KR101732886B1

KR101732886B1 - 베타아밀로이드(β-amyloid) 축적으로 인해 발병하는 질병 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101732886B1
Application number: KR1020140194881A
Authority: KR
Inventors: 주성수
Original assignee: 강릉원주대학교 산학협력단
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2017-05-24
Also published as: KR20160081288A

Abstract

본 발명은 알츠하이머병을 비롯한 베타아밀로이드의 축적에 의해 발병하는 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 증포 인삼열매 추출물 유래 진세노사이드 함유 분획물을 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드(β-amyloid) 축적으로 인해 발병하는 질병 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

베타아밀로이드(β-amyloid) 축적으로 인해 발병하는 질병 치료용 조성물{Novel composition for treating and alleviating disease by the accumulation of β-amyloid}

본 발명은 신규 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 베타아밀로이드(β-amyloid) 축적으로 인해 발병하는 질병 치료용 조성물에 관한 것이다.

알츠하이머 치매는 고령자 층에 가장 많이 발생하는 질병으로 65-85세 인구의 10%, 그리고 85세 이상의 연령의 약 40%가 발병한다. 이 알츠하이머 치매는 1907년 독일의 알로이스 알츠하이머(Alois Alzheimer)가 치매 환자 뇌의 해마(hippocampus)와 신피질(neocortex)에서 신경세포가 손실되어 있고, 신경세포의 세포체 내에 엉켜진 실뭉치처럼 보이는 신경섬유 덩어리(neurofibrillary tangle; NTF)와 노인반(senile plaque)과 같은 비정상적 구조가 있음을 처음 관찰함으로써 알려졌다. 노인반은 아밀로이드 펩타이드(amyloid peptide)의 세포외부 축적물로서 신경돌기(neurite), 성상세포(astrocyte), 미세아교세포(microglial cell) 등에 둘러싸여 있고, 대뇌 번연계(limbic structure)나 연합 신피질(association neocortex) 부위에서 주로 발견된다. 신경섬유 덩어리는 타우 단백질(Tau)이 과다 인산화되어 이중 쌍으로 꼬인 직선섬유 형태의 불용성 구조라고 할 수 있다.

이러한 비정상적인 조직특성이 치매의 발병원인으로 작용하는지를 규명하기 위하여 많은 연구가 진행되어 왔는데, 플라크(plaque)의 주성분인 아밀로이드베타(amyloid beta; Aβ)의 형성이 치매의 발병에 주원인으로 작용할 것이라는 가설이 가장 주목을 받아왔다. 알츠하이머병(Alzheimer's Disease, AD)의 병리학적 특징은 대뇌피질(cerebral cortex)과 해마(hippocampus)에서 과인산화된 타우(tau) 단백질이 응집되어 나타나는 신경섬유덩어리(neurofibrillary tangle, NFT)와 신경 세포 밖에 축적된 아밀로이드 베타 단백질(amyloid beta peptide Aβ)이 주성분인 노인반이 있다. Aβ 단백질은 신경전달물질인 아세틸콜린을 만드는 대뇌 부분과 대뇌피질의 신경세포를 파괴하여 아세틸콜린의 활성 상태를 감소시키며, 활성산소종(reactive oxygen species :ROS)을 생성하여 산화적 손상을 유발함으로써 신경세포 사멸을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한 산화적 세포사멸뿐만 아니라 염증에 관련하는 기전이 뇌세포 손상을 일으키는 주요한 원인이 된다.

최근 연구에서 인삼에서 분리된 진세노사이드(예를 들어, Rg1 및 Rb1)가 중추신경계 및 말초신경계에 대한 인삼의 효과를 담당한다고 보고한 바 있으며(Nah et al., CNS Drug Rev., 13: 381-404, 2007; Chang et al., Eur. J. Pharmacol., 578: 28-36, 2008), 인삼 복합 생약 추출물, 진세노사이드 Rg2와 진세노사이드 F2를 포함하는 뇌기능 및 인지 기능 개선용 조성물에 관한 대한민국 공개특허 제2014-0082053호, 진세노사이드―Ｆ2와 진세노사이드―ＣＫ를 주성분으로 함유하는 치매 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 대한민국 공개특허 제2009-0083780호, 및 진세노사이드 가수분해물을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 대한민국 등록특허 제0448667호 등이 보고된 바 있다.

