군.
도 11은 치매 유발 마우스를 이용하여 FSGC 처리에 따른 수동회피 시험 결과를 분석한 그래프이다(●, normal; ○, Aβ_1-42alone;▼, FSGC 100 mg/kg; △, FSGC 300 mg/kg; ■, FSGC 500 mg/kg; □, epigallocatechin gallate (EGCG) 100 mg/kg(*, P<0.05. #,P<0.05).
도 12는 치매 유발 마우스를 이용하여 FSGC 처리에 따른 수중미로 시험 결과를 분석한 그래프이다(●, normal; ○, Aβ_1-42 alone;▼, FSGC 100 mg/kg; △, FSGC 300 mg/kg; ■, FSGC 500 mg/kg; □, epigallocatechin gallate (EGCG) 100 mg/kg.(*, P<0.05. #,P<0.05).
도 13은 치매 유발 마우스에 본 발명의 FSGC를 농도별로 처리 후 뇌 조직 내 아세틸콜린 함량을 분석한 그래프이다(*, P < 0.05; #, P < 0.05).
도 14는 치매 유발 마우스에 본 발명의 FSGC를 농도별로 처리 후 Aβ 제거 효과를 관찰한 면역형광염색 사진이다(Scale bar=100 μm).
도 15는 치매 유발 마우스에 본 발명의 FSGC를 농도별로 처리 후 신경교섬유질산성단백질의 발현이 발현된 성상세포를 관찰한 면역형광염색 사진이다(Scale bar=100 μm).
도 16은 치매 유발 마우스에 본 발명의 FSGC를 농도별로 처리 후 신경교섬유질산성단백질의 발현이 발현된 성상세포 수를 분석한 그래프이다(*, P<0.05. #,P<0.05).

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 "인삼열매(ginseng berry)"는 진생베리라고도 하며, 4년생 이상의 인삼에서 열리는 열매이다. 인삼열매는 인삼이 3년 이상 자라야 비로소 인삼열매가 맺히며, 보통 4년 근부터 열매 채취가 가능하다. 인삼열매에는 인삼 내 전체 진세노사이드 중 20%가량이 함유되어 있는 반면 뿌리는 약 6%만 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며, 특히, Re의 경우 약 30~40배의 함량 차이를 보이고 있고, 비타민, 미네랑, 폴리페놀 역시 인삼열매에 상대적으로 다량 함유되어 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "사포닌(saponins)"은 스테로이드, 스테로이드알카로이드 혹은 트리텔펜(triterpene)의 배당체로, 물에 녹아 비누식의 발포작용을 나타내는 물질의 총칭이다. 여러 식물에 존재하며, 일부의 극피동물(불가사리, 해삼)의 몸 안에도 포함되어 있다. 사포닌은 인체의 면역력을 높이는 성분으로 알려져 있으며, 특히 인삼에 함유된 사포닌 종류인 진세노사이드(ginsenoside)와 엘루테로사이드(eleutheroside)가 유명하고 녹차에도 다양한 종류의 사포닌이 있음이 알려져 있다.

발명의 상세한 설명:

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)일 수 있고 상기 인삼열매는 미성숙 인삼열매일 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 증포 인삼열매 추출물은 미성숙 인삼열매를 3 내지 5회 증포하여 제1증포 인삼열매를 제조하는 단계; 미성숙 인삼열매를 6 내지 8회 증포하여 제2증포 인삼열매를 제조하는 단계; 상기 제1증포 인삼열매 및 상기 제2증포 인삼열매를 동량으로 혼합한 후 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 상기 저급알코올의 수용액으로 추출하는 단계; 및 추출된 추출물을 여과 후 감압농축 및 동결건조하는 단계를 통해 제조될 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 발효 증포 인삼열매 추출물은 상기 증포 인삼열매 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계; 및 발효된 증포 인삼열매 추출물을 건조하는 단계를 통해 제조될 수 있다. 이때 상기 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)일 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 발효 증포 인삼열매 추출물은 상기 증포 인삼열매 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계; 및 발효된 증포 인삼열매 추출물을 건조하는 단계를 통해 제조될 수 있다. 이때 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)일 수 있다.

상기 건강기능식품에 있어서, 탕제, 드링크제, 산제, 환제, 캡슐, 정제 또는 젤리의 제형으로 제공될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "추출물"은 원료로부터 임의의 방법으로 추출된 물질을 의미하며, 이렇게 추출된 추출액, 이로부터 얻을 수 있는 농축액, 상기 농축액의 건조물 및 분말을 제한 없이 모두 포함하는 의미로 사용된다.

상기 추출물을 원료로부터 추출하여 수득할 때, 추출 방법으로는 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법 등 종래 알려진 통상적인 추출 방법을 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법이나 환류 추출법을 이용함으로써 제조할 수 있다. 상기 추출 과정은 수회 반복할 수 있으며, 이후에 농축 또는 동결건조 등의 단계를 추가적으로 거칠 수 있다. 구체적으로, 수득한 추출물을 감압 농축하여 농축액을 얻고, 상기 농축액을 동결건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 고농도의 추출 분말을 제조할 수 있다.

