CN106574248B

CN106574248B - 由源自多能干细胞的细胞形成的神经网络

Info

Publication number: CN106574248B
Application number: CN201580044770.9A
Authority: CN
Inventors: K·P·曼甘; C·B·卡尔森
Original assignee: Fuji Film Cell Power Co Ltd
Current assignee: Fuji Film Cell Power Co Ltd
Priority date: 2014-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2035-08-19
Also published as: AU2015305515A1; CA2957801A1; AU2015305515B2; EP3183338B1; US20160116459A1; CN106574248A; WO2016028880A1; JP6761409B2; US10444227B2; JP2017528127A; EP3183338A1; CA2957801C

Abstract

在一些方面，提供了源自人诱导多能干细胞(iPS细胞)的神经元的培养物，其显示神经网络的同步突发。在一些实施方式中，可以使用多电极阵列检测或测量培养物的神经元活性。

Description

由源自多能干细胞的细胞形成的神经网络

本申请要求于2014年8月19日提交的美国临时专利申请No.62/039,244的权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明一般涉及分子生物学、细胞生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及混合或组合源自多能干细胞的神经元的培养物以及使用这样的混合细胞培养物的方法。

背景技术

只有当兴奋和抑制之间存在适当的平衡时，哺乳动物大脑才恰当地工作。兴奋性-抑制性(E/I)比率的不平衡与异常感官处理和无意识有关(Zhang和Sun，2011；Massiminiet al.，2012)。提高的E/I比率可以导致延长的新皮质回路活动、刺激性超敏反应、认知障碍和癫痫(Hagerman和Hagerman，2002；Gibson et al.，2008：在Zhang和Sun，2011中综述)。类似地，E/I比率的降低与诸如社交障碍和自闭症行为以及精神发育迟滞(Rett综合征)等异常有关(Tabuchi et al.，2007；Dani et al.，2005；在Zhang和Sun，2011中综述)。已经充分研究并确定E/I比率在发育过程中变化，兴奋降低和抑制增加，并且二者中任一者的这些变化中的偏差能破坏E/I比率(在Zhang和Sun，2011中综述)。随着神经疾病发病率的急剧上升，需要改进的治疗。然而，获得临床相关的细胞模型仍然是神经科学研究和药物开发中的主要挑战。人诱导多能干细胞(iPSC)衍生的神经元提供可用于促进对神经疾病机制的更好理解的细胞类型。显然，需要可以更有效地模拟体内系统的体外方法。

发明内容

本发明通过在一些方面提供源自诱导多能干细胞(iPSC或iPS细胞)的神经元的改良培养物来克服现有技术中的局限性，所述神经元可在体外显示神经网络的同步簇放电(bursting)。在一些方面，任选地与额外的星形胶质细胞一起，共培养各种比率的兴奋性神经元和抑制性神经元。这些神经元培养物可以用于例如检测由于将神经培养物暴露于测试化合物而引起的网络通信的变化。这些神经元培养物可以用于例如检测由于将神经培养物暴露于测试化合物而引起的网络通信变化。在一些实施方式中，通过混合兴奋性和抑制性神经元然后使用多电极阵列测量自发同步神经簇放电而产生同步神经网络。

