JP6761409B2 - 多能性幹細胞由来細胞から形成された神経回路網 - Google Patents
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Description
1.発明の分野
本発明は基本的に、分子生物学、細胞生物学および医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、多能性幹細胞に由来するニューロンの培養物を混合または組み合わせること、およびそのような混合した細胞培養物の使用方法に関する。
哺乳類の脳は、興奮と抑制のバランスが正常なときにのみ、適切に機能する。興奮/抑制(E/I)比の不均衡は、感覚処理の異常および意識消失と関連している(チャンおよびサン、2011;マッシミニら、2012)。E/I比が高くなると、新皮質の神経回路活動の長期化、刺激への過敏症、認知機能障害およびてんかんが引き起こされる可能性がある(ハガーマンおよびハガーマン、2002;ギブソンら、2008:チャンおよびサンによる総説、2011)。同様にE/I比の低下は、社会的相互作用の障害や自閉症的行動などの異常性、および知的障害(レット症候群)と関連づけられてきた(タブチら、2007;ダニら、2005;チャンおよびサンによる総説、2011)。これらのことについては研究が進展しており、E/I比は発達中に興奮の低下と抑制の増加を伴って変化し、この変化が興奮と抑制のいずれかに偏ることがE/I比の不均衡を引き起こす可能性があることが分かっている(チャンおよびサンによる総説、2011)。神経疾患の発症頻度が劇的に高まっていることから、より良い治療法が望まれている。しかしながら、神経科学研究および創薬においては、現在においても、臨床的に意義のある細胞モデルの入手が大きな課題である。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のニューロンは、神経疾患の機序をより深く理解するのに使うことができる細胞型を提供するものである。インビボの系をより効率的にシミュレーションすることができるインビトロでの手法にニーズがあることは明らかである。
いくつかの態様では、種々の細胞を様々な比率でインビトロで組み合わせてニューロンの同期的な回路網を形成することができる。例えばいくつかの態様では、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンを様々な比率でインビトロで組み合わせて(例えば、多電極アレイなどのマルチウェルプレート上で)、例えば電気生理学的手法を介して記録可能な同期発火を示す神経回路網を形成してもよい。いくつかの態様では、このニューロン培養物はアストロサイトを含まない。しかしながらいくつかの態様では、アストロサイトを興奮性および/または抑制性ニューロンと組み合わせて、インビトロで含めてもよい。
いくつかの態様では、神経回路網を形成するためにニューロンをインビトロで培養する。ニューロンは必要に応じて培養しても、またはアストロサイトと共培養してもよい。いくつかの態様では、マルチウェルプレート自体または多電極アレイの上でニューロンを培養する。例えば、いくつかの態様で使用することができるマルチウェル電極アレイの例としては、アキシオン・バイオシステム(Axion BioSystems)多電極アレイ(MEA)が挙げられる。MEAシステムには、ニューロンの電気的な活動の検出に使うことのできる電極が各ウェルに備えられており、MEAプレートにはウェルが48個または96個ある。マルチチャネルシステムズ(Multichannel Systems、ロイトリンゲン、ドイツ)およびニューロネクサス(NeuroNexus、アナーバー、ミシガン)も、本発明の様々な態様で使用可能な市販の多電極アレイを製造している。しかしながらいくつかの態様では、細胞を培養皿またはマルチウェルディッシュ上で培養し、その後、細胞の神経活性を検出する別の技術、例えば、ニューロンの動機発火を検出することができる他の電気生理学的な技術、例えばFLIPRカルシウムアッセイならびに電位感受性色素および/またはタンパク質(VIP)を使って、個別に測定してもよい。基本的には、回路網のバースト、回路網レベルのコミュニケーション、回路網の結合性、神経の伝導率、結合性、または同期ニューロンバーストもしくは発火の測定または検出を含む本質的に全ての技術を本発明で使用してもよいことが想定される。
本発明の様々な側面で使用するためのニューロンおよび/またはアストロサイトを生成するには、様々な方法が利用可能である。いくつかの態様では、ニューロン(例えばGABA作動性、グルタミン酸作動性、またはドーパミン作動性ニューロンなど)またはアストロサイトを、多能性細胞、例えばiPS細胞または幹細胞から培養・生産することができる。いくつかの態様では、多電極アレイ(例えばMEA)を構成しているウェルの中で培養する前にニューロンを分化させてもよく、他の態様では、未分化な、多能性の、多分化能の(multipotent)、または神経前駆細胞である細胞を多電極アレイのウェルに入れ、その後、神経細胞へと分化させてもよい。