인삼열매 추출물 제조 시 사용되는 용매로서 물 및 에탄올 중 적어도 하나가 사용될 수 있다. 상기 에탄올은 에탄올 또는 에탄올 수용액일 수 있고, 상기 에탄올 수용액은 40%(v/v) 이상 ~ 100%(v/v) 미만의 에탄올 수용액일 수 있으며, 바람직하게는 45%(v/v) 내지 90%(v/v)의 에탄올 수용액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50%(v/v) 내지 80%(v/v)의 에탄올 수용액일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 60%(v/v) 내지 80%(v/v)의 에탄올 수용액일 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 에탄올 수용액의 농도가 하한값 미만일 경우에는 추출 후 분획하더라도 분획물의 기억력 개선 효과가 감소할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 인삼열매 추출물의 분획물 외에 본 발명이 목적으로 하는 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 상기 인삼열매 추출물의 분획물의 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 또는 담체를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여 경로는 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함되고, 예컨대 도포에 의한 국부투여(topical application) 방식으로 적용될 수 있고 상기 비경구는 피하, 피내, 정맥 내, 근육 내, 병소 내 주사 또는 주입기술을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 본 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 학습장애, 인지장애, 기억력 손상의 개선을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것에 사용가능하다.

상기 약학적 조성물은 상기 인삼열매 추출물의 분획물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질 캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제형화할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 투여시간, 투여 경로, 배출률, 약물 배합 및 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 또한 상기 약학적 조성물은 성인 기준으로 0.001 내지 2500㎎/㎏ 범위 내의 투여량으로 투여될 수 있고, 상기 약학적 조성물이 외용제인 경우에는 성인기준으로 1.0 내지 3.0㎖의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속하는 것이 좋으나, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

상기 약학적 조성물을 단위 용량 형태로 제형화하는 경우, 유효성분으로서 본 발명의 인삼 열매 추출물의 분획물은 약(0.01 내지 1,500)㎎의 단위 용량으로 함유되는 것이 바람직하고, 성인 치료에 필요한 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약(1 내지 500)㎎ 범위가 보통이나 이에 한정되는 것은 아니며, 일부 환자의 경우 더 높은 1일 투여량이 바람직할 수 있다.

인삼 열매(ginseng berry)는 인삼을 재배한 지 4년 이후부터 성숙하며, 인삼 뿌리보다 높은 영양소를 함유하고 있는 항산화 식품으로 알려져 있고 미국, 일본, 한국 등 의학계의 임상실험 및 연구 결과를 통해 인삼 뿌리보다 뛰어난 효능을 지닌 것이 밝혀졌다. 이와 같이 인삼열매가 재조명되고 있음에도 불구하고, 농가에서는 파종을 위한 열매 채종이 아니면 뿌리부로의 영양분 집중을 위해 열매를 제거하고 있어 천연물소재로서 활용도가 낮은 상황이었다. 이에 본 발명자들은 현재까지 주로 폐기의 대상이었던 인삼열매를 증포 후 에탄올로 추출한 추출물과 상기 에탄올 추출물을 발효균주로 발효시킨 발효물을 동량으로 혼합하여 유효성분 함량 및 장내 흡수력도 향상되어 기억력 및 인지능력 개선 효과가 우수한 인삼열매의 복합공정 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 및 인지능력 개선용 조성물을 개발하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

일반적 방법

재료 및 시료 준비

본 발명의 시료인 인삼 열매는 경기도 연천군 인삼재배지에서 4년 이상의 인삼으로부터 수확하여 세척, 건조 및 증포(4증 4포, 7증 7포)를 시작 물질로 사용하였으며, 인삼 열매 원료의 표준화를 위해 6월 초 과육 내 씨앗이 아물기 전 초록색을 띤 단단한 열매만을 채취하였다. 시험 원료 확보를 위해 4증포 인삼 열매와 7증포 인삼 열매를 동량으로 혼합한 뒤 10배수 용량의 50% 발효 주정(Daehan Ethanol Life, Seoul, Korea)에 침지하여 상온에서 2회 추출하였다. 상기 추출물은 여과지(Hyundai micro No.20, Hyundai micro, Seoul, Korea)로 여과한 후 감압 농축과 동결 건조를 수행하여 비 발효 건조 시료(수율 32.9%)를 얻었다. 상기 과정과 동일하게 추출 및 감압 농축한 비 발효 추출물을 증류수를 이용하여 4 brix로 희석하고 Lactobacillus plantarum을 접종(1×10⁷ CFU/mL)한 후 30 배양기에서 48시간 발효를 수행하여 발효 건조 시료(수율 31.6%)를 얻었으며, 비 발효 건조 시료와 발효 건조 시료를 중량비 1:1로 혼합하여 1:1 mixture FSGC(Fermented and Steam-dried Ginsengberry Compound))를 확보하였다.

본 발명의 비교 물질로 다양한 연구에서 인지능 및 기억력 개선에 효과가 입증된 성분이고(Cascella et al., infect. Agent Cancer. 19: 12:36, 2017) 식품의 약품안전처에서 기억력 개선 원료로 인증한 epigallocatechine gallate(EGCG)를 사용하였다.

