CN107427536A

CN107427536A - 用于刺激细胞增殖和提供 fgf2 同种型的生物活性混合物的方法和组合物

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Publication number: CN107427536A
Application number: CN201680020284.8A
Authority: CN
Inventors: I·埃兹曼; D·巴特斯
Original assignee: Sanbio Inc
Current assignee: Sanbio Inc
Priority date: 2015-04-01
Filing date: 2016-04-01
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2036-04-01
Also published as: EP3277297B1; US20180036378A1; US11406685B2; JP2020023502A; JP2018511599A; US10363285B2; JP6869303B2; JP6663445B2; EP3277297A1; EP3277297A4; CN107427536B; CA2981523A1; WO2016161290A1; US20190290730A1; HK1247080A1; ES2890123T3

Abstract

本文公开了用于提供具有生物活性的FGF2同种型的混合物的方法和组合物。生物活性包括但不限于刺激神经前体细胞的增殖，刺激内皮细胞的增殖，刺激神经前体细胞的发育和刺激星形胶质细胞的发育。

Description

用于刺激细胞增殖和提供FGF2 同种型的生物活性混合物的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求美国临时专利申请号 62/178,190(2015年4月1日提交)和美国临时专利申请号62/204,776 (2015年8月13日提交)的权益；为了所有目的，其公开内容通过引用整体并入本文。

关于联邦政府支持的声明

不适用。

领域

本发明涉及生长因子及其对细胞特别是神经细胞和与神经系统相关的细胞的增殖和发育的影响的领域。

背景

间充质细胞植入

间充质基质细胞(MSC)及其衍生物的植入正在被作为中枢神经系统(CNS)的各种退行性疾病的治疗进行开发。认为MSC植入CNS 导致的治疗效果主要是由于来自活的植入细胞的可溶性因子的分泌，所述可溶性因子提供组织保护、再生和免疫调节刺激[1-3]。然而，矛盾的是，植入后CNS中MSC的移植率较低[4,5]；并且已经观察到治疗益处在移植细胞不能被检测到之后持续很长时间。已经提出了各种解释来解释植入的MSC的不良移植。一些研究者提出触发先天和随后的适应性免疫应答来解释移植物损失；然而，其他人发现与HLA匹配状态无关的相似移植细胞丢失率[6,7]。另外的研究提供了证据，显示同种异体MSC在植入后不会引起显著的免疫反应(在[8]中综述)。还已经报道，植入成人脑中的细胞内标记的MSC(活的或死的) 可以将标签转移到受者的周围和远处的细胞，并且标签可以掺入受者的细胞[9,10]。

FGF-2

FGF2(也称为碱性成纤维细胞生长因子或bFGF)是干细胞的主要生长因子，血管生成的强力诱导剂，必需的伤口愈合介导因子，和神经系统发育和再生的主要参与者(在[11]中综述)。通过可变翻译起始从独特的FGF2 mRNA翻译5个FGF2同种型：18kD低分子量 (LMW)同种型；和分子量为22、22.5、24和34kD的高分子量(HMW) 同种型。LMW FGF2主要是细胞质的并且是分泌性的，而HMW同种型主要是细胞核的，然而在某些条件下可以在细胞核、细胞质或细胞外基质中发现任何一种异构体。所有同种型缺乏引导通过内质网- 高尔基体途径分泌的信号肽。早期研究表明，机械损伤的内皮细胞单层释放高水平的FGF2[12,13]。基于这些研究和分泌信号肽的缺乏，细胞死亡或甚至亚致死性损伤已被描述为FGF2释放的主要机制[14]。因此，FGF2已经被提名为“用于快速引发组织完整性和/或损伤后修复的常规维持所需的细胞生长的伤口激素”[15]。

虽然许多报告记录了MSC的FGF2 mRNA的表达，并证明细胞内FGF2蛋白的存在[11,12,16]，但由于分泌的FGF2的浓度非常低，很少有报道提供FGF2分泌的测量[17,18]。也许是因为这个原因， FGF2并不被认为是介导植入MSC对周围的神经组织的再生作用的主要候选者。

DNTT-MSC

DNTT-MSC(“NICD瞬时转染的MSC的后代”)是可以通过用编码Notch细胞内结构域(NICD)(例如人Notch1细胞内结构域 (NICD1))的载体瞬时转染MSC和随后进行选择和随后的扩增而从人骨髓MSC衍生的细胞群。与亲代MSC相比，该过程产生在体外表现出优异的血管生成和神经生长(即，神经前体细胞的生长和分化) 性质的细胞群体[19-21]。DNTT-MSC的神经发生作用归因于FGF1， FGF2和BMP的增加的表达和从而增加的分泌[19,22]。

然而，非常低水平的FGF2由MSC或DNTT-MSC分泌。Tate 等人(2010)CellTransplantation 19:973-984。因此，如果FGF2全部或部分负责MSC和/或DNTT-MSC的神经发生作用，则其来源仍然是难以捉摸的。

概述

间充质细胞(例如，成纤维细胞、MSC和DNTT-MSC)含有FGF2 的细胞内储存；但是细胞内FGF2很少被分泌在培养物中。相反，间充质细胞的损伤或死亡导致其细胞内FGF2的释放。本发明人已经发现间充质细胞含有FGF2的特别大的细胞内储存，其在释放时可以在许多体外模型系统中对相邻细胞或组织施加神经发生和血管生成作用。此外，间充质细胞含有FGF2同种型的混合物，并且该同种型混合物具有比单一同种型(即重组FGF2)更高的生物学活性。

因此，本公开内容(除其它以外)提供以下实施方案。

1.一种用于诱导神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法，所述方法包括将神经前体细胞或内皮细胞与从间充质细胞获得的制剂接触，所述制剂选自细胞裂解物、可溶性无细胞提取物和不溶性细胞残留物。

2.一种诱导星形胶质细胞前体细胞向星形胶质细胞的发育的方法，所述方法包括使星形胶质细胞前体细胞与活间充质细胞和间充质细胞的细胞裂解物的混合物接触。

3.一种向细胞或组织提供FGF2同种型的混合物的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与从间充质细胞获得的制剂接触，所述制剂选自细胞裂解物、可溶性无细胞提取物和不溶性细胞残留物。

4.一种用于将FGF2同种型的混合物递送到有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者中引入从间充质细胞获得的制剂，所述制剂选自细胞裂解物、可溶无细胞提取物和不溶性细胞残留物。

5.实施方案3的方法，其中所述混合物包含分子量为18、22、22.5 和24kD的FGF2同种型。

6.实施方案4的方法，其中所述混合物包含分子量为18、22、22.5 和24kD的FGF2同种型。

7.实施方案3的方法，其中所述混合物具有比重组FGF2更高的生物活性。

8.实施方案4的方法，其中所述混合物具有比重组FGF2更高的生物活性。

9.实施方案3的方法，其中所述细胞是神经前体细胞。

10.实施方案3的方法，其中所述细胞是内皮细胞。

11.实施方案4的方法，其中所述受试者已经经历了缺血性损伤。

12.实施方案11的方法，其中所述缺血性损伤是中风。

13.实施方案3的方法，其中所述组织是坏死的。

14.实施方案13的方法，其中坏死是由梗死或创伤性损伤引起的。

15.实施方案1的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。

16.实施方案2的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。

17.实施方案3的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。

18.实施方案4的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。

19.一种用于将FGF2同种型的生物活性混合物递送至组织的方法，所述方法包括：

使组织与间充质细胞接触；

其中所述接触导致间充质细胞的裂解或破裂。

20.实施方案19的方法，其中所述FGF2同种型的分子量为18、 22、22.5和24kD。

21.实施方案19的方法，其中所述混合物具有比重组FGF2更高的生物活性。

22.实施方案19的方法，其中所述组织包含一个或多个神经前体细胞。

23.实施方案19的方法，其中所述组织包含一个或多个内皮细胞。

24.实施方案19的方法，其中所述组织存在于已经经历缺血性损伤的受试者中。

25.实施方案24的方法，其中所述缺血性损伤是中风。

26.实施方案19的方法，其中所述组织是坏死的。

27.实施方案26的方法，其中坏死是由梗塞或创伤性损伤引起的。

28.实施方案19的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。

29.一种用于刺激神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法的间充质细胞的无细胞提取物，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞、MSC和 DNTT-MSC。

30.一种用于刺激神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法的间充质细胞的细胞裂解物，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞、MSC和 DNTT-MSC。

31.一种用于刺激神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法的间充质细胞的不溶性细胞残留物，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞、 MSC和DNTT-MSC。

32.一种用于刺激神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法的组合，其中所述组合包含：

(a)成纤维细胞生长因子-2(FGF2)，和

(b)来自间充质细胞的条件培养基，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞、MSC和DNTT-MSC。

