KR100937456B1

KR100937456B1 - 인간배아줄기세포를 조골세포 직계열로 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR100937456B1
Application number: KR1020070077440A
Authority: KR
Inventors: 조이숙; 이규원
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-08-01
Filing date: 2007-08-01
Publication date: 2010-01-19
Also published as: KR20090013376A; US20100297755A1; WO2009017269A1; US8093050B2

Abstract

본 발명은 세포내 mTOR 신호전달과정을 억제함으로써 인간배아줄기세포를 조골세포 직계열(osteogenic lineage)로 분화 유도하는 조성물 및 이를 이용하여 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 mTOR의 신호전달과정을 억제하는 물질을 인간배아줄기세포의 배양배지에 첨가하여 배양하였을 때 조골세포 직계열로의 분화가 효과적으로 유도됨을 확인하였다. 본 발명의 조성물 및 이를 이용하여 분화된 인간배아줄기세포들은 조골세포의 발생과정 및 분화기전 그리고 골다공증을 포함한 골 손상 및 골 대사 관련 질환의 발병원인을 규명하는데 이용될 수 있으며, 또한 임상적으로 유용한 분화가 완료된(terminally differentiated) 성숙 세포 또는 전구세포를 확보하기 위한 조골세포 분화유도기술개발에 활용될 수 있다.

인간 배아줄기세포(human embryonic stem cells), 분화(differentiation), mTOR, PI3K, AKT, 조골세포(osteoblast), 라파마이신(rapamycin)

Description

인간배아줄기세포를 조골세포 직계열로 분화시키는 방법{A Method for differentiating of human embryonic stem cells into the osteoblastic lineage}

본 발명은 인간배아줄기세포의 배양배지에 mTOR의 신호전달을 억제하는 물질을 첨가하여 배양함으로써 인간배아줄기세포를 효과적으로 골세포 직계열로 분화 유도하는 방법 및 그러한 분화 유도 조성물에 관한 것이다.

최근 재생의학 및 의료산업개발 분야에서 줄기세포, 특히 인간 배아줄기세포의 세포치료제로서의 활용 가능성이 높게 시사되고 있으며, 이에 대한 경제 및 산업적 이용 및 부가가치가 인정되면서 인간배아줄기세포로부터 특정 기능을 담당하는 세포로의 분화유도기술 및 관련 물질 개발의 중요성이 부각되고 있다. 1981년 Evans와 Kaufman이 생쥐 배아에서 배아줄기세포의 배양을 최초로 성공하면서 생쥐 배아줄기세포는 배아줄기세포 연구 및 분화유도 기술 개발을 위한 기반 및 연구의 주재료로 이용되고 있다.

배아줄기세포는 생체 외 배양조건에서 분화하지 않고 정상적인 핵형을 유지 한 채 지속적으로 자가 증식할 수 있는 능력이 뛰어나며 또한 배양 환경에 따라 이론적으로 생체를 구성하고 있는 거의 모든 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다는 특성으로 인해 연구 및 기술개발의 중요성이 강조되고 있다. 1998년 Thomson 등에 의해 인간 배반포의 세포 내부괴에서 인간 배아줄기세포 배양이 성공한 이래 인간배아줄기세포를 이용한 기술 개발, 특히 조직 세포 특이적 분화 유도 기술의 개발이 활발히 진행되고 있다. 다수의 연구 보고에서 인간배아줄기세포가 생체 외 배양조건에서 망막세포 전구세포(Lamba DA et al., 2006), 신경세포( Li XJ et al., 2006; Zhang SC et al., 2001), 조혈세포(Tian X et al., 2005; Kaufman DS et al., 2005; Kaufman DS et al., 2001), 심근세포(Kehat I et al., 2003; Kehat I et al., 2001), 췌장세포(Assady S et al., 2001) 등으로 분화 유도됨이 보고되어 있으며, 또한 관련 질환의 세포치료제로서의 활용 가능성이 함께 제시되고 있다(Zhang SC et al., 2001).

인체의 골은 형성과 재형성 과정을 통해 항상성을 유지한다. 재형성은 조골세포 및 파골세포로 구성된 골 다세포성 단위체(bone multicellular unit: BMU)에서 일어나며 이들 세포는 각각 조골형성과 골흡수 과정에서 중요한 역할을 한다. 이 과정에서의 두 세포 간 협력체계에 손상이 올 경우 골다공증 등을 포함한 다양한 골대사 질환이 생기게 된다. 하지만 현재까지 완치를 위한 효과적인 치료법이 없으며 예방이 강조되고 있는 실정이다.

최근 생체 외 배양조건에서 줄기세포 분화유도 기술을 이용하여 조골세포를 생산하고 이를 이용하여 골조직의 기능을 강화하거나 손상을 치료하고자 하는 노력이 급증하고 있다. 골을 형성하는 조골세포는 자연적으로는 중간엽 줄기세포로부터 파생하기 때문에 (Caplan AI, 1991) 중간엽세포를 이용한 골세포 분화 유도 및 이를 세포치료제로 활용하기 위한 기술개발이 활발히 이루어지고 있다(Halleux C et al., 2001; Jaiswal N et al., 1997; Hashimoto J et al., 2006; Hofmann S et al., 2007; Xin X et al., 2007; Quarto R et al., 2001). 성체 조직에 존재하는 중간엽세포는 자가 골이식에 의한 골재생의 중요한 수단이 될 수 있지만 성체 조직에 존재하는 중간엽세포의 수가 매우 적고 골수천자에 의한 세포의 채취 과정에 어려움이 있다는 단점이 있다. 따라서, 채취된 세포는 임상적용을 위에 생체 외 배양을 통해 필요한 양만큼 세포증식을 해야 하나, 세포분열 수량이 한정적이라는 점과 이 과정에서 세포 변이가 유도 될 수 있다는 점 등이 중간엽세포 이용의 병목점으로 작용하고 있다. 중간엽세포의 경우 생체 외 배양조건에서 계대배양을 9번 이상하면 노화가 진행되어 줄기세포의 특성 및 골형성 잠재능을 상실한다고 보고된 바 있다(Bonab MM et al., 2006) . 발달 초기단계의 분화능을 가진 인간배아줄기세포는 골세포 분화 기전을 이해하는데 중요한 수단이 될 수 있을 뿐만 아니라 인체 외 배양조건에서 무한대로 증식할 수 있다는 특성으로 인해 상대적으로 많은 양을 효과적으로 수급할 수 있어 상당수의 환자 치료에 적용될 수 있다는 장점을 가지고 있다.