HPLC

본 발명의 HPLC 분석은 선행연구에서 표준화한 방법에 따라 수행하였다(Jang et al., Korean J. Food Sci. Technol. 49: 676-684. 2017). 구체적으로, 진세노사이드 분석을 위해 HPLC(UltiMate 3000 HPLC system, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 사용하였고 물(A)과 아세토나이트릴(B)(HPLC grade, Thermo Fisher Scientific)을 이동상으로 하였으며 유속은 1.6 mL/min으로 203 nm에서 검출하였다. 또한 분석에서 사용한 컬럼(column)은 YMCTriart C18 column (250×4.6 mm, S-5 μm, 12 nm, YMC, Tokyo, Japan)으로 온도를 30℃로 설정하여 측정하였으며, 시료 10 μL를 주입하였다. 이동상의 조건은 국가기술표준원(인삼 및 인삼제품-진세노사이드 함량 측정-고성능액체크로마토그래피법, 표준번호 KS H 2153)에 명시된 조건으로, 80% A로 시작하여 0-10분(80% A, 20% B), 10-40분(80-68% A, 20-32% B), 40-55 분(68-50% A, 32-50% B), 55-70분 (50-35% A, 50-65% B), 70-72 min (35-10% A, 65-90% B), 72-82 min (10% A, 90% B), 82-84 min(10-80% A, 90-20% B), 84-90 min (80% A, 20% B)을 사용하였다. 이어서 진세노사이드 표준물질 14종은 Biopurify(Chengdu, China)에서 구입하여 사용하였고, 2,000 μg/mL부터 연속 희석하여 측정 곡선을 작성하였으며 이를 통하여 정성·정량분석을 수행하였다.

세포 생존율 분석

시료 농도에 따른 세포 활성을 측정하고자, N2a cell을 96-well plate에 6.0 × 10⁵ cells/well로 파종(seeding) 후 하룻밤 동안(overnight) 배양하여 안정화 시킨 뒤, 무혈청 배지 100 ㎕로 배지 교체와 함께 농도별 시료와 양성대조군(positive control)인 H₂O₂를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 반응 종료 후 세포 생존율 측정을 위해 각 테스트 웰(test well)에 멸균처리된 1/10 부피의 ez-cytox (EZ-CYTOX, Daeilbio, Korea) 용액을 가한 후 2시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시켜고 450 nm 파장에서 ELISA 판독기(SpectraMax plus384, Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

세포 독성 시험

세포 독성 시험을 위해 96-웰 플레이트에 인간 신경줄기세포(F3.ChAT)를 웰(well) 당 5 x 10⁴cells로 분주하여 배양하였다. 배양 배지는 10% 우태아혈청(FBS, #S1520, Biowest, Nuaille, France) 및 1% antibiotic-antimycotic x100 (페니실린 10,000 U/mL, 스트렙토마이신 10 mg/mL, 및 암포테리신(amphotericin) B 25 μg/mL; #15240062, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 포함하는 DMEM (#L0103-500, Biowest)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 그 후 시험물질의 세포 독성 평가를 위해 배양 24시간 후 FBS가 함유되지 않은 배지로 교체하였고, 양성대조군으로 Aβ_1-42를 7 μM로 세포에 처리하였으며, 실험군은 FSGC (0.1, 1, 10, 50, 100 또는 500 μg/mL)를 단독으로 24시간 동안 처리하였다. 그 후 Cell counting kit-8 (CCK-8; #KU652, Dojindo, Rockville, USA) 용액을 웰 당 10 μL씩 추가하고 4시간 동안 배양한 뒤, ELISA 판독기로 570 nm/450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 용매 대조군 값을 100%로 설정하여 세포 생존율(cell viability)을 비교 분석하였다.

세포 보호 효과 평가

치매 유발용 Aβ의 응집(aggregation)을 유도하기 위해 단량체(monomer) 상태의 Aβ_1-42 (#ab120301, Abcam, Cambrige, UK)는 PBS에 1 mg/mL의 농도로 녹인 후 37℃에서 7일간 aging을 유도하였다. 양성 대조군은 Aβ_1-42를 15 μM로 세포에 단독처리하였고, 실험군인 FSGC는 각각 0.1, 1, 5, 10, 50 μg/mL의 농도로 추가 처리하였으며 처리 24시간 후에 CCK-8을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.

qPCR(quantitative real time polymerase chain reaction)

