CN107513551A - 神经源性因子和胶质生成性因子及其测定 - Google Patents

Abstract

本文中公开了用于测量物质或物质的来源促进神经发生和胶质生成的潜能的定量测定。还公开了促进神经发生和胶质生成的物质。

Description

神经源性因子和胶质生成性因子及其测定

本申请是申请号为201280048345.3的分案申请。

相关申请的参考

本申请要求2011年8月19日提交的美国临时专利申请号61/575,378和2011年12月28日提交的美国临时专利申请号61/580,991的利益；为了所有目的将所述美国临时专利申请的说明书和附图通过引用整体并入本文。

关于联邦政府资助的声明

不适用

领域

本申请涉及促进神经发生和胶质生成的物质以及用于这样的物质的测定的领域。

背景

间充质基质细胞包括一群称为间充质干细胞的多潜能干细胞(综述于[1]中)。成年哺乳动物的间充质干细胞(MSC)的主要来源是骨髓；获自骨髓的多潜能干细胞被称为下列不同名称：间充质干细胞(MSC)、骨髓粘附基质细胞(MASC)、骨髓粘附干细胞和骨髓基质细胞(BMSC)。间充质干细胞已被作为用于神经组织修复的潜在细胞疗法进行了研究(综述于[2]中)。MSC或MSC衍生物至神经系统的移植已显示在神经变性疾病包括中风、帕金森病、脊髓损伤、多发性硬化和新生儿缺氧缺血性脑损伤的许多模型中是有益的[3-9]。

目前的证据表明MSC或其衍生物的移植激活受损神经组织[9-13]和正常脑组织[14]中的内源性再生机制。这些再生过程包括内源神经干细胞的增强的增殖、新生儿神经元的增加的存活[10-11],胶质生成[7]以及炎症细胞因子产生的调节[15]。据认为神经保护作用和神经增殖的增强至少部分是通过由移植的细胞分泌的可扩散的神经营养因子和细胞因子介导的。事实上，已显示MSC在培养物中分泌许多生长因子[16,17]；并且分泌的生长因子的身份在神经变性环境中可通过移植来调节[18,19]。

因此重要的是鉴定由MSC及其衍生物产生的负责间充质细胞的神经源性活性和胶质生成活性的因子。MSC与神经细胞之间的体外相互作用的研究对产生适合于几种不同细胞类型(例如，神经元、神经胶质细胞、神经干细胞、间充质细胞)的培养条件提出了挑战，每一种类型对基底和生长培养基具有不同的要求。事实上，在大多数系统中，共培养条件(例如，血清的存在或不存在，或使用MSC单层作为少数神经细胞的基底)选择性地偏爱某些细胞，但以牺牲其它细胞为代价，这导致不一致的结果[23-26]并且阻止了MSC作用的充分定量。例如，某些培养系统有利于神经元但非神经胶质细胞的生长；还未发现同时支持神经前体细胞和3个主要类型的神经细胞(神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞)的生长的系统。

MSC和其它物质对神经干细胞的增殖和至不同神经谱系的分化(即，神经发生)的作用通常使用丝裂原驱动的神经球作为神经干细胞/早期前体细胞的来源在体外进行研究；随后通过将神经球涂铺在粘附基底上并且撤除促有丝分裂生长因子来诱导它们的分化[23-26]。然而，神经球中的细胞可能不反映神经前体细胞的天然库，因为它们的生长条件会选取对于非生理性的高浓度的生长因子和非附着型生长的响应者[27,28]。从而有可能的是，在共培养开始时，来源于神经球的细胞可能已被培养条件重编程。此外，在神经球共培养实验中，神经干细胞前体的生长状态难以观察，因为其存在于神经球自身内部的“盲点”中。最后，通过细胞附着状态的改变对神经分化的诱导可能在神经球系统中掩盖测试物质的作用。

为了上述原因，能够定量在相同条件下神经源性和胶质生成性因子对神经前体细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的作用的系统仍然是不可获得的

SB623细胞是通过用编码Notch1细胞内结构域的载体转染MSC从MSC衍生而来的。参见，例如，美国专利号7,682,825。先前的工作已显示由人MSC和从其衍生的SB623细胞产生的ECM在无添加的因子或血清的情况下有效地支持大鼠胚胎皮层细胞的生长和分化(29，也参见US 2010/0310529，为了描述由MSC和SB623细胞产生的ECM的某些性质，将其公开内容通过引用整体并入本文)。

如上所述，仍然存在对这样的简单精确的体外系统的需要：所述体外系统建立具有神经源性和/或胶质生成活性的物质(例如，MSC及其衍生物例如SB623细胞)与神经细胞的复杂群体的相互作用的模型，并定量这样的物质的效力。

概述

本文中提供了用于在最优化定量影响培养物中的不同神经细胞的生长和分化的因子的作用之能力的条件下，共培养MSC和/或其衍生物(例如，SB623细胞)与神经细胞群体的体外系统。

这些培养系统可用于提供用于测量物质(例如,MSC及其衍生物，例如SB623细胞、条件化培养基、多肽、有机化合物)对不同类型的神经细胞(例如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞)的作用的定量功能测定。具体地，可鉴定和定量神经营养性、神经源性、胶质营养性和胶质生成性因子以及这类因子的来源。

通过使用本文中描述的测定，已鉴定了许多具有神经源性活性和胶质生成活性的物质。

因此，本公开内容提供了，除其它以外，下列实施方案。

1.一种用于测试促进神经发生的物质的方法，所述方法包括：

(a)在固体基底上培养间充质干细胞(MSC)；

(b)从基底除去MSC，以便由MSC产生的细胞外基质保留在所述基底上；

(c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；

(d)将物质添加至步骤(c)的培养物中；和

(e)测量神经元的生长；

其中神经元的生长表明所述物质促进神经发生。

2.实施方案1的方法，其中所述MSC获自人。

3.实施方案1的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。

4.实施方案1的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。

5.实施方案1的方法，其中所述物质是化合物或多肽。

6.实施方案1的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。

7.实施方案6的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进神经发生。

8.实施方案1的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。

9.实施方案1的方法，其中神经元的生长通过轴突生长物或通过选自微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β-微管蛋白III型(TuJ1)、突触囊泡蛋白和神经元特异性烯醇化酶的标志物的表达来测量。

10.实施方案1的方法，其中将神经元的生长与不存在所述物质的情况下神经元的生长相比较。

11.一种用于测试促进胶质生成的物质的方法，所述方法包括：

(a)在固体基底上培养间充质干细胞(MSC)；

(b)从基底除去MSC，以便由MSC产生的细胞外基质保留在所述基底上；

(c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；

(d)将物质添加至步骤(c)的培养物中；和

(e)测量神经胶质细胞的生长；

其中神经胶质细胞的生长表明所述物质促进胶质生成。

12.实施方案11的方法，其中所述MSC获自人。

13.实施方案11的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。

14.实施方案11的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。

15.实施方案11的方法，其中所述物质是化合物或多肽。

16.实施方案11的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。

17.实施方案16的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进胶质生成。

18.实施方案11的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。

19.实施方案11的方法，其中将神经胶质细胞的生长与不存在所述物质的情况下神经胶质细胞的生长相比较。

20.实施方案11的方法，其中所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。

21.实施方案20的方法，其中所述星形胶质细胞的生长通过神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、Glast或谷氨酰胺合成酶的表达来测量。

22.实施方案11的方法，其中所述神经胶质细胞是少突胶质细胞。

23.实施方案22的方法，其中所述少突胶质细胞的生长通过选自2',3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNPase)、O1抗原、O4抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白的标志物的表达来测量。

24.一种用于测试促进神经发生的物质的方法，所述方法包括：

(a)在固体基底上培养细胞；其中所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代；

(b)从基底除去细胞；

(c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；

(d)将物质添加至步骤(c)的培养物中；和

(e)测量神经元的生长；

其中神经元的生长表明所述物质促进神经发生。

25.实施方案24的方法，其中所述MSC获自人。

26.实施方案24的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。

27.实施方案24的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。

28.实施方案24的方法，其中所述物质是化合物或多肽。

29.实施方案24的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。

30.实施方案29的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进神经发生。

31.实施方案24的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。

32.实施方案24的方法，其中神经元的生长通过轴突生长物或通过选自微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β-微管蛋白III型(TuJ1)、突触囊泡蛋白和神经元特异性烯醇化酶的标志物的表达来测量。

33.实施方案24的方法，其中将神经元的生长与不存在所述物质的情况下神经元的生长相比较。

34.一种用于测试促进胶质生成的物质的方法，所述方法包括：

(a)在固体基底上培养细胞；其中所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代；

(b)从基底除去细胞，以便由所述细胞产生的细胞外基质保留在所述基底上；

(c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；

(d)将物质添加至步骤(c)的培养物中；和

(e)测量神经胶质细胞的生长；

其中神经胶质细胞的生长表明所述物质促进胶质生成。

35.实施方案34的方法，其中所述MSC获自人。

36.实施方案34的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。

37.实施方案34的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。

38.实施方案34的方法，其中所述物质是化合物或多肽。

39.实施方案34的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。

40.实施方案34的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进胶质生成。

41.实施方案34的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。

42.实施方案34的方法，其中将神经胶质细胞的生长与不存在所述物质的情况下神经胶质细胞的生长相比较。

43.实施方案34的方法，其中所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。

44.实施方案43的方法，其中所述星形胶质细胞的生长通过神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、Glast或谷氨酰胺合成酶的表达来测量。

45.实施方案34的方法，其中所述神经胶质细胞是少突胶质细胞。

46.实施方案45的方法，其中所述少突胶质细胞的生长通过选自2',3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNPase)、O1抗原、O4抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白的标志物的表达来测量。

47.一种用于测试促进神经前体细胞(NPC)的生长的物质的方法，所述方法包括：

(a)在固体基底上培养间充质干细胞(MSC)；

(b)从基底除去MSC，以便由MSC产生的细胞外基质保留在所述基底上；

(c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；

(d)将物质添加至步骤(c)的培养物中；和

(e)测量神经前体细胞的生长；

其中NPC的生长表明所述物质促进NPC的生长。

48.实施方案47的方法，其中所述MSC获自人。

49.实施方案47的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。

50.实施方案47的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。

51.实施方案47的方法，其中所述物质是化合物或多肽。

52.实施方案47的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。

53.实施方案52的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进神经前体细胞的生长。

54.实施方案47的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。

55.实施方案47的方法，其中通过巢蛋白或SOX2的表达测量NPC的生长。

56.实施方案47的方法，其中将NPC的生长与不存在所述物质的情况下NPC的生长相比较。

57.一种用于测试促进神经前体细胞(NPC)的生长的物质的方法，所述方法包括：

(a)在固体基底上培养细胞，其中所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞(MSC)的后代；

(b)从基底除去细胞，以便由所述细胞产生的细胞外基质保留在所述基底上；

(c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；

(d)将物质添加至步骤(c)的培养物中；和

(e)测量NPC的生长；

其中NPC的生长表明所述物质促进NPC的生长。

58.实施方案57的方法，其中所述MSC获自人。

59.实施方案57的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。

60.实施方案57的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。

61.实施方案57的方法，其中所述物质是化合物或多肽。

62.实施方案57的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。

63.实施方案62的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进神经前体细胞的生长。

64.实施方案57的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。

65.实施方案57的方法，其中所述NPC的生长通过巢蛋白、Glast或SOX2的表达来测量。

66.实施方案57的方法，其中将NPC的生长与不存在所述物质的情况下NPC的生长相比较。

67.一种用于测试促进神经前体细胞(NPC)的分化的物质的方法，所述方法包括：

(a)在固体基底上培养间充质干细胞(MSC)；

(b)从基底除去MSC，以便由MSC产生的细胞外基质保留在所述基底上；

(c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；

(d)将物质添加至步骤(c)的培养物中；和

(e)测量NPC的分化；

其中NPC的分化表明所述物质促进NPC的分化。

68.一种用于测试促进神经前体细胞(NPC)的分化的物质的方法，所述方法包括：

(a)在固体基底上培养细胞，其中所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞(MSC)的后代；

(b)从基底除去细胞，以便由所述细胞产生的细胞外基质保留在所述基底上；

(c)在步骤(b)的基底上培养胚胎皮层细胞；

(d)将物质添加至步骤(c)的培养物中；和

(e)测量NPC的分化；

其中NPC的分化表明所述物质促进NPC的分化。

69.实施方案67或68的任一个的方法，其中所述MSC获自人。

70.实施方案67或68的任一个的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。

71.实施方案67或68的任一个的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。

72.实施方案67或68的任一个的方法，其中所述物质是化合物或多肽。

73.实施方案67或68的任一个的方法，其中所述物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。

74.实施方案73的方法，其中在细胞表面表达的蛋白质促进神经发生。

75.实施方案67或68的任一个的方法，其中所述物质是来自细胞培养物的条件化培养基。

76.实施方案67或68的任一个的方法，其中将NPC的分化与不存在所述物质的情况下NPC的分化相比较。

77.实施方案67或68的任一个的方法，其中NPC的分化通过轴突生长物，或通过选自微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β-微管蛋白III型(TuJ1)、突触囊泡蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、谷氨酰胺合成酶、GLAST谷氨酸转运蛋白、2',3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNPase)、O1抗原、O4抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白的标志物的表达来证明。