본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효과적 베타아밀로이드(β-amyloid) 축적으로 인해 발병하는 질병의 치료 및 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 증포 인삼열매 추출물, 상기 추출물을 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 순차 분획한 증포 인삼열매 추출물의 진세노사이드 함유 분획물, 또는 상기 진세노사이드 함유 분획물을 크로마토그래피로 분리하여 에틸아세테이트:메탄올=3:1의 용매를 전개 용매로 한 박막크로마토그래피(TLC) 상 Rf 값 0.4 내지 0.7에 상응하는 분획을 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드(β-amyloid) 축적으로 인해 발병하는 질병 치료 및 개선용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 증포 인삼열매 추출물, 상기 추출물을 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 순차 분획한 증포 인삼열매 추출물의 진세노사이드 함유 분획물, 또는 상기 진세노사이드 함유 분획물을 크로마토그래피로 분리하여 에틸아세테이트:메탄올=3:1의 용매를 전개 용매로 한 박막크로마토그래피(TLC) 상 Rf 값 0.4 내지 0.7에 상응하는 분획을 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드(β-amyloid) 축적으로 인해 발병하는 질병 예방 및 개선용 건강기능식품이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 증포 인삼열매의 진세노사이드 Rg3 함유 추출물은 알츠하이머 주요유발물질인 Aβ42를 효과적이고 신속하게 제거할 수 있기 때문에, 베타아밀로이드(β-amyloid) 축적으로 인해 발병하는 질병 개선에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 증포 인삼열매 추출물로부터 증포 인삼열매 추출물의 진세노사이드 함유 분획물(이하, 'RgC'라 약칭함)의 추출과정을 도식한 개요도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 증포 인삼열매 추출물의 진세노사이드 함유 분획물 RgC의 인삼열매 증포횟수에 따른 HPLC 크로마토그램을 나타낸 그래프다.
도 3은 상기 증포 인삼열매 추출물의 진세노사이드 함유 분획물을 크로마토그래피로 분획한 분획물을 TLC에 의한 전개 패턴에 따라 그룹화한 분획 그룹들의 TLC 크로마토그래피 결과를 촬영한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 진세노사이드 Rg3의 분자구조도이다.
도 5는 HMO6 인간 미세아교세포에서 Aβ 분해-관련 유전자의 mRNA 발현을 정량적인 RT-PCR을 통해 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 HMO6 인간 미세아교세포에서의 Aβ 및/또는 Rg3의 처리에 따른 카베올린1, 카베올린2, 클라트린(clathrin),넵필리신(NEP), 인슐린 분해효소(insulin-degrading enzyme, IDE) 유전자 발현 변화를 나타내는 그래프이다. HMO6 세포를 35 mm 세포배양 플레이트 또는 챔버 슬라이드에 세포를 분주한 후 Aβ42(5 μM) 또는 Rg3(2.5 또는 5 μg/ml)를 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음 정량적인 RT-PCR 방법에 의해 mRNA 발현을 확인하였다. Rg3/Aβ42의 존재 여부에 따른 endocytosis(내포)-관련 유전자인, 카베올린(A-B), 클라트린(C), 및 Aβ-degrading(분해) 효소 유전자인, NEP(D), IDE(E)의 발현을 비교하였다. 평균 ± 표준편차로 결과를 나타낸다. * P < 0.05, **P < 0.01, *** P < 0.001.
도 7은 HMO6 세포에서 농도별 RgC(10, 25, 50 μg/ml) 처리 후 24시간 내 각 유전자 발현 수준을 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예 따라 HMO6.hSRA 인간 미세아교세포주(human microglial cell line)에 의한 SRA(Scavenger receptor class A)의 발현 및 Aβ42 흡수를 확인한 결과로서, 인간 SRA 유전자를 포함하는 pcDNA3.1(+) vector로 형질감염된 HMO6 인간 미세교아세포(human microglia, HM06.hSRA) 및 비형질감염 세포(HMO6)를 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다(A); HM06.hSRA에서 SRA의 발현을 RT-PCR 분석한 결과(B), HM06.hSRA에서 SRA의 발현을 웨스턴블랏 분석한 결과(C); 및 HMO6 / HMO6.hSRA 세포에서 2시간째에 FITC-결합 Aβ42 흡수를 면역세포분석을 통해 확인한 형광현미경 사진이다(D). 눈금막대는 10 μm를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 ERK(extracellular-regulated kinase) 및 p38의 인산화 정도를 확인하기 위한 웨스턴블랏 결과를 나타낸 사진이다. Rg3의 존재의 여부에 따라 phospho-ERK 및 phospho-p38 단백질 발현정도를 면역블랏을 통해 조사하였다. HMO6 세포는 60 mm 세포배양 플레이트에 세포를 뿌린 후 Rg3(5 μg/ml)를 처리하고, phenol red-/무혈청 DMEM 배지에서 1시간 동안 둔 후 웨스턴블랏하였고, 독립적으로 3 회 블랏을 실시하였다.
도 10은 HMO6세포에서 NEP(neprilysin) 및 IDE(insulin-degrading enzyme)의 발현을 웨스턴블랏을 통해 나타낸 이미지이며(A), 이를 정량적으로 나타낸 그래프(B, C) 및 면역세포분석 결과를 나타낸 사진(D, E)이다. HMO6 세포는 60 mm 세포배양 플레이트 또는 챔버 슬라이드에 세포를 분주한 후 무혈청 DMEM 배지에서 Aβ42(5 μM) 또는 Rg3 (2.5 또는 5 μg/ml)를 24시간 동안 처리한 후 NEP 및 IDE 발현을 웨스턴블랏 분석 및 면역세포분석을 통해 확인하였다. 평균 ± 표준편차로 결과를 나타낸다. * P < 0.05, **P < 0.01, *** P < 0.001.
도 11은 Rg3를 처리하거나 처리하지 않은 HMO6 세포에서 카베올린 및 클라트린의 발현을 면역세포화학분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다. HMO6 세포를 챔버 슬라이드에 분주한 후 24시간 동안 Rg3(5 μg/ml)을 처리한 후, 카베올린 및 클라트린에 대해 각각 특이적으로 결합하는 1차 항체로 면역세포화학염색을 하고, DAPI로 대비염색을 하였다. 눈금막대는 10 μm를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 뇌조직에서 진세노이드 Rg3 및 SRA(scavenger receptor class A)의 발현에 관하여 HPLC 크로마토그램을 나타낸 그래프(A), 동일한 뇌조직에서 SRA 및 SRB mRNA의 발현을 나타낸 그래프(B), 및 웨스턴블랏 결과에 따른 단백질 패턴을 나타낸 이미지(C)이다. Ctrl은 대조군이며, 평균 ± 표준편차로 결과를 나타낸다. *** P < 0.001.
도 13은 HMO6 세포에서 FITC-labeled Aβ 흡수 결과를 나타낸 결과 그래프이다. Ctrl은 정상대조군을 나타내며, 평균 ± 표준편차로 결과를 나타낸다. *** P < 0.001.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따라 알츠하이머 모델 마우스에 Rg3 투여한 후, 행동학적 변화를 관찰한 결과를 나타내는 그래프로서, 수동 회피 실험(PAT) 결과를 나타내는 그래프(A) 및 수중미로실험(Morris Water Maze Test; MWM)의 결과를 나타내는 그래프(B)이다. Aβ42 주입 후 2 주 후에 10 mg/kg의 Rg3 투여 후 4주 동안 측정하였다. 평균 ± 표준편차로 결과를 나타낸다. **P < 0.01, *** P < 0.001.
●은 정상대조군(normal control);
○는 Aβ42;
▼는 Rg3+ Aβ42;
△는 Rg3를 나타낸다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 증포 인삼열매 추출물, 상기 추출물을 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 순차분획한 증포 인삼열매 추출물의 진세노사이드 함유 분획물, 또는 상기 진세노사이드 함유 분획물을 크로마토그래피로 분리하여 에틸아세테이트:메탄올=3:1의 용매를 전개 용매로 한 박막크로마토그래피(TLC) 상 Rf 값 0.4 내지 0.7에 상응하는 분획을 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드(β-amyloid) 축적으로 인해 발병하는 질병 치료 및 개선용 약학적 조성물이 제공된다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 유효성분은 뇌의 미세아교세포(microglial cell)에서 베타아밀로이드의 내포화(endocytosys) 및 내포화된 베타아밀로이드의 분해를 촉진함으로써 베타아밀로이드 축적으로 인해 발병하는 질병을 치료 및 개선할 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 베타아밀로이드 축적으로 인해 발병하는 질병은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 루위체 치매(Lewy body dementia), 근염(myositis), 또는 대뇌 밀로이드 맥관병증(cerebral amyloid angiopathy)일 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 증포 인삼열매 추출물은 미성숙 인삼열매를 증포하여 건조한 후 이를 C1 내지 C4의 저급알코올 또는 상기 저급알코올의 수용액에 첨가하여 추출한 것일 수 있고, 이 때 상기 저급알코올은 메탄올, 에탄올, 또는 프로판올일 수 있으나, 에탄올인 것이 바람직하며, 상기 증포 인삼열매는 3 내지 10회 또는 4 내지 7회 증포한 것일 수 있다. 상기 증포는 80 내지 120℃의 온도의 수증기 하에서 1 내지 3시간 동안 수행될 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 증포 인삼열매 추출물의 진세노사이드 함유 분획물은 상기 증포 인삼열매 추출물에 에틸아세테이트 및 증류수로 구성된 용매를 첨가한 후 에틸아세테이트층과 증류수 층으로 분획하는 단계; 및 분획된 물층을 다시 n-부탄올로 분획한 후 n-부탄올층을 에테르를 이용하여 재결정하는 단계를 통해 제조될 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 크로마토그래피는 고정상으로 실리카 겔을, 이동상으로 물(A), 아세토니트릴(B) 및 클로로포름(C)을 섞어서 사용하는 컬럼 크로마토그래피로서, 용매비율은 C의 농도를 고정하고 점차 A의 농도를 증가시키고 그에 상응하게 B의 농도를 감소시킴으로써 수행될 수 있으며, 상기 용매비율은 순차적으로 A:B:C=0:80:20(500 mL), A:B:C=10:70:20(500 mL), A:B:C=20:60:20(500 mL), A:B:C=50:30:20(500 mL), A:B:C=50:30:20(500 mL), 및 A:B:C=50:30:20(500 mL)일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구투여 또는 비경구투여를 통해 투여되는 것이 가능하며, 경구투여가 더욱 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주사, 비강내 흡입, 근육내 투여, 복강내 투여, 경피흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.

