TWI826635B - 包含單克隆幹細胞的組合物的用途、製備單克隆幹細胞的方法以及幹細胞的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及包含通過改良的幹細胞層分離培養獲得的單克隆幹細胞的 用於預防、治療或改善特應性皮炎的組合物、其製備方法以及利用其的特應性皮炎治療方法。根據本發明的改良的幹細胞層分離培養及增殖方法，可通過單克隆幹細胞的快速增殖來在短時間內獲得大量所需的單克隆幹細胞，由此獲得的單克隆間充質幹細胞是治療特應性皮炎效果增強的幹細胞，可有效地用作特應性皮炎治療劑。

Description

包含單克隆幹細胞的組合物的用途、製備單克隆幹細胞的方 法以及幹細胞的用途
本分發明涉及包含通過改良的幹細胞層分離培養獲得的單克隆幹細胞的用於預防、治療或改善特應性皮炎的組合物、其製備方法以及利用其的特應性皮炎治療方法。
還被稱為特應性濕疹的特應性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一種常見的炎性皮膚疾病，據報導，急性特應性皮炎的發病機制與CD4+T細胞及嗜酸性粒細胞的皮膚滲透、免疫球蛋白E(IgE)及Th2細胞因數分泌增加介導的Th2炎症反應有關。特應性皮炎伴有嚴重的瘙癢和皮膚乾燥等症狀，並且特應性在血液中具有較高的免疫球蛋白E表達量，並以嗜酸性粒細胞的增加等為特徵。最近，特應性皮炎據估計特應性皮炎發生在大約10%至20%的人口中，但是實際上尚無明確的治療法，尤其，大多數病例被診斷在5歲以下的幼小年紀，其中50%診斷在6個月至24個月之間。大韓小兒過敏呼吸器官學會進行的國家流行病學調查中，近十年來特應性皮炎的患病率逐漸上升，並且對此的社會關注度也在增 加。由於50%至75%的特應性皮炎患兒表現出發展為哮喘、鼻炎的過敏性疾病的進展，作為過敏性疾病起點的特應性皮炎的早期診斷和管理對於預防成人過敏的進行非常重要。
特應性皮炎是由許多因素引起的，包括諸如T淋巴細胞的活化、細胞因數系統的異常、細胞介導的免疫力降低、免疫球蛋白E的增加之類的免疫因素和諸如皮膚的生化缺陷之類的生理因素。為了治療這種特應性皮炎，需要對乾燥皮膚進行保濕，並且通常需要用諸如類固醇之類的藥物進行治療。在症狀較輕的情況下，作為特應性皮炎的治療劑使用局部類固醇、抗組胺劑、抗生素及局部免疫反應調節劑等。在作為重症的特應性皮炎的情況下，使用全身類固醇或免疫製劑，但是長期使用時產生副作用，並且如果停止服藥，則該病變很有可能復發，因此，需要即使長期使用也安全有效的治療法。
最近，正嘗試使用幹細胞治療各種炎性疾病。幹細胞具有可生長成我們體內的所有210多種器官的組織的潛力，可以無限分裂，並且可通過適當的操作分化為所需的器官。由於幹細胞的這些特性，幹細胞作為一種新型治療劑備受關注，並且使用幹細胞治療頑固性疾病的可能性非常高，因此有望治療多種疾病，例如白血病、骨質疏鬆症、肝炎、帕金森氏病、老年性癡呆、燒傷等。
然而，在幹細胞的情況下，由於很難獲得大量幹細胞，因此仍然存在許多限制。作為獲得幹細胞的方法，從冷凍的胚胎細胞中獲得幹細胞的方法可能是有效的，但是道德方面仍然存在很多爭議。為了解決這種問題，關於利用體細胞核移植或成體幹細胞來獲得幹細胞的方法也進行了許多研究。相對於對胚胎幹細胞的研究，更積極進行對成體幹細胞的研究。成體幹細胞是保留 在中樞神經系統或骨髓等各種器官中並參與生長期的器官的發育和損傷期的再生的細胞，由於它們存在於各種器官，因此可以從包括骨髓、脾臟和脂肪細胞等在內的各種部位獲得，但是從骨髓獲得的方法最常用。然而，在從許多不同種類的骨髓細胞中分離並培養間充質幹細胞中，總是很難獲得均勻形態的細胞，因此進行了用於完善這種問題的研究。
本發明人發明了被命名為新型層分離培養方法的幹細胞的分離方法，通過韓國專利申請KR 10-2006-0075676號申請專利並授權。上述層分離培養法與其他幹細胞獲得方法相比具有優越的優秀性，不僅能夠以比其他方法更低的成本進行，而且沒有污染問題，並且可以有效地獲得菌落間充質幹細胞(cMSC)，而不必擔心與其他幹細胞的混合。然而，儘管上述方法具有優秀性，但是層分離培養法在獲得快速單克隆間充質幹細胞群體方面有局限性，為了生產大量充質幹細胞並將其用作最終產品，必須製備工作細胞庫，並且通過由此獲得最終產物的工序，可獲得足夠量的間充質幹細胞，並且需要至少培養至第十代(Passage)以上。
因此，為治療炎性疾病，尤其為治療特應性皮炎而使用幹細胞仍然具有多種局限性，迄今為止，沒有用於有效治療特應性皮炎的製備方法和利用其的特應性皮炎治療方法。
本發明人在研究通過改良如上所述的層分離培養法來誘導幹細胞的快速增殖的過程中，在利用通過調低培養細胞密度並添加抗氧化劑來進行 培養的改良的層分離培養法的情況下，僅少量傳代培養可以誘導細胞增殖率的有效增加，與現有的層分離培養方法的幹細胞相比，確認由此獲得的單克隆幹細胞具有非常顯著的特應性皮炎治療效果，從而完成了本發明。
因此，本發明的目的在於，提供包含單克隆幹細胞的用於預防、治療及改善特應性皮炎的組合物及其製備方法，上述單克隆幹細胞通過改良現有層分離方法的幹細胞的層分離培養及增殖方法獲得。
為了實現上述目的，本發明提供一種用於防或治療特應性皮炎的藥學組合物，包含含通過如下步驟獲得的單克隆幹細胞：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。
並且，本發明提供一種用於預防或改善特應性皮炎的化妝品組合物，包含通過如下步驟獲得的單克隆幹細胞：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。
並且，本發明提供一種用於預防或治療特應性皮炎的准藥物組合物，包含通過如下步驟獲得的單克隆幹細胞：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養； 步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。
並且，本發明提供一種用於預防、改善或治療特應性皮炎的藥學組合物的製備方法，包括：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。
並且，本發明提供一種用於預防、改善或治療特應性皮炎的方法，包括：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；步驟5)，以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養；以及步驟6)，向個體給藥上述單克隆幹細胞。
並且，本發明提供一種用於預防、改善或治療特應性皮炎的幹細胞，通過如下步驟獲得：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克 隆幹細胞；以及步驟5)，以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。
根據本發明的改良的幹細胞層分離培養及增殖方法，可通過單克隆幹細胞的快速增殖來在短時間內獲得大量所需的單克隆幹細胞，由此獲得的單克隆間充質幹細胞是治療特應性皮炎效果增強的幹細胞，可有效地用作特應性皮炎治療劑。
圖1為示出從骨髓分離單克隆間充質幹細胞的現有層分離培養法的圖。
圖2為示出通過顯微鏡觀察確認根據細胞培養密度及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞的形態變化的結果的圖。
圖3為示出通過流式細胞儀(Flow cytometry；FACS)分析並以前向散射(forward scatter；FSC)(A)及側向散射(side scatter；SSC)(B)光的平均值確認根據細胞培養密度及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞的細胞大小及粒度(granularity)變化的結果的圖(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。
圖4為示出在以不同的細胞培養密度及細胞傳代培養下培養單克隆間充質幹細胞中，通過β半乳糖苷酶(β-gal)活性染色確認細胞是否老化的結果的圖。
圖5為示出在不同細胞培養密度下培養第十五代(Passage 15；P15)單克隆間充質幹細胞後，通過反轉錄聚合酶鏈式擴增反應(RT-PCR)確認作為老 化相關基因的p15、p16及作為增殖標記物的增殖細胞核抗原(PCNA)的結果的圖。
圖6為示出通過細胞群體倍增時間(Population Doubling Time；PDT)及細胞群體倍增水準(population Doubling Level；PDL)確認根據細胞培養密度及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞的增殖能力的結果的圖(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。
圖7為示出確認根據細胞培養密度及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞的分化能力的結果的圖(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。圖7的A部分為通過油紅O(Oil red O)組織學染色確認根據細胞培養及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞分化成脂肪細胞的能力的結果，圖7的B部分為示出對A部分的組織學染色程度進行定量的圖。圖7的C部分為通過茜素紅S(Alizarin red S)組織學染色確認根據細胞培養及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞分化成破骨細胞的能力的結果，圖7的D部分為示出對C部分的組織學染色程度進行定量的圖。
圖8為示出通過彗星試驗(comet assay)確認根據細胞培養密度及細胞傳代培養的單克隆間充質幹細胞中產生的總活性氧種(reactive oxygen species；ROS)的產生(A)以及基於此的去氧核糖核酸(DNA)損傷(B)的結果的圖(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。
