KR20210074901A

KR20210074901A - 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4를 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20210074901A
Application number: KR1020190166045A
Authority: KR
Inventors: 송규용; 안병희
Original assignee: 아레즈 주식회사
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2021-06-22
Also published as: KR102291748B9; WO2021118080A1; KR102291748B1

Abstract

본 발명은 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 진세노사이드는 근위축이 유도된 세포 또는 노화가 유도된 마우스에 처리하는 경우 근관으로의 분화 촉진 효과 및 근육조직 재생 효과가 우수하여 근육 질환 특히 근 기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환 치료에 유용하게 사용 가능하다.

Description

진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4를 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 {A pharmaceutical composition comprising ginsenoside Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 and Rh4 for preventing or treating muscular disease}

본 발명은 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4를 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

근육(muscle)은 인체에서 가장 구성양이 많은 조직으로서 인체의 기능적 능력을 유지하고 대사성 질환을 예방하기 위해서는 적정 근육량의 확보가 필수적으로 요구된다.

근육은 크게 평활근(smooth muscle), 심장근(cardiac muscle), 골격근(skeletal muscle)으로 나뉜다. 골격근은 우리 몸 전체에서 상당한 부분을 차지하면서, 골격의 움직임을 촉진시킨다. 이러한 골격근은 분열하지 않고, 다핵체인 근섬유로 이루어져 있으며, 배 형성 과정에서 만들어 진다. 배 형성 과정이 끝난 후에는, 출생 후 생장 또는 근육 분화(myogenesis) 과정에 의해 근육이 형성된다. 특히 동상이나 염좌, 타박상 등에 의해 근육이 손상되면, 근육 분화가 일어난다.

근육 분화(myogenesis) 과정은 먼저 위성세포(satellite cell)가 활성화되고, 활성화 된 위성세포가 근원세포(myoblast)로 분화된다(Morgan, J. E. et al., Int J Biochem Cell Biol., 35(8), 1151-1156, 2003). 분화된 근원세포는 분열이 일어나고, 근원세포들의 융합(fusion)이 일어나 근관(myotube)으로 발달하여 근섬유(muscle fiber)를 형성한다. 이와 같은 과정을 통해 형성된 근섬유는 다발을 이루어 최종적으로 근육을 형성하게 된다.

위성세포에서 근원세포로의 분화, 근원세포의 분열 등과 같은 근육 분화 과정 동안에 문제가 생기면 근육감소증(sarcopenia), 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy) 등과 같은 여러 가지 근육 장애 및 질환이 발생한다(Bonaldo, P. et al., Dis Model Mech., 6(1), 25-39, 2013; Wagatsuma, A. et. al., Biomed Res Int., 2014, 121254, 2014).

근육 장애 및 질환을 극복하기 위한 방법으로, 근육세포를 재생하는 방법이 최근에 보고되고 있으며, 이러한 근육세포의 재생은 근육세포 바깥부분에 존재하는 위성세포를 자극하여 위성세포가 분열을 일으켜 근육조직을 형성하는 것으로 알려져 있다. 근육세포의 재생은 손상된 근육의 수리뿐만 아니라 노화에 의한 자연적인 근육 손실에도 적용이 가능한 것으로 보고되었다(Conboy, I. M. et al., Science, 302(5650), 1575-1577, 2003).

인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 두릅나무과의 식물로 뿌리를 주로 약용부위로 사용하고 있으며, 뿌리의 잔뿌리를 제거하고 말려서 사용하거나 식물 전체를 사용하고 있다. 특히 우리나라에서는 백삼(白蔘:생 것), 홍삼(紅蔘:찐 것), 미삼(尾蔘:가는 뿌리)으로 구분하여 약효에 따라 사용하며, 민간에서는 야생삼도 장뇌와 산삼으로 구별한다. 중국에서는 인삼의 뿌리와 뿌리줄기를 말하며 원삼(재배삼), 홍삼, 산삼(야생삼)으로 구별한다. 인삼은 특이한 냄새가 있으며 맛은 달고 약간 쓰며 성질은 약간 따뜻한(甘苦微溫) 것으로 알려져 있으며, 원기를 보하고 신체허약, 권태, 피로, 식욕부진, 구토, 설사에 쓰이며 폐 기능을 도우며 진액을 생성하고 안신작용 및 신기능을 높여 주는 것으로 알려져 있다. 인삼의 약리작용으로는 자양강장작용, 면역증강작용, 중추신경계작용, 심혈관계 작용, 혈당강하작용 등 다양한 활성이 알려졌다(Choi, J. et al., PLoS One, 8(4), e59978, 2013; Alraek, T. et al., BMC Complement Altern Med., 11(87), 1-11, 2011).

