WO2005121320A1 - 幹細胞自己複製促進剤 - Google Patents

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WO2005121320A1
WO2005121320A1 PCT/JP2005/010642 JP2005010642W WO2005121320A1 WO 2005121320 A1 WO2005121320 A1 WO 2005121320A1 JP 2005010642 W JP2005010642 W JP 2005010642W WO 2005121320 A1 WO2005121320 A1 WO 2005121320A1
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stem cells
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Atsushi Hirao
Keisuke Ito
Toshio Suda
Kazuhiro Sakurada
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Keio University
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Definitions

  • the present invention relates to a stem cell self-renewal promoting agent, a prophylactic agent for cancer, a prophylactic or therapeutic agent for a disease or tissue dysfunction accompanied by tissue destruction, a stem cell culture medium to which the stem cell self-renewal promoting agent is added,
  • the present invention relates to a stem cell cultured in a medium, a method for producing a stem cell, and a method for screening a hematopoietic stem cell self-renewal promoter.
  • Cells produced by such a stem cell system include, in addition to blood cells, skin epithelial cells, corneal epithelium, nervous system cells, alveolar epithelial cells, tracheal epithelial cells, gastrointestinal mucosal cells, hepatocytes, spleen endocrine, There are exocrine cells, salivary gland cells, blood vessels, mesenchymal tissues such as skeletal muscle and bone, renal tubular epithelial cells, renal glomerular cells, testicular germ cells, and the like.
  • Mitotic senescence is a phenomenon in which normal cells stop cell division after a limited number of divisions. Cells that have ceased cell division change their morphology significantly and eventually induce cell death. It has been shown that the molecular mechanism of such mitotic senescence is caused by shortening of the telomere at the end of the chromosome. (See Non-Patent Document 5).
  • Ataxia telangiectasia is an ataxia telangiectasia (AT) that exhibits progressive cerebellar ataxia, telangiectasia of the ocular mucosa and skin, and is highly susceptible to infection.
  • AT is autosomal recessive and affects men and women.
  • IgG2, IgG4, IgA, and IgE decreased antibody production against polysaccharide antigens, decreased T cell numbers, and dysfunction were observed.
  • defects have been observed in radiation sensitivity, DNA repair capacity, and cell cycle monitoring of cells.
  • stress-induced aging has been proposed as another hypothesis of cell aging. Unlike programmed aging, such as mitotic aging, when cells are exposed to long-term stress, the stress-induced DNA damage accumulates and cell aging occurs. It is a hypothesis that it will occur (see Non-Patent Document 9). Oxidative stress, ultraviolet rays, and chemicals are considered as stresses on cells. In C. elegans, mutations in the insulin / IGF-I signal pathway were observed to promote the transcription of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase (SOD) by extending the activity of the forkhead transcription factor, extending the lifespan.
  • SOD superoxide dismutase
  • Non-Patent Document 10 It is the mitochondrial electron transport system that produces the most active oxygen in cells, and in humans and other mammals, skeletal muscle and liver are thought to play a central role in producing active oxygen. It is also believed that continuous exposure of macrophages to reactive oxygen species associated with chronic inflammation promotes cell senescence. It is thought that these active oxygens not only lead the cells to senescence, but also activate the oncogenes due to DNA damage and induce cancer cells instead of senescence in stem cells. However, in bone marrow stem cells, skeletal muscle and liver-derived active oxygen and inflammation The likelihood of exposure to reactive oxygen species derived from macrophages is low, and it is difficult to explain stem cell senescence in "stress-induced senescence".
  • Non-Patent Document 1 "Journal of Clinic al Investigation", 2004, Vol. 113, p. 4-7
  • Non-Patent Document 2 "Journal of Clinic al Investigation", 2004, Vol. 113, p. 16-168
  • Non-Patent Document 3 "Journal of Clinic al Investigation", 2004, Vol. 113, p. 175-179
  • Non-Patent Document 4 "Etamental Cell Research", 19961, Vol. 25, p. 585-621
  • Non-Patent Document 5 “Nature”, 1990, Vol. 345, p. 458-460
  • Non-Patent Document 6 “Nature Review Cancer Journal", 2003, Volume 3, p. 155—168
  • Non-Patent Document 7 “Nature”, 2003, Vol. 421, p. 643-648
  • Non-patent Document 8 “Journal of Clinic al Investigation” ) ", Vol. 113, p. 4-7, 2004
  • Non-Patent Document 9 "Physiological Reviews", 2002, Vol. 82, p. 47-95
  • Non-Patent Document 10 “Trend in Biochemical Sciences”, 2002, Vol. 27, p. 352—360
  • the present invention provides a stem cell self-renewal promoting agent, a prophylactic agent for cancer, a prophylactic or therapeutic agent for a disease associated with tissue destruction or tissue failure, a medium for stem cell culture to which the stem cell self-renewal promoting agent is added,
  • An object of the present invention is to provide a stem cell cultured in the medium, a method for producing the stem cell, or a method for screening a hematopoietic stem cell self-renewal promoter.
  • the present invention relates to the following (1) to (32).
  • (1) In stem cells, the activity to suppress the production of active oxygen, the activity to reduce active oxygen in stem cells by eliminating the generated active oxygen, and the intracellular signal transduction system induced by the active oxygen
  • the activity to suppress the production of active oxygen the activity to reduce active oxygen in stem cells by eliminating the generated active oxygen, and the intracellular signal transduction system induced by the active oxygen
  • the activity of suppressing the production of active oxygen the activity of reducing active oxygen in stem cells by eliminating the generated active oxygen, and the intracellular signal transduction system induced by the active oxygen
  • antioxidant enzyme is an enzyme selected from the group consisting of catalase, daltathione peroxidase, daltathione reductase, and superoxide dismutase.
  • the substance having the ability to induce the expression of antioxidant enzyme and enhance the activity of Z or the activity of the antioxidant enzyme is a gene therapy vector into which a gene encoding the antioxidant enzyme has been introduced.
  • the agent for promoting self-renewal of stem cells according to (4) or (5) which is a substance having the ability to induce expression of antioxidant enzymes and enhance Z or the activity of the antioxidant enzymes, caratonin.
  • a substance having at least one activity of reducing active oxygen in the stem cell by removing the active oxygen and removing the intracellular signal transduction system induced by the active oxygen is added to the stem cells by the Ataxia 'Terranectasia' mu.
  • the agent for promoting self-renewal of stem cells according to the above (1) which is a substance capable of inducing the expression of a titid (Ataxia telangiectasia muted, hereinafter referred to as “ATM”) protein and enhancing the activity of Z or ATM protein.
  • the agent for promoting self-renewal of stem cells according to (8), wherein the substance capable of inducing the expression of ATM protein and enhancing the activity of Z or ATM protein is a vector for gene therapy into which ATM has been introduced.
  • a prophylactic agent for cancer comprising as an active ingredient a substance having at least one inhibitory activity.
  • a preventive or therapeutic agent for a disease associated with tissue destruction or tissue failure comprising as an active ingredient a substance having at least one inhibitory activity.
  • the activity to suppress the production of active oxygen In stem cells, the activity to reduce active oxygen in stem cells by erasing the generated active oxygen, and the intracellular signal transduction system induced by the active oxygen
  • a substance having at least one inhibitory activity glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) inhibitor; hepatocyte growth factor (HGF); granulocyte colony stimulating factor (G-CSF); macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and granulocyte 'macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
  • G-CSF glycogen synthase kinase-3
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte 'macrophage colony stimulating factor
  • Tissues are red blood cells, white blood cells, platelets, fibroblasts, fat cells, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes, neurons, glia, oligodendrocytes, vascular endothelial cells, skin epidermal cells, skin dermal cells , Hair follicle cells, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, tracheal epithelial cells, alveolar cells, gastrointestinal epithelial cells, oral epithelial cells, ameloblasts, zoegeblasts, hepatocytes, Kupffer cells, Gallbladder epithelial cells, spleen endocrine cells, spleen exocrine cells, renal tubular cells, renal glomerular cells, ureteral epithelial cells, urothelial cells, pituitary secretory cells, thyroid cells, adrenal cortex cells, adrenal medulla cells, prostate The prophylaxis according to the above (13) or (14),
  • Substances having antioxidant activity include vitamin B12, vitamin C, vitamin E, carotenoids, ubiquinone, N-acyl derivatives of cysteine, dipeptides or tripeptides containing at least one cysteine, polyphenols, curcumin And the prophylactic or therapeutic agent according to the above (16), which is at least one substance also selected from the group consisting of tetrahydrocurcumin.
  • the activity to suppress the production of active oxygen the activity to reduce active oxygen in stem cells by erasing the generated active oxygen, and the intracellular signal transduction system induced by the active oxygen
  • the substance having at least one inhibitory activity is a substance capable of inducing the expression of an antioxidant enzyme in the stem cell and enhancing Z or the activity of the antioxidant enzyme.
  • the prophylactic or therapeutic agent according to any one of the above.
  • the antioxidant enzyme is an enzyme selected from the group consisting of catalase, daltathione peroxidase, daltathione reductase, and superoxide dismutase.
  • the gene therapy vector described above, wherein the substance capable of inducing the expression of the antioxidant enzyme and enhancing Z or the activity of the antioxidant enzyme is a gene therapy vector into which a gene encoding the antioxidant enzyme has been introduced.
  • the activity to suppress the production of active oxygen the activity to reduce active oxygen in stem cells by eliminating the generated active oxygen, and the intracellular signal transduction system induced by the active oxygen
  • the substance having at least one inhibitory activity is a substance capable of inducing the expression of an ATM protein in the stem cells and enhancing the activity of Z or ATM protein.
  • the preventive or therapeutic agent according to the above (22), wherein the substance capable of inducing the expression of the ATM protein and enhancing the activity of Z or ATM protein is a vector for gene therapy into which ATM has been introduced.
  • prophylactic agent according to any one of (12) to (15) above, wherein the substance having an activity of suppressing an intracellular signal transduction system induced by active oxygen in stem cells is a P38MAPK inhibitor. Therapeutic drugs.
  • a prophylactic or therapeutic agent for a disease or tissue failure associated with tissue destruction including stem cells cultured in the medium according to (26).
  • stem cells cultured in the medium according to (26).
  • the self-renewal ability of cells including hematopoietic stem cells derived from ATM homo-deficient mice was measured, and the cells were tested in the presence and absence of the test substance.
  • the self-renewal ability in the presence of the test substance is compared to the self-renewal ability in the absence of the test substance.
  • a method for screening a hematopoietic stem cell self-renewal promoter which is characterized in that:
  • Stem cells are cultured in the presence of the stem cell self-renewal promoter according to any one of (1) to (11) to promote self-renewal of the stem cells, and the stem cells are collected from the culture.
  • a method for producing a stem cell is described in detail below.
  • An activity for suppressing the production of active oxygen in stem cells an activity for reducing active oxygen in stem cells by erasing the generated active oxygen, and an activity for producing active agents for promoting self-renewal of stem cells.
  • a stem cell self-renewal promoting agent a prophylactic agent for cancer, a prophylactic or therapeutic agent for a disease or tissue failure accompanied by tissue destruction, a medium for stem cell culture to which the stem cell self-renewal promoting agent is added, And a method for producing a stem cell or a method for screening a hematopoietic stem cell self-renewal promoter.
  • the agent for promoting self-renewal of stem cells of the present invention has an activity of suppressing the production of active oxygen in stem cells, an activity of reducing active oxygen in stem cells by erasing the generated active oxygen, and an activity of inducing the active oxygen.
  • a substance having an activity of suppressing the production of active oxygen and reducing active oxygen by eliminating Z or produced active oxygen includes a substance having an antioxidant effect, an antioxidant enzyme in stem cells.
  • ATM Ataxia telangiectasia mutated
  • Examples of the substance having an antioxidant effect include vitamin B12, vitamin C, vitamin E, carotenoid, ubiquinone, N-acyl derivative of cysteine, dipeptide or tripeptide containing at least one cysteine, polyphenols , Curcumin, tetrahydrocurcumin and the like.