78.一种包含固体基底与沉积在其上的生物层的组合物，其中所述生物层是由如下(a)或(b)沉积的细胞外基质：

(a)间充质干细胞(MSC)，或

(b)已用核酸转染的MSC，其中所述核酸编码Notch细胞内结构域但不编码全长Notch蛋白。

79.实施方案78的组合物，其中所述MSC获自人。

80.实施方案78的组合物，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。

81.实施方案78的组合物,其还包含胚胎皮层细胞。

82.实施方案81的组合物，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。

83.实施方案81的组合物，其还包含测试物质。

84.实施方案83的组合物，其中所述测试物质是化合物或多肽。

85.实施方案83的组合物，其中所述测试物质是细胞或细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代(SB623细胞)。

86.实施方案83的组合物，其中所述测试物质是来自细胞培养物的条件化培养基。

87.一种用于测定物质对神经生成、神经发生、星形胶质细胞发生或少突胶质细胞发生的效应的试剂盒；所述试剂盒包括实施方案78-86的任一项的组合物。

88.实施方案87的试剂盒，其还包括一种或多种用于检测神经元或神经胶质标志分子的试剂。

89.实施方案88的试剂盒，其中所述检测是通过免疫组织化学。

90.实施方案89的试剂盒，其中所述试剂包括一种或多种抗体。

91.实施方案90的试剂盒，其中所述一种或多种抗体特异于选自如下的一种或多种抗原：微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β-微管蛋白III型(TuJ1)、突触囊泡蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、Glast、谷氨酰胺合成酶、2',3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNPase)、O1抗原、O4抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白。

92.实施方案88的试剂盒，其中所述检测是通过定量逆转录酶/聚合酶链式反应(qRT-PCR)。

93.实施方案92的试剂盒，其中所述试剂包括一种或多种寡核苷酸引物或寡核苷酸探针。

94.实施方案93的试剂盒，其中所述一种或多种寡核苷酸引物或寡核苷酸探针特异性检测编码选自下列的蛋白质的核酸：微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、β-微管蛋白III型(TuJ1)、突触囊泡蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、Glast、谷氨酰胺合成酶、2',3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNPase)、O1抗原、O4抗原、髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白。

附图概述

图1A和1B显示ECM涂覆的板上单独的大鼠神经细胞(表示为"N")或与MSC共培养的大鼠神经细胞(表示为"M")的增殖的测量结果。图1A显示3个不同的时间点(共培养开始后第1天、第5天和第7天)的共培养物中的DAPI-染色的神经细胞(非-MSC)的细胞核的数目的测量。对于每一对条柱，最左边的条柱表示活神经细胞的数目，最右边的条柱表示死神经细胞的数目，如通过细胞核形态学评价的。图1B显示单独培养的(表示为"N")或与MSC共培养的(表示为"M")神经细胞以及在大鼠神经细胞不存在的情况下培养的MSC的细胞数目，如通过大鼠noggin基因的相对水平测定的。显示了两个时间点(第1天和第7天)的数据。

图2，图框A至E，显示在ECM涂覆的板上进行的大鼠神经细胞(N)的培养物和大鼠神经细胞与MSC(N+M)的共培养物中双皮质素(DCX)(图2A)、微管相关蛋白-2(MAP2)(图2B)、巢蛋白(Nes)(图2C)、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)(图2D)和2',3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNP)(图2E)的mRNA的表达的时间过程。共培养物包含200个MSC/细胞。"天数"是指共培养开始后的天数。

图3显示定量PCR研究的结果，该结果表明大鼠E18皮层细胞中编码不同神经标志物的RNA的表达在生长于细胞外基质(ECM)上的共培养物中是MSC剂量依赖性的。在第5天评价了大鼠巢蛋白(rNes)、MAP2(rMAP2)和CNPase(rCNPase)基因表达的MSC-剂量反应，在第7天评价了大鼠GFAP(rGFAP)和人GAP(huGAP)表达。在任何大鼠表达测定中未检测到来自单独的人MCS或SB623细胞的信号，并且在人GAP表达测定中未检测到来自大鼠细胞的信号。

图4显示通过qRT-PCR测定的，ECM涂覆的板上的大鼠神经细胞与MSC的共培养物中的不同标志物的相对表达水平。大鼠标志物是巢蛋白(Nes)、CNPase(CNP)、双皮质素(DCX)、微管相关蛋白-2(MAP2)、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)和甘油醛3-磷酸脱氢酶(ratGAP)。用于鉴定和定量培养物中的MSC的人标志物是甘油醛3-磷酸脱氢酶(huGAP)。在5天的共培养后测定巢蛋白和CNPase的表达；在7天的共培养后测定所有其它标志物。在最低MSC剂量(32个细胞/孔)时的水平被人为指定为表达水平为1。

图5显示MSC浓度对ECM涂覆的板上的共培养物的两个不同时期的CNPase mRNA表达水平的作用。通过qRT-PCR定量CNPase mRNA水平。将在特定的测定日(第5天或第7天)观察到的最高水平人为设定为相对表达水平为1。

图6显示在非附着条件下进行的大鼠神经细胞与MSC的共培养物中标志物表达的水平。还在无MSC但存在bFGF和EGF的情况下培养神经细胞作为对照。对于每一组条件，条柱从左至右表示大鼠巢蛋白(rNes)、大鼠微管相关蛋白-2(rMAP2)、大鼠神经胶质原纤维酸性蛋白质(rGFAP)、大鼠双皮质素(rDCX)、大鼠2',3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶(rCNPase)、大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶(rGAP)和人甘油醛3-磷酸脱氢酶(huGAP)的表达水平。在bFGF/EGF存在的情况下神经标志基因表达水平被赋予等于1的值，除GFAP外的所有其他标志物相应地表达为其他值，GFAP在bFGF/EGF样品中被赋予等于0.1的值。

图7显示在不同附着条件下进行的大鼠神经细胞和MSC的共培养物中标志物表达的水平。"ECM"表示用SB623细胞衍生的细胞外基质涂覆的板上的共培养物。"Orn/FN"表示用鸟氨酸和纤连蛋白涂覆的板上的共培养物。"ULA"表示Ultra Low Attachment板上的培养物。在ECM和Orn/FN板上，将神经细胞与MSC以10:1的比率(1.5x 10⁴个细胞/cm²)共培养。在ULA板上，将神经细胞与MSC以2:1的比率("+MSC,5X")一起培养或在MSC不存在的情况下培养在补充有生长因子("FGF2/EGF")的培养基中。对于每一组条件，条柱从左至右表示大鼠巢蛋白(Nes)、大鼠2',3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNPase)、大鼠神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、大鼠双皮质素(DCX)和人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(huGAP)的表达水平。在培养或共培养5天("5d")后测试巢蛋白和CNPase水平；在7天("7d")时测定所有其它标志物。

图8显示肝素酶对神经细胞的巢蛋白mRNA的表达的作用。将大鼠皮层细胞培养在ECM涂覆的板上。在涂铺皮层细胞之前，ECM涂覆的板已用两个浓度的肝素酶I(0.5个单位/ml和1.5个单位/ml)或用肝素酶缓冲液(H-缓冲液")处理或未处理("无添加")。巢蛋白mRNA表达在培养开始后5天利用qRT-PCR来测定。未处理的ECM涂覆的板上培养的细胞中检测到的巢蛋白mRNA的量被人为地赋予等于1的相对表达水平。

图9A-9D显示通过qRT-PCR测定的、纯化的生长因子(EGF,BMP6,HB-EGF)和MSC条件化培养基(CM)对由在ECM涂覆的板上培养的神经细胞产生的编码不同神经标志物的mRNA的相对表达水平的作用。图9A显示对巢蛋白(神经前体细胞的标志物)的表达的作用。图9B显示对双皮质素(DCX)(新生神经元的标志物)的表达的作用。图9C显示对CNPase(少突胶质细胞的标志物)的表达的作用。图9D显示对GFAP(星形胶质细胞的标志物)的表达的作用。

图10显示抗-FGF2中和抗体对ECM涂覆的板上的神经细胞/MSC的共培养物中的神经细胞的巢蛋白表达的作用。将大鼠皮层细胞(5,000个细胞)本身(“无MSC”)单独培养或与200MSC一起("+MSC")共培养。另外的共培养样品还包含中和性抗-FGF2抗体("+MSC+bFM1")或非中和性抗-FGF2抗体("+MSC+bFM2")。在培养或共培养开始后5天测定巢蛋白表达。在MSC不存在的情况下培养的皮层细胞的巢蛋白表达水平被人为地赋予等于1的相对表达值。

图11显示MSC条件化培养基和FGF2被耗尽的MSC条件化培养基对培养的大鼠神经细胞的巢蛋白表达的作用。将大鼠皮层细胞在无其它添加("无添加")的情况下与MSC条件化培养基("CM")，与已通过免疫沉淀耗尽了FGF2的MSC条件化培养基("FGF2被耗尽的CM")，与利用不与FGF2反应的对照抗体处理的MSC条件化培养基("IP-对照-CM")一起在ECM涂覆的板上进行培养。在培养开始后5天测定巢蛋白表达。在条件化培养基不存在的情况下培养的皮层细胞的巢蛋白表达水平被人为地赋予等于1的相对表达值。

图12显示由在200个间充质干细胞("+MSC,200个细胞")或来自间充质干细胞的条件化培养基的1:10稀释物("+CM,10％")存在的情况下在ECM涂覆的板上培养的神经细胞表达的编码巢蛋白(Nes)和神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)的mRNA的水平。在MSC或条件化培养基不存在("无添加")的情况下培养对照细胞。在培养开始后5天进行巢蛋白的测定；在培养开始后7天进行GFAP的测定。与MSC的共培养物中表达的每一种标志物的水平被人为地赋予等于1的相对表达值。

图13显示在培养或共培养开始后7天测定的ECM涂覆的板上培养的大鼠皮层细胞中的GFAP mRNA的水平。将皮层细胞与MSC("MSC")共培养，在30ng/ml重组noggin蛋白存在的情况下与MSC共培养("MSC+noggin")，或在抗-BMP4抗体存在的情况下与MSC共培养("MSC+抗-BMP4")。将与MSC共培养物中表达的GFAP mRNA水平人为地赋予等于1的相对表达值。

图14显示ECM涂覆的板上大鼠神经细胞和MSC的共培养物中的人骨形态发生蛋白-4("huBMP4")、人甘油醛3-磷酸脱氢酶("huGAP")、人成纤维细胞生长因子-2("huFGF2")和大鼠神经胶质原纤维酸性蛋白质("rGFAP")的mRNA表达水平。在共培养之前，用靶向人BMP-4序列的siRNA库("N+siBMP4-MSC")或对照非-BMP4-靶向的siRNA("N+siContr-MSC")转染MSC。还在MSC不存在(“单独的N”)的情况下单独地培养神经细胞。