本发明的一个方面涉及用于产生神经元群体的体外方法，其包括：(a)在体外组合多个兴奋性神经元和抑制性神经元，和(b)将神经元培养足够的时间以允许形成神经网络；其中所述兴奋性神经元和所述抑制性神经元都源自多能干细胞；并且其中所述兴奋性神经元与所述抑制性神经元的比率足以允许产生同步神经元放电或同步动作电位。神经元的培养物可以进一步包含星形胶质细胞，其中所述星形胶质细胞源自多能干细胞。所述多能干细胞可以是人诱导多能干(induced pluripotent stem，iPS)细胞。所述多能干细胞可以是源自小鼠、大鼠、灵长类动物、猿或猴的iPS细胞。在一些实施方式中，所述iPS细胞源自健康供体(例如，健康人供体)。在一些实施方式中，所述iPS细胞源自患有疾病的受试对象(例如，患有疾病例如遗传疾病的人)。所述疾病可以是神经疾病或神经变性疾病。所述疾病可以是例如自闭症、癫痫、精神分裂症、ADHD、ALS或双相性精神障碍(bipolar disorder)。神经元群体可以包含约30％至约90％的兴奋性神经元和约10％至约70％的抑制性神经元。所述群体可以包含约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90％的或从其中可导出的任何范围内的兴奋性神经元。所述群体可包含约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70％的或从其中可导出的任何范围内的抑制性神经元。神经元群体可以在具有约300-320、约305-315或约300、305、310、315、320mOsmol或从其中可导出的任何范围内的摩尔渗透压浓度(osmolarity)的溶液或培养基中培养、温育和/或提供。所述溶液或培养基可以补充有N2、B27、视黄酸、脑源性神经营养因子(BDNF)、源自神经胶质细胞的神经营养因子(GDNF)、抗坏血酸、cAMP、层粘连蛋白和/或胆固醇中的1、2、3、4、5种或更多种或全部。在一些实施方式中，神经元群体还包含约5％至约25％的星形胶质细胞，其中所述星形胶质细胞源自iPS细胞(iPSC)，例如人iPS细胞。所述星形胶质细胞可以源自人iPS细胞；例如，所述星形胶质细胞可以源自人iPS细胞，其中所述iPS细胞由来自健康供体或患病供体的细胞产生。在一些实施方式中，神经元群体包含源自多能干细胞的兴奋性神经元的第一培养物和源自多能干细胞的抑制性神经元的第二培养物的混合物；其中所述第一培养物包含至少约70％的GABA能神经元；并且其中所述第二培养物包含至少约90％的谷氨酸能神经元。在一些实施方式中，所述多能干细胞是人诱导多能干(iPS)细胞。所述群体可以包含约90％至约20％的第一培养物和约10％至约80％的第二培养物。所述神经元群体可以进一步包含约5％至约25％的星形胶质细胞，其中所述星形胶质细胞源自iPSC。在一些实施方式中，在多电极阵列(例如，Maestro MEA、Axion MEA；Axion Biosystems，Atlanta，GA)上培养神经元群体。所述多电极阵列可以包括至少8个电极。在一些实施方式中，所述多电极阵列包括至少16个电极。例如，所述多电极阵列可以在多电极阵列中的每个孔中包含至少8个、至少16个、至少32个或至少64个电极。在一些实施方式中，在所述多电极阵列的每个孔中，至少8、16、32或64个单独嵌入的微电极(例如，约30-50μm直径；约200-350μm中心间距；任选具有集成的接地电极)可以用于同时监测神经元的活动。所述多电极阵列可以包括在多电极阵列中不同孔中的所述神经元的多种培养物，其中兴奋性与抑制性神经元的比率在培养物之间不同。在一些实施方式中，所述兴奋性神经元是谷氨酸能神经元、多巴胺能神经元或胆碱能神经元。在一些实施方式中，所述抑制性神经元是GABA能神经元。所述神经元群体可以包括皮质神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、海马神经元、杏仁核神经元、周围神经元、运动神经元或表达伤害感受器的神经元。所述方法可以进一步包括使神经元群体与测试化合物接触。在一些实施方式中，测试化合物可以调节神经传递。在一些实施方式中，所述方法还包括检测或测量群体的电活性或神经元活性。在一些实施方式中，所述检测或测量包括测量由所述群体产生的电压。来自所述检测或测量的数据可以例如使用

神经分析仪(

NeuroAnalyzer)进行分析。

本发明的另一方面涉及如本文所述或通过本发明的方法产生的神经元的培养物。所述培养物可以包含兴奋性神经元、抑制性神经元和神经网络，其中所述兴奋性神经元与所述抑制性神经元的比率足以允许产生同步神经元放电或同步动作电位。在一些实施方式中，神经元包括在多电极阵列中或多电极阵列上。

