JP6869303B2 - 細胞増殖の刺激のための方法及び組成物、ならびにfgf2アイソフォームの生物学的に活性な混合物の提供 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法第119条(e)のもとで、米国仮特許出願第62/178,190号(2015年4月1日出願)、及び米国仮特許出願第62/204,776号(2015年8月13日出願)の恩典を請求し;それらの開示は、全ての目標のためにその全体が参照によって本明細書に援用される。
該当せず。
間葉系間質細胞(MSC)及びそれらの誘導体の移植は、中枢神経系(CNS)の種々の変性障害の処置として発達している。CNSへのMSC移植から生じる治療効果は、組織の防御、再生及び免疫調節性の刺激を提供する、生きている移植された細胞からの可溶性因子の分泌に主に起因すると考えられる[非特許文献1〜3]。しかし、逆説的には、移植後のCNS中のMSCの生着率は低く[非特許文献4、5];そして治療上の利点は、移植された細胞がもはや検出できなくなった後も長く続くことが観察された。種々の説明が、移植されたMSCの生着が劣ることについて説明するために提唱されている。研究者の中には、移植片喪失を説明するための先天性免疫及びその後の適応免疫の免疫応答の誘導を示唆するものもいるが、他の研究者らは、HLA適合状態にかかわらず移植片細胞喪失が同様の率であることを見出している[非特許文献6、7]。さらなる研究によって、同種異系のMSCは、移植後に有意な免疫応答を惹起しないという証明が得られている([非特許文献8]で概説される)。成体の脳に移植された、細胞内で標識されたMSC(生きているか死んでいるかいずれか)は、レシピエントの周囲の細胞及び遠位の細胞に対して標識を移行し得、かつその標識は、そのレシピエントの細胞に組み込まれるようになり得ることも報告されている[非特許文献9、10]。
FGF2(塩基性線維芽細胞増殖因子、すなわちbFGFとしても公知)は、幹細胞の主要な増殖因子、血管形成の強力な誘導因子、必須の創傷治癒媒介因子であり、ならびに神経系の発達及び再生の主要なプレイヤーである([非特許文献11]で概説される)。5つのFGF2アイソフォームは、選択的翻訳開始によって固有のFGF2のmRNAから翻訳される:18kDの低分子量(LMW)のアイソフォーム;ならびに22、22.5、24及び34kDの分子量を含む高分子量(HMW)のアイソフォーム。LMWのFGF2は、ほとんどが細胞質内であり、かつ分泌されるが、HMWアイソフォームは主に核であって、しかし任意のアイソフォームが、特定の条件下で、核、細胞質、または細胞外基質中で見出され得る。全てのアイソフォームは、小胞体−ゴルジ経路を通じた分泌を指向するシグナルペプチドを欠く。初期の研究では、内皮細胞の機械的に損傷された単層は、高レベルのFGF2を放出することが実証された[非特許文献12、13]。これらの研究、及び分泌用のシグナルペプチドの欠失に基づいて、細胞死または致死未満の損傷でさえ、FGF2放出の主要な機構として記載されている[非特許文献14]。従って、FGF2は、「組織の完全性の慣用的な維持及び/または受傷後の修復に必要な細胞増殖を迅速に開始するための創傷ホルモン」として推薦されている[非特許文献15]。
DNTT−MSC(「NICD一過性トランスフェクトのMSCの子孫(descendants of NICD transiently−transfected MSC)」)とは、ノッチ細胞内ドメイン(NICD);例えば、ヒトNotch1細胞内ドメイン(NICD1)をコードするベクターを用いたMSCの一過性のトランスフェクション、つづいて、選択及びその後の増殖によるヒト骨髄MSCに由来し得る細胞の集団である。この過程によって、親のMSCと比較して、インビトロで優れた血管形成性及び神経新生性(すなわち、神経前駆細胞の増殖及び分化)特性を示す細胞集団が生じる[非特許文献19〜21]。DNTT−MSCの神経新生性効果は、FGF1、FGF2、及びBMP発現の増大、及び対応する分泌の増大に寄与していた[非特許文献19、22]。
