KR102533128B1 - Nell-1을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물 - Google Patents

Nell-1을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 골분화 촉진 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, Nell-1을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물은 줄기세포 스페로이드의 형태를 유지하면서 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키는 효과가 있으므로, 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키고자 할 때 본 발명의 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물이 유용하게 이용될 수 있다.

Description

Nell-1을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물{Composition for Facilitating the Osteogenic Differentiation of Stem Cell Spheroids Comprising Nell-1 as an Effective Ingredient}
본 발명은 Nell-1을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물 및 이를 이용한 골분화 촉진 방법에 관한 것이다.
Nell-1은 골 연골 계통에 관여하는 세포를 우선적으로 표적으로 삼는 것으로 여겨지는 강력한 성장인자이며(Zhai, Y., et al., 2019, Oncol Rep 41: 1817-1826), 분비된 상기 골유도성 당단백질은 두개골의 골화를 포함하여 골격 골화를 가변성으로 제어하는 것으로 보고되었다(Meyers, C. A., et al., 2019, J Orthop 16: 175-178; Wang, J., et al., 2017, Cell Physiol Biochem 41: 484-500; James, A. W., et al., 2015, Nat Commun 6: 7362). 또한, Nell-1-반가불충분성의(haploinsufficient) 마우스는 정상적인 골격 발달을 보였지만, 골아 세포 대비 골세포 비율의 감소와 골 취약성 증가를 특징으로 하는 연령-관련 골다공증을 겪는 것으로 알려져 있다(James, A. W., et al., 2015, Nat Commun 6: 7362). Nell-1은 골 형성 및 골 재생을 통해 골 결손의 치유에 적용될 수 있다(Huang, X., 2019, J Cell Mol Med 23: 8432-8441). Nell-1이 결핍된 두개골 신경 능선 세포(Nell-1-deficient cranial neural crest cells)는 세포 증식과 골 분화에서 상당한 감소를 보여 주었다(Chen, X., 2020, Cell Death Differ 27: 1415-1430). Nell-1은 FDA에 의해 승인된 골형성 단백질-2와 비슷한 골형성 효능을 가지는 것으로 나타났다(Li, C., 2019, J Dent Res 98: 1458-1468).
최근 몇 년 동안 줄기세포 연구는 큰 관심을 불러 일으켰고 많은 연구가 이루어지고 있다. 줄기세포는 다양한 조직으로 분화할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 인자를 분비하며, 파라크라인 효과(paracrine effect)라고 불리우는 이 기능이 주변 조직에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다(Lee, H., et al., 2018. Adv Clin Exp Med 27: 971-977). 최근에는 줄기세포가 조직재생에 적용되고 있다(Kang, S.H., et al., 2019. J Periodontal Implant Sci 49: 258-267). 특히, 3차원 스페로이드를 적용하여 세포 생존, 줄기세포능, 혈관신생 특성 및 항염증 효과의 개선을 통해 치료 잠재력을 전반적으로 향상시킬 수 있다(Petrenko, Y., et al., 2017, Stem Cell Res Ther 8: 94).
골절이나 종양제거 후 형성된 국소적인 골 조직 결손부의 치료나 골 관절염에 대한 인공 관절 삽입 치료 시, 골 조직 이식에 대한 수요는 매우 크다. 그러나, 골 조직 이식은 임상적 이용에 있어 한계점과 단점을 가지고 있어서, 골 조직 대체물에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 줄기세포를 이용하여 골 손실의 치료를 위한 재생의학 관점의 연구도 활발히 진행되고 있다. 이와 관련하여 골 결손과 관련된 질환의 세포 치료제로서 조골세포(osteoblast)의 분화촉진과 활성화등이 연구되고 있다.
특히, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)로부터 특정 단백질 또는 유전자를 이용하여 조골세포로 분화시키는 기술들이 보고되고 있다. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 중간엽 계통으로 분화할 수 있는 다능성 세포이며 다양한 조직에서 분리할 수 있으며 인 비트로(in vitro)에서 쉽게 배양할 수 있다(Castro-Manrreza, M.E., 2015, Journal of immunology research 394917-394917).
