TWI613446B - 使用脂肪組織衍生之幹細胞進行的神經生成篩選方法和系統 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於識別神經生成調節性化合物之方法和系統，該等方法包含：於候選化合物存在時培養脂肪組織衍生之幹細胞(ADSC)，及測定該等ADSC之神經生成程度。本發明亦提供促進ADSC之神經生成之方法。

Description

使用脂肪組織衍生之幹細胞進行的神經生成篩選方法和系統
本發明關於用於識別神經生成調節性化合物(例如促進或抑制神經生成之化合物)之方法。更具體地，本發明關於使用脂肪組織衍生之幹細胞(ADSC)(更特別地人脂肪組織衍生之幹細胞(hADSC))以識別神經生成調節性化合物之方法。
腦營養物已成為嬰幼兒、懷孕婦女及授乳婦女的飲食中日益重要的添加物，因為它們能促進腦部早期發育。除此之外，可用於治療神經變性疾病或腦損傷的化合物也被持續找尋。對神經毒性化合物如環境、工業或飲食毒素的識別是必要的，如此才能加以移除或減少暴露於該些化合物。用於發現這些營養物或毒素的方法通常相當費時，沒有效率。因此，需要提供一種可靠、一致且快速的方法來識別具有神經發展益處之化合物。此外，也需要 識別對神經有害之化合物。
研究發現，幹細胞如脂肪組織衍生之幹細胞(ADSC)可以可再現之方式分化成多種成熟細胞表型，其包括神經元細胞。特別是人脂肪組織衍生之幹細胞(hADSC)。hADSC是一種非常有用的研究工具，因為它們的取得方便，可購自商業途徑或得自抽脂手術，而且不涉及使用胚胎幹細胞時所面臨之潛在爭議。另外，hADSC可輕易地得自個別病患，因此提供個人化醫藥之機會。
本發明之一態樣提供使用ADSC以識別神經生成調節性化合物之方法。這些方法可用於識別潛在腦營養物，該等營養物可能可被用於添加至嬰幼兒、懷孕婦女及授乳婦女之飲食。本發明之方法亦可用於識別潛在之藥物候選物，以供治療神經疾病及神經損傷。最後，本發明之方法可用於識別可能具神經毒性之化合物，例如會危害胎兒、嬰幼兒之神經發育的化合物。神經毒性化合物也可能造成神經性疾病或干擾神經性疾病及神經性損傷之治療和痊癒。
因此，在某些實施態樣中，本發明提供一種用於識別神經生成調節性化合物之方法，該方法包含：於候選化合物存在時培養脂肪組織衍生之幹細胞(ADSC)，及測定該等ADSC之神經生成程度。上述方 法可能另包含在候選化合物不存在時培養ADSC，測定該在候選化合物不存在時培養之ADSC之神經生成程度，以及比較在候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度與在候選化合物不存在時所培養之ADSC之神經生成程度。在一些實施態樣中，該脂肪組織衍生之幹細胞係人脂肪組織衍生之幹細胞(hADSC)。
在不受任何特定理論束縛之前提下，一般認為若在候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度，相較於該候選化合物不存在時所培養之ADSC之神經生成程度增加，顯示該候選化合物係促神經生成化合物。相反地，若在候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度，相較於該候選化合物不存在時所培養之ADSC之神經生成程度減少，顯示該候選化合物係抑制神經生成化合物。
在某些實施態樣中，該方法另包含在已知之促神經生長化合物如二十二碳六烯酸(DHA)存在時培養ADSC，測定在DHA存在時所培養之ADSC之神經生成程度，以及比較在該候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度，與DHA存在時所培養之ADSC之神經生成程度，其中若該候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度，相較於DHA存在時所培養之ADSC之神經生成程度增加，顯示該候選化合物係促神經生成化合物。
在某些實施態樣中，神經生成之程度係藉由觀察ADSC之細胞型態的改變測定。該細胞型態之改變包 括但不限於細胞質收縮、神經突形成、樹突樣突出形成、軸突形成或任何彼等之組合。細胞型態之改變可利用任何用於細胞分析之方法或目視測定。舉例來說，細胞型態之改變可利用顯微鏡，例如相差顯微鏡觀察。在其他實施態樣中，神經生成之程度係藉由觀察顯示神經生成之細胞生物標記測定。
