KR20220149252A - 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물 - Google Patents

쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물 및 분리된 줄기세포에 쿠민 추출물을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물은 줄기세포를 연골세포로 촉진를 유도시키는 효과가 현저하여, 줄기세포를 연골세포로 유도하고자 할 때 유용한 이점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 이용하여 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하여　골결손증의 예방 및 치료제로서 사용하게 할 수 있는 이점이 있다.

Description

쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물{Composition for Inducing Differentiation of Stem Cells into Chondrocytes Comprising the Extract Of Cumin as an Effective Ingredient}
본 발명은 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물 및 줄기세포의 연골세포로의 분화 방법에 관한 것이다.
쿠민(cumin, Cuminum cyminum L.)은 고대부터 넓은 지리적 영역의 전통적인 치유 시스템에서 다양한 적응증을 치료하는 데 사용되었다(Johri, R.K., 2011, Pharmacogn Rev 5: 63-72). 쿠민은 에센셜 오일의 풍부한 공급원이며 화학 성분과 생물학적 활성에 대해 활발히 연구되었다. 쿠민은 다양한 질병의 치료에 적용되었다(Kermani, M., et al., 2012. Chin J Integr Med 2012). 쿠민은 칸디다 감염에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Katiraee, F., et al., 2017. Curr Med Mycol 3: 1-6). 쿠민은 물, 메탄올, 에탄올 및 에틸아세테이트 등 다양한 용매에 의해 추출되어 사용되어왔다. 예를 들어, 면역세포의 염증 반응과 항 알러지 효과를 평가하기 위해 쿠민 수용성 추출물이 적용되었고 쿠민의 메탄올 추출물은 생체 분자 손상 및 신경 약리 활성에 대한 보호 역할을 평가하는데 사용되었다. 또한, 쿠민의 에탄올 추출물은 당뇨병 쥐 모델(diabetic rats)에서 트리글리세리드(triglycerides)를 낮추기 위해 적용되었고, 쿠민의 에틸아세테이트 추출물은 상처 치유 적용을 위해 평가되었다.
줄기세포는 특히 다양한 질병의 치료에 오랫동안 큰 관심을 받아왔다. 줄기세포는 다양한 기능을 가지는 것으로 알려져 있다(Tae, J.Y., et al., 2019. Exp Ther Med 18: 326-331). 줄기세포는 다양한 조직으로 분화할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 인자를 분비하며, 파라크라인 효과(paracrine effect)라고 불리우는 이 기능이 주변 조직에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다(Lee, H., et al., 2018. Adv Clin Exp Med 27: 971-977). 최근에는 줄기세포가 조직재생에 적용되고 있다 (Kang, S.H., et al., 2019. J Periodontal Implant Sci 49: 258-267).
연골 분화에 대한 중간엽 줄기세포의 조절은 관절 연골 결함 및 골관절염에 대한 줄기세포 치료에서 중요한 문제다. 한편, 에탄올, 아스코르브산, 덱사메사손, 프로스타글란딘 E2, 스타우로스포린, 카토제닌, 그리고 옥소피페라진 유도체를 포함한 저분자 화합물들이 중간엽 줄기세포의 연골 분화를 효과적으로 유도하는 것으로 보고되고 있다. 그러나, 더욱 뛰어난 연골 분화를 위한 효과적인 단분자 화합물은 지속적으로 연구되고 있다.
