KR102446907B1 - 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물 - Google Patents

쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102446907B1
KR102446907B1 KR1020200132704A KR20200132704A KR102446907B1 KR 102446907 B1 KR102446907 B1 KR 102446907B1 KR 1020200132704 A KR1020200132704 A KR 1020200132704A KR 20200132704 A KR20200132704 A KR 20200132704A KR 102446907 B1 KR102446907 B1 KR 102446907B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
stem cells
cumin
extract
composition
promoting
Prior art date
Application number
KR1020200132704A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220049273A (ko
Inventor
박준범
민세경
이현진
살라하 우딘 무하메드
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to KR1020200132704A priority Critical patent/KR102446907B1/ko
Publication of KR20220049273A publication Critical patent/KR20220049273A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102446907B1 publication Critical patent/KR102446907B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Abstract

본 발명은 줄기세포의 골분화를 촉진시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 골분화 촉진 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 쿠민(cumin) 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물은 줄기세포의 골광물화를 촉진시키는 효과가 있으므로, 줄기세포의 골광물화를 촉진시켜 효과적으로 골광물화된 세포를 얻고자 할 때 본 발명의 줄기세포 골분화 촉진용 조성물이 유용하게 이용될 수 있다.

Description

쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물{Composition for Facilitating the Osteogenic Differentiation of Stem Cells Comprising the Extract of Cumin as an Effective Ingredient}
본 발명은 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물 및 이를 이용한 골분화 촉진 방법에 관한 것이다.
쿠민(cumin, Cuminum cyminum L.)은 고대부터 넓은 지리적 영역의 전통적인 치유 시스템에서 다양한 적응증을 치료하는 데 사용되었다(Johri, R.K., 2011, Pharmacogn Rev 5: 63-72). 쿠민은 에센셜 오일의 풍부한 공급원이며 화학 성분과 생물학적 활성에 대해 활발히 연구되었다. 쿠민은 다양한 질병의 치료에 적용되었다(Kermani, M., et al., 2012. Chin J Integr Med 2012). 쿠민은 칸디다 감염에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Katiraee, F., et al., 2017. Curr Med Mycol 3: 1-6). 쿠민은 물, 메탄올, 에탄올 및 에틸아세테이트 등 다양한 용매에 의해 추출되어 사용되어왔다. 예를 들어, 면역세포의 염증 반응과 항 알러지 효과를 평가하기 위해 쿠민 수용성 추출물이 적용되었고 쿠민의 메탄올 추출물은 생체 분자 손상 및 신경 약리 활성에 대한 보호 역할을 평가하는데 사용되었다. 또한, 쿠민의 에탄올 추출물은 당뇨병 쥐 모델(diabetic rats)에서 트리글리세리드(triglycerides)를 낮추기 위해 적용되었고, 쿠민의 에틸아세테이트 추출물은 상처 치유 적용을 위해 평가되었다.
줄기세포는 특히 다양한 질병의 치료에 오랫동안 큰 관심을 받아 왔다. 줄기세포는 다양한 기능을 가지는 것으로 알려져 있다(Tae, J.Y., et al., 2019. Exp Ther Med 18: 326-331). 줄기세포는 다양한 조직으로 분화할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 인자를 분비하며, 파라크라인 효과(paracrine effect)라고 불리우는 이 기능이 주변 조직에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다(Lee, H., et al., 2018. Adv Clin Exp Med 27: 971-977). 최근에는 줄기세포가 조직재생에 적용되고 있다 (Kang, S.H., et al., 2019. J Periodontal Implant Sci 49: 258-267).
골절이나 종양 제거 후 형성된 국소적인 골 조직 결손부의 치료나 골 관절염에 대한 인공 관절 삽입 치료 시, 골 조직 이식에 대한 수요는 매우 크다. 그러나, 골 조직 이식은 임상적 이용에 있어 한계점과 단점을 가지고 있어서, 골 조직 대체물에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 줄기세포를 이용하여 골 손실의 치료를 위한 재생의학 관점의 연구도 활발히 진행되고 있다. 이와 관련하여 골결손과 관련된 질환의 세포 치료제로서 조골세포(osteoblast)의 분화촉진과 활성화 등이 연구되고 있다.