진세노사이드(ginsenoside)란 인삼(ginseng)과 배당체(glycoside)의 합성어로, 다른 식물에서 발견되는 사포닌과는 다르게 특이한 화학구조와 약리효능을 가진 것으로 알려져 있다. 진세노사이드는 트리테르페노이드(triterpenoid) 계열의 담마란(dammarane) 골격에 글루코즈(glucose), 아라비노즈(arabinose), 자일로즈(xylose), 람노즈(rhamnose) 등이 결합되어 있는 중성배당체이며, 현재 약 30종 이상의 화학구조가 밝혀졌고, 화학구조의 특성에 따라 프로토파낙사디올(protopanaxadiol, PPD)계(19종), 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol, PPT)계(10종) 및 올레안(oleanane)계(1종)로 구분된다.

수삼이나 백삼에 존재하는 주요 진세노사이드는 Rg1, Re, Rf, Rh1, Rb1, Rb2, Rc, Rd 등으로, 전체 진세노사이드의 80-90% 이상을 차지한다. 반면 희귀 진세노사이드의 경우에는, 상기 다량으로 존재하는 진세노사이드로부터 당의 일부가 떨어져 나가거나 탈수반응이 일어나서 생성되는데, 인삼을 물과 알코올로 추출하는 경우에는 미량으로 존재한다.

진세노사이드의 약리 활성은 상기 다량으로 존재하는 진세노사이드로부터 기인되는 희귀 진세노사이드에 의해 나타나며, 면역력강화, 항염증, 항알러지, 항암, 혈압강하, 항콜레스테롤, 항혈전, 항노화, 항산화, 두뇌활동 촉진, 피부미용 효과 등이 주요 효능으로 알려져 있다(Kim, Y. S. et al., Arch Pharm Res., 23(5), 518-524, 2000; Shibata, S., J Korean Med Sci., 16(suppl), S28-37, 2001; Tachikawa, E. et al., Biochem Pharmacol., 66(11), 2213-2221, 2003; Tsai, S. C. et al., Chin J Physiol., 46(1), 1-7, 2003).

한편, 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4를 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물과 관련된 종래선행문헌으로써, 한국등록특허 제10-1120996호에는 진세노사이드 Rg3 및 Rg2를 포함하는 운동능력증진 및 피로회복 증진용 조성물이 개시되었으며, 한국등록특허 제10-1966117호에는 진세노사이드 Rh2 및 Rg3을 유효성분으로 포함하는 가공인삼추출물의 근육 분화 촉진용 조성물이 개시되었고, 한국등록특허 제10-2007451호, 한국등록특허 제10-1917794호, 한국공개특허 제10-2019-0108777호에는 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rh2, 진세노사이드 Rb1 및 Rb2를 포함하는 근육 재생용 조성물이 개시된 바 있다. 그러나, 본 발명과 같이 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4가 근육 질환, 특히 근 기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환에 대해 치료 효과가 있음을 언급한 이전 보고는 없다.

이에 따라 본 발명자들은 진세노사이드를 연구하는 과정에서, 상기 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드가 근육 감소는 억제시키며 근육 재생은 향상시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

한국등록특허 제10-1120996호, 진세노사이드 Rg3 및 Rg2를 포함하는 운동능력증진 및 피로회복 증진용 조성물, 2012년 02월 21일, 등록. 한국등록특허 제10-1966117호, 가공인삼추출물을 포함하는 근육 분화 촉진용 조성물, 2019년 04월 01일, 등록. 한국등록특허 제10-2007451호, 진세노사이드 Rg1을 유효성분으로 포함하는 근육 재생용 조성물, 2019년 07월 30일, 등록. 한국등록특허 제10-1917794호, 진세노사이드 Rh2를 포함하는 근육 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물, 2018년 11월 06일, 등록. 한국공개특허 제10-2019-0108777호, 진세노사이드 Rb1 및 Rb2를 유효성분으로 함유하는 근육 재생용 조성물, 2019년 09월 25일, 공개.