本发明的另一方面涉及包含多个兴奋性神经元和抑制性神经元的神经元培养物，其中所述兴奋性神经元和所述抑制性神经元都源自多能干细胞；并且其中所述兴奋性神经元与抑制性神经元的比率足以允许产生同步神经元放电或同步动作电位。如本文所述，所述多能细胞可以是诱导多能细胞，例如本文所述来自健康或患病的哺乳动物或人受试对象。神经元的培养物可以例如本文所述在多电极阵列上提供。所述兴奋性与抑制性神经元的比率在多电极阵列的不同孔中可以变化或者可以不变化。所述神经元群体可以在具有约300-320、约305-315或约300、305、310、315、320mOsmol或从其中可导出的任何范围内的摩尔渗透压浓度的溶液或培养基(例如，生理学上可接受的细胞培养基)中培养、温育和/或提供。所述多电极阵列的每个孔中的神经元培养物可以在本文所述的培养基中温育或在每个孔中包含如本文所述的培养基，例如，在Bardy et al.，2015或WO2014172580中所述的培养基。所述培养基可以补充有N2、B27、视黄酸、脑源性神经营养因子(BDNF)、源自神经胶质细胞的神经营养因子(GDNF)、抗坏血酸、cAMP、层粘连蛋白和/或胆固醇中的1、2、3、4、5种或更多种或全部。所述神经元的培养物可以包含星形胶质细胞。在一些实施方式中，一种或多种神经细胞是转基因或遗传改变的。在一些实施方式中，神经元的培养物还包含多个诱导多能干细胞和/或神经前体细胞，例如与多电极阵列中的神经细胞一起存在，如本文所述。

如本文所用，“兴奋性神经元”(excitatory neuron)是指当其作为突触前神经元在突触间隙处释放神经递质(例如谷氨酸)时增加突触后神经元中的动作电位的概率的神经元。如本文所用，“抑制性神经元”(inhibitory neuron)是指当其作为突触前神经元在突触间隙处释放神经递质(例如，γ-氨基丁酸(GABA))时降低突触后神经元中的动作电位的概率的神经元。

如本文所用，“同步神经元放电”(“synchronous neuronal firing”，“synchronous neuron firing”)和“同步动作电位”(synchronous action potentials)在本文中可互换使用，并且是指在一段时间内神经元的重复放电以例如产生神经振荡或神经元动作电位的重复簇放电。所述神经振荡可以通过它们的频率、振幅和相位来表征。如本领域技术人员将能够理解的，同步神经放电(synchronous neural firing)或同步动作电位可以通过各种电生理学技术来检测。

在一些方面，提供了神经细胞的混合物，其中所述细胞源自多能干细胞，例如人iPS细胞。所述混合物可以包括分类为例如皮质神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、海马神经元、杏仁核神经元、周围神经元、运动神经元和/或表达伤害性感受器的神经元的兴奋性神经元和抑制性神经元的组合。所述兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的混合物可以在体内大脑的相同一般神经解剖区域中或在大脑的不同神经解剖区域中发现(例如，在哺乳动物受试对象例如人、灵长类动物、猿、猴、小鼠或大鼠等的大脑中)。

如在本说明书中使用的，“a”或“an”可以表示一个或多个。如本文在权利要求中使用的，当与词语“comprising”(包括/包含)结合使用时，词语“a”或“an”可以表示一个或多于一个。

权利要求中的术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指出仅表示替代物或者替代物是相互排斥的，但是本公开支持仅表示替代物以及“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以指至少第二个或更多个。

在本申请中，术语“约”用于指示数值包括用以确定该数值的装置或方法的误差的固有变化，或存在于研究对象之间的变化。

通过以下详细描述，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，虽然指明本发明的优选实施方式，但本发明的详细描述和具体实施例仅以说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图简述

以下附图形成本说明书的一部分，并被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1：产生冷冻保存的

冲经元的示意图。

图2：不同数量的兴奋性-抑制性细胞的神经细胞类型的实例。

图3：具有增加的抑制量的8个孔的示例光栅图和速度图。通过混合

多巴神经元(

DopaNeurons)(70∶30，E∶I％)与

神经元(

Neurons)(30∶70)(细胞类型的百分比在以上附图中显示)来设定E/I比。速度图表示4分钟记录中的每500毫秒的瞬时平均放电速率。同步网络簇放电在培养的6-10天开始。