在任何上述方法中，ADSC係於候選化合物存在一段足以讓神經生成發生之期間時培養，例如約1至約5天。另外，ADSC可於升高之溫度下培養，例如自約25至約45℃。
用於培養ADSC之培養器皿可包含促進或支持神經生成之塗層，例如模擬中樞神經環境之塗層。舉例來說，該培養器皿可能包含一含有聚L-鳥胺酸及牛纖維黏連蛋白之塗層。
在一些實施態樣中，用於培養ADSC之培養基促進或支持神經生成。舉例來說，該培養基可能包含神經基底培養基、表皮生長因子(EGF)、鹼性纖維母細胞生長因子(b-FGF)、N2添加劑及L-麩胺醯胺。
在某些實施態樣中，該方法包含將ADSC置於預備培養基中預備約1至約5天，然後才在候選化合物存在時培養該細胞。該預備培養基可能包含神經基底培養基、EGF、b-FGF及N2添加劑。在預備之後，ADSC可於包含MesenPRO complete及候選化合物之培養基中培養約1至約5天。
本發明之另一態樣提供一種促進ADSC之神經生成之方法，該方法包含：在促神經生長化合物存在時培養ADSC。在某些實施態樣中，該方法另包含測定ADSC之神經生成之程度。
本發明之又一態樣關於一種用於識別神經生成調節性化合物之系統，該系統包含：ADSC、包含模擬中樞神經系統之塗層的培養器皿以及用於促進神經生成之培養基。該培養器皿之塗層可能包含例如牛纖維黏連蛋白及聚L-鳥胺酸。該培養基可能包含神經基底培養基、EGF、b-FGF、N2添加劑以及L-麩胺醯胺。在其他實施態樣中，該系統包含：ADSC、包含模擬中樞神經系統之塗層的培養器皿、預備培養基以及培養基。該預備培養基可能包含神經基底培養基、EGF、b-FGF以及N2添加劑，而該培養基可能包含MesenPRO Complete。
圖1係根據本發明之實施態樣繪示之快速神經元分化平台(RNDP)。hADSC係培養於適當培養基及適量之候選化合物(處理)中達24至72小時。接著評估該hADSC以測定神經生成之程度。
圖2係根據本發明之實施態樣繪示之延時神經元分化平台(ENDP)。hADSC係培養於適當預備培養基中最多3天。接著用適當之培養基(分化培養基)取代預備培養基，並加入適當量之候選化合物，培養1至5 天。接著評估該hADSC以測定神經生成之程度。
圖3A為對照實驗中之ADSC的相差顯微影像。圖3B為經腦營養物處理後之ADSC的相差顯微影像。
圖4A是來自細胞表現試驗之對照影像，其中細胞係經抗微管相關蛋白質2(MAP2)(一種神經元標誌)之抗體染色。圖4B是該MAP2表現試驗中經腦營養物處理後之影像。紅色螢光(如白色線條所示)表示MAP2表現。
圖5A是來自細胞表現試驗之對照影像，其中細胞係經抗巢蛋白(nestin)(一種神經元標誌)之抗體染色。圖5B是該巢蛋白表現試驗中經腦營養物處理後之影像。紅色螢光(如白色線條所示)表示巢蛋白表現。
圖6A是來自細胞表現試驗之對照影像，其中細胞係經抗神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)(一種神經元標誌)之抗體染色。圖6B是該GFAP表現試驗中經腦營養物處理後之影像。紅色螢光(如白色線條所示)表示GFAP表現。
圖7A是來自細胞表現試驗之對照影像，其中細胞係經抗βIII微管蛋白(一種神經元標誌)之抗體染色。圖7B是該βIII微管蛋白表現試驗中經腦營養物處理後之影像。紅色螢光(如白色線條所示)表示βIII微管蛋白表現。
本發明提供用於識別神經生成調節性化合物之方法，該方法包含：在候選化合物存在時培養脂肪組織衍生之幹細胞(ADSC)，及測定該ADSC之神經生成程度。
「神經生成」係指神經細胞自體外或體內之幹細胞或祖細胞之分化、產生或增生。神經生成之程度可利用各種該領域已知之技術測定，例如觀察細胞之型態學改變。任何用於細胞分析或目測之方法皆適用於本發明之方法。舉例來說，ADSC之型態學改變可利用顯微鏡技術觀察，例如相差顯微鏡。表示神經生成之型態學改變包括但不限於細胞質收縮以及出現神經突、軸突及樹突。在其他實施態樣中，神經生成之程度係藉由觀察顯示神經生成之細胞生物標記測定，像是藉由使用生物標記表現實驗。該等生物標記之實例包括但不限於蛋白質如神經絲、髓磷脂鹼性蛋白、微管相關蛋白2(MAP2)、巢蛋白、β-III微管蛋白、神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、S100(一種鈣結合蛋白)、CNP酶及GABA受體。