특히, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)로부터 특정 단백질 또는 유전자를 이용하여 조골세포로 분화시키는 기술들이 보고되어 있고 천연물 유래 추출물 또는 화합물을 줄기세포 배양시 처리하여 조골세포로 분화 유도에 관한 연구가 보고되고 있다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
한국 공개특허 10-2004-0089733(공개일자: 2004.10.21)
본 발명자들은 골수 유래 중간엽 줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)의 골분화에 대한 쿠민(cumin) 추출물을 사용할 수 있는지 연구하였고, 쿠민 추출물을 골분화 유도 배지에 첨가할 경우에 골수 유래 중간엽 줄기세포의 골광물화를 촉진할 수 있음을 실험적으로 증명함으로써 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 쿠민(cumin) 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 쿠민(cumin) 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 분리된 줄기세포에 쿠민(cumin) 추출물을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 골분화를 촉진시키는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 골분화 촉진용 조성물로 분화된 조골세포를 유효성분으로 포함하는 골결손증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 쿠민(cumin) 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 줄기세포 골분화 촉진용 조성물의 유효성분인 쿠민 추출물은 줄기세포의 골광물화를 증가시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 골분화 촉진용 조성물에 포함되는 상기 쿠민 추출물은 쿠민의 다양한 기관 또는 부분 (예: 잎, 꽃, 열매, 종자, 줄기, 뿌리, 가지 및 껍질 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 쿠민의 종자로부터 얻은 추출물일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 쿠민 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출될 수 있다.
본 발명에서, 상기 유기용매는 C1-C4의 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 상기 C1-C4의 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에서 “추출물”은 원료로부터 임의의 방법으로 추출 또는 분리해 낸 물질을 말하며, 원료로부터 추출된 추출액, 이로부터 얻을 수 있는 농축액, 상기 농축액의 건조물 및 분말을 제한없이 모두 포함하는 의미이다.
상기 추출물은 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법 등 종래 알려진 모든 추출 방법을 통해 수득될 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법이나 환류 추출법을 이용하여 수득될 수 있다.
본 발명에 있어서, 쿠민 추출물은 감압 농축 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 쿠민 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다.
상기와 같은 과정을 거쳐 수득된 쿠민 추출물은 줄기세포의 조골세포로의 분화를 촉진하는 효과를 나타낸다. 즉, 상기 쿠민 추출물은 줄기세포가 조골세포로 분화되도록 유도하고, 분화된 조골세포는 골광물화(무기질 결정화)의 특성을 가지게 된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 및 각종 분화 세포를 초기화시킨 유도 다능성 줄기세로(ips 세포)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 성체줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 골수(bone marrow) 유래인 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 용어“줄기세포”는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도 다능성 줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.
본 발명에서 상기 용어 “배아줄기세포”는 배아줄기세포는 남성의 생식세포인 정자와 여성의 생식세포인 난자가 결합하여 생성된 수정란에서 유래한다. 그리고 배아줄기세포는 착상 전 배반포기배의 내부 세포괴로부터 획득되며 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지녔으나 배양조건만 주어진다면 분화되지 않은 상태로 무한대로 증식이 가능한 아직 분화되지 않은 세포를 말한다. 다시 말해서 특수 분화 배양 환경에서는 원하는 방향으로 세포 분화가 유도되어 신경, 당뇨, 혈액과같은 질환의 세포 치료제로 이용될 수 있어서 한 개의 배아줄기세포주만으로도 수많은 환자의 치료에 이용될 수 있다고 기대되는 만능세포를 의미한다.
본 발명에서 상기 용어 “유도 다능성 줄기세포”는 분화된 세포들이 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서, 역분화 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells)이라고도 한다.
본 발명에서 상기 용어 “성체줄기세포”는 인간을 포함한 포유동물의 조직에서 분리해 낸, 분화되기 직전의 원시세포로서, 무한정으로 증식할 수 있는 능력 및 여러 가지 형태의 세포(예를 들면, 지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포등)로 분화할 수 있는 줄기세포이다.
본 발명에서 상기 용어“분화”는 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달하여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 의미한다. 상기 분화는 주로 다세포 생물이 단일 접합자(zygote)에서 복잡한 조직을 형성하는 과정 중에 일어나거나, 성인이 되었을 때 손상된 조직을 복구하는 경우 성체줄기세포가 특정한 세포로 분화하게 된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 골분화는 줄기세포가 조골세포로 분화하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 골분화 촉진용 조성물에는 쿠민(cumin) 추출물이 0.0001 내지 10 μg/ml의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.0005 내지 5 μg/ml의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 1 μg/ml의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지를 제공한다.