유전자 발현 분석을 위해 Trizol Reagent (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 세포 및 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 즉, Trizol 용액 1 mL를 첨가하여 세포를 용해시키고 실온에서 5분 동안 방치 후 클로로포름 200 μL를 첨가하여 13500 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 투명한 상층액(500 μL)을 취하여 새로운 튜브로 옮기고 동량의 이소프로필 알코올을 첨가한 후 13500 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 RNA를 침강 시켰다. RNA 침전물을 diethyl pyrocarbonate (DEPC, Sigma-Aldrich) 처리한 증류수로 희석한 70% 에탄올 0.75 mL로 세척한 후 공기 중에서 건조해 역전사 샘플(reverse transcription sample)로 사용하였다. 1차 가닥(first strand) cDNA 합성은 추출된 총 RNA 1 μg을 사용하여 수행되었고, Improm-Ⅱ reverse transcription system(Promega)과 oligo dT primer를 사용하여 역전사 반응을 수행하였다. qPCR 분석은 Rotor-Gene 6000 (Qiagen, Venlo, Netherlands)을 사용하였으며, 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 ChAT 유전자의 발현을 정량적으로 측정하였고 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)에 정상화(normalization) 시킨 상대 수치를 비교 분석하였다. 상기 PCR 분석에 사용한 프라이머에 관한 정보를 하기 표 1에 요약하였다.

프라이머 핵산서열 정보

프라이머	핵산서열(5' --> 3')	크기	접근번호	서열번호
hChAT F	GTGGCTCAGAACAGCAGCAT	274 bp	NM_020984	1
hChAT R	CAATCATGTCCAGCGAGTCC	274 bp	NM_020984	2
hGAPDH F	GGAGCCAAAAGGGTCATCAT	203 bp	AK_026525	3
hGAPDH R	GTGATGGCATGGACTGTGGT	203 bp	AK_026525	4

실험 동물

실험동물은 대한바이오링크로부터 6주령 수컷 ICR 마우스를 공급받아 약 1주간 순화과정을 거친 후 사용하였다. 동물실험실의 환경은 온도 23±2℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 12회/시간, 조명주기 12시간, 조도 150-300 Lux로 조절되었다. 또한 실험동물용 pellet형 고형사료인 Harlan 2018S rodent diet를 공급하였고, 음수는 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 발명에서 수행한 모든 실험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 동 기관의 표준작업지침서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행되었다.

치매유발 동물모델

치매유발 동물모델 구축을 위해 7주령의 마우스(n=8/group)에 본 발명의 지표물질인 FSGC(100, 300 또는 500 mg/kg)을 3주간 매일 경구로 투여하였고, 비교물질은 EGCG(epigallocatechin gallate, 100 mg/kg)를 투여하였다. 지표물질 마지막 투여 후에 마우스를 에테르(ether)로 흡입 마취시킨 다음 stereotaxic frame (Stoelting, Wood daled, IL, USA)에 고정하였고, Aβ_1-42(5 μL, 5 mg/mL)/head로 뇌실 내(AP: -2.0, ML: 2.9, DV: -3.0 mm) 투여하여 치매를 유발하였다.

수동회피 시험(passive avoidance test)

수동회피 시험(model ENV-010MD; Med Associates, Albans, VT, USA)은 어두운 방과 밝은 방으로 나누어진 수동회피상자의 밝은 방에 동물을 위치시키고 동물이 어두운 방으로 이동하면 1 mA로 2초간 전기충격을 가한다. 이 후 같은 시험에서 어두운 방의 전기충격으로 인한 기억을 확인하기 위해 밝은 방에서 동물이 체류하는 시간을 측정하여 기억력을 평가한다. 학습 및 기억능력 평가를 위해 Aβ_1-42 투여 48시간 후, 20분 간격으로 6회 실시하였고 Suttle box에서 어두운 방의 전기자극을 기억해 일정시간(180초) 이상 밝은 방에 오래 머무는 시간을 측정하여 학습 및 기억력을 평가하였다.

수중미로 시험(water maze test)

수중미로 시험은 공간지각능력 개선 효과를 평가하는 대표적인 실험으로 실험동물이 수조 주변의 표지물을 기억하여 수조 내 일정한 장소에 위치한 플랫폼을 찾아갈 때까지 소요되는 시간을 측정하는데 실험동물이 180초 동안 플랫폼을 찾지 못할 경우 플랫폼에 30초 간 머물게 하여 기억을 유도한다. 본 발명에서는 공간지각능력 평가를 위해 마우스 치매 유발 48시간 후,수중미로를 이용해 매일 반복적인 수영으로 hidden platform에 안착할 때까지의 시간이 단축되는 현상으로 인지기능 향상을 평가하였다.

뇌조직 내 ACh 농도 측정

치매유발 동물모델을 대상으로 시험을 진행한 후 뇌 조직 내 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine, ACh)의 농도를 측정하기 위해 부검을 수행하였다. 마지막 행동검사 24시간 후 부검하여 저온 식염수(cold saline)로 뇌를 충분히 관류하여 뇌 조직을 적출하였고 -80℃ 액체질소에 동결·보관하여 변성을 최소화하였다. 상기 적출한 뇌조직의 중량을 측정한 후, 10배 부피의 저온 PBS를 첨가하였고 균질기(homogenizer)를 이용하여 균질액을 제조 후 Amplex Red 아세틸콜린/아세틸콜린가수분해효소 분석 키트(Invitrogen , Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.