る、方法。
上記組織と間葉細胞とを接触させるステップを包含し;
上記接触が、間葉細胞の溶解または破裂を生じる、方法。
(a)線維芽細胞増殖因子−2(FGF2)と、
(b)間葉細胞由来の馴化培地と、を含み、ここで上記間葉細胞が線維芽細胞、MSC及びDNTT_MSCからなる群より選択される、組み合わせ。
(a)生きた間葉細胞であって、線維芽細胞、MSC及びDNTT−MSCからなる群より選択される間葉細胞と;
(b)間葉細胞から得られる調製物であって、細胞溶解液及び可溶性無細胞抽出物からなる群より選択される調製物と、
を含む、組み合わせ。
上記調製物は、細胞溶解液、可溶性無細胞抽出物及び不溶性細胞残渣からなる群より選択され;
さらに、ここで上記間葉細胞は、線維芽細胞、MSC及びDNTT−MSCからなる群より選択される、調製物。
には、例えば、線維芽細胞(例えば、ヒト包皮線維芽細胞)、MSC(本明細書に定義される)、及びMSC由来の細胞、例えば、本明細書に定義されるDNTT−MSCなどが挙げられる。
本開示は、とりわけ、被験体におけるCNS障害の部位に間葉細胞(例えば、線維芽細胞、MSCまたはDNTT−MSC)を移植することにより生物学的に活性なFGF2を提供するための方法を提供する。MSCは、骨髄から付着細胞(すなわち、組織培養プラスチックに付着する細胞)を選択することにより(例えば、培養中での増殖により)得られる。治療における使用のための十分な数の細胞を有するMSC集団を得るには、付着細胞の集団を、付着についての選択後に培養中で増殖させる。混入する細胞(例えば、単球)は、培養条件下では増殖しないために、培養中での増殖はまた、MSCも富化する。
Notchタンパク質(例えば、Notch1)は、すべての後生動物で見られる、細胞内シグナル伝達を通じて細胞分化に影響を及ぼす膜貫通受容体である。Notch細胞外ドメイン(例えば、Notch1タンパク質の細胞外ドメイン)のNotchリガンド(例えば、デルタ(Delta)、セレート(Serrate)、ジャグド(Jagged))との接触は、Notchタンパク質の2つのタンパク質分解切断をもたらし、その2番目は、γ−セクレターゼにより触媒され、そして細胞質中にNotch細胞内ドメイン(NICD)を放出する。マウスNotchタンパク質において、この切断は、アミノ酸gly 1743とval 1744との間で起こる。NICDは、核に移行し、そこで転写因子として働き、さらなる転写調節タンパク質(例えば、MAM、ヒストンアセチラーゼ)を動員して、様々な標的遺伝子(例えば、Hes1)の転写抑制を緩和する。
細胞培養のための標準的な方法が、当該技術分野において公知である。例えば、R.I.Freshney 「Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique」,第5版,Wiley,New York,2005を参照のこと。
DNTT−MSCは、MSCにおいてNotchタンパク質の細胞内ドメインを一過性に発現することによって、間葉系幹細胞(MSC)としても公知である、骨髄付着間質細胞から得られる。MSCにおけるNotch細胞内ドメイン(例えば、ヒトNotch1タンパク質由来のNICD)の一過性発現は、MSCの集団をDNTT−MSCの集団へ変換するのに十分である;増殖因子及び/または分化因子によるさらなる処置は必要とされない。従って、MSCの集団は、NICDをコードする(ただし全長Notchタンパク質はコードしない)配列を含むベクターを用いるMSCの一過性トランスフェクションにより、続いてベクターを含む細胞についての選択及び血清含有培地中での選択された細胞のさらなる培養により、追加の増殖及び/または分化の因子に対して曝されることなく、DNTT−MSCの集団に変換され得る。