33.实施方案32的组合，其中所述FGF2是重组的。

34.实施方案32的组合，其中所述FGF2是18kd同种型。

35.一种用于诱导星形胶质细胞前体细胞向星形胶质细胞的发育的方法的组合，其中所述组合包含：

(a)活间充质细胞，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞、MSC 和DNTT-MSC；和

(b)从间充质细胞获得的制剂，其中所述制剂选自细胞裂解物和可溶性无细胞提取物。

36.实施方案35的组合，其中裂解细胞当量与活细胞的比例为3:1。

37.一种从间充质细胞获得的制剂，其用于向有需要的细胞、组织或受试者提供FGF2同种型的混合物的方法；

其中所述制剂选自细胞裂解物、可溶性无细胞提取物和不溶性细胞残留物；

其中所述间充质细胞选自成纤维细胞、MSC和DNTT-MSC。

38.实施方案37的制剂，其中FGF2同种型的混合物含有分子量为18、22、22.5和24kD的FGF2同种型。

39.实施方案37的制剂，其中FGF2同种型的混合物具有比重组 FGF2更高的生物学活性。

40.实施方案37的制剂，其中所述细胞是神经前体细胞或内皮细胞。

41.实施方案37的制剂，其中所述组织包含神经前体细胞和/或内皮细胞中的一种或多种。

42.实施方案37的制剂，其中所述组织或受试者已经经历了缺血性损伤。

43.实施方案42的制剂，其中所述缺血性损伤是中风。

44.实施方案37的制剂，其中所述组织是坏死的。

45.实施方案44的方法，其中坏死是由梗塞或创伤性损伤引起的。

46.一种刺激神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法；该方法包括使神经前体细胞或内皮细胞与实施方案32的组合接触。

附图说明

图1A-1C显示从MSC和DNTT-MSC获得的提取物或条件培养基中FGF2和LDH的水平。所有值都是从一百万个细胞获得的。

图1A显示了通过FGF2ELISA测量的来自MSC(左侧条)和 DNTT-MSC(右侧条)的冻融的无细胞的提取物(E0提取物)中的 FGF2水平。

图1B显示了通过HS-FGF2ELISA测量的来自MSC(左侧条) 和DNTT-MSC(右侧条)的条件培养基(CM)中的FGF2水平。

图1C显示了MSC(左侧的一对条)和DNTT-MSC(右侧的一对条)中无细胞E0提取物(每对中的左侧条)和无细胞E1提取物(每对中的右侧条)的LDH水平。条代表7个细胞批次的平均值。误差条表示标准偏差。

图2A和2B显示通过BRDU掺入测定的神经细胞增殖的测量。

图2A显示暴露于来自MSC的增加浓度的无细胞E0提取物(填充正方形)或条件培养基(空心圆圈)的神经细胞的BRDU掺入水平。

图2B显示了在抗FGF2抗体(bFM1)或对照免疫球蛋白(IgG1) 存在下暴露于0、5或15％无细胞E0提取物(分别相当于0、0.07或 0.2ng/ml FGF2)的神经细胞的BRDU掺入水平。

图3A和3B显示通过BRDU掺入测定的内皮细胞增殖的测量。

图3A显示暴露于来自MSC的增加浓度的无细胞E0提取物(实心正方形)或条件培养基(实心三角形)的HUVEC的BRDU掺入水平。使用NeuroBasal(NB)培养基(空心圆圈)作为阴性对照。

图3B显示对照HUVEC(最左侧条)、暴露于10ng/ml重组血管内皮生长因子(rVEGF，左侧第二条)的HUVEC和暴露于1ng/ml 重组成纤维细胞生长因子-2(rFGF2，左侧第三条)的HUVEC的BRDU 掺入水平。还显示了暴露于来自DNTT-MSC的15％无细胞E0提取物(右侧第三条)的HUVEC，在对照免疫球蛋白(IgG1，右侧第二条)存在下暴露于来自DNTT-MSC的15％无细胞E0提取物的 HUVEC或在抗FGF2抗体(bFM1，最右侧的条)存在下暴露于来自 DNTT-MSC的15％无细胞E0提取物的HUVEC的BRDU掺入水平。

图4A-4E显示了来自DNTT-MSC的活细胞、死细胞悬液(即细胞裂解物)和无细胞提取物诱导的神经元和胶质细胞标志物的表达水平。

图4A显示了含有活的DNTT-MSC(A)、死亡的(冻融的) DNTT-MSC(即DNTT-MSC细胞裂解物)(D)或DNTT-MSC的无细胞提取物(E)的大鼠皮层细胞培养物中表达的大鼠巢蛋白的水平。如所示的，每个测定中使用的DNTT-MSC数量或细胞当量为125、250 或500。

图4B显示含有活的DNTT-MSC(A)、死亡(冻融的)DNTT-MSC (即DNTT-MSC细胞裂解物)(D)或DNTT-MSC的无细胞提取物 (E)的大鼠皮层细胞培养物(与图4A中测定的培养物相同的培养物) 中表达的大鼠GFAP的水平。如所示的，每个测定中使用的 DNTT-MSC数量或细胞当量为125、250或500。

图4C显示含有活的DNTT-MSC(A)、死亡(冻融的)DNTT-MSC (即DNTT-MSC细胞裂解物)(D)或DNTT-MSC的无细胞提取物 (E)的大鼠皮层细胞培养物(与图4A中测定的培养物相同的培养物) 中表达的人GAP的水平。如所示的，每个测定中使用的DNTT-MSC 数量或细胞当量为125、250或500。

图4D显示含有活的DNTT-MSC(A)、死亡的DNTT-MSC(即 DNTT-MSC细胞裂解物)(D)或活和死亡的DNTT-MSC的混合物 (D/A)的大鼠皮层细胞培养物中表达的大鼠GFAP的水平。DNTT-MSC数量或细胞当量沿X轴显示。

图4E显示含有活的DNTT-MSC(A)、死亡的DNTT-MSC(即 DNTT-MSC细胞裂解物)(D)或活和死亡的DNTT-MSC的混合物 (D/A)的大鼠皮层细胞培养物(与图4D中测定的培养物相同的培养物)中表达的人GAP的水平。DNTT-MSC数量或细胞当量沿X轴显示。

图5A和5B显示与PBMC共培养的MSC和DNTT-MSC的细胞裂解的程度(通过LDH的释放测量)和FGF2释放。

图5A显示在将靶细胞与PBMC共培养18小时后从靶细胞释放到培养基中的总细胞内LDH的百分比(最左边，每对中阴影条)和从相同的靶细胞制备物释放到培养基中的总细胞内FGF2的百分比 (最右边，每对中的实心条)。靶细胞为MSC(M)和DNTT-MSC (S)。PBMC与靶细胞在PBMC：靶细胞比例为30：1(30xP)和 10：1(10×P)的情况下共培养。

图5B显示靶细胞、裂解的靶细胞和共培养物的培养物中的FGF2 浓度。完整的靶细胞是MSC(M)或DNTT-MSC(S)。靶细胞在1％Triton中裂解(“M裂解”和“S裂解”)。共培养物含有PBMC相对于靶细胞的10倍(10×P)或30倍(30xP)过量。在含有与存在于30xP 共培养样品(30x PBMC)中的相同数目的PBMC的PBMC样品中也测量了FGF2浓度。

图6A和6B显示MSC和DNTT-MSC的缺氧培养物中细胞内和细胞外FGF2和LDH的水平。

图6A显示在缺氧条件下培养开始(“0h”)和之后的各时间(4 小时，20小时，2天和5天)时，MSC和DNTT-MSC的培养物中细胞内FGF2(“FGF2细胞内”，交叉影线条)和胞外FGF2(“FGF2CM”，实心条)的浓度。

图6B显示显示在缺氧条件下培养开始(“0h”)和之后的各时间 (4小时，20小时，2天和5天)时，MSC和DNTT-MSC的培养物中细胞内乳酸脱氢酶(“LDH细胞内”，交叉阴影条)和细胞外乳酸脱氢酶(“LDH CM”，实心条)的浓度。

图7A和7B显示通过BRDU掺入测定的神经细胞增殖的测量。

图7A显示暴露于增加浓度的重组FGF2的神经细胞(rFGF2，三角形)和在来自DNTT-MSC的75％条件培养基存在下暴露于增加浓度的重组FGF2的神经细胞(圈)的BRDU掺入水平。还示出了基于对rFGF2和CM的响应为加性的假设计算的假设曲线(正方形)。

图7B显示暴露于增加浓度的rFGF2(0-10ng/ml)、增加浓度的 rFGF2(0-10ng/ml)加上来自DNTT-MSC的75％条件培养基 (DNTT-MSC-CM，75％)或增加浓度的DNTT-MSC冻/融提取物 (DNTT-MSC-E0)的神经细胞的BRDU掺入水平。

图8显示通过蛋白质印迹分析来自DNTT-MSC的细胞内FGF2。使用bFM2抗FGF2抗体(Millipore，Billerica，MA)在变性Tris- 甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶的印迹中鉴定FGF2。泳道1含有通过在含SDS 的缓冲液中裂解细胞获得的来自SB623细胞的全细胞裂解物。泳道2 含有重组FGF2(约1ng/ml)。在凝胶的单独泳道中运行的分子量标记的位置显示在泳道1的左侧。

