KR20190092348A - 미토콘드리아를 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

미토콘드리아를 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이며, 보다 상세하게는 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 이를 통해, 본 발명에 따른 조성물은 허혈성 질환이 발생한 환부에 직접적으로 정상적인 활성을 갖는 외래 미토콘드리아를 공급할 수 있어, 미토콘드리아 기능이 저하된 세포의 활성을 증가시키거나 미토콘드리아 기능 이상 세포 재생에 유용하며, 미토콘드리아 이상 허혈성 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.

Description

미토콘드리아를 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING ISCHEMIC DISEASES COMPRISING MITOCHONDRIA}
본 발명은 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이며, 보다 상세하게는 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
미토콘드리아는 에너지 공급원으로서 아데노신 트라이포스페이트(adenosine triphosphate: ATP) 합성 및 조절에 관여하는 진핵 세포의 생존에 필수적인 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다.
따라서, 미토콘드리아가 손상되면 다양한 질병이 유발될 수 있는데, 대부분의 공지된 미토콘드리아 장애는 미토콘드리아 DNA에서 발생하는 유전성 또는 후천성 돌연변이에 기인한다. 예를 들어, 미토콘드리아 막전위 이상으로 인한 팽윤, 활성산소종, 또는 자유라디칼 등에 의한 산화적 스트레스, 그리고 미토콘드리아의 에너지 생성을 위한 산화적 인산화 기능의 결함 등에 의해 미토콘드리아의 기능이 변형될 수 있다.
구체적으로, 미토콘드리아의 기능이상은 다발성경화증, 뇌척수염, 뇌신경근염, 말초신경변증, 라이증후군, 알퍼증후군, MELAS, 편두통, 정신병, 우울증, 발작과 치매, 중풍성 에피소드, 시신경위축, 시신경병증, 망막색소변성, 백내장, 고알도스테론혈증, 부갑상선기능저하증, 근위축증, 미오글로빈뇨, 근육긴장저해, 근육통, 운동내성저하, 세뇨관증, 신부전, 간부전, 간기능부전, 간비대, 철적혈구빈혈, 호중성백혈구 감소증, 저혈소판증, 설사, 융모위축, 다발성구토, 연하곤란, 변비, 감각신경난청, 허혈성 질환, 정신지체, 간질, 알츠하이머, 파킨슨, 헌팅턴 질환 등의 다양한 질병에 직접 또는 간접적인 원인이 되는 것으로 알려져 있다.
한편, 허혈성 질환은 혈류의 공급 감소로 인해 조직을 구성하는 세포의 비가역적인 손상이 발생된 것으로, 허혈 연쇄반응(ischemic cascade)이라 불리는 과정들이 촉발되어 뇌, 심장 또는 말초 조직이 영구적으로 기능을 상실하는 질병이다. 허혈성 질환은 예를 들어, 중증하지허혈증, 심근경색, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 대장염 등이 있다.
특히, 미토콘드리아 기능 장애로 인해 증가된 활성산소(수퍼옥사이드, 퍼옥시나이트라이트, 하이드록시 라디칼, 과산화수 등)는 과산화지방질(lipid peroxidation)을 유발하는데, 이는 허혈성 질환에서 나타나는 세포 손상의 주 요인으로 알려져 있다.
이러한 미토콘드리아 질환을 치료하기 위하여, 미토콘드리아를 보호하거나 미토콘드리아의 기능장애를 회복하는데 사용될 수 있는 물질 또는 이러한 물질을 효율적으로 표적에 전달할 수 있는 방법 등에 대한 연구가 지속되고 있으나, 치료범위가 다소 제한적이거나 부작용이 발생하는 문제가 있는 등 아직은 획기적인 치료법이 개발되지 않은 실정이다.
본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 외래 세포로부터 분리된 미토콘드리아가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 미토콘드리아 기능장애에 기인한 세포 이상이 발병된 환부에 정상 미토콘드리아 또는 정상 미토콘드리아를 포함하는 세포를 환부에 투여함으로써, 허혈성 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여,
본 발명의 일 측면에 따르면 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 외래 미토콘드리아가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 동물의 환부에 직접 주사 방식으로 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 외래 미토콘드리아 또는 외래 미토콘드리아를 포함하는 세포를 포함함으로써, 이를 투여 받는 세포의 미토콘드리아 활성을 향상시킬 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 조성물은 미토콘드리아 기능저하와 관련하여 발병하는 허혈성 질환에 대한 근본적인 예방 및 치료의 목적으로 유효하게 적용될 수 있다.