圖9為示出用於確認由根據細胞培養密度及細胞傳代培養產生的活性氧種引起的去氧核糖核酸損傷程度而測定8-羥基-去氧鳥苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine；8-OHdG)濃度的結果的圖。(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。
圖10為示出通過單獨的高密度條件(HD)或高密度條件+抗壞血酸(抗氧化劑的一種)(HD+AA)來培養第十一代(P11)至第十五代(P15)的單克隆間充質幹細胞後確認細胞增殖能力變化的結果的圖。
圖11為示出通過單獨的高密度條件(HD)或高密度條件+抗壞血酸(HD+AA)來培養第十五代(P15)的單克隆間充質幹細胞後，比較所產生的活性氧種水準的結果的圖(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。
圖12a為示出現有的層分離培養法及改良的層分離培養法實驗方法的圖。
圖12b為改良的層分離培養法的示意圖，與現有的層分離培養法不同的對應於第二代之後的低密度培養的示意圖。
圖13至圖20為示出將通過層分離培養法獲得的SCM01至SCM08單克隆間充質幹細胞以1000細胞/cm2或4000細胞/cm2密度接種並利用添加或不添加抗氧化劑的Dulbecco改良的Eagle培養基，低葡萄糖(Dulbecco's Modified Eagle Medium，low glucose；LG-DMEM)，最低基本培養基α(Minimum Essential Medium α，α-MEM)培養基培養的細胞的增殖率的結果的圖。各圖的A部分為示出根據各實驗組第一代(P1)至第五代(P5)的細胞數變化、各圖的B部分為各實驗組的群體倍增時間及群體倍增水準結果的圖。
圖21為示出使用不添加抗氧化劑的LG-DMEM培養基，確認僅將細胞密度改為1000細胞/cm2或4000細胞/cm2密度的實驗組中的細胞增殖率的結果的圖。
圖22為示出使用不添加抗氧化劑的LG-DMEM培養基，確認僅將細胞密度改為1000細胞/cm2或4000細胞/cm2密度的實驗組中的群體倍增時間及群體倍增水準的結果的圖。
圖23為示出使用添加抗氧化劑的α-MEM培養基，確認僅將細胞密度改為1000細胞/cm2或4000細胞/cm2密度的實驗組中的細胞增殖率的結果的圖。
圖24為示出使用添加抗氧化劑的α-MEM培養基，確認僅將細胞密度改為1000細胞/cm2或4000細胞/cm2密度的實驗組中的群體倍增時間及群體倍增水準的結果的圖。
圖25為示出將細胞密度固定為1000細胞/cm2密度，並確認將培養基改為LG-DMEM或α-MEM的實驗組中的細胞增殖率的結果的圖。
圖26為示出將細胞密度固定為1000細胞/cm2密度，並確認將培養基改為LG-DMEM或α-MEM的實驗組中的群體倍增時間及群體倍增水準的結果的圖。
圖27為示出在特應性皮炎動物模型中根據對照組(Cell Vehicle，veh)、GCM-MSC、SCM-cMSC給藥確認皮膚病變的變化的結果的圖。
圖28為示出通過蘇木精—伊紅(H&E)及甲苯胺藍染色，在特應性皮炎動物模型中根據對照組(Cell Vehicle，veh)、GCM-MSC、SCM-cMSC給藥確認皮膚病變的變化的結果的圖。
圖29為示出在特應性皮炎動物模型中根據對照組(Cell Vehicle，veh)、GCM-MSC、SCM-cMSC給藥確認表皮厚度的變化的結果的圖(*P=0.0152，**P=0.0016)。
圖30為示出在特應性皮炎動物模型中根據對照組(Cell Vehicle，veh)、GCM-MSC、SCM-cMSC給藥確認真皮厚度的變化的結果的圖(***P=0.0003)。
圖31根據對照組(Cell Vehicle，veh)、GCM-MSC、SCM-cMSC處理確認免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1(IgG1)生產量的變化的結果的圖(IgE-P**=0.009，IgG1-P*=0.0432)。
圖32為根據對照組(Cell Vehicle，veh)、GCM-MSC、SCM-cMSC處理確認免疫球蛋白G2a(IgG2a)生產量變化的結果的圖(P****<0.0001)。
圖33為示出根據對照組(Cell Vehicle，veh)、GCM-MSC、SCM-cMSC處理確認腋窩淋巴結中的白細胞介素4(IL-4)、γ-干擾素(IFN-γ)生產量變化的結果的圖(***P=0.0008，P*=0.0338)。
圖34為示出根據對照組(Cell Vehicle，veh)、GCM-MSC、SCM-cMSC處理確認肥大細胞數量變化的結果的圖。(P**=0.0026，0.0036)。
圖35為示出在特應性皮炎動物模型中根據對照組(Cell Vehicle，veh)、cMSC1(100細胞/cm2、1000細胞/cm2)、cMSC2(4000細胞/cm2)給藥確認體重變化的結果的圖。
圖36為示出在特應性皮炎動物模型中根據cMSC1(100細胞/cm2、1000細胞/cm2)、cMSC2(4000細胞/cm2)給藥確認細胞存活率的結果的圖。
圖37為示出通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)，在特應性皮炎動物模型中根據正常對照組(naïve)、對照組(Cell Vehicle，veh)、cMSC1(100細胞/cm2、1000細胞/cm2)、cMSC2(4000細胞/cm2)給藥確認總免疫球蛋白E生產量變化的結果的圖(1way ANOVA-Tukey’s multiple comparisons test ****P<0.0001 ***P=0.0001 *P=0.0238 compared to Veh.Unpaired t test-#P=0.0336 compared to 100細胞/cm2 group)。
圖38為示出確認在特應性皮炎動物模型中根據塗敷正常對照組(-)、對照組(PBS，veh)、cMSC1(100細胞/cm2、1000細胞/cm2)、cMSC2(4000細胞/cm2)的皮膚病變的變化的結果的圖。
圖39為示出確認在特應性皮炎動物模型中根據正常對照組(-)、對照組(PBS，veh)、cMSC1(100細胞/cm2，1000細胞/cm2)、cMSC2(4000細胞/cm2)塗敷的表皮增厚緩解效果的結果的圖。
本發明涉及一種預防或治療特應性皮炎的方法，包括向所需的個體給藥包含單克隆抗體的用於預防或治療特應性皮炎的藥學組合物或上述單克隆幹細胞的步驟，上述單克隆幹細胞通過改良的間充質幹細胞的層分離培養及增殖方法獲得。
並且，本發明涉及一種用於預防、改善或治療特應性皮炎的組合物的製備方法，包括通過改良的間充質幹細胞的層分離培養及增殖方法獲得單克隆幹細胞。
作為本發明的有效成分的單克隆幹細胞是通過改良的層分離培養方法獲得的幹細胞，上述改良的層分離培養方法除了具有能夠快速且無污染地獲得幹細胞的優點以外，通過單克隆幹細胞，優選為單克隆間充質幹細胞的快速增殖在短時間內可獲得大量所需的單克隆幹細胞，而不需要製備工作細胞庫(Working Cell Bank，WCB)的步驟。與通過現有的層分離培養方法獲得的幹細胞相比，通過上述方法獲得的單克隆幹細胞的特徵在於，其是治療特應性皮炎效果增強的幹細胞。
以下，詳細說明本發明。
本發明提供本發明提供一種用於防或治療特應性皮炎的藥學組合物，包含通過如下步驟獲得的單克隆幹細胞：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。
上述步驟2)及步驟3)的培養可以如下進行：在30℃至40℃的溫度下培養4小時以下，優選地，培養1小時至3小時，更優選地，培養1小時30分 鐘至2小時30分鐘，重複培養是在30℃至40℃的溫度下培養4小時以下，優選地，培養1小時至3小時，更優選地，培養1小時30分鐘至2小時30分鐘後，在30℃至40℃的溫度下培養12至36小時，優選地，將18小時至30小時的培養重複兩次至三次，接著，在30℃至40℃的溫度下培養24小時至72小時，優選地，培養36小時至60小時，每次將上清液移到新的培養容器中。
本發明的實施例中分離的方法簡要說明如下。
Figure 109101125-A0305-02-0013-1
所培養的細胞形成單克隆細胞群體，在分離該單克隆細胞群體後可進行傳代培養，本發明的特徵在於，除了現有的層分離培養方法以外，還包括步驟5)的傳代培養步驟。
在本發明中，“層分離培養(Subfractionation Culturing Method，SCM)”是指根據比重分離幹細胞的方法，是指如下工序，即，首先，提取人骨髓並培養於細胞培養液後，獲得上清液並將其移到處理或未處理塗敷劑的培養容器中進行培養後，多次重複相同過程。這種層分離培養的特徵在於，重複進行通過重複獲得上清液來進行培養的工序，而無需離心過程，並且其優點在於， 最終可獲得單克隆幹細胞，優選地可獲得單克隆間充質幹細胞，而不會污染其他細胞。
本發明的上述步驟1)至步驟5)中步驟1)至步驟4)可以以與KR 10-2006-0075676號或KR10-2014-0170045號中記載的層分離培養方法相同或等同的方式進行，可以將KR 10-2006-0075676號的所有內容作為參照。
並且，現有KR10-2014-0170045號中公開了一種作為用於獲得與特應性皮炎的治療有關的獲得細胞的方法，通過層分離方法獲得單克隆幹細胞並利用其的用於預防或治療特異性皮炎的方法，上述方法包括：步驟(i)，通過在第一容器中培養來源於骨髓的間充質幹細胞來獲得上清液；步驟(ii)，將第一容器的上清液移至第二容器；步驟(iii)，通過培養存在於上述第二容器的細胞來獲得上清液；步驟(iv)，重複步驟(ii)及步驟(iii)三次以上；步驟(v)，分離來源於單細胞的菌落；以及步驟(vi)，將細胞從上述菌落移至生長培養基並培養細胞，其為僅利用密度差而無需進行離心來獲得單克隆幹細胞的方法，使用KR 10-2006-0075676號的現有層分離培養方法。