详述

已经证明难以建立支持各种不同类型的神经细胞的生长和分化的体外培养条件。本发明人设计了其中神经前体细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞全都能够生长和分化的体外培养系统。本文中公开的培养系统从而第一次允许定量评价测试物质对神经细胞的生长和分化的作用。该系统包括在测试物质存在的情况下在细胞外基质上培养神经细胞(例如啮齿类动物胚胎皮层细胞)，随后分析神经细胞培养物的一种或多种标志分子的表达。这些测定中使用的细胞外基质由如下细胞产生：(a)间充质干细胞，或(b)已用核酸转染的间充质干细胞，其中所述核酸编码Notch细胞内结构域但不编码全长Notch蛋白(例如，SB623细胞)。

该系统的不同方面促成其提供关于各种神经源性和胶质生成因子的效力的定量信息的能力。在一个方面，将神经细胞培养在由MSC或SB623细胞(通过用包含编码Notch细胞内结构域的序列的载体转染MSC而从MSC衍生的细胞)产生的细胞外基质上。在另一个方面，选择将神经细胞与测试物质共培养的时间的量来最优化待测定的标志物的检测和定量。测定前共培养的持续时间对于每一个标志物是独特的。例如，对于巢蛋白和CNPase的测量进行5天的共培养；对于GFAP、DCX和MAP2的测量进行7天的共培养。在另一个方面，最优化培养的细胞的浓度。例如，以1.5x 10⁴个细胞/ml的浓度使用神经细胞；以0.5-1.5x 10³个细胞/ml的浓度使用MSC和SB623细胞。

本文中公开的定量测定系统使用来自间充质细胞例如MSC及其衍生物(例如，SB623细胞)的ECM作为用于测试物质(例如,MSC或其衍生物SB623细胞、条件化培养基、生长因子、细胞因子)与神经细胞群体的共培养的生物基底，并且提供了有利于间充质细胞和神经细胞的生长的培养系统。这样的系统继而允许定量间充质细胞以及其它细胞和物质对不同类型的神经细胞的生长和分化的作用。

本文中描述的测定的有利方面包括下列事实：发育转变在生理条件下和整个生理时间过程中发生，而不是响应于异常物理条件例如附着或聚集而发生(参见神经球培养)。此外，待测定的细胞的发育期可容易地确定，因为发育不会在神经球的内部发生。最后，本文中公开的测定不需要外部生长因子；从而允许在该系统中定量这样的因子的作用。

通过使用该系统，本发明人已确定：间充质细胞ECM不仅支持神经细胞群(例如，胚胎皮层细胞)的生长，而且MSC或SB623细胞向在间充质细胞ECM上生长的神经细胞群体中的添加显著增强了所有神经谱系(例如，神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)的生长和分化。

与现有共培养系统相比较，低得多的间充质细胞对神经细胞的比率能够在本文中描述的基于ECM的共培养中诱导神经细胞的显著生长和分化。例如，本文中描述的测定系统的灵敏性足以检测约50个间充质细胞对5,000个神经细胞的作用。

本文中提供的是神经源性和胶质生成因子以及促进神经前体细胞的生长和分化的因子的定量测定。所述测定还可用于鉴定和定量这样的因子的来源，例如细胞培养物或条件化培养基。

为了进行测定，将MSC或SB623细胞(统称为"间充质细胞")生长在容器中，例如组织培养皿，进行足以让细胞在容器表面上留下细胞外基质的时间。任何固体基底可用作在其上生长细胞的表面，只要其支持细胞的生长和让细胞产生细胞外基质。适当的基底包括塑料、玻璃或硝酸纤维素。此外，可用物质例如纤连蛋白或胶原或重建的基膜例如Matrigel^TM涂覆基底。

适当的基底的实例是塑料组织培养皿或培养瓶。可按需将细胞生长1天、2天、3天、1周、2周、1个月或其间任意时间间隔。关于由MSC和SB623细胞产生的ECM的其它详细内容，参见美国专利申请公布号2010/0310529，为了描述由MSC和SB623细胞(在该公布中称作"MASC的分化限制的后代")产生的ECM及其性质的目的，将其公开内容通过引用并入本文。

MSC可通过从骨髓样品选择附着细胞来获得。骨髓可商购获得(例如，来自Lonza,Walkersville,MD)或来自骨髓生物活检组织。间充质干细胞的其它来源包括例如脂肪组织、牙髓、脐带血、胎盘和蜕膜。MSC可获自任何动物，包括哺乳动物，并且包括人。

MSC的示例性公开内容提供于美国专利申请公布号2003/0003090；Prockop(1997)Science 276:71-74和Jiang(2002)Nature 418:41-49。用于分离和纯化MSC的方法可见于例如美国专利号5,486,359；Pittenger等人(1999)Science 284:143-147和Dezawa等人(2001)Eur.J.Neurosci.14:1771-1776。人MSC可商购获得(例如，BioWhittaker,Walkersville,MD)或可通过例如骨髓穿刺，随后选择附着骨髓细胞而从供体获得。参见，例如，WO 2005/100552。

SB623细胞通过用包含编码Notch细胞内结构域(NICD)但不编码全长Notch蛋白的序列的载体转染MSC(以便转染的细胞表达外源NICD但不表达外源全长Notch蛋白)而从MSC产生。用于获得MSC和用于从MSC群体衍生SB623细胞的方法描述于例如美国专利号7,682,825和美国专利申请公布号2010/0266554中，为了描述MSC和SB623细胞以及获得这些细胞的方法，将所述专利和专利申请公布的公开内容通过引用并入。

在于基底上生长预定量的时间后，从基底除去MSC或SB623细胞，从而留下沉积在基底上的细胞外基质。从基底除去细胞的方法在本领域是公知的。在本文中公开的方法的实践中，必须足够温和地从基底除去细胞，以便由细胞产生的ECM保留在基底上。这样的方法包括例如利用非离子型去垢剂(例如，Triton X-100,NP40)和碱(例如NH₄OH)的处理。关于其它内容参见下文中的"实施例"部分。

随后将含ECM基底用作用于神经细胞与一种或多种测试物质的共培养的基底，测定并定量测试物质对神经细胞的作用。可同时或以任一顺序将神经细胞和测试物质引入培养物。

可使用任何类型的神经细胞或神经细胞群体；这样的细胞在本领域是已知的。神经细胞群体的方便来源是啮齿类动物胚胎皮层细胞(例如，来自大鼠或小鼠)，其可商购获得(BrainBits,Springfield,IL)。在某些实施方案中，在神经前体细胞中富集神经细胞群体。

测试物质可以是任何化合物、大分子(例如，核酸或多肽)、细胞、细胞培养物、细胞级分或组织，或其组合。例如，生长因子和细胞因子、低分子量有机化合物、mRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、反义RNA分子、核酶、DNA分子、DNA或RNA类似物、蛋白质(例如，转录调控蛋白)、抗体(例如，中和性抗体)、酶(例如，核酸酶)、糖蛋白、聚糖、蛋白聚糖、细胞、细胞膜制剂、细胞培养物、来自细胞培养物的条件化培养基、亚细胞级分和组织切片或组织级分全都是适当的测试物质。测试物质还可包括电磁辐射例如X-射线、光(例如，紫外、红外)或声音(例如，亚声或超声辐射)。在某些实施方案中，蛋白质与与针对蛋白质的中和抗体的组合被用作测试物质。

天然存在的测试物质可包括由细胞合成和分泌的可溶性分子(例如，蛋白质)，以及由细胞合成、被转运至细胞表面，并且仍然嵌入细胞表面、分子的全部或部分暴露于细胞的外部的分子(例如，蛋白质)(即，表面分子、表面蛋白或表面糖蛋白)。

将神经细胞和测试物质共培养适当量的时间，如由本方法的实施者决定的。例如，共培养可进行1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、1个月或其间的任意时间间隔。

测试物质对神经细胞的作用通过测量神经细胞的一种或多种标志物的表达来测定。取决于选择的标志物，可能测定神经前体细胞、神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞的形成。

在一个实施方案中，特定蛋白质(天然的或重组的)对神经发生或胶质生成的作用可通过将该蛋白质添加至在MSC或SB623ECM上生长的神经细胞的培养物、并且测定适当的神经元或神经胶质标志物来测定。任选地，低浓度(1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或其间的任意值)的来自MSC或SB623细胞的条件化培养基也可包括在培养物中。例如，条件化培养基的加入可提供除了待测试的因子外的研究过程所需的另外的因子，从而允许评价多因子信号转导系统的一个组分的作用。

神经前体细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的分子和形态发生标志物在本领域是公知的；下列标志物被提供来作为实例。

神经前体细胞的标志物包括例如巢蛋白，谷基酸转运蛋白(GLAST)、3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-PGDH,星形胶质细胞前体)、ephrin B2(EfnB2)、Sox2、Pax6和musashi。在某些实施方案中，增殖能力也可用作神经前体细胞的标志物。增殖能力可以例如通过溴脱氧尿苷的掺入、羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记、Ki-67的表达或增殖细胞核抗原(PCNA)的表达来测量。

神经元的标志物包括例如微管相关蛋白2(MAP2)、β-微管蛋白同种型III(也称为β-III微管蛋白和TuJ-1)、双皮质素(DCX)、神经丝蛋白质(例如，神经丝-M)、突触囊泡蛋白和神经元特异性烯醇化酶(也称为烯醇化酶-2和γ烯醇化酶)。轴突生长物也可用作神经元发育的标志物。

其它神经元标志物列于下表中：

神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)、谷基酸转运蛋白(GLAST)、3-PGDH和谷氨酰胺合成酶可用作星形胶质细胞的标志物。

少突胶质细胞的标志物包括例如A2B5抗原、半乳糖脑苷脂(GalC)、2',3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNPase)、O1抗原、O4抗原,髓磷脂碱性蛋白、少突胶质细胞转录因子1、少突胶质细胞转录因子2、少突胶质细胞转录因子3、NG2和髓磷脂相关糖蛋白。

标志物的表达可通过本领域公知的技术来测量。例如，蛋白质的表达可通过免疫荧光、免疫组织化学(IHC)、ELISA和蛋白质印迹(例如，Western印迹)来测量和定量。

mRNA的表达可通过方法包括例如印迹法、核酸酶保护法和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)来进行测量和定量。

取决于测试物质和待测定的标志，可能必需确保测定对于由神经细胞产生的分子是特异性的并且不与由测试物质产生的相同或相似分子交叉反应，特别是当测试物质是细胞例如MSC或SB623细胞时。例如，MSC表达巢蛋白；从而，如果巢蛋白将被测定为大鼠皮层细胞与人MSC的共培养物中的神经前体细胞的标志，则在测定中使用特异于大鼠巢蛋白的抗体。类似地，如果测定核酸表达，例如通过定量逆转录酶/聚合酶链式反应(qRT-PCR)或TaqMan，则使用物种特异性引物(和探针，如果适用的话)。

在某些实施方案中，将上述测定(即神经细胞与测试物质的共培养物)中的神经细胞的标志物的表达与在所述测试物质不存在的情况下神经细胞中相同标志物的表达相比较。

本文中描述的测定还可用于通过测量神经前体细胞(NPC)的后代的特征性标志物的表达来定量NPC的分化，所述NPC的后代包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。这样的标志物在本领域是公知的，并且在本文中描述了示例性标志物。

在某些实施方案中，提供了用于测定测试物质的神经源性或胶质生成潜能的试剂盒或用于测定物质促进神经元前体细胞的生长和/或分化的能力的试剂盒。试剂盒包括MSC和SB623细胞的之一或二者(任选地以冷冻保存的状态)以及一个或多个培养容器和任选地培养基，以允许用户在培养容器中生长MSC或SB623细胞。试剂盒还可包括用于从培养容器除去MSC或SB623细胞以留下沉积在培养容器表面上的细胞外基质的试剂(例如，非离子型去垢剂例如Triton X-100或Nonidet P-40；氢氧化铵)。试剂盒还可包括神经细胞(例如，大鼠E18皮层细胞)的样品。还可在试剂盒中包括针对不同神经元和神经胶质标志物的标记抗体；还可包括特异于编码神经元和神经胶质标志物的mRNA的寡核苷酸探针和/或引物。可在试剂盒中包括任何类型的检测神经元或神经胶质标志物(例如，蛋白质)或其编码mRNA的试剂。还可在试剂盒中包括适合用于免疫组织化学、FACS、RT-PCR、电生理学和药理学的试剂和/或缓冲液和/或装置。