상기 쿠민 추출물은 줄기세포 배양용 배지에 일 성분으로 포함될 수 있다.
상기 줄기세포 배양용 배지는 줄기세포의 배양에 통상적으로 이용되는 모든 배지를 포함하고, 예를 들어 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, MEM(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)등과 같은 기본 배지, 또는 골분화를 유도할 수 있는 성분이 함유된 배지일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 배양용 배지에 포함되는 상기 쿠민 추출물은 쿠민의 다양한 기관 또는 부분 (예: 잎, 꽃, 열매, 종자, 줄기, 뿌리, 가지 및 껍질 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 쿠민의 종자로부터 얻은 추출물일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 배양용 배지로 배양되는 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 및 각종 분화 세포를 초기화시킨 유도 다능성 줄기세로(ips 세포)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 성체줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 골수(bone marrow) 유래인 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 배양용 배지에 포함되는 쿠민 추출물은 0.0001 내지 10 μg/ml의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.0005 내지 5 μg/ml의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 1 μg/ml의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 분리된 줄기세포에 상기 쿠민 추출물을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 골분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 줄기세포 골분화를 촉진시키는 방법은 분리된 줄기세포에 상기 쿠민 추출물을 처리하는 단계 및 상기 쿠민 추출물이 처리된, 분리된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다.
상기 골분화 촉진의 대상이 되는 줄기세포는 인 비트로(in vitro) 상태일 수 있고, 상기 쿠민 추출물은 상기 줄기세포 배양용 배지의 형태로 줄기세포에 처리될 수 있다. 또한, 골분화를 촉진하기 위하여 줄기세포는 3차원 지지체에서 배양될 수 있다. 상기 지지체를 구성하는 성분은 생체적합한 물질을 사용할 수 있고, 지지체에서 배양되어 분화된 조골세포는 지지체로부터 별도로 분리하지 않고 골질환 치료를 위하여 지지체에 부착된 상태로 생체에 이식될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 골분화를 촉진시키는 방법에 포함되는 상기 쿠민 추출물은 쿠민의 다양한 기관 또는 부분 (예: 잎, 꽃, 열매, 종자, 줄기, 뿌리, 가지 및 껍질 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 쿠민의 종자로부터 얻은 추출물일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 골분화를 촉진시키는 방법에 포함되는 상기 쿠민 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출될 수 있으며, 상기 추출용매는 바람직하게는 메탄올일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 쿠민 추출물을 처리하는 단계는 쿠민 추출물을 0.0001 내지 10 μg/ml의 농도로 처리될 수 있고, 바람직하게는 0.0005 내지 5 μg/ml의 농도로 처리될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 1 μg/ml의 농도로 처리될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 골분화 촉진용 조성물로 분화된 조골세포를 유효성분으로 포함하는 골결손증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 분화된 조골세포는 각종 세포 치료에 이용될 수 있다. 분화된 조골세포는 콜라겐이나 히드록시아파타이트 스캐폴드 등 다양한 생체보조제와 혼합하여 외과수술로 골조직에 이식할 수 있다. 본 발명의 치료용 조성물은 상기 분화된 조골세포 외에 보조성분으로서 콜라겐이나 골지지체 등을 더 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물 중 분화된 조골세포는 질병의 유형, 투여경로, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 수를 조절할 수 있고, 바람직하게는 평균 성인의 경우 1 ~ 5×107 cell/cm3 스캐폴드를 투여한다. 또한, 본 발명의 치료용 조성물은 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 치료용 조성물은 골질환 치료를 위해 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 용어 “골질환”이란 골분화 및 재생을 필요로 하는 골에 관련된 질환을 의미하며, 골절등 외상성 골손상 및 수술 후 발생한 골결손을 포함한다.
본 발명의 효과 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 줄기세포의 골분화를 촉진시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 골분화를 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
(ⅱ) 본 발명의 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물은 줄기세포의 골광물화를 촉진시키는 효과가 있다.
(ⅲ) 본 발명은 줄기세포의 골광물화를 촉진시켜 효과적으로 골광물화된 세포를 얻고자 할 때 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 줄기세포의 배양 및 분석방법에 대한 개략도이다.