  • vitamin B12 examples include hydroxocobalamin hydrochloride, hydroxocobalamin acetate, hydroxocobalamin, cyanocobalamin, methylcobalamin, ditriconolamin, adenosylconolamin, and acocobalamine.
  • vitamin C examples include L-ascorbic acid, sodium L-ascorbate, and stearic acid L-ascorbate.
  • vitamin E examples include ⁇ -tocopherolone, j8-tocopherolone, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherolone, ⁇ -tocotrienole, j8-tocotrienole, ⁇ -tocotrienol And ⁇ -tocotrienol, and derivatives thereof such as acetates, nicotinic esters and phosphates.
  • the carotenoid may be any of a natural product and a synthetic product.
  • ⁇ -force roten, / 3 strength strength, ⁇ strength strength strength, astaxanthin , canthaxanthin, zeaxanthin , Lycopene, cryptoxanthin, crocin, rhodoxanthin, rutin, etc. it can.
  • an ester of the carotenoid with a fatty acid or the like for example, a monoester or diester of oleic acid, linoleic acid, normitic acid, myristic acid, or the like can also be used.
  • ubiquinone those having 1 to 12 isoprene residues in ubiquinone are preferably used, those having 6 to 12 residues are more preferably used, and those having 10 residues ( Ubidecarenone) is particularly preferably used.
  • N-acyl derivative of cysteine N-acetyl cysteine is preferably used.
  • dipeptide or tripeptide containing at least one cysteine is preferably used.
  • polyphenols examples include flavonoids, tannins, caffeic acid, caffeic acid derivatives, lignans, and the like.
  • Flavonoids include, for example, flavone, isoflavone, flavonol, flavanone, flavan-3-oneole, catechin, auron, anthocyanidin, force norecon, dihydro force norecon, and more specifically, for example, quercetin, genistein, Rutin, Hesbergin, Silymarin, (+)-Catechin, (-)-Epigallocatechin gallate, (-)-Epicatechin, (-)-Epigallocatechin, (-)-Epi tekine gallate, etc. .
  • caffeic acid derivative examples include, for example, 3,4-dicaffeoylquinic acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid, 4,5-dicafoiloquinic acid, and 3,4,5-tricafoiloquinic acid. , Chlorogenic acid, rosmarinic acid and the like.
  • lignans examples include sesamin, sesamolin, sesamol, sesaminol, scizandrine, deoxycisandrin, gomisin and the like.
  • Examples of the substance capable of inducing the expression of antioxidant enzymes in stem cells and enhancing Z or the activity of the antioxidant enzymes include melatonin and the like. Further, a gene therapy vector into which a gene encoding the antioxidant enzyme has been introduced can be used as a substance having the ability to induce the expression of antioxidant enzyme in stem cells and enhance the activity of Z or the activity of the antioxidant enzyme. .
  • antioxidant enzymes include catalase, daltathione peroxidase, and gluta. Thione reductase, superoxide dismutase, and the like.
  • Examples of the gene therapy vector include a retrovirus vector and an adenovirus vector.
  • the retrovirus vector utilizes a mouse leukemia virus (MoMLV: Moloney murine leukemia virus) as an RNA virus as a vector.
  • MoMLV mouse leukemia virus
  • the basic structure of the retroviral genome to which MoMLV belongs is the LTR (long terminal repeat) at both ends, the gag, pol, env sandwiched between them, and the ⁇ force between the LTR and gag on the 5 'side.
  • the retrovirus vector can be used as a vector for gene therapy according to the method described in Br. Med. Bull. 1995 Jan; 51 (l): 12-30. Vile RG, Russell SJ and the like.
  • the vector plasmid is introduced into a packaging cell line designed to express a viral protein (gag, pol gene product), and the cells are cultured.
  • Lovirus retroviral vector
  • the recombinant retrovirus in the culture can be concentrated by centrifugation.
  • an adenovirus vector is a vector derived from an adenovirus which is a DNA virus different from a retrovirus vector.
  • the adenovirus vector can be used as a gene therapy vector according to the method described in Curr. Opin. Biotechnol. 1999 Oct; 10 (5): 440-7. Benihoud K, Yeh P, Perricaudet M. That is, in order to use adenovirus as a vector for gene therapy, first, the E1 gene region is deleted from the viral genome consisting of linear double-stranded DNA of about 36 kb, and the above-mentioned antioxidant enzyme is added thereto. Construct a cosmid with one of the genes inserted.
  • adenovirus vector By introducing the cosmid into a human fetal kidney-derived cell line (293 cells) that continuously expresses E1A and E1B together with the parental viral DNA obtained by cutting the E1 gene region at multiple locations, Homologous recombination occurs to produce a non-proliferating recombinant adenovirus (adenovirus vector).
  • adenovirus vector This recombinant adenovirus vector can be recovered by freeze-thawing the cells.
  • Examples of the substance having the ability to induce the expression of the ATM protein in the stem cells and enhance the activity of the Z or ATM protein include, for example, a gene therapy vector into which the ATM has been introduced. Examples of the gene therapy vector include the above-described gene therapy vector and the like.
  • Examples of the substance having an activity of suppressing an intracellular signal transduction system induced by active oxygen in stem cells include an inhibitor of P38MAPK and the like.
  • P38MAPK is activated by active oxygen, and as a result, self-renewal of stem cells is suppressed. Therefore, a p38MAPK inhibitor suppresses the activation of p38MAPK, thereby suppressing the intracellular signal transduction system, thereby promoting the self-renewal of stem cells.
  • Examples of p38 MAPK inhibitors include SB203580 (Journal of Biological Chemistry 272 (18) 121 16-12121, 1997), SB202190 (BIOMOL Research Labs., Inc.) ⁇ PD169316 (Calbiochem), FR167653 (Nikken Chemical Co. , Ltd.) ⁇ BIRB796BS (Blood 101, 4446-4448, 2003).
  • an inhibitor of P38MAPK gene expression such as small inhibitory RNA (siRNA) against p38MAPK may be used!
  • the agent for promoting self-renewal of stem cells of the present invention can promote self-renewal of stem cells when brought into contact with stem cells in vivo and in vitro.
  • the stem cells are not particularly limited as long as they are stem cells present in adult tissues (adult stem cells), but are preferably stem cells present in bone marrow, peripheral blood, skin, adipose tissue, skeletal muscle, and the like.
  • the activity of inhibiting the production of active oxygen in the stem cell is a drug that can be used alone as it is as a stem cell self-renewal promoter. It is desirable to mix it with one or more carriers that are physically acceptable and provide it as a pharmaceutical preparation produced by any method well known in the pharmaceutical arts.
  • Examples of the administration form include tablets, capsules, granules, injections, ointments, tapes, inhalants such as dry powders and aerosols.
  • excipients such as lactose, disintegrants such as starch, lubricants such as magnesium stearate, binders such as hydroxypropylcellulose, fatty acid esters and the like
  • binders such as hydroxypropylcellulose, fatty acid esters and the like
  • surfactants and plasticizers such as glycerin can be used.
  • Formulations suitable for intramuscular, subcutaneous, intradermal, intravenous or intratracheal administration include, for example, injections, sprays and the like.
  • water for example, water, physiological saline, vegetable oils such as soybean oil, solvents, solubilizers, isotonic agents, preservatives, antioxidants and the like can be used.
  • the inhalant is prepared using the substance of the present invention or a carrier which does not irritate the oral and respiratory mucosa of the recipient, disperses the substance as fine particles, and facilitates absorption.
  • the carrier include lactose, glycerin and the like. Preparations such as aerosols and dry powders are possible depending on the properties of the substance and the carrier used in the present invention. Also, in these parenteral preparations, the components exemplified as additives in the oral preparation can be added.
  • the dose or the number of administrations varies depending on the desired prophylactic or therapeutic effect, the administration method, the administration period, the age, the body weight, etc., but is usually 20 to 25 mg for vitamin B12 and 20 to 25 mg for vitamin C per adult per day. 200-1000 mg, vitamin E 400-800 IU, carotenoids 5-60 mg, ubiquinone 30-150 mg, N-acetylcystine 250-1500 mg, glutathione 500-1000 mg, polyphenols l-1000 mg, curcumin
  • tetrahydrocurcumin is administered at 10 to 1000 mg, and SB203580, SB202190, PD169316, FR167653, and BIRB796BS at 100 to 1000 g, respectively.
  • the stem cell self-renewal promoter of the present invention can promote self-renewal of the stem cells by contacting the stem cells in vitro and culturing the stem cells.
  • the agent for promoting self-renewal of stem cells of the present invention is used in vitro
  • the substance of the present invention is preferably dissolved in a solution capable of dissolving the substance before use.
  • the solution may be water, Rusulfoxide (DMSO) and the like.
  • tissues from which stem cells can be separated include bone marrow, peripheral blood, skin, adipose tissue, skeletal muscle, and the like.
  • CD45-negative and glycophorin-A-negative cells were selected from cells isolated from these tissues by enzyme treatment, etc., and 10 ⁇ g / ml insulin, 5.5 ⁇ g / ml using Low-GLUCOSE DMEM, MCDB-201, etc. as a basic medium.
  • Transferrin 5 ng / ml selenium, 0.5 ⁇ g / ml bovine serum albumin, 0.01 ⁇ mol / 1 dexamethasone, 0.1 mmol / l L-ascorbic acid diphosphate, 2% fetal bovine serum, lOng / ml platelet-derived growth factor, lOng 5 ng / ml using a medium containing epidermal growth factor, lOng / ml insulin-like growth factor, 1000 IU leukemia inhibitory factor and the substance of the present invention, or DMEM medium containing 10% horse serum and the substance of the present invention.
  • DMEM medium containing 10% horse serum and the substance of the present invention.
  • the concentration of the substance of the present invention in the medium used in the above culture is adjusted according to the density of the cells to be cultured.
  • the equipment used is a completely closed system capable of concentrating, washing and recovering cultured cells. It is preferable that the cultured cells be washed with a physiological saline solution using Hemolite 2 Plus or the like to remove as much as possible the substances such as cytodynamics used for culture!
  • the stem cell self-renewal promoting activity of the stem cell self-renewal promoting agent of the present invention can be evaluated, for example, by the following method.
  • the stem cell self-renewal promoting agent of the present invention is administered to a non-human animal with reduced stem cell self-renewal ability, and the stem cell self-renewal promoting ability of the non-human animal is measured.
  • the activity of promoting self-renewal of stem cells can be evaluated.
  • Stem cell self-renewal ability is determined by observing the reduction in symptoms associated with reduced stem cell self-renewal ability, or by culturing stem cells isolated from the animal in the presence of the stem cell self-renewal promoter of the present invention. It can be measured, for example, by measuring colony forming ability.
  • an ATM homo-deficient mouse As a non-human animal with reduced self-renewal ability of stem cells, for example, an ATM homo-deficient mouse can be used.
  • the self-replicating ability was decreased due to an increase in the amount of intracellular active oxygen of hematopoietic stem cells, and as a result, myeloid cells, lymphoid cells, erythroid cells, etc. were remarkably reduced, and hematopoietic stem cell colonies were formed. Performance is significantly reduced.
  • the stem cell self-renewal promoter of the present invention when an ATM homo-deficient mouse is used as a non-human animal with reduced stem cell self-renewal ability, after administering the stem cell self-renewal promoter of the present invention to the mouse, the anemia state is reduced by flow cytometry.
  • the stem cell self-renewal promoting activity of the stem cell self-renewal promoter of the present invention can be evaluated.
  • cells containing hematopoietic stem cells such as osteoclasts collected from the mice, c-Kit positive, Sca-1 positive and Lineage negative cells (KSL cells) separated by the bone marrow cell force FACS sorter or the like.
  • KSL cells Lineage negative cells
  • the self-renewal ability of cells including hematopoietic stem cells derived from ATM homo-deficient mice was measured by the above method, and the presence of the test substance and the absence of the test substance were measured.
  • the self-renewal ability of the cells in the presence of the test substance is compared, and the self-renewal ability in the presence of the test substance is enhanced more than the self-renewal ability in the absence of the test substance!
  • a hematopoietic stem cell self-replication promoter can be screened.