图4：使用Axion的48孔(每孔16个通道)MEA板对具有递增量的抑制性细胞(

神经元)的兴奋性细胞(

多巴神经元)进行滴定，分8步进行，重复6次。Axion的神经度量(Neural Metrics)分析工具盒用于评估(每个通道)平均放电速率、通道簇放电速率(bursting rate)(poisson surprise)和簇放电强度，以及(所有通道)网络簇放电和每个网络簇放电(扩张)中包括的通道数。对于每个测量显示了所有8个条件(N＝6)的平均值和SEM。观察到在不改变簇放电强度的情况下，随着抑制量的增加，放电速率和簇放电速率降低。增加的抑制率还分流网络簇放电和扩张(expansion)。

图5：示出了具有增加的兴奋量的8个孔的示例原始数据轨迹和速度图。通过混合

神经元(30：70)和谷氨酸能95(Glutamatergic95)(95∶5)细胞来设定E/I比。随着兴奋的增加观察到网络簇放电的扩张(框)和增加的强度。在达到兴奋阈值(5.)之后观察到网络癫痫发作的出现，其持续直至观察到培养物大多在最高兴奋比(8.)沉默。对于每幅图，显示

神经元的百分比(左边，较大字体)和谷氨酸能95的百分比(右边，较小字体)。

图6：Axion的48孔板允许8个条件，重复6次。平均放电速率、通道簇放电速率和簇放电强度都显示不同的E/I比率峰和分布。通道簇放电和强度随着兴奋水平的增加而下降。注意，在较低的兴奋量下表现一致的扩张水平也随着过度兴奋而下降。

图7：与图5所示相同的培养物，加入～15k

星形胶质细胞(

Astrocytes)7天之后。

图8：在添加星形胶质细胞之后，变动的通道簇放电速率E/I比率分布，以及归一化的所有E/I比率的强度、网络簇放电和扩张水平。

图9：表达相似的E/I比率(70∶30)的神经元培养物的两个实例(第12天)。

多巴神经元(顶部)是中脑神经元，而谷氨酸能70(Glutamatergic70)(底部)细胞类型是皮层神经元。注意这两个网络显示类似的网络簇放电强度水平和簇放电后鸣动(rumbling)水平，这在

多巴神经元中更加明显。

图10：显示了

多巴神经元培养物的网络簇放电分析(～第12天)(簇放电实施例：图9：顶部)。与对照(维持培养基：MM)相比，在Brains Phys(BP)培养基中生长的两种培养物均导致增加的平均放电速率(上部：红色)和同步(上部：紫色)，并且还产生更稳定的神经网络(*所有比较的p＜0.05)。值得注意的是，BP将培养物网络的活动从MM中看到的高频、短通道(泊松捕获(Poisson-captured))簇放电行为(框：左)改变为高频、长期网络(ISI捕获)簇放电行为(框：右)，其包含更大百分比(％)的通道簇放电活性(底部)。

图11：显示了

多巴神经元培养物上的兴奋性药理学的两个实例，THIP(上)和L-655，708(下)。THIP是一种睡眠辅助剂并激活紧张性抑制(tonic inhibition)，而L-655，708减少紧张性抑制，是一种认知增强剂，也已知会诱导癫痫发作。紧张性抑制是一种抑制电流，其协助设置细胞的静息膜，以及分流兴奋性电位使细胞去极化至动作电位的阈值。结果表明，药理学试剂均未改变网络簇放电强度，但两者都改变了簇放电后行为。THIP缩短了整个簇放电的持续时间和簇放电后的鸣动(rumble)，反之，L-655，708通过诱导活动的连续鸣动(rumbling)而破坏了“之后的安静”。这些实验表明，培养物的网络同步对已知的兴奋性调节药理学有适当的响应。