도 1은 대상세포의 미토콘드리아와 공여세포의 미토콘드리아를 공초점 주사 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 2는 중증하지허혈질환 동물에 대한 치료 효과를 육안적으로 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 3 및 도 4는 중증하지허혈질환 동물에 대한 치료 효과를 혈류량을 통해 평가한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다.
본 발명의 일 측면은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한,　"유효성분"은　단독으로 활성을 나타내거나 또는 그 자체로는 활성이 없는 보조제(담체)와 함께 활성을 나타내는 성분을 지칭한다.
상기 미토콘드리아는 포유동물로부터 수득된 것일 수 있으며, 인간으로부터 수득된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 세포 또는 세포 배양액으로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 미토콘드리아는 포유동물 또는 인간으로부터 유래한 체세포, 생식세포, 줄기세포 또는 이들의 조합으로부터 수득된 것일 수 있고, 구체적으로, 근육세포, 간세포, 섬유아세포, 상피세포, 신경세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구 또는 점막세포로부터 수득된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 정상인 세포로부터 수득된 정상적인 미토콘드리아일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 체외에서 배양된 것일 수 있다.
한편, 상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 분리할 수 있다.
상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 세포를 파쇄하고원심분리를 하여 수행할 수 있다. 일 구체예로, 세포를 배양하고, 이러한 세포를 포함하는 조성물을 제1차 원심분리하여 펠렛을 생성하는 단계, 상기 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시키고, 균질화하는 단계, 상기 균질화된 용액을 제2차 원심분리하여 상청액을 제조하는 단계 및 상기 상청액을 제3차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간은 제1차 및 제3차 원심분리가 수행되는 시간보다 짧도록 조절되는 것이 세포 활성 유지 면에서 바람직하며, 제1차 원심분리에서 제3차 원심분리로 갈수록 속도를 높일 수 있다.
구체적으로, 상기 제1차 내지 제3차 원심분리는 0 내지 10℃의 온도, 바람직하게는 3 내지 5℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 원심분리가 수행되는 시간은 1 내지 50분 동안 수행될 수 있으며, 원심분리 횟수 및 샘플의 함량 등에 따라 적절히 조정될 수 있다.
아울러, 상기 제1차 원심분리는 100 내지 1,000×g, 또는 200 내지 700×g, 또는 300 내지 450×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2차 원심분리는 1 내지 2,000×g, 또는 25 내지 1,800×g, 또는 500 내지 1,600×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제3차 원심분리는 100 내지 20,000×g, 또는 500 내지 18,000×g, 또는 800 내지 15,000×g의 속도로 수행될 수 있다.
또한, 상기 미토콘드리아는 세포를 배양한 후 얻어진 배양액 내에서 수득할 수 있다. 이러한 배양액에는 세포가 분비한 사이토카인, 케모카인, 엑소좀 및 미세소포체 등과 미토콘드리아가 포함될 수 있다. 일 구체예로, 상기 미토콘드리아 분리는 세포를 배양하고, 얻어진 배양액을 포함하는 조성물을 제1차 원심분리하여 세포잔해 등을 제거하고 상청액을 수득하는 단계, 상기 상청액을 제2차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 제1차 원심분리는 0 내지 10℃의 온도, 바람직하게는 3 내지 5℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한 상기 원심분리가 수행되는 시간은 5 내지 30분 동안 수행될 수 있으며, 원심분리 횟수 및 샘플의 함량에 따라 적절히 조정될 수 있다.
아울러, 상기 제1차 원심분리는 500 내지 5,000×g, 700 내지 4,000×g, 1,000 내지 3,000×g, 또는 1,500 내지 2,500×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2차 원심분리는 5,000 내지 40,000×g, 10,000 내지 30,000×g, 또는 15,000 내지 25,000×g의 속도로 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물이 유효하게 적용될 수 있는 허혈성 질환은 혈류의 공급 감소로 인해 조직을 구성하는 세포의 비가역적인 손상이 발생된 것으로, 허혈 연쇄반응(ischemic cascade)이라 불리는 과정들이 촉발되어 뇌, 심장 또는 말초 조직이 영구적으로 기능을 상실하는 질병이다. 예를 들어, 상기 허혈성 질환은, 중증하지허혈증, 허혈성 뇌졸중, 허혈성 심장질환 또는 허혈성 대장염 등 일 수 있다. 이때, 상기 허혈성 질환은 미토콘드리아 이상에 의해 발병하는 질환일 수 있으며, 미토콘드리아 기능 저하로 인해 발생하는 허혈성 세포 장애를 모두 포함한다.