아울러, 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 다양한 제형으로 제형화될 수 있는데, 탕제로 제조되어 레토르트 파우치에 포장되어 제조될 수 있고, 열풍건조, 동결건조 등의 방법에 의해 건조된 후 산제, 환제, 캡슐 등의 제형으로 제형화될 수도 있으며, 젤라틴 등 젤화 성분과 혼합되어 젤리 형태로 제형화될 수도 있다. 약학적 제제의 제조에 통상 사용되는 공지된 제형은 어느 것이라도 사용 가능하다.

아울러, 본 발명의 약학적 조성물을 제조하는데 있어서 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체가 사용될 수 있는데, 이러한 담체로는 통상적인 각종 유기 또는 무체 담체, 예를 들어, 고형제제에서는 부형제, 윤활제, 결합제 및 붕해제, 액체제제에서는 용매, 가용화제, 현탁화제, 등장화제, 완충제 및 무통화제(soothing agent)가 있다. 또한, 필요한 경우, 통상적인 보존제, 산화방지제, 착색제, 감미제, 흡착제, 습윤제 등과 같은 첨가제가 적절량으로 적절하게 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품은 건강기능식품에 적합한 다양한 제형, 예컨대, 탕제, 드링크제, 산제, 환제, 캡슐, 정제(코팅정, 당의정, 설하정 등), 젤리 등의 제형이 사용될 수 있다.

본 문서에서 사용되는 "증포 인삼열매 추출물의 진세노사이드 함유 분획물(RgC)"은 진세노사이드가 주성분으로 포함되도록 증포 인삼열매 추출물을 분획하여 제조된 분획물을 의미한다.

본 문서에서 사용되는 용어 "활성 진세노사이드 농축 분획"은 상기 증포 인삼열매 추출물의 진세노사이드 함유 분획물을 크로마토그래피로 분리한 분획 중 박막크로마토그래피에 의해 분류된 본 발명의 유효 진세노사이드인 진세노사이드 Rg3의 함량이 농축된 분획물을 의미한다.

본 문서에서 사용되는 "진세노사이드(ginsenoside)"는 인삼 뿌리에서 주로 발견되는 사포닌의 일종으로 당쇄의 부가 정도에 따라 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg1, Rg2, Rg3, Rg4, Rg5, Rg6, Rh1, Rh2, Rh3, Rk1, Rk2, Rk3, Re, Rf1, Rf2, Rf3 등 다양한 형태로 존재하며, 통상적으로 인삼 뿌리의 증숙 정도에 따라 사포닌 배당체로부터 당쇄의 절단 정도가 달라짐으로써 그 종류에 변화가 있는 것으로 알려져 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 인삼열매 추출

본 발명에서 신선한 인삼열매(Panax ginseng C.A. Meyer berries)는 ㈜한국 지네틱 팜(Korea Genetic Pharm Co. Ltd. 한국 경기)으로부터 구입하였다. 본 발명에서 사용한 익기 직전의 미성숙 인삼열매(unripened berries)는 4년생을 모았고, 전체 인삼 열매는 2시간 동안 100℃에서 증포(增布)한 후 50℃에서 24시간 동안 건조하였다. 이러한 증포와 건조 과정을 4회 내지 9회 반복하였고, 마지막으로 7일 동안 건조하여 준비하였다. 도 1은 증포 인삼 미성숙 열매로부터 증포 인삼열매 추출물의 진세노사이드 함유 분획물(RgC)의 추출과정을 도식화한 개요도이다. 도 1에 나타난 바와 같이 최종 증포된 100 g의 인삼 열매를 실온에서 80% 에탄올 1L 안에 반복적으로 24시간씩 3회에 거쳐 3일 동안 교반하면서 추출하였다. 이후 각 회차에 획득한 에탄올 추출물을 혼합하고, 여과지(Whatman International Ltd., 영국)로 여과한 후 증발시켰다. 에탄올 추출물을 1:1 비율의 에틸아세테이트와 증류수 혼합물을 사용하여 분획하였고 그후 물층을 다시 n-부탄올로 분획한 후 n-부탄올 층을 에테르를 이용하여 재결정함으로써 RgC를 수득하였다(도 1). 상기 RgC의 수율은 건조된 파우더 100g 당 수득된 추출물의 그램으로 나타내었는데, 건조중량 기준으로 에탄올 추출물(27.5 g)에서 대략 50%의 RgC(13.8 g)가 수득되었다.

실시예 2: 진세노사이드 함유 분획물(RgC)의 성분 분석

본 발명자는 상기 RgC에 포함된 진세노사이드의 구성성분과 함량을 조사하기 위하여, 상기 4회 내지 9회 증포한 미성숙 인삼열매로부터 수득된 n-부탄올 분획물에 대하여 고성능 액체크로마토그래피(HPLC 1100 series, Agilent, USA)를 수행하였다. 구체적으로, 시료를 증류수에 녹이고 물(A)과 아세토니트릴(B)(HPLC grade, Fisher scientific, USA)를 이동상으로 하여 유속은 1.0 mL/min으로 하였으며 흡광도는 203 nm에서 분석하였고, 분석에 사용한 칼럼은 Zorbax SB-Aq C18 column(4.6 x 150 mm, 5μm)으로 칼럼 온도는 35℃로 설정하여 측정하였고 10 μL의 시료를 주입하였다. 이동상의 조건으로는 79%의 A로 시작하여 0-10분(79-78 %A, 21-22 %B), 10-11분(78-77 %A, 22-23 %B), 11-29분(77-76 %A, 23-24 %B), 29-34분(76-70 %A, 24-30 %B), 34-44분(70-68 %A, 30-32 %B), 44-49분(68-50 %A, 32-50 %B), 49-64분(50-35 %A, 50-65 %B), 64-78분(35-0 %A, 65-100 %B), 78-80분(0-79 %A, 100-21 %B)를 사용하였고, 마지막으로는 메탄올 300 mL을 이용하여 종료하였다. 또한 진세노사이드의 구성성분을 확인하기 위하여 표준시료(진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 Rb1, BTGin, 대한민국)를 구입하여 동일 조건으로 측정하였으며 표준시료와의 같은 머무름시간(retention time)을 나타내지지 여부를 확인하고 UV 스펙트럼과 분자량 측정값을 이용하여 각각의 진세노사이드를 확인하였다(도 2).