  • the agent for promoting stem cell self-renewal of the present invention has an effect of preventing senescence of stem cells, and therefore can be used as a preventive agent for cancer whose onset frequency increases with aging and diseases associated with tissue destruction.
  • the agent for promoting self-renewal of stem cells of the present invention promotes tissue repair by promoting self-renewal of stem cells and bone marrow stem cells of injured tissues, and is therefore a therapeutic agent for diseases associated with tissue destruction.
  • diseases associated with tissue destruction include neurological diseases, cardiovascular diseases, liver diseases, spleen Disease, digestive tract disease, kidney disease, skin disease, lung disease and the like.
  • Examples of the neurological disease include cerebral infarction, cerebrovascular disease, Parkinson's disease, Aln's disease, Huntington's chorea, spinal cord injury, depression, and manic depression.
  • Examples of the circulatory system disease include obstructive vascular disease, myocardial infarction, heart failure, coronary artery disease and the like.
  • liver disease examples include hepatitis B, hepatitis C, alcoholic hepatitis, cirrhosis, liver failure and the like.
  • Examples of the spleen disease include diabetes, spleenitis and the like.
  • Gastrointestinal diseases include, for example, Crohn's disease, ulcerative colitis and the like.
  • kidney disease examples include IgA nephropathy, nephritis, renal failure and the like.
  • Skin diseases include, for example, pressure sores, burns, suture wounds, lacerations, incision wounds, bites, dermatitis, hypertrophic scars, keloids, diabetic ulcers, arterial ulcers, venous ulcers and the like.
  • lung diseases include emphysema, chronic bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis, idiopathic interstitial pneumonia (pulmonary fibrosis), diffuse pulmonary fibrosis, tuberculosis, and asthma. It is.
  • the agent for promoting self-renewal of stem cells of the present invention promotes self-renewal widely to stem cells present in adult tissues, and thus can be used as a therapeutic agent for tissue failure associated with various diseases. That is, the agent for promoting self-renewal of stem cells of the present invention promotes the self-renewal of stem cells present in a tissue in which a tissue failure has occurred, thereby promoting the renewal of cells forming the tissue and treating the tissue failure. be able to.
  • Diseases associated with tissue failure include, for example, bone marrow failure, motor dysfunction, circulatory disease, neurological disease, pressure ulcer, osteoporosis, arthritis, lung disease, gastrointestinal tract disease, alveolar pyorrhea, liver disease Patients, spleen disease, kidney disease, endocrine abnormalities, retinal disorders, cataracts, hearing loss and the like.
  • the cells stimulated by the stem cell self-renewal promoting agent of the present invention include, for example, red blood cells, white blood cells, and platelets in bone marrow failure, and fibroblasts, adipocytes, and skeletal muscle in motor dysfunction.
  • Cells smooth muscle cells, cardiomyocytes, vascular endothelial cells for cardiovascular diseases, neurons-euron, glia, oligodendrocytes, skin for pressure ulcers Skin epidermal cells, skin dermal cells, hair follicle cells, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts for osteoporosis, chondrocytes for arthritis, tracheal epithelial cells, alveolar cells for lung disease, gastrointestinal tract for gastrointestinal diseases
  • Epithelial cells oral epithelial cells for alveolar pyorrhea, enamel blast cells, zoege blast cells, hepatocytes for liver disease, Kupffer cells, gallbladder epithelial cells, endocrine spleen cells for spleen disease, exocrine spleen cells for kidney disease, kidney tubule for kidney disease Cells, renal glomerular cells, ureteral epithelial cells, urothelial cells, pituitary secretory cells, thyroid cells,
  • the stem cells self-replicated in vitro using the stem cell self-renewal promoting agent of the present invention according to the method described in 1 above can be injected into a vein by a normal infusion method or directly into an affected part by injection. It can be used for the prevention or treatment of each of the above diseases.
  • stem cell self-renewal promoter of the present invention in combination with a GSK-3 inhibitor, HGF, G-CSF, M-CSF, GM-CSF
  • the agent for promoting self-renewal of stem cells of the present invention includes a glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) inhibitor and hepatocyte growth factor (HGF) that promote proliferation and differentiation of stem cells, and mobilization, proliferation, and distribution of stem cells.
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte 'macrophage colony stimulating factor
  • GSK-3 inhibitors include L803-mts (Biol Psychiatry. 2004 Apr 15; 55: 781-4.) And macrocyclic bis-7-azaindolylmaleimides (Bioorg Med Chem. 2004 Mar 12: 1239-55). ), 6-bromoindiruDin-3′-oxime (Nat Med. 2004 Jan 0: 55-63.), 1-azakenpaullone (Bioorg Med Chem Lett. 2004 Jan 19; 14: 413-6) and the like.
  • the G-CSF for example Nartograstim (trade name Noiappu, Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.), off Irugurasuchimu (trade name Gran, Sankyo Co., Ltd .; trade name Granulokine, Hoffman 'La' Roche Ltd .; trade name Ne U p Gen , Amdion), Lenograstim (trade name Neutrogin, manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd .; Granocyte, Aventis), pegfilgrastim (trade name Neulasta, Amge) Sargramostim (trade name Leukine, manufactured by Schering) and the like.
  • Nartograstim trade name Noiappu, Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
  • off Irugurasuchimu trade name Gran, Sankyo Co., Ltd .
  • trade name Granulokine Hoffman 'La' Roche Ltd .
  • Ne U p Gen Amdion
  • Lenograstim trade name Neutrogin, manufactured by Ch
  • M-CSF examples include Millimostim (trade name of Leukoprol, manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) and the like.
  • GM-CSF examples include romultide (trade name: Nopia Note, manufactured by Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.) and the like.
  • the agent for promoting self-renewal of stem cells and the concomitant components of the present invention may be used as a single agent (combination) or in a combination of a plurality of preparations as long as they are formulated so as to contain these respective active ingredients.
  • the preparation method, administration form, administration method and the like of the preparation can be performed in the same manner as in the above 1.
  • kits When administered as a combination of a plurality of preparations, for example, (a) a first component containing a stem cell self-renewal promoter and (b) a second component containing a combination component are separately formulated.
  • a kit can be prepared and each component can be administered to the same subject by the same route or different routes at the same time or at a certain time using the kit.
  • the kit may be made of, for example, any material or shape as long as it is a container that does not show denaturation of its components due to external temperature or light during storage or elution of chemical components from the container. It is composed of two or more containers (eg, vials, bags, etc.) and contents without limitation, and the above-mentioned first and second components, which are contents, are administered via separate routes (eg, tubes, etc.) or via the same route. Those having a possible form are used. Specifically, kits for tablets, injections, inhalants and the like can be mentioned.
  • the preferred U ⁇ dose ratio (weight Z weight) of the stem cell self-renewal promoter and the concomitant component is appropriately adjusted according to the combination of the stem cell self-renewal promoter and the concomitant component used, the potency of the concomitant component, and the like. For example, it is used at a dose ratio of lZ5000 to 100Zl, preferably 10000 to 20 ⁇ , more preferably ⁇ .
  • the dose or the number of administrations varies depending on the desired preventive or therapeutic effect, administration method, period, age, body weight, and the like.
  • the dose described in 1 above, and for the GSK-3 inhibitor Usually, it is preferable to administer 0.1 mgZkg to 100 mgZkg per adult per day, and for HGF, G-CSF, M-CSF or GM-CSF, usually 0.1 mgZkg to 100 gZkg per adult per day.
  • Test Example 1 Increased amount of active oxygen and decreased self-renewal ability in ATM homo-deficient mouse hematopoietic stem cells
  • the ATM homo-deficient mouse is the same as the male and female of the ATM hetero-deficient mouse obtained from Dr. Peter McKinnon at St. Jude Children's Research Hospital. Obtained by Litters of wild-type mice (C57B L / 6-Ly5.2) were used as a control.
  • the recovered bone marrow cell strength was also determined by FACS sorter and anti-c-Kit antibody (BD Regngen, 2B8), anti-Sea-1 antibody (BD Regngen, D7), anti-CD4 antibody (BD Regngen, L3T4) , Anti-CD8 antibody (BD Regngen, 53-6.72), anti-B220 antibody (BD Regngen, RA3-6B2), anti-TER-119 antibody (BD Regngen), anti-Gr-1 antibody (BD POngen RB6- 8 C5) and anti-Mac-1 antibody (BD Regngen, M1 / 70) using c-Kit positive, Sea-1 positive and Lineage negative cells (KSL cells), Lineage negative cells and Lineage positive cells were separated.
  • the lineage negative cells include CD4 and CD8, T cell markers, B220, B cell markers, TER-119, a red blood cell marker, Gr-1, a granulocyte marker, and macrophages.
  • Lineage-positive cells are cells that are positive for at least one of these markers. Means vesicle.
  • the bone marrow remodeling ability at one month after transplantation showed no significant difference between cells derived from ATM homo-deficient mice and cells derived from wild-type mice.
  • the number of cells derived from ATM homo-deficient mice decreased significantly. This tendency was more remarkably observed when KSL cells, an undivided cell population, were transplanted.
  • failure of bone marrow remodeling was observed in all three lineages of B cells, T cells, and myeloids.
  • ATM homo-deficient mice frequently develop lymph tumors after 8 weeks of age, but some mice survive for a long time without developing lymph tumors. Observation of such long-term surviving ATM home-deficient mice revealed that they exhibited severe anemia after 20 weeks of age, unlike wild-type mice.
  • KSL cells derived from ATM homo-deficient mice had about 15 to 20-fold increase in KSL cells derived from wild-type mice. Furthermore, after culturing for 2 days in the presence of SCF and TPO, the amount of active oxygen in the cells was measured.As a result, KSL cells derived from ATM homo-deleted mice were approximately 40 to 50 times more than wild-type mice. Also reached. When the changes in the gene expression of KSL cells due to vigorous culture were analyzed by RT-PCR, a remarkable increase in the expression of pl6I NK4a gene was observed.
  • Test Example 2 Recovery of reduced self-renewal ability in hematopoietic stem cells from ATM homo-deficient mice by administration of an antioxidant
  • the cells were collected, and on methylcellulose, 20 ng / ml SCF, 20 ng / ml IL-3 (manufactured by PeproTech EC) and 2 U / ml erythropoietin (manufactured by Chugai Pharmaceutical) A mouth-one formation test was performed in the presence of.
  • hematopoietic stem cells contained in KSL cells need to self-renew.
  • NAC and catalase-added koji reduced the amount of active oxygen in hematopoietic stem cells and restored the self-renewal ability of the stem cells.
  • NAC was subcutaneously administered to the ATM homo-deficient mouse at a dose of 100 mg / kg / day for 3 weeks, and the amount of active oxygen in the KSL cells isolated from the bone marrow of the mouse by the above method was measured. As a result, it was equal to the amount of active oxygen in KSL cells derived from wild-type mice.
  • a competitive bone marrow reconstitution test using the method described in Test Example 1 using KSL cells derived from ATM homo-deficient mice to which NAC was administered, unlike the control group that received NAC, Hematopoietic recovery was observed.
  • An injection having the following composition is prepared by a conventional method.
  • An injection having the following composition is prepared by a conventional method.
  • a stem cell self-replication promoter a prophylactic agent for cancer, a prophylactic or therapeutic agent for a disease or tissue failure accompanied by tissue destruction, and a culture medium for stem cell culture to which the stem cell self-replication promoter is added
  • the present invention also provides a stem cell cultured in the medium, a method for producing a stem cell, or a method for screening a hematopoietic stem cell self-renewal promoter.