즉, 본 발명의 조성물은 세포 활성이 유지되는 미토콘드리아를 유효성분으로 포함함으로써, 상기 조성물이 적용되는 세포의 미토콘드리아 활성을 향상시켜 미토콘드리아성 병증이 개선될 수 있다.
또한, 상기 조성물에 대하여, 상기 미토콘드리아는 0.1 내지 500 ㎍/ml, 0.1 내지 200 ㎍/ml 또는 0.2 내지 10 ㎍/ml 의 농도로 포함될 수 있다. 상기 범위로 미토콘드리아를 포함함으로써, 투여 시 미토콘드리아 용량 조절이 용이하고, 환부의 허혈성 병증 개선 정도가 보다 향상될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 외래 미토콘드리아가 도입된 세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 여기서, 외래 미토콘드리아란 상기 미토콘드리아가 도입되는 세포를 제외한 별개의 정상세포로부터 유래된 미토콘드리아를 지칭한다. 상기 외래 미토콘드리아와 이를 분리하는 방법에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
또한, 상기 세포는 외래 미토콘드리아를 세포질 내에 포함하고 있는 세포로서, 세포 활성이 유지되는 정상세포일 수 있다. 또한, 상기 세포는 체세포, 생식세포, 줄기세포 또는 이들의 조합인 것이 바람직하다. 이때, 상기 세포는 분리된 세포이거나 분리된 세포를 추가적으로 배양하여 수득한 세포일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 태반, 탯줄에서 수득하거나, 지방 등 조직에서 수득한 세포일 수 있으며, 역분화를 유도하여 제조한 iPSC일 수 있다.
또한, 상기 외래 미토콘드리아가 도입된 세포와 상기 외래 미토콘드리아를 제공한 세포는 동종 세포 또는 이종 세포일 수 있다. 또한, 상기 외래 미토콘드리아가 도입된 세포와 상기 외래 미토콘드리아를 제공한 세포는 동일한 개체 또는 다른 개체로부터 수득된 것일 수 있다.
또한, 상기 조성물에 포함되는 세포는, 105개 세포당 0.1 내지 500 ㎍, 0.2 내지 450 ㎍ 또는 1 내지 300 ㎍의 미토콘드리아가 도입된 것일 수 있으며, 상기 조성물은 이와 같은 함량으로 외래 미토콘드리아가 전달된 세포를 포함함으로써 투여 시 허혈성 병증 환부의 세포 기능이 개선될 수 있다.
한편, 상기 외래 미토콘드리아와 이를 전달받을 세포가 혼합된 조성물을 원심분리하여, 상기 외래 미토콘드리아를 세포 내로 삽입시킬 수 있다. 또한, 상기 원심분리는 0 내지 40℃, 20 내지 38℃, 또는 30 내지 37℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 0.5 내지 20분, 1 내지 15분, 또는 3 내지 7분 동안 수행될 수 있다. 또한, 1 내지 2,400×g, 25 내지 1,800×g, 또는 200 내지 700×g으로 수행될 수 있다.
상기 조건으로 세포와 외래 미토콘드리아에 함께 원심력을 가해줌으로써, 세포에 다른 손상이 발생하지 않으면서도 높은 효율로 외래 미토콘드리아를 세포로 주입할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 하단으로 갈수록 점진적으로 직경이 좁아지는 시험관 내에서 원심분리되는 것이 세포와 미토콘드리아에 가해지는 유효 원심력 및 접촉 효율 측면에서 보다 효율적이다. 상기 원심분리는 동일한 조건으로 1회 내지 3회 추가로 수행될 수 있다.