종래의 연구에 따르면, 치은(gingiva) 유래 중간엽 줄기세포는 임상적으로 뼈 재건과 같은 골재생에 있어서, 줄기세포 기반 치료에 새로운 공급원이 될 수 있다. 또한, 인간 치은(gingiva) 유래 중간엽 줄기세포는 재생 의학에서 세포 치료를 위한 골수(bone marrow) 유래 중간엽 줄기세포보다 우수함이 밝혀졌다(Tomar GB, Srivastava RK, Gupta N, Barhanpurkar AP, Pote ST, Jhaveri HM, et al. Human gingiva-derived mesenchymal stem cells are superior to bone marrow-derived mesenchymal stem cells for cell therapy in regenerative medicine. Biochem Biophys Res Commun 2010;393:377-383.). 줄기세포의 다른 공급원과 마찬가지로 치은 유래 중간엽 줄기세포에서 면역 조절 성질이 발견되었다. 치은 조직으로부터 유래된 줄기세포는 격리의 용이성, 접근 가능한 조직 공급원 및 빠른 생체 외 팽창을 포함한 몇 가지 장점을 가지고 있다.
지금까지 마이크로 웰을 이용한 3차원 배양을 통한, 치은 유래 줄기세포(gingiva-derived stem cells)로 구성되는 세포 스페로이드에 대한 Nell-1의 효과에 대해서 보고되지 않았다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
한국 등록특허 10-1565856 (등록일자: 2015. 10. 29)
본 발명자들은 치은(gingiva) 유래 줄기세포 스페로이드의 골분화에 Nell-1을 사용할 수 있는지 연구하였고, Nell-1을 골분화 유도 배지에 첨가할 경우에 치은 유래 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진하는 것으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 Nell-1을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드(spheroid)의 골분화 촉진용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 Nell-1을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 분리된 줄기세포에 Nell-1을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 골분화 촉진용 조성물로 분화된 조골세포를 유효성분으로 포함하는 골결손증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Nell-1을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드(spheroid)의 골분화 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 유효성분인“Nell-1”은 전-조골세포(pre-osteoblast)의 골분화를 향상시키는 것으로 보고되었고(Shen, M. J., et al., 2018, Cell Physiol Biochem 50: 1522-1534), 골밀도를 증가시키는 물질로 알려져 있다(Wang, B., et al., 2018, Biomed Mater Eng 29: 757-771).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포는 성체줄기세포 및 각종 분화 세포를 초기화시킨 유도 다능성 줄기세포(ips 세포)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 성체줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 치은(gingiva) 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 용어 "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 유도 다능성 줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.
본 발명에서 상기 용어 "유도 다능성 줄기세포"는 분화된 세포들이 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서, 역분화 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells)이라고도 한다.
본 발명에서 상기 용어 "성체줄기세포"는 인간을 포함한 포유동물의 조직에서 분리해 낸, 분화되기 직전의 원시세포로서, 무한정으로 증식할 수 있는 능력 및 여러 가지 형태의 세포(예를 들면, 지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포등)로 분화할 수 있는 줄기세포이다. 성체줄기세포는 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell), 재생의학의 재료로 각광 받고 있는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 및 신경 줄기세포(neural stem cell) 등이 있다.
본 발명에서 상기 용어 "분화"는 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달하여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 의미한다. 상기 분화는 주로 다세포 생물이 단일 접합자(zygote)에서 복잡한 조직을 형성하는 과정 중에 일어나거나, 성인이 되었을 때 손상된 조직을 복구하는 경우 성체줄기세포가 특정한 세포로 분화하게 된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 골분화는 줄기세포가 조골세포로 분화하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물에는 상기 Nell-1이 0.0001 내지 2000 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.0005 내지 1000 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 500 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 Nell-1을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지를 제공한다.
상기 Nell-1은 줄기세포 배양용 배지에 일 성분으로 포함될 수 있다.