在另一个实施方案中，本文中公开的试剂盒可包括一个或多个培养容器，其上沉积了来自MSC或SB623细胞的ECM。这样的试剂盒可任选地包括神经细胞和检测神经元和/或神经胶质标志物的试剂(例如，抗体、探针、引物)。这样的试剂盒还可任选地包括适合用于免疫组织化学、FACS、RT-PCR、电生理和药理学的试剂和/或缓冲液。

在另一个实施方案中，试剂盒可包括来自MSC或SB623细胞的纯化的细胞外基质(或其混合物)，以应用于培养容器。

在其它实施方案中，试剂盒包括具有沉积在其上的生物层的固体基底(例如，培养容器)，其中生物层是由如下(a)或(b)沉积的细胞外基质：

(a)间充质干细胞，或

(b)已用核酸转染的间充质干细胞，其中所述核酸编码Notch细胞内结构域但不编码全长Notch蛋白。

在试剂盒的操作中，在测试物质存在的情况下，将神经细胞与来自MSC或SB623细胞的细胞外基质接触生长，随后分析神经细胞的选择的神经元或神经胶质标志物的表达。对于某些上述试剂盒，ECM在培养容器上的沉积(通过MSC和/或SB623细胞)和产生ECM的细胞的去除由用户在添加神经细胞和测试物质至培养容器之前进行。

实施例

一般方法

MSC和SB623细胞制备

已描述了MSC和SB623细胞制备[29]。简而言之，将成年人骨髓抽吸物(Lonza,Walkersville,MD)生长在补充有10％胎牛血清(FBS)(Hyclone,Logan,UT)、2mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素(两者来自Invitrogen,Carlsbad,CA)的αMEM(Mediatech,Herndon,VA)中。在第二次传代时，将一些细胞冷冻保存(MSC制剂)，将一些细胞涂板以用于制备SB623细胞。为了制备SB623细胞，用编码人Notch 1细胞内结构域(NICD)的pCI-neo表达质粒转染MSC。在1天的培养后，将转染的细胞置于利用G418(Invitrogen)的选择之下，进行7天，随后除去选择，生长培养物，通过传代2次扩增培养物。随后收获SB623细胞，使用Cryostor CS5(BioLife Solutions,Bothell,WA)冷冻保存。将来自3个不同供体的细胞用于本文中描述的研究。将MSC和SB623细胞解冻，在使用之前用αMEM洗涤一次。为了进行共培养实验，将细胞重悬浮于由补充有2％B27和0.5mM GlutaMAX(全部来自Invitrogen)的Neurobasal培养基组成的神经生长培养基中。为了产生ECM涂层或产生条件化培养基(CM)，将细胞涂板于补充有10％FBS和青霉素/链霉素的αMEM中涂板。

板的涂覆

为了制备用ECM涂覆的孔，将SB623细胞以3x10⁴个细胞/cm²涂板在96孔板中或盖玻片(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)上，所述盖玻片被置于12孔板中(全部板购自Corning Inc,Corning,NY)，让其生长5天。随后，将培养基更换成不含血清的培养基，将细胞再培养2天。随后使用先前描述的方案[29]加以一些改进，从ECM除去细胞。简而言之，利用水中的0.2％的Triton X-100(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在室温处理细胞40分钟；随后小心地抽吸细胞裂解物，缓慢地添加浓NH₄OH(Sigma-Aldrich)的1:100(v/v)水溶液，进行5-7分钟，随后将其除去。为了洗涤，用PBS完全充满孔，温育至少3小时。立即使用孔或将其在4℃贮存。

条件化培养基(CM)的制备

将MSC或SB623细胞以3x10⁴个细胞/cm²涂板，在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的αMEM中生长3-4天直至汇合。随后用Neurobasal培养基(Invitrogen)替代培养基，将培养物温育1-2小时。弃去该培养基，用新鲜Neurobasal培养基替代，通常使用一半体积来进行细胞生长。将细胞温育24小时，随后收集培养基，通过离心除去颗粒物质。将该培养基按等份分配，于-70℃贮存。使用前，用2％B27和0.5mM GlutaMAX补充MSC-CM制剂。

大鼠胚胎脑皮层细胞的制备

大鼠胚胎(E18)脑皮层对购自BrainBits(Springfield,IL)；如所描述[29]制备细胞悬浮液。简而言之，将皮层用0.25％胰蛋白酶/EDTA在37℃温育5-7分钟，除去胰蛋白酶。用含有10％FBS的αMEM洗涤组织，随后用PBS进行洗涤。随后添加浓度为0.25mg/ml的DNA酶(MP Biomedicals,Solon,OH)，通过涡旋30秒混合管的内容物。研磨所得的细胞悬浮物，用PBS稀释，沉淀，随后重悬浮于神经生长培养基(上文中描述的)。

共培养实验

用一部分神经生长培养基预温热如上所述涂覆的板，随后添加不同数目的间充质细胞。随后，以1.5x10⁴个细胞/cm²的密度将神经细胞添加至除对照孔外的所有孔中，将培养物温育指定的时间。对于每一个时间点，使用包含一式四份样品的单独的板。为了进行定量，将细胞涂板在96孔板中，以始于1.5x10³个细胞/cm²(即，500个细胞/孔)的递减密度添加MSC或SB623细胞。为了进行免疫染色，将培养物涂板在12孔板中的ECM涂覆的盖玻片上。除非另外指出，否则以1.5x10³个细胞/cm²的恒定细胞密度添加MSC或SB623细胞。

在一个实验亚组(其中将细胞(MSC或SB623)的作用与它们的条件化培养基的作用相比较)中，在实验开始之前，将细胞的冷冻保存的等份用于产生条件化培养基，在实验当天将来自相同供体的细胞的等份解冻，以产生对应的细胞悬浮物。如上所述以递减浓度使用细胞，以始于50％的总培养基的递减浓度使用条件化培养基。为了定量基因表达，对于每一个神经标志物，使用相同标准曲线在相同PCR板上测试所有培养条件。

在共培养实验过程中(所述实验在96孔格式中持续7-8天，对于盖玻片上的细胞持续达14天)不改变培养基。未观察到培养衰退的征兆，当在培养的最后一天使用台盼蓝染色排除法评价时，神经细胞的存活性高于95％。

在另一组实验中，当在非附着条件下共培养细胞时，使用Ultra-Low AdhesionCostar 12或24孔板。将间充质细胞与神经细胞以指定的量混合，涂板在神经生长培养基中。作为对照，单独生长神经细胞，或在20ng/ml或50ng/ml的EGF和FGF2(购自R&D Systems(Minneapolis,MN)或Peprotech(Rocky Hill,NJ))的每一种存在的情况下生长神经细胞。在整个实验过程(2周)中不改变培养基。

免疫细胞化学

用4％多聚甲醛(Electron Microscopy Science,Hatfield,PA)固定生长于盖玻片上的培养物，进行20分钟，用PBS洗涤一次，在含有10％正常驴血清(JacksonImmunoresearch,West Grove,PA)、1％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)、0.1％Triton X-100的封闭溶液中温育30分钟。随后将抗大鼠巢蛋白的山羊多克隆抗体(R&D Systems,Cat#AF2736)以1:1000添加至封闭溶液中，在4℃温育过夜。用PBS洗涤盖玻片，随后添加兔多克隆抗-神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)(Dako,Denmark)(1:2000)、鼠单克隆抗-微管相关蛋白2(MAP2)(Sigma-Aldrich)(1:1000)或鼠单克隆抗-2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNPase)(Millipore,Billerica,MA)(1:200)，将盖玻片在室温温育1小时。洗涤后，用二抗温育1小时：与缀合有DyLight 549 488的IgG的AffiniPure抗-兔F(ab')₂片段(1:2000)或缀合有Cy3的AffiniPure驴抗-鼠IgG(1:1000)组合的缀合有DyLight 488的IgG的AffiniPure驴抗-山羊F(ab')₂片段(1:1000)，所述二抗全部来自JacksonImmunoresearch，并且全部被制造商选择来用于多重标记。在用PBS和水洗涤后，使用包含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen)的ProLong Gold抗衰退剂封片。

在一些实验中，在固定之前，将细胞用10uM 5-溴-2'-脱氧尿苷(BRDU,来自Sigma-Aldrich)(具有或不具有浓度为50ug/ml的丝裂霉素)温育细胞7-8小时。随后用2％PFA固定培养物，用0.5％Triton进行透化，在37℃用含有0.15M NaCl和4.2mM MgCl₂的缓冲液中的脱氧核糖核酸酶(MP Biomedicals,Solon,OH)处理1h。随后用冷甲醇(Fisher Scientific,Fair Lawn,NJ)后固定培养物，进行10分钟。在如上所述封闭后，用抗-BRDU单克隆抗体(BDPharmingen)，随后用上述抗-小鼠第二抗体进行温育，随后用缀合有Alexa Fluor的TUJ1(一种神经元III类β-微管蛋白特异性抗体)(Covance,Princeton,NJ)温育培养物。

使用Nikon Eclipse50i(Nikon Instruments,Melville,NY)和Nikon数码相机DXM1200C进行荧光显微镜检查。

在本文中描述的条件下，抗体都不与间充质细胞反应。

基因表达的定量

为了定量编码不同神经标志物的mRNA的表达，在96孔板中进行细胞的生长和培养。在培养进行指定的时间后，使用配备有10ul移液器尖头的Nunc Immuno Washer小心且完全地吸取培养基；用20ul/孔的裂解缓冲液Cell-to-Signal^TM(Applied Biosystems/Ambion,Austin,TX)或SideStep^TM(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)裂解细胞3分钟。随后小心地上下吸打裂解物，将样品(以一式四份)配对组合(从而产生生物品一式两份)，转移至贮存板并于-70℃冷冻。

为了进行基因表达测试，将样品解冻，将等分用PCR级水以1:10稀释。具有高预期表达水平的样品也用于在10％的裂解缓冲液中制备系列稀释物以用作一系列用于定量的标准物。与来自Qiagen(Valencia,CA)的Probe RT-PCR预混合物)和购自Applied Biosystems(Foster City,CA)的基因表达测定组合，将稀释的样品在一步qRT-PCR反应中用作模板。在牵涉大鼠神经细胞以及人间充质细胞和神经细胞的实验中确定了来自大鼠与人细胞的对应mRNA之间不存在交叉反应。使用下列预先最优化的测定(全部被设计来横跨外显子-外显子边界)：大鼠特异性-巢蛋白(Rn00564394_ml)、MAP2(Rn00565046_ml)、GFAP(Rn00566603_ml)、CNPase(Rn01399463_ml)、双皮质素(Dcx)(Rn00584505_ml)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(rGAP)(Rn-1462661_gl)；和人特异性甘油醛3-磷酸脱氢酶(huGAP)(4333764F)、骨形态发生蛋白4(BMP4)Hs00370078_ml和成纤维细胞生长因子2Hs00266645_ml。括号内的数字是指制造商的(Applied Biosystems)测定ID号。为了进行扩增反应，按照预混合物制造商的方案，利用40-60个扩增循环将LightCycler 480(Roche,Mannheim,Germany)编程。使用二阶导数最大法进行分析。

神经突生成的评价

将神经细胞(1.5x10⁴个细胞/cm²)单独地或与MSC或SB623细胞(1.5x10³个细胞/cm²)一起于包含为正常使用的1/10(0.2％)的B27的神经生长培养基中涂板在ECM涂覆的盖玻片上，并让其生长18-24小时。随后固定培养物，就MAP2表达对其进行染色，使用含DAPI培养基封片，如上文中所描述的。使用相同的暴光时间对约12-15个视野进行照相，每条件分析总共20个神经元。测量每一个细胞的最长神经突的长度，计数每细胞神经突的数目。