神経細胞を同定するために、ニューロン系への分化効率を決定するために、神経細胞を選択もしくは単離するために、または神経細胞を濃縮するために、ニューロン系の特徴を評価してもよい(シュワルツら、2008)。
本明細書に記載した種々の側面において使用される細胞(例えばニューロン、アストロサイトなど)は、分化する前、分化中、または分化後のいずれかの時点で、細胞の遺伝子操作によって1つ以上の遺伝子変異を含むように改変することができる(米国特許公開第2002/0168766号)。通常、人為的操作の任意の好適な手段によってポリヌクレオチドが細胞内に導入されたとき、またはその細胞が遺伝するポリヌクレオチドを有する最初に変化した細胞の後代である場合に、細胞は「遺伝子変異している」または「トランスジェニック」である。例えば、細胞が限定された発生系譜の細胞または高分化型細胞に進む前または進んだ後のいずれかの時点で、細胞がテロメラーゼ逆転写酵素を発現するように遺伝子変異させてその複製能力を高めるように処理することができる(米国特許公開第2003/0022367号)。別の例では、神経細胞の選択またはスクリーニングを効率的にするために、細胞に、神経プロモーター(例えばMAP2プロモーター)の制御下にあるスクリーニング可能なマーカーまたは選択マーカーを含めることができる。特に、多能性細胞をマーカーで改変し、神経細胞へと分化させ、その後、マーカーに基づいて選択して、精製した神経細胞(例えばニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、GABAニューロンなど)の集団を得ることができる。
同期的なニューロンの発火または同期的な活動電位を示す神経細胞培養物は、例えば、神経の分化もしくは生存に与える分子の効果を試験することにおいて、または毒性試験において、あるいは神経もしくはニューロンの機能におよぼす分子の効果を試験することにおいて使用することができる。このことは、ニューロンの活動、可塑性(例えば長期的な相乗効果)、または機能に影響をおよぼす化合物を同定するためのスクリーニングも含む場合がある。細胞培養物を、新薬や、神経幹細胞、神経前駆細胞または分化したニューロンつまりニューロン型と相互作用する、またはそれらのバイオロジーに影響を与える化合物の探索、開発および試験に使用することもできる。神経細胞は、軸索誘導、神経変性障害、ニューロンの可塑性および学習と記憶を含むがこれらには限定されない、神経の発達および障害の細胞学的および分子学的な基礎を明らかにするために設計された研究においても非常に有用である。このような神経生物学的な研究を、このような過程の新規分子成分を同定するのに用いてもよく、また、このような研究から、既存の薬剤や化合物の新規使用法が提供されたり、新規薬剤標的または薬剤候補が同定されたりするだろう。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれるものである。以下に記載される実施例中で開示される技術は、発明者らによって発見され、本発明の実践においてうまく機能する技術を示すものであり、従ってその実践に好ましい形態を構成していると考えられると当業者は認識すべきである。しかしながら、本開示を踏まえると、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示した特定に態様に多くの変更を施し、その上でなお、似たようなまたは同様の結果が得られるということを当業者であれば理解できる。
マエストロ(Mestro)多電極アレイを使った、iPS細胞由来ニューロンの細胞外単一ユニット記録
以下の方法を使用して、マエストロ多電極アレイ(MEA)上において神経細胞を培養してもよい。アイセル(iCell)(登録商標)ニューロンを解凍し、50%ポリエチレンイミン(PEI;シグマ)溶液で予めコーティングしておいた48ウェルMEAプレートにプレーティングする。プレーティングの1日後、消費した培地の100%を、10%ノックアウト血清代替品(KSR;ライフ・テクノロジーズ)を添加したニューロベーサル(Neurobasal)−A培地(NBA;ライフ・テクノロジーズ)で交換する。プレーティングの5日後、消費した培地の50%をNBA+10%KSRで交換する。プレーティングの8日後、ベースライン活性を記録し、細胞を化合物で処理し、その後、活性を記録する。
1. 3.10gのホウ酸と4.75gのテトラホウ酸ナトリウムを蒸留水に溶解して1Lのホウ酸緩衝液を準備する。pHを8.4に調整する。必要に応じて計量する。
2. 50%のPEI溶液をホウ酸緩衝液で希釈して0.05〜0.1%のPEI溶液を準備する。0.05〜0.1%のPEI溶液を0.22μmフィルターに通して濾過する。注意:0.05〜0.1%のPEI溶液は4℃で1ヶ月間保存できる。
3. 0.05〜0.1%のPEI溶液を48ウェルMEAプレートの1ウェルにつき125μl入れる。室温で1時間インキュベートする。
4. 48ウェルMEAプレートからPEI溶液を吸引する。ウェルが乾かないように注意する。
5. 1ウェル当たり少なくとも300μlの滅菌水で4回すすぐ。