然而，上述KR 10-2006-0075676號及KR10-2014-0170045號的層分離培養方法未公開在低傳代時有效獲得單克隆幹細胞並由此治療特應性皮炎治療效果得到顯著改善的用於獲得改良的單克隆幹細胞的方法。
如圖1所示，現有層分離培養方法如下進行，即，從單菌落中獲得的所有細胞移到6孔中，並增殖至80~90%匯合(confluency)後，以增殖狀態的第一代(P1)細胞為種子細胞(seed cell)，在對密度調節不了解的情況下，為了獲得大量細胞，可以以4000細胞/cm2進行高密度培養。
與此相反，本發明涉及一種“改良的層分離培養方法”，其基於可通過調節細胞密度來有效地獲得預防、治療、改善特應性皮炎的效果優秀的幹細胞，其特徵在於，改變現有層分離培養方法和種子細胞培養步驟。例如，具 體地，包括“步驟5)，將步驟4)的上述單克隆幹細胞以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度接種於培養基中進行培養”。與現有的層分離培養方法相比，改良的層分離培養方法可誘導單克隆幹細胞的快速增殖，因此可快速獲得最終產物，優選地，僅培養至小於第十代如P2至P8來製備主細胞庫(Master Cell Bank，MCB)，並可獲得預防或治療特應性皮炎效果優秀的單克隆幹細胞。
如現有的工序所示，在以4000細胞/cm2的高密度培養本發明的單克隆幹細胞的情況下，細胞增殖能力顯著減少且間充質幹細胞的標記物發生變化，並且幹細胞的分化能力可能喪失。因此，通過改良的層分離培養法獲得的單克隆幹細胞意味著以低密度程度至中密度程度、小於4000細胞/cm2的細胞密度進行培養，例如，3000細胞/cm2以下，優選地，2000細胞/cm2以下，更優選地，50細胞/cm2至1000細胞/cm2(cells/cm2)的細胞密度培養。
與以4000細胞/cm2之類的高密度培養的間充質幹細胞相比，在以1000細胞/cm2以下的細胞密度培養單克隆間充質幹細胞的情況下，細胞的增殖能力在長期的培養時間內都保持很高，因此，具有無需重複多次傳代也可快速獲得大量所需的單克隆細胞的優點。因此，本發明的改良的層分離培養方法的特徵在於，將種子細胞之後的傳代培養步驟僅進行至小於第十代，優選地，僅進行至第八代以下，與為確保足夠數量的細胞而培養至最高第二十五代的現有的層分離培養方法相比，其具有僅用較少的傳代培養也可生產大量單克隆幹細胞的優點。
並且，在用上述細胞密度培養單克隆間充質幹細胞的情況下，該細胞的去氧核糖核酸的損傷較少，由於抑制老化，因此具有可有效地保持幹細胞的分化能力的優點，進而可快速獲得具有優秀的幹細胞特性的單克隆間充質幹細胞。
並且，與以4000細胞/cm2之類的高密度培養的單克隆幹細胞相比，根據本發明的方法獲得的單克隆幹細胞的預防、改善或治療特應性皮炎的效果優秀。
使用於本發明中的培養基均可包括不含抗氧化劑的培養基、上述培養基中添加有抗氧化劑的培養基或含抗氧化劑的培養基。
不含抗氧化劑的培養基並不限定於此，可使用DMEM培養基，根據需要在上述培養基中進一步添加抗氧化劑來進行培養。並且，根據需要，可通過使用含抗氧化劑的α-MEM培養基來進行培養。
本發明的抗氧化劑可以不受限制地包含可用於細胞培養的抗氧化劑，其可以為選自由穀胱甘肽(Glutathione)、半胱氨酸(Cysteine)、半胱胺(Cysteamine)、泛醇(Ubiquinol)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)及抗壞血酸(Ascorbic acid；AA)組成的組中的一種以上。在培養基中添加抗氧化劑的情況下，能夠以10μg/ml至50μg/ml的濃度，優選地，以10μg/ml至30μg/ml的濃度，更優選地，以25μg/ml的濃度添加上述抗氧化劑。
在本發明的一例中，作為不含抗氧化劑的培養基使用DMEM，更優選地，使用LG-DMEM培養基，作為含抗壞血酸作為抗氧化劑的培養基使用α-MEM培養基。
另一方面，根據本發明的方法，可以非常有效地增單克隆幹細胞，因此可省略通過使用主細胞庫來製備工作細胞庫的工序。與現有的層分離培養法相比，該方法簡化了在製備主細胞庫後需要伴隨製備工作細胞庫的工序。
在使用含抗氧化劑的培養基作為本發明的培養基的情況下，在上述培養基中還可添加慶大黴素作為抗生素。
優選地，通過本發明的方法獲得的間充質幹細胞最終可以是小於P2至P10的間充質幹細胞，更優選地，可以是P2至P8的間充質幹細胞，進一步優選地，可以是P2至P6的間充質幹細胞。
這表明，與以最終產物獲得至少培養至P10至P12的間充質幹細胞的現有的工序相比，是在更低的傳代時獲得的幹細胞，並且，可通過調節細胞接種密度來以在低傳代時輕鬆獲得大量快速增殖的間充質幹細胞。
在本發明中，與通過現有的層分離培養法獲得的單克隆幹細胞(以下標記為‘cMSC2’)相比，通過如上改良的層分離培養法，優選地，在2000細胞/cm2以下，更優選地，在1000細胞/cm2以下的低密度及抗氧化條件下改良的層分離培養法獲得的單克隆幹細胞(以下標記為‘cMSC1’或‘SCM-cMSC)的細胞大小更小並可以均勻地形成，緩解誘發特應性皮炎的皮膚真皮或表皮的增厚，抑制選自由免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1及白細胞介素4組成的組中的一種以上的生成，並促進γ-干擾素的生成，且抑制肥大細胞的效果優秀。
在本發明中，“特應性皮炎”是指可包括胎熱，並且可包括但不限於以皮膚乾燥症及瘙癢症為主要症狀的皮膚過敏性疾病。
通過本發明的方法獲得的單克隆幹細胞的特徵在於，可有效緩解在誘發特應性皮炎的皮膚中出現的硬皮、真皮的增厚及角質的症狀，尤其緩解真皮或表皮的增厚。
並且，通過本發明的方法獲得的單克隆幹細胞可改善從特應性皮炎誘發的各種免疫、炎症因數，優選地，抑制選自由免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1及白細胞介素4組成的組中的一種以上的生成，並可促進γ-干擾素的生成。
並且，通過本發明的方法獲得的單克隆幹細胞的特徵在於，可抑制誘發過敏性反應的細胞，優選地，抑制肥大細胞。
與通過現有的密度梯度離心方法獲得的幹細胞(GCM-MSC)以及通過現有的層分離方法獲得的cMSC2相比，作為通過本發明的方法獲得的單克隆幹細胞的cMSC1或SCM-cMSC的特徵在於，與特應性皮炎相關的組織學、生理學因數的改善效果也優秀。
本發明的藥學組合物可通過進一步包含除上述有效成分之外的一種以上藥學上可接受的載體來製備，以用於給藥。包含在本發明的藥學組合物中的藥學上可接受的載體是製劑時通常所使用的，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但並不限定於此。除了上述成分以外，本發明的藥學組合物還可包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、調味劑、乳化劑、懸浮劑、保鮮劑等。
本發明的藥學組合物的劑量可根據上述藥學組合物的製劑化方法、給藥方式、給藥時間和/或給藥途徑等而有所不同，並且可根據通過上述藥學組合物的給藥來所要實現的反應的類型和程度、成為給藥對象的個體的種類、年齡、體重、常規健康狀態、疾病的症狀程度、性別、飲食、排泄、包括與該個體同時使用或與之結合使用的藥物成分或其他成分在內的醫學領域眾所周知的幾種因素和類似因素而有所不同，本技術領域的普通技術人員可以容易地確定並開出對於所需治療有效的劑量。
例如，本發明的藥學組合物的劑量可以為每天1mg/kg至1000mg/kg，但是，上述劑量在任何方面均不限制本發明的範圍。
本發明的藥學組合物的給藥途徑及給藥方式可以彼此獨立，對其方式並沒有特別的限制，並且任何給藥途徑和給藥方式均可以，只要上述藥學組合物以達到所需的目的部位即可。
可通過口服給藥或非口服給藥方式給藥上述藥學組合物。例如，上述非口服給藥方式可利用靜脈內給藥、腹腔內給藥、肌肉內給藥、經皮給藥或皮下給藥等，並且還可利用將上述藥學組合物塗敷、噴霧或吸附在疾病部位的方法，但並不限定於此。
並且，本發明提供一種用於預防或治療特應性皮炎的方法，包括：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；步驟5)，以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養；以及步驟6)，向個體給藥上述單克隆幹細胞。
在本發明中，上述“個體”包括需要預防或治療特應性皮炎的個體，可以是哺乳類或除人類以外的哺乳類。
在向個體給藥本發明的單克隆幹細胞的情況下，可與本領域中公知的預防或治療特應性皮炎的藥物一起給藥，可以與本領域公知的幹細胞治療劑、賦形劑一起以劑型化的形式給藥，該賦形劑已被許可或證明對人體無害。
並且，本發明提供一種用於預防、改善或治療特應性皮炎的幹細胞，通過如下步驟獲得：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。
並且，本發明提供一種於預防或改善特應性皮炎的化妝品組合物，包含通過如下步驟獲得的單克隆幹細胞：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。
除了本發明的上述幹細胞之外，上述化妝品組合物還可包含通常擁有化妝品領域的輔助劑，例如，脂肪物質、有機溶劑、溶解劑、濃縮劑及膠凝劑、軟化劑、抗氧化劑、懸浮劑、穩定劑、發泡劑(foaming agent)、芳香劑、表面活性劑、水、離子型乳化劑或非離子型乳化劑、填充劑、金屬離子阻滯劑及螯合劑、保鮮劑、維生素、封閉劑、潤濕劑、必需油、染料、顏料、親水性活性劑和親脂性活性劑、脂質囊泡或通常用於化妝品的任意其他成分。
在上述化妝品組合物中，在通常所包含的化妝品組合物中可添加0.01重量百分比至15重量百分比的本發明的幹細胞，優選地，可添加1重量百分比至10重量百分比。