实施例1：间充质细胞对增殖和神经元分化的作用

首先使用巢蛋白(神经干细胞/早期祖细胞的标志物)和MAP2(神经元的标志物)的免疫细胞化学分析利用或不利用间充质细胞生长的基于ECM的神经培养物的组成。在不同的时间固定培养物，随后用大鼠特异性抗-巢蛋白抗体和抗-MAP2抗体进行温育。还用核特异性染料DAPI对所有培养物进行复染色。随后通过荧光显微镜检查固定并染色的培养物。在第1天，单阳性Nes⁺和MAP2⁺细胞以及一些MAP2⁺Nes⁺双阳性细胞存在于所有测试的培养物中，其中MAP2染色和巢蛋白染色被共定位。还存在少部分双阴性细胞。到第3天，未检测到双阳性细胞，而单阳性细胞延长了它们的突起。在第5天，MAP2⁺神经元继续延伸神经突，而Nes⁺细胞的数目显著增加。在该时间点上，Nes⁺细胞形成集落。在间充质细胞存在的情况下观察到更多数目的集落和更大的集落尺寸。未检测到双阳性细胞。

到第9天，观察到大量的MAP2⁺Nes⁺双阳性细胞以及MAP2⁺Nes^-神经元和MAP2^-Nes⁺细胞。在与SB623的共培养中，相较于与MSC的共培养，发现更大数目的双阳性细胞，而无间充质细胞的培养物具有最少数目的MAP2⁺Nes⁺细胞。这些双阳性细胞具有特征性的具有二裂片的形状的细胞核，细的MAP2-阳性突起，定位至核周区域-最常见地，定位至与最突出生长相邻的两个核叶之间的裂缝的强巢蛋白反应性。该形态与在培养的第1天存在的MAP2⁺Nes⁺双阳性细胞的形态相似。

当将神经细胞和间充质细胞在PDL上共培养时，在培养的第1天观察到大致相同的双阳性和单阳性细胞的频率，当将细胞在ECM上共培养时亦观察到这样的现象。在更晚的时间点上，未检测到发育的单阳性Nes⁺细胞(极少的Nes⁺细胞是圆的，具有致密的细胞核)。到培养的第5天，仅观察到少量双阳性细胞集落，每一个集落由极少的细胞组成。这些结果表明在PDL上，大多数或全部Nes⁺细胞定向于神经元分化。在第9天，双阳性集落在间充质细胞存在的情况下比在它们不存在的情况下更加突出。

还使用相差显微镜术和对α-平滑肌肌动蛋白(间充质细胞的标志物)染色检查了间充质细胞在共培养物中的状态。在PDL上，间充质细胞几乎不散开，通常在大致第5-7天消失。在ECM上，在共培养的整个持续过程中很容易检测到间充质细胞；它们显示良好的分散、移动以及表现出缓慢地增殖。

在ECM和PDL上共培养的神经突生成非常活跃，但在培养的前18-24小时过程中在间充质细胞存在的情况下得到进一步增强。为了增大该差异反应，将培养物于具有低浓度的B27补充剂的神经生长培养基中涂板。在这些条件下，在24小时的共培养后相较于单独的神经细胞培养，在MSC或SB623细胞存在的情况下观察到更长的神经突(表1)。然而，未观察到神经突数目的显著差异(表1)。

表1:第1天的神经突的长度和数目

神经突长度以μm表示。

实施例2:间充质细胞对星形胶质细胞生成的作用

通过神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)的表达的免疫组织化学分析测定星形胶质细胞发育。神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP，星形胶质细胞的标志物)和巢蛋白的基于ECM的培养物的双染色显示在第3天以前在所有培养物中不存在GFAP反应性。在第5天前后，在Nes⁺集落内的共培养物中开始观察到表达GFAP的细胞，其为单或双阳性细胞。在不包含间充质细胞的培养物中未观察到表达GFAP的细胞。不同集落具有可变比例的GFAP⁺Nes⁺细胞和更完全分化的GFAP⁺Nes^-细胞。此时在不存在间充质细胞的培养物中未检测到GFAP⁺细胞。在第9天，所有3种表型(GFAP⁺Nes⁺、GFAP^-Nes⁺和GFAP⁺Nes^-)都存在于所有培养物中，GFAP^-Nes⁺细胞占优势。

关于其细胞内定位，GFAP免疫反应性在一些巢蛋白阳性丝状细胞中最初(在第5天)作为嵌入丝(intercalating filament)出现在巢蛋白丝旁边或内部。随后，巢蛋白在某些细胞中实际上被GFAP替代，如通过巢蛋白染色的不均匀分布证明的，然而其它细胞继续仅表达巢蛋白。在共培养物中，GFAP⁺Nes⁺细胞通常与GFAP⁺Nes^-细胞具有相同的形态，然而在GFAP^-Nes⁺细胞之间，形态是变化的。一种类型的细胞具有非常长的突起，通常超过200μm。其它类型是小的GFAP^-Nes⁺细胞，其巢蛋白反应性偏离细胞核中心，作为来自细胞核一侧的"花边"或集中在有二裂片的细胞核的裂缝中并延伸至与该裂缝相对的突起中。后一种形态与前述实施例中描述的Nes⁺MAP2⁺细胞的形态是相似的。

当在PDL上进行共培养时，未检测到GFAP⁺细胞。

实施例3:间充质细胞对于少突胶质细胞发生(oligodendrogenesis)的作用

通过早期少突胶质细胞标志物2',3'-环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNPase)的表达的免疫组织化学分析来评价少突胶质细胞发生。CNPase⁺细胞在共培养的第9天之前不能被检测到。在第12天，在间充质细胞不存在的情况下在ECM上生长的培养物中，仅可在极少的、通常是正在分裂的细胞中检测到CNPase反应性。在相同的时间点，在与间充质细胞的共培养物中，CNPase⁺细胞显示成簇存在，CNPase表达定位至核周区域。在与SB623细胞的共培养物中，CNPase染色更强，更广泛，扩展至整体细胞质。CNPase的表达不与巢蛋白表达共定位。

当在PDL上进行共培养时，未检测到CNPase⁺细胞。

实施例4:共培养物中的神经细胞增殖

使用两个方法在包含1.5x10⁴个神经细胞/cm²的培养物(具有或不具有MSC(1.5x10³个细胞/cm²))中测定神经细胞的增殖。在第一个方法中，在制备用于上述免疫组织化学分析的载玻片上计数DAPI-染色的细胞核。对200倍放大倍数下的5个显微镜视野进行计数，并对每个条件取平均值(来自两个实验)。极度凝缩的或碎片化的细胞核被认为是死亡细胞的指示。基于它们的独特尺寸不对MSC细胞核计数。

在第二个方法中，使用针对大鼠noggin(单外显子基因(Rn01467399_s))的定量PCR测定(Applied Biosystems)在微量板形式的共培养中测量神经细胞的增殖。除省略qRT-PCR方案的反转录步骤外，按照针对qRT-PCR所描述的，进行分析。检测人noggin序列从MSC的最少扩增(图1B)。

结果示于图1中。两种方法表明在MSC存在的情况下，在7天的与MSC的共培养的过程中，大鼠神经细胞的数目增加至3至4倍，然而在MSC不存在的情况下，神经细胞的数目仅仅加倍。如通过DAPI染色的神经细胞核的形态学所评价的，在任意给定的时间上10-20％的细胞死亡(图1A)。

还在大鼠神经细胞与MSC在ECM上的共培养中测定神经前体细胞的增殖。在共培养的第7天，利用BRDU处理培养物7小时，随后进行固定，利用针对BRDU的抗体和利用神经特异性TUJ1抗体进行免疫染色。无论神经细胞是单独培养的还是与MSC共培养的，在该时间点上培养物包含小的细胞，几乎未产生突起，显示了与抗-TUJ1和抗-BRDU抗体的反应性，这表明是正在增殖的神经前体细胞。使用针对大鼠noggin基因的PCR测定对这些神经前体细胞的定量显示：当将神经细胞与MSC共培养时，它们的数目增加(图1B)。

实施例5：时间过程

在本实施例中，在200个MSC/孔存在和不存在的情况下，分析不同神经元(双皮质素,MAP2)、神经前体细胞(巢蛋白)和神经胶质的标志物(GFAP和CNPase)在于ECM上培养的神经细胞中的表达时间过程。在不同的时间点收集样品并冷冻。随后将所有样品解冻，利用qRT-PCR进行平行测定。引物、探针和扩增条件如上文中所述。结果示于图2中。神经标志物双皮质素(DCX)和MAP2的水平初始时高，并且随培养和共培养时间而升高。在中间培养时间上，共培养似乎对DCX和MAP2RNA水平几乎无作用；然而，在更晚的时间上，共培养的激活作用变得明显。巢蛋白(神经前体细胞标志物)的表达在共培养初始时几乎不可检测，但在7天的培养中稳定升高，并且因MSC的存在而增强。GFAP mRNA(星形胶质细胞标志物)的表达在与MSC的共培养不存在的情况下未被检测到；然而在共培养中，其最早在第4天被检测到，在第6至第7天增加最多。CNPase mRNA(少突胶质细胞标志物)的表达最早在与MSC共培养的第4天被检测到，并且在第6至第7天也显示急剧的增加。

基于这些结果，用于检测巢蛋白和CNPase mRNA表达的最佳时间被确定为共培养的第5天；用于检测DCX、MAP2和GFAP mRNA表达的最佳时间被确定为共培养的第7天。

实施例6:剂量反应

为了进行定量测定，将大鼠皮层细胞(5000个细胞/孔)进行单独培养或与500至32个细胞/孔的递减数目的MSC共培养。作为对照，还以500个细胞/孔单独地培养MSC。将大鼠巢蛋白、MAP2、GFAP和CNPase mRNA的qRT-PCR Taqman测定用于定量基因表达。将人特异性甘油醛3-磷酸脱氢酶(huGAP)qRT-PCR Taqman测定用于评价MSC数目。图3和4显示共培养样品中rNes、rMAP2、rCNPase或rGFAP基因表达的总水平直接取决于存在的MSC的数目，MSC数目通过用于人特异性GAP(huGAP)mRNA的测定来进行定量。这些作用不是人序列的扩增引起的，因为使用大鼠特异性PCR探针和条件，单独的MSC未产生信号。

为了观察使用巢蛋白、MAP2或CNPase作为标志物的MSC依赖性剂量反应，取样的时间安排是非常重要的。例如：测试大鼠巢蛋白基因表达的最佳时间安排为第4天至第6天，因为在第7天，表达达到饱和。

大鼠CNPase mRNA表达最早在第5天左右被检测到，远早于蛋白质可被检测到的时间。在第5天，CNPase mRNA水平与共培养的MSC浓度成正比。在第5天后，CNPase基因表达水平继续升高；但到了第7天，MSC-剂量-依赖性曲线变成二相性的(图5)。在这些较晚的时间上，更高剂量的MSC在观察过程中渐进地抑制CNPase基因表达，更低的剂量维持诱导性。该结果在蛋白质水平上得到验证：与1000个细胞/cm²的MSC或SB623共培养的神经细胞相较于与100个细胞/cm²的MSC或SB623细胞共培养的神经细胞，具有显著更少的CNPase染色。

GFAP mRNA的表达显示强烈且恒定的对间充质细胞浓度的剂量反应，只要其可被检测到(第4或5天)并且在剩余的培养期(第7-9天)中未显示饱和。

实施例7:通过间充质细胞条件化培养基、间充质细胞ECM和活间充质细胞介导的作用的定量

在本实施例中，将活MSC对神经细胞分化的作用与它们的条件化培养基(CM)的作用相比较；以及将使用ECM作为基底的作用与多聚D赖氨酸的使用相比较。

将定量神经分化测定(qRT-PCR)用于确定间充质干细胞培养物的哪个组分具有最大的促神经生长作用。为此目的，将神经细胞对MSC的反应与对MSC-CM的反应相比较，将细胞在ECM-或PDL-涂覆的板上共培养。将浓度递减的MSC和MSC-CM用于确保在饱和度以下对效应进行分析。结果概述于表2中。为了简化呈现，该表仅包括来自包括间充质细胞(500个细胞/孔)或MSC-CM(50％)的最高浓度的实验的数据。较低浓度的这些添加剂刺激更低标志物表达水平，从而确认了反应既未被饱和也未被下调。结果是相对于指定日上在无添加剂的情况下于ECM上生长的培养物中的水平表达的。