도 2는 골분화 유도 배지에서 쿠민 추출물을 다양한 농도(0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml)로 처리한 후 배양 1, 3, 7 및 14일자의 줄기세포의 형태변화를 역상 현미경으로 관찰한 이미지이며(최초 배율 x 100), 스케일바는 200 μm를 나타낸다.
도 3은 골분화 유도 배지에서 쿠민 추출물을 다양한 농도(0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml)로 처리한 후 배양 1, 3, 5 및 7일자의 CCK-8 분석에 의한 세포 생존도를 나타내는 그래프이다.
* 배양 5일자의 쿠민 추출물을 0 μg/ml로 처리한 군과 비교하여 통계적 유의차를 나타냈다(P < 0.05).
도 4는 골분화 유도 배지에서 쿠민 추출물을 다양한 농도(0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml)로 처리한 후 배양 7 및 14일자의 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase)의 활성을 나타내는 그래프이다.
도 5a는 골분화 유도 배지에서 쿠민 추출물을 다양한 농도(0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml)로 처리한 후 배양 7 및 14일자의 알리자린 레드 S(Alizarin Red S) 염색 결과를 현미경으로 관찰한 이미지이며(최초 배율 x 100), 스케일바는 200 μm를 나타낸다.
도 5b는 알리자린 레드 S 염색의 정량분석을 나타내는 그래프이다.
* 배양 7일자의 쿠민 추출물을 처리하지 않은 대조군(0 μg/ml)과 비교하여 통계적 유의차를 나타냈다(P < 0.05).
# 배양 14일자의 쿠민 추출물을 처리하지 않은 대조군(0 μg/ml)과 비교하여 통계적 유의차를 나타냈다(P < 0.05).
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
실시예
실험 재료 및 방법
1. 쿠민(cumin) 추출물의 제조
본 발명의 쿠민(cumin, Cuminum cyminum L.)은 방글라데시의 라지샤히 (Rajshahi) 지역, 보그라 (Bogra) 지구에 있는 시브곤지(Shibgonj) 하위 지구에서 살라 후딘 박사(Md. Salah Uddin)에 의해 수집되었다. KRIB 0086021로 기록된 바우처 표본이 한국생명공학연구원 식물표본관에 기탁되었다. 쿠민의 종자를 건조하고 분쇄한 후 생성된 분말(75 g)을 45℃에서 3일 동안, 99.9% (v/v) 메탄올 1 L로 반복적인 초음파 처리(15 분) 및 침지(2 시간)하여 추출하였다. 상기 생성물을 비 형광면(non-fluorescence cottons)으로 여과하고 회전식 증류기(N-1000SWD, EYELA)를 이용하여 45℃에서 감압 하에서 농축하고 동결 건조에 의해 13.16 g의 쿠민(cumin) 추출물을 수득하였다.
2. 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 (BMSCs) 배양
본 발명의 프로토콜은 가톨릭대학교 의과대학 서울성모병원의 임상시험연구심사위원회에서 검토 및 승인되었다. 모든 실험은 헬싱키 선언에 명시된 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.
도 1에서 본 발명에 따른 줄기세포 배양 및 분석방법의 개요를 보여준다.
인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(Human bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs); 가톨릭 MASTER 세포)를 가톨릭 세포 치료 사업단(CIC, 서울, 한국)에서 입수하였다. BMSCs의 분리 및 특성화는 이전에 보고된 방법에 따라 수행되었다 (Jeong, C.H., et al., 2014. Biomed Res Int 2014: 129145). 가톨릭 세포 치료 사업단에서 상기 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포가 90% 이상 CD73 및 CD90을 발현하는 것으로 확인하였다. 배양 배지를 2일 또는 3일마다 교환하고, 골수 유래 중간엽 줄기세포를 95% O2 및 5% CO2의 37℃ 배양기에서 증식시켰다.
3. 쿠민 추출물 처리 후, 줄기세포 형태 평가
상기 줄기세포를 96웰 플레이트에 2.0 × 103 세포/웰의 밀도로 배치하고 15% 소태아혈청(FBS, Gibco), 200 mM L-글루타민(시그마 알드리치), 10 mM 아스코르브산 2-인산염(시그마 알드리치), 38 μg/ml 덱사메타손, 2 mg/ml의 글리세로포스페이트이나트륨 염 수화물(glycerophosphate disodium salt hydrate), 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 (시그마 알드리치)이 보충된 골분화 유도 배지 (α-MEM, Gibco, 미국)에서 배양했다.