並且，可以以皮膚病學領域中通常使用的量引入上述成分。為了治療特應性皮炎，還可通過適當稀釋上述幹細胞或其培養液來直接塗敷於皮膚，並且可將本發明的用於治療皮膚疾病的藥物組合物製備成軟膏劑，從而可以有效地應用於患處。通過將本發明的用於治療特應性皮炎的藥學組合物與無機物質混合，然後用脂溶性基質塗敷來製備上述軟膏劑。優選地，上述無機物使用抗菌性、消炎效果、表皮再生效果等優秀的材料，其具體實例包括氧化鋅、碳酸鋅、氧化鐵等。並且，優選地，進一步使用可以安全地浸漬作為水溶性物質的本發明的用於治療特應性皮炎的藥學組合物的陶瓷載體。優選地，作為上 述陶瓷載體使用沸石、滑石、石膏、牡蠣粉及它們的混合物。由於這種陶瓷載體在水溶性成分的浸漬性方面優秀，因此可以向皮膚順利地供應水溶性成分。
並且，本發明提供一種用於預防或改善特應性皮炎的准藥物組合物，包含通過如下步驟獲得的單克隆幹細胞：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。
在本發明中，術語“准藥物”為對應於以用於治療、減輕、處理或預防人或動物的疾病為目的而使用的纖維、橡膠產品或與其類似、對人體的作用弱或不直接用於人體且不是儀器或機器以及與其類似、用於預防感染的殺菌、殺蟲以及與其類似的用途所使用的製劑中的一種物品，是指以用於診斷、治療、減輕、處理或預防人或動物的疾病為目的而使用的物品中，除不是儀器、機器或裝置以及而不是用於藥理學上影響人或動物的結構和功能的儀器、機器或裝置外的物品，還包括皮膚外用劑及個人護理品。
在以預防或改善、治療特應性皮炎為目的包含本發明的組合物的情況下，可直接包含上述組合物來使用，或者可與其他准藥物成分一起使用，並可根據常規方法適當調節使用。可根據使用目的適當地確定有效成分的混合量。對於本發明的准藥物沒有特別限制，但是，例如，可通過製備成膏劑、乳液劑、氣溶膠、洗髮劑、凝膠劑或面膜劑的形態來使用。在膏劑、軟膏劑、洗髮劑、凝膠劑或面膜劑的情況下，包括：基質，如白凡士林、黃凡士林、羊毛脂、漂白蜜蠟、鯨蠟醇、硬脂醇、硬脂酸、硬化油、膠凝烴、聚乙二醇、液體石蠟、角鯊烷等；溶劑及助溶劑，如油酸、肉豆蔻酸異丙酯、甘油三異辛酸酯、 克羅米通、癸二酸二乙酯、己二酸二異丙酯、月桂酸己酯、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、植物油等；抗氧化劑，如生育酚衍生物、L-抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚等；防腐劑，如對羥基苯甲酸酯等；保濕劑，如甘油、丙二醇、透明質酸鈉等；表面活性劑，如聚氧乙烯衍生物、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、卵磷脂等；增粘劑，如羧基乙烯基聚合物、黃原膠、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉鹽類、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素等。
在氣溶膠的情況下，可適當地結合使用於軟膏劑、膏劑、凝膠劑、懸浮劑、乳劑、液劑及乳液劑等的製備的基質，如白凡士林、黃凡士林、羊毛脂、漂白蜜蠟、鯨蠟醇、硬脂醇、硬脂酸、硬化油、膠凝烴、聚乙二醇、液體石蠟、角鯊烷等；溶劑或助溶劑，如油酸、肉豆蔻酸異丙基、己二酸異丙基、癸二酸異丙酯、甘油三異辛烷、巴豆、癸二酸二乙酯、月桂酸己酯、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、植物油等；抗氧化劑，如生育酚衍生物、L-抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚等；防腐劑，如對羥基苯甲酸酯等；保濕劑，如甘油、丙二醇、透明質酸鈉等；表面活性劑，如聚氧乙烯衍生物、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、卵磷脂等；增粘劑，如羧乙烯基聚合物、黃原膠、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉鹽類、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素；還可結合各種穩定劑、緩衝劑、交聯劑、助懸劑、乳化劑、芳香劑、保鮮劑、助溶劑、除此之外的合適的添加劑。並且，根據需要還可結合穩定劑、保鮮劑、吸收促進劑、pH調節劑和其他合適的添加劑。
並且，本發明提供一種用於預防、改善或治療特應性皮炎的組合物的製備方法，包括：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的上清液移到新容器中進行培養；步驟3)，培養存在於上述 新容器中的細胞並獲得上清液；步驟4)，將步驟3)的上述上清液作為步驟2)的第一容器的上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以50細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養。
根據本發明，與通過現有的層分離培養法獲得的單克隆幹細胞相比，無需製備工作細胞庫即可快速、輕鬆地獲得優異的具有預防、改善或治療特應性皮炎效果的單克隆幹細胞，上述組合物可包括但不限於藥學、食品、准藥物及化妝品組合物。
在本發明的製備方法中，其特徵在於，在上述步驟5)的培養中，以1000細胞/cm2的細胞密度接種於培養基中進行培養。
並且，在本發明的製備方法中，其特徵在於，上述步驟5)的培養基為添加抗氧化劑的培養基。
在本發明的治療方法及製備方法中，可以以相同的方法應用於在上述的組合物中描述的內容，為避免描述的複雜性，省略重複的內容。
以下，通過實施例詳細說明本發明。
下述實施例僅用於示例本發明，本發明的內容並不限定於下述實施例。
發明的具體實施方式
實施例1、建立改良的層分離培養法
為了製備對特應性皮炎具有更優秀的效果的單克隆間充質幹細胞，利用了改良的間充質幹細胞層分離培養法及增殖方法。改良的間充質幹細胞層分離培養法及增殖方法的特徵在於，改變記載於韓國國內專利申請10-2006-0075676號中的層分離培養法的培養條件中的細胞密度及培養基。在以下實驗中，將通過層分離培養法獲得的單克隆間充質幹細胞(cMSC)的細胞培 養密度分別改為50細胞/cm2(低密度)、1000細胞/cm2(中密度)、4000細胞/cm2(高密度)，並分析相應的細胞特性。
1.1、確認根據細胞密度的間充質幹細胞的形態變化
首先，進行了用於確認長期培養中根據細胞密度的間充質幹細胞的形態變化。為了提供長期培養條件，使用了第五代(P5)、第十代(P10)、第十五代(P15)的間充質幹細胞，分別在低密度、中密度、高密度的條件下接種於LG-DMEM培養基中。隨後，通過顯微鏡觀察細胞的形態變化來判斷幹細胞是否老化，其結果示出在圖2中。
如圖2所示，在第五代(P5)及第十代(P10)中，根據細胞密度細胞大小和形態模式具有差異，尤其，在P15的情況下，在高密度培養條件下觀察到偏平且變大的形態的間充質幹細胞。這種形態代表典型的間充質幹細胞的老化，可確認在長期培養中細胞的密度調節可調節間充質幹細胞的老化。
1.2、確認根據細胞密度的間充質幹細胞大小及粒度
為了進一步確認根據細胞密度的幹細胞的變化，通過流式細胞儀對已知在老化的細胞中會增加的細胞大小及細胞的粒度(granularity)進行定量分析，其結果示出在圖3中。
如圖3所示，確認在P5中細胞的大小沒有顯著差異，但在P10及P15的情況下，根據細胞密度具有顯著差異。尤其，可以確認到，在P10及P15中，在高細胞密度的培養條件下細胞的大小顯著增加以進一步促進細胞老化。同樣，細胞的粒度也顯示隨著所有傳代中細胞密度的增加而顯著增加的結果。因此，在間充質幹細胞的長期培養中，可以確認到，細胞密度的調節可成為調節細胞老化的因素，確認到可通過降低細胞培養密度來改善以後傳代中所出現的形態變化。
1.3、確認根據培養細胞密度的間充質幹細胞的老化
為了確認在實施例1.1及實施例1.2中確認的形態變化是否實際上是間充質幹細胞的老化依賴性(age-dependent)現象，進行了使用可對老化細胞選擇性地染色的β半乳糖苷酶的染色分析法，並通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)比較作為老化相關基因的p15、p16及作為增殖標記物的增殖細胞核抗原基因的表達。其結果分別示出在圖4及圖5中。
如圖4所示，在第五代(P5)及第十代(P10)中，不能在所有細胞密度下都確認到老化的細胞的染色，但在第十五代(P15)中，確認到老化的細胞的染色隨著細胞密度增加而顯著增加。並且，如圖5所示，在第十五代(P15)中，作為與老化相關的基因的細胞週期依賴性蛋白激酶(CDK)抑制劑p15及p16的基因表達隨著細胞培養密度的增加而增加，而作為增殖標記物的增殖細胞核抗原減少。
這結果表明，間充質幹細胞的形態變化與間充質幹細胞的老化有關，傳代培養時細胞培養密度的調節可以調節間充質幹細胞的老化。
1.4、確認根據培養細胞密度的間充質幹細胞的增殖能力的變化
已知間充質幹細胞的增殖能力隨著傳代和細胞的老化而逐漸降低。因此，增殖能力可作為確認間充質幹細胞的老化的標準，並比較了長期細胞培養時根據細胞培養密度的間充質幹細胞的增殖能力。通過根據初始接種細胞數量和培養結束後獲得的細胞的數量來計算根據每個傳代的增殖率，由此確認每個細胞的增殖能力，其結果如表1及圖6所示。
Figure 109101125-A0305-02-0025-2
如表1所示，確認到，在低密度下培養的間充質幹細胞(MSC)的情況下，在第五代(P5)、第十代(P10)、第十五代(P15)中增加倍數(fold increase)為88.4、34.3、16.4，相反，在中密度下培養的間充質幹細胞的增加倍數為8.5、4.9、3.1，在高密度下培養的間充質幹細胞的增加倍數為3.0、1.9、1.1。並且，如圖6所示，確認到，群體倍增時間及群體倍增水準也與增加的倍數處於相同模式。這些結果表明，可通過在長期間充質幹細胞培養中降低細胞密度來保持間充質幹細胞的增殖能力，即使進行相同的傳代培養，也可以抑制間充質幹細胞的老化並延長其壽命。
1.5、確認根據培養細胞密度的間充質幹細胞(MSC)的分化能力的變化