현재 골형성 첨가물(Osteogenic supplement)로 사용되고 있는 아스코르브산, 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 덱사메타손 (dexamethasone) 등이 인간배아줄기세포의 골세포 분화유도에 효과적임이 보고된 바 있고(Karp JM et al., 2006; Cao T et al., 2005; Bielby RC et al., 2004; Sottile V et al., 2003), 이외 골조직에서 추출한 세포와 인간배아줄기세포를 공배양하여 조골세포의 분화를 유도하는 방법(Ahn SE et al., 2006), 인간배아줄기세포로부터 유래된 중간엽줄기세포로부터 조골세포를 분화 유도하는 방법(Barberi T et al., 2005; US2005/0282274 A1) 등이 보고되고 있다. 현재 엑티빈, 골형성 단백질(Bone Morphogenic Protein: BMP), 인히빈, 성장/분화 인자 (growth/differentiation factor: GDF) 등을 포함하는 변형 성장 인자 베타계 (Transforming Growth actor-beta (TGF-beta) subfamily)가 골조직의 형성과 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 특히 BMP2 또는 BMP4 등을 배양배지에 첨가하여 배양할 경우 조골세포로의 분화유도가 증가됨이 보고되고 있다. 그러나 임상적으로 우수한 기능을 수행할 수 있는 세포치료제 확보를 위한 조골세포 분화 기전 이해와 분화유도기술이 아직은 미약한 수준으로, 이를 극복하기 위해서는 골세포 분화유도에 관여하는 인자 및 작용기전을 이해하는 것이 중요하다. 또한 이들의 활성을 조절하는 물질을 발굴하여 분화유도 기술에 활용하는 것이 매우 중요하다고 할 수 있다.

배아줄기세포의 증식 및 분화를 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PI3K/AKT 신호전달과정의 중요한 하향신호전달 분자인 mTOR(the mammalian target of rapamycin; 포스포이노시티드 카이네이즈 관련 카이네이즈계 (phosphoinositide kinase-related kinase(PIKK) family))는 FK506 결합 단백질 12(FK506-binding protein 12: FKBP12)와 복합체를 형성하는데, 라파마아신은 FKBP12와 결합함으로써 mTOR의 신호전달체계를 억제한다. mTOR는 하향조절자인 p70S6 카이네이즈 1(p70S6 kinase 1: S6K1)과 진핵성 개시인자 결합 단백질 1(euryotic initiation factor 4E (eIF4E) binding protein 1: 4E-BP1)을 인산화함으로써 단백질의 합성 등 다양한 세포내 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다(Harris TE et al., 2003). 면역억제제로 알려진 라파마이신이 간엽줄기세포를 포함한 여러 세포주에서 조골세포로의 분화유도활성이 있다고 보고되고 있으며(Ogawa T et al., 1998; Tang L et al., 2002), 골소실에 대한 치료효과가 있다고 보고되고 있다(US2006/0173033 A1). 또한 줄기세포에서 mTOR의 활성을 증가시키는 포스파티드산과 같은 경쟁제는 줄기세포의 자가재생산을 증가시키며 mTOR의 활성을 억제하는 1-부탄올, 라파마이신과 같은 길항제는 줄기세포의 분화를 유도한다고 보고된 바 있다(WO 2006/027545 A2, A3).

인간배아줄기세포에 대한 연구의 많은 부분이 생쥐배아줄기세포의 연구 결과를 기반으로 이루어지고 있으나, 인간배아줄기세포의 증식 및 분화 관련 특성과 이와 관련된 분자적 조절 기전 등이 생쥐배아줄기세포와는 상당히 다름이 보고되고 있다. 이에 본 발명에서는 세포의 신호전달과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 mTOR의 활성억제물질을 인간배아줄기세포의 배양배지에 첨가하여 배양하였을 때 효과적으로 조골세포 직계열(lineage)로 분화 유도함을 확인하였고, 분화 유도된 세포의 특성을 분석함으로써 발명을 완성하였다.

본 발명은 인간배아줄기세포에서 신호전달분자 mTOR의 신호전달과정을 억제하는 물질을 포함하는, 인간배아줄기세포를 조골세포 직계열로 분화 유도하는 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 배양액 내에서 배양함으로써 인간배아줄기세포를 조골세포 직계열로 분화 유도하는 방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 첫 번째 양태에서는 mTOR의 신호전달과정을 억제하는 물질을 포함하는 인간배아줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 조성물을 제공한다. 바람직하게, 상기 mTOR의 신호전달과정을 억제하는 물질은 mTOR 신호전달과정의 하류(down-stream) 또는 상류(up-stream)에서 mTOR의 활성을 억제하는 물질로서, 라파마이신, PI3K 억제제 및 AKT 억제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물이다.

본 발명에서, "mTOR(mammalian target of Rapamycin)"은 FKBP12 라파마이신 관련 단백질(rapamycin-associated protein: FRAP/RAFT/RAPT/SEP)이라고도 불리며 포스포이노시톨 카이네이즈 관련 카이네이즈계(phosphoinositol kinase-related kinase family: PIKK family)와 진화적으로 보존된 세린/쓰레오닌 단백질 카이네이 즈의 일종을 말한다. mTOR은 아미노산, 성장인자, 인슐린, 분열촉진제 등의 자극에 의한 유전자 번역 개시를 통하여 세포의 성장을 조절하는데 관여하며, 유전자 번역 개시는 리보좀의 p70S6k 단백질 카이네이즈(p70S6k protein kinase: S6K1)에 의해 일어나고 eIF4E 억제제(eIF4Einhibitor: 4E-BP1)에 의해 억제된다. mTOR은 액틴 구성, 막중계성 분비, 단백질 분해, 리보좀 생성 등에 관여할 것이라 예상되는 단백질이다(Schmelzle T et al., 2000).

본 발명에서 mTOR의 하류(down-stream) 신호전달과정을 억제하여 mTOR의 활성을 억제하는 물질로는 하기 화학식 1로 표시되는 라파마이신을 들 수 있다. 라파마이신(Calbiochem사 제품)은 FK-506 결합 단백질(FK-506 binding protein: FKBP12)과 복합체를 형성하며, 이렇게 형성된 FKB12-라파마이신 복합체는 mTOR과 반응하여 mTOR의 기능을 억제한다.

mTOR 신호전달과정의 상류(upstream)에서 작용하여 mTOR의 신호전달과정을 억제하는 물질로는 PI3K 억제제 및 AKT 억제제를 들 수 있는데, PIK3 억제제로는 하기 화학식 2로 표시되는 "LY294002(Calbiochem사 제품)" 화합물이 알려져 있다. LY294002는 PI3K의 억제제로서 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이다. LY294002는 PI3K를 억제하는 반면, PI4K, EGR 수용체, PDGF 수용체, 인슐린 수용체, MAP 카이네이즈, S6 카이네이즈 등은 억제하지 않는다.

mTOR 신호전달과정의 상류(upstream)에서 작용하여 mTOR의 신호전달과정을 억제할 수 있는 AKT 억제제로는 역시 Calbiochem에서 판매하는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물이 알려져 있다. 본 발명에서 AKT 억제제라 함은 하기 화학식 3의 화합물을 지칭하는 것으로 이해할 수 있다.