특히, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)로부터 특정 단백질 또는 유전자를 이용하여 조골세포로 분화시키는 기술들이 보고되어 있고 천연물 유래 추출물 또는 화합물을 줄기세포 배양시 처리하여 조골세포로 분화 유도에 관한 연구가 보고되고 있다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
대한민국 공개특허 제10-2004-0089733호(2004.10.21)
본 발명자들은 골수 유래 중간엽 줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)의 연골분화에 대한 쿠민(cumin) 추출물을 사용할 수 있는지 연구하였고, 쿠민 추출물을 연골분화 유도 배지에 첨가할 경우에 골수 유래 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도를 촉진할 수 있음을 실험적으로 증명함으로써 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 분리된 줄기세포에 쿠민 추출물을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 연골분화 촉진용 조성물로 분화된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 골결손증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 측면은 본 발명은 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물의 유효성분인 쿠민 추출물은 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도를 증가시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물에 포함되는 상기 쿠민 추출물은 쿠민(cumin)의 다양한 기관 또는 부분 (예: 잎, 꽃, 열매, 종자, 줄기, 뿌리, 가지 및 껍질 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 쿠민의 종자로부터 얻은 추출물일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 쿠민 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출될 수 있다.
본 발명에서 상기 유기용매는 C1-C4의 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 상기 C1-C4의 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에서 "추출물"은 원료로부터 임의의 방법으로 추출 또는 분리해 낸 물질을 말하며, 원료로부터 추출된 추출액, 이로부터 얻을 수 있는 농축액, 상기 농축액의 건조물 및 분말을 제한없이 모두 포함하는 의미이다.
상기 추출물은 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법 등 종래 알려진 모든 추출 방법을 통해 수득될 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법이나 환류 추출법을 이용하여 수득될 수 있다.
본 발명에 쿠민 추출물은 감압 농축 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 쿠민 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다.
상기와 같은 과정을 거쳐 수득된 쿠민 추출물은 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 효과를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 및 각종 분화 세포를 초기화시킨 유도 다능성 줄기세로(ips 세포)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 성체줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 골수(bone marrow) 유래인 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도 다능성 줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.
본 발명에서 "배아줄기세포"는 배아줄기세포는 남성의 생식세포인 정자와 여성의 생식세포인 난자가 결합하여 생성된 수정란에서 유래한다. 한편, 배아줄기세포는 착상 전 배반포기배의 내부 세포괴로부터 획득되며 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지녔으나 배양조건만 주어진다면 분화되지 않은 상태로 무한대로 증식이 가능한 아직 분화되지 않은 세포를 말한다. 다시 말해서 특수 분화 배양 환경에서는 원하는 방향으로 세포 분화가 유도되어 신경, 당뇨, 혈액과 같은 질환의 세포 치료제로 이용될 수 있어서 한 개의 배아줄기세포주만으로도 수많은 환자의 치료에 이용될 수 있다고 기대되는 만능세포를 의미한다.
본 발명에서 "유도 다능성 줄기세포"는 분화된 세포들이 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서, 역분화 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells)이라고도 한다.
본 발명에서 "성체줄기세포"는 인간을 포함한 포유동물의 조직에서 분리해 낸, 분화되기 직전의 원시세포로서, 무한정으로 증식할 수 있는 능력 및 여러 가지 형태의 세포(예를 들면, 지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포등)로 분화할 수 있는 줄기세포이다.
본 발명에서 "분화"는 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달하여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 의미한다. 상기 "분화"는 주로 다세포 생물이 단일 접합자(zygote)에서 복잡한 조직을 형성하는 과정 중에 일어나거나, 성인이 되었을 때 손상된 조직을 복구하는 경우 성체줄기세포가 특정한 세포로 분화하게 된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 "분화"는 줄기세포가 연골세포로 분화하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물에는 쿠민 추출물이 0.0001 내지 10 μg/ml의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.0005 내지 5 μg/ml의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 1 μg/ml의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
본 발명의 또 다른 측면은 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지를 제공한다.
상기 쿠민 추출물은 줄기세포 배양용 배지에 일 성분으로 포함될 수 있다.