MSC及びDNTT−MSCの抽出物中のFGF2のレベルは、これらの細胞由来の馴化培地中でかなり高く、これによって、そのほとんどが分泌されない、MSC及びDNTT−MSC中の生物学的に活性なFGF2の大きい細胞内デポの存在が示される。機械的に破裂されたMSC及びDNTT−MSCから得られた抽出物は、皮質神経前駆体細胞の
、及び臍静脈内皮細胞の濃度依存性の増殖を誘導し;かつMSC及びDNTT−MSC抽出物によって誘導される増殖は、抗FGF2中和抗体によって阻害された。
じるような虚血)または損傷(例えば、外傷性脳損傷)によって生じ得る。従って、壊死組織の存在によって特徴付けられる壊死性の組織及び障害は、本明細書で開示される組成物で処置され得る。特定の実施形態では、本明細書で開示されるような組成物は、壊死性組織に隣接する可変組織へ(例えば、注射によって)移植される。従って、梗塞の場合は、その組成物は、梗塞の周囲の組織に移植される。
本明細書に開示されるような、間葉細胞を含む治療用組成物もまた、提供される。そのような組成物は、典型的には間葉細胞及び医薬的に許容される担体を含む。本明細書に開示される治療組成物は、とりわけ、梗塞、虚血損傷、壊死及び外傷後に必要であり得るような、神経前駆細胞及び/または内皮細胞の増殖及び分化の刺激のために有用である。従って、間葉細胞を含む組成物の「治療上有効な量(therapeutically effective amount)」とは、これらの目的に適切な任意の量であってもよく、かつその損傷の性質及び重篤度、被験体の体重及び全身的健康、ならびに当業者に公知である他の基準に基づいて決定され得る。例えば、投与量は、約100;500;1,000;2,500;5,000;10,000;20,000;50,000;100,000;500,000;1,000,000;5,000,000〜10,000,000個以上の細胞(またはそれらの間の任意の整数値)で変化し得;例えば、体重、投与経路、疾患の重篤度などに依存して、例えば、単回用量、1日に1回、1週間に2回、1週間に1回、1月に2回、1月に1回の投与頻度である。
類及び程度で変化し、そしてまた、被験体の全身の状態に依存しても変化し得る。
MSC及びDNTT−MSC由来の細胞抽出物及び馴化培地は、凍結保存された細胞から調製した。細胞アリコートを解凍し、洗浄し、胚性神経細胞の基本培地(NeuroBasal,(NB),Life Technologies,Carlsbad,CA)
中に再懸濁して、2回洗浄した。MSCの供給源及びDNTT−MSCの調製を記載した。例えば、米国特許第7,682,825号(ここでは、MSCは、「骨髄間質細胞」と呼ばれ、DNTT−MSCは、「神経前駆細胞」と呼ばれる)、及び米国特許出願公開第2010/0266554(ここではMSCは「骨髄付着幹細胞」と呼ばれ、及びDNTT−MSCは「神経再生細胞」と呼ばれる)を参照のこと。また、Aizman et al.(2009)J.Neurosci.Res.87:3198〜3206も参照のこと。前述の引用文献の全ての開示は、MSC及びDNTT−MSCについての産生の供給源及び方法を記述する目的のため、その全体が本明細書において参照によって援用される。
ト非間葉細胞(すなわち、神経前駆細胞(NPC)株ENStem及びReNcell)中でも測定した。表2に示されるとおり、HFFは、より多くのFGF2を放出したが、HUVEC及びヒト神経幹細胞株は、MSCよりも放出するFGF2が少なかった。
ラット胚性皮質細胞集団は、FGF2に応答して増殖する、大きい割合の神経前駆細胞(NPC)を含む。MSC中の細胞内FGF2の生物学的効果は、ラット皮質細胞と、0〜75%にわたって変化するMSC由来E0及びCMの希釈物とを接触させること、ならびにBRDU取り込みを用いて増殖アッセイを行うことによって特徴付けられた。