쿠민 추출물의 최종 처리농도는 각각 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml이다. 배양 1, 3, 7 및 14일자에 역상 현미경(CKX41SF, Olympus Corporation, Tokyo, 일본)을 사용하여 형태학적 평가를 수행하였다.
4. 쿠민 추출물 처리 후, 줄기세포 생존도 평가
본 발명자들은 배양 1, 3, 5 및 7일자에 줄기세포의 세포 생존도에 대한 정량적 분석을 위해, 수용성 테트라졸륨염(tetrazolium salt)을 기반으로 하는, cell counting kit-8 (CCK-8, Dojindo, Tokyo, 일본) 분석 키트을 사용하여 생존도 평가를 수행했다. Cell counting kit는 세포 생존도를 확인하기 위한 분석 방법으로, 수용성 테트라졸륨염이 배양 배지 내에 있는 세포의 디히드로게나제에 의해 환원되어 포르마잔이 되는 원리를 이용한 것이며, 생성된 포르마잔의 양은 살아있는 세포의 수에 비례하므로, 상기 포르마잔의 생성량을 비색 분석(colorimetric assays)으로 확인함으로써 세포의 생존도를 확인할 수 있다. 분석과정을 간략히 설명하면, 세포를 37℃에서 1 시간 동안 테트라졸륨모노나트륨 염(tetrazolium monosodium salt)과 함께 배양한 후, 450 nm에서의 분광 광도계 흡광도는 마이크로 플레이트 리더(BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, 미국)를 사용하여 측정되었다.
5. 쿠민 추출물 처리 후, 알칼리 포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP) 활성 평가
골수 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 평가하기 위해 알칼리 포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP) 활성 평가를 수행하였다.
ALP는 조골세포(osteoblast) 활성의 표지인자로 알려져 있으며 석회화 과정 동안 무기인산의 운반, 세포 분열이나 분화의 조절자 역할을 한다. 따라서, 쿠민 추출물이 골수 유래 중간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화를 유도하는지 확인하기 위하여 ALP 활성을 측정하였다.
알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase) 활성 분석을 배양 7일 및 14일자에 수행하였다. 트립신(Trypsin, Gibco)을 사용하여 세포를 분리하고, 시판되는 키트 (K412-500, BioVision, Inc., 미국)를 사용하여 알칼리 포스파타제 활성 분석을 수행하였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader, BioTek, 미국)를 사용하여 샘플의 분광 광도 흡광도를 측정하였다.
6. 쿠민 추출물 처리 후, 골광물화 평가
골광물화(무기질 결정화) 평가를 위해 배양 7일 및 14일자에 알리자린 레드 S(Alizarin Red S) 염색이 수행되었다. 알리자린 레드는 칼슘과 같은 무기질 결정에 결합된다. 조골세포는 무기질 결정을 형성하므로 알리자린 레드 염색 정도에 비례하여 조골세포로의 분화 정도를 알 수 있다. 본 발명자들은 쿠민 추출물에 의해 줄기세포가 조골세포로 분화하는지 확인하기 위하여 쿠민 추출물이 포함된 배지로 줄기세포를 배양한 후 알리자린 레드 S 염색을 실시하였다. 간략히 설명하면, 세포를 세척하고 고정시키고 2% 알리자린 레드 S 용액(ScienCell Research Laboratories, Inc., 미국)으로 염색하고 현미경(CKX41SF, Olympus Corporation)으로 칼슘 침착정도를 관찰하였다. 이후 결합된 염료의 정량분석은 주위 온도에서 15 분 동안 10% 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride)를 첨가함으로써 수행되었다. 560 nm에서의 분광 광도 정량화(spectrophotometric quantification)를 수행하였다.
7. 통계 분석
실험 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 정규성 검정 (Normality Test)을 수행하였고, Tukey의 사후 검증(post hoc test)을 포함하는 일원 분산 분석(ANOVA)은 시판되는 프로그램(SPSS 12 for Windows, SPSS Inc., 미국)을 이용하여 그룹 간의 차이를 확인하기 위해 수행되었다. 유의 수준은 0.05이다.