아울러, 상기 원심분리를 수행하기 전에, 상기 조성물을 인큐베이션을 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 인큐베이션은 0 내지 40℃, 20 내지 38℃, 또는 30 내지 37℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 0.1 내지 4시간, 0.5 내지 3.8시간 또는 0.8 내지 3.5시간 동안 수행될 수 있다. 또한, 인큐베이션은 세포에 미토콘드리아가 전달된 후에 소정의 시간 동안 수행될 수 있다. 또한, 인큐베이션 시간은 세포의 종류 및 미토콘드리아의 양에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한, 상기 조성물에 계면활성제를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 계면활성제는 세포의 세포막 투과성을 증진시키기 위해 사용되며, 첨가 시점은 세포와 미토콘드리아를 혼합하기 전, 혼합시점 또는 혼합 후에 첨가될 수 있다. 또한, 계면활성제를 세포에 첨가한 후 세포의 세포막 투과성을 높이기 위해 일정 시간 세포를 방치할 수 있다.
구체적으로, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제인 것이 바람직하며, 폴록사머(poloxamers) 즉, 폴리옥시에틸렌의 두 개의 친수성 사슬에 의해 옆으로 배치된 폴리옥시프로필렌의 중심 소수성 사슬로 구성된 삼블록 공중합체일 수 있다. 또한, 상기 조성물에서 계면활성제의 농도는 1 내지 100 mg/ml, 3 내지 80 mg/ml 또는 5 내지 40 mg/ml 일 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 30 mg/ml이다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 미토콘드리아성 허혈성 질환 또는 질병에 걸릴 수 있거나, 그러한 질환 또는 질병을 앓고 있는 인간 또는 다른 포유동물에 대하여 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 환부에 직접적으로 투여될 수 있는 주사제일 수 있고, 바람직하게는 주사용 제제일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 조성물은 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여, 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써, 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 조성물은 주사용수를 포함할 수 있다. 상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수로서, 글루코스 주사, 자일리톨 주사, D-만니톨 주사, 프룩토스 주사, 생리식염수, 덱스트란 40 주사, 덱스트란 70 주사, 아미노산 주사, 링거액, 락트산-링거액 또는 pH 3.5~7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨-구연산 완충용액 등 일 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 안정화제 또는 용해보조제를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 안정화제는 나트륨 피로설파이트(sodium pyrosulfite) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)일 수 있고, 용해보조제는 염산, 아세트산, 수산화나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨 또는 수산화칼륨일 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 조성물을 개체의 환부에 직접 주사 방식으로 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다. 여기서 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
이를 통해, 본 발명에 따른 조성물은 허혈성 질환이 발생한 환부에 직접적으로 정상적인 활성을 갖는 외래 미토콘드리아를 공급할 수 있어, 미토콘드리아 기능이 저하된 세포의 활성을 증가시키거나 미토콘드리아 기능 이상 세포 재생에 유용하며, 미토콘드리아 이상 허혈성 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
비교예 : 태반 유래 중간엽줄기세포를 포함하는 조성물의 제조
태반(분당차병원으로부터 제공받음, IRB No, 1044308-201511-BR-022-02) 유래 중간엽줄기세포를 10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco), 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 100 U/ml 암피실린을 함유하는 Alpha-MEM (Alpha-Minimum Essential Medium)배지에 접종하고 72시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline, Gibco)를 이용하여 2회 세척하였다. 세척된 세포는 0.25% Trypsin-EDTA (TE, Gibco)를 처리하여 세포를 획득하였다.
이렇게 획득한 세포는 다시 DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline, Gibco)를 이용하여 2회 세척한 뒤, 1 x 105, 1 x 106, 5 x 106개의 양으로 각각 주사용수 100 ㎕와 혼합한 뒤 인슐린 주사기에 충진 하였다.
실시예 1: 미토콘드리아를 포함하는 조성물의 제조
태반(분당차병원으로부터 제공받음, IRB No, 1044308-201511-BR-022-02) 유래 중간엽줄기세포를 10% 우태혈청 (Fetal bovine serum, FBS, Gibco), 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 100 U/ml 암피실린을 함유하는 Alpha-MEM (Alpha-Minimum Essential Medium)배지에 접종하고 72시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline, Gibco)를 이용하여 2회 세척하였다. 세척된 세포는 0.25% Trypsin-EDTA (TE, Gibco)를 처리하여 세포를 획득하였다.