상기 줄기세포 배양용 배지는 줄기세포의 배양에 통상적으로 이용되는 모든 배지를 포함하고, 예를 들어 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, MEM(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)등과 같은 기본 배지, 또는 골분화를 유도할 수 있는 성분이 함유된 배지일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 배양용 배지로 배양되는 줄기세포는 성체줄기세포 및 각종 분화 세포를 초기화시킨 유도 다능성 줄기세포(ips 세포)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 성체줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 치은(gingiva) 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 배양용 배지에 포함되는 Nell-1이 0.0001 내지 2000 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.0005 내지 1000 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 500 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 분리된 줄기세포에 Nell-1을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법을 제공한다.
본 발명의 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법은 분리된 줄기세포에 Nell-1을 처리하는 단계 및 상기 Nell-1이 처리된, 분리된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다.
상기 골분화 촉진의 대상이 되는 줄기세포는 인 비트로(in vitro) 상태일 수 있고, 상기 Nell-1은 상기 줄기세포 배양용 배지의 형태로 줄기세포에 처리될 수 있다. 또한, 골분화를 촉진하기 위하여 줄기세포는 3차원 지지체에서 배양될 수 있다. 상기 지지체를 구성하는 성분은 생체적합한 물질을 사용할 수 있고, 지지체에서 배양되어 분화된 조골세포는 지지체로부터 별도로 분리하지 않고 골질환 치료를 위하여 지지체에 부착된 상태로 생체에 이식될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법으로 배양되는 줄기세포는 성체줄기세포 및 각종 분화 세포를 초기화시킨 유도 다능성 줄기세포(ips 세포)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 성체줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 치은(gingiva) 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법에 포함되는 Nell-1이 0.0001 내지 2000 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.0005 내지 1000 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 500 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법에서 상기 줄기세포 스페로이드는 오목한 표면에서 배양하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물로 분화된 조골세포를 유효성분으로 포함하는 골결손증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 분화된 조골세포는 각종 세포 치료에 이용될 수 있다. 분화된 조골세포는 콜라겐이나 히드록시아파타이트 스캐폴드 등 다양한 생체보조제와 혼합하여 외과수술로 골조직에 이식할 수 있다. 본 발명의 치료용 조성물은 상기 분화된 조골세포 외에 보조성분으로서 콜라겐이나 골지지체 등을 더 함유할 수 있다. 본 발명의 치료용 조성물 중 분화된 조골세포는 질병의 유형, 투여경로, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 수를 조절할 수 있고, 바람직하게는 평균 성인의 경우 1 ~ 5×107 cell/cm3 스캐폴드를 투여한다. 또한, 본 발명의 치료용 조성물은 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 치료용 조성물은 골질환 치료를 위해 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 용어 "골질환"이란 골분화 및 골재생을 필요로 하는 골에 관련된 질환을 의미하며, 골절등 외상성 골손상 및 수술 후 발생한 골결손을 포함한다.
본 발명의 효과 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물 및 이를 이용한 골분화 촉진 방법에 관한 것이다.
(ⅱ) 본 발명의 Nell-1을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물은 줄기세포 스페로이드의 형태를 유지하면서 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키는 효과가 있다.
(ⅲ) 본 발명의 골분화 촉진용 조성물은 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키고자 할 때 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 줄기세포 스페로이드 배양 및 분석방법에 대한 개략도이다.
도 2는 배양 1, 3 및 7 일자의 줄기세포 스페로이드의 형태를 보여주는 사진이며, 스케일바는 200μm을 나타낸다(원래 배율 x 100).
도 3은 줄기세포 스페로이드에 Nell-1을 최종농도 0, 1, 10, 100 및 500 ng/ml로 처리한 후, 배양 1, 3 및 7 일자에 세포 스페로이드의 직경(diameter)을 분석한 결과이다.
도 4a는 배양 1 일자의 줄기세포 스페로이드의 Live/Dead 세포의 중앙(central) 및 병합(merged) 이미지를 나타낸다. 스케일바는 100 μm을 나타낸다(원래 배율 x 200).
도 4b는 배양 3 일자의 줄기세포 스페로이드의 Live/Dead 세포의 중앙(central) 및 병합(merged) 이미지를 나타낸다. 스케일바는 100 μm을 나타낸다(원래 배율 x 200).