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Abstract

　本発明は、幹細胞自己複製促進剤、癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患もしくは組織不全の予防薬もしくは治療薬、該幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細胞培養用培地、該培地で培養した幹細胞、幹細胞の製造方法または造血幹細胞自己複製促進剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。 　本発明によれば、幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効成分として含有する幹細胞自己複製促進剤、癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患もしくは組織不全の予防もしくは治療薬、該幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細胞培養用培地、該培地で培養した幹細胞、幹細胞の製造方法または造血幹細胞自己複製促進剤のスクリーニング方法が提供される。

Description

明 細 書
幹細胞自己複製促進剤
技術分野
[0001] 本発明は、幹細胞自己複製促進剤、癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患または組織 不全の予防薬または治療薬、該幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細胞培養 用培地、該培地で培養した幹細胞、幹細胞の製造方法および造血幹細胞自己複製 促進剤のスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] 成体組織中の細胞は細胞自身の寿命、物理的な傷害、感染など様々な原因により 失われる。そのため、生体には細胞死に伴い細胞新生を引き起こす仕組みが存在す る。このような細胞新生は、各組織や骨髄に存在する幹細胞により担われている。造 血幹細胞は、毎日数千億個の様々な血液系の細胞を産生しつつも、一生の間枯渴 しないことから、幹細胞は多分ィ匕能を有すると同時に幹細胞が幹細胞を産み出すと いう自己複製能を持つと考えられている。このような幹細胞システムにより産生される 細胞群には、血液細胞以外に、皮膚上皮細胞、角膜上皮、神経系細胞、肺胞上皮 細胞、気管上皮細胞、消化管粘膜細胞、肝細胞、脾内分泌，外分泌細胞、唾液腺細 胞、血管、骨格筋や骨などの間葉系組織、腎尿細管上皮細胞、腎糸球体細胞、精 巣生殖細胞などがある。
[0003] 成体の幹細胞が完全な自己複製能を有するとするならば、幹細胞は加齢に伴って その機能を変化させることはないはずである。し力 細胞新生の障害を原因とする臓 器不全や癌は加齢に比例して増加することが知られており、これは幹細胞の老化が 原因と考えられている (非特許文献 1〜3参照)。
[0004] 細胞の老化に関する最初の重要な発見は、 1961年に Hayflickにより観察された"分 裂老化"である (非特許文献 4参照)。分裂老化とは、正常細胞が限られた回数の分 裂を終えると細胞分裂を停止するという現象である。細胞分裂を停止した細胞は、そ の形態を大きく変化させ、最終的には細胞死が誘導される。このような分裂老化の分 子メカニズムとして、染色体の末端のテロメァの短縮が原因であることが示されて 、る (非特許文献 5参照)。
[0005] 血管拡張性運動失調症 (Ataxia telangiectasia, A-T)は、進行性の小脳性運動失 調、眼球粘膜や皮膚の毛細管拡張症と易感染性を呈し、また高率な悪性腫瘍の合 併を特徴としている (非特許文献 6参照)。 A-Tは常染色体劣性遺伝で男女に発症す る。また、 A-Tでは IgG2、 IgG4、 IgA、 IgEの低下と多糖体抗原に対する抗体産生の低 下、 T細胞数の低下、機能不全が認められる。さらに、細胞の放射線高感受性、 DNA 修復能や細胞周期監視機構にも欠陥が観察されている。
[0006] A-Tの原因遺伝子 (ATM)欠失マウスとテロメァーゼ遺伝子欠失マウスを掛け合わ せたマウスでは、テロメァの顕著な欠失が観察され、幹細胞のプールが減少すること が報告されている (非特許文献 7参照)。しかし幹細胞は、通常テロメァの短縮を防ぐ ためにテロメァーゼを発現して 、ることから、テロメァーゼ遺伝子を欠失して 、な！/、個 体における幹細胞の老化をテロメァの短縮で説明するのは困難である（非特許文献 8参照)。実際、幹細胞の老化と幹細胞のテロメァ長の間には相関がないことが観察 されている。
[0007] 一方、細胞老化のもう一つの仮説として"ストレス誘導老化"が提唱されて 、る。これ は分裂加齢のようにプログラムされた加齢とは異なり、細胞が長期間ストレスに暴露さ れる環境下にいると、これらストレスにより誘導される DNAの障害が蓄積し、細胞の老 化が起こるという仮説である（非特許文献 9参照)。細胞に対するストレスには、酸化ス トレス、紫外線、化学物質などが考えられている。線虫において、インスリン/ IGF-Iシ グナル経路の変異がフォークヘッド転写因子の活性ィ匕によりスーパーォキシドジスム ターゼ (SOD)などの抗酸化酵素の転写を促進し寿命を延ばすことが観察されて!、る ことから、酸化ストレスは特に加齢との関係で注目されている（非特許文献 10参照)。 細胞内で活性酸素が最も多く産生されるのはミトコンドリアの電子伝達系であり、ヒト などの哺乳類では、骨格筋や肝臓などが活性酸素の産生の中心を担うと考えられて いる。また慢性炎症に伴うマクロファージカもの継続的な活性酸素の暴露も、細胞の 老化を促進すると考えられている。これら活性酸素は細胞を老化に導くだけではなく 、 DNAの障害により癌遺伝子を活性ィ匕し幹細胞に老化の代わりに癌化を誘導すると 考えられている。しかし、骨髄の幹細胞では骨格筋や肝臓由来の活性酸素や炎症に 伴うマクロファージ由来の活性酸素に暴露される可能性は低ぐ "ストレス誘導老化" で幹細胞の老化を説明することは難し 、。
非特許文献 1 :「ジャーナル'ォブ'タリ-カル'インべスティゲイシヨン（Journal of Clinic al Investigation)」、 2004年、第 113卷、 p. 4— 7
非特許文献 2 :「ジャーナル'ォブ'タリ-カル'インべスティゲイシヨン（Journal of Clinic al Investigation)」、 2004年、第 113卷、 p. 16— 168
非特許文献 3 :「ジャーナル'ォブ'タリ-カル'インべスティゲイシヨン（Journal of Clinic al Investigation)」、 2004年、第 113卷、 p. 175— 179
非特許文献 4 :「ェタスペリメンタル'セル'リサーチ（Experimental Cell Research)」、 1 961年、第 25卷、 p. 585 - 621
非特許文献 5 :「ネイチヤー（Nature)」、 1990年、第 345卷、 p. 458— 460 非特許文献 6 :「ネイチヤ^ ~ ·レヴューズ 'キャンサ^ ~ ·ジャーナル（Nature Reviews Can cer Journal)」、 2003年、第 3卷、 p. 155— 168
非特許文献 7 :「ネイチヤー（Nature)」、 2003年、第 421卷、 p. 643— 648 非特許文献 8 :「ジャーナル'ォブ 'タリ-カル 'インべスティゲイシヨン（Journal of Clinic al Investigation)」、 2004年、第 113卷、 p. 4— 7
非特許文献 9 :「フイジォロジカル 'レヴューズ（Physiological Reviews)」、 2002年、第 82卷、 p. 47- 95
非特許文献 10 :「トレンド'イン'バイオケミカル 'サイェンシズ（Trend in Biochemical S ciences)」、 2002年、第 27卷、 p. 352— 360
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、幹細胞自己複製促進剤、癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患もしくは組 織不全の予防薬もしくは治療薬、該幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細胞 培養用培地、該培地で培養した幹細胞、幹細胞の製造方法または造血幹細胞自己 複製促進剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明は以下の（1)〜（32)に関する。 (1)幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消 去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導 する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効 成分として含有する幹細胞自己複製促進剤。
(2)幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消 去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導 する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、抗 酸化作用を有する物質である、上記（1)記載の幹細胞自己複製促進剤。
(3)抗酸ィ匕作用を有する物質力 ビタミン B12、ビタミン C、ビタミン E、カロテノイド、ュ ビキノン、システィンの N—ァシル誘導体、システィンを少なくとも一つ含むジペプチド またはトリペプチド、ポリフエノール類、クルクミン、およびテトラヒドロクルクミンカゝらなる 群力も選ばれる少なくとも一つの物質である、上記（2)記載の幹細胞自己複製促進 剤。
(4)幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消 去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導 する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該 幹細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強する 能力を有する物質である、上記（1)記載の幹細胞自己複製促進剤。
(5)抗酸化酵素が、カタラーゼ、ダルタチオンペルォキシダーゼ、ダルタチオンリダク ターゼおよびスーパーォキシドジスムターゼカもなる群力も選ばれる酵素である、上 記 (4)記載の幹細胞自己複製促進剤。
(6)抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強する能力 を有する物質が、該抗酸化酵素をコードする遺伝子を導入した遺伝子治療用べクタ 一である、上記 (4)または（5)に記載の幹細胞自己複製促進剤。
(7)抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強する能力 を有する物質カ ラトニンである、上記 (4)または（5)に記載の幹細胞自己複製促進 剤。
(8)幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消 去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導 する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該 幹細胞にァタキシァ 'テランジェクタシァ 'ミューティティッド（Ataxia telangiectasia mu tated、以下「ATM」という。）蛋白質の発現を誘導および Zまたは ATM蛋白質の活性 を増強する能力を有する物質である、上記（1)記載の幹細胞自己複製促進剤。
(9) ATM蛋白質の発現を誘導および Zまたは ATM蛋白質の活性を増強する能力を 有する物質が、 ATMを導入した遺伝子治療用ベクターである、上記（8)記載の幹細 胞自己複製促進剤。
(10)幹細胞内の活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性を有する 物質が P38MAPKの阻害剤である、上記（1)記載の幹細胞自己複製促進剤。
(11) ρ38ΜΑΡΚの阻害剤が SB203580、 SB202190, FR167653および BIRB796BSから なる群力も選ばれる少なくとも一つの物質である、上記（10)記載の幹細胞自己複製 促進剤。
(12)幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を 消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘 導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有 効成分として含有する癌の予防薬。
(13)幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を 消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘 導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有 効成分として含有する、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬
(14)幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を 消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘 導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質と、 グリコーゲンシンターゼキナーゼ— 3 (GSK-3)阻害剤、肝細胞増殖因子 (HGF)、顆 粒球コロニー刺激因子（G- CSF)、マクロファージコロニー刺激因子（M- CSF)および 顆粒球'マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)力もなる群より選ばれる少なくと も一つとを有効成分として含有する、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬 または治療薬。