상기 줄기세포 배양용 배지는 줄기세포의 배양에 통상적으로 이용되는 모든 배지를 포함하고, 예를 들어 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, MEM(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)등과 같은 기본 배지, 또는 연골분화를 유도할 수 있는 성분이 함유된 배지일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 배양용 배지에 포함되는 상기 쿠민 추출물은 쿠민의 다양한 기관 또는 부분 (예: 잎, 꽃, 열매, 종자, 줄기, 뿌리, 가지 및 껍질 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 쿠민의 종자로부터 얻은 추출물일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 배양용 배지로 배양되는 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 및 각종 분화 세포를 초기화시킨 유도 다능성 줄기세로(ips 세포)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 성체줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 골수(bone marrow) 유래인 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 배양용 배지에 포함되는 쿠민 추출물은 0.0001 내지 10 μg/ml의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.0005 내지 5 μg/ml의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 1 μg/ml의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
본 발명의 또 다른 측면은 분리된 줄기세포에 쿠민 추출물을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법은 분리된 줄기세포에 상기 쿠민 추출물을 처리하는 단계 및 상기 쿠민 추출물이 처리된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 연골분화 촉진의 대상이 되는 줄기세포는 인 비트로(in vitro) 상태일 수 있고, 쿠민 추출물은 상기 줄기세포 배양용 배지의 형태로 줄기세포에 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 연골분화를 촉진하기 위하여 줄기세포는 3차원 지지체에서 배양될 수 있다. 상기 지지체를 구성하는 성분은 생체적합한 물질을 사용할 수 있고, 지지체에서 배양되어 분화된 조골세포는 지지체로부터 별도로 분리하지 않고 골질환 치료를 위하여 지지체에 부착된 상태로 생체에 이식될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법에 포함되는 상기 쿠민 추출물은 쿠민의 다양한 기관 또는 부분 (예: 잎, 꽃, 열매, 종자, 줄기, 뿌리, 가지 및 껍질 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 쿠민의 종자로부터 얻은 추출물일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법에 포함되는 상기 쿠민 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출될 수 있으며, 상기 추출용매는 바람직하게는 메탄올일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 쿠민 추출물을 처리하는 단계는 쿠민 추출물을 0.0001 내지 10 μg/ml의 농도로 처리될 수 있고, 바람직하게는 0.0005 내지 5 μg/ml의 농도로 처리될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 1 μg/ml의 농도로 처리될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 연골분화 촉진용 조성물로 분화된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 골결손증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "골결손증"은 골분화 및 재생을 필요로 하는 골에 관련된 질환을 의미하며, 골절 등 외상성 골손상 및 수술 후 발생한 골결손을 포함한다.
본 발명의 분화된 연골세포는 각종 세포 치료에 이용될 수 있다. 분화된 조골세포는 콜라겐이나 히드록시아파타이트 스캐폴드 등 다양한 생체보조제와 혼합하여 외과수술로 골조직에 이식할 수 있다.
본 발명에 따른　골결손증　예방 또는 치료용　조성물은 상기 분화된 조골세포 외에 보조성분으로서 콜라겐이나 골지지체 등을 더 함유할 수 있다.
본 발명에 따른　골결손증　예방 또는 치료용　조성물　중 분화된 연골세포는 질병의 유형, 투여경로, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 수를 조절할 수 있고, 바람직하게는 성인의 경우 1~5×107　cell/cm3　스캐폴드로, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물은 줄기세포를 연골세포로 촉진을 유도시키는 효과가 현저하여, 줄기세포를 연골세포로 유도하고자 할 때 유용하며, 유도된 연골세포를 치과 영역을 비롯한 연골세포가 필요한 다양한 재생의료시장에 적용이 가능하므로 그 활용도가 높은 이점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 이용하여 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하여　골결손증의 예방 및 치료제로서 사용하게 할 수 있는 이점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 줄기세포의 배양 및 분석방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 연골분화 유도 배지에서 쿠민 추출물을 다양한 농도(0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml)로 처리한 후 배양 1, 3, 7 및 14일자의 줄기세포의 형태변화를 역상 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 3은 연골분화 유도 배지에서 쿠민 추출물을 다양한 농도(0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml)로 처리한 후 배양 1, 3, 5 및 7일자의 세포 스페로이드의 직경 변화를 나타낸 것이다.