그 결과 도 2에서 나타난 바와 같이, RgC의 주요성분은 진세노사이드 Rg3, Rd, Rh2, Rf, Rb1, Rc, M1, Rh1, Rg2, Re 등으로 다양하게 나타났고, Rg3의 양이 가장 많았고, 그 다음이 Rd였다. 증포 횟수에 따른 진세노사이드 종류 및 함량은 표 1에 정리하였다.

인삼 미성숙 열매의 증포 횟수에 따른 진세노사이드 함량비교

함량 (%W/W)	4회 증포	5회 증포	6회 증포	7회 증포	8회 증포	9회 증포
Ginsenoside Re	7.46	3.64	2.82	1.64	1.07	0.58
Ginsenoside Rf	7.25	8.25	7.74	9.25	9.25	9.01
Ginsenoside Rh1	3.48	3.84	3.32	4.04	3.87	3.83
Ginsenoside Rg2	2.33	2.26	1.74	1.22	0.96	1.78
Ginsenoside Rb1	2.43	2.03	1.57	1.49	1.13	0.97
Ginsenoside Rc	4.62	3.54	2.85	2.41	1.82	0.94
Ginsenoside Rd	11.68	10.04	9.04	8.78	7.95	7.06
Ginsenoside Rg3	24.92	27.87	28.82	29.7	28.79	29.12
Ginsenoside M1	8.26	8.83	9.62	9.02	9.98	10.07
Ginsenoside Rh2	8.52	9.75	10.99	10.73	11.19	12.18

상기 표 2에서 나타난 바와 같이, HPLC 분석 결과 인삼열매의 증포 회수별 진세노사이드함량의 변화 및 조성에 차이가 나는 것을 확인했으며 총진세노사이드 함량은 7회 증포 시 가장 높은 것으로 나타났다. 흥미롭게 증포 회수를 더할수록 Rf, Rh1, Rg3, M1 및 Rh2가 증가하는 것이 관찰되었으나, Re, Rc, Rd의 경우 4회 증포시 가장 높은 함량을 나타나다가 증포회수를 더할수록 함량이 감소하는 것으로 나타났다. 이에, 본 발명자는 위의 결과로부터 상기 HLPC에서 진세노사이드의 함량 분석 시 최고함량을 나타낸 Re, Rf, Rd, Rg3 중 뇌 신경과의 관련이 있을 것으로 예상되는 Re, Rd, 및 Rg3와 다양한 연구에서 중추신경계와의 상관관계가 이미 규명된 Rg1 및 Rb1 등 총 5종의 단일 진세노사이드(Re, Rg2, Rb1, Rc, 및 Rd)의 함량이 가장 높았던 4회 증포 분획물과 총진세노사이드 함량이 가장 높은 7회 증포 분획물을 합하여 사용하는 것이 유용한 진세노사이드를 확보하는 최적의 조건으로 판단하여, 4회 증포 분획물과 7회 증포 분획물을 50:50으로 혼합한 시료를 이후, 시험관내 실험에 사용하였으며, 상기 5종의 단일진세노사이드에 대한 동일한 시험관내 실험을 통해 어떤 진세노사이드가 유효물질인지 규명하고자 하였다.

실시예 3: RgC의 크로마토그래피를 통한 유효성분의 농축

본 발명자는 이어, 최적 증포 회수인 4회/7회 증포 추출물로부터 진세노사이드 분획물(RgC)에 대한 그룹화(grouping)를 수행하였다. 상술한 실시예 2의 방법에 따라 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 그룹화를 수행하였으며, 시험관 마다 45 mL씩 74개의 시험관을 이용하여 용출물을 수득하였으며, 각각의 시험관에 대해 TLC를 이용하여 그룹을 선정하였다. 즉, 각 시험관에 대한 TLC를 모니터링하면서 R _f 값의 변화되는 부분을 새로운 그룹으로 지정하였다. 그룹 1의 경우 칼럼 크로마토그래피에서 최초로 수거된 부분이고, 그룹 2의 경우 R _f값이 0.5인 부분이며, 그룹 3은 R _f값 0.48 영역까지 무수히 많은 스팟들이 끌어올려져 있는 형태가 나타났으며, 그룹 4는 Group 3에서 보이지 않았던 R _f값 0.6 영역의 스팟이 나타나 별도로 분류하였다. 그룹 5는 칼럼 크로마토그래피 마지막 과정인 물:아세토니트릴:클로로포름=50:30:20(500 mL)에서 메탄올 300 mL 부분으로 TLC 에틸초산:메탄올=3:1의 전개용매 조건에서 출발지점에 머물러 있는 점 형태가 관찰되었다(도 3). 각 그룹별 HPLC 결과는 도 4에 도시된 바와 같다. 그 결과, 그룹 2에는 소량의 진세노사이드가 포함되어 있는 반면, 그룹 3에는 Rf, Rd, 및 Rg3가 다량으로 포함되어 있었고, 그룹 4에는 Re, Rg3, M1, Rh1 등이 포함되어 있었으며, 특히 RgC에 비하여 Re의 함량이 높다는 점을 주목할 수 있다.

실험예

실험예 1: 일반적 방법

1-1: 시약

본 발명에서 사용한 Panax ginseng으로부터 유래한 순도 98% 이상의 진세노이드 Rg3는 BTGin(대전, 한국)에서 구입하였다(도 4). 10 mg/ml의 Rg3의 농축된 저장액(stock solution)을 10% DMSO(dimethylsulfoxide, Sigma-Aldrich, 미국)으로 용해하였다. 상기 용액은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다. 그런다음 저장액은 세포에 처리하기 위하여 세포배지에 1:10으로 희석하였다. 세포 배지 내의 최종 DMSO 농도(< 0.25%)는 미세아교세포의 활성화(microglial activation)에 아무런 영향을 주지 않았다. 동결건조된 Aβ42(Calbiochem, 미국)은 증류수에 5 mg/ml로 희석하여, -20 ℃에 사용하기 전까지 보관하였다.

1-2: 세포배양

HMO6 인간 미세아교세포주(human microglial cell line)는 중앙대학교(Dr. SU Kim, 한국)에서 제공 받아 실험하였다. HMO6 세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린(penicillin, Invitrogen, 미국), 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin, Invitrogen, 미국)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Hyclone, 미국) 배지에 배양하였다. 5% CO₂, 37 ℃로 세포 배양 조건을 유지하였다. 세포는 90% 이상의 포화도로 20 계대를 넘지 않는 조건으로 배양하였다. 배지는 2-3일 마다 교체하였다. poly-L-lysine-코팅된 35 mm 세포배양 플레이트는 5 ㅧ 10⁵세포, 60 mm 세포배양 플레이트는 5 ㅧ 10⁶세포 조건으로 세포를 뿌려준 후 배양하였다. 세포를 분주하고 24시간 경과 후, 세포 배지를 무혈청 DMEM 배지로 교체하였고, PBS(phosphate buffered saline)으로 1회 세척한 후, Rg3, RgC 및/또는 Aβ42를 24시간 동안 처리하였다.