為了確認細胞培養密度是否影響幹細胞能力，比較了根據P5至P15培養的分化能力。作為幹細胞能力確認了脂肪細胞分化能力及骨細胞分化能力，在各個傳代及密度下進行了正常、定量分析。具體地，脂肪細胞分化培養液使用在高糖DMEM培養液中添加新生牛血清(Newborn Calf Serum，NCS)(Gibco)、10-7mol的地塞米松(dexamethasone)(Sigma)、0.5mM的IBMX(Sigma)、10μg/ml的胰島素(insulin)(Sigma)、100μM的吲哚美辛(indomethacin)(Sigma)來製備的培養基並進行了實驗，在分化7天後，通過油紅O組織染色進行確認。並且，在油紅O組織染色後，利用異丙醇洗脫，並在500nm下測量後，通過定量分析確認。
骨細胞分選培養液使用了在α-MEM培養液中添加胎牛血清(FBS)(Gibco)、50μg/ml的抗壞血酸2磷酸酯(ascorbic acid 2 phosphate)(sigma)，10-8mol的地塞米松(Sigma)、10mM的β-甘油磷酸酯(β-glycerophosphate)(sigma)的培養基，在分化21天後，通過茜素紅S組織化學染色確認。並且，在茜素紅S組織化學染色後，利用10%的乙酸洗脫，在405nm 下測定並通過定量分析來確認。通過如上所述的方法確認脂肪分化能力及骨細胞分化能力的結果如圖7所示。
如圖7所示，脂肪細胞分化能力總體上隨著傳代而降低，但密度差不明顯，相反，在骨細胞分化能力的情況下，確認到在高密度條件下的第十五代(P15)培養組中顯著減少。通過這些結果確認到，當以低細胞密度培養時，可以更好地保持間充質幹細胞的骨細胞分化能力。
1.6、根據培養細胞密度的間充質幹細胞的抗原圖譜分析
進行了用於確認細胞培養密度是否還影響幹細胞的抗原表達的實驗，利用流式細胞儀確認根據每個傳代及培養密度的陽性及陰性抗原表達的變化，其結果如表2所示。
Figure 109101125-A0305-02-0027-3
如表2所示，陰性標記物表達的變化尚未明確，但是，在部分陽性標記物的情況下，確認到表達量也根據相同傳代的細胞培養密度而發生變化。
尤其，在第十五代(P15)中，在高密度下培養細胞的情況下，不僅大多數陽性標記物的表達量顯著減少，而且CD73、CD105顯示陰性表達，確認到可通過保持低細胞密度來進行細胞培養將成為非常重要的因素。
1.7、比較根據培養細胞密度的活性氧種(ROS)的產生及去氧核糖核酸損傷
已知間充質幹細胞的功能下降與去氧核糖核酸損傷有關，尤其，已知由活性氧種引起的去氧核糖核酸損傷促進間充質幹細胞(MSC)的老化。因此，為了確認總活性氧種的產生及由此產生的去氧核糖核酸損傷是否根據培養密度而不同，通過螢光強度分析比較了根據傳代及細胞培養密度的總細胞活性氧種量，並通過彗星(comet)分析確認去氧核糖核酸損傷程度，其結果如圖8所示。
如圖8所示，確認到在所有傳代中總活性氧種的產生趨於隨著細胞培養密度的增加而增加，尤其，確認到在第十代(P10)和第十五代(P15)中活性氧種的產生顯著增加(A)。在彗星分析中，從去氧核糖核酸損傷最少的CC1分為損傷最多的CC5並分析數據，在損傷最嚴重的CC5的情況下，確認到隨著細胞培養密度的增加而顯著增加。相反，CC1趨於隨著細胞密度的增加而顯著降低(B)。
進而，為了確認去氧核糖核酸損傷是否由活性氧種引起，進行了用於確認由活性氧種引起的去氧核糖核酸損傷的確認8-羥基-去氧鳥苷(8-OHdG)的濃度的實驗。8-羥基-去氧鳥苷分析方法如下：將從各個細胞中獲得的50μl的去氧核糖核酸試樣加入8-羥基-去氧鳥苷偶聯板(8-OHdG conjugate coated plate)後，在常溫下培養10分鐘。隨後，再加入抗-8-羥基-去氧鳥苷抗體(anti-8-OHdG antibody)並在常溫下培養1小時，清洗3次後，將二抗酶偶聯物(secondary antibody enzyme conjugate)分別加入各個孔(well)後，在常溫下再培養1小時。然後，再清洗3次後，加入底物溶液(substrate solution)並在常溫下培養30分鐘。最後，添加終止溶液(Stop solution)後，在450nm下測定吸光度並進行確認，將其結果示出在圖9中。
如圖9所示，在去氧核糖核酸損傷最嚴重的第十五代(P15)組中，確認到8-羥基-去氧鳥苷的濃度隨著細胞培養密度增加而顯著增加。這些結果表 明，去氧核糖核酸損傷因在高密度培養條件下產生的活性氧種而增加，由此促進間充質幹細胞的老化。
這些結果表明，將細胞培養密度調低可能在保護間充質幹細胞免受由間充質幹細胞的活性氧種的產生增加引起的去氧核糖核酸損傷。
1.8、確認根據抗氧化劑處理的間充質幹細胞(MSC)增殖及活性氧種(活性氧種)的產生能力
為了確認間充質幹細胞的增殖是否受到在高密度培養條件下產生活性氧種的影響，進行了活性氧種清除實驗。在第十一代(P11)至第十五代(P15)中，通過在高密度培養條件及高密度培養條件中添加作為抗氧化劑的25μg/ml的抗壞血酸來培養後，比較兩組之間的增殖率的增加倍數(Fold)，其結果如圖10所示。
如圖10所示，在P11至P15中高密度培養條件下的增加倍數分別為2.6、1.9、1.6，隨著傳代數量的增加增殖率減少且開始出現老化，但是，在處理抗氧化劑的情況下，確認到在所有傳代中增殖能力保持在50%左右。並且，在抗氧化劑處理組中，在P11至P15中生長增加倍數(growth fold increase)分別為3.8、2.9、2.5，甚至直到P15為止增殖能力仍保持很高。
確認在作為終點(Endpoint)的P15中在單獨的高密度培養條件及高密度培養條件+抗氧化劑處理下的兩組之間的活性氧種水準，並將其結果示出在圖11中。
如圖11所示，在通過處理作為抗氧化劑的抗壞血酸來增加增殖的條件中，確認到活性氧種水準仍下降。因此，優選地，間充質幹細胞培養在低細胞密度下進行，在用抗氧化劑清除在高密度細胞培養下誘導的活性氧種的產生的情況下，確認到可增加間充質幹細胞的增殖能力，即，高密度條件會抑制 由活性氧種引起的間充質幹細胞的增殖能力，活性氧種隨著細胞密度的減少而減少，因此可促進間充質幹細胞增殖能力。
總結這些結果，為了保持通過層分離培養獲得的單克隆間充質幹細胞的增殖、培養及幹細胞能力，重要的是將培養條件中的細胞密度調至1000細胞/cm2以下，在通過添加抗氧化劑來進行培養的情況下，確認到可通過抑制細胞培養中可誘導的氧化應激來有效地促進間充質幹細胞增殖。並且，比較相同的低細胞密度條件培養，與小於第十代如第五代的幹細胞相比，第十代以上如P15的幹細胞的細胞的形態變化顯著並確認到諸如促進幹細胞的老化、降低分化能力之類的結果，因此，確認到以1000細胞/cm2以下的密度以少於第十代的低傳代數進行培養是最有效的。
實施例2、驗證改良的層分離培養法
通過上述實施例1，確認了在通過層分離培養法獲得的間充質幹細胞培養中細胞密度的調節、傳代調節及抗氧化劑的添加可成為重要的因素，因此，針對於通過韓國國內專利申請10-2006-0075676號中記載的層分離培養法的現有工序獲得的單克隆間充質幹細胞，通過改變細胞培養密度，並改變添加抗壞血酸作為抗氧化劑的培養基，比較了通過進行傳代培養來獲得的單克隆間充質幹細胞的增殖能力及根據其的細胞獲得效果。
在現有韓國專利申請10-2006-0075676號的實施例1中，公開了通過如圖1所示的層分離培養方法從骨髓中分離間充質幹細胞並進行培養的方法，並公開了將通過層分離步驟獲得的作為單一性細胞群體的菌落以每孔100至600的細胞數量轉移至培養容器的事實。
並且，在韓國專利申請10-2014-0170045號中，公開了利用層分離培養法分離來源於骨髓的間充質幹細胞並進行培養的方法，並且公開了以50細胞/cm2至100細胞/cm2塗抹菌落的事實。
然而，在韓國專利申請10-2006-0075676號及10-2014-0170045號中，僅公開了通過計數對通過層分離培養法獲得單一性細胞群體菌落進行計數並轉移至6孔板後，以低濃度塗敷，製備用於傳代培養的種子細胞的結構，即，僅公開了對應於第一代的菌落培養條件，而沒有公開對第二代後的單個非菌落的重複培養密度調節有關的構成及根據其的效果。根據記載於上述申請的現有層分離培養法，為了獲得足夠數量的具有預防、治療、改善特應性皮炎效果的單克隆幹細胞，應培養至至少第十代。相反，在本發明的改良的層分離培養方法中，可通過第二代後的低細胞密度條件、最多第八代以下的低傳代培養數量來有效地獲得大量所需的單克隆幹細胞。
具體地，在本改良方法中，在培養通過層分離培養方法獲得的第一代(P1)的菌落後，在第二代(P2)後的傳代培養中，以作為低密度的1000細胞/cm2以下的密度接種細胞，將其與4000細胞/cm2細胞培養的效果進行比較。並且，將細胞培養基改為含抗氧化劑的α-MEM培養基和不含抗氧化劑的LG-DMEM培養基，比較根據其的細胞增殖效果。
在下述表3中示出用於確認改良的層分離培養法的效果的實驗組，並在圖12a及圖12b中示意性地示出相對於現有層分離培養法改良的層分離培養方法的工序改良部分。
如圖12a所示，直到獲得第一代的工序為止，現有的層分離培養法和改良的層分離培養法以相同的方式進行此工序，但是，在改良的層分離培養法中，在使用擴增的第一代細胞作為種子細胞培養的步驟之後的傳代培養工序與現有的層分離培養法不同。現有的層分離培養法以對密度調節不了解的情況下獲得大量細胞為目的，進行4000細胞/cm2以上的高密度傳代培養，但是，改良的層分離培養法將傳代培養的密度調至作為低密度的1000細胞/cm2以下，從而 僅培養至第二代之後最高第八代以下的培養也可以獲得最終產物。在圖12b中詳細示出第二代之後的培養工序。
Figure 109101125-A0305-02-0032-4
上述表3的細胞株為通過層分離培養方法分離的細胞，分別命名為SCM01至SCM0。
2.1、確認根據細胞株密度及培養基的增殖效果
利用上述SCM01至SCM08細胞株進行培養，通過細胞數量、群體倍增時間、群體倍增水準分別比較至少於第十代的第五代的傳代培養，並示出在圖13至圖20中。
在圖13至圖20中確認，與通過以每平方釐米4000個細胞密度接種的方式培養的實驗組相比，通過以每平方釐米1000個細胞密度接種的方式培養的所有實驗組的細胞增殖效果更好。並且，即使在相同的1000個細胞密度組中，確認到在含作為抗氧化劑的抗壞血酸的α-MEM培養基中培養的1000alpha實驗組的細胞增殖效果更顯著。
2.2、比較根據細胞株密度的增殖效果