图9显示了DNTT-MSC中FGF2同种型的亚细胞分布，通过变性聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质印迹进行分析。泳道1含有3×10⁴个 DNTT-MSC的总细胞裂解物；泳道2含有1.5×10⁴个DNTT-MSC的细胞质级分；泳道3含有1.5×10⁴个DNTT-MSC的核部分；泳道4包含4×10⁴个DNTT-MSC的无细胞E0提取物。在凝胶的单独泳道中运行的分子量标记的位置显示在泳道1的左侧。上方的图显示使用抗 hsp90抗体(Boster Biologics，Pleasanton，CA)检测的热休克蛋白 90(HSP90)(细胞质标记物)的水平。中间的图显示使用抗NUP62 抗体(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)检测的核蛋白 p62(NUP62)(核标记物)的水平。下方的图显示了使用bFM2抗 FGF2抗体(Millipore，Billerica，MA)检测的FGF2同种型的水平。

图10A-10C显示MSC和人包皮成纤维细胞(HFF)的比较。

图10A显示来自HFF和MSC(D94M)的级分中FGF2的水平。测定的级分是细胞裂解物(“死亡的”)、无细胞提取物(“E0”)和细胞残留物(“沉淀”)。

图10B显示在暴露于来自HFF和MSC(D94M)的增加浓度的细胞裂解物(“死亡细胞悬液”)、无细胞E0提取物(“E0”)和重悬的细胞残留物(“沉淀悬液”)的神经细胞中的神经细胞增殖(通过BrdU 掺入测量)。“无添加”表示没有添加。

图10C显示了noggin(50ng/ml)(每对条的最右侧)对MSC细胞裂解物(D94M-死亡的)、HFF细胞裂解物(HFF-死亡细胞悬液) 和MSC细胞残留物(D94M-沉淀)诱导的神经前体细胞增殖的影响。“无添加”表示没有添加。

图11显示了暴露于活MSC和来自MSC和HFF的无细胞冻/融 (E0)提取物的皮层细胞的培养物中巢蛋白(Nes，左上图)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP，右上图)，2',3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNP，左下图)和双皮质素(dcx，右下图)的水平。

图12显示了来自DNTT-MSC的无细胞E0提取物中的FGF2水平与提供神经前体细胞增殖的三倍刺激的提取物的有效浓度之间的关系。

详细描述

除非另有说明，否则本公开内容的实践使用在本领域技术范围内的细胞生物学，毒理学，分子生物学，生物化学，细胞培养，免疫学，肿瘤学，重组DNA和相关领域的标准方法和常规技术。这样的技术在文献中描述并且由此可供本领域技术人员使用。参见例如Alberts,B. 等人,“Molecular Biology of the Cell,”第5版,Garland Science,NewYork,NY,2008；Voet,D.等人“Fundamentals of Biochemistry:Life at the MolecularLevel,”第3版,John Wiley&Sons,Hoboken,NJ, 2008；Sambrook,J.等人,“MolecularCloning:A Laboratory Manual,”第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001；Ausubel,F.等人,“Current Protocols in Molecular Biology,”John Wiley&Sons,NewYork,1987和定期更新；Freshney,R.I.,“Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique,”第4版,John Wiley &Sons,Somerset,NJ,2000；以及丛书“Methods inEnzymology,” Academic Press,San Diego,CA。

为了本公开内容的目的，“血管发生”是指形成新的脉管系统(例如，血管；例如静脉，动脉，小静脉，小动脉，毛细血管)。血管发生可以通过从现有血管发芽新血管和/或通过内皮细胞的原位聚结形成新的血管而发生。血管发生还包括伴随的基质重塑和细胞募集(例如，平滑肌细胞、单核细胞和/或周细胞的募集)过程。血管生成还包括内皮细胞的增殖和/或迁移。

“神经生成”是指神经前体细胞(NPC)向神经元和/或神经胶质细胞(例如，星形胶质细胞，少突胶质细胞)的生长和/或分化。神经生成过程的实例包括但不限于NPC增殖，神经发生(例如，形成新神经元)和胶质发生(例如星形胶质细胞和/或少突胶质细胞的形成)。与神经元发育相关的其它过程包括例如神经突生长，轴突的生长以及树突的生长。

“间充质细胞”是指间充质组织(例如成软骨细胞，软骨细胞，成骨细胞，骨细胞，脂肪细胞)的细胞及其前体，包括例如成纤维细胞(例如人包皮成纤维细胞)，MSC(如本文所定义)和衍生自MSC 的细胞，诸如本文所定义的DNTT-MSC。

“MSC”(“间充质干细胞”)是指从骨髓获得的粘附性非造血多能细胞。这些细胞被称为间充质干细胞，间充质基质细胞，骨髓粘附基质细胞，骨髓粘附干细胞和骨髓基质细胞。MSC也可以从例如脐带血，脂肪组织，牙髓，沃顿的果冻和各种类型的结缔组织获得。

术语“DNTT-MSC”(“NICD瞬时转染的MSC的后代”)和“SB623 细胞”是指在MSC中外源性Notch细胞内结构域(NICD)瞬时表达后获得的细胞群体。例如，通过用包含编码NICD(例如，人Notch1 蛋白)序列但不编码全长Notch蛋白的序列的载体瞬时转染MSC，然后进行选择(例如，使用G418)，可以获得DNTT-MSC群体。在不存在任何添加的生长因子或分化因子的情况下(除了可能存在于血清中的那些，如果血清存在于培养基中的化)，所选择的细胞进一步在标准培养基(任选补充有血清)中培养。

“条件培养基”(CM)是指细胞培养基，其中细胞已孵育并随后在孵育后去除。去除可以包括从培养基去除细胞，或从细胞去除培养基。在培养基中孵育时，取决于培养基的组成，细胞生长可能发生也可能不发生。例如，在无血清培养基中，细胞仍然存活，但不生长。细胞在去除之前在培养基中孵育的时间量在本说明书的其他地方指出。条件培养基可以含有由其中培养的细胞合成和/或分泌的分子，并且还可以任选地在其中孵育细胞之前耗竭存在于培养基中的组分。

为了本公开内容的目的，术语“死细胞或死亡的细胞”和“细胞裂解物”用于指由破坏细胞膜完整性而导致的组合物，使得细胞内的内容物不再保持在完整细胞膜内部。所述细胞膜的破坏可以通过本领域已知的任何方法发生，即机械地(例如通过冻融，超声，共混，剪切，均化等)，热地，化学地，生物化学地，渗透性地，免疫学地，细胞毒性地，和通过蒸发等。因此，细胞裂解物由各种不溶性细胞结构和可溶性细胞材料组成。因此，细胞裂解物的组成可以进一步分为两类：“不溶性级分”和“可溶性级分”。可以例如通过离心或过滤分离可溶性和不溶性成分。不溶性组分通过离心沉淀和/或由过滤器截留；而可溶性组分在离心后保留在上清液中和/或穿过过滤器。不溶性组分也可以称为“沉淀”级分或称为“细胞残留物”。类似地，可溶性组分也可以称为“上清液”级分或称为“无细胞提取物”。

术语“植入”和“移植”用于表示将外源细胞引入受试者。外源细胞可以是自体的(即从受试者获得)或同种异体的(即从受试者以外的个体获得)。

间充质干细胞(MSC)

本公开内容除其它以外提供了通过将间充质细胞(例如成纤维细胞，MSC或DNTT-MSC)植入受试者的CNS损伤部位来提供生物活性FGF2的方法。通过从骨髓中选择(例如通过在培养中生长)粘附细胞(即粘附于组织培养塑料制品的细胞)获得MSC。为了获得具有足够数量的细胞的用于治疗的MSC群体，在就粘附性进行选择后，在培养中扩增粘附细胞群。培养扩增还富集了MSC，因为污染细胞(如单核细胞)在培养条件下不会增殖。

在美国专利申请公开号2003/0003090；Prockop(1997)Science 276:71-74andJiang(2002)Nature 418:41-49中提供了MSC的示例性公开内容。分离和纯化MSC的方法可以在例如美国专利号5,486,359； Pittenger等人(1999)Science 284:143-147和Dezawa等人(2001)Eur. J.Neurosci.14:1771-1776中找到。人MSC是可商购获得的(例如BioWhittaker,Walkersville,MD)，或者可以通过例如骨髓抽吸随后培养和选择粘附的骨髓细胞从供体获得。参见例如WO 2005/100552。

MSC也可以从脐带血中分离出来。参见，例如，Campagnoli等人(2001)Blood 98:2396-2402；Erices等人(2000)Br.J.Haematol. 109:235-242and Hou等人(2003)Int.J.Hematol.78:256-261。MSC 的其他来源包括例如脂肪组织，牙髓和Wharton’s胶质。