Alraek, T. et al., Complementary and alternative medicine for patients with chronic fatigue syndrome: a systematic review, BMC Complement Altern Med., 11(87), 1-11, 2011. Bonaldo, P. et al., Cellular and molecular mechanism of muscle atrophy, Dis Model Mech., 6(1), 25-39, 2013. Choi, J. et al., Ginseng for health care: a systematic review of randomized controlled trials in Korean literature, PLoS One, 8(4), e59978, 2013. Conboy, I. M. et al., Notch-mediated restoration of regenerative potential to aged muscle, Science, 302(5650), 1575-1577, 2003. Kim, Y. S. et al., Differential expression of protein kinase C subtypes during ginsenoside Rh2-lnduced apoptosis in SK-NBE(2) and C6Bu-1 cells, Arch Pharm Res., 23(5), 518-524, 2000. Lee, M. K. et al., Pyropia yezoensis peptide PYP1-5 protects against dexamethasone-induced muscle atrophy through the downregulation of atrogin1/MAFbx and MuRF1 in mouse C2C12 myotubes, Mol Med Rep., 15(6), 3507-3514, 2017. Morgan, J. E. et al., Muscle satellite cells, Int J Biochem Cell Biol., 35(8), 1151-1156, 2003. Nozaki, T. et al., A novel in vitro model of sarcopenia using BubR1 hypomorphic C2C12 myoblasts, Cytotechnology, 68(5), 1705-1715, 2016. Shibata, S., Chemistry and cancer preventing activities of ginseng saponins and some related triterpenoid compounds, J Korean Med Sci., 16(suppl), S28-37, 2001. Son, Y. H. et al., Dexamethasone downregulates caveolin-1 causing muscle atrophy via inhibited insulin signaling, J Endocrinol., 225(1), 27-37, 2015. Tachikawa, E. et al., In vitro inhibition of adrenal catecholamine secretion by steroidal metabolites of ginseng saponins, Biochem Pharmacol., 66(11), 2213-2221, 2003. Tsai, S. C. et al., Stimulation of the secretion of luteinizing hormone by ginsenoside-Rb1 in male rats, Chin J Physiol., 46(1), 1-7, 2003. Wagatsuma, A. et. al., Vitamin D signlaing in Myogenesis: Potential for Treatment of Sarcopenia, Biomed Res Int., 2014, 121254, 2014.

본 발명의 목적은 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 근 기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 바람직하게는 근 기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

보다 더 바람직하게는 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4가 모두 혼합된 혼합물(RGX 365)을 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용하며, 이때 상기 혼합물은 진세노사이드 Rg2((S)-Rg2 및 (R)-Rg2) 30~40중량%, 진세노사이드 Rg4 30~40중량%, 진세노사이드 Rg6 13~23중량%, 진세노사이드 Rh1((S)-Rh1 및 (R)-Rh1) 1~5중량% 및 진세노사이드 Rh4 2.5~5중량%가 포함된 것을 사용하는 것이 근육 질환의 예방 또는 치료에 효과적이다.

상기 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드는 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있는 방법이라면 제한 없이 본 발명에 포함되나, 진세노사이드 Re 100중량부에 증류수 100~300중량부를 혼합한 다음 4~8시간 동안, 110~140℃의 온도범위 및 0.11~0.16㎫의 압력 조건에서 고온 고압으로 처리하고 컬럼 분리하여 얻는 것이 바람직하다.

상기 근육 질환은 근 기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환에 관한 것으로, 보다 바람직하게는 근육감소증(sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy) 및 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. “약학적으로 허용 가능”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 또한, 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로즈, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아라비아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산프로필, 탈크, 스테아르산마그네슘 및 광물유를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 안정화제, 결합제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 진세노사이드에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 미결정셀룰로오스, 수크로스 또는 락토오스, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 히프로멜로오스 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아르산마그네슘, 탈크 같은 활택제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 유동파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 진세노사이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 멸균되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질과 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다.

상기 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여시간, 투여경로, 약물의 흡수, 분포 및 배설률, 사용되는 다른 약물의 종류 및 처방자의 판단 등에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품은 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 또는 가공한 식품을 지칭하는 것으로, 예를 들어 건강보조식품, 기능성 식품, 영양제, 보조제 등을 모두 포함한다.