「神經生成調節性化合物」係指影響神經生成之化合物，不論促進亦或抑制神經生成。因此，在一些實施態樣中，神經生成調節性化合物促進神經生成(「神經生成促進性化合物」)，然而在其他實施態樣中，該神經生成調節性化合物抑制或減少神經生成(「神經生成抑制性化合物」)。被識別為促進神經生成之化合物可能有益 地被用來作為嬰幼兒、懷孕及授乳婦女之飲食的添加劑，以促進及支持早期腦部發育。這些化合物亦可被用於治療神經變性疾病或神經損傷。被識別為抑制神經生成之化合物可能是應該避免或應自嬰幼兒、懷孕及授乳婦女之飲食及環境中移除之潛在毒素。這些化合物也可能會干擾神經性疾病或損傷之治療或癒合。因此，罹患神經性疾病或損傷之個體的飲食及環境中也應避免神經生成抑制性化合物。
「候選化合物」係指欲利用此處所述之方法測試其神經生成調節性質之任何化合物。該候選化合物包括但不限於天然發生之物質、合成性化合物或萃取物，例如植物或動物組織、真菌或細菌之萃取物。候選化合物可能被單獨測試，或可能與其他候選化合物或已知神經生成調節性化合物一起測試，以觀察協同效應或達到高通量篩選化合物之目的。
在某些實施態樣中，該方法另包含提供ADSC之陰性對照培養以與候選化合物比較。因此，該方法另包含在候選化合物不存在時培養ADSC，測定該在候選化合物不存在時培養之ADSC之神經生成程度，以及比較在候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度與在候選化合物不存在時所培養之ADSC之神經生成程度。若在該候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度，相較於該候選化合物不存在時所培養之ADSC之神經生成程度增加，顯示該候選化合物係促神經生成化合物。相反地， 若在候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度，相較於該候選化合物不存在時所培養之ADSC之神經生成程度減少，顯示該候選化合物係抑制神經生成化合物。因此，陰性對照培養提供有關候選化合物之神經生成調節性質之額外資訊。
在其他實施態樣中，該方法另包含提供一種陽性對照培養。因此，該方法另包含在已知促神經生成化合物存在時培養ADSC，以及測定在該促神經生成化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度。舉例來說，已知DHA能促進早期腦部發育，因此可被用來作為陽性對照。因此，該方法可能另包含在DHA存在時培養ADSC。若在該候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度，相較於DHA存在時所培養之ADSC之神經生成程度增加，顯示該候選化合物係比DHA更優異之促神經生成化合物。
在神經生成期間，ADSC可能分化成神經元細胞、神經元細胞之前體以及具有神經元性質之細胞。因此，神經生成之程度可藉由觀察細胞之型態改變測定。表示神經生成之細胞型態改變包括但不限於細胞質收縮、神經突形成、樹突樣突出形成、軸突形成或彼等之組合。其包表示神經生成之細胞型態改變包括發生類似雙級、三級以及多極神經元細胞之型態。
上述之細胞型態學改變可利用顯微鏡技術觀察，例如相差顯微鏡。在培養ADSC期間可能拍攝多次 ADSC之相差顯微鏡影像。舉例來說，可能在與候選化合物培養之前拍攝影像，在添加該候選化合物後(例如三小時後)拍攝一或多次，並且之後每天拍攝一次。
神經生成之程度可被進一步測定，例如測量表現神經元分化之ADSC的百分比以及測量細胞中之細胞質突出(如神經突、軸突及樹突)的長度。表現神經元分化之ADSC的百分比以及細胞質突出的長度可利用具有適當附加元件之Image J開放軟體測量。
細胞生物標記之改變發生在神經生成期間。因此，在一些實施態樣中，神經元標記之細胞表現試驗被用來測定神經生成之程度。該等生物標記之實例包括但不限於蛋白質如神經絲、髓磷脂鹼性蛋白、巢蛋白、β-III微管蛋白、神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、S100(一種鈣結合蛋白)、微管相關蛋白2(MAP2)、CNP酶及GABA受體。其他用於測定神經元分化之技術包括免疫組織學染色神經元標記、神經元興奮性測量以及西方墨點法測量神經蛋白質表現。