FGF2の報告された血管形成性活性に照らして、MSC及びDNTT−MSCの抽出物を、それらが、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)の増殖を誘導する能力について試験した。これらの実験について、HUVECは、内皮増殖培地中で培養し、EGM(商標)に、ウシ脳抽出物(両方がLonza由来)及び2%のFBSを2〜4継代の間、補充し、アリコートに分配して、凍結保存して保管した。アッセイに関して、96ウェルのプレートを40μg/mlのラット尾コラーゲンI(Life Technologies)を用いて2時間コーティングし、次いで吸引し、乾燥して、使用するまで−20℃で洗浄または保管した。アッセイ培地は、0.5%FBSを補充したMedium 199(Life Technologies)であった。HUVEC(新鮮に解凍するか、または一晩培養後のいずれか)を、三連で陰性対照としてNBのみを用いて、種々の希釈の抽出物及びCMの存在下で2.5×103細胞/ウェルでプレートした。いくつかの実験では、抗FGF2抗体bFM1または対照のマウスIgG1を(各々2μg/mlの濃度で)、DNTT−MSC由来の15%のE0抽出物(約0.2ng/mlのFGF2を含む)の存在下で含んだ。追加の実験では、組み換えヒトVEGF165(rVEGF)(R&D Systems)または組み換えFGF2(rFGF2)(Peprotech,Rocky Hill,NJ,USA)を、抽出物またはCMの代わりに、それぞれ10ng/ml及び1ng/mlの濃度で含んだ。培養の2日後、細胞を、BRDUを用いて2時間標識し;そしてBRDU取り込みを、実施例2に記載のとおり定量した。
神経原性因子及びグリア分化性(gliogenic)因子に関する定量的アッセイ(共有に係る米国特許出願公開第2013/0210000号に記載)を用いて、MSC及びDNTT−MSCにおいて神経新生性活性を特徴付けた。このアッセイを用いて、(a)抽出物の活性を評価し、かつ(b)抽出物の活性と、生細胞及び死滅細胞の活性とを比較した。これらの実験のために、NB中のMSCまたはDNTT−MSCのいずれかの作業懸濁物を3つのアリコートに分けた。1つのアリコートは、さらなる処置を受けず、生細胞と命名された(「A」と表示)。残りの2つのアリコートを凍結し、次いで解凍して、これから細胞溶解液を生じた(すなわち、死滅細胞、「D」と表示)。次いで、これらの2つの細胞溶解液のうちの1つを、遠心分離によって浄化して、無細胞抽出物を得た(「E」と表示)。
よりも40倍大きい希釈であったことに注目すべきである:実際、これらの実験で用いられるほとんどの濃縮抽出物(すなわち、100μlの培養物培地中の500個の細胞からの抽出物)は、上記で調製された2.5%希釈のE0に相当する(106細胞/5ml培地)。
脳内移植後、大多数の移植された細胞がその後まもなく死ぬことは、まれなことではない。従って、上記の実施例4に記載のように調製した、生きたDNTT−MSC及び死滅DNTT−MSC(すなわち、DNTT−MSC細胞溶解液)の組み合わせを、実施例4に記載の神経新生アッセイで試験した。この目的を達成するために、細胞溶解液(すなわち、死滅細胞、D)及び生細胞(A)を、生細胞に対して死滅細胞を3:1という比で混合し、この混合されたサンプルの活性を、死滅細胞または生細胞のいずれかの同じ総細胞数を含むサンプルの活性と比較した。
細胞が脳に注射されたとき、脳の小血管に対する損傷が生じ得る;そして脈管構造のこの破壊によって、局所の末梢血単核球(PBMC)に対する移植細胞の暴露、及びそれらに関連する細胞毒性の影響が生じ得る。生物学的に活性なFGF2の細胞内貯蔵庫が、PBMC細胞毒性の天然に存在する過程によってMSC及びDNTT−MSCから放出され得るかを試験するために;PBMC媒介性細胞溶解、及びFGF2の放出は、PBMC(IL2の非存在下で7日間予備培養された)及び標的細胞(MSCまたはDNTT−MSCのいずれか)の18時間の同時培養中で評価した。
細胞が組織損傷のゾーンに移植されるとき(例えば、梗塞に対して二次的)、それらは、酸素及び栄養素の限られた拡散によって特徴付けられる、低酸素である場合が多い環境に高密度で沈着される。移植後の脳内微小環境をモデリングするため、MSCまたはDNTT−MSCを、0.35×106/350μl/ウェルの濃度でNB/B27/GLX中で96ウェルプレートの丸底ウェルにプレートした。そのウェルをPCRテープで緊密にシールして、ガス交換を妨げた。培地は、急速に酸性になり、これによって、低酸素環境が示される。ほとんどの細胞は、非接着のままであった;しかし、この環境における培