(15)組織が、赤血球、白血球、血小板、繊維芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑 筋細胞、心筋細胞、ニューロン、グリア、オリゴデンドロサイト、血管内皮細胞、皮膚表 皮細胞、皮膚真皮細胞、毛胞細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、気管 上皮細胞、肺胞細胞、消化管上皮細胞、口腔上皮細胞、エナメル芽細胞、ゾゥゲ芽 細胞、肝細胞、クッパー細胞、胆嚢上皮細胞、脾臓内分泌細胞、脾臓外分泌細胞、 腎臓尿細管細胞、腎糸球体細胞、尿管上皮細胞、尿路上皮細胞、下垂体内分泌細 胞、甲状腺細胞、副腎皮質細胞、副腎髄質細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、視細胞、 色素上皮細胞、角膜細胞、涙腺細胞および鼓膜細胞力 なる群より選ばれる少なく とも 1種類の細胞を含む組織である、上記（13)または（14)に記載の予防薬または治 療薬。
(16)幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を 消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘 導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、 抗酸化作用を有する物質である、上記（12)〜（15)のいずれか 1項に記載の予防薬 または治療薬。
(17)抗酸化作用を有する物質が、ビタミン B12、ビタミン C、ビタミン E、カロテノイド、 ュビキノン、システィンの N—ァシル誘導体、システィンを少なくとも一つ含むジぺプ チドまたはトリペプチド、ポリフエノール類、クルクミン、およびテトラヒドロクルクミンから なる群力も選ばれる少なくとも一つの物質である、上記（16)に記載の予防薬または 治療薬。
(18)幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を 消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘 導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、 該幹細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強 する能力を有する物質である、上記（12)〜（15)のいずれか 1項に記載の予防薬ま たは治療薬。 (19)抗酸化酵素が、カタラーゼ、ダルタチオンペルォキシダーゼ、ダルタチオンリダ クターゼおよびスーパーォキシドジスムターゼカもなる群力 選ばれる酵素である、 上記（18)記載の予防薬または治療薬。
(20)抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強する能 力を有する物質が、該抗酸化酵素をコードする遺伝子を導入した遺伝子治療用べク ターである、上記（18)または（19)に記載の予防薬または治療薬。
(21)抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強する能 力を有する物質力 Sメラトニンである、上記（18)または（19)に記載の予防薬または治 療薬。
(22)幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を 消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘 導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、 該幹細胞に ATM蛋白質の発現を誘導および Zまたは ATM蛋白質の活性を増強す る能力を有する物質である、上記（12)〜（15)のいずれか 1項に記載の予防薬また は治療薬。
(23) ATM蛋白質の発現を誘導および Zまたは ATM蛋白質の活性を増強する能力 を有する物質が、 ATMを導入した遺伝子治療用ベクターである、上記（22)記載の予 防薬または治療薬。
(24)幹細胞内の活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性を有する 物質が P38MAPKの阻害剤である、上記（12)〜（15)のいずれ力 1項に記載の予防 薬または治療薬。
(25) p38MAPKの阻害剤が SB203580、 SB202190, FR167653および BIRB796BSから なる群力 選ばれる少なくとも一つの物質である、上記（24)記載の予防薬または治 療薬。
(26)上記（1)〜（11)のいずれか 1項に記載の幹細胞自己複製促進剤を添加してな る幹細胞培養用培地。
(27)上記（26)記載の培地で培養した幹細胞を含む組織破壊を伴う疾患または組 織不全の予防薬または治療薬。 (28)被験物質存在下または被験物質非存在下で、 ATMホモ欠失マウス由来の造血 幹細胞を含む細胞の自己複製能を測定し、被験物質存在下および被験物質非存在 下での該細胞の自己複製能を比較し、被験物質存在下での該自己複製能が被験 物質非存在下での該自己複製能よりも増強されて!、る物質を造血幹細胞自己複製 促進剤として選択することを特徴とする、造血幹細胞自己複製促進剤のスクリーニン グ方法。
(29)上記（1)〜（11)の 、ずれか 1項に記載の幹細胞自己複製促進剤の存在下、 幹細胞を培養して幹細胞の自己複製を促進させ、該培養物中から幹細胞を採取す ることを特徴とする、幹細胞の製造方法。
(30)幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を 消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘 導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を被 験体に投与する工程を包含する、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防または 治療方法。
(31)幹細胞自己複製促進剤の製造のための、幹細胞内において、活性酸素の産 生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素 を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活 性の少なくとも一つの活性を有する物質の使用。
(32)組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬の製造のための、 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去 することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導す る細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質の使用。 発明の効果
本発明により、幹細胞自己複製促進剤、癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患もしくは 組織不全の予防薬もしくは治療薬、該幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細 胞培養用培地、該培地で培養した幹細胞、幹細胞の製造方法または造血幹細胞自 己複製促進剤のスクリーニング方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態 [0011] 1.幹細胞自己複製促進剤
本発明の幹細胞自己複製促進剤は、幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制 する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少さ せる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少な くとも一つの活性を有する物質を有効成分として含有する。
[0012] 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制および Zまたは産生された活性酸素を 消去することにより活性酸素を減少させる活性を有する物質としては、抗酸化作用を 有する物質、幹細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活 性を増強する能力を有する物質、幹細胞にァタキシァ 'テランジェクタシァ 'ミューテ ィティッド（Ataxia telangiectasia mutated,以下「ATM」と 、う。）蛋白質の発現を誘導 および Zまたは ATM蛋白質の活性を増強する能力を有する物質等をあげることがで きる。
[0013] 抗酸化作用を有する物質としては、例えば、ビタミン B12、ビタミン C、ビタミン E、カロ テノイド、ュビキノン、システィンの N—ァシル誘導体、システィンを少なくとも一つ含 むジペプチドまたはトリペプチド、ポリフエノール類、クルクミン、テトラヒドロクルクミン 等をあげることができる。
ビタミン B12としては、例えば、塩酸ヒドロキソコバラミン、酢酸ヒドロキソコバラミン、ヒ ドロキソコバラミン、シァノコバラミン、メチルコバラミン、二トリトコノ ラミン、アデノシルコ ノ ラミン、アココバラミン等をあげることができる。
[0014] ビタミン Cとしては、例えば、 L—ァスコルビン酸、 L—ァスコルビン酸ナトリウム、 L— ァスコルビン酸ステアリン酸エステル等をあげることができる。
ビタミン Eとしては、例えば、 α—トコフェローノレ、 j8—トコフェローノレ、 γ—トコフエ口 一ノレ、 δ —トコフェローノレ、 α—トコトリエノーノレ、 j8—トコトリエノーノレ、 γ—トコトリエ ノールおよび δ—トコトリェノール、ならびにこれらの酢酸エステル、ニコチン酸エステ ルおよびリン酸エステル等の誘導体等をあげることができる。
[0015] カロテノイドとしては、天然物、合成品のいずれであってもよぐ例えば、 α—力ロテ ン、 /3一力口テン、 Ί一力口テン、ァスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチ ン、リコペン、クリプトキサンチン、クロシン、ロドキサンチン、ルティン等をあげることが できる。また、当該カロテノイドと脂肪酸等とのエステル、例えば、ォレイン酸、リノール 酸、ノルミチン酸、ミリスチン酸等とのモノエステルまたはジエステル等を用いることも できる。
[0016] ュビキノンとしては、ュビキノンの有するイソプレン残基数が 1〜12のものが好適に 用いられ、残基数が 6〜12のものがさらに好適に用いられ、残基数が 10のもの（ュビ デカレノン）が特に好適に用いられる。
システィンの N -ァシル誘導体としては、 N—ァセチルシスティンが好ましく用いられ る。
[0017] システィンを少なくともひとつ含むジペプチドまたはトリペプチドとしては、ダルタチ オンが好ましく用いられる。
ポリフエノール類としては、例えば、フラボノイド、タンニン、カフェ一酸、カフェ一酸 誘導体、リグナン類等をあげることができる。
フラボノイドとしては、例えば、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラ バン- 3-ォーノレ、カテキン、オーロン、アントシァニジン、力ノレコン、ジヒドロ力ノレコン等 があげられ、より具体的には、例えば、ケルセチン、ゲニスティン、ルチン、ヘスベリジ ン、シリマリン、（+)-カテキン、（-) -ェピガロカテキンガレート、（-) -ェピカテキン、（-) -ェ ピガロカテキン、（-) -ェピ力テキンガレート等をあげることができる。
カフェ一酸誘導体としては、例えば、 3,4-ジカフェオイルキナ酸、 3,5-ジカフェオイ ルキナ酸、 4,5-ジカフヱオイルキナ酸、 3,4,5-トリカフヱオイルキナ酸、クロロゲン酸、 ロズマリン酸等をあげることができる。
リグナン類としては、例えば、セサミン、セサモリン、セサモール、セサミノール、シザ ンドリン、デォキシシザンドリン、ゴミシン等をあげることができる。
上記の幹細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を 増強する能力を有する物質としては、例えば、メラトニン等をあげることができる。また 、該抗酸化酵素をコードする遺伝子を導入した遺伝子治療用ベクターを、幹細胞に 抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強する能力を有 する物質として用いることができる。
[0018] 抗酸化酵素としては、例えば、カタラーゼ、ダルタチオンペルォキシダーゼ、グルタ チオンリダクターゼ、スーパーォキシドジスムターゼ等をあげることができる。
遺伝子治療用ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスべ クタ一等をあげることができる。
[0019] レトロウイルスベクターは、 RNAウィルスであるマウス白血病ウィルス (MoMLV: Molo ney murine leukemia virus)をベクターとして利用するものである。 MoMLVが属する レトロウイルスゲノムの基本構造は、両端に存在する LTR (long terminal repeat)と、そ の間に挟まれる gag、 pol、 envおよび 5'側の LTRと gagの間の φ力らなる。レトロウイルス ベクターは、 Br. Med. Bull. 1995 Jan;51(l):12- 30. Vile RG, Russell SJ等に記載の方 法に従って、遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。すなわち、レトロウイ ルスベクターを作製するには、 gag、 pol、 envの遺伝子部分は不要であるため、まずそ の大部分を取り除き、代わりに上記の抗酸ィ匕酵素遺伝子のいずれか一つを挿入した ベクタープラスミドを構築する（ φ =パッケージングシグナル配列は残す)。次に該べク タープラスミドをウィルス蛋白（gag、 polの遺伝子産物）を発現するように作られたパッ ケージング細胞株に導入し、該細胞を培養することにより、培養上清中に組換えレト ロウィルス（レトロウイルスベクター）が産生される。該培養液中の組換えレトロウイルス は遠心分離により濃縮することができる。
[0020] 一方、アデノウイルスベクターは、レトロウイルスベクターとは異なる DNAウィルスで あるアデノウイルスに由来するベクターである。アデノウイルスベクターは、 Curr. Opin . Biotechnol. 1999 Oct;10(5):440- 7. Benihoud K, Yeh P, Perricaudet M.等に記載 の方法に従って、遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。すなわち、アデ ノウィルスを遺伝子治療用ベクターとして用いるためには、まず約 36kbの大きさの線 状二本鎖 DNAからなるウィルスゲノムのうち、 E1遺伝子領域を削除してそこに上記の 抗酸化酵素遺伝子の 、ずれか一つを挿入した形のコスミドを構築する。該コスミドを 、 E1遺伝子領域を複数箇所で切断した親ウィルス DNAと共に E1A、 E1Bを持続的に 発現して!/ヽるヒト胎児腎由来細胞株 (293細胞)に導入することにより、該細胞内で相同 組換えが起こり、非増殖性の組換えアデノウイルス (アデノウイルスベクター）が産生さ れる。この組換えアデノウイルスベクターは細胞の凍結融解により回収することができ る。 [0021] 上記の幹細胞に ATM蛋白質の発現を誘導および Zまたは ATM蛋白質の活性を増 強する能力を有する物質としては、例えば、 ATMを導入した遺伝子治療用ベクター をあげることができる。遺伝子治療用ベクターとしては、例えば、上記の遺伝子治療 用ベクター等をあげることができる。