图12：由源自人iPS细胞的神经元培养物观察到簇放电。

图13：不同比率的兴奋性和抑制性神经元可以在单个MEA中共培养。

具体实施方式

本发明部分基于这样的发现，即兴奋性和抑制性神经元的组合可以在体外混合或组合以形成可以显示同步放电的神经网络。在一些实施方式中，已经发现兴奋性神经元与抑制性神经元的特定比率(E/I比率)可以有效地用于形成神经网络。可以通过组合源自多能干细胞诸如人iPS细胞的不同细胞类型(例如，

神经元、

多巴神经元、谷氨酸能X，其中X等于谷氨酸神经元的百分比)来产生神经元细胞培养物内的E/I比率。例如，可以从人iPS细胞产生一种、两种、三种或更多种不同E/I比率的神经元培养物，并在体外组合和培养以产生神经网络。在各种实施方式中，iPS细胞可来自健康患者或患有疾病例如神经性疾病或神经变性疾病的患者。如下面的实施例所示，Axion Maestro多电极阵列(MEA)平台用于评估在各种E/I比率的iPS细胞衍生神经元培养物中的神经元活性、同步和簇放电行为。在一些实施方式中，也可以向培养物中加入源自多能干细胞例如人iPS细胞的星形细胞(例如

星形胶质细胞)。可以例如经由Neural Metrics统计工具盒(Axion)来执行分析。如以下实施例所示，结果支持E/I比率可用于调节神经元网络同步性、扩张和癫痫发作倾向的想法。本文提供的培养物和方法可以是特别有用的，例如用于毒性筛选和/或筛选或测试可用于调节神经传递的治疗上有用的化合物。

I.由各种比率的不同细胞类型形成同步网络

在一些实施方式中，各种比率的不同细胞可以在体外组合以形成神经元的同步网络。例如，在一些实施方式中，各种比率的兴奋性和抑制性神经元可以在体外(例如，在多孔板例如多电极阵列中)组合以形成显示出同步放电的神经网络，所述同步放电可以例如通过电生理技术被记录到。在一些实施方式中，神经元培养物不包括星形胶质细胞。尽管如此，在一些实施方式中，星形胶质细胞可以在体外与兴奋性和/或抑制性神经元组合。

取决于形成的神经网络的预期用途，可以使用兴奋性和抑制性神经元的不同比率来形成神经元网络或神经网络。例如，如果需要以兴奋性神经元活性增加或抑制性神经元活性降低为特征的神经疾病表型的体外重现(例如癫痫)，则可以使用与抑制性神经元相比更高比例的兴奋性神经元，例如具有约100∶0、90∶10、80∶20或70∶30，或其中可导出的任何范围的E∶I比率。另外一种方式，如果需要与兴奋性神经元活性降低或抑制性神经元活性增加相关的神经疾病表型的体外重现(例如自闭症谱系障碍)，则可以使用与兴奋性神经元相比具有一定范围的抑制性神经元比例的神经培养物，例如具有约20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60或其中可导出的任何范围的E∶I比率。例如，可以使用具有约0∶100、5∶95、10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15、90∶10、95∶5或100∶0，或其中可导出的任何范围的E∶I比率的培养物。在一些实施方式中，如果需要非疾病表型的体外重现，则可以使用与抑制性神经元相比近似相等数量的兴奋性神经元，或优选地，E与I的比例近似为约80∶20、75∶25、70∶30、60∶40、55∶45、50∶50或其中可导出的任何范围，并包括其中的所有组合。

所述神经培养物或神经网络可以进一步包括星形胶质细胞。在一些实施方式中，星形胶质细胞可以占神经培养物或神经网络的约1、2.5、5、10、15、20、25、35、40、45、50或55％，或其中可导出的任何范围。在一些实施方式中，可将至少约1k(即约1000)、2.5k、5k、10k、15k、20k、25k或更多星形胶质细胞加入包含兴奋性和抑制性神经元的培养物中。