為了進一步準確地比較根據培養細胞數量的增殖率，將培養基分別固定為LG DMEM或α-MEM培養基，並比較根據以每平方釐米1000個或4000個細胞接種密度的傳代培養的細胞增殖效果，將其結果示出在圖21至圖24中。
如圖21所示，確認到與以每平方釐米4000個細胞數量接種組相比，當以每平方釐米1000個細胞數量接種的方式培養時，在LG DMEM中培養的SCM01至SCM08細胞株的第二代(P2)至第五代(P5)中的增殖率顯著高，與在第五代(P5)中確認的每平方釐米4000個細胞接種相比，1000個細胞接種組的增殖率為最少3.08倍至最大48.50倍。
並且，如圖22所示，每平方釐米1000個細胞接種組的群體倍增時間值也低於所有細胞株中每平方釐米4000個細胞株接種或具有與其類似的水準，在所有細胞株中，群體倍增水準值高於每平方釐米4000個細胞接種值。
並且，如圖23所示，當以1000個細胞數接種在α-MEM中培養的SCM01至SCM08細胞株時，傾向於與DMEM實驗組相同，確認到與在第五代(P5)中確認的每平方釐米4000個細胞株接種相比，每平方釐米1000個細胞接種組的增殖率為最少6.32倍至最大85.63倍。並且，如圖24所示，每平方釐米1000個細胞接種組的群體倍增時間值也低於所有細胞株中每平方釐米4000個細胞接種量，或具有與其類似的水準，在所有細胞株中，群體倍增水準值高於每平方釐米4000個細胞接種值。
這些結果表明，與每平方釐米4000個高密度細胞接種培養相比，可通過每平方釐米1000個以下的細胞接種來誘導單克隆間充質幹細胞的快速增殖。
2.3、根據培養基的增殖效果比較
在先通過實施例2.2確認，與4000細胞/cm2培養相比，1000細胞/cm2培養可具有優異的增殖效果，因此，將細胞數量固定在1000個，以培養基為變數通過改變培養基來比較細胞增殖效果，從而進一步驗證基於培養基條件的增殖效果，並將其結果示出在圖25及圖26中。
如圖25所示，用α-MEM及DMEM比較不同培養基的細胞增殖率，其結果確認，與LG-DMEM相比，在利用α-MEM培養基的實驗組中細胞增殖率至少高1.77倍至6.39倍。並且，如圖26所示，在所有α-MEM實驗組中群體倍增時間均較低，而群體倍增水準增加。
這些實驗的結果表明，除了將細胞接種密度調節至每平方釐米1000個以下的細胞來培養至小於第十代的傳代如第二代(P2)至第五代(P5)之外，在利用含有抗氧化劑的培養基時可以最大程度地提高細胞增殖效率。
實施例3、建立改良工序
通過上述實施例，確認細胞密度的調節及抗氧化劑的添加可成為間充質幹細胞培養中的重要因素，因此，除了在韓國國內專利申請10-2006-0075676號及10-2014-0170045中記載的層分離培養法的現有工序之外，傳代培養時細胞培養密度及培養基條件來在小於第十代的低傳代下可有效獲得單菌落的間充質幹細胞的改良的工序，在下述表4(利用DMEM培養基的培養條件)及表5(利用α-MEM培養基的培養條件)中一併示出。
Figure 109101125-A0305-02-0034-5
Figure 109101125-A0305-02-0035-6
Figure 109101125-A0305-02-0035-7
Figure 109101125-A0305-02-0036-8
更具體地，來源於本發明的骨髓的間充質幹細胞的層分離培養工序及增殖培養可以如下進行。
在用局部麻醉劑麻醉骨髓供體的臀部後，通過將針插入臀骨中收集骨髓。100mm的培養容器中加入含20%的胎牛血清、1%的青黴素/鏈黴素的14ml的DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium，GIBCO-BRL，Life-technologies，MD，USA)、1ml的人骨髓，於37℃、5%的CO2細胞培養器中培養2小時。培養後，將培養容器稍微向一側傾斜，在以使底部的細胞不脫落的條件下，盡可能僅將培養容器的上部培養基轉移到新的容器中。
將再次重複相同的過程後獲得的培養液轉移至底部塗敷有膠原質(collagen)的培養容器(Becton Dickinson)後，在37℃的溫度下培養2小時。將培養液轉移到塗敷有新的膠原質的容器，並在24小時後將其再次轉移到新容器，然後在24小時後將其再次轉移到新容器。最後，在48小時後，將其轉移到新容器中並通過肉眼觀察剩餘的細胞貼附生長在培養容器底部。可猜到可通過之前幾個層分離步驟達到此階段的細胞為細胞比重顯著小於其他細胞的細胞。
約10天至14天後，細胞形成單菌落(single colony)，對此單菌落細胞組處理胰蛋白酶後轉移到6孔培養容器。並在37℃、5%的CO2細胞培養器中 培養4天至5天後，當生長至約80%時，通過用0.05%的胰蛋白酶/1mM的EDTA(GIBCO-BRL)處理獲得細胞後，轉移到T175培養容器中並以低細胞密度進行傳代培養。
像這樣，當以小於第十代，優選地，在第八代以下的第二代(P2)至第五代(P5)中將細胞密度降低到1000細胞/cm2的水準來進行培養的情況下，確認到儘管將其他工序調至一樣也很好地保持了間充質幹細胞的增殖能力及幹細胞特性，從而在相同的傳代中也有效地誘導了增殖。尤其，在通過降低細胞密度來進行培養的情況下，可省略現有過程中所需的由間充質幹細胞製備工作細胞庫的過程，因此可有效地縮短細胞製備時間。尤其，若降低傳代，則可獲得大量的老化程度相對較低的細胞，在將這些細胞用作治療劑的情況下，可以預期優異的治療效果。
並且，在將含抗氧化劑的α-MEM用作培養基的情況下，通過抗氧化劑處理可以有效地改善高密度細胞培養物中誘導的活性氧種應激，並且可以恢復間充質幹細胞的細胞增殖能力，與現有的工序相比，其特徵在於，可顯著縮短細胞的傳代，並且能夠快速且穩定地獲得保持間充質幹細胞的特性且沒有老化的單克隆間充質幹細胞。
綜上所述，低密度細胞培養可以在短時間內獲得大量細胞，因此，不僅簡化製備工序，而且在長期培養(long-term culture)中，也可以獲得保持完整的間充質幹細胞特性的未老化細胞，從而能夠生產高質量的幹細胞。
由此，在以下治療特應性皮炎的實驗中，使用了通過上述實施例構建的改良的方法獲得的幹細胞。
實施例4、確認通過改良的層分離培養法獲得的幹細胞的特應性皮炎治療效果
4.1、試樣及方法
進行了用於確認使用通常用於獲得幹細胞蔗聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)的密度梯度離心方法(gradient centrifugation method，GCM)獲得的幹細胞(以下，GCM-MSC)和通過改良的層分離培養法獲得的單克隆幹細胞(以下，SCM-cMSC)是否在特應性皮炎治療效果方面具有差異的比較實驗。
實驗中使用的試樣示出在下述表6中。源自蛋清的白蛋白和氫氧化鋁用於誘發特應性皮炎，Tegaderm Film被用作敷料。
Figure 109101125-A0305-02-0038-9
為了製備特應性皮炎動物模型，由SLC公司(日本鈴鹿市)提供6周齡的無特定病原體(specific pathogen-free，SPF)BALB/c小鼠(15~20g)。經過1周的適應期後，開始了實驗。為了誘發特應性皮炎，對6周齡的BALB/c小鼠進行一次腹膜內和皮下給藥，每週一次，每次卵清蛋白(OVA)50μg及40mg的明礬佐劑(Alum Ajuvant)持續3周。在給藥誘發物質後，將包含60μg的卵清蛋白的1.2cm×1.2cm的貼劑貼附在兩周內脫毛兩次的區域並在BALB/c中誘導特應性。在致敏20天後，以每隔2天通過尾靜脈(caudal vein)對具有特應性皮炎的小鼠給藥三次劑量如下表7所示的細胞空白組、GCM-MSC、SCM-cMSC。作為正常對照組設定沒有誘發特應性皮炎的5只小鼠。
Figure 109101125-A0305-02-0038-10
Figure 109101125-A0305-02-0039-11
為了確認給藥後對特應性皮炎的效果，確認了小鼠皮膚、腋窩淋巴結(axillary lymph node，aLN)及血液中與特應性皮炎有關的標記物的表達變化及相關指標。
4.2、確認根據SCM-cMSC給藥的皮膚病變的變化
以如上所示方案的向在實施例4.1中製備的特應性皮炎誘發動物模型給藥SCM-cMSC、GCM-MSC，59天後確認了皮膚病變的變化，其結果示出在圖27中。
如圖27所示，在通過改良的層分離培養法獲得的SCM-cMSC給藥組中，確認有效改善了特應性皮膚病變。
將異位性皮炎模型的背部皮膚組織用10%的福馬林處理並在4℃下固定24小時，然後通過切開及脫水化處理拱頂在石蠟上。的切片放在載玻片上，用H&E溶液染色8分鐘，用酒精洗滌後，檢查表皮和真皮的厚度變化及炎性浸潤。使用200倍的CaseViewer 1.4軟體(3DHISTECH，BU，匈牙利)確認表皮和真皮的厚度。隨後，在皮膚組織處理之後，以與H&E相同的方式進行甲苯胺藍染色，並在工作液(working solution)中進行2~3分鐘的染色，洗滌並脫水。將如上所示的視覺意見及組織染色的結果示出在表8、圖28至圖30中。
Figure 109101125-A0305-02-0039-12
如表8所示，與細胞空白組相比，SCM-cMSC處理組抑制了由特應性皮炎誘發增加的表皮及真皮的厚度增加了1.5倍，與GCM-MSC處理組相比，這些效果具有1.4倍、1.3倍的抑制效果，並且與GCM-MSC處理組相比，具有顯著的改善效果。
並且，如圖28至圖30所示，皮膚病變的組織學分析顯示，在SCM-cMSC的處理組中，特應性嚴重程度顯著降低。
4.3、確認SCM-cMSC給藥的免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1抑制效果及免疫球蛋白G2(IgG2)生產效果
通過酶聯免疫吸附劑測定測量並比較在4個實驗組中免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1的生產來確認特應性皮炎治療效果。微孔板用稀釋於塗敷緩衝液中的100μl/孔的捕獲抗原進行塗敷，將板密封並在4℃下培養過夜，以用於分析免疫球蛋白E。抽吸孔並用洗滌緩衝液洗滌後，將板倒置，並去除洗滌後剩餘的緩衝液。用200μl/孔的稀釋液(Assay Diluent)封閉板並在室溫下培養1小時。清洗後，將每個實驗組移至適當的板上。將密封的板在室溫下培養2小時，再次洗滌，然後通過添加100ul的工作檢測器(Working Detector)(檢測抗體和Sav HRP試劑)在室溫下進一步培養1小時。向每個孔中添加100μl底物溶液後，將板在無板密封的黑暗環境中培養30分鐘，並添加50ul的終止溶液。在終止反應30分鐘內確認450nm處的吸光度，並且從450nm吸光度值減去570nm吸光度值。將確認免疫球蛋白E及免疫球蛋白G1生成的效果的結果示出在圖31中。