1-3: 실험동물

10주령 웅성 BALB/c 마우스는 샘타코(경기, 한국)에서 구입하여 사용하였고, 일주일 동안 온도는 20 ± 2℃, 습도는 50%, 명암주기는 12 시간 조건으로 순응시켜다. 5주령 Sprague-Dawley 랫트는 대한바이오링크(음성, 한국)으로부터 기억 및 학습 실험을 위하여 구입하였다. 실험동물(그룹별 n=5)은 23 ± 2℃ 온도로 일정하게 유지시켰다. 또한 습도는 55 ± 10%, 명암주기는 12 시간 조건으로 순응시켰다. 실험동물은 임의대로 standard rodent chow를 식이하였고, 물을 음용하였다. 건조동결된 Aβ42 (0.5 mg)을 7일 동안 RT 온도에서 근모상의 집합체 Aβ42(fAβ42; fibrillar-aggregated Aβ42)을 준비하기 위해서 PBS(PH=7.4)에 흔들어서 섞어주었다. 10주령 마우스를 마취한 후 1 μl fAβ42 (350 μM 스톡 농도)을 정위방법으로(stereotaxically) 두정엽(parietal cortex)에 단방향으로(1 분 이내 해마보다 위의 시상(矢狀) 봉합과 관상(冠狀) 봉합의 접합점 방향으로 앞쪽 1.7 mm, 옆쪽 1 mm, 및 배측 1 mm) 주입하였다(Mohajeri et al., J. Biol. Chem., 277: 35460-35465, 2002).

실험예 2: 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응

HMO6 세포 또는 관류시킨 마우스 뇌 조직에서 총 RNA를 Trizol 시약(Invitrogen)을 이용하여 추출한 후, 1 μg의 RNA를 역전사효소 시스템(Improm-II reverse transcription system, Promega, 미국) 및 올리고 dT 프라이머를 이용하여 역전사반응시킨 후, 역전사된 cDNA를 주형으로 하여, 하기 표 1에 기재된 프라이머 및 SensiMix^TM SYBR Hi-ROX Kit(Bioline, UK)로 Rotor-Gene 6000 실시간 PCR 장치(Corbett Research, 오스트레일리아)를 이용하여, 95℃에서 15분 사전 가열 후, 95℃에서 15초, 52℃에서 15초, 72℃에서 10초의 반응을 45회 반복하였고, 예상된 PCR 산물이 생성되었는지 확인하기 위해 녹는점 곡선 분석을 사용하였고, 정확한 길이의 산물이 생성되었는지 확인하기 위해 일부는 1.2% 아가로즈겔 상에서 전기영동을 수행하였다. 상대적인 발현 수준은 마우스에 대하여 내부 표준유전자인 베타-액틴, HM06 세포에 대하여는 인간 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)에 대한 비율로 환산하여 Rotor-Gene 6000 시리즈 소프트웨어 1.7를 이용하여 분석하였고, 반응-간 교정기를 이용하여 반응-간 변이를 교정하였다. 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 RT-PCR함으로써 정량하였다. 상기 결과는 내부표준유전자에 대한 비율(%)로서 나타낸다. 도 5A 내지 도 5E를 통해 Rg3-처리된 정상 HMO6 세포는 농도-의존으로 SRA, NEP, 및 IDE mRNA 발현을 증가하였다(도 9A-E). 특히, zinc-metalloprotease IDE는 처리하지 않은 정상대조군에 비해 대략 6배의 발현이 증가하였다. 세포 안에서 Aβ peptides의 분해(degradation)는 대폭 활성화하였다. 도 6A 내지 도 6C는 Rg3가 카베올린1 및 클라트린-매개 내포 기전을 통해 HMO6 세포로 Aβ42 흡수(uptake)를 증진시킴을 보여준다. 또한 NEP 및 IDE mRNA의 발현이 현저하게 증가함을 확인하였다. 이는 Aβ42의 세포내 내재화(internalization) 후에 효과적으로 Aβ42 저하가 일어남을 시사하는 것이다. 일반적으로, 클라트린-매개 내포작용(clathrin-mediated endocytosis) 및 포낭(caveolae)을 통한 대체된 내재화 모두 MAPKs(mitogen-activated protein kinases)의 활성화와 연관되어 있다다. 따라서, 본 발명자들은 Rg3가 p38 및 ERK와 같은 MAPK 신호전달(signal pathways)를 활성화함을 확인하였다. 한편, 본 발명자들은 Rg3뿐만 아니라 Rg3를 주요성분으로 포함하고 있는 RgC 역시 유사한 활성이 나타나는지 확인하기 위해, 0 내지 50 μg/ml의 RgC를 HMO6 세포에 처리한 후, 상술한 SRA, nepsiliyn, IDE, clathrin, 및 caveolin1의 발현정도의 변화를 관찰하였다. 그 결과 도 7에서 나타난 바와 같이, SRA의 경우 농도의존적인 발현증가 양상을 나타냈고(도 7A), neprilysin의 경우 비록 처리한 농도 구간에서는 농도의존적이진 않았으나, 처리시 발현이 증가하였으며(도 7B), Clathrin(도 7D), 및 Caveolin1(도 7E) 역시 그 정도는 낮긴하였으나, 농도의존적인 발현증가양상을 나타냈다. 반면, IDE의 경우에는 Rg3와는 달리 큰 변화가 없었다(도 7C). 그러나, 전반적으로 RgC의 처리 후의 유전자 발현양상의 변화가 Rg3의 처리시와 유사하였기 때문에, RgC가 Aβ42 소거와 관련된 유전자의 발현을 유의적하게 유도함을 확인할 수 있었다.

본 발명에서 사용한 프라이머

유전자	프라이머	서열	서열번호	크기(bp)	GenBank 동록번호
human SRA	hSRA-F	5'- AGGAGATCGAGGTCCCACTG-3'	1	197	NM_138715
	hSRA-R	5'- TGTTTCCACTCCCCTTTTCC-3'	2
human SRB	hSRB-F	5'- ACCCTAACCAGGAGGCACAC-3'	3	212	NM_005505
	hSRB-R	5'- GTGAAGAGTCTCCCCCTCCA-3'	4
mouse SRA	mSRA-F	5'- TTCACTGGATGCAATCTCCA-3'	5	195	AF203781
	mSRA-R	5'- ACGTGCGCTTGTTCTTCTTT-3'	6
mouse SRB	mSRB-F	5'- ACAAATGGAACGGACTCAGC-3'	7	202	NM_016741
	mSRF-R	5'- GTGAAGAGTCTCCCCCTCCA-3'	8
NEP	NEP-F	5'- ATCAGCCTCTCGGTCCTTGT-3'	9	241	NM_000902
	NEP-R	5'- TGGAAGACAGCGCAAGACTC-3'	10
IDE	IDE-F	5'- CAGTGATCCCACCACGGATA-3'	11	264	NM_004969
	IDE-R	5'- GTGCCCTAGACAGGTTTGCA-3'	12
MMP9	MMP9-F	5'- CTCCTACTCTGCCTGCACCA-3'	13	257	NM_004994
	MMP9-R	5'- AACTACGACCGGGACAAGCT-3'	14
Caveolin1	Caveolin1-F	5'- CAGACGAGCTGAGCGAGAAG-3'	15	190	BT007143
	Caveolin1-R	5'- GACAGCAAGCGGTAAAACCA-3'	16
Caveolin2	Caveolin2-F	5'- AGCCATGCCCTCTTTGAAAT-3'	17	239	BT007051
	Caveolin2-R	5'- ACGCTCGTACACAATGGAGC-3'	18
Clathrin	Clathrin-F	5'- AAGCCCTTGATGCCAATTCT-3'	19	244	BT007170
	Clathrin-R	5'- AGATCGTTCGTCCGGTTTCT-3'	20
GAPDH	GAPDH-F	5'- GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3'	21	202	NM_002046
	GAPDH--R	5'- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'	22
mouse β-actin	β-actin-F	5'- TACAGCTTCACCACCACAGC-3'	23	187	NM_007393
	β-actin-R	5'- AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC-3'	24