Notch细胞内区域

Notch蛋白(例如Notch1)是在所有后生动物中发现的通过细胞内信号传导影响细胞分化的跨膜受体。Notch细胞外结构域(例如， Notch1蛋白的细胞外结构域)与Notch配体(例如，Delta，Serrate， Jagged)的接触导致Notch蛋白的两个蛋白水解切割，其中第二个由γ分泌酶催化并将Notch细胞内结构域(NICD)释放到细胞质中。在小鼠Notch蛋白中，这种切割发生在氨基酸gly1743和val1744之间。 NICD转位到细胞核中，其中它作为转录因子，招募额外的转录调节蛋白(例如MAM，组蛋白乙酰化酶)以减轻各种靶基因(例如Hes1)的转录抑制。

关于Notch信号传导的其它细节和信息例如在 Artavanis-Tsakonas等人(1995)Science 268:225-232；Mumm and Kopan(2000)Develop.Biol.228:151-165和Ehebauer等人(2006)Sci. STKE 2006(364),cm7.[DOI:10.1126/stke.3642006cm7]中找到。

细胞培养和转染

细胞培养的标准方法是本领域已知的。参见例如R.I.Freshney “Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Technique,”Fifth Edition,Wiley,New York,2005。

将外源DNA引入细胞的方法(即转染)和转染细胞的选择也是本领域公知的。参见，例如，Sambrook等人“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press, 2001；Ausubel等人,“Current Protocols in MolecularBiology,”John Wiley&Sons,New York,1987和定期更新。

DNTT-MSC

DNTT-MSC通过在MSC中瞬时表达Notch蛋白的细胞内结构域从骨髓粘附基质细胞(也称为间充质干细胞(MSC))获得。在MSC 中Notch细胞内结构域(例如，人Notch1蛋白的NICD)的瞬时表达足以将MSC群体转化为DNTT-MSC的群体；不需要用生长和/或分化因子进行额外的处理。因此，通过用包含编码NICD(但不是编码全长Notch蛋白)的序列的载体瞬时转染MSC，然后选择包含载体的细胞并在不暴露于另外的生长和/或分化因子的情况下，在含有血清的培养基中进一步培养选择的细胞，可将MSC群体转化为DNTT-MSC 群体。

在制备DNTT-MSC的一个实施方案中，将MSC的培养物与包含编码Notch细胞内结构域(NICD)的序列的多核苷酸接触；例如通过转染；随后通过药物选择和进一步培养来富集转染的细胞。参见例如美国专利号7,682,825(2010年3月23日)；美国专利申请公开号2010/0266554(2010年10月21日)；和WO 2009/023251(2009年2 月19日)；为了描述间充质干细胞的分离和将间充质干细胞转化为 DNTT-MSC(在这些文献中称为“神经前体细胞”和“神经再生细胞”) 的目的，所有这些公开内容通过引用整体并入本文。

在这些方法中，可以使用编码Notch细胞内结构域的任何多核苷酸(例如载体)，并且可以使用用于选择和富集转染细胞的任何方法。例如，在某些实施方案中，使用含有编码Notch细胞内结构域(例如，人Notch1细胞内结构域)的序列并且还含有编码选择标记(例如，耐药性，例如对G418的抗性)的序列的载体转染MSC。在另外的实施方案中，使用两个载体转染MSC，一个含有编码Notch细胞内结构域的序列，另一个含有编码药物抗性标记的序列。在这些实施方案中，在用载体或两个载体转染细胞培养物之后，通过以足以杀死不包含载体的细胞但不杀死包含载体的细胞的量向细胞培养物中加入选择剂 (例如，G418)来实现选择。选择的消除需要去除所述选择剂或将其浓度降低到不杀死不包含载体的细胞的水平。选择后(例如七天)，除去选择剂，并将细胞在含血清培养基中进一步培养(例如两代)。

取决于选择标记的性质和/或所用选择剂的浓度，可能的是在选择过程中不是每个缺少编码选择标记的载体的细胞都被杀死。例如，选择剂可以抑制不包含选择标记的细胞的生长，并且在除去选择剂后，该细胞可以恢复并重新生长。

因此，DNTT-MSC的制备涉及MSC中外源性Notch细胞内结构域的瞬时表达。为此，可以用包含编码Notch细胞内结构域(例如，人Notch1细胞内结构域)的序列的载体转染MSC，其中所述序列不编码全长Notch蛋白。所有这些序列是本领域技术人员熟知并且容易获得的。例如，Del Amo等人(1993)Genomics 15:259-264提出了小鼠Notch蛋白的完整氨基酸序列；而Mumm and Kopan(2000)Devel. Biol.228:151-165提供了来自小鼠Notch蛋白的围绕释放细胞内结构域的所谓的S3切割位点的氨基酸序列。总而言之，这些参考文献为技术人员提供了含有不是全长Notch蛋白质的Notch细胞内结构域的每种和每个肽；从而也为本领域技术人员提供了包含编码Notch细胞内结构域但不编码全长Notch蛋白的序列的每个多核苷酸。上述文献 (Del Amo和Mumm)通过引用整体并入本文以便分别公开全长 Notch蛋白的氨基酸序列和Notch细胞内结构域的氨基酸序列。

类似的信息对于来自其他物种(包括大鼠，非洲爪蟾，果蝇和人类)的Notch蛋白质和核酸是可获得的。参见，例如，Weinmaster 等人(1991)Development 113:199-205；Schroeter等人(1998) Nature 393:382-386；NCBI参考序列号NM_017167(及其中引用的参考文献)；SwissProt P46531(及其中引用的参考文献)；SwissProt Q01705(及其中引用的参考文献)；和GenBank CAB40733(及其中引用的参考文献)。为了公开许多不同物种的全长Notch蛋白的氨基酸序列和Notch细胞内结构域的氨基酸序列，上述参考文献全部内容通过引用并入本文。

在另外的实施方案中，通过向MSC中引入包含编码Notch细胞内结构域的序列的核酸以使得MSC不表达外源性Notch细胞外结构域来制备DNTT-MSC。这可以例如通过用包含编码Notch细胞内结构域的序列的载体转染MSC来实现，其中所述序列不编码全长Notch 蛋白。

关于DNTT-MSC的制备的其它细节以及用于制备具有与可用于本文公开的方法的DNTT-MSC相似性质的细胞的方法可见于美国专利号7,682,825；和美国专利申请公开号2010/0266554(2010年10月 21日)和2011/0229442(2011年9月22日)；其公开内容通过引用并入本文，用于为DNTT-MSC的制备提供额外的细节和替代方法，以及提供用于制备具有与DNTT-MSC相似性质的细胞的方法。还参见Dezawa等人(2004)J.Clin.Invest.113:1701-1710。

间充质细胞的FGF2含量

MSC和DNTT-MSC的提取物中FGF2的水平比来自这些细胞的条件培养基中的FGF2水平高得多，表明在MSC和DNTT-MSC中存在生物活性FGF2的大量细胞内储库，其中大部分不分泌。从机械破裂的MSC和DNTT-MSC获得的提取物诱导皮质神经祖细胞和脐静脉内皮细胞的浓度依赖性增殖；并且由MSC和DNTT-MSC提取物诱导的增殖被抗FGF2中和抗体抑制。

测量并比较了通过分泌相对机械细胞损伤从MSC或DNTT-MSC 释放的FGF2的量。本文公开了通过机械细胞损伤释放的内容物在刺激神经前体细胞和内皮细胞的增殖上具有高度活性。此外，这些细胞内容物的促有丝分裂活性显示是由于细胞内FGF2的释放引起的。可能导致脑内植入后MSC死亡的替代性非机械细胞损伤的模型证明，在这些模型中也释放了显著量的FGF2，并且FGF2释放与MSC或 DNTT-MSC的死亡相关。最后，已经观察到机械损伤和活的间充质细胞的共培养物协同作用以影响神经祖细胞的分化。

因此，本公开内容显示MSC和DNTT-MSC含有大量细胞内储存的生物活性FGF2，其可以在各种类型的细胞损伤(例如机械损伤，细胞介导的细胞毒性和缺氧)后释放；释放的FGF2能够刺激细胞增殖，神经生成和血管生成。因此，除其它以外，提供了用于通过提供死亡的间充质细胞(例如成纤维细胞、MSC和/或DNTT-MSC)，或通过提供间充质细胞(例如，成纤维细胞、MSC和/或DNTT-MSC) 的可溶性和/或不溶性细胞内提取物，来刺激神经前体细胞的增殖和分化以及刺激内皮细胞的增殖的方法。还提供了用于刺激神经和内皮细胞增殖的死亡的间充质细胞(即细胞裂解物)、间充质细胞的可溶性无细胞提取物和间充质细胞的不溶性细胞残留物。

在另外的实施方案中，提供了用于向细胞、组织或受试者提供生物活性FGF2(例如两种或更多种FGF2同种型的混合物)的方法和组合物；其中所述方法包括使细胞、组织或受试者与来自间充质细胞 (例如成纤维细胞、MSC和/或DNTT-MSC)的可溶性无细胞提取物或不溶性细胞残留物接触；或使细胞、组织或受试者与死亡的间充质细胞(例如死亡的成纤维细胞，死亡的MSC和/或死亡的DNTT-MSC) 接触。