如圖31所示，通過SCM-cMSC的給藥顯著降低了由特應性皮炎引起的免疫球蛋白E及免疫球蛋白G1的生成。與GCM-MSC相比，這種結果也顯著優秀。
進而，利用酶聯免疫吸附劑測定方法確認了免疫球蛋白G2a的生成變化，其結果示出在圖32中。
如圖32所示，與GCM-MSC處理組相比，免疫球蛋白G2a的生成在SCM-cMSC中顯著優秀，與特應性皮炎模型組(vehicle)相比，增加約3倍以上。
4.4、確認根據SCM-cMSC給藥的淋巴結中白細胞介素4、γ-干擾素表達效果
從特應性皮炎動物模型中分離腋窩淋巴結(axillary lymph nodes)，並通過即時聚合酶鏈式反應確認根據SCM-cMSC、GCM-MSC給藥的腋窩淋巴結中的白細胞介素4及γ-干擾素的表達變化。用TRIzol試劑(生命技術(Life technologies))從腋窩淋巴結獲得總核糖核酸(RNA)，互補去氧核糖核酸(cDNA)根據製造商的指示利用帶有gDNA的清除器primeScriptTMRT試劑盒(TAKARA)來準備。互補去氧核糖核酸產物用SYBR Green定量PCR預混液(KAPA Biosystems)擴增，引物均購自凱傑(Qiagen)。反應在StepOnePlus RealTime PCR系統(Applied Biosystems)中進行，並對於共20ml在以下條件下進行聚合酶鏈式反應：變形，在94.1℃的溫度下進行5分鐘；擴增，針對於GAPDH進行25個迴圈、在94.1℃的溫度下進行30秒鐘、在58.1℃的溫度下進行30秒鐘及在72.1℃的溫度下進行30秒鐘；延伸，在72℃的溫度進行10分鐘。隨後，將1μl的每個樣品置於瓊脂糖凝膠，用溴化乙錠染色並用紫外光進行視覺化。每個靶基因的表達均以GAPDH標準化，其結果示出在圖33中。實驗中使用的引物的資訊如下。
-GAPDH Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay Cat# QT01658692
-IL-4 Mm_Il4_va.1_SG QuantiTect Primer Assay Cat# QT02418311
-IFNγ Mm_Ifng_1_SG QuantiTect Primer Assay Cat# QT0103882115
如圖33所示，在特應性皮炎模型的腋窩淋巴結中增加的白細胞介素4隨著GCM-MSC及SCM-cMSC處理而減少，並確認SCM-cMSC處理具有最佳 的減少效果。並且，在特應性皮炎模型中，發現減少的γ-干擾素的水準通過SCM-cMSC處理明顯增加。
4.5、測定根據SCM-cMSC給藥的肥大細胞數量
另外，使用吉姆薩(Giemsa)進行皮膚組織染色以計數肥大細胞，並使用paint.NET在100放大倍數下計數浸潤的肥大細胞數量。
如圖34所示，與正常對照組相比，在特應性皮炎模型中，由於炎症誘發，肥大細胞顯著增加(平均86)，通過SCM-cMSC給藥將這種肥大細胞的增加顯著降低至平均水準49。與幾乎沒有降低肥大細胞活性的效果的SCM-cMSC給藥組相比，這是只有在GCM-MSC給藥組中才能確認的效果。
實施例5、根據培養密度的特應性皮炎治療效果比較
5.1、準備cMSC1、cMSC2
通過實施例4確認，即使在長期培養過程中，以通過實施例2、實施例3改良的分離培養法獲得的層cMSC保持間充質幹細胞的特性的未老化的細胞狀態獲得，與以往通過密度梯度離心獲得的作為幹細胞的GCM-MSC相比，通過改良的層分離培養法獲得的這種cMSC的治療特異性皮炎的效果顯著優秀。為此進一步進行了實驗以確認用包括低密度培養步驟的改良層分離培養法獲得的cMSC與包括高密度培養步驟的現有的層分離培養法獲得的cMSC相比，在特應性皮炎治療效果方面是否有差異。
根據實施例3的改良的層分離培養法，將傳代培養時細胞培養密度為100細胞/cm2、1000細胞/cm2，利用含抗氧化劑的阿爾法-MEM培養基獲得了單克隆間充質幹細胞。作為抗生素添加了慶大黴素，並用α-MEM培養液進行(參照表5)。以下，將100細胞/cm2、1000細胞/cm2以下的低密度及抗氧化條件的通過改良層分離培養法獲得幹細胞命名為“cMSC1”。
並且。為了與通過改良的層分離培養法獲得的幹細胞比較效果，將在傳代培養時以4000細胞/cm2以上的密度及未添加抗氧化劑的條件的培養方法培養的通過現有的層分離培養法獲得的幹細胞命名為“cMSC2”。
5.2、實驗材料及方法
使用於特應性皮炎試驗的動物由SLC公司(日本鈴鹿市)提供雌性6周齡的無特定病原體(specific pathogen-free，SPF)BALB/c小鼠(15~20g)，經過1周的適應期後，進行了實驗。在仁荷大學醫學院生命科學研究所，在溫度為22~25℃、濕度為40~60%、12小時交換晝夜交替的方式照射150~300Lux的照明條件下，在小鼠用籠子中分別飼養5只，保持飼養以便可以自由攝取蒸餾水和固體飼料的環境並進行實驗。混合50μg/50μl(PBS)的卵清蛋白和4mg/100μl的明礬佐劑，並對7周齡的雌性BALB/c小鼠通過腹膜內和皮下給藥每週三次，持續三周，以誘導過敏性皮炎。當三次均給藥於相同部位時，可誘發與該疾病無關的炎症，因此分別給藥在不同部位。卵清蛋白給藥3周後，將浸濕60μg/60μl(PBS)的卵清蛋白的大小為1.2cm×1.2cm的貼劑的無菌紗布貼附在脫毛的背部皮膚，兩周貼附2~3次，從而在局部部位誘導特應性。通過卵清蛋白貼劑誘導特應性後，通過磷酸鹽緩衝液(PBS)、層分離培養方法獲得的單克隆幹細胞通過不同的細胞密度獲得，例如，第二代以後的步驟中細胞密度為100細胞/cm2、1000細胞/cm2、4000細胞/cm2，每隔2天通過尾靜脈共注入3次。注射量分3次靜脈給藥，每次給藥以3.3×105/200μl，共給藥1.0×106/600μl。給藥結束2天後，對病變部位再次脫毛，然後將浸濕60μg/60μl(PBS)的卵清蛋白的大小為1.2cm×1.2cm的貼劑的無菌紗布貼附在脫毛的背部皮膚，兩周貼附3~4次，再次在局部部位誘發特應性。誘導特應性皮炎後，在13~14天的時間點用限制器(restrainer)校準實驗動物後，使用配備26 1/2規針(gauge needle)的BD公司的1ml的注射器(syringe)通過微靜脈給藥。Veh.組的動物以相同的方法用磷酸 鹽緩衝液代替試驗物質來靜脈內給藥，除了Naïve、Veh.組以外，將試驗物質懸浮於磷酸鹽緩衝液後進行靜脈給藥。均以200μl/頭的相同量給藥磷酸鹽緩衝液及試驗物質。
通過如下方式獲得用於確認血樣對特應性皮炎的效果。在給藥細胞穩定劑或試驗物質第十三天，使用異氟烷(isoflurane)麻醉所有實驗動物後，切開腹部以暴露後腔靜脈後，使用1ml的l注射器采血約700μl。收集的血液放入血清分離管(Serum separate tube)中，並以3000rpm/15分鐘、在4℃的溫度下離心後分離血清(serum)，分離的血清放入1.5ml的e管(e-tube)並保存在-70℃的冰櫃(deep freezer)中。
為了分析對特應性皮炎的效果，通過使用酶聯免疫吸附劑測定試劑盒測量所有實驗動物的血清樣品的總免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1、免疫球蛋白G2a的濃度，根據試劑盒中的方案進行測量。具體地，血液中免疫球蛋白E水準的測量如下，將通過後腔靜脈收集的血液放入EDTA管中後，並以3000rpm/15分鐘的速度離心，僅分離上清液，並保存在-70℃的溫度下直至實驗。在酶聯免疫吸附劑測定板(ELISA plate)上將可識別免疫球蛋白E的捕獲抗體(capture antibody)與塗敷緩衝液(coating buffer)一起在4℃的溫度下保存過夜(overnight)，第二天經1小時的封閉(blocking)過程後，將血清稀釋100倍並在室溫下以50μl的量反應2小時。然後，加入識別免疫球蛋白E的第二抗體，並添加作為底物緩衝液(substrate buffer)的TMB溶液反應15分鐘左右後，添加50μl的終止溶液(stop solution)。利用酶標儀(ELISA reader)在450nm的濾光器(filter)中測量該值。
在實驗結束時間點，將提取的皮膚組織固定在4%的福馬林溶液後，製備組織切片，然後進行蘇木精和曙紅(Hematoxylin & Eosin，H&E)染色和甲苯胺藍染色以浸潤肥大細胞。在光學顯微鏡的200倍放大倍數下測量染色 的組織的真皮和表皮的厚度，在100倍的放大倍數下測定炎症細胞浸潤及肥大細胞的敏化程度。皮膚厚度及肥大細胞的測量利用PAINT.NET程式進行。
使用定量聚合酶鏈式反應(qPCR)預混液從所有實驗動物中取樣的皮膚(skin)和腋窩淋巴結(axillary lymph node)中白細胞介素4、白細胞介素5、白細胞介素-10、白細胞介素17、白細胞介素31、腫瘤壞死因數-α(TNF-α)、轉化生長因數-β(TGF-β)、γ-干擾素、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)等的表達量。測量方法根據定量聚合酶鏈式反應中的方案進行，具體地，為了進行即時聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)從實驗動物的皮膚組織中分離了信使核糖核酸(mRNA)。通過將1ml的Trizol溶液加入皮膚組織並通過研棒研磨來獲得核糖核酸。為了將1μg的分離的核糖核酸製備成互補去氧核糖核酸，進行基因組去氧核糖核酸消除反應(genomic DNA elimination reaction)後，通過添加逆轉錄酶(reverse-transcription enzyme)反應20分鐘。使用SYBR FAST qPCR預混液特異性結合雙去氧核糖核酸進行即時聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)。其中，使用與雙去氧核糖核酸特異性結合的SYBR FAST qPCR預混液進行實驗。準備的試樣體積為20μl，其中，包含5μl的互補去氧核糖核酸、10μl的qPCR預混液(2X)、1μl的特異性靶引物(specific target primer)、4μl的DW。聚合酶鏈式反應共進行45個迴圈，對用GAPDH校正靶基因的比例進行數值化。