실험예 3: 발현 시스템의 구축 및 HMO6 세포로의 hSRA의 형질감염

전장 인간 SRA cDNA(Accession NM_138715)는 human small intestine Marathon-Ready cDNA(Clontech, USA)로부터 PCR을 통해 획득한 후, PCR 산물 클로닝용 플라스미드 pGEM-Teasy vector(Promega, 미국)에 삽입한 후, ABI 3100 DNA sequencer(Applied Biosystems, 미국)로 염기서열 분석을 통해 무결성을 확인하였다. 이후 상기 플라스미드 벡터를 제한효소 EcoRI-XhoI로 절단하여, hSRA cDNA를 pcDNA3.1(+) mammalian expression vector(Invitrogen, 미국)에 삽입하였다. 그런 다음, 전장 hSRA cDNA를 포함하는 pcDNA3.1(+)를 E. coli(DH5α)에 서브클로닝하였고, 플라스미드 DNA miniprep kit(QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen, 미국)을 사용하여 정제하였다. 형질전환 1일 전, HMO6 세포를 트립신 처리한 후, 세포를 계수하여 35 mm 플레이트에 4ㅧ10⁵ cells/ml 로 세포를 도말하고, 포화도가 80% 되었을 때, 세포 배지를 무혈청-DMEM 배지로 교체하였다. 그런 다음 PolyFect^ㄾTransfection Reagent kit(Qiagen, 미국)을 사용하여 HMO6 세포를 pcDNA3.1(+).hSRA로 형질감염한 후 24시간 동안 세포배양을 수행하였다. 그런 다음 안정적으로 형질감염된(stable transfected) 세포를 선별하기 위하여 500 μg/ml의 G418(Promega, 미국)를 4주 동안 처리하였고, 통상의 PCR을 통해 상기 형질감염을 확인하였다.

그리고 상기 형질감염 세포(HM06.hSRA)에서 hSRA가 제대로 발현되는지 여부를 형광현미경 분석, RT-PCR 분석 및 웨스턴블랏 분석으로 분석하였다(도 8A 내지 8C). 그 결과, 도 8A 내지 8C에서 확인되는 바와 같이, HM06.hSRA에서는 hSRA가 정상적으로 과발현되고 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 웨스턴블랏 분석

HMO6 세포를 프로테아제 및 탈인산화효소 저해제(Roche, 독일)를 포함하고 있는 1% RIPA(radioimmunoprecipitation assay) 완충액으로 세척하고, 세포를 용해시킨 후, 세포 용해액에 대하여 10% SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동 후, 단백질을 폴리비닐리덴 디플로라이드(PVDF) 막으로 전사한 후, 상기 PVDF 막을 5% 탈지분유 함유 TBST(tris-buffered saline solution containing 0.1% Tween-20)로 차단한 후, 항-인산화-p38 항체, 항-p38 항체, 항-인산화-ERK 항체, 항-ERK 항체, 및 항-베타-액틴 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 처리하고 세척을 수행한 후, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-결합 항-래빗 또는 항-마우스 이차항체(Stressgen, 미국)를 반응시켰다. 이차항체가 결합된 PVDF 막을 세척한 후, 개량 화학발광 분석 키트(ECL, Thermo, 미국)를 이용하여 시약A와 B를 1:1 비율로 섞어 약 1분간 화학반응을 유도한 뒤 이차항체가 결합된 PVDF 막과 반응시킨 후 30분 내에 발광 수준을 관찰하였다. 도 9에서 나타나듯이, Rg3는 HOM6 미세아교세포에서 p38 및 ERK의 인산화를 촉진시켰다. 이러한 결과들은 Rg3가 수용체-매개(receptor-medicated) Aβ42 흡수(uptake)의 촉진에 기여하고, 클라트린-의존적 및 -비의존적 내포작용 기전을 통해 내재화된 Aβ42의 분해를 촉진시킴을 보여주는 것이다.

실험예 5: 면역세포분석(immunocytochemistry, ICC) 및 현미경 관찰

본 발명자는 면역세포분석(immunocytochemistry, ICC) 및 현미경을 통한 세포형태 분석을 통해서, 진세노사이드가 SRA, 클라트린, 카베리올린1, NEP, 또는 IDE의 발현의 유도 및 실제 신경세포의 분화를 유도할 수 있는지 조사하였다. 구체적으로 배양 중인 HMO6 세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 15분 동안 고정하고, 100 mM 글리신이 첨가된 PBS로 2회 세척한 후 PBS에 용해된 0.1% Triton X-100(Sigma-Aldirich, 미국) 용액으로 상온에서 30분간 투과화(permeabilizing)를 수행한 후, 1% 소 혈청알부민(BSA)으로 30분간 상온에서 차단한 후, SRA, 클라트린, 카베올린1, NEP, 또는 IDE에 각각 특이적인 마우스 단클론 항체 (1:200; Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1% 소 혈청알부민(BSA)를 함유한 PBST(Tween 20 함유 PBS)에 1:200으로 희석하여 처리하고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그런 다음 세포를 1X PBS로 3회 세척한 후, FITC-결합 항 마우스 또는 Alexa Fluor^ㄾ555-결합 항 마우스 IgG(Cell Signaling Technology, 미국)를 1:200으로 희석비율로 처리한 후 1시간 동안 상온에서 반응하였다. 최종적으로 세포를 세척하고, DAPI(Sigma-Aldrich, 미국)로 대조염색을 한 후, 도립 형광현미경(Eclips Ti-S, Nikon, 일본) 하에서 600배의 비율로 형광을 관찰하였다. 또한 도 10A 내지 도 10E는 웨스턴블랏 분석과 면역세포분석을 통해 IDE 및 NEP 유전자의 발현 패턴이 일치함을 확인하였다. 5 μg/ml의 Rg3 처리 후 세포에서 IDE 및 NEP는 눈에 띄게 발현이 증가하였다. 도 11A 및 도 11B는 Rg3-처리된 HMO6 세포에서 카베올린(caveolin1) 및 클라트린(clathrin)의 발현을 확인한 결과를 나타낸다. 상기 분석 결과, 면역세포분석을 통해 Aβ42의 흡수는 카베올린 및 클라트린-의존적인 내포작용(endocytosis)에 의해 유도됨을 확인하였다.