源自多能干细胞例如人诱导多能干细胞(iPSC)的多种细胞群体可用于本申请的各种实施方式中；这些细胞群体类型包括例如皮质(GABA能/抑制)神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、血清素能神经元、谷氨酸能神经元、表达士的宁敏感性甘氨酸受体的神经元、乙酰胆碱神经元、肾上腺素或去甲肾上腺素神经元、组胺应答性神经元、A-δ或C组疼痛纤维、表达伤害感受器的神经元和星形胶质细胞。在一些实施方式中，通常在海马区、杏仁核、外周(周围神经元)、运动神经元或皮质神经元(例如，谷氨酸能神经元或兴奋性神经元)中发现的神经元类型可以用在各种实施方式中。例如，在一些实施方式中，胆碱能神经元可以如例如US 8,513,017或US 8,796,022中所述生成。在一些实施例中，运动神经元可以如例如US 8,735,149中所述生成。在一些实施方式中，多巴胺能神经元可以如WO2013067362；WO2013163228；WO2012080248；或WO2011130675中所述形成。

可以使用多种方法产生和维持诱导的多能干细胞(iPSC或iPS细胞)。例如，可以如Yu et al.(2007)，Yu et al.(2008)，Yu et al.(2009)，Takahashi et al.，(2006)，Takahashi et al.(2007)，US 8,546,140，US 8,741,648或美国专利公开2011/0104125所述产生iPS细胞。例如使用如美国专利公开2007/0238170、美国专利公开2003/0211603、美国专利公开2008/0171385，和/或美国专利公开2009/0029462所述的方法培养iPS细胞并维持在未分化状态。在某些实施方式中，可使用未定义的条件；例如，可以在成纤维细胞滋养细胞或已暴露于成纤维细胞滋养细胞的培养基中培养多能细胞，以维持干细胞处于未分化状态。另外一种方式，可以使用确定的、无滋养细胞培养系统，例如TeSR培养基(Ludwig etal.，2006a；Ludwig et al.，2006b)或E8或Essential8培养基(Chen et al.，2011：PCT/US2011/046796)培养多能细胞并维持在基本上未分化的状态。

在一些实施方式中，特定比率的兴奋性神经元和抑制性神经元可以在体外接种到单个孔或容器中，以便形成在体外产生同步神经放电的神经网络。在一些实施方式中，将兴奋性(例如谷氨酸能)神经元与抑制性神经元(例如，GABA能神经元)的以下比率，例如约90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、50∶50或其中可导出的任何范围的比率，接种或培养以形成可在体外显示同步神经放电的神经网络或培养物。

II.体外培养神经元的方法

在一些实施方式中，在体外培养神经元以允许形成神经网络。神经元可以任选地与星形胶质细胞一起培养或共培养。在一些实施方式中，在多孔板诸如多孔电极阵列上培养神经元。例如，Axion BioSystems多电极阵列(MEA)是可以在一些实施方式中使用的多孔电极阵列的实例。所述MEA系统在每个孔中包括可以用于检测神经元电活动的电极，并且MEA板可以具有48或96个孔。Multichannel Systems (Reutlingen，德国)和NeuroNexus(Ann Arbor，MI)也生产可用于本发明的各种实施方式中的可商购的多电极阵列。然而，在一些实施方式中，细胞可以在培养皿或多孔皿中培养，然后使用另一种技术单独测量以检测细胞的神经活性；例如，可以检测神经元的同步放电的其他电生理学技术包括例如FLIPR钙评估和电压敏感染料和/或蛋白质(VIP)。一般来说，可以设想，涉及测量或检测网络簇放电、网络级通信、网络连接性、神经传导性、连接性或同步神经元簇放电或放电的几乎任何技术都可以用在本发明中。

在一些实施方式中，使用Axion BioSystems的Maestro多电极阵列(MEA)技术。MEA允许非侵入性、无标记的平台，其可以用于测量单个细胞或细胞网络的电活动。在一些实施方式中，源自IPS细胞的神经元(例如

神经元，

多巴神经元)可以在MEA上直接解冻并培养以形成适于电生理学研究的神经元网络。可以使用

神经分析仪(

NeuroAnalyzer)、基于MATLAB的脚本和/或Axion′s Neural Metrics来分析在Maestro MEA系统上检测到的神经元电活动。总之，这些方法可以用作非侵入性平台以用于评估神经传递的复合调节的潜在效应。