[0022] 幹細胞内において、活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性を有 する物質としては、例えば P38MAPKの阻害剤等をあげることができる。活性酸素が誘 導する細胞内情報伝達系において、 P38MAPKは活性酸素による活性ィ匕を受け、そ の結果、幹細胞の自己複製は抑制される。従って、 p38MAPK阻害剤は、 p38MAPK の活性化を抑制することにより、該細胞内情報伝達系を抑制する結果、幹細胞の自 己複製を促進することができる。
[0023] p38MAPK阻害剤としては、 SB203580 (Journal of Biological Chemistry 272 (18) 121 16-12121, 1997)、 SB202190 (BIOMOL Research Labs., Inc.)ゝ PD169316(Calbioche m)、 FR167653(Nikken Chemical Co., Ltd.)ゝ BIRB796BS(Blood 101, 4446-4448, 200 3)等をあげることができる。また、 p38MAPKに対する small inhibitory RNA (siRNA)等 の P38MAPKの遺伝子発現の抑制剤を用いてもよ!、。
本発明の幹細胞自己複製促進剤は、 in vivoおよび in vitroにおいて、幹細胞と接触 させたとき、該幹細胞の自己複製を促進させることができる。
幹細胞としては、成体組織に存在する幹細胞 (成体幹細胞)であれば特に限定され ないが、骨髄、末梢血、皮膚、脂肪組織、骨格筋等に存在する幹細胞が好ましい。
[0024] 上記に記載した、幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生され た活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該 活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を 有する物質 (以下「本発明における物質」ともいう。）は、幹細胞自己複製促進剤とし て、そのまま単独で用いることも可能である力 通常は薬理学的に許容される一つま たはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野にお!、てよく知られる任意 の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
[0025] 投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましぐ例えば、経 口投与、または口腔内、気道内、直腸内、筋肉内、皮下、皮内もしくは静脈内等の非 経口投与等があげられ、好ましくは筋肉内、皮下、皮内、静脈内または気道内投与 等があげられる。
投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤、軟膏、テープ剤、 ドライパウダー、エアロゾル等の吸入剤等があげられる。
[0026] 錠剤等の固形製剤の製造には、例えば、乳糖等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、ステ アリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸 エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いることができる。
筋肉内、皮下、皮内、静脈内または気道内投与に適当な製剤としては、例えば、注 射剤、噴霧剤等があげられる。
[0027] 注射剤の製造にあたっては、例えば、水、生理食塩水、大豆油等の植物油、溶剤、 可溶化剤、等張化剤、保存剤、抗酸化剤等を用いることができる。
また、吸入剤は本発明における物質そのもの、または受容者の口腔及び気道粘膜 を刺激せず、かつ該物質を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体等 を用いて調製される。担体としては、例えば、乳糖、グリセリン等があげられる。本発 明における物質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製 剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した 成分を添加することもできる。
[0028] 投与量または投与回数は、目的とする予防または治療効果、投与方法、投与期間 、年齢、体重等により異なるが、通常成人 1日当たり、例えば、ビタミン B12は 20〜25m g、ビタミン Cは 200〜1000mg、ビタミン Eは 400〜800IU、カロテノイドは 5〜60mg、ュビ キノンは 30〜150mg、 N—ァセチルシスティンは 250〜1500mg、グルタチオンは 500〜 1000mg、ポリフエノール類は l〜1000mg、クルクミン、テトラヒドロクルクミンは 10〜100 0mg、 SB203580、 SB202190, PD169316、 FR167653、 BIRB796BSは 100〜1000 gを それぞれ投与するのが好ま 、。
[0029] 本発明の幹細胞自己複製促進剤は、 in vitroにお 、て幹細胞と接触させ、該幹細 胞を培養することにより、該幹細胞の自己複製を促進することができる。 in vitroで本 発明の幹細胞自己複製促進剤を用いる場合、本発明における物質を、該物質を溶 解することができる溶液に溶解して用いることが好ましい。該溶液としては、水、ジメチ ルスルホキシド（DMSO)等をあげることができる。
[0030] 幹細胞を分離できる組織としては、例えば、骨髄、末梢血、皮膚、脂肪組織、骨格 筋等があげられる。これらの組織から酵素処理等により分離した細胞から CD45陰性 、グリコホリン- A陰性細胞を選別し、 Low- GLUCOSE DMEM、 MCDB- 201等を基本 培地として、 10 μ g/mlインスリン、 5.5 μ g/mlトランスフェリン、 5ng/mlセレニウム、 0.5 μ g/ml牛血清アルブミン、 0.01 μ mol/1デキサメタゾン、 0.1mmol/l L—ァスコルビン酸 2 リン酸、 2%牛胎児血清、 lOng/ml血小板由来増殖因子、 lOng/ml上皮細胞増殖因子 、 lOng/mlインスリン様増殖因子、 1000IU白血病阻害因子および本発明の物質を含 む培地、または 10%の馬血清と本発明の物質を含む DMEM培地を用い、 5ng/mlのフ イブロネクチンでコートした培養皿の上で培養することにより、幹細胞の自己複製を効 率よく行うことができる。
[0031] 上記培養に用いる培地中の本発明における物質の濃度は、培養する細胞の密度 により調整することが必要である力 例えば、ビタミン B12、ビタミン C、ビタミン E、カロ テノイド、ュビキノン、 N—ァセチルシスティン、グルタチオン、ポリフエノール類、クル クミン、テトラヒドロクルクミン等でぁればl〜500 iu mol/l、 SB203580, SB202190, PD16 9316、 FR167653, BIRB796BS等であれば 50ηπιο1/1〜10 /ζ mol/1が好ましい。
[0032] in vitroで自己複製させた幹細胞を疾患の予防または治療に用いる場合、用いる機 器は完全閉鎖系で培養細胞の濃縮、洗浄、回収処理が可能なものがあげられ、へモ ネテイツタス社のへモライト 2プラス等を用いて培養細胞を生理食塩水により洗浄し、 培養に用 、たサイト力イン等の物質をできる限り除去できるものが好まし!/、。
[0033] 2.幹細胞自己複製促進活性の評価方法
本発明の幹細胞自己複製促進剤の幹細胞自己複製促進活性は、例えば以下の 方法により評価することができる。
[0034] すなわち、本発明の幹細胞自己複製促進剤を、幹細胞自己複製能低下非ヒト動物 に投与し、該非ヒト動物の幹細胞自己複製能を測定することにより、本発明の幹細胞 自己複製促進剤の幹細胞自己複製促進活性を評価することができる。幹細胞自己 複製能は、幹細胞自己複製能低下に伴う症状の低減を観察するか、該動物から分 離した幹細胞を、本発明の幹細胞自己複製促進剤の存在下で培養し、該幹細胞の コロニー形成能を測定すること等により、測定することができる。
[0035] 幹細胞自己複製能低下非ヒト動物としては、例えば、 ATMホモ欠失マウスを用いる ことができる。該マウスでは、造血幹細胞の細胞内活性酸素量の上昇により自己複 製能が低下する結果、ミエロイド系細胞、リンパ系細胞、エリスロイド系細胞等が顕著 に減少しており、造血幹細胞のコロニー形成能は著しく低下している。
[0036] 従って、幹細胞自己複製能低下非ヒト動物として ATMホモ欠失マウスを用いた場合 、本発明の幹細胞自己複製促進剤を該マウスに投与した後、フローサイトメトリー法 で上記貧血状態の低減を観察すること等により、本発明の幹細胞自己複製促進剤の 幹細胞自己複製促進活性を評価することができる。
[0037] また、該マウスから回収した骨随細胞や、該骨髄細胞力 FACSソーター等で分離 した c-Kit陽性、 Sca-1陽性および Lineage陰性細胞 (KSL細胞)等、造血幹細胞を含 む細胞を、本発明の幹細胞自己複製促進剤の存在下で培養し、メチルセルロース上 で形成される幹細胞のコロニー数を計測すること等により、本発明の幹細胞自己複 製促進剤の幹細胞自己複製促進活性を評価することができる。
[0038] また、被験物質存在下または被験物質非存在下で、 ATMホモ欠失マウス由来の造 血幹細胞を含む細胞の自己複製能を上記の方法で測定し、被験物質存在下および 被験物質非存在下での該細胞の自己複製能を比較し、被験物質存在下での該自 己複製能が被験物質非存在下での該自己複製能よりも増強されて!、る物質を造血 幹細胞自己複製促進剤として選択することにより、造血幹細胞自己複製促進剤をス クリーニングすることができる。
[0039] 3.癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬
本発明の幹細胞自己複製促進剤は幹細胞の老化を防ぐ作用があることから、加齢 に伴い発症頻度が高まる癌や組織破壊を伴う疾患の予防薬として利用することがで きる。
[0040] また、本発明の幹細胞自己複製促進剤は、傷害を受けた組織の幹細胞や骨髄幹 細胞の自己複製を促進することで組織修復を促進することから、組織破壊を伴う疾患 の治療薬として利用することができる。
組織破壊を伴う疾患としては、例えば、神経疾患、循環器系疾患、肝臓疾患、脾臓 疾患、消化管系疾患、腎臓疾患、皮膚疾患、肺疾患等があげられる。
[0041] 神経疾患としては、例えば、脳梗塞、脳血管障害、パーキンソン病、アルッノヽイマ 一病、ハンチントン舞踏病、脊髄損傷、うつ病、躁鬱病等があげられる。
循環器系疾患としては、例えば、閉塞性血管病、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患 等があげられる。
肝臓疾患としては、例えば、 B型肝炎、 C型肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変、肝不 全等があげられる。
[0042] 脾臓疾患としては、例えば、糖尿病、脾炎等があげられる。
消化管系疾患としては、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎等があげられる。
腎臓疾患としては、例えば、 IgA腎症、腎炎、腎不全等があげられる。
皮膚疾患としては、例えば、褥瘡、熱傷、縫合創、裂傷、切開創、咬傷、皮膚炎、肥 厚性瘢痕、ケロイド、糖尿病性潰瘍、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍等があげられる。 肺疾患としては、例えば、肺気腫、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線 維症、特発性間質性肺炎 (肺線維症)、びまん性肺線維症、結核、喘息等があげら れる。
[0043] また、本発明の幹細胞自己複製促進剤は、成体組織に存在する幹細胞に対して 広く自己複製を促進することから、様々な疾患に伴う組織不全の治療薬として用いる ことができる。すなわち、本発明の幹細胞自己複製促進剤は、組織不全が生じてい る組織に存在する幹細胞の自己複製を促進することにより、該組織を形成する細胞 の新生を促進し、該組織不全を治療することができる。
[0044] 組織不全を伴う疾患としては、例えば、骨髄不全、運動機能障害、循環器系疾患、 神経疾患、褥瘡、骨粗しょう症、関節炎、肺疾患、消化管系疾患、歯槽膿漏、肝臓疾 患、脾臓疾患、腎臓疾患、内分泌異常、網膜障害、白内障、難聴等をあげることがで きる。
[0045] 上記組織不全において、本発明の幹細胞自己複製促進剤により新生が促進される 細胞としては、例えば、骨髄不全では赤血球、白血球、血小板、運動機能障害では 繊維芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、循環器系疾患では心筋細胞、 血管内皮細胞、神経疾患では-ユーロン、グリア、オリゴデンドロサイト、褥瘡では皮 膚表皮細胞、皮膚真皮細胞、毛胞細胞、骨粗しょう症では骨細胞、骨芽細胞、破骨 細胞、関節炎では軟骨細胞、肺疾患では気管上皮細胞、肺胞細胞、消化管系疾患 では消化管上皮細胞、歯槽膿漏では口腔上皮細胞、エナメル芽細胞、ゾゥゲ芽細 胞、肝臓疾患では肝細胞、クッパー細胞、胆嚢上皮細胞、脾臓疾患では脾臓内分泌 細胞、脾臓外分泌細胞、腎臓疾患では腎臓尿細管細胞、腎糸球体細胞、尿管上皮 細胞、尿路上皮細胞、内分泌異常では下垂体内分泌細胞、甲状腺細胞、副腎皮質 細胞、副腎髄質細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、網膜障害では視細胞、色素上皮細 胞、白内障では角膜細胞、涙腺細胞、難聴では鼓膜細胞等をあげることができる。
[0046] 上記 1記載の方法により本発明の幹細胞自己複製促進剤を用いて in vitroで自己 複製させた幹細胞は、通常の点滴法で静脈中に注入するか、患部に直接注入する ことにより、上記各疾患の予防または治療に用いることができる。
[0047] 4.本発明の幹細胞自己複製促進剤と GSK- 3阻害剤、 HGF、 G- CSF、 M-CSF, GM- CSFとの併用
本発明の幹細胞自己複製促進剤は、幹細胞の増殖と分化を促進するグリコーゲン シンターゼキナーゼ— 3 (GSK-3)阻害剤および肝細胞増殖因子 (HGF)、ならびに幹 細胞の動員、増殖、分ィ匕を促進する顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)、マクロファ ージコロニー刺激因子（M-CSF)および顆粒球'マクロファージコロニー刺激因子（G M-CSF)からなる群より選ばれる一つ以上と併用することによって、上記 3記載の各種 疾患の予防または治療に対する効果を高めることができる。以下、 GSK-3阻害剤、 G - CSF、 M- CSFおよび GM- CSFを総称して「併用成分」と!、う。