6. 48ウェルMEAプレートに蓋をしない状態で、無菌の生物学的安全キャビネット内で一晩風乾する。最適な細胞接着性と最大性能を引き出すために48ウェルMEAプレートを一晩風乾させてもよい。
1. アイセル(登録商標)ニューロンの使用説明書に従って、完全アイセル(登録商標)ニューロン維持培地(完全維持培地、Complete Maintenance Medium)を調製する。必要に応じて、ペニシリン−ストレプトマイシンを1×最終濃度で完全維持培地に添加してもよい。
2. 250μlのラミニン溶液のストック(1mg/ml)を25ml完全維持培地を添加して希釈して最終濃度を10μg/mlにする。チューブを反転しながら穏やかに混合する。ラミニン溶液のストックは室温でまたは4℃で一晩かけて解凍することができる。
3. 使用説明書に従ってアイセル(登録商標)ニューロンを解凍し、この細胞懸濁液を、10μg/mlのラミニンを含有する完全維持培地で最終容量が10mlになるように希釈する。
4. 必要に応じて、細胞懸濁液試料を除去し、血球計数器でニューロンを計数して、細胞の生存率と総数を決定してもよい。
5. 細胞懸濁液を15mlの遠心管に移す。
6. 380×gで5分間遠心してニューロンを濃縮する。
7. ペレットを壊さないように注意しながら細胞塊の間近まで上清を吸引し、およそ50μlを残す。この近似容量は、真空吸引器の不正確な特性から導き出されたものである。
8. 細胞ペレットに10μg/mlラミニン含有完全維持培地を125μl加え、上下にピペッティングすることで穏やかに再懸濁する。
9. ピペッタ−を使って細胞懸濁液の最終容量を測定する。10μg/mlラミニン含有完全維持培地を最終容量が220μlになるように加える。ピペッティングで穏やかに混合する。
10. 細胞懸濁液を1.5mlの遠心管に移す。
1. チューブを2〜3回、ゆっくりと上下に反転させ、細胞懸濁液を完全に混合する。ウェルの底面が見えるように、48ウェルMEAプレートを一定の角度に傾ける。直ちに、PEI溶液で予めコーティングしておいた48ウェルMEAのウェルの記録電極部分に直接、1ウェル当たり、細胞懸濁液の液滴4μlを分注する。
2. 液滴が蒸発しないように、48ウェルMEAプレートのウェルの周囲に滅菌水2mlを添加する。水が48ウェルMEAプレートのウェルの中に入らないように注意する。プレートを傾けた時に水がウェル中に漏れるのを回避するために、細胞懸濁液をプレーティングした後に水を加えることもできる。48ウェルMEAプレートの湿潤環境を維持できれば、水の量は重要ではないだろう。
3. 滅菌済みのマイクロクライム・エンバイロメンタル・リッド(MicroClime Environmental lid)で48ウェルMEAプレートを覆い、37℃、5% CO2、湿度95%にした細胞培養用インキュベーター内で約40分インキュベートする。
4. 培地を加える前に、滅菌済みのチップを備えた12チャネルピペッターを装填し、必要があれば、48ウェルMEAプレートへの分注に応じて、チップを外す。
5. 急勾配(およそ75〜80°)になるようにプレートを傾ける。1ウェル当たり150μlの10μg/mlラミニン含有完全維持培地を、48ウェルMEAプレートの1列分のウェルの片側に、12チャネルピペッターを使って一度にゆっくりと加える。培地を勢いよく加えると接着しているニューロンがはがれる恐れがある。この工程ではタイミングが重要になる可能性がある。液滴が乾くと性能が落ちる可能性がある。それぞれのウェルに一度の全容量を入れずに、先に少量の培地を全ウェルに入れておいてもよい。
6. 48ウェルMEAプレートをゆっくりと、生物学的安全キャビネットの表面で水平に戻し、培地が液滴をゆっくりと覆うようにする。
7. 1ウェル当たりの最終容量が300μlになるまで工程5を繰り返す。
8. 滅菌済みマイクロクライム・エンバイロメンタル・リッドで48ウェルMEAプレートを覆い、37℃、5% CO2、湿度95%にした細胞培養用インキュベーター内でインキュベートする。
1. 10%のKSRと1×ペニシリン−ストレプトマイシンを加えたNBA培地(NBA+KSR培地)を準備する。0.22μmのフィルターで濾過する。必要に応じて、ペニシリン−ストレプトマイシンを最終濃度が1×となるように培地に加えてもよい。
2. プレーティングした1日後に、NBA+KSR培地を水浴中、37℃で平衡化する。
3. 培地を分注し、消費した培地を48ウェルMEAプレートの一列分のウェルから一度に除去するために、前述したように、滅菌済みのチップを備えた12チャネルピペッターを装填する。
4. 37℃のNBA+KSR培地を1ウェル当たり150μl、48ウェルMEAプレートの1列分のウェルの片側に、12チャネルピペッターを使って一度にゆっくりと加える。培地を勢いよく加えると接着しているニューロンがはがれる恐れがある。
5. 1ウェル当たりの最終容量が300μlになるまで工程4を繰り返す。
6. 滅菌済みマイクロクライム・エンバイロメンタル・リッドで48ウェルMEAプレートを覆い、37℃、5% CO2、湿度95%にした細胞培養用インキュベーター内で4日間インキュベートする。