實驗結果的所有測量值均以平均值±標準誤差計算並示出，使用一步驟方差分析(1Way ANOVA)(Tukey的多重比較測試，使用Prism 7.05(美國加利福尼亞州聖地牙哥的GraphPad軟體公司))進行統計分析p值為*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001的情況下被判定為具有顯著性。
5.3、確認特應性皮炎動物模型體重及細胞存活率
在特應性皮炎誘發動物模型的處死時間點(D-59)測量每個組的體重，並通過自動細胞計數器和細胞分析儀(Automated cell counters and cell analyzers)(NC-250TM)方法確認根據cMSC1及cMSC2給藥的總細胞數量及細胞存活率，其結果示出在圖35及圖36中。
如圖35所示，按在給藥誘發特應性皮炎的動物模型及cMSC1、cMSC2的各組個體的體重沒有差異，如圖36所示，在每隔2天通過尾靜脈注入3次cMSC1(100cm2及1000cm2)及cMSC2(4000cm2)的組中，確認平均細胞存活率為90%以上。
5.4、確認抑制免疫球蛋白E表達的效果
在實施例4.3中，在特應性皮炎動物模型中抑制免疫球蛋白E的效果SCM-cMSC的給藥優於GCM-MSC的給藥。為此還進行了酶聯免疫吸附測定分析，以確認血清中抑制免疫球蛋白E的效果是否因通過層分離培養法獲得的幹細胞之間的密度差而有所不同。更具體地，在D-59時間點處死在實施例5.2中製備的特應性皮炎動物模型，並在處死時間點從通過後靜脈採取的血液中獲得血清，並進行了免疫球蛋白E酶聯免疫吸附測定分析。其結果示出在圖37中。
如圖37所示與空白(Vechicle)處理組相比，cMSC1、cMSC2給藥組均具有抑制免疫球蛋白E的效果，但是在包括低密度培養步驟的通過改良的層分離培養法的cMSC1(100細胞/cm2、1000細胞/cm2)實驗組的抑制免疫球蛋白E的效果更優高密度培養cMSC2。這表明，通過低密度培養獲得的單克隆幹細胞可以顯著降低免疫球蛋白E水準，因此對特應性皮炎可顯示出優秀的效果。
5.4、肉眼觀察皮膚病變
對實施例5.2中製備的共7只特應性皮炎小鼠單獨塗敷PBC(Vechicle)、cMSC1(100細胞/cm2、1000細胞/cm2)、cMSC2，並肉眼確認皮膚病變部位中特應性皮膚症狀的恢復程度。通過對肉眼的觀察比較確認誘發特應性皮炎的背部部位中的傷口、紅斑、角質程度，並通過蘇木精—伊紅染色確認皮膚表皮的厚度變化，其結果示出在圖38及圖39中。
如圖38所示，視覺上，與cMSC2相比，在cMSC1(100細胞/cm2、1000細胞/cm2)組中確認到皮膚病變改善效果，在塗敷作為較低的密度的100細胞/cm2的組中確認到更加優秀的病變改善效果。
如圖39所示，與cMSC2相比，在cMSC1(100細胞/cm2、1000細胞/cm2)塗敷組中，確認到緩解表皮增厚的效果明顯。
綜上所述，與通過現有密度梯度層分離培養法獲得的單克隆幹細胞相比，若使用通過改良的工序獲得的cMSC1，則可具有更優秀的抗炎症效果，因此可具有得以改善的特應性皮炎改善效果。並且，與通過包括高密度培養步驟的層分離培養法獲得的幹細胞(cMSC2)相比，在通過包括低密度培養步驟的改良的層分離培養方法獲得的幹細胞(cMSC1)的情況下，可顯示出更加優秀的特應性皮炎改善效果。

Claims (10)

  1. 一種藥學組合物在製備治療特應性皮炎之藥物的用途，其中，該藥學組合物包含通過如下步驟獲得的單克隆幹細胞：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的第一上清液移到第二容器中且於上述第二容器中培養上述第一上清液；步驟3)，培養存在於上述第二容器中的細胞並於上述第二容器獲得第二上清液；步驟4)，將步驟3)的上述第二上清液作為步驟2)的上述第一上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以100細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養至第一代；以及步驟6)，傳代培養上述單克隆幹細胞至第二代至第八代，其中以100細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將上述單克隆幹細胞再接種至第二代至第八代；其中上述步驟5)或6)的培養基更包含一抗氧化劑。
  2. 如請求項1之用途，在上述步驟5)或步驟6)的培養中，以1000細胞/cm2的細胞密度接種於培養基中進行培養。
  3. 如請求項1之用途，上述單克隆幹細胞緩解由特應性皮炎引起的真皮或表皮的增厚。
  4. 如請求項1之用途，上述單克隆幹細胞抑制選自由免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1及白細胞介素4組成的組中的一種以上或促進γ-干擾素的生成。
  5. 如請求項1之用途，上述單克隆幹細胞抑制肥大細胞。
  6. 一種化妝品組合物在製備改善特應性皮炎之化妝品的用途，其中，該化妝品組合物包含單克隆幹細胞和化妝品輔助劑，其中，該單克隆幹細胞是通過如下步驟獲得：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的第一上清液移到第二容器中且於上述第二容器中培養上述第一上清液；步驟3)，培養存在於上述第二容器中的細胞並於上述第二容器獲得第二上清液；步驟4)，將步驟3)的上述第二上清液作為步驟2)的上述第一上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以100細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養至第一代；以及步驟6)，傳代培養上述單克隆幹細胞至第二代至第八代，其中以100細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將上述單克隆幹細胞再接種至第二代至第八代；其中上述步驟5)或6)的培養基更包含一抗氧化劑。
  7. 一種准藥物組合物在製備改善特應性皮炎之准藥物的用途，其中，該准藥物組合物包含通過如下步驟獲得的單克隆幹細胞：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的第一上清液移到第二容器中且於上述第二容器中培養上述第一上清液；步驟3)，培養存在於上述第二容器中的細胞並於上述第二容器獲得第二上清液；步驟4)，將步驟3)的上述第二上清液作為步驟2)的上述第一上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及 步驟5)，以100細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養至第一代；以及步驟6)，傳代培養上述單克隆幹細胞至第二代至第八代，其中以100細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將上述單克隆幹細胞再接種至第二代至第八代；其中上述步驟5)或6)的培養基更包含一抗氧化劑；以及其中上述准藥物組合物是製備成膏劑、乳液劑、氣溶膠、洗髮劑、凝膠劑或面膜劑的形態。
  8. 一種製備用於治療或改善特應性皮炎的緩解特應性皮炎引起的真皮或表皮的增厚的單克隆幹細胞的方法，該方法包括：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的第一上清液移到第二容器中且於上述第二容器中培養上述第一上清液；步驟3)，培養存在於上述第二容器中的細胞並於上述第二容器獲得第二上清液；步驟4)，將步驟3)的上述第二上清液作為步驟2)的上述第一上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以100細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養至第一代；以及步驟6)，傳代培養上述單克隆幹細胞至第二代至第八代，其中以100細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將上述單克隆幹細胞再接種至第二代至第八代，從而獲得緩解特應性皮炎引起的真皮或表皮的增厚的單克隆幹細胞，其中上述步驟5)或6)的培養基更包含一抗氧化劑。
  9. 如請求項8之方法，其中，在上述步驟5)或6)的培養中，以1000細胞/cm2的細胞密度接種於培養基中進行培養。
  10. 一種幹細胞在製備用於治療或改善特應性皮炎的幹細胞的用途，其中，該幹細胞通過如下步驟獲得：步驟1)，在第一容器中培養從個體分離的骨髓；步驟2)，僅將上述第一容器的第一上清液移到第二容器中且於上述第二容器中培養上述第一上清液；步驟3)，培養存在於上述第二容器中的細胞並於上述第二容器獲得第二上清液；步驟4)，將步驟3)的上述第二上清液作為步驟2)的上述第一上清液，通過重複步驟2)和步驟3)一次以上來獲得單克隆幹細胞；以及步驟5)，以100細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將步驟4)的上述單克隆幹細胞接種於培養基中進行培養至第一代；以及步驟6)，傳代培養上述單克隆幹細胞至第二代至第八代，其中以100細胞/cm2至1000細胞/cm2的細胞密度將上述單克隆幹細胞再接種至第二代至第八代；其中上述步驟5)或6)的培養基更包含一抗氧化劑。
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