실험결과
1. 쿠민 추출물 처리 후, 줄기세포 형태 평가
골분화 유도 배지에서 배양한, 줄기세포의 형태에 대한 이미지는 도 2에 나타내었다. 배양 1일자 세포의 형태는 쿠민 추출물을 처리하지 않은 대조군(untreated control group)의 줄기세포는 섬유아세포-유사((fibroblast-like) 형태를 보였으며, 쿠민 추출물을 최종 농도 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml로 1일 처리할 경우, 처리하지 않은 대조군과 비교했을 때 눈에 띄는 변화를 나타내지 않았다. 또한 3, 7 또는 14일까지 연장배양할 경우, 줄기세포의 형태학적 변화가 관찰되지 않았다.
2. 쿠민 추출물 처리 후, 줄기세포 생존도 평가
배양 1, 3, 5 및 7 일자의 세포 생존능에 대한 정량적 값이 도 3에 도시되어 있다. 쿠민 추출물을 최종 농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml로 1일 처리한 경우, 450 nm에서의 흡광도 각각 0.946 ± 0.041, 1.032 ± 0.182, 0.995 ± 0.181, 0.953 ± 0.163 및 1.026 ± 0.218로 나타났다(P > 0.05). 쿠민 추출물을 최종 농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml로 7일 처리한 경우, 450 nm에서의 흡광도는 각각 1.636 ± 0.092, 1.587 ± 0.204, 1.362 ± 0.212, 1.487 ± 0.120 및 1.291 ± 0.046로 나타났다(P > 0.05).
3. 쿠민 추출물 처리 후, 알칼리 포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP) 활성 평가
알칼리 포스파타제 활성 분석결과가 도 4에 도시되어 있다. 배양 7일 및 14일에 쿠민 추출물을 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml로 7일 처리한 경우, 알칼리 포스파타제 활성에 대한 405 nm에서의 흡광도는 각각 2.591 ± 0.059, 2.613 ± 0.044, 2.537 ± 0.234, 2.519 ± 0.154 및 2.632 ± 0.105로 나타났다(P > 0.05). 또한, 쿠민 추출물을 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml로 14일 처리한 경우, 알칼리 포스파타제 활성에 대한 405 nm에서의 흡광도는 각각 2.888 ± 0.141, 2.827 ± 0.151, 2.746 ± 0.160, 2.814 ± 0.105 및 2.872 ± 0.024로 나타났다.
4. 쿠민 추출물 처리 후, 골광물화 평가
골분화 유도 배지에서 쿠민 추출물을 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml로 처리한 후 배양 7일 및 14일자에 알리자린 레드 S 염색을 수행하고 염색된 세포를 현미경으로 관찰하여 수득한 이미지를 도 5a에 나타내었다. 또한, 골광물화(무기질 결정화)정도를 정량적으로 분석한 결과를 도 5b에 나타내었다. 쿠민 추출물을 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml로 7일 처리한 경우, 골광물화에 대한 560 nm에서의 흡광도는 각각 0.142 ± 0.001, 0.278 ± 0.010, 0.155 ± 0.003, 1.261 ± 0.014 및 1.422 ± 0.034로 나타났다(P < 0.05). 또한, 쿠민 추출물을 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml로 14일 처리한 경우, 골광물화에 대한 560 nm에서의 흡광도는 각각 0.261 ± 0.003, 1.904 ± 0.032, 1.775 ± 0.037, 2.416 ± 0.187 및 1.731 ± 0.025로 나타났다(P < 0.05). 상기의 결과로부터, 쿠민 추출물의 처리에 의해 줄기세포의 골광물화가 상당히 증가됨이 확인되었다(도 5a 및 도 5b 참고).

Claims (20)

  1. 쿠민(cumin) 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 쿠민 추출물은 쿠민의 종자로부터 추출한 것을 특징으로 하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 쿠민 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유기용매는 C1-C4의 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기용매인 것을 특징으로 하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 알코올은 메탄올인 것을 특징으로 하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 성체줄기세포는 골수(bone marrow) 유래인 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 골분화는 줄기세포가 조골세포로 분화하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 쿠민 추출물을 0.0001 내지 10 μg/ml의 함량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물.