실험예 6: 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석

진세노사이드의 두뇌로의 전달여부를 확인하기 위한 HPLC 분석을 위하여 10주령의 웅성 BALB/c 마우스(샘타코, 대한민국)에 10 mg/kg의 진세노사이드(Rg3)를 경구투여하고 6시간 경과 후 0.9% 식염수로 완전관류시킨 다음 뇌조직을 수득하고, TissueLyser(Qiagen, 영국)를 이용하여 기계적으로 파쇄한 후, 13,500 rpm으로 10분간 원심분리를 수행하였다. 그런 다음, 상등액 1 ml을 n-부탄올 0.4 mL과 혼합한 후 n-부탄올층을 완전히 기화시켜 건조한 후 HPLC 분석을 수행하였다. 그런 다음, 상등액 1 ml을 n-부탄올 0.4 mL과 혼합한 후 n-부탄올층을 완전히 기화시켜 건조한 후 HPLC 분석을 수행하였다. HPLC 분석은 진공건조장치, 4원펌프(quaternary pump) 및 자외선 검출기가 부착된 Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템(Agilent Technologies, USA)을 사용하였고, 고정상으로는 Zorbax SB-Aq C18 칼럼(4.6150 mm, 5 μm)를 사용하였으며, 용매 A(물) 및 용매 B(아세토니트릴)을 1 mL/min의 속도로 이동시켰다. 용출 구배는 79% 용매 A 및 21% 용매 B에서 출발하여, 0-10 분 구간에 용매 B의 농도를 21-22%, 10-11 분 구간에 용매 B의 농도 22-23%, 11-29 분 구간에 용매 B의 농도 23-24%, 29-34 분 구간에 용매 B의 농도 24-30%, 34-44 분 구간에 용매 B의 농도 30-32%, 44-49 분 구간에 용매 B의 농도 32-50%, 49-64 분 구간에 용매 B의 농도50-65%, 64-78 분 구간에 용매 B의 농도 65-100%를 사용하였고, 다음 주입에 앞서 10분간 초기 용액(용매 B 21%)로 평형화하였다. 컬럼 온도는 35℃로 유지하였고 시료는 10 μl를 주입하였으며, 검출은 203 nm의 흡광도에서 수행하였다. 진세노사이드 Rg3는 BV2 미세아교세포로부터 SRA의 과발현을 유도하고 Aβ42 펩타이드의 흡수 및 분해된 Aβ42의 방출을 증진시킴을 확인하였다. 결국 상기 결과로부터 Rg3가 Aβ42 흡수 및 분해를 촉진시킴을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 뇌조직에 대한 HPLC 분석 결과, 도 12A에서 나타난 바와 같이 뇌조직에서 Rg3가 검출되었는데, 이는 Rg3가 뇌쪽으로 물질의 출입을 제어하기 위한 혈액뇌장벽(blood-brain barrier)을 통과한다는 것을 의미한다. 아울러, 본 발명자들은 실제 뇌조직으로 이동된 Rg3가 실제 뇌에서의 Aβ42의 흡수 및 분해에 기여할 수 있는지 확인하기 위해, 상기 Rg3 처리 마우스의 뇌조직에서의 SRA 및 SRB 유전자의 발현정도를 상기 실험예 2에 기재된 방법과 동일한 RT-PCR 분석 및 실험예 4에 기재된 방법과 동일한 웨스턴블랏 분석을 통해 분석하였다(도 12B 및 12). 그 결과, 도 12B 및 도 12C를 통해 알 수 있듯이, Rg3 경구투여시 뇌조직에서 SRA mRNA 및 단백질의 발현이 증가됨을 확인하였다. 이러한 동물실험 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 Rg3 또는 이를 주요성분으로 함유하는 RgC가 경구투여시 알츠하이머병 등 베타아밀로이드 축적으로 인한 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

실험예 7: HMO6 세포에서의 FITC-표지 Aβ 흡수

상기 실험예 2에서 제조된 안정적으로 형질감염됨된 HM06.hSRA세포는 Aβ의 흡수 분석을 위해 96웰 플레이트에 웰당 5000개의 세포로 분주하였다. 세포는 20시간 동안 5 μg/ml의 Rg3를 전처리하였고 그런 다음 Aβ42 펩타이드는 FITC 항체 표지키트(Cat. 53027, Thermo Scientific, USA)를 사용하여 FITC 표지를 수행하였고, HM06.hSRA세포와 4시간 이상 함께 두었다.

그런 다음, SRA-과발현 인간 미세아교세포주(SRA-overexpressing human microglial cell line)인 HMO6.hSRA 미세아교세포에서 과발현된 SRA이 Aβ42 흡수(uptake)에 중요한 역할을 하는지 확인하였다. 구체적으로 상기 FITC-표지 Aβ42 펩타이드 7A 내지 7C는 각각 대조군인 비형질감염 세포(HMO6)과 달리 hSRA 유전자로 형질감염된 HM06.hSRA에서 SRA가 잘 발현되고 있음을 나타내는 형광현미경 사진, RT-PCR 결과 및 웨스턴블랏 분석 결과이고, 도 7D는 HMO6.hSRA 세포는 정상대조군과 비교하였을 때 2시간 내로 주목할 만한 FITC-결합 Aβ42의 흡수(uptake) 정도를 보여준다.

정상 세포 배양 상태 하에서 4시간 동안 매 30분 마다 HMO6 세포의 세포질 내의 Aβ42 흡수의 동역학(kinetic) 측정을 위하여 IncuCyte^TMFLR live-cell 이미징 시스템(Essen Bioscience, 영국)을 사용하여 시간의 경과에 따른 형광강도(fluorescence intensity)의 변화를 측정하였다. 상기 형광강도(Fluorescence intensities)는 형광을 나타내는 세포의 수(count/mm²)로 나타내며, Aβ42 흡수(uptake)율은 하기의 수식을 사용하여 계산되었다(도 13):

Aβ42 uptake(%) = (총 FITC-양성 세포) / (세포 총 수) X 100.

도 13에서 나타난 바와 같이, 30분 후에 live-cell imaging system 하에서 Rg3-처리된 HMO6 세포(Rg3-treated HMO6 cells)에서의 Aβ42 흡수가 명확히 확인되었다.