본 발명에서, "인간배아줄기세포"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴를 추출하여 체외에서 배양한 것으로 인체의 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency)을 가지는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 인간배아줄기세포로부터 유래한 배아체도 포함한다.

본 발명에서, "조골세포"는 골을 형성하는 입방형의 세포로, 골 형성 및 재형성 작용을 하는 세포를 의미한다. 골은 골세포와 골기질로 구성되는데 골세포는 다시 조골세포와 파골세포로 나뉜다. 파골세포는 뼈의 계속된 성장을 위해 기존의 골성분을 용해, 분해하여 골기질을 흡수하며,조골세포는 파골세포에 의해 분해된 부분에 콜라겐을 격자모양으로 만들고 거기에 칼슘, 마그네슘, 인 등을 부착시켜 골기질을 새롭게 만들어낸다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 도 1에서 보는 바와 같이 인간배아줄기세포에서 세포의 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PI3K down-stream 신호 전달과정의 활성을 조절하는 화합물로서 라파마이신, LY294002, 또는 AKT 억제제가 첨가된 배양배지를 이용하여 인간배아줄기세포(도 2) 또는 인간배아줄기세포 유래 배아체(도 3 및 4)를 배양하여 이들을 조골세포 계통으로 분화를 유도하고, 도 5 내지 8에서 보는 바와 같이 조골세포 특이적 유전자의 발현을 역전사 효소중합반응을 통해 확인하였다. 도 2의 단계 II(Stage II)에서 10 mM LY294002, 0.1 mM AKT 억제제, 또는 20 nM 라파마이신이 포함된 배양배지에서 인간배아줄기세포를 5일 동안 배양하거나 도 3의 단계 II(Stage II)에서 10 mM LY294002, 0.1 mM AKT 억제제, 또는 20 nM 라파마이신이 포함된 배양 배지에서 인간배아줄기세포 유래 배아체를 3주 동안 배양하였을 때 조골세포 특이적 유전자의 발현이 증가함을 확인함으로써, 이들 세 화합물이 조골세포 분화유도능이 있음을 확인하였고, 이중 라파마이신은 낮은 농도에서도 가장 효과가 높음을 관찰하였다(도 6). 또한 도 3의 단계 II(Stage II)에서 20 nM 라파마이신이 포함된 배양 배지에서 인간배아줄기세포 유래 배아체를 3주 동안 배양하였을 때 인산칼슘이 침착된 조골세포에만 특이적으로 염색되는 알츠아드린 레드 S 염색법(도 10)과 late osteoblastic marker인 BSP와 osteocalcin의 항체를 이용한 면역 형광염색법(도 9)을 이용하여 검증하였을 때 모두 양성염색을 확인하였고, 이로부터 성숙(mature) 조골세포로의 분화를 확인하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 1. mTOR 억제제로 사용된 라파마이신을 첨가하여 배양한 경우, 2. 기존의 조골세포의 분화에 효과적인 것으로 알려진 골형성 첨가물(Osteogenic supplements: β-glycerophosphate, Dexametazone, 및 L-ascorbic acid)을 첨가하여 배양한 경우, 및 3. 라파마이신과 골형성 첨가물 (Osteogenic supplements: β-glycerophosphate, Dexametazone, L-ascorbic acid)을 함께 첨가하여 배양한 경우에서의 조골세포 분화유도능을 검증하였다. 이 때, 라파마이신이 단일 화합물임에도 불구하고 세포의 형태 상으로도(도 2), 그리고 조골세포 특이적인 유전자의 발현 정도에서도(도 7 내지 8) 기존의 골형성 조성물의 분화 유도 효과와 동등 이상의 결과를 나타냄을 확인하였다. 20 nM 라파마이신을 도 3의 단계 II(Stage II)에서 3 주 동안 처리하였을 때 성숙 조골세포(mature osteoblast)로의 분화가 가장 효율적으로 이루어졌음을 확인하였고, 골형성 조성물(Osteogenic supplements: β-glycerophosphate, Dexametazone, L-ascorbic acid)과 함께 라파마이신을 처리하였을 때는 2 주 동안 배양하여도 조골세포 특이적인 유전자의 발현(도 11) 및 성숙 조골세포로의 분화가 효과적으로 이루어짐을 확인하였다(도 12).

한편, 도 3에서 보는 바와 같이, 배아체를 형성한 후 분화를 유도하기 위해 인간배아줄기세포를 계대배양 48 시간 후 새로운 배양액으로 교환하여 4일 동안 배양하고 콜로니 형태로 자란 인간배아줄기세포를 사방 500 μM 크기로 작제하였다. 이를 4일 동안 부유배양하여 배아체를 만든 후 서로 다른 농도의 LY294002(0-50 μM), AKT 억제제(0-20 μM), 및 라파마이신(0-200 nM)이 각각 첨가된 분화배지에서 1- 3주 동안 배양하였다. 이때 상기 각 억제제를 처리하지 않은 대조군에 비하여 각각의 억제제를 처리한 세포에서 조골세포 특이적 유전자의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 5 내지 8). 도 3A의 모식도와 같이 인간배아줄기세포로부터 배아체를 형성한 후 배아체를 그대로 부착한 경우나, 도 4A의 모식도와 같이 단일세포로 작제하여 배양접시에 부착한 후 상기 화합물을 처리하였을 경우 모두에서 효과적으로 조골세포 분화가 이루어짐을 확인하였다. 이와 같이 단일세포로 작제하여 분화를 유도하는 방법은 분화된 세포의 특성을 규명하기 위한 정량, 정성분석에 유용할 것으로 기대된다.