在所有测试条件下观察到相似的第1天的rMAP2表达水平，表明初始神经元附着和发育是相似的。随后，在第5天，活MSC或MSC-CM的存在在任一基底上使该标志物的表达增加至2-3倍。巢蛋白基因表达在ECM上比在PDL上强2-3个数量级。在第5天，巢蛋白基因表达在MSC-CM和活MSC存在的情况下在ECM和PDL上显著增加。第5天的CNPase基因表达由活MSC诱导，并且在基于ECM的培养中受到MSC-CM甚至更强的诱导，然而在基于PDL的培养中，其低于检测限值。CNPase基因诱导在第7天在PDL上可被检测到，MSC-CM是比活MSC更有效的刺激物。GFAP基因表达在ECM上被活MSC最显著地诱导，被MSC-CM在较低的程度上诱导。在PDL上，GFAP表达在整个研究中低于定量限值。

还在本研究的第1天和第7天测试了人GAP表达。在第1天，在PDL涂覆的板上进行的共培养中的人GAP基因表达仅略低于在ECM中培养的细胞，然而在第7天，其低于定量限值。显微镜检查显示，在PDL上进行7天后，仅有少数间充质细胞存活，并且它们几乎不扩散，然而在ECM上，它们显示它们典型的形态学，并且数目略有增加。结果概述于表3中。

表2:ECM和PDL上神经标志物的相对表达水平

显示每一天的相对于来自"无添加，ECM"的每一个标志物的值。

变异系数示于括号中。

*以500个细胞/孔涂板MSC细胞

**50％的MSC-CM

#相对于来自第5天的"无添加,ECM"样品

S/I信号在这些时间点上是饱和的或被抑制

表3:关于人MSC、MSC-CM和MSC来源的ECM对大鼠E18皮层细胞培养物中的神经发生的作用的观察的概述

通过"+"评价和表示每一个细胞群体的生长。缩写：

A：星形胶质细胞；O：少突胶质细胞；N：现有神经元，可能不增殖；Nn：新生神经元；(Nes+)：增殖中的；S：神经干细胞/早期祖细胞。

*标志物的转录可被检测到，然而蛋白质不可被检测到，或仅有极少的阳性细胞在9天的培养中被检测到。

实施例8:MSC在非附着型培养中的作用

在上述实验中，利用间充质细胞的汇合层进行板的ECM涂覆，所述间充质细胞的浓度为用于共培养的间充质细胞的最高浓度的约40倍。为了阐明共培养中神经干细胞/早期祖细胞增殖和分化的强刺激是否因共培养物中间充质细胞ECM的存在而引起，将皮层细胞与数目递减的MSC或SB623细胞混合，在用多聚D赖氨酸(PDL)涂覆的板中在非附着条件下进行共培养。作为对照，将皮层细胞单独地涂板，与或不与FGF2和EGF一起涂板；将间充质细胞以共培养中使用的最高浓度单独地涂板。

为了进行多聚-D-赖氨酸(PDL)涂覆，用10μg/ml的水中的PDL(Sigma-Aldrich)在室温涂覆板，进行1小时。随后吸取PDL溶液，使孔干燥，随后用PBS洗涤一次。在将细胞涂板在这些涂覆的孔中之前，用一部分神经生长培养基替代PBS，在细胞悬浮物制备过程中，将板在培养箱中进行温热。

将细胞共培养14天。在该时期，在所有孔中形成细胞聚集体。在单独的间充质细胞培养中，这些聚集体较小并且在培养期中未观察到它们的尺寸的可视增加；事实上，它们中有许多死亡。在所有其它条件下，聚集体显著生长，形成典型的神经球。在温育结束时，收集所有孔的总内容物，沉淀，在等体积的裂解缓冲液中裂解；随后利用qRT-PCR测试大鼠神经标志物的表达。图6提供了代表性结果，其显示MSC的存在在ECM不存在的情况下在非附着条件下以剂量依赖性方式强烈地刺激rNes、rMAP2、rGFAP和rCNPase表达。大鼠双皮质素(rDCX,神经元增殖的标志物)的表达也被PDL涂覆的基底上的MSC刺激。MSC也以剂量依赖性方式诱导rGAP的表达，这表明与MSC的共培养刺激活的大鼠神经细胞的总体数目的增加。

当将在包含最高剂量的MSC的共培养物中观察到的神经球与在FGF2和EGF存在的情况下生长的神经球相比较时，前者具有1/3的巢蛋白基因表达水平，但具有2.5倍的Dcx表达和55倍的GFAP表达，以及更高水平的MAP2、CNPase和rGAP表达(分别是1.5、3.5和3倍)。在非附着条件下在单独培养的MSC中检测到人GAP(huGAP)mRNA，但当将相同数目的细胞与神经细胞共培养时，其水平急剧下降(分别是17.2和3.1)。更低剂量的MSC显示低于定量限值的huGAP表达水平。这表明与非附着条件组合的神经细胞环境不利于间充质细胞的生长，并且它们在更低的涂板剂量上不存活。然而，它们刺激神经发育的能力一直保持。

在于bFGF和EGF不存在的情况下培养的皮层细胞中，所有神经标志物的基因表达都低，对于大鼠GAP的表达情况亦如此。在与MSC的共培养中，所有标志物的表达以剂量依赖性方式增加，尽管大部分MSC在共培养中以及当单独培养时死亡(如通过huGAP水平显示的)。

使用SB623细胞而非MSC获得了相似的结果。这些结果显示在ECM上的共培养中观察到的间充质细胞的刺激作用不是因ECM本身而产生的。

实施例9：附着条件的作用

评价了附着条件对共培养的神经细胞的分化的作用。为此，将神经细胞与MSC在SB623细胞衍生的ECM涂覆的板上、鸟氨酸/纤连蛋白涂覆的板上以及Ultra LowAttachment(ULA)板(Corning,Lowell,MA)上共培养。鸟氨酸/纤连蛋白涂覆的板支持MSC的附着。在ULA板上，将神经细胞与5倍浓度的MSC(与在ECM或鸟氨酸/纤连蛋白上的共培养相比较)或与各20ng/ml的成纤维细胞生长因子-2(FGF2)和表皮生长因子(EGF)一起培养。

鸟氨酸/纤连蛋白涂层(Orn/FN)通过用15ug/ml的PBS中的多聚L鸟氨酸(Sigma-Aldrich)在37℃温育孔过夜、随后洗涤孔3次、随后在37℃用PBS温育过夜来制备。此后，用1ug/ml的PBS中的牛纤连蛋白(Sigma-Aldrich)温育孔，进行3-30小时，在将细胞涂板之前洗涤1次。

将大鼠皮层细胞与人MSC(神经细胞/MSC比率10:1，1.5x10⁴/cm²)的混合悬浮物涂板在SB623细胞ECM涂覆的板上和鸟氨酸/纤连蛋白涂覆的板上。将与5倍浓度的MSC或与FGF2和EGF(如上所述的)混合的神经细胞涂板在ULA板上。在共培养的第5或7天通过qRT-PCR测定标志物表达。

结果示于图7中。在ECM上与MSC共培养的神经细胞相较于所有其它条件表达显著更高水平的GFAP。ECM涂覆的板上的巢蛋白的表达显著高于利用Orn/FN涂覆的板上的表达，并且与在ULA板上培养的、利用重组细胞因子刺激的或与高浓度的MSC共培养的细胞中观察到的所述表达相似。在7天中，在于ECM上生长的共培养物中，大鼠巢蛋白和GFAP的表达水平显著高于Orn/FN上的表达水平，然而大鼠DCX、CNP和人GAP表达水平相似。ECM上生长的共培养物相较于非附着型共培养物显示显著更高的GFAP和DCX表达。

非附着型生长(在ULA板上)对MSC的生长和存活具有不利作用，如通过这样事实证明的：尽管在ULA板上MSC的浓度为ECM和orn/FN涂覆的板上的5倍，但huGAP水平极低。在非附着条件下，FGF2/EGF和MSC支持相似水平的Nes和CNPase表达。

总之，与在Orn/FN上或ULA孔中的共培养物相反，在ECM涂覆的板上生长的神经细胞与MSC的共培养物，包含最多样的神经细胞群体。具体地，ECM上的共培养物支持与在FGF2/EGF驱动的球状体中的巢蛋白表达水平相当的巢蛋白表达水平，并且还在测试的任何条件下支持最高水平的GFAP表达。

实施例10：硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的作用

鉴于ECM对表达巢蛋白的细胞的丰度的积极作用，如在先前实施例中描述的，研究了ECM的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖对巢蛋白表达的作用。

为了进行这些实验，如上所述，用SB623ECM涂覆板，随后在室温用10mM HEPES,pH7.4,100mM NaCl和4mM CaCl₂中的肝素酶1(Sigma-Aldrich)溶液处理ECM过夜，随后洗涤1次。肝素酶浓度示于图8的图例中。

在包含肝素酶处理的ECM的板上培养大鼠皮层细胞。在5天的培养后，利用qRT-PCR测定巢蛋白表达。图8中显示的结果表明利用肝素酶处理的ECM导致巢蛋白表达的肝素酶剂量依赖性减少。根据这些结果，可得出硫酸乙酰肝素保成表达巢蛋白的神经细胞生长的结论。

实施例11:MSC的生长因子和细胞因子的表达

将定量RT-PCR用于测量MSC的编码某些生长因子和细胞因子的mRNA的表达，如下面表4中显示的。

表4

	交叉点*	标准差
			BMP-2	35.8	0.3
BMP-4	31.3	1.0
			BMP-6	33.2	0.6
FGF-1	31.1	0.2
			FGF-2	27.7	0.6
FGF-2AS	31.5	0.5
			FGFR-2	27.0	0.3
EGF	29.6	0.5
			HBEGF	29.3	0.4
IGFBP5	26.1	0.8
			GAP(对照)	21.8	0.4

*-信号首次被检测到时的扩增循环

实施例12:细胞因子、生长因子和其它蛋白质的神经源性和/或胶质生成作用的测定

通过将重组因子(单独地或与5％MSC条件化培养基(MSC-CM)一起)添加至ECM上培养的神经细胞，来测试MSC产生的许多生长因子和细胞因子的刺激神经发生和胶质生成的能力。

通过在培养物中生长SB623细胞、随后从培养容器洗涤细胞来产生ECM。将原代胚胎大鼠皮层细胞(Brain Bits,Springfield,IL)在5％MSC条件化培养基和特定重组细胞因子或生长因子(如下面表5中显示的)存在的情况下培养在ECM上，进行5或7天。随后通过物种特异性定量RT-PCR测定细胞的不同大鼠神经元和神经胶质的标志物的表达。这些结果的概述示于表5中。

表5

	巢蛋白	MAP2	GFAP	CNPase
					FGF-1	+	+	+	+
FGF-2	+	+	-	+
					BMP-2	-		+
BMP-4	-		+
					BMP-6	-		+
EGF	+	+	-	+
					HB-EGF	+			+
HGF	+			+
					LL6		+/-	+/-	+/-
LL8	+/-		+/-	+/-
					LL1b	+/-	+/-	+/-	+

+＝增加

+/-＝微弱诱导

-＝减少

显示3种因子(EGF、BMP6和HB-EGF)对神经元前体(巢蛋白)、新生神经元(DCX)、少突胶质细胞(CNPase)和星形胶质细胞(GFAP)的标志物的表达的作用的定量结果示于图9中。

实施例13:FGF2在巢蛋白表达的上调中的作用

成纤维细胞生长因子-2(FGF2)由MSC分泌(表4，见上)并且FGF2至皮层细胞的添加刺激巢蛋白、MAP2和CNPase的表达(表5，见上)。进行两个另外的实验以确认FGF2在刺激巢蛋白表达中的作用。在第一实验中，将针对FGF2的封闭抗体添加至神经细胞与MSC的共培养物中。在第二实验中，耗尽MSC条件化培养基的FGF2，添加至神经细胞的培养物。

对于第一实验，使用两种抗体：bFM1(识别大鼠和人FGF2的FGF2中和抗体)和bFM2(FGF2特异性非中和抗体)，两者都获自Millipore,Billerica,MA。在MSC(浓度为200个细胞/孔)存在或不存在的情况下，以5,000个细胞/孔的浓度培养大鼠皮层细胞。将抗体添加至皮层细胞与MSC(浓度为0.2ug/ml)的共培养物中。