획득한 세포는 미토콘드리아를 추출하기 위하여, 혈구계산기를 이용 하여 세포수를 측정하여 3×106 cells/ml 정도의 세포를 회수하였다. 이후, 상기 세포주를 약 4℃의 온도에서 10분 동안 350×g의 속도로 제1차 원심분리를 수행하였고, 이 때 얻어진 펠렛을 회수하여 버퍼 용액에 재현탁시켜 10 내지 15분 동안 균질화시켰다. 상기 펠렛을 포함하는 조성물을 약 4℃의 온도에서 3분 동안 1,100×g의 속도로 제2차 원심분리시켜 상청액을 수득하였다. 이후, 상기 상청액을 약 4℃의 온도에서 15분 동안 12,000×g의 속도로 제3차 원심분리시켜 세포주로부터 미토콘드리아를 분리하였다.
이렇게 얻어진 미토콘드리아를 각각 0.2, 2, 10 ㎍의 양으로 각각 주사용수 100 ㎕와 혼합한 뒤 인슐린 주사기에 충진 하였다.
실시예 2: 미토콘드리아가 전달된 세포를 포함하는 조성물의 제조
실시예 1의 방법에 따라 태반 유래 중간엽줄기세포로(공여세포)부터 추출된 미토콘드리아를, 별도의 태반 유래 중간엽줄기세포(대상세포)가 각각 1 x 105, 1 x 106, 5 x 106의 양으로 포함된 3개의 시험관에 주입하고, 약 4℃의 온도에서, 15 분 동안 1,500×g의 속도로 원심 분리하였다. 상등액을 제거하고 PBS로 세척하고 약 4℃의 온도에서, 5 분 동안 원심분리 하였다. 같은 조건으로 세척은 2회 수행하였다. 이때, 분리된 미토콘드리아는 각각 대상세포 1 x 105, 1 x 106, 5 x 106개당 2 ㎍의 중량으로 전달되었다.
이렇게 얻어진 미토콘드리아가 전달된 세포는 각각 1 x 105, 1 x 106, 5 x 106의 양으로 각각 주사용수 100 ㎕와 혼합하여 인슐린 주사기에 충진하였다.
실험예 1: 외래 미토콘드리아 전달 확인
실시예 2에서 외래 미토콘드리아가 세포로 전달된 것을 확인하기 위하여, 공여세포의 미토콘드리아와 대상세포의 미토콘드리아를 구분하기 위해 공여세포의 미토콘드리아는 녹색의 형광(Mitotracker green)으로 표지하고, 대상세포의 미토콘드리아는 빨간색의 형광(Mitotracker red)으로 각각 표지하였다. 형광이 표지된 세포는 핵을 염색하는 DAPI가 포함된 고정액을 이용하여 슬라이드에 고정하고 공초점 주사 현미경(Zeiss LSM 880 Confocal microscope)을 이용하여 촬영하였고, 이를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아가 전달된 세포에는 노랑색을 띄는 부분이 관찰되었다. 이는 빨간색으로 발광되는 대상세포 미토콘드리아와 녹색으로 발광되는 공여세포 미토콘드리아가 공존함으로써 발광되는 색이 융합(merge)된 것으로, 이를 통해 대상세포의 미토콘드리아에 공여세포의 미토콘드리아가 전달된 것을 확인하였다.
실험예 2: 육안을 통한 중증하지허혈질환 치료 평가 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio Co., Ltd., Seoul, Korea)로부터 5주 내지 6주령의 수컷 Balb/c nude 마우스를 구입하였다. 구입한 마우스는 차의과학대학교 실험동물센터의 청정구역에서 적응기간을 거친 후 실험을 진행하였다. 적응기간 동안 마우스가 지내는 환경은 12시간 간격으로 낮과 밤이 조성되고, 23 ± 2℃의 실내 온도 및 40 내지 60%의 습도가 유지되었다. 이러한 적응기간을 7일 거친 후 실험에 투입되었다.
이렇게 준비된 마우스의 하지 부분을 외과적 수술을 통해 동맥혈관을 결찰하여 중증하지허혈질환을 유발하였다. 이때, 외과적 수술이 진행된 대퇴부 부위에 상기 비교예, 실시예 1 및 실시예 2에 따른 조성물을 100 ㎕를 근육내주사(IM, Intramuscular injection)방식으로 투여하여 실험군 1 내지 9를 제작하였다(하기 표 1 참조).