도 4a는 연골분화 유도 배지에서 쿠민 추출물을 다양한 농도(0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml)로 처리한 후 배양 7 및 14일자의 알시안 염색 후 이미지를 나타낸 것이다.
도 4b는 연골분화 유도 배지에서 쿠민 추출물을 다양한 농도(0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml)로 처리한 후 배양 7 및 14일자의 밀도계에 의한 알시안 염색 결과의 정량 분석값을 나타낸 것이다.
도 5a는 연골분화 유도 배지에서 쿠민 추출물을 다양한 농도(0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml)로 처리한 후 배양 14일자의 정량적 실시간 PCR에 의한 Sox9 mRNA 발현값을 나타낸 것이다.
도 5b는 연골분화 유도 배지에서 쿠민 추출물을 다양한 농도(0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml)로 처리한 후 배양 14일자의 정량적 실시간 PCR에 의한 COL2A1 mRNA 발현값을 나타낸 것이다.
도 5c는 연골분화 유도 배지에서 쿠민 추출물을 다양한 농도(0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml)로 처리한 후 배양 14일자의 정량적 실시간 PCR에 의한 COL1A1 mRNA 발현값을 나타낸 것이다.
도 6은 Sox9, collagen II 및 collagen I 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
실시예
실험 재료 및 방법
1. 쿠민(cumin) 추출물의 제조
본 발명의 쿠민(cumin, Cuminum cyminum L.)은 방글라데시의 라지샤히 (Rajshahi) 지역, 보그라 (Bogra) 지구에 있는 시브곤지(Shibgonj) 하위 지구에서 살라 후딘 박사(Md. Salah Uddin)에 의해 수집되었다.
KRIB 0086021로 기록된 바우처 표본이 한국생명공학연구원 식물표본관에 기탁되었다.
쿠민의 종자를 건조하고 분쇄한 후 생성된 분말(75 g)을 45°C에서 3일 동안, 99.9% (v/v) 메탄올 1 L로 반복적인 초음파 처리(15 분) 및 침지(2 시간)하여 추출하였다.
상기 생성물을 비 형광면(non-fluorescence cottons)으로 여과하고 회전식 증류기(N-1000SWD, EYELA)를 이용하여 45°C에서 감압 하에서 농축하고 동결 건조에 의해 13.2 g의 쿠민(cumin) 추출물을 수득하였다.
2. 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(BMSCs) 배양
본 발명의 프로토콜은 가톨릭대학교 의과대학 서울성모병원의 임상시험연구심사위원회에서 검토 및 승인되었다. 모든 실험은 헬싱키 선언에 명시된 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.
도 1에 본 발명에 따른 줄기세포 배양 및 분석방법의 개요를 나타내었다.
인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(Human bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs); 가톨릭 MASTER 세포)를 가톨릭 세포 치료 사업단(CIC, 서울, 한국)에서 입수하였다.
BMSCs의 분리 및 특성화는 이전에 보고된 방법에 따라 수행되었다 (Jeong, C.H., et al., 2014. Biomed Res Int 2014: 129145). 가톨릭 세포 치료 사업단에서 상기 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포가 90% 이상 CD73 및 CD90을 발현하는 것으로 확인하였다.
배양 배지를 2일 또는 3일마다 교환하고, 골수 유래 중간엽 줄기세포를 95% O2 및 5% CO2의 37°C 배양기에서 증식시켰다.
3. 줄기세포 형태 분석
상기 줄기세포를 600 μm 직경의 실리콘 엘라스토머 기반 오목 마이크로웰 (Silicon elastomer-based concave microwells; StemFIT 3D; MicroFIT, 성남, 경기도)에 1Х106 cells/well의 밀도로 도말하고 연골 유도 배지(STEMPRO Chondrogenesis Differentiation kit; Gibco)에서 배양하였다. 또한, 배지를 2~3 일마다 새로운 유도 배지로 교체하였다.