상기 진세노사이드는 전체 건강기능식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001중량% 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001중량% 내지 40중량%, 가장 바람직하게는 0.001중량% 내지 30중량%로 하여 첨가될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 및 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명 진세노사이드를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다.

도 1은 근원세포에서의 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4와 이를 모두 포함하는 혼합물(RGX 365) 처리에 따른 세포 생존율을 확인한 그래프이다.
도 2A는 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365)의 농도별 처리에 따른 근관의 분화 정도를 미오신 발현양으로 확인한 형광현미경 측정 결과이며, 도 2B는 근관의 수를 지름 크기별로 확인한 결과이다.
도 3A는 덱사메타손으로 근위축이 유도된 근관의 분화 정도를 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4와 이를 모두 포함하는 혼합물(RGX 365)의 처리에 따른 미오신 발현양으로 확인한 형광현미경 측정 결과이며, 도 3B는 근관의 수를 지름 크기별로 확인한 결과이다.
도 4는 노화마우스에 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4와 이를 모두 포함하는 혼합물(RGX 365)의 근육주사 및 경구투여에 따른 근육조직 손상 정도를 H&E 염색으로 확인한 결과이다.
도 5는 노화마우스에 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4와 이를 모두 포함하는 혼합물(RGX 365)의 근육주사 및 경구투여에 따른 근섬유 단면적(C.S.A.) 변화를 측정한 결과이다.
도 6A은 노화마우스에 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4와 이를 모두 포함하는 혼합물(RGX 365)의 근육주사 및 경구투여에 따른 악력 변화를 측정한 결과이며, 도 6B는 전체 근육 무게 변화를 측정한 결과이다.
도 7A 내지 7D는 노화마우스에 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365)의 근육주사 및 경구투여에 따른 근육조직에서의 Atrogin-1, Murf-1, MyoD, MyoG 발현량 변화를 확인한 결과이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4와 이를 모두 포함하는 혼합물(RGX 365) 제조>

진세노사이드 Re 30.4g에 증류수 60㎖를 첨가하여 121℃, 0.13MPa 조건으로 6시간 동안 처리한 다음 컬럼 분리하였다. 35~70% 발효주정 용매를 사용하여 얻은 분획물을 감압농축함으로써 본 발명 진세노사이드 Rg2 30~40중량%, 진세노사이드 Rg4 30~40중량%, 진세노사이드 Rg6 13~23중량%, 진세노사이드 Rh1 1~5중량% 및 진세노사이드 Rh4 2.5~5중량%가 포함된 혼합물(RGX 365)을 얻었다. 또한 이를 분리 정제하여 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4를 얻었다.

<실험예 1. 세포 배양>

C2Cl2는 C3H종의 생쥐에서 얻은 근원세포주로서, 근세포 분화 연구에 널리 사용되고 있다. 정상적인 세포 배양용 배지(GM, growth media)는 10% 어린 소혈청(fetal bovine serum), 50U/㎖ 페니실린 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Invitrogen, OR, USA) 배지을 사용하였으며, 분화용 배지(DM, differentiation media)는 2% 말 혈청이 포함된 DMEM을 사용하였다. 세포배양에 사용된 인큐베이터의 설정은 온도 37℃, CO₂ 농도 5%로 유지하였다.

<실험예 2. 세포 생존율 확인>

세포 생존율을 확인하기 위해 MTT 시험법을 수행하였다. 먼저, 상기 실험예 1의 조건으로 배양한 C2C12 세포를 96웰 조직배양 플레이트(BD Falcon, NJ, USA)에 2000세포/웰의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4는 20㎍/㎖으로, 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365)은 농도별(0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20㎍/㎖) 처리한 다음 48시간 동안 배양하였고, 상기 배양 세포에 MTT 용액(혈청이 들어 있지 않은 배지로 희석시킴)을 웰 당 200㎕씩 분주하였다. 이후 CO₂인큐베이터에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 배지를 제거하고 50㎕의 DMSO를 더하여 약 10분 동안 교반기에서 반응시켰다. 상기 반응액을 마이크로플레이트 리더기(microplate reader, TECAN, Mannedorf, Switzerland)로 570㎚ 파장에서의 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 구한 다음, 이를 도 1에 나타내었다.

도 1을 살펴보면, 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4와 이를 모두 포함하는 혼합물(RGX 365)을 처리한 C2C12 마우스 근원세포의 생존율은 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비슷하였다. 따라서, 본 발명 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4와 이를 모두 포함하는 혼합물(RGX 365)은 세포 독성을 나타내지 않는 조성물임을 알 수 있었다.