실험예 8: 인지기능 개선 관련 실험

본 발명자들은 실제 Rg3가 치매모델 동물에서 치매증상을 개선시킬 수 있는지 확인하기 위해, 랫트를 사용하여 학습 및 기억 기능 검사를 수행하였다. 구체적으로 수동 회피 실험(PAT)은 기억 습득(memory acquisition) 및 대기(retention)를 평가하기 위해 4일 동안 연속으로 하루에 한 번씩 수행하고, 4번째 시도 1주 후 5번째 시도를 수행하였다. 암실(dark compartment)에서 2초 동안 1 mA의 전기 충격을 준 다음 점등 후 명실(light room)에서 머무른 대기 시간(latency time)을 기록하였다. 수중미로실험(Morris Water Maze Test; MWM)은 원형의 수조(지름 10 cm x 높이 40 cm)와 탈출용 지지대(platform, 지름 10cm)로 이루어진 실험장비를 준비하여, 수조에 물(온도 22±1℃)을 채웠다. 감춰진 10 cm 지름의 지지대를 수면 밑 대략 1 cm, 사분면의 가운데 고정된 위치에 두었고, 실험동물이 수조 주변의 표지물을 이용하여 지지대를 찾아가도록 훈련하였다. 만약 랫트가 수중의 지지대를 찾지 못한다면, 여러 주변의 단서에 따라 숨겨진 플랫폼을 찾을 수 있도록 하였다. 4일 연속으로 매일 5분 간격으로 3회 실험을 수행하였으며, 4일째 실험일로부터 1주일 경과 후 5번째 실험을 수행하였으며, 플랫폼으로 탈출하기 위해 소비된 평균 시간을 기록하였다. 실험에 사용한 랫트는 대조군으로 정상 랫트 및 실험군으로 도 14A는 수중미로실험(Morris Water Maze Test; MWM) 결과를 나타내며, 도 14B는 수동회피실험 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 실험결과, 도 14A 및 14B에서 나타난 바와 같이, Rg3를 투여한 랫트의 경우 Rg3가 Aβ42에 의한 뇌신경세포를 공격을 억제하였기 때문에, Rg3가 투여된 치매 모델 랫트(Aβ42)는 4-5 주에서 학습과 기억 기능을 유지하였다.

상기 각 데이터는 평균±표준편차로 표현하였고 SPSS v. 13 software (SPSS, Inc., 미국)를 사용하여 Dunnet's post-hoc test에 의한 one-way 분석을 수행하였다. P < 0.05에서 통계적 유의성을 나타냈다.

상기 결과들은 결국 인삼유래 진세노사이드 Rg3에 의한 베타아밀로이드(β-amyloid) 펩타이드의 제거능을 확인한 결과들로서, 본발명자들은 Rg3가 알츠하이머병 등의 원인물질인 뇌내에 축적된 Aβ42의 제거함으로써 치매모델 동물의 기억 및 학습능력을 유지시킬 수 있음을 확인하였으며, 그 기전이 뇌 미세아교세포(miroglia)의 macrophage scavenger receptor type A(SRA) 및 IDE 등의 발현을 촉진시킴으로써 Aβ42를 효과적으로 소거함에 따른 것임을 확인하였다. Rg3에 의한 Aβ42의 효과적인 소거는 Rg3가 미세아교세포로의 Aβ42의 흡수를 내포화과정을 통해 촉진시키고(Aβ42의 내포화의 촉진), 미세아교세포로 내포화된 Aβ42를 neprilysin(NEP) 및 insulin-degrading enzyme(IDE)의 발현 유도를 통해 신속히 분해하는(내포화된 Aβ42의 분해) 두 가지 수준에서 일어남을 확인하였다. 또한 SRA에 의한 Aβ42의 내포작용(endocytosis)는 caveloae 및 clathrin의 발현촉진과 활성화를 통해 유도됨을 확인하여 결과적으로는 Rg3 및 이를 다량으로 함유한 RgC가 알츠하이머 유발물질인 Aβ42의 효과적이고 신속한 제거를 통해 새로운 항알츠하이머 소재로 유망함을 보여준다

본 발명은 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허 청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> GANGNEUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP <120> Novel composition for treating disease by the accumulation of beta-amyloid <130> PD14-5132 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSRA-F <400> 1 agatcgttcg tccggtttct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSRA-R <400> 2 tgtttccact ccccttttcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSRB-F <400> 3 accctaacca ggaggcacac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSRB-R <400> 4 gtgaagagtc tccccctcca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSRA-F <400> 5 ttcactggat gcaatctcca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSRA-R <400> 6 acgtgcgctt gttcttcttt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSRB-F <400> 7 acaaatggaa cggactcagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSRF-R <400> 8 gtgaagagtc tccccctcca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEP-F <400> 9 atcagcctct cggtccttgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEP-R <400> 10 tggaagacag cgcaagactc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDE-F <400> 11 cagtgatccc accacggata 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDE-R <400> 12 gtgccctaga caggtttgca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9-F <400> 13 ctcctactct gcctgcacca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9-R <400> 14 aactacgacc gggacaagct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Caveolin1-F <400> 15 cagacgagct gagcgagaag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Caveolin1-R <400> 16 gacagcaagc ggtaaaacca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Caveolin2-F <400> 17 agccatgccc tctttgaaat 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Caveolin2-R <400> 18 acgctcgtac acaatggagc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clathrin-F <400> 19 aagcccttga tgccaattct 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clathrin-R <400> 20 agatcgttcg tccggtttct 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F <400> 21 ggagccaaaa gggtcatcat 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R <400> 22 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin-F <400> 23 tacagcttca ccaccacagc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin-R <400> 24 aaggaaggct ggaaaagagc 20

Claims

증포 인삼열매 추출물을 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 순차분획한 증포 인삼열매 추출물의 진세노사이드 함유 분획물, 또는 상기 진세노사이드 함유 분획물을 크로마토그래피로 분리하여 에틸아세테이트:메탄올=3:1(부피비)의 용매를 전개 용매로 한 박막크로마토그래피(TLC) 상 Rf 값 0.4 내지 0.7에 상응하는 활성 진세노사이드 농축 분획을 유효성분으로 함유하고, 상기 유효성분은 뇌의 미세아교세포(microglial cell)에서 베타아밀로이드의 내포화(endocytosys) 및 내포화된 베타아밀로이드의 분해를 촉진하는, 루위체 치매(Lewy body dementia), 근염(myositis), 및 대뇌 아밀로이드 맥관병증(cerebral amyloid angiopathy)질병로 구성되는 군으로부터 선택되는 베타아밀로이드(β-amyloid) 축적으로 인해 발병하는 치료 및 개선용 약학적 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 증포 인삼열매 추출물은 미성숙 인삼열매를 증포하여 건조한 후 이를 C1 내지 C4의 저급알코올 또는 상기 저급알코올의 수용액에 첨가하여 추출한 것인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 저급알코올은 메탄올, 에탄올, 또는 프로판올인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 증포 인삼열매는 3 내지 10회 증포한 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 증포 인삼열매 추출물의 진세노사이드 함유 분획물은 상기 증포 인삼열매 추출물에 에틸아세테이트 및 증류수로 구성된 용매를 첨가한 후 에틸아세테이트층과 증류수 층으로 분획하는 단계; 및 분획된 물층을 다시 n-부탄올로 분획한 후 n-부탄올층을 에테르를 이용하여 재결정하는 단계를 통해 제조되는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 크로마토그래피는 고정상으로 실리카 겔을, 이동상으로 물(A), 아세토니트릴(B) 및 클로로포름(C)을 섞어서 사용하는 컬럼 크로마토그래피로서, 용매비율은 C의 농도를 고정하고 점차 A의 농도를 증가시키고 그에 상응하게 B의 농도를 감소시킴으로써 수행되는, 조성물.
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