在一些實施態樣中，ADSC係人脂肪組織衍生之幹細胞(hADSC)。hADSC可被有利地維持於培養中及簡單地繼代以提供多重子代培養。另外，hADSC很容易取得，因為它們可自例行抽脂手術所取得之人脂肪組織分離然後冷凍保存。hADSC具有易於自個別病患取得之額外優點。如此獲得之hADSC可被用於本發明之方法以篩選供個人化使用之候選化合物。因此，個人化且理想化 之營養、藥物治療或測定對神經毒素之敏感性皆可利用本發明之方法達成。
ADSC可經培養一段足以讓神經生成發生之時間。神經生成可在不同時間觀察到，視該受測之腦營養物而定。因此，在一些實施態樣中，神經生成可能在培養後數小時觀察到，而在其他實施態樣中，神經生成可能在培養後數天觀察到。舉例來說，ADSC可經培養約1小時至約5天、約1小時至約3天、約3小時至約36小時、約12小時至約24小時或約24小時至約36小時。另外，ADSC之培養可持續1、2、3或4週以達到更完全之神經元分化。ADSC之培養可進一步在提高之溫度中進行，例如室溫以上之溫度。該等溫度包括約25至約45℃、約30至約40℃或約37℃。
在前述方法中，ADSC可被有利地培養於支持或促進神經生成之培養基中，例如引導ADSC分化成神經元細胞。在一些實施態樣中，該培養基包含神經基底培養基、表皮生長因子(EGF)、鹼性纖維母細胞生長因子(b-FGF)、N2添加劑及L-麩胺醯胺。該些培養基之成分可購自商業來源。舉例來說，神經基底培養基可為購自Invitrogen之NeurobasalTM培養基。Neural Basal Medium TM可包含表1列示之成分：
Figure TWI613446BD00001
N2添加劑可購自Invitrogen。Invitrogen N2添加劑可能包含下列成分：
Figure TWI613446BD00002
舉例來說，該培養基可能包含約1至約100、約5至約50、約10至約25，或約20ng/mL之EGF。該培養基另包含約1至約100ng/mL、約5至約50、約10至約25，或約20ng/mL之b-FGF。N2添加劑可能以約1×之濃度存在於培養基中，L-麩胺醯胺可能以約0.1至約10mM、約1至約5mM，或約1.3至約3mM之量存在。該培養基可能另外包含適當量之候選化合物，例如自約0.1nM至約10mM，或1nM至約1mM。
在某些實施態樣中，該培養基係實質上不含血清，或較佳為完全不含血清。實質上不含血清之培養基係指具有少於約10%血清、更具體為少於約2%或0.1%血清之培養基，在某些實施態樣中，實質上不含血清係指少於約0.5%血清。完全不含血清之培養基具有0%血清。雖然不受任何特定理論束縛，一般相信血清可能包含不一致且未經測定量之生長因子，其可能影響神經生成之程度。 因此，不含血清之培養基排除血清對神經生成程度之可能影響。如此一來，在培養於不含血清培養基中的ADSC所觀察到之神經生成可被歸因於候選化合物而非血清之存在。
前述方法可被用於快速神經元分化平台(RNDP)。RNDP可被有利地用於快速篩選大量之潛在神經生長調節性化合物。化合物可利用多孔盤及/或藉由同時測試多種化合物或化合物庫之快速篩選以得到高通量結果。在RNDP識別之化合物若有需要可利用延時平台進一步測試。
延時神經元分化平台(ENDP)另外包含一預備步驟。ENDP可用於進一步研究及證實RNDP之結果。雖然不受任何特定理論束縛，一般認為預備ADSC能夠獲得增進之神經元型態，藉以提供更多關於給定化合物之神經生成調節潛力之資訊。因此，在一些實施態樣中，ADSC在有候選化合物存在時培養之前係經預備。舉例來說，該ADSC可被置於適當之預備培養基中預備約1至約5天，然後才與候選化合物一起培養。在其他實施態樣中，ADSC可經預備約1至約3天，或約3天。
在一些實施態樣中，該預備培養基包含神經基底培養基(如購自Invitrogen之Neurobasal Medium TM)，以及適當濃度之EGF、b-FGF及N2添加劑。適當濃度之EGF包含約1至約100ng/mL、約5至約50、約10至約25，或約20ng/mL。適當濃度之b-FGF包含約1 至約100、約5至約50、約10至約25，或約20ng/mL之b-FGF。N2添加劑可以約1×之濃度存在於培養基中。該預備培養基可實質上不含血清，或更佳地完全不含血清。實質上不含血清之預備培養基係指具有少於約10%血清之培養基，例如少於約2%或0.1%血清，而完全不含血清之培養基具有0%血清。另外，該預備培養基可能不含或實質上不含候選化合物。