쿠민 추출물의 최종 처리농도는 각각 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml이다. 배양 1, 3, 7 및 14일자에 역상 현미경(CKX41SF, Olympus Corporation, Tokyo, 일본)을 사용하여 형태학적 평가를 수행하였다.
4. 알시안 블루(Alcian blue) 염색
7 일과 14 일째에 각각 세포를 인산염 완충 식염수로 두 번 헹구고 4% 파라 포름알데히드로 20°C에서 15분 동안 고정하였다. 이어서 세포를 증류수로 세척하고 60% 이소프로판올로 헹구고 알시안 블루 용액 (SigmaAldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germany)으로 20분 동안 덮었다. 배양 후, 세포를 3% 아세트산으로 헹구고 증류수(D.W)로 세척하였다.
역상 현미경을 사용하여 세포 형태를 관찰하고 이미지 분석 소프트웨어 (ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 알시안 블루 염색의 강도를 측정하여 연골 형성의 상대 값을 결정하였다.
5. 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)에 의한 SOX9, COL1A1 및 COL2A1
연골 형성을 유도한지 14 일 후, 스페로이드(spheroids)를 TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 균질화하고 total RNA를 얻었다.
Complementary DNA는 제조사의 지시에 따라 SuperScript Ⅱ RTase (Invitrogen)에 의해 합성되었다.
SYBR Green PCR Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 StepOnePlus™ Real Time PCR System(Applied Biosystems, Waltham, MA)에서 Real-time PCR을 수행하였다.
연골 형성 마커 유전자(chondrogenic marker genes)로서 SOX9 및 COL2A1, 섬유 연골 마커 유전자(fibrocartilage marker gene)로서 COL1A1의 mRNA 발현을 평가하였다. 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
Gene Accession No. Primer sequences
SOX9 NM 000346.4 forward: 5'-CCCTTCAACCTCCCACACT-3'
reverse: 5'-GAGTTCTGGTGGTCGGTGTA-3'
COL2A1 NM 033150.3 forward: 5'-AAGGTTTTCTGCAACATGGA-3'
reverse: 5'-TCTTCTTGGGAACGTTTGCT-3'
COL1A1 NM 000088.4 forward 5'-TACCCCACTCAGCCCAGTGT-3'
reverse: 5'-CCGAACCAGACATGCCTCTT-3'
β-actin NM 001101 forward: 5'-AATGCTTCTAGGCGGACTATGA-3'
reverse: 5'-TTTCTGCGCAAGTTAGGTTTT-3'
상기 반응은 95°C에서 10 분, 95°C에서 15 초 동안 40 사이클 및 59°C에서 30 초로 수행되었다. mRNA 발현 수준은 β-actin 수준으로 정규화되었다.
6. 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석
연골 형성 배지 하에서 배양된 스페로이드(spheroids)를 14일에 수집하고(스페로이드(Spheroid)수=300) 1x인산염 완충 식염수로 세척하였다. 50mM Tris-HCl(PH 7.8), 150mM NaCl, 1% IGEPAL, 10mM NaF, 0.1mM EDTA 및 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충액(buffer)으로 세포주를 용해시켰다.
단백질 농도는 Bradford Assay 용액(Bio-Rad, Contra Costa County, CA)을 기반으로 한 단백질 분석 방법을 사용하여 결정하였다.
동일한 양의 단백질(10 ㎍)을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide 10% gel electrophoresis)에 110V로 2시간 동안 로드하고, PVDF 멤브레인(Merck Millipore, Burlington, MA)에 100V에서 1.5시간 동안 수행하였다.
멤브레인(membrane)을 5% 탈지유(skimmed milk)에서 1 시간 동안 실온에서 차단하고, 이어서, 1차 항체 9(anti-rabbit SOX9 antibody (D8G8H; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA)), 항 토끼 collagen II 항체(ab34712; Abcam, Cambridge, MA), 항-토끼 collagen I 항체(ab34710; Abcam) 및 항-마우스
Figure pat00001
-Actin(SC-47778; Santa Cruz Biotechnologies, Dallas, TX)를 4°C에서 밤새 배양하였다.