본 발명에 따라 인간 배아줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 조성물은 바람직하게 배지 조성물 형태로 제공될 수 있으며, 이때 배지 조성물은 상기한 mTOR 활성 억제제, 즉, 라파마이신, LY294002, 및 AKT 억제제 외에도 당해 분야에서 잘 알려진 기존의 골형성 유도 조성물 및 배지 조성물의 기본 첨가물을 포함할 수 있다. 배지 조성물의 기본 첨가물로는 혈청, 아미노산, 항생제, 분화 억제를 위한 인자 등이 있다. 한편, 라파마이신은 FK506 및 사이클로스포린(cyclosporine)과 함께 면역억제제로서의 효능이 잘 알려져 있으며, 따라서 이들 FK506 및 사이클로스포린 화합물 또한 인간배아줄기세포의 조골세포 분화유도를 위한 첨가물에 포함될 수 있다.

본 발명의 배지 조성물은, 바람직하게 배양배지 내 mTOR의 억제제가 LY294002의 경우 0.1-50 μM의 농도로, AKT 억제제의 경우 0.1-20 μM의 농도로, 그리고 라파마이신의 경우 0.1-200 nM의 농도로 포함되는 배지 조성물이며, 더욱 바람직하게는 LY294002 0.1-20 μM, AKT 억제제 0.1-10μM, 또는 라파마이신 0.1-100 nM의 농도로 포함하는 조성물이다.

본 발명의 또다른 양태에서는 상기 mTOR 억제제를 포함하는 조성물을 이용하여 인간배아줄기세포를 조골세포로 분화 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 분화를 유도하는 방법에는 크게 부착배양(Adhesion culture)법, 배아체 생성법, 및 단일세포 작제법(Single cell dissociation)이 있는데, 부착배양법은 미분화 인간배아줄기를 배양기 표면에 부착시켜 배양하면서 분화시키는 방 법이며, 배아체 생성법은 줄기세포를 1일간 배양하다 배아체를 생성하여 분화를 유도하는 방법이다. 단일세포 작제법에서는 상기 배아체 생성법에서도 동일하게 배아체를 생성한 후, 4일차에 상기 배아체를 단일세포로 작제한 후 부착배양하는 방법이다.

우선 부착배양법에 대하여 자세히 설명하면, 도 2A에 나타난 바와 같이, 인간배아줄기세포를 20% 넉아웃 시럼 리플레이스먼트(Invitrogen, USA), 0.1 mM 비필수 아미노산(NEAA; Invitrogen, USA), 0.1 mM 베타-머캡토에탄올, 4 ng/ml 인간재조합 염기성 FGF(Invitrogen, USA), 및 1X 페니실린-스트랩토마이신 (Penicillin-Streptomycin; Invitrogen, USA)이 첨가된 DMEM/F12(Invitrogen, USA) 배양배지에서 마이토마이신 C 처리된 MEF (mouse epidermal fibroblast) 영양세포와 함께 2일간 공배양 하고(1단계), 이후 인간재조합 염기성 FGF를 포함하지 않는 상기 배지에서 LY294002, AKT 억제제, 라파마이신, 또는 기존의 골형성 조성물(Osteogenic supplements: 10 mM β-glycerophosphate, 0.1 mM Dexametazone, 0.1 mM L-ascorbic acid)을 첨가하여 5일간 배양하여 조골세포로 분화를 유도하였다(2단계).

배아체 형성법은 도 3A에 개략적으로 나타난 바와 같이, 우선 인간배아줄기세포를 1일간 상기 부착배양법과 동일한 방법으로 배양한 후, 사방형 콜로니로 자란 인간배아줄기세포를 유리파이펫으로 만든 기구를 이용하여 작제하여 배아체를 형성하였고, 이를 4일간 배아체 배양배지(80% Knockout DMEM, 20% 우태아혈청, 1mM L-글루타민, 0.1mM β-머캡토에탄올, 1mM 비필수 아미노산)에서 배양한 후(1단계), 상기 배지에 LY294002, AKT 억제제, 라파마이신, 또는 기존의 골형성 조성물(Osteogenic supplements: 10 mM β-glycerophosphate, 0.1 mM Dexametazone, 0.1 mM L-ascorbic acid))을 첨가하여 3주간 배양하여 조골세포로 분화를 유도하였다(2단계).

단일세포 작제법은 상기 부착배양법 및 배아체 형성법과 같이 인간배아줄기세포를 1일간 배양한 후, 배아체를 형성하고 4일간 상기 배아체 배양배지에서 배양하였다(1단계). 배양 4일째에 배아체를 Trypsin-EDTA/TrypLE Express (Invitrogen) 용액을 이용하여 단일세포화 하고, 이를 다시 부착배양하여 상기 배지에 LY294002, AKT 억제제, 라파마이신, 또는 기존의 골형성 조성물(Osteogenic supplements: 10 mM β-glycerophosphate, 0.1 mM Dexametazone, 0.1 mM L-ascorbic acid)을 첨가하여 3주간 더 배양하여 조골세포로 분화를 유도하였다(2단계).

상기 언급한 3가지 분화방법에 의해 배양된 세포들의 조골세포로의 분화를 확인하기 위한 역전사 중합효소반응(RT PCR), 정량 역전사 중합효소반응 (Quantitative Real-Time PCR), 면역형광염색법, 및 알리자린 레드 에스(Alizarin Red S) 염색법 등을 이용하였다.

그 결과, 도 2A에서 모식도로 보여진 부착배양법으로 라파마이신에 의해 분 화된 세포들은 도 5의 역전사 중합효소반응(RT PCR) 전기영동 사진에서 보는 바와 같이 Cbfa-1, Osteocalcin, Osteoprotegerin 등의 조골세포 특이적인 유전자의 발현이 독립적으로 확립된 서로 다른 두 인간 배아줄기세포주에서 동일하게 미분화 대조군에 비하여 확연함이 확인되었고, Osteocalcin과 Osteonectin의 발현정도를 비교해 보면, 10nM의 농도보다 20nM의 농도에서 더 발현량이 많음을 확인할 수 있었다. 따라서, 분화를 유도하기 위해서는 20nM 정도의 적정 농도로 라파마이신을 배양배지에 첨가하였을 때 세포독성이 적고 조골세포 특이적 유전자 발현을 가장 효과적으로 유도됨을 확인하였다.