在其中ADSC在與候選化合物一起培養之前先經預備之實施態樣中，該ADSC接著於適當之培養基中培養約1至約5天。在其他實施態樣中，該ADSC係經培養約1至約3天，或約3天。在預備後，移除該預備培養基並加入培養基至該ADSC。該培養基包含例如可購自Invitrogen之MesenPRO complete。該培養基可另包含適當量之候選化合物，例如約0.1nM至約10mM，或1nM至約1mM之候選化合物。在陰性對照實驗中，該培養基不含或實質上不含候選化合物。在陽性對照實驗中，該培養基包含已知之促神經生成化合物，如DHA。
在一些實施態樣中，用於培養ADSC之培養器皿係經獨特之基質蛋白質組合塗覆，此設計是為了模擬中樞神經系統之體內環境，最大化細胞性神經元分化活性，並增進細胞附著。在一實施態樣中，該塗覆包含聚L-鳥胺酸及牛血漿纖維黏連蛋白。經塗覆之培養器皿可藉由使該培養器皿與聚L-鳥胺酸溶液及牛纖維黏連蛋白溶液接觸製備。該接觸步驟可以任何順序、同時或實質上同 時進行。舉例來說，該培養器皿可在與牛纖維黏連蛋白接觸之前或之後與聚L-鳥胺酸接觸。或者，該聚L-鳥胺酸及牛纖維黏連蛋白係與該培養器皿同時或實質上同時接觸。
本發明之另一態樣關於一種促進ADSC之神經生成之試管內方法，該方法包含：在促神經生長化合物存在時培養ADSC。由前述方法產製之神經元細胞及類神經元細胞可於培養基中維持、繼代或經冷凍保存。該方法因此可提供用於實驗室如用於藥物篩選之人神經元細胞及類神經元細胞。在一些實施態樣中，該方法另包含測定ADSC之神經生成之程度，如前述篩選方法中所述。
本發明之另一態樣關於用於識別神經生成調節性化合物之系統，包含：ADSC、包含模擬中樞神經系統之塗層的培養器皿以及培養基。在一些實施態樣中，該塗層包含牛纖維黏連蛋白及聚L-鳥胺酸。在用於RNDP之系統中，該培養基包含神經基底培養基、EGF、b-FGF、N2添加劑以及L-麩胺醯胺。用於ENDP之系統另預備培養基，例如包含神經基底培養基、EGF、b-FGF及N2添加劑之培養基，以及包含MesenPRO Complete之培養基。
hADSC
下列實施方式所使用之hADSC係購自商業來源，並生長於由Complete MesenPRO RS培養基與添加劑 及L-麩胺醯胺所組成之維持培養基中。當hADSC之細胞培養長滿時，進行繼代培養。為了繼代hADSC，使用下列方法：i)抽吸細胞培養器皿中之Complete MesenPRO RS培養基，ii)以Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水(DBPS)清洗細胞層之表面，清洗方式為添加DPBS至器皿中細胞層附著側之對側，來回搖動該器皿數次，iii)抽吸移除DPBS並丟棄之，iv)脫附細胞，添加足夠體積之不含苯酚紅之預熱胰蛋白酶-EDTA溶液，以收集該細胞層，v)於37℃培養約7分鐘，vi)在顯微鏡下觀察細胞，以決定是否需要額外培養，vii)添加3mL之維持培養基至細胞盤，混合細胞懸浮液，添加懸浮液至15mL離心管並於210g離心5分鐘，viii)利用血球計測定細胞總數及存活百分比，ix)添加Complete MesenPRO RS培養基至各器皿以使終培養體積成為每cm2 0.2mL-0.5mL，x)接種細胞，添加適當體積之細胞至各器皿，於37℃、5% CO2及90%濕度下培養，以及xi)接種後3或4天，完全移除該培養基，並更換相等體積之Complete MesenPRO RS培養基。
塗層
在接種該經繼代之hADSC至新鮮培養盤之前，以無菌DPBS溶液清洗該培養器皿之表面三次，然後以無菌水潤洗數次。該塗層之第一層係聚L-鳥胺酸。藉由添加0.1mg/mL之聚L-鳥胺酸並於37℃培養1小時以 製備該塗層。用DPBS清洗培養盤三次，每次清洗15分鐘。該塗層之第二層係牛血漿纖維黏連蛋白。該纖維黏連蛋白原液係經DPBS稀釋至1：1000，並於各孔中添加500μL。使該孔盤靜置於室溫中1小時。最後再用每孔500μL之DPBS清洗一次，然後立即使用該孔盤。
培養基