在另外的实施方案中，可以使用活间充质细胞(例如成纤维细胞、 MSC和/或DNTT-MSC)和间充质细胞(例如成纤维细胞、MSC和/ 或DNTT-MSC)的无细胞提取物的混合物诱导星形胶质细胞前体至星形胶质细胞的分化。在另外的实施方案中，提供了包含活间充质细胞 (例如成纤维细胞、MSC和/或DNTT-MSC)和间充质细胞的无细胞提取物的混合物的组合物。

在另外的实施方案中，可以使用活的和死亡的间充质细胞(例如成纤维细胞、MSC和/或DNTT-MSC)的混合物来刺激星形胶质细胞的发育。因此，还提供了活的和死亡的间充质细胞的混合物。

在另外的实施方案中，FGF2(例如重组FGF2)和来自间充质细胞的条件培养基的混合物可用于刺激神经前体细胞和/或内皮细胞的增殖。因此，还提供了FGF2(例如重组FGF2)和来自间充质细胞的条件培养基的混合物。

本文公开的组合物可用于治疗缺血性损伤(例如中风)和治疗坏死。坏死可以由除其它以外梗塞(例如发生在例如中风后的缺血)或损伤(例如创伤性脑损伤)引起。因此，可以用本文公开的组合物治疗坏死组织和以坏死组织存在为特征的病症。在某些实施方案中，本文公开的组合物被植入(例如通过注射)到与坏死组织相邻的活组织中。因此，在梗塞的情况下，将组合物植入梗塞周围组织。

制剂、试剂盒和施用

还提供了包含本文公开的间充质细胞的治疗组合物。这样的组合物通常包含间充质细胞和药学上可接受的载剂。本文公开的治疗组合物尤其可用于刺激神经前体细胞和/或内皮细胞的增殖和分化，例如可能在梗塞、缺血性损伤、坏死和创伤性损伤后是需要的。因此，包含间充质细胞的组合物的“治疗有效量”可以是适合于这些目的的任何量，并且可以基于损伤的性质和严重程度、受试者的体重和一般健康以及本领域技术人员已知的其他标准来确定。例如，剂量可以为约 100；500；1,000；2,500；5,000；10,000；20,000；50,000；100,000， 500,000；1,000,000；5,000,000至10,000,000个细胞或更多(或其间的任何整数值)；例如单个剂量的施用频率可以是每天一次，每周两次，每周一次，每月两次，每月一次，这取决于例如体重、施用途径、疾病严重程度等。

鉴于本公开内容，用于其制备和使用的各种药物组合物和技术是本领域技术人员已知的。有关用于其施用的适合的药物组合物和技术的详细列表可以参考文献例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed.1985；Brunton等人,“Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,”McGraw-Hill,2005；University of the Sciences in Philadelphia(eds.),“Remington:The Science andPractice of Pharmacy,”Lippincott Williams&Wilkins, 2005；和University of theSciences in Philadelphia(eds.),“Remington: The Principles of PharmacyPractice,”Lippincott Williams&Wilkins, 2008。

本文所述的间充质细胞可以悬浮在生理上相容的载剂中用于植入。如本文所用，术语“生理相容的载剂”是指与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害的载剂。本领域技术人员熟悉生理上相容的载剂。合适载剂的实例包括细胞培养基(例如，Eagle's最小必需培养基)，磷酸缓冲盐水，Hank's平衡盐溶液+/-葡萄糖(HBSS)和多种电解质溶液如Plasma-Lyte^TM A(Baxter)。

施用于受试者的间充质细胞悬浮液的体积将根据植入部位、治疗目标和溶液中的细胞数量而变化。通常，施用的细胞量将是治疗有效量。如本文所用，“治疗有效量”或“有效量”是指实现特定病症的治疗(即产生与该病症相关的症状的量和/或严重程度的降低)所需的移植细胞数。治疗有效量随损伤的类型和程度而变化，并且还可以根据受试者的总体状况而变化。

所公开的治疗组合物还可以包括药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂或包封材料，即载剂。这些载剂可以例如稳定间充质细胞和/或促进体内间充质细胞的存活。每个载剂应该是“可接受的”，意思是与制剂的其他成分相容，并且不会对受试者造成伤害。可用作药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括：糖，如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油，山梨糖醇，甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和药物制剂中使用的其他无毒相容物质。润湿剂，乳化剂和润滑剂，例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，脱模剂，包衣剂，甜味剂，调味剂和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。

示例性制剂包括但不限于适于肠胃外施用(例如肺内，静脉内，动脉内，眼内，颅内，脑膜下或皮下施用)的那些，包括包封在胶囊中的制剂，脂质体或药物释放胶囊(引入设计用于缓释的生物相容性包衣中的活性剂)；可摄取制剂；用于局部使用的制剂，例如滴眼剂，霜剂，软膏剂和凝胶剂；和其它制剂如吸入剂，气溶胶和喷雾剂。本公开内容的组合物的剂量将根据治疗需要的程度和严重性，施用组合物的活性，受试者的一般健康状况以及本领域技术人员熟知的其它考虑因素而变化。

在另外的实施方案中，本文所述的组合物在局部递送。局部递送允许非全身性地递送组合物，从而与全身递送相比减少组合物的身体负担。这种局部递送可以例如通过使用各种医学上植入的装置来实现，包括但不限于支架和导管，或者可以通过吸入、注射或手术实现。将所需试剂涂覆、植入、包埋和以其他方式附着在医疗装置如支架和导管上的方法是本领域中已建立的并且在本文中考虑。

本公开内容的另一方面涉及用于对受试者进行间充质细胞的施用的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含在一种或多种单独的药物制剂中适当配制(例如在药物载剂中)的间充质细胞的组合物。

实施例

实施例1：MSC和DNTT-MSC中细胞内和分泌的FGF2的水平

MSC和DNTT-MSC的细胞提取物和条件培养基由冷冻保存的细胞制备。将细胞等分试样解冻，洗涤，重悬于用于胚胎神经元细胞的基础培养基(NeuroBasal，(NB)，LifeTechnologies，Carlsbad， CA)中并洗涤两次。已经描述了MSC的来源和DNTT-MSC的制备。参见例如美国专利号7,682,825，其中MSC被称为“骨髓基质细胞”， DNTT-MSC被称为“神经前体细胞”；以及美国专利申请公开号 2010/0266554，其中MSC被称为“骨髓粘附干细胞”，DNTT-MSC被称为“神经再生细胞”。另见Aizman Aizman等人(2009)J.Neurosci. Res.87:3198-3206。为了描述MSC和DNTT-MSC的来源和生产方法的目的，所有前述参考文献的公开内容通过引用并入本文。

为了制备称为E0的无细胞提取物，将2×10⁶个细胞在-80℃下在 4ml NB中冷冻1-2小时，然后解冻，重新悬浮在总共10ml NB培养基中，悬浮液通过在3000rpm离心15分钟澄清。该过程基本上破裂细胞膜，导致细胞内内容物的释放。将上清液分配至等分试样并储存在 -80℃。

为了制备条件培养基(CM)，将2x10⁶个细胞在补充有10％胎牛血清(HyClone，Logan，UT)和青霉素/链霉素的α-最小必需培养基(Mediatech，Inc，Manassas，VA)(α-MEM/FBS/PS)(Life Technologies)中接种在T75烧瓶中并培养过夜。第二天将培养基改为 NB持续1小时，然后丢弃并用10ml新鲜NB替代，并继续培养24 小时；然后除去条件培养基，以3000rpm离心15分钟，分配成等分试样，并储存在-80℃。

除去条件培养基后，将除去培养基的烧瓶(含有细胞层)冷冻和融化，用10ml NB提取细胞残余物，离心提取物，将上清液分配成等分试样并储存在-80℃。这些无细胞提取物称为E1提取物。初步实验表明，冻融过程中没有细胞存活。除非另有说明，使用细胞与培养基的相同比例(10⁶个细胞/5ml NB)产生E0和CM。

通过ELISA测量FGF2(bFGF)和其他细胞因子的水平。从R &D Systems(Minneapolis，MN)获得碱性FGF(FGF2)、高灵敏度(HS)碱性FGF、VEGF和酸性FGF(FGF1)的免疫测定。MCP-1ELISA试剂盒获自Boster Biological Technology(Pleasanton，CA)。根据制造商的说明进行ELISA，除了对于FGF2 ELISA，将样品孵育过夜。这提供了与制造商推荐的2小时孵育获得的结果相当的结果。在初步实验中测定的FGF2检测的最佳稀释度对于E0提取物为1/10，对于CM为1/2或不稀释。

通过在经历单次冻/融循环的细胞的无细胞提取物(E0提取物) 中测定FGF2来测定MSC和DNTT-MSC中的细胞内FGF2水平。从 7个供体获得细胞，平均结果。图1A显示，10⁶个MSC释放平均3.9ng 的FGF2；而10⁶个DNTT-MSC释放平均7.2ng的FGF2。一个冻融循环足以杀死所有细胞(如用台盼蓝染色和细胞铺板培养测试的)，而每次额外的冻融循环将FGF2浓度降低约20％。