養の5日後でさえ、培養物は、正常な増殖条件下で再プレートされたとき、結合、成長及び増殖できた、含んでいる生細胞がやはり少なかった。
組み換えFGF2(rFGF2,Peproptech,Rocky Hill,NJ)の効果を、単独で、及びDNTT−MSC由来の順化培地を組み合わせて、ラット胚性皮質細胞の増殖に対して、DNTT−MSC凍結/解凍無細胞(E0)抽出物の効果と評価して比較した。細胞増殖は、上記の実施例2に記載のように測定した。
胞を、種々の濃度のrFGF2に対して、単独で、または75%に希釈されたDNTT−MSC CMと組み合わせて、及びDNTT−MSC E0抽出物の一連の希釈に対して暴露した。ELISAによるE0抽出物中のFGF2レベルのアッセイによって、未希釈のE0抽出物中の3.5ng/mlというFGF2濃度が示された。
天然に存在するFGF2は、18kD、22kD、22.5kD、24kD、及び34kDという少なくとも5つのアイソフォームで存在する。組み換えFGF2は、低分子量(18kD)のアイソフォームのみを含む(図8,レーン2)。対照的に、RIPA緩衝液(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)を用いて調製され、変性Tris−グリシンSDSポリアクリルアミドゲルで解析されたDNTT−MSCの細胞丸ごとの溶解液は、モノクローナル抗FGF2抗体(bFM2,(Millipore,Billerica,MA)を用いて検出されたとおり、少なくとも3つのFGF2アイソフォームを含む(図8,レーン1)。
ヒト包皮線維芽細胞(HFF,ATCC 1041)を用いて、実施例1に記載のような、凍結−解凍無細胞抽出物及び不溶性細胞残渣画分を調製した。これらの画分における
、及びHFF細胞溶解液における、FGF2のレベルを、実施例1に記載のとおり測定し、これらの画分が、神経細胞の増殖を刺激する能力を、実施例2に記載のとおりアッセイした。
Claims (9)
- インビトロで、細胞または組織に対してFGF2アイソフォームの混合物を提供するための調製物の使用であって、前記調製物は、ノッチ細胞内ドメインをコードする配列で一過的にトランスフェクトされた間葉系幹細胞の子孫から得られた可溶性無細胞抽出物であり、前記FGF2アイソフォームの混合物が:
(a)18kDの分子量を有するFGF2アイソフォーム;
(b)22kDの分子量を有するFGF2アイソフォーム;
(c)22.5kDの分子量を有するFGF2アイソフォーム;及び
(d)24kDの分子量を有するFGF2アイソフォーム、
から成る群から選択される1又は複数のFGF2アイソフォームを含む、使用。 - 前記混合物が、組み換えFGF2よりも大きい生物学的な活性を有する、請求項1に記載の使用。
- 前記細胞が神経前駆細胞である、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記細胞が内皮細胞である、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記組織が壊死性である、請求項1又は2に記載の使用。
- 壊死が、梗塞または外傷から生じる、請求項5に記載の使用。
- 前記組織が、虚血性傷害を受けている、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記虚血性傷害が脳卒中である、請求項7に記載の使用。
- 前記調製物が神経前駆細胞又は内皮細胞の増殖を刺激する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用。
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