7. プレーティングした5日後、消費した培地の50%(150μl/ウェル)を1ウェル当たり150μlの、新しい37℃のNBA+KSR培地で交換する。
8. 37℃、5% CO2、湿度95%にした細胞培養用インキュベーター内で3日間インキュベートする。最適性能を発揮するために、プレーティングした8日後にデータを収集することができる。
ヒトiPSC由来細胞型を用いたE/I比の決定による神経回路網バーストおよび同期性の調節
アイセル(登録商標)ニューロン:発明者らは、健常提供者または疾患特異的提供者から得た成人細胞を多能性状態にリプログラミングするためにiPSC技術を利用してきた。この状態では、iPS細胞は実質的に、これまでは扱うことができなかったヒトのニューロンを含む全ての細胞型に分化する能力を有する。重要なことは、アイセル(登録商標)ニューロンが凍結保存された材料として提供され、解凍でき、その週のいつでも使用できるということである。図1に、凍結保存したアイセル(登録商標)ニューロンを生成するための一般的な模式図を示す。
アイセル(登録商標)ドーパニューロンを解凍後、維持培地(MM)またはブレインフィズ(BP)培地のいずれかを使い、〜12日間培養した。神経回路網の活動/結合性を図示するバースト動態の解析から、MM中で生育させた培養と比較して、BPで処理した培養の方が、より強固で安定した大きな回路網バーストを示すことが分かった。より具体的には、回路網の挙動は、MMで見られたより大きな回路網の活動を伴わない、強く、小さい回路網(単一チャネル)バーストから、大きく、培養全体を包含した(全チャネル)回路網バーストへと変化し、それでもなお、BPで処理した培養では、強く、小さい回路網(単一チャネル)バーストも見られた。解析および結果を図10に示す。
抑制の量を増やしていった8つのウェルに関する例示的なラスタープロットおよびベロシティグラフ。E/I比は、アイセル(登録商標)ドーパニューロン(70:30、E:I%)とアイセル(登録商標)ニューロン(30:70)(各細胞型の%を各グラフの上に示した)を混合することで調整した。ベロシティグラフは、記録を行った4分間の500ミリ秒ごとの瞬間的な平均発火頻度を示している。同期回路網バーストは培養の6〜10日目に始まっている。結果を図3に示す。
興奮の量を増やしたときの8ウェルに関する例示的な生データのトレースとベロシティグラフを示している。E/I比は、アイセル(登録商標)ニューロン(30:70、E:I%)とグルタミン酸作動性95(95:5、E:I%)細胞を混合することによって調整した。培養は数週間の間、同期回路網バーストを示し続けた。興奮の量が増えると回路網バーストが増大し(図5、枠内)、強度が高まることに注目されたい。また、興奮が閾値に達すると回路網の発作(seizures)の出現も注目に値する。結果を図5に示す。
E/I比の決定で使用したものと同じ培養物を使用した。ただし、アイセル(登録商標)アストロサイトを細胞培養に添加した点が異なる。アイセル(登録商標)アストロサイト添加7日後の結果を図7に示す。アストロサイト添加後には、チャネルバースト頻度のE/I比分布が変化し、強度、回路網バーストおよび増大レベルは全E/I比にわたって標準化された。結果を図8に示す。
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に示す詳細の補足となる手続上の詳細の例または他の詳細の例を提供する範囲において、具体的に参照することによって本明細書に組み入れられる。
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米国特許公開第2007/0238170号
米国特許公開第2008/0171385号
米国特許公開第2009/0029462号
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米国特許公開第2012/0276063号
米国特許第7,820,439号
米国特許第8,153,428号
米国特許第8,252,586号
米国特許第8,426,200号
米国特許第8,513,017号
米国特許第8,546,140号
米国特許第8,735,149号
米国特許第8,741,648号
米国特許第8,796,022号
国際公開第2011130675号
国際公開第2012080248号
国際公開第2013067362号
国際公開第2013163228号
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Claims (28)
- ニューロン集団を生産するためのインビトロ法であって、
(a)複数の興奮性ニューロンと抑制性ニューロンをインビトロで混合すること、および
(b)前記ニューロンを、神経回路網を形成するのに十分な期間培養すること、を含み、