相比之下，从相同数量的MSC或DNTT-MSC获得的CM含有约0.02ng的FGF2(图1B)。因此，MSC和SB623细胞含有FGF2 的大量细胞内储库，但是其分泌很少。

为了控制细胞代谢活性的潜在差异，在洗涤的冷冻保存的MSC 和DNTT-MSC的无细胞提取物(E0提取物)以及在细胞生长并生产 CM后获得的无细胞提取物(E1提取物)中测量LDH活性(细胞数量的替代标记)。使用LDH细胞毒性检测试剂盒(Clontech Laboratories，Mountain View，CA)以1:2和1:4稀释度在细胞提取物中检测活性并平均。牛LDH(SigmaAldrich，St.Louis，MO)用作标准品。

LDH测定结果显示，对于MSC和DNTT-MSC，E0提取物 (0.3U/10⁶个细胞)中LDH活性高于E1提取物(0.13U/10⁶个细胞)；表明与冷冻保存后破裂的细胞相比，饥饿细胞中代谢活性降低(图 1C)。然而，来自MSC和DNTT-MSC的E0提取物(约0.3U/10⁶个细胞)和来自MSC和DNTT-MSC的E1提取物(0.13U/10⁶个细胞) 中的LDH水平相似，表明在培养以产生CM之前和之后在两种细胞类型中的相似的代谢水平(即，相似的细胞数)(图1C)。

这些结果表明，在MSC和DNTT-MSC中，FGF2主要是细胞内的，而很少被分泌。还研究了FGF1、血管内皮生长因子(VEGF)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)的细胞分布。在MSC中，对于FGF1，但不是VEGF和MCP1，细胞内划分也似乎是这种情况(表1)。

表1.来自MSC的CM和冻/融(E0)提取物中的各种因子的检测

通过ELISA测定10⁶个MSC产生的因子量。对于FGF2显示了7个细胞批次的平均测量值和对于其它因子显示了2个细胞批次的平均测量值。LLD：检测下限；CV：变动系数。

还测量了来自其他人间充质细胞(人包皮成纤维细胞，HFF)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC))和人非间充质细胞(即神经前体细胞(NPC)系ENStem和ReNcell)的冻/融(即E0)提取物中的FGF2 水平。如表2所示，HFF释放更多的FGF2，而HUVEC和人神经干细胞系释放的FGF2比MSC少。

表2.来自不同细胞类型的提取物中的FGF2含量

实施例2：MSC的提取物促进神经前体细胞的增殖

大鼠胚胎皮质细胞群体含有大量响应于FGF2而增殖的神经前体细胞(NPC)。通过使大鼠皮质细胞与MSC衍生的E0和CM的稀释液(从0至75％)接触，并使用BRDU掺入进行增殖测定来表征细胞内FGF2在MSC中的生物学作用。

已经描述了皮质细胞测定。参见，例如，Aizman等人(2013)Stem CellsTransl.Med.2:223-232和美国专利申请公开号2013/0210000 (2013年8月15日)。简言之，用鸟氨酸/纤连蛋白(Orn/Fn，均来自Sigma Aldrich，St.Louis，MO)包被九十六孔板(Corning Inc， Corning，NY)。大脑胚胎E18皮质对购自BrainBits(Springfield， IL)；和如Aizman等人(同上)所述分离神经细胞。测定培养基由补充有B27和0.5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAX)的NB (NB/B27/GLX，全部来自Invitrogen)组成。以6.7×10³个细胞/孔铺板神经细胞；然后将E0或CM的各种浓度(0％-75％范围)一式三份加入孔中。在抗体中和实验中，还加入中和性抗FGF2抗体克隆 bFM1(Millipore，Billerica，MA)或对照小鼠IgG1(R&D Systems， Minneapolis，MN，USA)，每种为2μg/ml。含有培养基但不含细胞的孔用作空白。加入提取物后，将神经细胞培养5天。

为了量化增殖，进行5-溴-2'-脱氧尿苷(BRDU)标记2小时，然后根据制造商的说明书，使用Cell Proliferation ELISA，BrdU (Colorimetric)(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany) 处理板。通过从1：1000开始连续稀释抗BRDU试剂制备标准品。最高标准值任意设定为100，比色分析结果以这些单位表示。使用 SpectraMax Plus读板器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)对颜色显影进行定量。

这些实验的结果表明，使用来自MSC的E0无细胞提取物处理神经细胞以剂量依赖性方式增加神经细胞增殖；而用MSC条件培养基 (即分泌的分子)处理神经细胞对增殖没有影响(图2A)。在另外的实验中，显示在中和抗FGF2(bFM1)抗体存在下，对来自DNTT-MSC 的E0提取物的增殖响应减弱，而对照抗体没有作用(图2B)。因此，从MSC和DNTT-MSC释放的细胞内FGF2促进神经细胞的增殖。

细胞内FGF2在刺激神经前体细胞增殖中的作用的额外支持如图 12所示。在该实验中，通过ELISA(如实施例1所述)测定来自不同批次的DNTT-MSC的E0提取物的FGF2含量并且在上述增殖测定中测试这些E0提取物的稀释度。对于每批细胞，随后将刺激细胞增殖高于背景(无提取物)三倍的提取物(稀释后)的有效浓度相对于该提取物中的FGF2浓度作图。结果显示FGF2含量与三倍刺激增殖所需的提取物的有效浓度之间呈反相关；即提取物中FGF2水平与刺激增殖能力之间直接相关。

除神经前体细胞外，胚胎大鼠皮质细胞群含有未成熟神经元。为了鉴定响应于MSC和DNTT-MSC提取物而增殖的细胞亚群，将神经细胞用或不用来自DNTT-MSC的E1提取物(即，从经培养以提供条件培养基的细胞获得的无细胞提取物)培养5天，然后就dcx(未成熟神经元的标记)和巢蛋白(神经前体细胞标记)进行免疫染色，并且还用BRDU标记。免疫染色分析表明，在提取物处理的培养物中， DCX⁺或BRDU⁺/DCX⁺细胞没有增加；相比之下，巢蛋白阳性细胞显著增加；几乎所有的巢蛋白阳性细胞也是BRDU阳性的。这些结果表明，在培养5天后，神经前体细胞是响应于提取物而增殖的主要细胞亚群。

实施例3：MSC和DNTT-MSC的提取物促进内皮细胞的增殖

根据报道的FGF2的血管生成活性，检测MSC和DNTT-MSC的提取物诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的能力。对于这些实验，将HUVEC在内皮生长培养基，补充有牛脑提取物(来自Lonza) 和2％FBS的EGM^TM(来自Lonza)中培养2-4代，分成等分试样，并冷冻保存。对于该测定，将96孔板用40μg/ml的大鼠尾巴胶原蛋白 I(Life Technologies)包被2小时，然后抽吸，干燥并洗涤或在-20℃下储存直至使用。测定培养基是补充有0.5％FBS的培养基199(Life Technologies)。将新鲜解冻或过夜培养的HUVEC在各种稀释度的提取物和CM的存在下以2.5×10³个细胞/孔一式三份铺板，使用单独的NB作为阴性对照。在一些实验中，在来自DNTT-MSC的15％E0 提取物(含约0.2ng/ml FGF2)的存在下，包括抗FGF2抗体bFM1 或对照小鼠IgG1(各自浓度为2μg/ml)。在另外的实验中，分别以 10ng/ml和1ng/ml的浓度包含重组人VEGF165(rVEGF)(R&D Systems)或重组FGF2(rFGF2)(Peprotech，Rocky Hill，NJ，USA) 代替提取物或CM。培养2天后，用BRDU标记细胞2小时；并如实施例2所述定量BRDU掺入。

结果如图3所示。MSC E0提取物强烈诱导HUVEC的增殖，而 MSC-CM和NB培养基没有作用(图3A)。在单独的实验中，HUVEC 与具有或不具有FGF2中和和对照抗体的rVEGF、rFGF2或 DNTT-MSC-E0提取物(15％)一起孵育(图3B)。对E0提取物的响应被抗FGF2中和抗体bFM1抑制，但不受对照小鼠IgG1的抑制，表明该测定中的HUVEC增殖是由FGF2驱动的。值得注意的是，本试验中天然和重组FGF2的活性是相似的；实际上，当减去背景(无 E0提取物，无重组生长因子，图3B，最左边的条)时，由15％E0 提取物(其对应于该E0制剂中0.2ng/ml的最终FGF2浓度)诱导的响应是1ng/ml rFGF2诱导的响应的约1/4。