또한, 도 3A에서 모식도로 보여진 배아체 형성법으로 분화된 세포들에 대해서도 조골세포로의 분화를 확인하였는데, 도 6에서 보는 바와 같이, 배아체 형성법을 이용하여 조골세포로 분화시킨 세포들에서 조골세포 특이적인 유전자의 발현유무를 중합효소반응(RT PCR)으로 확인하였다. 그 결과, LY294002, AKT, 라파마이신 모두 조골세포 특이적 유전자의 발현을 증가시킴을 확인하였고 이때, LY294002 또는 AKT 억제제로 분화를 유도했을 때보다 라파마이신으로 분화를 유도했을때 분화유도된 배아체에서 조골세포 특이적인 유전자들(BMP2, Osteocalcin, Cbfa-2, Sterix, Osteeoprotegerin, GATA2, CMP)의 발현유무 및 그 발현량에서 좀 더 우세한 결과를 나타내었다. 따라서, 조골세포로의 분화를 유도함에 있어 PI3K 또는 AKT 억제제와 같은 mTOR upstream 신호전달 분자의 활성을 억제 하는 것보다 mTOR down-stream 신호전달과정을 억제하는(down-regulation) 것이 효과적임을 관찰하였다.

라파마이신의 조골세포로의 분화 유도능은 정량 중합효소법(Quantitative Real-Time PCR)(도 7)과 면역형광염색법(도 10) 등과 같은 분자생물학적인 방법 및 알리자린 레드 에스(Alizarin Red S)라는 조골세포에 특이적으로만 염색되는 염색법과 같은 조직학적인 방법에 의해서도 다시 한 번 확인되었다. 도 3A에서 배아체를 라파마이신과 함께 배양하고 1주 후 부터 조골세포 특이적 표지 인자의 발현이 증가됨을 관찰하였으나(도 7), 이로부터 mature osteoblast phenotype을 확인하기 위해서는 3주 동안 지속적으로 라파마이신을 첨가하면서 배양해야 함을 확인하였다.

마지막으로, 배아체를 형성한 후 단일세포화하여 부착배양하는 단일세포 작제법에 의해 분화된 세포에서도 정량 중합효소법(Quantitative Real-Time PCR)(도 8) 및 면역형광염색법(도 11)을 이용하여 조골세포로의 분화를 확인하였다.

라파마이신, LY294002, 및 AKT 억제제 등은 조골세포로의 분화 유도를 위해 상기에서 언급한 바와 같이 다양한 농도로 배양배지에 첨가되어 사용되었는데, LY294002의 경우 10 μM의 농도로 배양배지에 첨가했을 경우, AKT 억제제의 경우에는 1 μM의 농도로 배양배지에 첨가하였을 경우, 그리고 라파마이신의 경우에는 20 nM의 농도로 배양배지에 첨가하였을 때 세포독성이 적고 조골세포 특이적 유전자 발현을 효과적으로 유도함을 확인하였다. 이 과정에서 얻은 인간배아줄기세포 유래 분화세포는 조골세포 전구세포로서, 계속 성장 증식하면 조골세포를 대량으로 얻는데 유용하게 활용될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 조골세포 분화 유도 조성물은 인간배아줄기세포의 배양배지에 mTOR 억제제가 LY294002의 경우 0.1-50 μM의 농도로, AKT 억제제의 경우 0.1-20 μM의 농도로, 또한 라파마이신의 경우 0.1-200 nM의 농도로 포함되는 경우 조골세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있으며, 더욱 바람직하게는 LY294002의 경우 0.1-20 μM의 농도로, AKT 억제제의 경우에도 0.1-10μM의 농도로, 그리고 라파마이신의 경우 0.1-100 nM의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명에서 생산되는 인간배아줄기세포로부터 분화된 조골세포는 골 관련 질환을 치료하기 위한 세포대체 요법용 세포조성물로 이용될 수 있다.

본 발명은 줄기세포로부터 조골세포 직계열로 분화를 촉진하는 조성물 및 이를 이용하여 줄기세포를 조골세포로 분화시키는 방법을 제공함으로 써, 골 관련 질환의 치료를 위한 세포 치료제 개발에 기여할 수 있다. 또한 인간배아줄기세포로부터 조골세포 직계열로의 분화과정을 조절하는 신호전달과정 및 외과학적, 약학적인 연구 및 이해에 기여함으로써 다른 신규 골 관련 인자들을 규명하는데 활용될 수 있으며, 또한 임상적인 관점에서 최종적으로 분화된 성숙세포를 확보하는데, 활용되어 골 관련 질환의 원인 및 치료법 개발에 이용될 수 있다. 본 발명에 의해 생산된 분화세포는 신약 개발 과정에서 요구되는 줄기세포를 이용한 생물학적 약효검증 시스템 특허, 조골세포 분화 유도 물질 및 골조직 기능강화 물질을 개발하기 위한 약효 검증 시스템과 신약 제품화에 활용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 인간 배아줄기세포 배양

본 발명에서는 미분화된 인간배아줄기세포를 유지하기 위해 20% 넉아웃 시럼 리플레이스먼트(Invitrogen, USA), 0.1 mM 비필수 아미노산(NEAA; Invitrogen, USA), 0.1 mM 베타-머캡토에탄올, 4 ng/ml 인간재조합 염기성 FGF(Invitrogen, USA), 및 1X 페니실린-스트랩토마이신(Penicillin-Streptomycin; Invitrogen, USA)이 첨가된 DMEM/F12 (Invitrogen, USA) 배양배지에서 마이토마이신 C 처리된 MEF (mouse epidermal fibroblast) 영양세포와 함께 공배양 하였다. 인간배아줄기세포를 계대배양 하루 전 10% 우태아혈청(Hyclone, USA), 0.1 mM의 비필수 아미노산, 1X 페니실린-스트랩토마이신, 및 0.5 mM 베타-머캡토에탄올이 첨가된 DMEM(Invitorgen, USA) 배양배지에서 유지 배양된 MEF 영양세포는 10 μg/ml 마이토마이신 C(Sigma, USA)에서 1시간 30분 동안 불활성화 한 후, 7.5 X 10⁴ cells/cm² 의 농도로 0.1% 젤라틴(gelatin)(Sigma, USA)으로 코팅한 배양용기에 부착 한 후 사용하였다. 인간배아줄기세포의 계대배양을 위해 콜로니 상태의 인간배아줄기세포를 유리 파스퇴르 파이펫으로 만든 기구를 사용하여 수작업으로 보다 작은 크기의 세포 덩어리로 분리한 후 영양세포 위에 적당한 간격을 유지시키면서 올려놓았다. 세포 덩어리가 영양세포 위에 부착한 약 2일 후부터 매일 배양배지를 교환하였으며, 5-6일 간격으로 계대배양 하였다.