면역형광염색(immunofluorescence, IF)

뇌 내 Aβ 분포를 확인하기 위해 제작된 동결조직 슬라이드에서 기억을 담당하는 해마 CA1 영역(hippocampal CA1 region) 및 뇌 전반부에 대하여 Aβ의 축적을 확인하고자 면역형광염색을 수행하였고 Aβ 축적 및 플라크(plaque) 확인이 명확하지 않은 경우에는 동결 보관했던 뇌 조직을 사용하였다. 또한, Aβ를 정량적으로 분석하기 위해 뇌조직의 중량을 측정한 후 10배 부피의 저온 PBS를 첨가하였고 균질액은 Aβ1-42 ELISA kit (IBL, Fujioka, Japan)를 이용하여 ELISA 판독기로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 1: 최종 공정 확립 및 성분 분석

본 발명자들은 선행연구를 통해 인삼열매를 활용한 인지 및 기억력 개선 건강기능식품 원료의 지표(기능)물질로써 해당 기능성에 대해 유의한 효과를 보이는 것으로 확인된 Re와 Rd를 비롯하여 생물전환 후 물질인 Rg3와 Rg5를 선정하였다.

최종 공정 구축 결과 발효 전 높은 함량의 Re, Rd를 비롯한 다량의 진세노사이드가 확보되었으며, 생체친화성 균주에 의한 발효 후 Rg3와 Rg5가 증가함에 따라 활성물질의 체내 흡수 증대가 기대되었다. 또한, Rg3의 경우 치매의 원인물질로 알려진 아밀로이드베타를 효과적으로 제거하는 것으로 알려져 있어 Re, Rd와 함께 시너지 효과를 얻을 수 있을 것으로 사료되었다(Jang et al., Eur. J. Pharmacol. 758: 1-10. 2015). 한편, 생물전환 후 Re, Rd의 함량이 감소하고, Rg3, Rg5의 함량이 증가함에 따라 지표물질이자 기능물질인 Re, Rd의 함량을 보존하기 위해 발효 전/후 산물을 동량으로 혼합하여 최종 원료를 제조하였다. 최종 공정을 통해 확보된 발효 전/후 혼합 원료 내 함유 지표성분인 Re, Rd, Rg3 및 Rg5를 분석한 결과 Re 58.06 mg/g, Rd 30.66 mg/g, Rg3 13.96 mg/g, Rg5 7.91 mg/g을 함유하고 있는 것으로 확인되었다(도 1). 상기 최종 공정을 통해 확보된 원료에 대한 진세노사이드 분석 결과를 하기 표 2에 요약하였다.

진세노사이드 분석 결과

진세노사이드	Rg1	Re	Rb1	Rd	Rg3	Rg5
함량 (mg/g)	5.05	58.06	26.56	30.66	13.96	7.91

또한, 발효 전·후의 단계적 추출 공정 스크리닝을 통해 확보된 결과를 바탕으로 확보된 최종 공정은 인삼열매 원물 대비 10배수의 50% 주정을 첨가하여 상온에서 2시간 동안 2회 추출 후 확보된 추출물과 해당 추출물을 발효한 발효물을 동량(1:1)으로 혼합하여 제조하였고 원료명은 인삼열매발효분말(FSGC: Fermented and Steam-dried Ginsengberry Compound)로 명명하였다(도 2).

실시예 2: 대량생산 규모(plant scale) 적용

본 발명자들은 상기 실시예 1의 최종 공정 확보 후 산업화를 위한 대규모 생산 시설에 적용함으로써 재현성을 확인하는 동시에 조정이 필요한 조건을 확인하였다. 구체적으로 확보된 공정 적용 결과 추출 단계에서는 실험실 규모(lab. scale)와 유사한 패턴의 결과가 도출되었으나 발효 공정 도입 시 100:1의 적용 비율은 충분한 균 활성을 보이지 않는 것으로 확인되어 균주 접종 비율을 50:1로 조정 후 진세노사이드의 함량을 분석하였다(도 4).

그 결과, 실험실 및 대량생산 규모의 진세노사이드 함량 변화는 모두 발효 전에는 Rg1, Re, Rd의 함량이 높았으나 발효 후에는 Rg3와 Rg5의 함량이 증가하는 경향을 나타내었다. 또한 발효 후 Rg3, Rg5의 증가량은 실험실 규모는 각각 27.22 mg/g, 14.47 mg/g이었으며, 대량생산 규모의 경우 각각 26.85 mg/g, 15.31 mg/g으로 나타났다(도 3 및 표 3).

상기 공정 규모별 발효 전/후의 진세노사이드 함량 비교 결과를 하기 표 3에 요약하였다.

발효 전/후 진세노사이드 함량 분석 결과

구분	공정 적용 규모	진세노사이드 6종 함량 (㎎/g)
구분	공정 적용 규모	Rg1	Re	Rb1	Rd	Rg3	Rg5
발효 전	Lab. scale	10.26	113.66	11.45	47.42	1.40	0.36
발효 전	Plant scale	8.43	87.67	18.11	55.45	-	2.92
발효 후	Lab. scale	1.33	1.02	45.24	19.66	27.22	14.47
발효 후	Plant scale	-	-	16.47	13.51	26.85	15.31

또한, 최종 원료 내 함유 지표물질인 Re, Rd, Rg3, Rg5를 분석한 결과 Re 43.69 mg/g, Rd 37.57 mg/g, Rg3 12.33 mg/g, Rg5 6.61 mg/g을 함유하고 있는 것으로 나타났다(도 5 및 표 4). 이를 실험실 규모 공정과 비교했을 때 절대량의 차이는 있으나 유사한 패턴을 보이는 것으로 확인되었다. 상기 최종 원료에 대한 진세노사이드 분석 결과를 하기 표 4에 요약하였다.