实施例4：活细胞、死亡细胞和细胞提取物的神经源性活性

用于神经源性和胶质发生因子的定量测定(在共同拥有的美国专利申请公开号2013/0210000中描述)用于表征MSC和DNTT-MSC 中的神经生成活性。该测定用于(a)评估提取物的活性，和(b)将提取物的活性与活细胞和死细胞的活性进行比较。对于这些实验，将MSC或DNTT-MSC在NB中的工作悬浮液分成3个等分试样。一个等分试样不接受进一步处理，并被命名为活细胞(表示为“A”)。将剩余的两个等分试样冷冻然后解冻，产生细胞裂解物(即死亡的细胞，表示为“D”)。然后通过离心澄清这两个细胞裂解物中的一个，得到无细胞提取物(表示为“E”)。

神经生成测定使用用MSC衍生的ECM包被的CellBIND Surface 96孔板(Corning)作为用于细胞生长的衬底。将3个等分试样(活细胞，死亡细胞和无细胞提取物)中的每一个以相同的稀释液(对应于500、250或125个活的MSC或DNTT-MSC/孔)进行铺板。向所有孔中加入皮质细胞(5000个细胞/孔)。培养后，使用Taqman测定(Life Technologies)，通过qRT-PCR定量大鼠巢蛋白、大鼠胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和人甘油醛磷酸脱氢酶(GAP)的表达。

结果如图4所示。确认以前的结果(上述实施例2)，通过无细胞提取物诱导巢蛋白表达；但诱导至比活细胞或细胞裂解物较低的程度(图4A)。细胞裂解物比活细胞的悬浮液诱导稍微更强的巢蛋白表达。相比之下，GFAP表达由活细胞诱导，但不由无细胞提取物诱导，和仅由细胞裂解物稍微诱导(图4B)。用细胞裂解物处理的培养物中人GAP表达的缺乏证实不存在存活的人细胞(图4C)。

无细胞提取物、活细胞和细胞裂解物诱导巢蛋白表达的能力的差异可以通过先前观察的神经细胞与MSC的共培养通过支持 Nes⁺GFAP⁺前体的增殖而触发增加的巢蛋白表达来解释。Aizman等人 (2013)_Stem Cells Transl Med.2:223-232。虽然可溶性无细胞提取物是胞质FGF2的丰富来源，但细胞裂解物还含有细胞残留物(例如核)，其可释放额外的FGF2并进一步刺激细胞增殖和巢蛋白表达。

最后，应该注意的是，本实验中使用的无细胞提取物比上文所述实验中使用的E0提取物稀释了40倍更多：实际上，这些实验中使用的最浓缩的提取物(即来自500个细胞的在100μl培养基中的提取物) 对应于如上文所述制备的E0的2.5％稀释度(10⁶个细胞/5ml培养基)。

实施例5：神经胶质细胞前体的诱导

脑内植入后，大多数移植细胞常常会在不久后死亡。因此，在实施例4中描述的神经生成测定中测试了如上述实施例4中所述制备的活的DNTT-MSC和死亡的DNTT-MSC(即，DNTT-MSC细胞裂解物)的组合。为此，细胞裂解物(即死亡细胞，D)和活细胞(A)以死亡细胞与活细胞的3:1的比率混合，将该混合样品的活性与含有相同总细胞数的死亡细胞或活细胞的样品的活性进行比较。

如从实施例2和4中所述的结果预期的，所有3个样品类似地诱导巢蛋白表达。图4D显示死亡细胞和活细胞的混合物对神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(星形胶质细胞标志物)的表达具有协同作用。对于MSC-和DNTT-MSC衍生的样品均观察到这种协同作用。死亡细胞和活细胞样品之间的协同作用并不是由于在混合D/A制剂中存在过量活的人细胞引起的，因为在活细胞样品和死亡细胞/活细胞混合物中检测到类似的人GAP水平(图4E)。因此，活的MSC或DNTT-MSC、它们的提取物或通过单个冻/融循环杀死的细胞的悬浮液都可以促进神经前体生长；而鲁棒的星形胶质细胞发生(astrogenesis)需要活的 MSC或DNTT-MSC的存在。

实施例6：由PBMC的细胞毒性活性导致的细胞内FGF2从MSC 和DNTT-MSC的释放

当细胞被注入脑内时，可发生对小脑血管的损伤；并且脉管系统的这种破坏可能导致植入的细胞暴露于局部外周血单核细胞(PBMC) 及其相关的细胞毒性作用。为了检测生物活性FGF2的细胞内储存是否可以通过天然存在的PBMC细胞毒性过程从MSC和DNTT-MSC释放；PBMC介导的细胞裂解和FGF2的释放在PBMC(在不存在IL2 的情况下预培养7天)和靶细胞(MSC或DNTT-MSC)的18小时共培养物中进行评估。

对于这些测定，根据制造商的说明书，使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)从全血的血沉棕黄层制备物获得 PBMC。通过离心(600rpm，20分钟)收集和洗涤淋巴细胞/单核细胞/血小板级分以除去大部分血小板。将效应细胞(PBMC)培养7天，随后在PBMC对靶细胞(MSC或DNTT-MSC)10或30倍过量的情况下与靶细胞共培养18小时。对照培养物含有仅PBMC，仅MSC，仅DNTT-MSC，和仅培养基。还将MSC和DNTT-MSC单独铺板并通过在培养的最后30分钟期间向培养物加入Triton至1％(w/v)的最终浓度来裂解，以测定靶细胞中的总LDH活性。进行了每个条件的五次重复。

培养后，将板以1000rpm离心5分钟。从五个重复中的三个中，从每个孔中移出25μl上清液用于使用LDH细胞毒性检测试剂盒 (Clontech Laboratories，Mountain View，CA)测量LDH活性。根据下列公式，将细胞毒性表达为效应物-靶共同培养物中的“LDH活性的特异性释放”：

从剩余的两个样品中移出上清液(10-50μl，取决于FGF2的预期浓度)用于使用FGF2Quantikine测定(R&D Systems，Minneapolis， MN)测量FGF2。以与LDH的特异性释放相同的方式计算共培养物中靶细胞的特异性FGF2释放；即作为靶细胞中总FGF2的百分数；并考虑来自靶细胞和效应细胞的自发背景FGF2释放。

代表性的结果如图5A所示。如通过特异性LDH释放测量的MSC 和DNTT-MSC的裂解与效应细胞:靶细胞比率成比例，并且对于MSC、DNTT-MSC和PBMC的不同供体在30:1的PBMC:靶细胞比例下为30至90％。尽管特异性FGF2释放的百分比低于LDH的百分比约2-2.5倍，但靶细胞中FGF2的百分比释放与裂解程度相关。

尽管在本实验中，MSC/PBMC共培养物中的特异性裂解高于 DNTT-MSC/PBMC共培养物中的特异性裂解(图5A)，但是由于 DNTT-MSC中FGF2的更高的细胞内水平，更多的FGF2在DNTT-MSC共培养物中释放(图5B，比较“S裂解”与“M裂解”样品)。此外，DNTT-MSC在不存在PBMC的情况下比MSC释放更多的 FGF2(图5B，比较“S”和“M”样品)。

总之，这些结果表明，由于PBMC的细胞毒性作用，MSC和 DNTT-MSC可以释放显著量的FGF2。

实施例7：在高密度、缺氧、营养不良培养物中FGF2从MSC和 DNTT-MSC释放

当细胞被植入组织损伤(例如继发于梗塞)区域时，它们以高密度沉积到常常缺氧的环境中，其特征在于氧和营养物的有限扩散。为了模拟植入后的脑内微环境，将MSC或DNTT-MSC以 0.35×10⁶/350μl/孔的浓度在NB/B27/GLX中铺板到96孔板的圆底孔中。用PCR带紧密密封孔，以防止气体交换。培养基变得快速酸化，表明缺氧环境。大多数细胞保持不粘附；然而，即使在这种环境中培养5天后，培养物仍然含有一些活细胞，当在正常生长条件下再铺板时，其能够附着、生长和增殖。

在几个时间点收集孔的内容物，离心以分离CM与细胞和碎片，并将细胞沉淀物进行冻/融循环以从存活的细胞中释放细胞内内容物。因此，在每个时间点，收集上清液(300μl/孔，称为CM)，将沉淀重新悬浮在300μl NB中；并将上清液和重悬浮的沉淀物冷冻。收集所有时间点后，将所有样品解冻并通过离心(200g，10分钟)澄清。然后在CM和细胞沉淀物的冻融提取物中测定LDH活性和FGF2浓度(如实施例6所述)。在这些实验中，使用10⁶个细胞/1毫升NB产生CM 和细胞提取物。

结果如图6所示。MSC和DNTT-MSC中的细胞内FGF2含量在初次铺板的20小时内迅速下降，而释放的FGF2的水平(CM中)在 4h和2天之间保持稳定(图6A)。来自DNTT-MSC的FGF2释放水平显著高于来自MSC的FGF2释放水平(分别为2相对0.5ng/10⁶个细胞)。在第5天检测到CM中FGF2水平的降低。释放的FGF2在缺氧培养条件下稳定一段时间。