<실시예 2> 인간 배아줄기세포로부터 배아체의 형성 및 단일 세포 형성

인간배아줄기세포의 계대배양시 균일한 크기의 배아체를 얻기 위해 실시예 1에서 기술한 유리 파이펫으로 사방 500 ㎛ 크기로 콜로니 상태의 인간배아줄기세포를 자른 후, 이를 부유상태로 회수하여 박테리아 배양을 위한 배양접시로 옮겨 부유 배양하였다. 배아체를 단일세포로 작제하기 위해 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline: PBS)로 씻은 후 1x 트립신-EDTA/트리플렛 익스프레스 용액(Trypsin-EDTA/TrypLE Express, Invitrogen)을 첨가하여 37℃에서 1~5분 반응시키고, 인산완충식염수로 두 번 씻은 후 마트리젤(Matrigel, BD biosciences, USA) 이 코팅된 배양접시에 부착배양 하였다.

<실시예 3> 인간 배아줄기세포 및 배아체의 조골세포로의 분화

부착배양법에 의한 조골세포로의 분화를 위해서, 상기 실시예 1에서 얻어진 인간 배아줄기세포를 계대배양후 2일간 상기 실시예 1의 줄기세포 배양배지에서 배 양한 후, 인간 재조합 염기성 FGF가 첨가되지 않고, 0.1~200 nM 농도의 라파마이신, 0.01~50 μM 농도의 LY294002, 0.01~20 μM 농도의 AKT 억제제 또는 기존의 골형성첨가제(Osteogenic Supplements Osteogenic supplements: 10 mM β-glycerophosphate, 0.1 mM Dexametazone, 0.1 mM L-ascorbic acid)가 각각 첨가된 배양배지에서 7일간 배양하여 조골세포로 분화시켰다. 이때 매일 새로 준비한 배지로 교체하며 배양하였다(도 2A).

배아체 형성법에 의한 조골세포로의 분화를 위해서는, 도 3A에서와 같이, 상기 실시예 1에서 얻어진 인간 배아줄기세포를 계대배양후 1일간 상기 실시예 1의 줄기세포 배양배지에서 배양하였고, 1일이 지난후 사방 500 ㎛ 크기로 콜로니 상태의 인간배아줄기세포를 자른 후 이를 부유상태로 회수하여 박테리아 배양을 위한 배양접시로 옮기고 5일간 부유 배양하였다. 5일 경과후 마트리젤(Matrigel, BD biosciences, USA)이 코팅된 배양접시에 배아체를 옮기고 인간 재조합 염기성 FGF가 첨가되지 않고, 0.1~200 nM 농도의 라파마이신, 0.01~50 μM 농도의 LY294002, 0.01~20 μM 농도의 AKT 억제제 또는 골형성 첨가제(Osteogenic Supplements; Osteogenic supplements: 10 mM β-glycerophosphate, 0.1 mM Dexametazone, 0.1 mM L-ascorbic acid)가 각각 첨가된 배양배지에서 3주간 부착배양하여 조골세포로 분화시켰다(도 3A).

또한, 단일세포 작제법에 의한 조골세포로의 분화를 위해서는, 상기 실시예 1에서 얻어진 인간 배아줄기세포를 계대배양후 1일간 상기 실시예 1의 줄기세포 배양배지에서 배양하였고, 1일이 지난후 사방 500 ㎛ 크기로 콜로니 상태의 인간배아줄기세포를 자른 후 이를 부유상태로 회수하여 박테리아 배양을 위한 배양접시로 옮기고 5일간 부유 배양하였다. 5일 경과후 배아체를 단일세포로 작제하기 위해 인산완충식염수로 씻은 후, 1x 트립신-이디티에이/트리플렛 익스프레스 용액을 첨가하여 37℃에서 1~5분 반응시키고, 인산완충식염수로 두 번 씻은 후 마트리젤이 코팅된 배양접시에 3주간 부착배양 하였다. 이때 배양배지로는 배아체 배양배지에 인간 재조합 염기성 FGF가 첨가되지 않고, 0.1~200 nM 농도의 라파마이신, 0.01~50 μM 농도의 LY294002, 0.01~20 μM 농도의 AKT 억제제 또는 골형성 첨가제(Osteogenic Supplements: 10 mM β-glycerophosphate, 0.1 mM Dexametazone, 0.1 mM L-ascorbic acid)가 각각 첨가된 배지를 사용하였다(도 4A).

<실시예 4> 조골세포 분화관련 표지인자 발현 조사

<4-1> 역전사 중합효소반응(RT-PCR) 및 정량 중합효소반응(Quantitative real-time PCR)

상기 실시예 3에서 얻어진 세포들에서 골세포 분화양상을 확인하기 위해 골세포 특이적으로 발현하는 유전자들의 발현양상을 역전사 중합효소반응(RT-PCR) 및 정량 중합효소반응(Quantitative real-time PCR)을 통해 확인하였다. 이를 위해 라파마이신, LY294002, AKT 억제제 또는 골형성 첨가제(Osteogenic Supplements: 10 mM β-glycerophosphate, 0.1 mM Dexametazone, 0.1 mM L-ascorbic acid)를 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 분화단계별로 회수한 후 트리졸 시약(TRIzol reagent, Invitrogen, USA)을 이용하여 모든 RNA를 분리하였고, 이를 주형으로 역전사효소(Superscript II reverse transcriptase)와 oligo(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하고, 이를 주형으로 다시 중합효소반응을 실시하였다. 실험에 사용된 프라이머 서열은 표 1에 제시하였다.

상기 중합효소반응을 이용하여 실시예 3에 의한 분화세포에서의 조골세포 특이적 유전자 변화양상을 살펴본 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 부착배양법에 의하고 라파마이신을 배양배지에 첨가하여 분화시킨 세포에서 Cbfa-1, Osteocalcin, Osteoprotegrin 등의 발현이 독립적으로 확립된 서로 다른 두 인간배아줄기세포 모두에서 나타남을 관찰할 수 있었다. 아울러 Osterix, BMP2, 및 Osteonectin 유전자의 경우, 두 세포에서 발현되는 양상이 서로 다르며 10nM의 농도로 첨가한 경우에서보다 20nM에서 그 발현량이 증가되었음을 확인할 수 있었다. 또한 전체적으로 조골세포 특이적 유전자의 발현에 대한 반응정도 (sensitivity)가 세포주에 따라 다르지만 거의 유사한 경향을 보임을 확인하였다. 이를 통하여 인간배아줄기세포를 조골세포로 효과적으로 분화 유도하기 위해서는 세포 독성이 우려되지 않는 범위 내에 한해서 적정농도 이상의 라파마이신이 첨가되어야 함을 알 수 있었다.