도 4c는 배양 7 일자의 줄기세포 스페로이드의 Live/Dead 세포의 중앙(central) 및 병합(merged) 이미지를 나타낸다. 스케일바는 100 μm을 나타낸다(원래 배율 x 200).
도 4d는 배양 1, 3 및 7 일자의 CCK-8(Cell Counting Kit-8) 분석에 의한 세포 생존도를 나타내는 그래프이다.
도 5는 배양 7 및 14 일자의 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase)의 활성을 나타내는 그래프이다.
* 배양 7 일자에서, Nell-1을 0 ng/ml 처리한 그룹과 비교하여 통계적 유의차를 나타냈다(P < 0.05).
도 6은 배양 7 및 14 일자의 알리자린 레드 S 염색의 정량분석 결과를 나타내는 그래프이다.
* 배양 7 일자에서, Nell-1을 0 ng/ml 처리한 그룹과 비교하여 통계적 유의차를 나타냈다(P < 0.05).
** 배양 7 일자에서, Nell-1을 1 및 10 ng/ml 처리한 그룹과 비교하여 통계적 유의차를 나타냈다(P < 0.05).
# 배양 14 일자에서, Nell-1을 0 ng/ml 처리한 그룹과 비교하여 통계적 유의차를 나타냈다(P < 0.05).
## 배양 14 일자에서, Nell-1을 1 ng/ml 처리한 그룹과 비교하여 통계적 유의차를 나타냈다(P < 0.05).
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
실시예
실험 재료 및 방법
1. 치은 유래 줄기세포의 분리 및 배양
가톨릭대학교 의과대학 서울성모병원의 임상시험연구심사위원회에서 승인받아, 치주치료 진행 중인 건강한 환자로부터 건강한 치은(gingiva) 조직을 얻었다. 상기 치은 조직은 즉시 100 U/㎖ 페니실린(시그마 알드리치, 미국) 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(시그마 알드리치, 미국)이 포함된 살균된 인산완충식염수(PBS, Welgene)에 넣어 4℃에 두었다. 상기 치은 조직은 탈-상피화(de-epithelialize)하여 분쇄하였고, 콜라게나아제 Ⅳ(시그마 알드리치)로 소화시킨 후, 5% CO2의 습윤 배양기에서 37℃로 배양하였다. 배양 24 시간 후, 부착되지 않은 세포는 씻어내고, α-MEM 배지를 기본으로 하는 배지로 교체하였다. 상기 배지는 15% 소태아혈청(fetal bovine serum, Gibco), 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 200 mM L-글루타민(시그마 알드리치, 미국) 및 10 mM 아스코르브산 2-인산염(시그마 알드리치, 미국)를 포함한다. 그 이후, 2 ~ 3일 마다 배지를 갈아줌으로써, 인간 치은(gingiva) 유래의 성체줄기세포를 확립하였다.
상기 세포는 콜로니-형성 능력, 부착능(plastic adherence) 및 다양한 계통으로 분화능(골형성, 지방형성, 연골형성)과 같은 줄기세포 특성을 나타내었고, 또한 상기세포는 유동 세포 분석법에 의해 CD44, CD73, CD90 및 CD105는 발현하지만, CD14, CD45, CD34 및 CD19는 발현하지 않는 것이 확인되었다.
2. 치은 유래 줄기세포를 이용한 세포 스페로이드의 형성
도 1은 본 발명에 따른 줄기세포 스페로이드 배양 및 분석방법의 개요를 보여준다. 시판되는 오목한 마이크로 웰(Cat. No. H389600, StemFIT 3D; MicroFIT, 한국)을 사용하여 줄기세포 스페로이드를 형성시켰다. 각 웰에 1 x 106 개의 세포를 올려놓고 상기 세포의 반응을 평가했다. 본 발명자들은 Nell-1을 최종농도 0, 1, 10, 100 및 500 ng/ml이 되도록 치은 유래 줄기세포로 형성된세포 스페로이드에 처리하였다. 역상 현미경(inverted microscope, Leica DM IRM, Leica Microsystems, Wetzlar, 독일)을 사용하여 줄기세포 스페로이드의 형태학적 변화를 관찰하였다. 스페로이드 직경의 변화는 배양 1, 3 및 7 일자에 평가되었다. 스페로이드의 직경은 선행문헌을 참조하여 측정하였다(Lee, S. I., et al., 2016, Biomed Rep 4: 97-101).