  10. 쿠민(cumin) 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 쿠민 추출물은 쿠민의 종자로부터 추출한 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양용 배지.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 줄기세포는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양용 배지.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 성체줄기세포는 골수(bone marrow) 유래인 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양용 배지.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 배지는 쿠민 추출물을 0.0001 내지 10 μg/ml의 함량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양용 배지.
  15. 분리된 줄기세포에 쿠민(cumin) 추출물을 처리하는 단계;를 포함하는 줄기세포 골분화를 촉진시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 쿠민 추출물은 쿠민의 종자로부터 추출한 것을 특징으로 하는 줄기세포 골분화를 촉진시키는 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 쿠민 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 골분화를 촉진시키는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 추출용매는 메탄올인 것을 특징으로 하는 줄기세포 골분화를 촉진시키는 방법.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 쿠민 추출물을 처리하는 단계는 쿠민 추출물을 0.0001 내지 10 μg/ml의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 골분화를 촉진시키는 방법.
  20. 삭제
KR1020200132704A 2020-10-14 2020-10-14 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물 KR102446907B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200132704A KR102446907B1 (ko) 2020-10-14 2020-10-14 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200132704A KR102446907B1 (ko) 2020-10-14 2020-10-14 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220049273A KR20220049273A (ko) 2022-04-21
KR102446907B1 true KR102446907B1 (ko) 2022-09-22

Family

ID=81437349

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200132704A KR102446907B1 (ko) 2020-10-14 2020-10-14 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102446907B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220149252A (ko) * 2021-04-30 2022-11-08 가톨릭대학교 산학협력단 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1649513A (zh) 2002-03-12 2005-08-03 科学与工业研究会 具有提高生物利用度/生物功效活性的枯茗植物及其提取物和提取物的精馏产物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kurniawati, L. et al., International Journal of Applied Pharmaceutics (2019) vol.11, Special Issue 1

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220149252A (ko) * 2021-04-30 2022-11-08 가톨릭대학교 산학협력단 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물
KR102547244B1 (ko) * 2021-04-30 2023-06-22 가톨릭대학교 산학협력단 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220049273A (ko) 2022-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Qi et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells repair critical-sized bone defects through enhanced angiogenesis and osteogenesis in osteoporotic rats
Gao et al. The effect of the coumarin-like derivative osthole on the osteogenic properties of human periodontal ligament and jaw bone marrow mesenchymal stem cell sheets
Williams IV et al. Cells isolated from adult human skeletal muscle capable of differentiating into multiple mesodermal phenotypes
US5834312A (en) Process and media for the growth of human epithelia
US10251824B2 (en) Method for inducing pluripotent stem cells and pluripotent stem cells prepared by said method
Boonanantanasarn et al. Morinda citrifolia leaves enhance osteogenic differentiation and mineralization of human periodontal ligament cells
CN106983704A (zh) 间充质干细胞培养物或其培养上清的用途
KR20150050861A (ko) 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 연골세포로 분화시키는 방법
KR102446907B1 (ko) 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물
KR101542848B1 (ko) 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 골아세포로 분화시키는 방법
KR20210021165A (ko) 지방줄기세포 유래 스페로이드를 포함하는 조건 배지를 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 약학 조성물
CN115820548A (zh) 一种动物组织来源的凋亡囊泡的制备方法及其应用
DE69837212T2 (de) Verfahren zur induzierung der osteoblastischen differenzierung der zellen des menschlichen extramedullären fettgewebes
KR20150050865A (ko) 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 지방세포로 분화시키는 방법
KR102533128B1 (ko) Nell-1을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물
KR101738087B1 (ko) 세신 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 골분화 촉진용 조성물
KR20230139673A (ko) 중대가리풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 분화 촉진용 조성물
KR102547244B1 (ko) 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물
KR102140492B1 (ko) 퐁암(Pongam) 나무 추출물을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물
KR102286634B1 (ko) 꾸지뽕나무 열매 추출물을 포함하는 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물
KR102237985B1 (ko) 줄기세포의 골분화 촉진용 조성물
KR101738088B1 (ko) 백지 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물
KR102129534B1 (ko) 대나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물
KR100759388B1 (ko) 치조골 골수 유래 성체 줄기세포의 골아세포 분화 방법
KR101736064B1 (ko) 승마 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 또는 분화 촉진용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right