최종 원료의 진세노사이드 함량 분석 결과

진세노사이드	Rg1	Re	Rb1	Rd	Rg3	Rg5
함량 (mg/g)	3.22	43.69	24.05	37.57	12.33	6.61

실시예 3: 지표성분 선정 및 분석

진세노사이드의 경우 인삼 및 유사 식물로 부터 해당 성분을 분리·분석하기 위한 많은 방법과 분석조건이 알려져 있으며, 인삼열매 내 Re, Rd, Rg3, Rg5는 인삼열매 유래 추출물을 확보하는 과정에서 추출물의 표준성을 입증할 수 있는 특이성, 대표성, 안정성 및 용이성을 가지는 물질들로 사료되어 본 발명자들은 상기 4개 진세노사이드를 인삼열매를 활용한 인지 및 기억력 개선을 위한 건강기능식품 원료의 지표성분으로 선정하였다. 외부 기관 분석은 대량생산 규모에서 확보한 3lot를 3반복으로 공인기관(한국기능식품연구원)에서 수행하였으며, 밸리데이션은 특이성, 정확도, 직선성에 대한 적정성을 조사하였다.

그 결과, 검량된 지표성분의 함량은 평균 Re 42.00 mg/g, Rd 29.76 mg/g, Rg3 12.89 mg/g, Rg5 16.90 mg/g으로 분석되었으며, 이에 대한 지표성분의 규격은 Re 33.60~50.40 mg/g, Rd 23.81~35.71 mg/g, Rg3 10.31~15.47 mg/g, Rg5 13.52~20.28 mg/g으로 설정하였다. 상기 공인기관 시험성적서에 근거한 FSGC 내 지표성분 함량을 하기 표 5 에 요약하였다.

FSGC 내 지표물질 함량 분석 결과

구분	진세노사이드(mg/g)
구분	Re	Rd	Rg3	Rg5
1Lot 평균	37.89	32.88	12.96	16.94
2Lot 평균	44.08	28.19	12.95	16.96
3Lot 평균	44.04	28.22	12.77	16.81
평균	42.00	29.76	12.89	16.90

실시예 4: AChE 억제효과

본 발명자들은 신경전달물질인 아세틸콜린분해효소(acetylcholinesterase, AChE)를 이용하여 In vitro에서 시험물질인 FSGC를 농도별(0.01, 0.1, 1 및 10 μg/mL)로 처리한 후 시간별 뇌조직 AChE 억제효과를 평가하였다.

그 결과, AChE 활성도는 FSGC 1 μg/mL 에서 유의하게 억제되는 것을 확인하였으나 FSGC 10 μg/mL에서는 억제율이 다소 약하게 나타났다(도 6). 이는 시료색과 반응색이 비슷하여 흡광도가 낮게 나타난 것으로 10 μg/mL 이상의 농도에서는 시료색의 영향으로 흡광도 값이 측정되지 않았다. 따라서 FSGC 1 μg/mL 이상의 농도에서 유의한 억제효과를 보임에 따라 FSGC가 AChE 억제를 통해 인지기능을 증진시킬 것으로 사료된다.

실시예 5: 세포 생존율 분석

세포 활성은 살아있는 세포의 미토콘드리아 전자전달계에 존재하는 탈수소 효소(dehydrogenase)가 전자수용체인 Tetrazolium salts을 분해하여 발색물질인 Formazan Dye를 생성하는 원리를 이용한 세포 계수 키트-8(CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan)를 사용하는 실험이다. 본 발명자들은 세포주(cell line)에 대해 PHA의 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)의 독성을 조사하기 위해 세포 생존율 분석을 수행하였다.

그 결과, H₂O₂를 처리한 양상대조군의 경우 세포 생존율이 현저히 저하된 반면 FSGC 처리한 실험군의 IC₅₀은 349.58 μg/mL로 확인되어 세포활성에 미치는 영향은 미미한 것으로 나타났다(도 7).

실시예 6: 세포 독성 시험

본 발명자들은 ChAT 유전자를 과발현시킨 인간 신경줄기세포주인 F3.ChAT 세포를 이용하여 본 발명의 지표물질인 FSGC의 세포 독성을 조사하였다.

그 결과, 신경세포에 독성을 가진 Aβ를 처리한 대조군의 세포생존율이 유의하게 감소된 반면, FSGC를 처리한 실험군은 0.1 μg/mL부터 고농도인 500 μg/mL까지도 신경세포에 대해 독성을 나타내지 않았다(도 8).