hADSC可被維持在未分化狀態或利用不同培養基引導分化。某些培養基能引導ADSC分化成為神經元細胞。示範性培養基如表3、4及5所述。
Figure TWI613446BD00003
Figure TWI613446BD00004
Figure TWI613446BD00005
RNDP程序
二種獨立的篩選程序係經描述命名為快速神經元分化平台(RNDP)以及延時神經元分化平台(ENDP)。RNDP程序提供快速篩選，在相對較短之時間期間大量篩選候選化合物。RNDP能夠快速識別促進或抑制神經生成，或對神經生成無影響之化合物。在RNDP之後可進行ENDP，以進一步研究及證實該結果。
上述之hADSC培養基係自培養盤移除，接著用5-10mL之無菌DPBS輕柔清洗該培養盤。移除DPBS，添加1.5mL之胰蛋白酶-EDTA以完全覆蓋細胞層。將該盤放回培養箱7分鐘。然後輕拍該盤以完全脫附細胞，添加3mL之維持培養基至該盤，然後混合該細胞懸浮液並將之加入15mL離心管。該所欲之細胞密度(1×104細胞/孔)被加至另一15mL試管，於210g離心5分鐘。以適當體積之預熱不含血清之快速神經元分化培養基(如表1所示)重懸細胞團塊，並接種至組織培養盤之各孔。於各孔依序添加候選化合物。將該盤放回培養箱。候選化合物之影響可利用相差顯微鏡影像快速且容易地觀察，通常在臨處理前、處理後3小時以及之後每天各拍攝一次共3天。由於具有快速轉換時間，因此最佳結果通常 發生在36小時內。收集到影像之後，進行資料分析及比較以測定各化合物或化合物之混合物調節神經生成之有效性。神經元分化係藉由觀察神經元型態加以測定。一些細胞之改變包括細胞質收縮、軸突形成及樹突樣細胞質突出形成。這些變化始於hADSC之細胞質向細胞核縮回，以形成具有細胞質突出之收縮細胞本體。最後發展成類似雙極、三極和多極神經元細胞之細胞型態。
ENDP程序
ENDP程序提供進一步研究RNDP結果之方法，也提供hADSC額外之預備時間以進一步分化成各種神經元細胞系。雖然不受任何特定理論束縛，該預備使hADSC自中胚層細胞系轉分化成神經外胚層。
hADSC被接種於具有塗層表面之培養盤，在不含血清之ENDP預備培養基(見表2)生長至少72小時。移除預備培養基，添加神經元分化培養基(見表3)，其中有至少一種候選化合物存在或不存在。接著培養細胞一段延長之時間以供神經元進一步發展。在培養3天後，在顯微鏡下檢查細胞之型態學改變。神經突之百分比及長度可利用具有適當附加元件之Image J開放軟體測量。另外可測定細胞之各種神經元標記以進一步證實神經元分化。
腦營養物之發現
本研究之目的是為了測定各種營養物(候選化合物)之神經生成效應，其使用RNDP及ENDP平台。候選化合物係經個別測試，並與陽性對照二十二碳六烯酸(DHA)以及陰性對照比較。預熱之不含血清培養基包含神經基底培養基以及L-麩胺醯胺、20ng/mL b-FGF、20ng/mL EGF及N2添加劑。候選化合物以各種濃度被添加至各孔之不含血清培養基中。候選化合物係選自ARA、EPA(順-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)及白藜蘆醇。其測試濃度廣泛，自奈莫耳至微莫耳之範圍。該等化合物係經個別測試，並與陽性對照二十二碳六烯酸(DHA)以及陰性對照比較。重複試驗三次。經發現能促進神經生成或顯示具有藥物用途之營養物再進一步經不同組合篩選。這些試驗亦重複三次。
候選化合物之影響可利用相差顯微鏡影像簡單且快速地觀察最多1週，影像通常在以候選化合物臨處理前、處理後3小時以及之後每天各拍攝一次共3天。由於具有快速轉換時間，因此最佳結果通常發生在36小時內。收集到影像之後，進行資料分析及比較以測定各化合物或化合物之組合促進神經生成之有效性。神經元分化係藉由神經元型態測定。這些細胞改變包括細胞質收縮、軸突形成及樹突樣細胞質突出(神經突)形成。這些變化始於hADSC之細胞質向細胞核縮回，以形成具有細胞質突出之收縮細胞本體。最後發展成類似雙極、三極和多極神經元細胞之細胞型態。
在上述之候選化合物中，白藜蘆醇、ARA、EPA、膽固醇及DHA係能有效促進神經生成之化合物實例。測試濃度及有效濃度係說明於表6。
Figure TWI613446BD00006
本發明中指涉之所有單數特徵或限制應包括該對應之複數特徵或限制，反之亦然，除非在該指涉之上下文中另外特別指明或清楚示意為相反。