이 후, 멤브레인(membrane)을 2차 항체(mouse anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated IgG secondary antibody(SC-2357; Santa Cruz Biotechnology)) 및 항 마우스 horseradish peroxidase(HRP) 결합된 IgG 2차 항체(SC-516102; Santa Cruz Biotechnology)와 함께 1:3,000 희석으로 실온에서 1시간 배양하였다.
멤브레인(membrane)을 ECL Prime 웨스턴 블로팅 시약(RPN2232; GE Heath Care, Chicago, IL)을 사용하여 시각화되었고 이미지는 화학 발광 웨스턴 시스템(Advansta, San Jose, CA)을 위해 X-ray 필름을 사용하였다.
상대적인 단백질 발현 수준은 상응하는 로딩 대조군 β-actin의 수준으로 정규화하였다. 상기 실험은 3 회 수행되었으며, 정량화는 이미지 분석 소프트웨어 (ImageJ)를 사용하였다.
7. 통계 분석
실험 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 정규성 검정 (Normality Test)을 수행하였고, 시판되는 프로그램(SPSS 12 for Windows, SPSS Inc., 미국)을 이용하여 그룹 간의 차이를 확인하기 위해 Tukey의 사후 검증(post hoc test)을 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)을 수행하였다. 유의 수준은 0.05이다.
실험결과
1. 줄기세포 형태 평가
쿠민 추출물(CCT)을 최종 농도 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml로 1, 3, 7 및 14일에 처리한 줄기세포의 형태에 대한 이미지를 도 2에 나타내었다. 온전한 줄기세포 스페로이드(spheroids)는 1일차에 실리콘 엘라스토머(silicone elastomer)로 만든 오목한 마이크로웰에 만들어졌다.
쿠민 추출물(CCT)을 0.001, 0.01, 0.1 및 1μg/ml의 최종 농도로 처리한 줄기세포의 형태는 처리되지 않은 대조군과 비교했을 때 눈에 띄는 변화를 나타내었다. 또한 3, 7 또는 14일까지 연장 배양할 경우, 줄기세포의 형태학적 변화가 관찰되지 않았다.
2. 스페로이드(Spheroid) 직경 평가
모든 그룹의 스페로이드(Spheroid는 1일차부터 14일차까지 크기를 유지하였다. (도 3).
1 일째 스페로이드(Spheroid)의 직경은 쿠민 추출물(CCT)의 처리농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml에 따라 각각 138.8 ± 12.7, 106.1 ± 18.0, 129.6 ± 15.0, 125.2 ± 18.0 및 164.7 ± 11.1이었다(P>0.05).
3 일째 스페로이드(Spheroid)의 직경은 쿠민 추출물(CCT)의 처리농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml에 따라 각각 120.7 ± 12.4, 103.0 ± 5.7, 131.0 ± 13.2, 122.6 ± 9.0 및 148.9 ± 10.5이었다(P<0.05).
7 일째 스페로이드(Spheroid)의 직경은 쿠민 추출물(CCT)의 처리농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml에 따라 각각 129.0 ± 19.5, 123.3 ± 14.8, 115.3 ± 17.7, 140.5 ± 9.5 및 137.6 ± 6.3이었다(P>0.05).
14 일째 스페로이드(Spheroid)의 직경은 쿠민 추출물(CCT)의 처리농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml에 따라 각각 151.7 ± 22.0, 167.3 ± 22.2, 125.8 ± 12.9, 167.8 ± 18.6 및 155.9 ± 21.9이었다(P>0.05).
3. 알시안 블루(Alcian blue) 염색 평가
알시안 블루 염색은 연골 특이적 단백질 발현의 존재를 검출하기 위해 7일차 및 14 일차에 수행하였다(도 4a).