실험군1 실험군2 실험군3 실험군4 실험군5 실험군6 실험군7 실험군8 실험군9
투여된 조성물 비교예
(MSC)		 비교예
(MSC)		 비교예
(MSC)		 실시예1
(MT)		 실시예1
(MT)		 실시예1
(MT)		 실시예2
(2 ㎍ MT 전달된 MSC)		 실시예2
(2 ㎍ MT 전달된 MSC)		 실시예2
(2 ㎍ MT 전달된 MSC)
투여량 1 x 105 1 x 106 5 x 106 0.2 ㎍ 2 ㎍ 10 ㎍ 1 x 105 1 x 106 5 x 106
또한, 주사 투여나 외과적 수술을 처리하지 않은 정상 마우스로 정상 대조군(대조군 1)을 제작하였다. 또한, 주사용수 100 ㎕를 근육내주사(IM, Intramuscular injection)방식으로 투여한 것을 제외하고는 실험군 1과 동일한 방법으로 대조군 1을 제작하였다. 7일 후 육안적 증상을 평가하기 위해, 실험군 1 내지 9 및 대조군 1, 2에 대하여, 하지절단(Limb loss), 족부괴사(Foot necrosis) 및 하지회복(Limb salvage)으로 구분하여 치료의 효과를 평가하여 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 대조군 1의 정상 마우스에는 어떠한 병증도 나타나지 않았으나, 생리식염수를 투여한 대조군 2의 마우스는 하지 손상이 90%이상 진행되었다. 또한, 태반 유래 중간엽줄기세포를 투여한 실험군 1, 2, 3에서는 40% 이상 하지회복과 50% 이상 하지절단이 발생된 것을 알 수 있다. 이와 달리, 미토콘드리아를 투여한 실험군 4, 5, 6의 마우스에서는 60 내지 100% 하지회복과 20% 미만의 하지절단이 발생된 것을 알 수 있다. 또한, 미토콘드리아가 전달된 세포를 투여한 실험군 8, 9의 마우스에서는 하지절단이 발생하지 않았으며, 실험군 7의 마우스에서만 50%의 하지절단이 발생된 것을 알 수 있다.
즉, 상기 결과를 통해, 본원발명에 따른 미토콘드리아 함유 조성물 또는 미토콘드리아가 전달된 세포 함유 조성물을 투여하는 경우, 중증하지허혈증상의 개선 및 치료 효과가 있고, 특히 일반적으로 분리된 줄기세포만을 투여하는 경우에 비해서 치료 효과가 보다 우수한 것을 확인하였다.
실험예 3: 혈류량 측정을 통한 중증하지허혈질환 치료 평가 확인
실험군 1 내지 9 및 대조군 1, 2에 대하여 하지혈류 흐름을 평가하기 위해, 레이저미세혈류영상측정기 (LDI, Laser doppler imaging)를 통해 일정 시점(투여직후, 3일, 5일, 7일 및 14일 후)의 혈류량의 흐름을 측정하여 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 대조군 1의 정상마우스에서는 빨간색과 초록색으로 혈류량의 흐름이 측정되었으나, 생리식염수를 투여한 대조군 2의 마우스는 하지절단으로 인해 혈류량의 흐름이 측정되지 않은 것을 확인하였다. 또한, 태반 유래 줄기세포만을 포함하는 조성물(비교예)을 투여한 실험군 1 내지 3에서는 대조군 2와 유사하게 혈류량의 흐름이 측정되지 않은 것을 확인하였다.
이와 달리, 도 4에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아를 포함하는 조성물(실시예1)을 투여한 실험군 4, 6과 미토콘드리아가 전달된 세포를 포함하는 조성물(실시예 2)를 투여한 실험군 8, 9에서 대조군 1의 정상마우스와 유사한 수준으로 혈류량이 측정된 것을 확인할 수 있다. 또한, 미토콘드리아를 투여한 실험군 5와 미토콘드리아가 전달된 세포를 투여한 실험군 7의 혈류량의 흐름을 대조군 1과 비교 시 약 50% 수준의 혈류량의 흐름이 측정된 것을 확인할 수 있다.
이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 외래 미토콘드리아가 도입된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,
    허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아는 세포 또는 세포 배양액으로부터 분리된 것인,
    허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    세포와 외래 미토콘드리아의 혼합물을 원심분리하여, 외래 미토콘드리아를 세포 내로 전달시킨,
    허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은, 105개 세포당 0.1 내지 500 ㎍의 미토콘드리아가 도입된 세포를 포함하는,
    허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 허혈성 질환은, 중증하지허혈증, 허혈성 뇌졸중, 허혈성 심장질환 또는 허혈성 대장염인,
    허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는,
    허혈성 질환의 예방 또는 치료 방법.
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