该分析的结果示于图10中。神经细胞与MSC的共培养增强神经细胞的巢蛋白表达，如所预期的。然而，当在抗-FGF2中和抗体存在的情况下进行共培养时，巢蛋白表达降至低于本底的水平。共培养物中非中和抗-FGF2抗体的存在对共培养物中的神经细胞中的巢蛋白表达的MSC依赖性上调几乎无作用至无作用。

对于第二实验，如下制备FGF2耗尽的MSC-CM和对照MSC-CM。将MSC-CM在4℃于烧烤器摇床上用抗-FGF2中和抗体bFM1或与对照小鼠IgG1(5ug/ml)温育过夜，随后添加蛋白A/G-加琼脂糖(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)并且温育1小时。在通过离心除去珠粒后，收集上清液，进行无菌过滤。

在无其它添加或添加MSC-CM、FGF2被耗尽的MSC-CM或对照免疫沉淀的MSC-CM的情况下将神经细胞培养在ECM涂覆的板上，进行5天，通过qRT-PCR测量巢蛋白mRNA的表达。结果示于图11中。MSC-CM至神经细胞的添加导致增加的巢蛋白表达，如所预期的。然而，FGF2被耗尽的MSC-CM对巢蛋白表达几乎无(如果有的话)刺激作用。已经历使用非FGF2特异性抗体的相同免疫沉淀法的MSC-CM刺激巢蛋白表达达到与未处理的MSC-CM相同的程度。

这些结果表明MSC来源的FGF2是负责神经细胞的巢蛋白诱导的主要因子，并且还表明皮层基于ECM的培养物的基础巢蛋白水平取决于大鼠或人来源的FGF2。

实施例14:MSC来源的因子在星形胶质细胞发育中的作用

将间充质干细胞的作用与来自间充质干细胞的条件化培养基对ECM涂覆的板上的神经细胞培养物的巢蛋白和GFAP的表达的作用相比较。结果示于图12中，200MSC/孔和10％MSC条件化培养基诱导相似水平的巢蛋白mRNA。然而，条件化培养基对GFAP表达的诱导低于细胞本身诱导的GFAP表达。该结果表明负责星形胶质细胞发育的组分在MSC条件化培养基中没有MSC本身中的丰富(和/或活性较低)。

由MSC分泌的因子骨形态发生蛋白-4(BMP4)(表4，见上)，当添加至神经细胞的培养物中时，刺激GFAP的表达(表5，见上)。为了确认BMP4在星形胶质细胞生成中的作用，在BMP激动剂(noggin)存在的情况下和在抗-BMP4抗体存在的情况下进行大鼠神经细胞与MSC的共培养。将获自R&D Systems(Minneapolis,MN)的重组人Noggin蛋白以30ng/ml的终浓度包含在共培养物中。将多克隆山羊抗-BMP4和正常山羊IgG对照以2ug/ml用于共培养物。这些试剂以及小鼠IgG1同种型对照获自R&D Systems(Minneapolis,MN)。

图13显示BMP拮抗剂noggin在ECM涂覆的板上与MSC共培养的神经细胞中抑制GFAP表达的诱导。当在抗-BMP4抗体存在的情况下将神经细胞与MSC共培养时，也观察到MSC对GFAP诱导的部分抑制(图13)。

尝试通过在烧烤器摇床上将MSC-CM与5ug/ml的抗-BMP4抗体或对照(山羊IgG或无抗体)在4℃温育过夜、随后添加蛋白A/G-加琼脂糖(Santa Cruz Biotechnology,SantaCruz,CA)进行1小时来从MSC条件化培养基免疫沉淀BMP4。在通过离心除去珠粒后，收集上清液，然后无菌过滤。然而，相较于在BMP4被耗尽的MSC-CM存在的情况下培养的神经细胞，在MSC-CM存在的情况下培养的神经细胞中的GFAP水平没有显著差异。然而，抗-BMP4抗体能够阻断由重组BMP4驱动的GFAP诱导。

MSC-CM相较于MSC更低的星形胶质细胞生成活性；利用抗-BMP4中和抗体处理的共培养物中的GFAP水平的部分下降；以及BMP4免疫耗尽对MSC-CM的星形胶质细胞生成活性的作用的不存在，综合起来，表明活性BMP4星形胶质细胞诱导活性存在于细胞-ECM区室中(而非在培养基中)，或其由大鼠细胞产生。

为了确定共培养物中的活性BMP4是由MSC产生还是由大鼠神经细胞产生，在共培养之前，使用siRNA抑制MSC产生BMP4。对于siRNA转染，将新鲜解冻的MSC以0.4x10⁶个细胞/6孔板于αMEM/10％FBS中进行涂板。第二天，按照制造商的说明书，使用1(所有试剂来自Thermo ScientificLafayette,CO)，利用25nM的ON-TARGETplusSMARTpool人BMP4siRNA或对照非靶向混合物转染细胞。第二天，使细胞接受胰蛋白酶作用和散开，通过添加FBS抑制胰蛋白酶。将细胞于Neurobasal培养基中洗涤2次，随后进行计数(存活率通常大于95％)。

转染后第二天，将相同细胞数目的转染子与大鼠皮层细胞一起涂板，共培养5天。在第5天，测定大鼠GFAP mRNA水平和人BMP4水平。图14中显示的结果表明在包含已用BMP4-siRNA转染的MSC的共培养物中大鼠GFAP mRNA水平显著降低，并且人BMP4mRNA实际上不可检测；然而人GAP和FGF2基因的表达不受影响。在利用对照siRNA转染的细胞中未观察到GFAP mRNA水平的降低。这些结果强有力地表明在共培养物中促进星形细胞生成的刺激的BMP4来源于MSC。

结论和讨论

在ECM上，活的间充质细胞或其条件化培养基以剂量依赖性方式显著增加Nes⁺细胞的生长，如使用免疫染色和qRT-PCR证明的，然而在PDL上，对这些因子的反应减小(图1和5以及表2)。这表明Nes⁺干细胞/早期祖细胞的增殖受到分泌的间充质细胞来源的因子刺激，并且受到间充质细胞ECM上的生长的协同促进。该协同作用的最可能机制是间充质细胞来源的生长因子通过基质蛋白聚糖进行的高效积累、贮存和至神经细胞的呈递。神经Nes⁺细胞的增殖可受远距离作用的MSC来源的可溶性因子刺激的结论与最近的报道一致，该报道显示与小鼠MSC共培养的但被半透膜隔开的小鼠神经球，具有高百分比的Ki-67阳性细胞[38]。实际上，已知MSC分泌许多生长因子，所述生长因子已经显示参与神经前体细胞的体内维持[16,30]，并且它们中的一些包括BMP4、FGF2、EGF、VEGF和PDGF-AA的分泌在本文中使用的MSC和SB623细胞中已得以确认[39]。

共培养物中的间充质基质细胞促进从Nes⁺细胞进行的神经突生成和从头神经元形成(图1和2；表1和2)。使用针对MAP2蛋白(MAP2蛋白是神经元细胞体和神经突的特异性标志物)的免疫染色观察到这两个作用；并且使用MAP2mRNA的表达测定定量了组合作用。在间充质细胞存在的情况下在ECM和PDL上观察到Nes⁺MAP2⁺细胞的增强的神经突生成和增加的数目，这表明神经突生成和神经元形成的可溶性调节剂似乎不需要ECM来实现它们的作用。事实上，MSC-CM至基于ECM-或PDL-的培养物的添加与活细胞的添加同样有效地升高了MAP2基因的表达(表2)。先前在不同来源的神经元上观察到MSC的神经突生成作用[16,23,40,41]。

间充质细胞包括MSC和SB623在ECM上增加了新的神经元的形成，如通过在共培养的第7天左右的双阳性Nes⁺MAP2⁺细胞的大量出现所显示的(示于图1上，第9天)。在间充质细胞不存在的情况下，这些双阳性细胞在更晚的时间并且以更小的数目出现。大鼠MAP2mRNA表达测定显示始于第5天的以MSC剂量依赖性方式显著增加的信号(图5)，这在ECM和PDL上是相似的(表2)。由于该增加在新生神经元出现之前出现，因此MAP2基因表达的MSC剂量依赖性增加可能反映成神经细胞的增殖。大鼠双皮质素(rDcx)(增殖中的神经元的标志物)的mRNA水平的测量产生了与针对MAP2表达的结果相似的结果(未显示)，表明rDcx可能在新生和成熟神经元中都表达，正如MAP2一样。

在本文中使用的涂板密度，GFAP表达是基于ECM的培养物的标志，并且在基于PDL的培养物中不存在。在第7天左右的Nes⁺丝状或扁平星形细胞中GFAP蛋白染色与巢蛋白丝的染色密切相关(图3A和3B)。GFAP未出现在基于PDL的培养物中，其中具有该形态学的细胞极少，尽管观察到一些圆形Nes⁺细胞。在ECM上，活的间充质细胞的存在极大地促进了GFAP表达，然而MSC-CM的存在不太有效(图3A表1)，这表明促进星形胶质细胞分化的因子可能是短寿命的。在另一个系统[26]中报道了相似的结果(MSC-CM对GFAP的诱导比活MSC弱)，在所述系统中在EGF和bFGF存在的情况下将以低密度涂板的MSC与成体海马趾神经球来源的神经干细胞共培养。在该系统中，将细胞接种在多聚鸟氨酸/层粘连蛋白或多聚赖氨酸/层粘蛋白-基底上；然而，还将这些基底短暂地暴露于10％血清以使MSC粘附，这可将血清纤粘连蛋白添加至涂层。用于培养星形胶质细胞的最常用方案包括在培养基中加入10％FBS——这可掩盖体外神经突生成对复杂"ECM涂层"的需要。本文中描述的无血清系统暗示了该可能性。

由于在PDL上不存在GFAP⁺细胞生长，因此不清楚可溶性短寿命星形胶质细胞诱导因子是否需要ECM来进行它们的信号传导，或如果未成熟，圆形Nes⁺细胞根本不表达诱导因子的受体。事实上，间充质细胞来源的因子TGFβ、HGF和BMP参与促进星形细胞生成[26,43-45]；所有这些因子是以其无活性形式与ECM结合的，并且当从ECM释放时具有短寿命。间充质细胞来源的可溶性和不溶性因子对于星形胶质细胞分化的重要性的另一个示例来自非附着型培养物的观察(图7)。在所有其它测试的分化标志物中，GFAP基因表达显示了在MSC存在的情况下形成的神经球相较于在EGF和FGF2存在的情况下形成的神经球的最剧烈的增加。

在ECM上，观察到不表达GFAP的星形胶质细胞如Nes⁺细胞(图3C)。它们的形态学暗示着它们可代表放射状胶质细胞，正在缓慢分裂的成体神经干细胞，其在大鼠中为GFAP阴性的[46-48]。该身份可通过表型分型来确认并且，如果确认，可使用本文中描述的测定来监控这些成体干细胞响应MSC的行为。

使用早期少突胶质神经细胞的标志物髓磷脂加工酶CNPase监控了少突神经胶质细胞分化，所述酶的表达通常在O4表达之后和髓磷脂碱性蛋白(MBP)表达之前[49]。在本文中描述的实验中，在其mRNA出现后相对晚的时间检测到CNPase蛋白的出现，但该出现可因MSC或SB623细胞的存在而加速(图4)。在早得多的时候检测到可定量的表达水平的CNPasemRNA，并且正好是MSC剂量依赖性的(图5)。然而，剂量依赖性曲线变成二相性的(图6A)，最终被逆转。似乎尽管在所有培养物中大鼠CNPase表达继续随时间而增加，但在更晚时间点上，更低剂量的MSC或SB623细胞而非更高的剂量诱导更高的总体水平的CNPase mRNA。蛋白质染色确认了该发现，并且显示少数SB623细胞诱导比10倍的间充质干细胞诱导更强的CNPase染色，然而两个剂量都增加了正在分裂的CNPase-阳性细胞的数目(图6B)。