<실험예 3. 근육 분화 촉진 효과 확인>

근육 분화 과정은 분화된 근원세포(myoblast)가 분열이 일어나고 근원세포들 간의 융합이 일어나 근관(myotube)으로 발달하여 근섬유(muscle fiber)를 형성한다. 형성된 근섬유는 다발을 이루어 최종적으로 근육(muscle)을 형성한다.

따라서, 본 발명 조성물의 근육 분화 촉진 효과를 확인하고자, 근관으로의 분화 활성을 확인하였다. 근관으로의 분화된 정도는 근육의 주요 구조단백질인 미오신(myosin)의 발현된 양과 근관의 크기를 측정함으로써 확인하였다.

먼저, 상기 실험예 1의 조건으로 배양한 C2C12 세포를 6웰 조직배양 플레이트(BD Falcon, NJ, USA)에 30000세포 /웰의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포가 90% 정도 찰 때까지 배양한 상태에서 2% 말혈청(HS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco) 배지를 넣고 3일 동안 근관으로 분화를 유도한 후, 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365)을 농도별(1.25, 2.5, 5, 10㎍/㎖)로 처리한 배지에서 2일 동안 더 배양하였다.

이후 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 2% BSA가 포함된 1X PBS로 블로킹하였다. 상기 세포에 MyHC(Anti-myosin heavy chain) 항체를 12시간 동안 결합시키고, 1X PBS로 3회 세척한 후 항-마우스 2차 항체(형광 물질(Alexa 488)이 결합)가 희석된 PBS를 더하여 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 상기 반응물을 1X PBS로 3회 세척한 후 덮개 유리를 올리고 형광현미경으로 사진을 찍어 도 2A에 분석 결과를 나타내었다. 또한, 상기 과정에서 형광으로 이미징한 근관 사진을 이용하여 NIH Image J software로 단면적(cross-section areas, CSAs)을 분석하였고, 지름 크기에 따른 근관의 수를 분석하여 도 2B에 나타내었다.

도 2의 결과를 살펴보면, 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365)을 처리한 그룹은 대조군(DMSO)에 비해 미오신의 발현이 현저하게 증가되었고, 분화된 근관의 지름 크기가 유의적으로 커졌음을 확인할 수 있었다.

<실험예 4. 근위축 억제 효과 확인>

덱사메타손을 분화된 근관에 1일 동안 혈청이 없는 배지에 희석하여 처리하면 근위축이 유도되는 것으로 알려진 바 있다(Son, Y. H. et al., J Endocrinol., 225(1), 27-37, 2015; Lee, M. K. et al., Mol Med Rep., 15(6), 3507-3514, 2017; Nozaki, T. et al., Cytotechnology, 68(5), 1705-1715, 2016).

이에, 본 발명에서는 덱사메타손에 의해 근위축이 유도된 근관에서의 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6 및 Rh1 혼합물(RGX 365)의 처리에 따른 미오신의 발현된 양과 근관의 크기 변화를 측정함으로써 근위축 억제 효과 여부를 확인하였다.

먼저, 상기 실험예 1의 조건으로 배양한 C2C12 세포를 6웰 조직배양 플레이트에 30000세포/웰의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포가 90% 정도 찰 때까지 배양한 상태에서 2% 말혈청(HS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 함유된 DMEM 배지를 넣고 5일 동안 근관세포로 분화를 유도한 후, 덱사메타손(50μM)을 혈청이 없는 DMEM 배지에 희석하여 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후 1X PBS로 3회 세척한 다음, 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 또는 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365)이 10㎍/㎖의 농도로 함유된 DMEM 배지에서 2일 동안 더 배양하였다.

이후 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 2% BSA가 포함된 1X PBS로 블로킹하였다. 상기 세포에 MyHC 항체를 12시간 동안 결합시키고, 1X PBS로 3회 세척한 후 항-마우스 2차 항체(형광 물질(Alexa 488)이 결합)가 희석된 PBS를 더하여 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 상기 반응물을 1X PBS로 3회 세척한 후 덮개 유리를 올리고 형광현미경으로 사진을 찍어 도 3A에 분석 결과를 나타내었다. 또한, 상기 과정에서 형광으로 이미징한 근관 사진을 이용하여 NIH Image J software로 단면적(cross-section areas, CSAs)을 분석하였고, 지름 크기에 따른 근관의 수를 분석하여 도 3B에 나타내었다.