[0048] GSK- 3阻害剤としては、 L803- mts (Biol Psychiatry. 2004 Apr 15; 55:781-4.)、 macr ocyclic bis- 7- azaindolylmaleimides (Bioorg Med Chem. 2004 Mar 1 2: 1239- 55)、 6- bromoindiruDin- 3'- oxime (Nat Med. 2004 Jan 0:55- 63.)、 1- azakenpaullone (Bioorg Med Chem Lett. 2004 Jan 19; 14:413- 6.)等があげられる。
[0049] G-CSFとしては、例えばナルトグラスチム（商品名ノィアップ、協和発酵工業製）、フ ィルグラスチム（商品名グラン、三共製;商品名 Granulokine、ホフマン 'ラ'ロシュ製； 商品名 NeUp。gen、アムジヱン製)、レノグラスチム (商品名ノィトロジン、中外製薬製； 商品名 Granocyte、アベンテイス製)、ぺグフィルグラスチム（商品名 Neulasta、アムジェ ン製）、サルグラモスチム（商品名 Leukine、シエーリング製)等があげられる。また、例 えば、 WO00/51626に記載の方法等で、これらのポリペプチドをポリエチレングリコー ル等で修飾 (PEG化）したもの等も用いることができる。
[0050] M-CSFとしては、例えば、ミリモスチム（商品名ロイコプロール、協和発酵工業製)等 があげられる。
GM-CSFとしては、例えば、ロムルチド (商品名ノピア注、第一製薬製)等があげら れる。
本発明の幹細胞自己複製促進剤と併用成分は、これらそれぞれの有効成分を含 有するように製剤化したものであれば、単剤 (合剤）としてでも複数の製剤の組み合わ せとしてもよい。製剤の調製方法、投与形態、投与方法等は、上記 1と同様にして行 うことができる。
[0051] 複数の製剤の組み合わせとして投与する際には、例えば (a)幹細胞自己複製促進 剤を含有する第一成分と、（b)併用成分を含有する第二成分とを、それぞれ製剤化 し、キットを作製し、このキットを用いてそれぞれの成分を同時にまたは時間をおいて 、同一対象に対して同一経路または異なった経路で投与することができる。
[0052] 該キットとしては、例えば、保存する際に外部の温度や光による内容物である成分 の変性、容器からの化学成分の溶出等がみられない容器であれば材質、形状等は 特に限定されない 2つ以上の容器 (例えばバイアル、バッグ等）と内容物からなり、内 容物である上記第一成分と第二成分が別々の経路 (例えばチューブ等)または同一 の経路を介して投与可能な形態を有するものが用いられる。具体的には、錠剤、注 射剤、吸入剤等のキットがあげられる。
[0053] 幹細胞自己複製促進剤と併用成分との好ま Uヽ用量比 (重量 Z重量）は、使用す る幹細胞自己複製促進剤と併用成分の組み合わせ、併用成分の効力等に応じて適 宜調整すればよいが、例えば、 lZ50000〜100Zl、好ましくは 1Ζ10000〜20Ζ ι、さらに好ましくは ΐΖΐοοο〜ιοΖΐの用量比で用いられる。
[0054] 幹細胞自己複製促進剤と併用成分との併用にお 、て、投与量または投与回数は、 目的とする予防または治療効果、投与方法、期間、年齢、体重等により異なるが、幹 細胞自己複製促進剤については上記 1記載の用量を、 GSK-3阻害剤については、 通常成人 1日当たり 0.1mgZkg〜100mgZkgを、 HGF、 G- CSF、 M- CSFまたは GM - CSFについては、通常成人 1日当たり 0.1 gZkg〜100 gZkgを投与するのが 好ましい。
[0055] 以下、試験例により、本発明の幹細胞自己複製促進剤の効果をより具体的に説明 する。
試験例 1 ATMホモ欠失マウス造血幹細胞における活性酸素量の上昇と自己複製 能の低下
(1) 8週齢の ATMホモ欠失マウス造血幹細胞の自己複製能の低下
ATMホモ欠失マウスは、聖ジユード小児研究病院（St. Jude Children' s Research H ospital)のピータ^ ~ ·マッキノン博士（Dr. Peter McKinnon)より入手した ATMヘテロ欠 失マウスの雌雄をつがわせることにより得た。対照として、同腹の野生型マウス (C57B L/6-Ly5.2)を用いた。
[0056] 8週齢の ATMホモ欠失マウスおよび野生型マウスを頸椎脱臼により致死させ、 70% エタノールで十分に消毒した後、ハサミとメスを用いて皮膚を切除し、下肢大腿骨お よび脛骨を取得した。ハサミで両端の骨端部を切除し、 PBS入りの注射器の針を骨髄 内に挿入し、十分量のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS)を流すことにより骨髄細胞を 回収した。
[0057] 回収した骨髄細胞力も FACSソーターと抗 c-Kit抗体（BD Parmingen社製、 2B8)、抗 Sea- 1抗体（BD Parmingen社製、 D7)、抗 CD4抗体（BD Parmingen社製、 L3T4)、 抗 C D8抗体（BD Parmingen社製、 53-6.72)、抗 B220抗体（BD Parmingen社製、 RA3-6B2 )、 抗 TER- 119抗体（BD Parmingen社製）、抗 Gr- 1抗体（BD Parmingen社製、 RB6- 8 C5)および抗 Mac- 1抗体（BD Parmingen社製、 M1/70)を用いて、 c- Kit陽性、 Sea- 1 陽性および Lineage陰性細胞（KSL細胞）、 Lineage陰性細胞ならびに Lineage陽性細 胞を分離した。それぞれの細胞からは全 RNAを抽出して cDNAを合成した。ここで、 Li neage陰性細胞とは、 T細胞のマーカーである CD4および CD8、 B細胞のマーカーで ある B220、赤血球のマーカーである TER-119、顆粒球のマーカーである Gr-1、なら びにマクロファージのマーカーである Mac-1のすべてについて陰性である細胞を意 味し、 Lineage陽性細胞とはこれらのマーカーのいずれか一つ以上が陽性である細 胞を意味する。
[0058] 野生型マウス由来の KSL細胞、 Lineage陰性細胞、 Lineage陽性細胞につ!、て、 AT M遺伝子の発現を RT-PCRで解析した結果、 ATM遺伝子の mRNAは、造血幹細胞が 濃縮されている KSL細胞で強く検出され、 Lineage陰性細胞ではほとんど検出されず 、また Lineage陽性細胞では全く検出されな力つた。この結果から、 ATMは造血幹細 胞で機能して 、ることが示唆された。
[0059] 次に、 ATMを欠失した造血幹細胞の骨髄再構築能を解析するために、競合的骨 髄再構築試験を行った。すなわち、野生型マウス (C57BL/6-Ly5.2)もしくは ATMホ モ欠失マウス (Ly5.2)の骨髄由来単核細胞 5 X 105個または KSL細胞 2,000個を、コン ペティターとなる C57BL/6- Ly5.1/5.2マウスまたは C57BL/6- Ly5.1マウスの骨髄由来 単核細胞 5 X 105個と一緒に、致死量の放射線を照射した C57BL/6-Ly5.1マウスに移 植した。移植 1ヶ月後および 4力月後に、 Ly5.2ドナー由来のミエロイド系およびリンパ 系細胞の割合を、抗 Ly5.2抗体（BD Parmingen社製）、抗 Ly5.1抗体（BD Parmingen 社製）、抗 CD3抗体（BD Parmingen社製）、抗 B220抗体、抗 Mac- 1抗体および抗 Gr- 1抗体で染色することにより、造血幹細胞の骨髄再構築能を解析した。
[0060] その結果、移植 1ヶ月後における骨髄再構築能は、 ATMホモ欠失マウス由来の細 胞と野生型マウス由来の細胞とでほとんど差は見られな力つた。一方、移植 4ヶ月後 では、 ATMホモ欠失マウス由来の細胞数は著しく低下した。また、この傾向は、未分 化な細胞集団である KSL細胞を移植した場合により顕著に観察された。また、このよう な骨髄再構築の不全は、 B細胞、 T細胞、ミエロイド系の 3つの系列全てにおいて観 察された。
[0061] 長期間に渡る骨髄の再構築には、造血幹細胞が造血前駆細胞を供給すると同時 に自己複製によって幹細胞自身を維持することが必要となる。上記の実験で、 ATM ホモ欠失マウス由来の細胞を移植した 4ヶ月後において、顕著な骨髄不全が観察さ れたことは、 ATM遺伝子の欠失により造血幹細胞の自己複製能が低下していること を示している。
[0062] (2) 24週齢の ATMホモ欠失マウス造血幹細胞の自己複製能の低下
ATM遺伝子の欠失による造血幹細胞の自己複製能の低下が、移植を介さない通 常の環境下でも起こることを明らかにするために、 24週齢の ATMホモ欠失マウスにお ける造血系構築能力につ!、て解析を行った。
[0063] ATMホモ欠失マウスは、 8週齢以降、高頻度でリンパ腫瘍を発症するが、一部のマ ウスではリンパ腫瘍を発症することなく長期生存する。このような長期生存した ATMホ モ欠失マウスを観察すると、野生型マウスとは異なり、 20週齢以降、高度の貧血を呈 することが明らかになった。
[0064] 24週齢において、ヘモグロビンとへマトクリットの量は、野生型マウスではそれぞれ、 15.3±0.94g/dl、 50.3 ±0.47%であるのに対して、 ATMホモ欠失マウスではそれぞれ、 9.93±0.37g/dl、 28.0 ± 1.41%であった。また、白血球と血小板の数は、野生型マウス ではそれぞれ、 10,833±213/ μ 1と 125.5± 18.9 X 104/ μ 1であるのに対して、 ATMホ モ欠失マウスではそれぞれ、 7,333 ±943 / μ 1と75.7±6.0 104/ μ 1であった。また、 A TMホモ欠失マウスの骨髄中の単核細胞の数は、野生型マウスの 36.9 ±2.0%まで減 少し、脂肪組織が増加していた。また、骨髄中の Mac-1陽性および Gr-1陽性のミエ口 イド系細胞、 B220陽性の B細胞、 Ter-119陽性のエリスロイド系細胞のいずれも力 A TMホモ欠失マウスで減少しており、中でもエリスロイド系細胞の減少が顕著であった
[0065] フローサイトメトリーの結果、 ATMホモ欠失マウスでは、野生型マウスと比較して、 KS L細胞画分中の c-Kitを高発現する細胞、すなわち造血幹細胞の数が顕著に減少し ていた。
以上の結果は、 24週齢の ATMホモ欠失マウスにおいて造血系構築能力が顕著に 低下していること、およびそれが造血幹細胞の自己複製能の低下に起因することを 示している。
[0066] (3) ATMホモ欠失マウス由来造血幹細胞における活性酸素量の上昇と pl6INK4a遺 伝子発現の上昇
ATM遺伝子が欠失することにより造血幹細胞の自己複製能が低下するメカニズム を明らかにするために、以下の実験を行った。
[0067] 8週齢の ATMホモ欠失マウスまたは野生型マウス力 上記（1)の方法により分離し た直後の KSL細胞を、 100ng/ml SCF(PeproTech EC社製)および 100ng/ml TPO(Pep roTech EC社製)の存在下、終濃度 5 μ mol/1の 2，- 7，- dichlorofluorescein diacetate ( DCF-DA、 Sigma社製）を添加し、 37°Cで 30分間インキュベートした後、 488nmの励起 光により発生する 525應の蛍光を測定することにより、細胞内の活性酸素量を測定し た。その結果、 ATMホモ欠失マウス由来の KSL細胞では、野生型マウス由来の KSL 細胞の約 15〜20倍に上昇していることが明らかになった。さらに、 SCFおよび TPOの 存在下で 2日間培養した後に細胞内の活性酸素量を測定した結果、 ATMホモ欠失 マウス由来の KSL細胞では、野生型マウス由来の KSL細胞の約 40〜50倍にも達した 。力かる培養に伴う KSL細胞の遺伝子発現の変化を RT-PCRで解析したところ、 pl6I NK4a遺伝子の顕著な発現上昇が観察された。
[0068] また、 pl6INK4a遺伝子の発現が in vivoでも変化していることを明らかにするために 、 24週齢の ATMホモ欠失マウスより分離した KSL細胞における該遺伝子の発現変化 を解析した結果、該遺伝子の発現が亢進していることが明ら力となった。
[0069] pl6INK4a遺伝子の発現上昇は、一般に細胞老化と関連することが知られている。
従って、上記の結果から、 ATM遺伝子が欠失することにより造血幹細胞の自己複製 能が低下するメカニズムとして、細胞内活性酸素量の上昇が pl6INK4a遺伝子の発現 上昇を介して自己複製能を低下させて ヽることが示唆された。
[0070] 試験例 2 ATMホモ欠失マウス造血幹細胞における自己複製能の低下の抗酸ィ匕 物質投与による回復
8週齢の ATMホモ欠失マウスおよび野生型マウス力 試験例 1記載の方法により分 離した KSL細胞 2,000個を、 OP9ストローマ細胞上で、 12.5%仔牛血清 (JRH Bioscience 社製)、 12.5%馬血清 (GIBCO BRL社製)および 10— 9 mol/1のデキサメタゾン (Sigma社製) を含む modified Eagles medium培地を用いて共培養を行った。培養開始 2週間後、 4 週間後、 6週間後に細胞を回収し、メチルセルロース上で、 20ng/ml SCF, 20ng/ml IL -3 (PeproTech EC社製)および 2U/mlエリスロポエチン (中外製薬社製)の存在下、コ 口-一形成試験を行った。
[0071] その結果、抗酸ィ匕物質を添加せずに 6週間培養した場合、 ATMホモ欠失マウス由 来の KSL細胞のコロニー形成能は、野生型マウス由来の KSL細胞のコロニー形成能 の 5%程度にまで低下した。一方、 100 mol/1の N—ァセチルシスティン（以下「NAC 」という。 ) (Sigma社製)または lOOU/mlのカタラーゼ (Sigma社製)を添加して 6週間培 養した場合には、 ATMホモ欠失マウス由来の KSL細胞のコロニー形成能は、野生型 マウス由来の KSL細胞のコロニー形成能の 60〜70%程度まで回復した。試験例 1記 載の方法により KSL細胞内の活性酸素量を測定した結果、 100 /z mol/1の NACを添カロ して培養した ATMホモ欠失マウス由来の KSL細胞内の活性酸素量は、野生型マウス 由来の KSL細胞内の活性酸素量と同程度にまで低下して 、た。
[0072] KSL細胞のコロニー形成には、 KSL細胞に含まれる造血幹細胞が自己複製すること が必要である。上記の結果は、 NACやカタラーゼの添カ卩により、造血幹細胞内の活 性酸素量が低下し、該幹細胞の自己複製能が回復したことを示している。