또한, 도 6에서 보는 바와 같이, 라파마이신, LY294002 또는 AKT 억제제를 각각 첨가하여 조골세포로 분화시킨 배아체에서 조골세포 특이적인 유전자의 발현은 그 양 및 종류에서 차이가 관찰되었다. 라파마이신을 첨가하여 분화 유도한 세포에서는 발현된 유전자의 종류가 가장 많았고(BMP2, Osteocalcin, Cbfa-2, Osterix, Osteoprotegrin, GATA2, CMP) 그 발현양도 LY294002 또는 AKT 억제제를 각각 첨가하여 조골세포로 분화시킨 세포들에서의 발현양과 동등 이상의 수준이었다. 한편, 여러 조골세포 특이적 유전자들 중에서 Osterix, Osteoprotegrin 등의 발현은 상기 세 화합물에 의해 조골세포로 분화유도된 세포들에서 공통적으로 다량 발현이 되는 유전자였다.

조골세포 특이적 유전자의 발현양상은 정량 중합효소반응을 통하여 정량적 분석을 할 수 있었는데, 도 7에서 보는 바와 같이, 배아체 형성법에 의한 분화 유도 과정에서 1주 배양 후에 조골세포 특이적 유전자의 발현정도를 확인한 결과 Cbfa1 (3.24배), BMP2 (1.38배), BSP (6.54배), Osteocalcin (1.84배), Osteopontin (2.89배)등의 발현이 rapamycin-특이적으로 증가되는 것을 확인하였다. 2주 배양 후 에는 Cbfa-1 (2.11배), Osterix (1.59배), BMP2 (1.34배), BMP4 (1.18배), BSP 1.63배), α1 type I collagen (1.35배), Oteocalcin (1.61배), Osteoprotegerin (2.18배), Osteonectin (1.94배), Osteopontin (5.81배)등의 발현이 rapamycin-특이적으로 증가되는 것을 확인하였다 (도 7). 또한 , 3주 후에는 Osterix, BMP2, BMP4, α1 type I collagen, Oteocalcin, Osteoprotegerin, Osteonectin, Osteopontin 등의 발현이 지속적으로 증가되는 것을 확인하였다 (도 8). 3주 배양 후 서로 다른 두 인간배아줄기세포에서의 라파마이신에 반응하는 조골세포 표지인자의 발현을 확인한 결과 Osterix, BMP4, α1 type I collagen, Osteoprotegerin, Osteopontin 등의 발현이 유사하게 증가되어 있고, Cbfa1은 감소되어 있음을 확인하였다. 하지만 BMP2, BSP, osteocalcin, osteonectin의 발현은 세포간 차이를 보임을 확인하였다. 도 11에서는, 기존의 골형성 첨가물(Osteogenic Supplements)(10 mM β-glycerophosphate, 0.1 mM Dexametazone, 0.1 mM L-ascorbic acid)와 함께 배양 한 경우 또는 골형성첨가물와 함께 라파마이신을 첨가하여 배양한 경우에서 조골세포 특이적 유전자의 발현정도를 확인하였다. 배양 1주 후 Cbfa1 (4.54배), Osterix (2.22배), BMP2 (2.21배), BMP4 (1.93배), BSP (2.62배), Osteoprotegerin (2.91배) 등의 발현이 골형성첨가제에 의해 증가됨을 확인하였으며, 라파마이신과 함께 배양하였을때 Cbfa1 (2.27배), Osterix (2.22배), BMP2 (2.21배), BMP4 (1.93배), BSP (2.62배), Osteoprotegerin (2.91배)등 골형성첨가물에 의해 발현이 증가되는 유전자 뿐만이 아니라 골형성첨가물에 반응하지 않은 α1 type I collagen (1.82배), Osteocalcin (3.36배), Osteoprotegerin (2.91배) 등의 발현이 증가됨을 확인하였다.

<4-2> 알리자린 레드 에스(Alizarin-Red S) 염색법에 의한 석회화 형성도 측정

실시예 3에서 기술한 바와 같은 3개 분화 유도 방법에 의해 얻어진 세포들의 석회화 형성도를 측정하기 위해 알리자린 레드 에스(Alizarin-Red S) 염색법을 실시하였다. 세포를 배양한 배양접시에서 배양배지를 제거하고 배양접시를 인산완충식염수로 세척한 후 고정액 (70% 에탄올)으로 4℃에서 1 시간 동안 고정하였다. 40 mM 알리자린 레드(Alizarin red, AR)용액 (pH 4.2)으로 10분간 염색하고 증류수로 세척한 ,후 완전히 마르지 않은 상태에서 광학현미경을 이용 결절(nodule) 형성 정도를 관찰하였다. 그 결과, 도 10에서 보는 바와 같이, 라파마이신을 배지에 첨가하여 분화시킨 세포들이 알리자린 레드-양성 염색된 것을 관찰할 수 있었고, 기존의 골형성 첨가물(10 mM β-glycerophosphate, 0.1 mM Dexametazone, 0.1 mM L-ascorbic acid)과 함께 라파마이신을 배지에 첨가하여 배양할 경우 알리자린 레드-양성 염색된 세포가 상대적으로 많이 증가됨을 확인 하였다(도 12). 라파마이신만을 첨가하여 조골세포 분화를 유도하였을 때 알리자린 레드-양성 세포를 최대로 형성하기 위해서는 3주의 배양 시간이 요구되었으나 골형성 첨가물(10 mM β-glycerophosphate, 0.1 mM Dexametazone, 0.1 mM L-ascorbic acid)과 함께 라파마이신을 배지에 첨가하여 배양할 경우에는 상대적으로 조기에 알리자린 레드-양성 세포를 관찰할 수 있었다.