도 3을 살펴보면, 덱사메타손과 본 발명 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 또는 이를 모두 포함하는 혼합물(RGX 365)을 처리한 군의 경우에는 덱사메타손 단독 처리군에 비해 미오신의 발현과 분화된 근관의 지름 크기가 현저하게 향상되었음을 확인할 수 있었다. 즉 덱사메타손의 처리에 따른 근관에서의 근위축은 본 발명 진세노사이드를 처리함에 따라 개선됨을 알 수 있었다.

이러한 결과로부터 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4와 이를 모두 포함하는 혼합물(RGX 365)은 근 기능 저하로 인한 근육 질환 치료에 유용한 조성물임을 알 수 있었고, 특히 단일 진세노사이드보다는 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365)을 처리하는 것이 보다 더 효과적임을 알 수 있었다.

<실험예 5. 노화마우스에서의 근육 감소 억제 효과 확인>

실험예 5-1. 근육조직 재생 효과 확인

실험동물은 생후 2개월령과 22-23개월령의 C57BL/6 수컷 마우스를 이용하였다. 체중이 비슷한 것끼리 10마리씩 배정하여 아무것도 투여하지 않은 2개월령 마우스, 동량의 용매를 식염수에 희석하여 투여한 대조군(22-23개월령 마우스), 단일 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4를 투여한 투여군(22-23개월령 마우스) 및 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365)을 투여한 투여군(22-23개월령 마우스)으로 분류하여 실험에 사용하였다.

또한 상기 실험군 마우스에 투여되는 본 발명 조성물은 식염수에 희석하여 0.5㎎/㎖이 되도록 조제한 다음 30일 동안 2일에 한 번씩 근육주사로 투여하거나, 90일 동안 매일 경구 투여하였다.

투여가 끝난 후 근육조직을 분리하여 OCT 컴파운드가 들어있는 틀(mould)에 분리한 조직을 넣고 액체질소를 이용하여 동결건조한 다음, 마이크로톰 장비를 이용하여 근육조직을 10㎛로 절단(section)하였다. 상기 절단된 근육조직(Tibialis anterior muscle, TA)을 현미경용 슬라이드(Microscope slide)에 부착시킨 다음 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 상기 고정된 시료는 H&E 염색(hematoxylin eosin staining)하고 디지털 카메라(IMTcam3_Plus, P/NUP900310A)로 이미징하여 도 4에 나타내었다.

또한, 상기 이미징한 결과로부터 NIH Image J software를 사용하여 근섬유(muscle fiber)의 크기를 분석하였고, 각 투여군 별로 단면적(cross-section areas, CSAs)의 평균값을 계산한 다음 이를 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5를 살펴보면, 노화마우스에 경구투여 또는 근육주사로 본 발명 조성물을 각각 투여하는 경우 대조군(용매만 처리한 노화마우스)에 비해 근육 손상 정도는 감소하였으며, 근섬유의 크기는 2개월령의 어린 마우스 수준만큼 증가하여, 노화에 의한 근육감소증 치료에 효과적인 조성물임을 알 수 있었다.

실험예 5-2. 악력(grip strength) 측정 및 근육 무게 변화량 확인

상기 실험예 5-1에서 경구투여 또는 근육주사가 끝나고 조직 적출을 위해 희생하기 전, 악력(grip strength) 측정 및 근육 무게를 측정하였다.

악력 측정은 BIOSEB사의 마우스용 악력측정기로 측정하였으며, 힘의 세기를 모니터링 할 수 있는 계기판에 부착된 철망 위에 마우스를 올려놓고 꼬리를 잡아 아래쪽으로 끌어내리면서 마우스가 철망을 잡는 힘을 측정하였다. 연속적으로 5회 반복하여 나타난 평균값을 사용하여 도 6A에 나타내었다.

또한, 악력 테스트가 끝난 후 마우스의 뒷다리 전체 근육을 분리하여 무게 측정 결과를 도 6B에 나타내었다.

도 6을 참고하면, 노화마우스에 경구투여 또는 근육주사로 본 발명 조성물을 각각 투여하면 대조군(용매만 처리한 노화마우스)에 비해, 악력 및 전체 근육 무게가 유의적으로 증가하였음을 알 수 있었다.