[0073] 次に、 ATMホモ欠失マウスに NACを 100 mg/kg/dayの用量で 3週間皮下投与し、該 マウスの骨髄から上記方法により分離した KSL細胞内の活性酸素の量を上記方法に より測定した結果、野生型マウス由来の KSL細胞内の活性酸素の量と同等であった。 また、 NACを投与した ATMホモ欠失マウス由来の KSL細胞を用い、試験例 1記載の 方法により競合的骨髄再構築試験を行った結果、 NACを投与して ヽな ヽ対照群とは 異なり、造血系の回復が観察された。さらに、 NACを投与した ATMホモ欠失マウス由 来の KSL細胞を移植したレシピエントマウスに対して、 NACを 100mg/kg/dayの用量で 皮下投与した結果、造血系は野生型マウスと同程度にまで回復した。また、再構築さ れた血液中には、 ATMホモ欠失マウス由来の B細胞、 T細胞、ミエロイド系細胞が観 察されたことから、 NAC投与により自己複製能を回復した造血幹細胞は、野生型マウ スの造血幹細胞と同等の分ィ匕能を有することが明らかとなった。
[0074] 上記の結果は、 NACの投与により、造血幹細胞内の活性酸素量が低下し、該幹細 胞の自己複製能が回復したことを示している。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
実施例 1
[0075] 注射剤（N-ァセチルシスティン）
常法により、次の組成からなる注射剤を調製する。
N-ァセチルシスティン 1 mg
曰局ポリソルベー卜 80 2.5 g 曰局乳糖 5 mg
日局生理食塩液 0.5 ml
実施例 2
[0076] 注射剤（N-ァセチルシスティンとナルトグラスチムの単剤）
常法により、次の組成からなる注射剤を調整する。
N-ァセチルシスティン 1 mg
ナノレトグラスチム 25 g
曰局ポリソルベー卜 80 2.5 g
曰局乳糖 5 mg
日局生理食塩液 0.5 ml
産業上の利用可能性
[0077] 本発明により、幹細胞自己複製促進剤、癌の予防薬、組織破壊を伴う疾患もしくは 組織不全の予防薬もしくは治療薬、該幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹細 胞培養用培地、該培地で培養した幹細胞、幹細胞の製造方法または造血幹細胞自 己複製促進剤のスクリーニング方法が提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去 することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導す る細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効成 分として含有する幹細胞自己複製促進剤。
[2] 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去 することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導す る細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、抗酸 化作用を有する物質である、請求項 1記載の幹細胞自己複製促進剤。
[3] 抗酸化作用を有する物質が、ビタミン B12、ビタミン C、ビタミン E、カロテノイド、ュビ キノン、システィンの N—ァシル誘導体、システィンを少なくとも一つ含むジペプチドま たはトリペプチド、ポリフエノール類、クルクミン、およびテトラヒドロクルクミン力もなる 群力も選ばれる少なくとも一つの物質である、請求項 2記載の幹細胞自己複製促進 剤。
[4] 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去 することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導す る細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該幹 細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強する能 力を有する物質である、請求項 1記載の幹細胞自己複製促進剤。
[5] 抗酸化酵素が、カタラーゼ、ダルタチオンペルォキシダーゼ、ダルタチオンリダクタ ーゼおよびスーパーォキシドジスムターゼカもなる群力も選ばれる酵素である、請求 項 4記載の幹細胞自己複製促進剤。
[6] 抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強する能力を 有する物質が、該抗酸化酵素をコードする遺伝子を導入した遺伝子治療用ベクター である、請求項 4または 5に記載の幹細胞自己複製促進剤。
[7] 抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強する能力を 有する物質カ ラトニンである、請求項 4または 5に記載の幹細胞自己複製促進剤。
[8] 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去 することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導す る細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該幹 糸田胞にァタキシァ ·テランジェクタシァ ·ミューティティッド（Ataxia telangiectasia mutat ed、以下「ATM」という。）蛋白質の発現を誘導および Zまたは ATM蛋白質の活性を 増強する能力を有する物質である、請求項 1記載の幹細胞自己複製促進剤。
[9] ATM蛋白質の発現を誘導および Zまたは ATM蛋白質の活性を増強する能力を有 する物質が、 ATMを導入した遺伝子治療用ベクターである、請求項 8記載の幹細胞 自己複製促進剤。
[10] 幹細胞内の活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性を有する物質 力 ¾38MAPKの阻害剤である、請求項 1記載の幹細胞自己複製促進剤。
[11] p38MAPKの阻害剤が SB203580、 SB202190, FR167653および BIRB796BSからなる 群力も選ばれる少なくとも一つの物質である、請求項 10記載の幹細胞自己複製促進 剤。
[12] 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去 することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導す る細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効成 分として含有する癌の予防薬。
[13] 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去 することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導す る細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を有効成 分として含有する、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬。
[14] 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去 することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導す る細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質と、グリコ 一ゲンシンターゼキナーゼー 3 (GSK-3)阻害剤、肝細胞増殖因子（HGF)、顆粒球コ 口-一刺激因子（G- CSF)、マクロファージコロニー刺激因子（M- CSF)および顆粒球 'マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF)からなる群より選ばれる少なくとも一つ とを有効成分として含有する、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または 治療薬。
[15] 組織が、赤血球、白血球、血小板、繊維芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋 細胞、心筋細胞、ニューロン、グリア、オリゴデンドロサイト、血管内皮細胞、皮膚表皮 細胞、皮膚真皮細胞、毛胞細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、気管上 皮細胞、肺胞細胞、消化管上皮細胞、口腔上皮、エナメル芽細胞、ゾゥゲ芽細胞、 肝細胞、クッパー細胞、胆嚢上皮細胞、脾臓内分泌細胞、脾臓外分泌細胞、腎臓尿 細管細胞、腎糸球体細胞、尿管上皮細胞、尿路上皮細胞、下垂体内分泌細胞、甲 状腺細胞、副腎皮質細胞、副腎髄質細胞、前立腺細胞、乳腺細胞、視細胞、色素 上皮細胞、角膜細胞、涙腺細胞および鼓膜細胞力 なる群より選ばれる少なくとも 1 種類の細胞を含む組織である、請求項 13または 14に記載の予防薬または治療薬。
[16] 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去 することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導す る細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、抗酸 化作用を有する物質である、請求項 12〜15のいずれか 1項に記載の予防薬または 治療薬。
[17] 抗酸化作用を有する物質が、ビタミン B12、ビタミン C、ビタミン E、カロテノイド、ュビ キノン、システィンの N—ァシル誘導体、システィンを少なくとも一つ含むジペプチドま たはトリペプチド、ポリフエノール、クルクミン、およびテトラヒドロクルクミン力もなる群 力も選ばれる少なくとも一つの物質である、請求項 16に記載の予防薬または治療薬
[18] 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去 することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導す る細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該幹 細胞に抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強する能 力を有する物質である、請求項 12〜15のいずれか 1項に記載の予防薬または治療 薬。
[19] 抗酸化酵素が、カタラーゼ、ダルタチオンペルォキシダーゼ、ダルタチオンリダクタ ーゼおよびスーパーォキシドジスムターゼカもなる群力も選ばれる酵素である、請求 項 18記載の予防薬または治療薬。
[20] 抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強する能力を 有する物質が、該抗酸化酵素をコードする遺伝子を導入した遺伝子治療用ベクター である、請求項 18または 19に記載の予防薬または治療薬。
[21] 抗酸化酵素の発現を誘導および Zまたは該抗酸化酵素の活性を増強する能力を 有する物質カ ラトニンである、請求項 18または 19に記載の予防薬または治療薬。
[22] 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去 することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導す る細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質が、該幹 細胞に ATM蛋白質の発現を誘導および Zまたは ATM蛋白質の活性を増強する能 力を有する物質である、請求項 12〜15のいずれか 1項に記載の予防薬または治療 薬。
[23] ATM蛋白質の発現を誘導および Zまたは ATM蛋白質の活性を増強する能力を有 する物質が、 ATMを導入した遺伝子治療用ベクターである、請求項 22記載の予防 薬または治療薬。
[24] 幹細胞内の活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性を有する物質 力 ¾38MAPKの阻害剤である、請求項 12〜15のいずれ力 1項に記載の予防薬または 治療薬。
[25] p38MAPKの阻害剤が SB203580、 SB202190, FR167653および BIRB796BSからなる 群力も選ばれる少なくとも一つの物質である、請求項 24記載の予防薬または治療薬
[26] 請求項 1〜11のいずれか 1項に記載の幹細胞自己複製促進剤を添加してなる幹 細胞培養用培地。
[27] 請求項 26記載の培地で培養した幹細胞を含む組織破壊を伴う疾患または組織不 全の予防薬または治療薬。
[28] 被験物質存在下または被験物質非存在下で、 ATMホモ欠失マウス由来の造血幹 細胞を含む細胞の自己複製能を測定し、被験物質存在下および被験物質非存在下 での該細胞の自己複製能を比較し、被験物質存在下での該自己複製能が被験物 質非存在下での該自己複製能よりも増強されて！、る物質を造血幹細胞自己複製促 進剤として選択することを特徴とする、造血幹細胞自己複製促進剤のスクリーニング 方法。
[29] 請求項 1〜11のいずれか 1項に記載の幹細胞自己複製促進剤の存在下、幹細胞を 培養して幹細胞の自己複製を促進させ、該培養物中から幹細胞を採取することを特 徴とする、幹細胞の製造方法。
[30] 幹細胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去 することにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導す る細胞内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質を被験体 に投与する工程を包含する、組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防または治療 方法。
[31] 幹細胞自己複製促進剤の製造のための、幹細胞内において、活性酸素の産生を 抑制する活性、産生された活性酸素を消去することにより幹細胞内の活性酸素を減 少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞内情報伝達系を抑制する活性の 少なくとも一つの活性を有する物質の使用。
[32] 組織破壊を伴う疾患または組織不全の予防薬または治療薬の製造のための、幹細 胞内において、活性酸素の産生を抑制する活性、産生された活性酸素を消去するこ とにより幹細胞内の活性酸素を減少させる活性、および該活性酸素が誘導する細胞 内情報伝達系を抑制する活性の少なくとも一つの活性を有する物質の使用。
PCT/JP2005/010642 2004-06-10 2005-06-10 幹細胞自己複製促進剤 WO2005121320A1 (ja)

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