<4-3> 면역형광염색법(Immunofluorescent staining)

실시예 3에서 기술한 바와 같은 3개 분화 유도 방법에 의해 얻어진 세포들의 조골세포 분화를 확인하기 위해 1 cm² 커버글라스에서 분화 증식된 세포에서 배양배지를 제거하고 인산완충식염수로 세척한 후, 고정액(citrate-acetone-formaldehyde)을 첨가하여 약 30초간 실온에 보관 한 후 45초간 증류수로 세척하였다. 이후 3% 우혈청알부민/인산완충식염수 용액(BSA/ PBS)에서 30분간 처리한 후 일차 항체를 첨가하여 12 시간 반응하였다. 0.1% 트리톤X-100/인산완충식염수 용액(Tritonx-100/ PBS)에서 15분간 3번씩 세척한 후, Alexa488-접합 이차 항체(Molecular probes, USA)로 실온에서 30분간 반응하여 표지한다. 다시 0.1% 트리톤X-100/인산완충식염수 용액(Tritonx-100/ PBS)에서 15분간 3번씩 세척한 후 형광현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 조골세포 분화를 확인하기 위한 항체로는 항-골 시알로프로테인(Bone sialoprotein, anti-BSP,Chemicon; 1:100), 및 osteocalcin(R&D Systems; 1:500)을 사용하였다. 도 9에서 보는 바와 같이, 후기 조골세포 분화마커인 골 시알로프로테인(Bone sialoprotein, BSP) 또는 osteocalcin로 염색된 세포의 양상을 관찰하였을 때, 조골세포로의 분화를 유도하는 것으로 알려진 골형성 첨가물과 비교하여 라파마이신을 배지에 첨가하여 분화시킨 세포들에서 동등 이상의 세포들이 염색된 것을 관찰할 수 있었다. 이를 통해 라파마이신을 배지에 첨가하여 분화시키는 것이 골형성 첨가물을 배지에 첨가하여 분화시키는 것 동등 이상의 조골세포 분화 유도 효과를 보임을 확인할 수 있었다.

도 1은 세포 내 신호전달과정에서 라파마이신, LY294002, 및 AKT 억제제 등의 작용 경로 및 효과를 설명하는 모식도이다.

도 2는 라파마이신 또는 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 덱사메타존(Dexametazone), 아스코르브산(L-ascorbic acid)으로 구성된 골형성첨가물(Osteogenic Supplements)을 인간배아줄기세포에 처리하여 조골세포로 분화유도하는 방법에 대한 간략한 도식(A)과 이들에 의해 분화된 세포들을 관찰한 광학현미경 사진(B)이다.

도 3은 라파마이신 또는 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 덱사메타존(Dexametazone), 아스코르브산(L-ascorbic acid)으로 구성된 골형성첨가물(Osteogenic Supplements)을 인간배아줄기세포 유래 배아체에 처리하여 조골세포로 분화유도하는 방법에 대한 간략한 도식(A)과 이들에 의해 분화된 세포를 관찰한 광학현미경 사진(B)이다.

도 4는 인간배아줄기세포 유래 배아체를 단일세포로 작제하고 부착 배양하면서 라파마이신 또는 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 덱사메타존(Dexametazone), 아스코르브산(L-ascorbic acid)으로 구성된 골형성첨가물(Osteogenic Supplements)을 처리하여 조골세포로 분화유도하는 방법에 대한 간 략한 도식(A)과 이들에 의해 분화된 세포를 관찰한 광학현미경 사진(B)이다.

도 5는 도 2의 분화된 세포로부터 골세포 특이적 유전자의 발현을 역전사 중합효소반응(RT-PCR)을 이용하여 유전자를 증폭시킨후 관찰한 전기영동 사진이다.

도 6A, B, C는 각각 인간배아줄기세포 유래 배아체를 Rapamycin(R), PI3K 억제제인 LY294002(LY), 및 AKT 억제제(AKT)를 처리한 후 골세포 특이적 유전자의 발현을 역전사 중합효소반응(RT-PCR)을 이용하여 유전자를 증폭시킨후 미분화줄기세포와 비교 관찰한 전기영동 사진이다. A, B, C 각각의 도면에서 상단의 ES는 미분화 인간배아줄기세포이고, C는 시약을 처리하지 않은 인간배아줄기세포 유래 배아체이다.

도 7은 도 3의 분화된 세포로부터 조골세포 특이적 유전자의 발현을 배양 1주 (도 7A), 2주(도 7B) 후에 정량 중합효소반응(quantitative real-time PCR)을 이용하여 검증하고 이들 각각의 발현량을 상대적 수치로 정량화한 막대 그래프이다.

도 8은 도 3의 서로 다른 인간배아줄기세포주에서 분화된 세포로부터 조골세포 특이적 유전자의 발현을 배양 3주 후에 정량 중합효소반응(quantitative real-time PCR)을 이용하여 검증하고 이들 각각의 발현량을 상대적 수치로 정량화 한 막대 그래프이다.

도 9는 도 3의 분화된 세포를 면역형광염색법으로 염색하여 관찰한 사진으로, 조골세포 특이 발현 단백질 BSP 및 OC 양성 염색 세포를 보여주는 사진이다.

도 10은 도 3의 분화된 세포를 면역세포화학법으로 염색하여 관찰한 사진으로 알리자린 S(Alizarin Red S) 양성 염색 세포를 보여주는 사진이다.

도 11은 도 3의 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 덱사메타존(Dexametazone), 아스코르브산(L-ascorbic acid)으로 구성된 골형성첨가물(Osteogenic Supplements), 또는 골형성첨가물과 라파마이신을 함께 첨가하여 분화된 세포로부터 조골세포 특이적 유전자의 발현을 배양 2주 후에 정량 중합효소반응(quantitative real-time PCR)을 이용하여 검증하고 이들 각각의 발현량을 상대적 수치로 정량화한 막대 그래프이다.

도 12는 도 3의 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 덱사메타존(Dexametazone), 아스코르브산(L-ascorbic acid)으로 구성된 골형성첨가물(Osteogenic Supplements) 또는 골형성첨가물과 라파마이신을 함께 첨가하여 분화된 세포를 면역세포화학법으로 염색하여 관찰한 사진으로 알리자린 S(Alizarin Red S) 양성 염색 세포를 보여주는 사진이다.

Claims

mTOR 또는 mTOR의 신호전달을 억제하는 물질인 1~20 nM 농도의 하기 화학식 1의 화합물, β-글리세로포스페이트, 덱사메타존 및 L-아스코르브산을 포함하는 배양배지에서 배양함으로써 인간배아줄기세포 또는 인간배아줄기세포 유래 배아체를 조골세포로 분화 유도하는 방법:

[화학식 1]
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제1항에 있어서, 인간배아줄기세포 유래 배아체는 사방 500 ㎛크기의 배아줄기세포 덩어리를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 인간배아줄기세포 유래 배아체를 단일세포 형태로 분리하여 분화 유도하는 방법.
1~20 nM 농도의 화학식 1의 화합물, β-글리세로포스페이트, 덱사메타존 및 L-아스코르브산을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간배아줄기세포 또는 인간배아줄기세포 유래 배아체를 조골세포로 분화 유도하는 배지 조성물:

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제11항에 있어서, 상기 β-글리세로포스페이트의 농도는 10 mM, 상기 덱사메타존의 농도는 0.1 mM, 및 상기 L-아스코르브산의 농도는 0.1 mM인 배지 조성물.