多种培养基可用于体外培养神经元。在一些实施方式中，人工牙髓-脊髓液(ACSF)可用于体外培养神经元。通常，培养基可以具有合适的无机盐浓度(例如，类似于DMEM/F12培养基)，合适的渗透压(例如约305-315mOsmol)和等于约7.4的pH。在一些实施方式中，可以使用BrainPhys培养基(The Salk Institute，La Jolla，CA；Bardy et al.，2015；WO2014172580)来培养细胞。BrainPhys培养基可以任选地补充有N2、B27、视黄酸、脑源性神经营养因子(BDNF)、源自胶质细胞的神经营养因子(GDNF)、抗坏血酸、cAMP、层粘连蛋白和胆固醇，例如以促进培养物中未分化细胞或神经前体细胞的进一步分化。在一些实施方式中，所用的培养基允许自发和诱发的动作电位、网络自发性钙活性、兴奋性突触活性和与生理条件相当的葡萄糖水平。在一些实施方式中，根据需要，所述培养基可以包括神经递质(例如GABA、谷氨酸、乙酰胆碱和/或多巴胺)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(glypican 4)和/或磷脂酰肌醇蛋白聚糖6(glypican 6)，以促进自发性神经传递。在其他实施方式中，添加到神经培养物中的培养基没有或仅有痕量的神经递质。

设想常规aCSF型培养基或常规aCSF型培养基可以进一步包含星形胶质细胞因子以促进兴奋性突触形成(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖4和/或磷脂酰肌醇蛋白聚糖6；Allen etal.，2010)。在一些实施方式中，设想可以使用以下aCSF培养基：aCSF(低Mg⁺)：125mM NaCl、25mM NaHCO₃、2.5mM KCl、1.25mM NaH₂PO₄、2.8mM CaCl₂、0.2mM MgCl₂、25mM D-葡萄糖、13.87M蔗糖，用95％O₂和5％CO₂鼓泡。所述培养基可以是约pH 7.4。aCSF型培养基还可以包含约4-10nM或8nM磷脂酰肌醇蛋白聚糖4和/或约4-10nM或8nM磷脂酰肌醇蛋白聚糖6。在一些实施方式中，所述培养基已被改变以减少或消除可能影响谷氨酸能突触活性或GABA能突触活性的神经活性氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸)的水平。所述培养基可以包含接近神经生理学水平的NaCl浓度，例如约120-125nM。所述培养基可以含有接近体内人脑脊髓液中的钙含量，例如约1.1mM的Ca²⁺。所述培养基可以具有约300-315、300-305、300-310、300、305、310、315mOsmol，由大于约300至约315mOsmol或其中可导出的任何范围的摩尔渗透压浓度。

III.由多能细胞产生神经元和星形胶质细胞的方法

多种方法可用于产生用于本发明的各个方面的神经元和/或星形胶质细胞。在一些实施方式中，可培养由多能细胞例如iPS细胞或干细胞产生的神经元(例如，GABA能、谷氨酸能或多巴胺能神经元等)或星形胶质细胞。在一些实施方式中，可以在包含多电极阵列(例如，MEA)的孔中培养之前分化神经元；在其它实施方式中，细胞是未分化的、多能的、多重能的或神经祖细胞，其可以置于包含多电极阵列的孔中，然后分化成神经细胞。

在一些实施方式中，由从获自健康供体的细胞产生的iPS细胞产生神经元或星形胶质细胞。在其他实施方式中，供体患有疾病。例如，在一些实施方式中，供体患有疾病，例如神经性或神经变性疾病，诸如癫痫、孤独症、注意缺陷多动障碍(ADHD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、Charcot-Marie-Tooth(CMT)、亨廷顿病、家族性癫痫、精神分裂症、家族性阿尔茨海默病、弗里德赖希共济失调(Friedreich ataxia)、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、遗传性痉挛性截瘫、白细胞营养不良、苯丙酮尿症、泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)、威尔森氏病、成瘾症、抑郁症或情绪障碍。所述疾病可以是遗传性疾病或对特定神经疾病增高的遗传易感性。