7일째 연골 특이적 단백질의 상대적 발현은 쿠민 추출물(CCT)의 처리농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml에 따라 각각 100.0 ± 1.3, 93.6 ± 3.7, 80.5 ± 7.9, 71.1 ± 5.6 및 71.4 ± 5.0이었다.
14 일째의 연골 특이적 단백질의 상대적 발현은 쿠민 추출물(CCT)의 처리농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml에 따라 각각 110.5 ± 3.5, 99.8 ± 3.3, 72.1 ± 8.6, 73.2 ± 2.2 및 106.8 ± 2.7이었다.
4. 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)에 의한 SOX9, COL1A1 및 COL2A1 평가
정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응에 의하여 쿠민 추출물(CCT)의 처리농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml에 따라 각각 SOX9의 mRNA 수준이 1.009 ± 0.172, 1.473 ± 0.130, 1.083 ± 0.047, 1.156 ± 0.100 및 0.772 ± 0.061 인 것으로 확인되었다(도 5a)(P <0.05).
정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응에 의하여 쿠민 추출물(CCT)의 처리농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml에 따라 각각 COL2A1의 mRNA 수준이 1.000 ± 0.015, 1.432 ± 0.222, 0.784 ± 0.096, 0.860 ± 0.304 및 0.649 ± 0.072 인 것으로 확인되었다(도 5b)(P> 0.05).
정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응에 의하여 쿠민 추출물(CCT)의 처리농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml에 따라 각각 COL1A1의 mRNA 수준이 1.031 ± 0.299, 0.722 ± 0.042, 0.750 ± 0.061, 0.587 ± 0.037 및 0.538 ± 0.007 인 것으로 확인되었다(도 5c)(P <0.05).
5. 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석 평가
Sox9, collagen II 및 collagen I 단백질 발현을 분석하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(도 6).
단백질 발현의 정규화는 대조군을 100%로 고려했을 때, 쿠민 추출물(CCT)의 처리농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml에 따라 각각 Sox9 발현은 245.6, 203.9, 116.3 및 48.1임을 확인하였다.
collagen II 발현 수준은 검출 불가능한 수준과 유사하게 낮았다.
단백질 발현의 정규화는 대조군을 100 %로 고려했을 때, 쿠민 추출물(CCT)의 처리농도 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml에 따라 각각 collagen I 발현은 85.0, 56.6, 92.1 및 75.0임을 확인하였다.
상기의 결과로부터, 쿠민 추출물의 처리에 의해 줄기세포의 연골세포로의 분화와 관련된 유전자의 발현이 상당히 증가됨에 따라, 줄기세포의 연골세포로의 분화를 향상시켰음을 확인할 수 있다.

Claims (20)

  1. 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 쿠민 추출물은 쿠민의 종자로부터 추출한 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 쿠민 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출되는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유기용매는 C1-C4의 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기용매인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 알코올은 메탄올인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 성체줄기세포는 골수(bone marrow) 유래인 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 쿠민 추출물을 0.0001 내지 10 μg/ml의 함량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  9. 쿠민 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 쿠민 추출물은 쿠민의 종자로부터 추출한 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양용 배지.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 줄기세포는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양용 배지.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 성체줄기세포는 골수(bone marrow) 유래인 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양용 배지.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 배지는 쿠민 추출물을 0.0001 내지 10 μg/ml의 함량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양용 배지.
  14. 분리된 줄기세포에 쿠민 추출물을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 쿠민 추출물은 쿠민의 종자로부터 추출한 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 쿠민 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출되는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 유기용매는 C1-C4의 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기용매인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 알코올은 메탄올인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 쿠민 추출물을 처리하는 단계는 쿠민 추출물을 0.0001 내지 10 μg/ml의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 의해 분화된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 골결손증 예방 또는 치료용 조성물.
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