这些结果表明存在少突胶质细胞分化的细胞密度依赖性抑制；然而，不清楚间充质细胞是直接起作用还是间接起作用。少突胶质细胞前体的扩增和分化受到细胞密度控制[50,51]，并且，尽管控制机制不清楚，已报道牵涉局部细胞间相互作用而非远程可扩散因子；以及作用是细胞类型特异性的，即其由少突胶质神经细胞的谱系特异性介导[50]。本文中描述的测定的结果与更高剂量的间充质细胞通过增加早期少突胶质细胞前体的增殖来抑制少突胶质细胞分化的可能性一致。在ECM上，MSC-CM诱导的CNPase表达为活细胞诱导的3倍(表2)，并且在这些条件下检测到少得多的GFAP表达。这些观察显示了星形胶质细胞相较于少突胶质细胞的增殖与分化之间的相互作用以及增殖与分化的平衡、速度。本文中公开的数据还支持这样的概念，即ECM本身可在促进少突胶质细胞增殖和分化中起重要作用[52]。事实上，在PDL上，甚至在MSC或MSC-CM存在的情况下，CNPase表达水平较低，并且在2周的过程中未检测到蛋白质，然而在ECM上，即使在其它添加剂不存在的情况下仍然检测到蛋白质。

本文中公开的方法和组合物使得能够定量分析测试物质在混合交叉物种的共培养物中的促神经生长活性。在该系统中，间充质细胞来源的ECM用作附着型共培养的基底；在外来生长因子不存在的情况下，从始至终在相同微环境中培养神经细胞；以低细胞涂板密度将原代神经细胞与测试物质(例如，MSC制剂)直接共培养。该系统允许分析分泌的、可扩散的、细胞结合的和基质结合的因子。可在微量板形式中进行分析；对于来自总的裂解物的神经标志物，使用基于qRT-PCR的读出。

间充质细胞来源的ECM被选择作为用于神经细胞共培养的基底，所述共培养基于先前的观察：人MSC来源的ECM和SB623细胞来源的ECM(在更大的程度上)允许大鼠胚胎皮层细胞以相对低的细胞涂板密度和在生长因子不存在的情况下生长和随后分化成神经元和神经胶质谱系[28]。在本文中公开了ECM涂层产生有利于巢蛋白阳性细胞生长的环境。ECM的整合型硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)是非常重要的，因为与对照处理的孔相反，ECM的肝素酶1预处理在培养中降低了巢蛋白水平。HSPG的作用表明牵涉FGF2信号转导。事实上，阻断FGF2的抗体，尽管不是对照抗体，在神经培养中仍然使巢蛋白表达降至低于基础水平。这表明FGF2在基于ECM的培养中起着重要作用。FGF2(大鼠或人来源的，或两种来源的)可提供生理刺激，所述生理刺激支持神经干细胞/早期祖细胞的存活和缓慢增殖，并且使得附着培养物随后能够分化。最近的报道将间充质细胞来源的ECM鉴定为以血管外基片(fractones)形式存在的体内神经干细胞小环境的完整部分，并且其HSPG牵涉FGF2的积累[31,32]。该观察证明将用于神经细胞培养的间充质细胞ECM用于建立干细胞小环境的模型是合理的。虽然使用本文中公开的大多数结果是使用SB623-细胞来源的ECM获得的，但基于MSC-ECM的系统也产生相似的结果，尽管以更长的培养时间。

当在生长因子或其它测试物质不存在的情况下将皮层细胞群体在ECM上生长时，在2-3周内检测到分化的神经胶质细胞[28]。在MSC存在的情况下，神经群体以MSC剂量依赖性的方式显著更快地增殖和分化(参见实施例)。本文中描述的物种特异性qRT-PCR读出法能够在低至50个人MSC/5000个大鼠神经细胞存在的情况下检测到大鼠神经标志物的诱导。神经标志物表达的水平反映若干过程在共培养中的积累结果。例如，MSC驱动的总的巢蛋白表达的增加(图2)反映了因细胞的细胞扩增的生长而引起的每细胞的表达增加，Nes⁺干细胞(Nes⁺集落和正在分裂的Nes⁺细胞)的数目增加以及Nes⁺MAP2⁺未成熟前体的数目增加(实施例1)。在第1天的共培养中显著的MAP2或DCX表达的MSC驱动的增加(图2)可能是MSC-增强的神经突生成的结果(实施例1和[15,22,33,34])。在更晚的时间点(在第6至7天)，在共表达MAP2和巢蛋白的细胞大量出现之前，观察到神经元标志的第2次增加。这些结果与先前的报道一致，这证明了MSC对神经球来源的神经前体细胞的增殖和对神经元分化的刺激作用[23-25]。

已知MSC分泌许多已证明参与神经前体细胞的维持和体内神经分化的生长因子[综述于35中]，它们中的一些(包括BMP4、FGF2、EGF、VEGF和PDGF-AA)的分泌在一些本文使用的MSC批次中得到确认(30和共同拥有的美国专利申请公布号2010/0266554)。封闭实验显示MSC产生的FGF2是在共培养中负责MSC驱动的巢蛋白诱导的主要因子(实施例13)。巢蛋白诱导活性还可通过MSC-CM高效转移；约85-90％的其可通过FGF2的免疫沉淀从MSC-CM除去。FGF2在神经干细胞的维持中的至关重要的作用是公知的(综述于36,37)；但本文中描述的结果显示MSC-来源的FGF2对MSC-驱动的巢蛋白诱导的贡献远超其它可能的贡献者。

在无血清条件下的星形胶质细胞生成的诱导(测量为GFAP表达)是E18皮层细胞的基于ECM培养的标志。在第7天左右，GFAP蛋白染色与巢蛋白丝的染色密切相关(实施例2)。此外，伴随Nes⁺细胞扩散的巢蛋白丝的形成似乎是星形胶质细胞分化的前提，因为在不支持Nes⁺-细胞扩散的其它基底上未观察到GFAP诱导(38)。MSC极大地促进了GFAP表达。在本文中发现BMP是该作用的主要调节剂，因为Noggin(BMP活性的负调节剂)在共培养物中抑制约90％的GFAP诱导。BMP4在MSC中丰富地表达(39和表4)。阻断人BMP4的抗体消除了约60％的GFAP诱导，这表明人BMP4是主要星形胶质细胞生成性BMP。BMP4先前在与小鼠神经球的共培养中参与介导特异性诱导的大鼠MSC的星形胶质细胞生成作用(40)。实施例14显示MSC-CM的星形胶质细胞生成作用弱于MSC，与先前的报道一致(25)。MSC-CM的残留星形胶质细胞生成作用不能通过免疫耗尽BMP4来除去；这意味着BMP4不是残余的星形胶质细胞生成活性的原因，或其以无活性形式存在。然而，利用BMP4-siRNA但非用对照siRNA转染的MSC，当在共培养中涂板时，显示减小的星形胶质细胞生成活性，然而FGF2表达不被转染改变(实施例14)。综上所述，这些结果表明MSC的星形胶质细胞生成生部分由BMP(具体地，人BMP4)介导，并且活性BMP4是与细胞结合的或结合至ECM，而不分泌进入培养基。这些结果不排除牵涉其它MSC来源的因子例如TGFβ(25,42)的可能性，尽管在共培养物中阻断TGFβ1不导致星形胶质细胞生成的抑制。

少突胶质细胞分化使用早期少突胶质神经细胞的标志物髓磷脂-加工酶CNPase来监控,其表达通常在O4表达之后，髓磷脂碱性蛋白表达之前，在整个成熟过程中都在增加(43)。与先前的报道(24,44,45)一致，在本文中描述的共培养物中少突胶质细胞发生明确地是MSC依赖性的；然而，MSC-剂量反应的时间与星形胶质细胞生成的时间不同。在共培养的第5天，在MSC剂量与CNPse表达的水平之间存在直接关系；然而，在第7天，通过递增剂量的MSC产生的CNPase激活达到平台期，超过该平台期的MSC剂量的进一步增加导致更低水平的激活(图5)。已知少突胶质细胞前体扩增和分化受细胞密度控制(46)。尽管不清楚精确的细胞密度控制机制，但已报道少突胶质神经细胞谱系的细胞之间的局部细胞间相互作用对此负责(47)。在高剂量的来自MSC的条件化培养基上观察到CNPase表达的同样的二相性剂量-反应，这表明在高MSC剂量时激活水平的逆转不是高浓度的间充质细胞的存在引起的。相反地，更高剂量的MSC在诱导少突胶质细胞前体的增殖中非常有效；前体更快速地达到更高的密度，并且更早地抑制它们自已的分化(CNPase的进一步积累)。

本文中公开了使得能够对测试物质对原代神经细胞群体的作用进行定量多因素分析的体外系统。所述系统保持原代细胞群体的复杂性和一些固有的相互作用。该系统可用于鉴定和定量可溶性细胞结合的和/或基质结合的促神经生长因子，并且已被用于显示可溶性FGF2和细胞结合的或基质结合的BMP4分别在神经元和星形胶质细胞发育中的重要性。最后，所述系统可用于比较不同批次的MSC或它们的衍生物(例如，SB623细胞)的效力，以及用于研究神经群体对MSC的作用。

本文中提供的数据表明SB623细胞比它们的亲代MSC更高效地诱导早期神经前体细胞的增殖和分化。

总之，本发明人已描述了体外系统，所述体外系统使得能够对物质(例如，MSC、SB623细胞及其产物)对神经细胞生长和分化的不同阶段的作用进行成像和高通量定量。该系统促进许多分化过程(包括例如MSC/神经细胞相互作用)的研究，以及用作基于神经再生细胞的疗法的效力测定的基础。

此外，已显示了FGF2的神经发生作用和BMP4的星形胶质细胞生成作用。因此，可用FGF2和BMP4替代神经前体细胞或共同拥有的美国专利号7,682,825中描述的任何神经细胞，以用于治疗中枢或周围神经系统的疾病、障碍或病况。为此目的，将美国专利号7,682,825的公开内容通过引用整体并入本文。此外，可用FGF2和BMP4替代神经元前体细胞、MASC来源的神经元细胞或共同拥有的美国专利号8,092,792中描述的任何移植形成单位，以用于治疗中枢神经系统损伤(例如，缺血性中风、出血性中风)。为此目的，将美国专利号8,092,792的公开内容通过引用整体并入本文。

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Claims (10)

1.一种用于确定物质是否促进神经前体细胞分化的定量测定法，所述测定法包括下列步骤：

(a)在固体基底上培养间充质细胞；

(b)从基底除去所述间充质细胞，以便由所述间充质细胞产生的细胞外基质保留在所述基底上；

(c)在不存在生长因子的情况下在步骤(b)的基底上铺板胚胎皮层细胞以形成测定培养物；

(d)将测试物质添加至步骤(c)的测定培养物中，其中

(i)使用多个测定培养物；和

(ii)将不同浓度的测试物质添加至所述多个测定培养物中的每一个；和

(e)在预先确定的时间段之后，测量所述测定培养物中下列一个或多个的表达：微管相关蛋白2(MAP2)、双皮质素(DCX)、神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)和环核苷酸3'磷酸二酯酶(CNPase)；

其中与步骤(e)的培养物中的测试物质的量成比例的MAP2或DCX的表达指示所述物质促进神经前体细胞分化为神经元；

进一步地，其中与步骤(e)的培养物中的测试物质的量成比例的GFAP的表达指示所述物质促进神经前体细胞分化为星形细胞；和

进一步地，其中与步骤(e)的培养物中的测试物质的量成比例的CNPase的表达指示所述物质促进神经前体细胞分化为少突胶质细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述间充质细胞选自：

(a)间充质干细胞，和

(b)已用编码Notch细胞内结构域的核酸转染的间充质干细胞的后代。

3.权利要求2的方法，其中所述间充质细胞获自人。

4.权利要求1的方法，其中所述固体基底选自塑料、硝酸纤维素和玻璃。

5.权利要求的1的方法，其中所述胚胎皮层细胞获自小鼠或大鼠。

6.权利要求1的方法，其中测定MAP2、DCX、GFAP或CNPase的mRNA的表达。

7.权利要求1的方法，其中测定MAP2、DCX、GFAP或CNPase的蛋白质的表达。

8.权利要求1的方法，其中所述预先确定的时间段是：对于测定MAP2、DCX和GFAP而言是7天；对于测定CNPase而言是5天。

9.权利要求1的方法，其中所述测试物质是细胞。

10.权利要求1的方法，其中所述测试物质是化合物。