本發明所使用之方法或程序步驟之所有組合可以任何順序進行，除非在該指涉之組合的上下文中另外特別指明或清楚示意為相反。
本發明之方法及組成物(包括彼之組分)可包含下列、由下列組成或實質上由下列組成：此處所述之實施態樣之必要元件及限制，以及此處所述之任何額外或可任選之成分、組分或限制。
此處所使用之用語「約」應被視為指涉任何範圍所指明之兩個數字。對於一範圍之任何指涉應被視為提供對該範圍內之任何亞群之支持。

Claims (14)

  1. 一種用於識別神經生成調節性化合物之方法，該方法包含：在候選化合物存在時培養脂肪組織衍生之幹細胞(ADSC)，測定該ADSC之神經生成程度，在二十二碳六烯酸(DHA)存在時培養ADSC，測定在DHA存在時所培養之ADSC之神經生成程度，及比較在該候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度與DHA存在時所培養之ADSC之神經生成程度，其中在該候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度相較於DHA存在時所培養之ADSC之神經生成程度增加，顯示該候選化合物係促神經生成化合物。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其另包含：在該候選化合物不存在時培養ADSC，測定在該候選化合物不存在時所培養之ADSC之神經生成程度，及比較在該候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度與該候選化合物不存在時所培養之ADSC之神經生成程度。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中在該候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度相較於該候選化合物不存在時所培養之ADSC之神經生成程度增加，顯 示該候選化合物係促神經生成化合物。
  4. 如申請專利範圍第2項之方法，其中在該候選化合物存在時所培養之ADSC之神經生成程度相較於該候選化合物不存在時所培養之ADSC之神經生成程度減少，顯示該候選化合物係抑制神經生成化合物。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中神經生成之程度係藉由觀察ADSC之細胞型態的改變測定。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該細胞型態之改變係細胞質收縮、神經突形成、樹突樣突出形成、軸突形成或彼等之組合。
  7. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該細胞型態之改變係藉由顯微鏡觀察。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該細胞型態之改變係藉由相差顯微鏡觀察。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該脂肪組織衍生之幹細胞係人脂肪組織衍生之幹細胞(hADSC)。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該ADSC係於候選化合物存在時培養1至5天。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該ADSC係於包含神經基礎培養基、EGF、b-FGF、N2添加物及L-麩胺醯胺之培養基中培養。
  12. 如申請專利範圍第1項之方法，其另包含在該候選化合物存在時培養該等ADSC之前，使該等細胞於預備培養基中預備1至5天。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該預備培養基包含神經基礎培養基、EGF、b-FGF及N2添加物。
  14. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該ADSC係於候選化合物存在時培養1至5天。
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