특히, 단일 진세노사이드를 처리하는 것보다 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4를 모두 포함하는 혼합물(RGX 365)을 처리하는 것이 노화마우스의 악력 및 전체 근육 무게량을 증가시키는 효과가 우수하여, 노화에 의한 근육감소증 치료에 보다 효과적인 조성물임을 알 수 있었다.

실험예 5-3. 근육 분해 유도 인자(Atrogin-1, Murf-1)와 근육 재생 마커(MyoD, MyoG) 발현량 변화 확인

상기 실험예 5-1의 절단된 근육조직(Tibialis anterior muscle, TA)에서 total RNA를 분리하고 cDNA합성한 다음, 단백질 특이적인 프라이머를 사용하여 근육 분화 마커들의 mRNA 발현 정도를 real time PCR로 확인하여 도 7에 나타내었다. 상기 과정에서 사용한 프라이머의 구체적인 염기서열은 다음과 같다.

Mouse atrogin-1 sense 5´ GCAAACACTGCCACATTCTCTC 3´

Mouse atrogin-1 anti-sense 3´ CTTGAGGGGAAAGTGAGACG 5´

Mouse MuRF-1 sense 5´ TGACCACAGAGGGTAAAG 3´

Mouse MuRF-1 anti-sense 3´ TGTCTCACTCATCTCCTTCTTC 5´

Mouse MyoD sense 5´ CTTCTATCGCCGCCACTC 3´

Mouse MyoD anti-sense 3´ AAGTCGTCTGCTGTCTCAA 5´

Mouse MyoG sense 5´ CCAACCCAGGAGATCATTTG 3´

Mouse MyoG anti-sense 3´ ACGATGGACGTAAGGGAGTG 5´

도 7에서 보여주듯이, 대조군인 노화마우스(old)에서는 근 단백질 분해 활성을 지닌 Atrogin-1 및 Murf-1의 발현이 증가한 반면, 본 발명 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365)을 노화마우스에 경구투여 또는 근육주사로 투여하는 경우에는 생후 2개월령 마우스(young)와 유사한 정도로 Atrogin-1 및 Murf-1의 발현이 감소하여 근 단백질 분해가 촉진되지 않았음을 알 수 있었다.

또한, 근육 분화 촉진 활성을 지닌 MyoD 및 MyoG의 발현은 본 발명 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365)을 투여에 의해 증가함을 확인할 수 있었다.

이를 통해, 본 발명 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365)이 노화에 의해 증가 또는 감소된 근육 조절 인자들을 조절함으로써 손상된 근육을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

<제제예 1. 정제의 제조>

본 발명 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365) 20g을 각각 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

<제제예 2. 캡슐제의 제조>

본 발명 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365) 100㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 3. 주사제의 제조>

본 발명 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365) 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

<제제예 4. 건강기능식품의 제조>

본 발명 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365) 20g, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산 마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎을 섞어 과립으로 제조하였으나, 용도에 따라 다양한 제형으로 변형시켜 제조할 수 있다. 또한, 상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 제조할 수 있다.

<제제예 5. 건강기능성 음료의 제조>

본 발명 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4 혼합물(RGX 365) 1g, 구연산 0.1g, 프락토올리고당 100g, 정제수 900g을 섞어 통상의 음료 제조방법에 따라 교반, 가열, 여과, 살균, 냉장하여 음료를 제조하였다.

Claims

진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 근육 질환은 근육감소증(sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy) 및 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
진세노사이드 Rg2 30~40중량%, 진세노사이드 Rg4 30~40중량%, 진세노사이드 Rg6 13~23중량%, 진세노사이드 Rh1 1~5중량% 및 진세노사이드 Rh4 2.5~5중량%가 포함된 혼합물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 근육 질환은 근육감소증(sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy) 및 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh1 및 Rh4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제5항에 있어서,
상기 근육 질환은 근육감소증(sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy) 및 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 근육 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
진세노사이드 Rg2 30~40중량%, 진세노사이드 Rg4 30~40중량%, 진세노사이드 Rg6 13~23중량%, 진세노사이드 Rh1 1~5중량% 및 진세노사이드 Rh4 2.5~5중량%가 포함된 혼합물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제7항에 있어서,
상기 근육 질환은 근육감소증(sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy) 및 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 근육 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.