在低氧培养过程中，MSC和DNTT-MSC的LDH释放增加(图 6B)，正如对于死亡细胞群所预期的那样。然而，随着细胞内FGF2 水平下降，细胞内的LDH水平保持高的水平。这表明，在缺氧条件下，存活细胞减少其细胞内FGF2的产生。此外，DNTT-MSC通常在这些条件下比MSC更好地存活，如在稍后时间点的DNTT-MSC中更高水平的细胞内LDH所表明的。

因此，尽管细胞内FGF2在缺氧培养过程中从死亡细胞中释放，但存活细胞似乎降低其细胞内FGF2的产生。因此，植入培养细胞 (MSC或DNTT-MSC)的提取物可能比植入的细胞(其可能在植入后减少其细胞内FGF2储存)提供更高量的生物活性FGF2。

实施例8：FGF2与从DNTT-MSC释放的其它分子之间的协同作用

单独的重组FGF2(rFGF2，Peproptech，Rocky Hill，NJ)和与来自DNTT-MSC的条件培养基组合的重组FGF2对大鼠胚胎皮质细胞增殖的作用进行了评估，并与DNTT-MSC冻/融无细胞(E0)提取物的作用进行比较。如上述实施例2所述测量细胞增殖。

图7A显示rFGF对皮质细胞增殖具有轻微的刺激作用(图7A，三角形)；然而，rFGF2和DNTT-MSC CM的组合导致远更高的增殖率(图7A，圆圈)。该结果表明在DNTT-MSC条件培养基中存在与FGF2协同作用以刺激皮层细胞增殖的一种或多种组分。与假设加和效应的计算的剂量反应(图7A，正方形)的比较表明rFGF2和CM 的作用是协同的。

将rFGF2和DNTT-MSC CM的协同组合在皮质细胞增殖测定中与DNTT-MSC无细胞E0提取物进行比较。对于该实验，将皮质细胞暴露于不同浓度的单独的rFGF2或与稀释至75％的DNTT-MSC CM 组合的rFGF2，以及暴露于系列稀释的DNTT-MSC E0提取物。通过 ELISA测定E0提取物中的FGF2水平，显示未稀释的E0提取物中 FGF2浓度为3.5ng/ml。

结果如图7B所示。如前所述，rFGF2和CM协同作用以刺激增殖。DNTT-MSC无细胞E0提取物也刺激增殖。值得注意的是，半浓度E0提取物(含有约1.75ng/ml FGF2)具有与在条件培养基(通常含有不超过20pg/ml的FGF2)存在下的2.5ng/ml rFGF2大致相同的增殖诱导活性。

这些结果表明，DNTT-MSC含有一种或多种与FGF2协同作用以刺激神经细胞增殖的分子，并且可以分泌这样的分子。

实施例9：DNTT-MSC中细胞内FGF2的表征

天然存在的FGF2存在于18kD，22kD，22.5kD，24kD和34kD 的至少五种同种型中。重组FGF2仅含有低分子量(18kD)同种型(图 8，泳道2)。相比之下，使用RIPA缓冲液(ThermoFisher Scientific， Rockford，IL)制备并在变性Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶上分析的DNTT-MSC的全细胞裂解物包含至少三种FGF2同种型，如使用单克隆抗FGF2抗体(bFM2，(Millipore，Billerica，MA)检测的(图8，泳道1)。

通过分析各种类型的细胞裂解物和提取物制剂，研究了 DNTT-MSC中各种FGF2同种型的细胞内分布。通过在RIPA缓冲液 (Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)中裂解细胞获得来自 DNTT-MSC的总细胞裂解物。该缓冲液含有离子和非离子洗涤剂，并溶解细胞核和细胞质膜，从而释放细胞质、核和膜结合的细胞成分。通过在等渗缓冲液中裂解细胞、沉淀细胞核和细胞碎片并回收上清液来制备细胞质裂解物。用RIPA缓冲液提取胞质裂解物制备过程中获得的沉淀，以产生细胞核裂解物。将这些裂解物与如前所述通过使培养细胞进行冻/融循环然后通过离心澄清而制备的DNTT-MSC的无细胞E0提取物进行比较。因此，E0提取物含有通过机械损伤如膜破裂而释放的可溶性细胞组分。

通过在变性Tris-甘氨酸-SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳分析样品，并通过免疫印迹检测蛋白质。结果如图9所示，表明大多数FGF2存在于DNTT-MSC的细胞质中；并且无细胞的E0提取物主要含有细胞质材料。

间充质细胞如DNTT-MSC含有FGF2的几种同种型的事实可以解释DNTT-MSC提取物与重组FGF2相比的优越增殖诱导活性。参见例如图7B，实施例8。

实施例10：成纤维细胞的提取物促进神经前体细胞的增殖和分化

如实施例1所述，将人包皮成纤维细胞(HFF，ATCC 1041)用于制备冻融无细胞提取物和不溶性细胞残留级分。如实施例1所述测量这些级分中和HFF细胞裂解物中的FGF2水平，如实施例2所述测定这些级分刺激神经细胞增殖的能力。

图10A显示，HFF含有比MSC更高水平的细胞内FGF2。图10B 显示所有级分(细胞裂解物，无细胞(E0)提取物和细胞残留物)刺激神经前体细胞的增殖。两种HFF和MSC的刺激作用对于头蛋白 (noggin)(BMP抑制剂)不敏感(图10C)。由于星形胶质细胞前体的分化被BMP刺激，这一结果与神经元前体的增殖一致。

还使用实施例4中所述的方法，测试来自HFF的级分促进神经前体细胞分化的能力。如图11所示，结果表明，来自HFF的无细胞(E0) 提取物促进皮层细胞分化为巢蛋白阳性神经前体细胞，GFAP阳性星形胶质细胞和CNP阳性少突胶质细胞。

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Claims

5.权利要求3的方法，其中所述混合物包含分子量为18、22、22.5和24kD的FGF2同种型。

6.权利要求4的方法，其中所述混合物包含分子量为18、22、22.5和24kD的FGF2同种型。

7.权利要求3的方法，其中所述混合物具有比重组FGF2更高的生物活性。

8.权利要求4的方法，其中所述混合物具有比重组FGF2更高的生物活性。

9.权利要求3的方法，其中所述细胞是神经前体细胞。

10.权利要求3的方法，其中所述细胞是内皮细胞。

11.权利要求4的方法，其中所述受试者已经经历了缺血性损伤。

12.权利要求11的方法，其中所述缺血性损伤是中风。

13.权利要求3的方法，其中所述组织是坏死的。

14.权利要求13的方法，其中坏死是由梗塞或创伤性损伤引起的。

15.权利要求1的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。

16.权利要求2的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。

17.权利要求3的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。

18.权利要求4的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。

使组织与间充质细胞接触；

其中所述接触导致间充质细胞的裂解或破裂。

20.权利要求19的方法，其中所述FGF2同种型的分子量为18、22、22.5和24kD。

21.权利要求19的方法，其中所述混合物具有比重组FGF2更高的生物活性。

22.权利要求19的方法，其中所述组织包含一个或多个神经前体细胞。

23.权利要求19的方法，其中所述组织包含一个或多个内皮细胞。

24.权利要求19的方法，其中所述组织存在于已经经历缺血性损伤的受试者中。

25.权利要求24的方法，其中所述缺血性损伤是中风。

26.权利要求19的方法，其中所述组织是坏死的。

27.权利要求26的方法，其中坏死是由梗塞或创伤性损伤引起的。

28.权利要求19的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。

29.一种用于刺激神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法的间充质细胞的无细胞提取物，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞、MSC和DNTT-MSC。

30.一种用于刺激神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法的间充质细胞的细胞裂解物，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞、MSC和DNTT-MSC。

31.一种用于刺激神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法的间充质细胞的不溶性细胞残留物，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞、MSC和DNTT-MSC。

(a)成纤维细胞生长因子-2(FGF2)，和

33.权利要求32的组合，其中所述FGF2是重组的。

34.权利要求32的组合，其中所述FGF2是18kd同种型。

(a)活间充质细胞，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞、MSC和DNTT-MSC；和

36.权利要求35的组合，其中裂解细胞当量与活细胞的比例为3:1。

其中所述间充质细胞选自成纤维细胞、MSC和DNTT-MSC。

38.权利要求37的制剂，其中FGF2同种型的混合物含有分子量为18、22、22.5和24kD的FGF2同种型。

39.权利要求37的制剂，其中FGF2同种型的混合物具有比重组FGF2更高的生物学活性。

40.权利要求37的制剂，其中所述细胞是神经前体细胞或内皮细胞。

41.权利要求37的制剂，其中所述组织包含神经前体细胞和/或内皮细胞中的一种或多种。

42.权利要求37的制剂，其中所述组织或受试者已经经历了缺血性损伤。

43.权利要求42的制剂，其中所述缺血性损伤是中风。

44.权利要求37的制剂，其中所述组织是坏死的。

45.权利要求44的方法，其中坏死是由梗塞或创伤性损伤引起的。

46.一种刺激神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法；该方法包括使神经前体细胞或内皮细胞与权利要求32的组合接触。