실시예 7: 세포 보호효과 평가

본 발명자들은 F3.ChAT 인간 신경줄기세포를 이용하여 FSGC 처리에 따른 신경줄기세포 보호효과를 조사하였다.

그 결과, Aβ를 처리한 양성 대조군의 생존율은 44%로 감소한데 비해 FSGC를 처리한 실험군은 0.1 μg/mL 이상의 농도에서 높은 생존율을 나타내었고 10 μg/mL 이상에서는 100%의 생존률을 보여 FSGC가 Aβ에 의한 세포사멸에 대해 신경세포를 보호하는 효과가 탁월함을 확인하였다(도 9).

실시예 8: 유전자 발현 조절 효과 분석

ChAT 발현 증가는 직접적인 ACh 양 조절을 통해 인지능 개선에 직간접적인 영향을 줄 수 있을 것으로 예상되며, AD 치료 요법의 한 부류로 포함될 수 있다(Gil-Bea et al., Neurosci. Lett. 375: 37-41. 2005). 이에 본 발명자들은 ChAT 유전자를 과발현하는 신경줄기세포(F3.ChAT)에 FSGC를 농도별(0.1, 1, 10 및 100 μg/mL )로 처리 후 유전자 발현 조절 효과를 분석하였다.

그 결과, 대조군과 비교하여 FSGC 처리 시 ChAT 유전자가 농도의존적으로 증가하는 것으로 나타났고 FSGC의 주요 활성 물질인 Rd 및 Rg3 단독 투여 시 ChAT 유전자 발현이 유의한 수준으로 증가하는 것으로 나타났다(도 10). 따라서 상기 결과는 FSGC가 인지 및 기억력 개선 효과의 주요 활성 물질임을 시사하는 것이다.

실시예 9: 학습 및 기억력 평가

본 발명자들은 본 발명의 FSGC 투여에 따른 인지기능 개선 효과 평가하기 위하여 치매유발 마우스 모델을 이용한 수동회피 시험을 수행하였다.

그 결과, Aβ_1-42로 인지기능 저하를 유발한 치매 유발군에서는 6회차까지 기억력이 회복되지 않은 반면 FSGC 100 및 500 mg/kg 투여군에서는 4회차부터 유의적인 회복을 나타내었고, 5회차 부터 비교물질 EGCG 100 mg/kg군과 모든 FSGC 투여 군(100, 300 또는 500 mg/kg)에서 정상군과 유사한 수준으로 인지기능이 회복되는 것을 확인하였다(도 11).

실시예 10: 공간지각능력 평가

본 발명자들은 본 발명의 FSGC 투여에 따른 공간지각 능력 개선 효과를 평가하기 위하여 치매유발 마우스 모델을 이용한 수중미로 시험을 수행하였다.

그 결과, Aβ_1-42 투여한 치매유발군에서는 6일째까지 공간지각 능력이 회복되지 않은 반면, FSGC를 3주간 경구투여했던 모든 실험군(100, 300 및 500 mg/kg)에서는 3일차부터 유의적인 개선 효과를 나타냈으며, 6일차에는 정상군과 비슷한 수준으로 공간지각 능력이 회복되는 것을 확인하였다(도 12).

실시예 11: ACh 농도 측정

본 발명자들은 치매유발 동물모델을 대상으로 본 발명의 FSGC 투여에 따른 뇌 조직 내 신경전달물질인 아세틸콜린의 농도를 측정하였다.

그 결과, 치매 유발군에서는 5.27 μM로 정상군(9.29 μM)에 비해 신경전달물질인 ACh이 감소되었음을 확인하였으나 FSGC를 3주간 투여한 실험군(100, 300 및 500 mg/kg)은 각각 6.20 μM, 6.41 μM 및 8.07 μM로 농도의존적으로 ACh 농도가 회복되는 것으로 나타났다(도 13). 특히 FSGC 500 mg/kg 투여군에서는 AChE 저해활성으로 인지기능 개선효과가 있는 것으로 알려진 EGCG 100 mg/kg (8.43 μM)과 비슷한 수준으로 유의적으로 증가하였다. 상기 결과는 본 발명의 FSGC의 투여하여 ACh 농도가 증가함에 따라 인지기능 회복 효과와 직접적으로 연관됨을 시사하는 것이다.

실시예 12: 뇌 내 Aβ 분포

본 발명자들은 본 발명의 FSGC 투여에 따른 치매유발 동물모델의 뇌 내 Aβ 제거 효과를 평가하기 위하여 기억을 담당하는 해마 CA1 영역 및 뇌 전반부에 대하여 Aβ의 축적을 확인하고자 면역형광염색을 실시하였다.

그 결과, Aβ_1-42를 뇌실 내로 투여한 치매 유발군에서 Aβ 축적 및 플라크(plaque)를 관찰하였다. 한편, FSGC투여군에서는 플라크를 관찰할 수 없었다(도 14).