3. 세포 생존도 측정
본 발명자들은 골분화 유도 배지에서 줄기세포 스페로이드를 배양하였다.
본 발명자들은 배양 1, 3 및 7 일자에 줄기세포 스페로이드의 정성분석을 위해, 원형질막 완전성(plasma membrane integrity) 및 에스테라제 활성(esterase activity)를 기반으로 하는, 시판되는 2 색(two-color) 분석키트(Live/Dead Kit assay, Molecular Probes, Eugene, OR, 미국)를 사용하였다. Live/Dead Kit 분석에서는 살아있는 세포는 강한 녹색 형광을 나타내고, 죽은 세포는 적색 형광을 나타낸다. 또한 수용성 테트라졸륨염(tetrazolium salt)을 기반으로 하는, 분석키트(Cell Counting Kit-8, Dojindo, Tokyo, 일본)를 사용하여 정량적 세포 생존도 분석을 수행하였다.
4. 골분화능 평가
줄기세포 스페로이드의 골분화능을 평가하기 위해, 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase, ALP) 활성 분석 및 알리자린 레드 S(Alizarin Red S) 염색에 의한 칼슘 침착 평가를 수행하였다. 골분화 유도 배지와 함께 배양 플레이트상에서 성장한 세포 스페로이드를 배양 7 및 14 일자에 수득하여 분석하였다.
알칼리 포스파타제 활성 수준의 평가를 위해 시판되는 키트(Cat. No. (K412-500, BioVision, Inc., Milpitas, 미국)를 사용하였다. 흡광도는 405 nm에서 마이크로 플레이트 리더(BioTek, Winooski, VT, 미국)를 사용하여 측정되었다.
골광물화(무기질 결정화) 평가를 위해 세포 스페로이드의 알리자린 레드 S(Alizarin Red S) 염색이 수행되었다. 안트라퀴논(anthraquinone) 유도체인, 알리자린 레드는 칼슘과 같은 무기질 결정에 결합된다. 조골세포는 무기질 결정을 형성하므로 알리자린 레드 염색 정도에 비례하여 조골세포로의 분화 정도를 알 수 있다. 본 발명자들은 Nell-1 처리에 의해 줄기세포가 조골세포로 분화하는지를 확인하기 위하여 알리자린 레드 S 염색을 실시하였다. 줄기세포 스페로이드를 세척 및 고정 절차 후 실온에서 30 분 동안 알리자린 레드 S(Alizarin Red S)로 염색하였다. 결합된 염료의 정량분석은 이후 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride) 추출에 의해 수행되었다. 560 nm에서의 분광 광도 정량화(spectrophotometric quantification)를 수행하였다.
6. 통계 분석
실험 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 정규성 검정(Normality Test) 및 동일한 분산 검정을 수행하였다. 본 발명자들은 Nell-1 처리농도 및 처리시점의 효과에 대해 이원 분산 분석(two-way analysis of variance)을 통해 평가하였다. 그룹 간의 차이 분석은 Tukey의 사후 검정(post hoc test)을 포함하는 일원 분산 분석을 적용하여 수행하였다(SPSS 12 for Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, 미국)(P < 0.05).
실험결과
1. 인간 치은(gingiva) 유래 줄기세포를 이용한 세포 스페로이드의 형성
배양 1, 3 및 7 일자에 성장 배지에서 배양된 세포 스페로이드의 형태가 도 2에 도시되어 있다. Nell-1을 0, 1, 10, 100 및 500 ng/ml의 농도로 처리한 경우, 세포 스페로이드의 현저한 형태학적 변화는 관찰되지 않았다. 세포 스페로이드 직경의 분석결과는 도 3에 나타내었다. Nell-1을 0, 1, 10, 100 및 500 ng/ml의 농도로 처리한 경우, 세포 스페로이드 직경은 그룹 간 통계적 차이가 없었다. 또한, 더 긴 배양시간에서의 세포 스페로이드 직경은 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다(P > 0.05).