前記興奮性ニューロンと前記抑制性ニューロンはいずれも多能性幹細胞に由来するものであり、前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹(iPS)細胞であり、興奮性ニューロンの抑制性ニューロンに対する比率が同期的なニューロンの発火または同期的な活動電位を生じるのに十分なものであり、前記ニューロン集団が40%から90%までの興奮性ニューロンと10%から60%までの抑制性ニューロンを含んでいる、インビトロ法。 - 前記ニューロンの培養物がさらにアストロサイトを含んでおり、前記アストロサイトが多能性幹細胞に由来するものである、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、マウス、ラット、霊長類、類人猿、またはサル由来のiPS細胞である、請求項1〜2のいずれか1項に記載の方法。
- 前記iPS細胞が健常提供者に由来する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記iPS細胞が、疾患を患っている対象に由来する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疾患が神経疾患または神経変性疾患である、請求項5に記載の方法。
- 前記疾患が自閉症、てんかん、統合失調症、ADHD、ALS、または双極性障害である、請求項6に記載の方法。
- 前記ニューロン集団がさらに5%から25%までのアストロサイトを含んでおり、、前記アストロサイトがiPS細胞由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記アストロサイトがヒトiPS細胞に由来する、請求項8に記載の方法。
- 前記ニューロン集団が、多能性幹細胞に由来する興奮性ニューロンの第一の培養物と多能性幹細胞に由来する抑制性ニューロンの第二の培養物との混合物を含み、前記第一の培養物が少なくとも90%のグルタミン酸作動性ニューロンを含み、前記第二の培養物が少なくとも70%のGABA作動性ニューロンを含んでいる、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹(iPS)細胞である、請求項10に記載の方法。
- 前記集団が、90%から20%までの前記第一の培養物と10%から80%までの前記第二の培養物を含んでいる、請求項10に記載の方法。
- 前記ニューロン集団がさらに5%から25%までのアストロサイトを含んでおり、前記アストロサイトがiPSC由来である、請求項12に記載の方法。
- 前記ニューロン集団を多電極アレイ上で培養する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多電極アレイがマエストロ(Maestro)MEAである、請求項14に記載の方法。
- 前記多電極アレイが少なくとも8個の電極を備えている、請求項14に記載の方法。
- 前記多電極アレイが少なくとも16個の電極を備えている、請求項14に記載の方法。
- 前記多電極アレイは、多電極アレイの個々のウェル中に、前記ニューロンの複数の培養物を含み、興奮性ニューロンの抑制性ニューロンに対する比率は培養物間で異なっている、請求項14〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記興奮性ニューロンがグルタミン酸作動性、ドーパミン作動性、またはコリン作動性ニューロンである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抑制性ニューロンがGABA作動性ニューロンである、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ニューロン集団が、皮質ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、海馬ニューロン、扁桃体ニューロン、末梢ニューロン、運動ニューロン、または侵害受容器を発現しているニューロンを含んでいる、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記ニューロン集団と被験化合物とを接触させることを含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被験化合物が神経伝達を調節することができる、請求項22に記載の方法。
- 前記集団の電気的な活動またはニューロン活動を検出することまたは測定することをさらに含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出することまたは測定することが、前記集団によって生成された電圧を測定することを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記検出することまたは測定することによって得られたデータをアイセル(アイセル)(登録商標)ニューロアナライザー(NeuroAnalyzer)を使って解析する、請求項25に記載の方法。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法によって生産されたニューロンの培養物。
- 前記ニューロンが多電極アレイに含まれているまたは多電極アレイ上にある、請求項27に記載の培養物。
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