실시예 13: 뇌 손상 분석

본 발명자들은 치매유발 동물모델의 뇌손상 분석을 위해 부검 시 저온 식염수로 뇌를 충분히 관류한 후 뇌조직을 적출하였고 4% 포름알데하이드 수용액(formaldehyde solution)에 고정시켜 동결조직 슬라이드를 제작하였다. 그 후, 고정된 뇌조직에서 신경교섬유질산성단백질(glial fibrillary acidic proteins, GFAP) 발현을 면역형광염색으로 확인하였고, 뇌손상에 따른 성상세포(astrocytes)의 세포 수를 분석하였다.

그 결과, Aβ 치매 유발군에서는 GFAP-양성 성상세포가 다수 관찰되었으나 FSGC 및 EGCG 투여군에서는 GFAP 발현이 크게 감소한 것으로 나타났다(도 15). 또한, 동일 면적에 대한 GFAP-양성 성상세포 수를 비교한 결과 치매 유발군에서는 정상군에 비해 3배 이상 증가하였지만, FSGC 투여에 의해 모든 농도(100-500 mg/kg)에서 유의하게 감소된 것을 관찰하였고 EGCG(100 mg/kg) 투여군 역시 우수한 효과를 나타내었다(도 16). 상기 결과는 본 발명의 FSGC가 식약처로부터 건강기능식품으로 인정된 EGCG와 유사한 효과를 나타냄에 따라 뇌 손상의 방어에 탁월한 효과가 있음을 시사하는 것이다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> Korea Genetic Pharm Co., Ltd. <120> A composition for improving memory and cognitive function comprising complex processed ginseng berry extract as an active ingredient <130> PD20-5899 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hChAT F <400> 1 gtggctcaga acagcagcat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hChAT R <400> 2 caatcatgtc cagcgagtcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH F <400> 3 ggagccaaaa gggtcatcat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH R <400> 4 gtgatggcat ggactgtggt 20

Claims

증포(蒸曝) 인삼열매 추출물 및 상기 증포 인삼열매 추출물을 유산균으로 발효시킨 발효 증포 인삼열매 추출물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 기억력 또는 인지능력 개선용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 인삼열매는 미성숙 인삼열매인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 증포 인삼열매 추출물은
미성숙 인삼열매를 3 내지 5회 증포하여 제1증포 인삼열매를 제조하는 단계;
미성숙 인삼열매를 6 내지 8회 증포하여 제2증포 인삼열매를 제조하는 단계;
상기 제1증포 인삼열매 및 상기 제2증포 인삼열매를 동량으로 혼합한 후 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 상기 저급알코올의 수용액으로 추출하는 단계; 및
추출된 추출물을 여과 후 감압농축 및 동결건조하는 단계를 통해 제조되는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 발효 증포 인삼열매 추출물은 상기 증포 인삼열매 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계; 및
발효된 증포 인삼열매 추출물을 건조하는 단계를 통해 제조되는, 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인, 약학적 조성물.
증포(蒸曝) 인삼열매 추출물 및 상기 증포 인삼열매 추출물을 유산균으로 발효시킨 발효 증포 인삼열매 추출물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인, 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 인삼열매는 미성숙 인삼열매인, 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 증포 인삼열매 추출물은
미성숙 인삼열매를 3 내지 5회 증포(蒸曝)하여 제1증포 인삼열매를 제조하는 단계;
미성숙 인삼열매를 6 내지 8회 증포하여 제2증포 인삼열매를 제조하는 단계;
상기 제1증포 인삼열매 및 상기 제2증포 인삼열매를 동량으로 혼합한 후 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 상기 저급알코올의 수용액으로 추출하는 단계; 및
추출된 추출물을 여과 후 감압농축 및 동결건조하는 단계를 통해 제조되는, 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 발효 증포 인삼열매 추출물은 상기 증포 인삼열매 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계; 및
발효된 증포 인삼열매 추출물을 건조하는 단계를 통해 제조되는, 약학적 조성물.
제11항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인, 약학적 조성물.
증포(蒸曝) 인삼열매 추출물 및 상기 증포 인삼열매 추출물을 유산균으로 발효시킨 발효 증포 인삼열매 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 기억력 또는 인지능력 개선용 건강기능식품.
제13항에 있어서,
탕제, 드링크제, 산제, 환제, 캡슐, 정제 또는 젤리의 제형으로 제공되는 건강기능식품.
미성숙 인삼열매를 3 내지 5회 증포(蒸曝)하여 제1증포 인삼열매를 제조하는 단계;
미성숙 인삼열매를 6 내지 8회 증포하여 제2증포 인삼열매를 제조하는 단계;
상기 제1증포 인삼열매 및 상기 제2증포 인삼열매를 동량으로 혼합한 후 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 상기 저급알코올의 수용액으로 추출하여 증포 인삼열매 추출물을 제조하는 단계;
상기 증포 인삼열매 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계;
상기 발효시킨 추출물을 여과 후 감압농축 및 동결건조함으로써 발효 증포 인삼열매 추출물을 제조하는 단계; 및
상기 증포 인삼열매 추출물 및 상기 발효 증포 인삼열매 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는, 증포 인삼열매 추출물 및 상기 증포 인삼열매 추출물을 유산균으로 발효시킨 발효 증포 인삼열매 추출물의 혼합물의 제조방법.