2. Nell-1 처리 후, 세포 생존도 평가
세포 스페로이드의 생존도에 대한 정성적인 결과를 배양 1, 3 및 7 일자에 Live/Dead Kit assay로 분석하여 얻었다(도 4a; 배양 1 일자, 도 4b; 배양 3 일자, 도 4c; 배양 7 일자). 배양 1 일자의 모든 그룹(0, 1, 10, 100 및 500 ng/ml)에서 세포 스페로이드 내의 대부분의 세포들이 살아있는 세포를 나타내는, 강렬한 녹색 형광을 나타내었다(도 4a 참조). 더 긴 배양시간(배양 7 일자)에서의 그룹 간 현저한 차이가 관찰되지 않았다(도 4c 참조). 배양 1, 3 및 7 일자의 세포 생존도에 대한 정량분석 결과는 도 4d에 도시되어 있다. 배양 1 일자에서, Nell-1을 0, 1, 10, 100 및 500 ng/ml의 농도로 처리한 경우, 450 nm에서의 흡광도 값은 각각 0.184 ± 0.019, 0.189 ± 0.008, 0.166 ± 0.005, 0.168 ± 0.004 및 0.173 ± 0.006으로 나타났다(P > 0.05). 배양 3 일자에서, 일반적으로 흡광도 값이 증가했지만 처리그룹(0, 1, 10, 100 및 500 ng/ml) 간에 유의한 차이가 나타나지 않았다(P > 0.05). 또한, 배양 7 일자에서도 그룹 간의 유의한 차이는 나타나지 않았다(P > 0.05).
3. Nell-1 처리 후, 골분화능 평가
배양 7 및 14 일자의 알칼리 포스파타제 활성 분석 결과가 도 5에 도시되어 있다. 배양 7 일자에서, Nell-1을 0, 1, 10, 100 및 500 ng/ml의 농도로 처리한 경우, 405 nm에서의 흡광도 값은 각각 0.065 ± 0.002, 0.077 ± 0.010, 0.082 ± 0.009, 0.069 ± 0.004 및 0.063 ± 0.001으로 나타났다(도 5 참조). 배양 7 일자에서, 대조군(0 ng/ml)과 비교할 때 Nell-1 10 ng/ml 처리한 그룹에서 흡광도 값이 통계적으로 유의하게 높은 것으로 나타났다(P < 0.05).
알리자린 레드 S 염색의 정량분석 결과가 도 6에 도시되어 있다. 배양 7 일자에서, 대조군(0 ng/ml)과 비교할 때 Nell-1 1, 10 및 100 ng/ml 처리한 그룹에서, 560 nm에서의 흡광도 값이 통계적으로 유의하게 높은 것으로 나타났으며, Nell-1 100 ng/ml 처리한 그룹에서 가장 높게 나타났다(P < 0.05). 배양 14 일자에서, Nell-1을 0, 1, 10, 100 및 500 ng/ml의 농도로 처리한 경우, 560 nm에서의 흡광도 값은 각각 0.179 ± 0.014, 0.247 ± 0.008, 0.352 ± 0.007, 0.317 ± 0.005 및 0.347 ± 0.008으로 나타났으며, 배양 14 일자에서, 대조군(0 ng/ml)과 비교할 때 Nell-1 10 ng/ml 처리한 그룹에서 560 nm에서의 흡광도 값이 가장 높게 나타났다(P < 0.05).

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  10. 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법에 있어서,
    분리된 줄기세포로 형성된 줄기세포 스페로이드에 Nell-1을 처리하는 단계;를 포함하고,
    상기 줄기세포는 인간 치은(gingiva) 유래 성체줄기세포이고,
    상기 인간 치은 유래 성체줄기세포는 CD44, CD73, CD90 및 CD105 양성이며, CD14, CD45, CD34 및 CD19 음성이고,
    상기 Nell-1은 1 내지 100 ng/ml의 함량으로 포함되고,
    상기 줄기세포 스페로이드는 오목한 표면에서 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법.
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