在一些实施方式中，以下方法可用于从多能干细胞例如胚胎干细胞或iPS细胞产生GABA能、谷氨酸能、多巴胺能或胆碱能神经元。例如，在一些实施方式中，美国专利申请2012/0276063的方法可用于从多能干细胞产生神经元。例如，在一些实施方式中，bFGF和TGFβ可以从用于在聚集体形成开始之前培养多能细胞例如iPS细胞的培养基(例如，从确定的培养基，例如TeSR或Essential8培养基中除去)中排除(而细胞仍然处于贴壁培养)，那么这可以用于促进多能细胞的神经元分化。在一些实施方式中，当iPS细胞在不存在TeSR生长因子的情况下“引发”，即在没有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β(TGFβ)的任何培养基中于聚集体形成前培养几天，细胞可以发展成具有纯度、快速性和一致性的神经谱系。用于制备神经元的其他方法包括Zhang et al.(2013)、US 7,820,439、PCT公开号WO 2011/091048、US 8,153,428、US 8,252,586和US 8,426,200。

多种方法可用于从多能干细胞例如胚胎干细胞或iPS细胞产生星形胶质细胞。这些方法包括例如美国专利申请2012/0276063，通过引用将其全部内容并入本文中，而没有免责声明。

在一些实施方式中，Studer等人的方法可用于产生多巴胺能神经元细胞(PCT公开号WO 2013/067362，通过引用并入本文)。这些结果表明，通过该方法产生的多巴胺能神经元可以在体内有效地移植。在一些实施方式中，美国专利申请14/664,245中描述的方法可用于产生多巴胺能神经元细胞。

源自多能细胞(包括iPS细胞)的神经元细胞类型的培养物也是可商购的，并且可以购买。例如，可以由Cellular Dynamics International(Madison，Wisconsin)购买源自人iPS细胞的

神经元、

多巴神经元和

星形胶质细胞。

神经元是人类诱导多能干细胞(iPSC)衍生的神经元，其表现出天然人类神经元的生物化学、电生理学和病理生理学特性。由于其高纯度、功能相关性和易用性，

神经元(

Neurons)代表了一种非常有用的体外试验系统，用于基础研究和药物开发的许多领域中的神经生物学研究。

在一些实施方式中，确定的培养基(即，不含有组织、滋养细胞或细胞条件培养基的培养基)可用于从多能细胞例如iPS细胞产生神经元或星形胶质细胞。

用于从iPS细胞产生神经元或星形细胞的培养基也可以基本上不含血清和/或源自血清的生长因子。在另一个实施方式中，培养基可以含有或基本上不含外部添加的TGFβ超家族信号调节剂，包括BMP信号转导和/或激活素/Nodal/TGFβ/GDF信号传导的正调节剂或抑制剂。例如，BMP信号传导抑制剂可以是dorsomorphin，而激活素/Nodal/TGFβ/GDF信号传导抑制剂可以是SB431542。在另一个实施方式中，培养基可以含有或基本上不含其它外部添加的FGF信号传导调节剂，特别是FGF抑制剂。

方法可涉及使用多能干细胞作为分化的起始材料，其可以是胚胎干(ES)细胞、诱导的多能干细胞或通过体细胞核转移产生的胚胎干细胞。在某一方面，所述多能干细胞可以源自单个多能干细胞克隆，可以包含源自单细胞克隆的大部分细胞，或可以是多个细胞群体的库，其中每个细胞群体是源自单细胞克隆。在一个特定方面，所述多能干细胞可以是例如源自单细胞的细胞群体。

用于从单细胞获得多能干细胞的示例性方法可以包括在包含ROCK抑制剂或肌球蛋白II抑制剂(例如，肌球蛋白抑制剂(blebbistatin))的培养基中在促进细胞生长的条件下温育单个多能干细胞，例如在贴壁培养条件下温育单个多能干细胞。在用于聚集体形成的悬浮培养物中培养多能干细胞之前，可以将作为起源来源的单一多能干细胞传代一次、两次、三次、四次、或优选为至少五次。在另一方面，所述多能干细胞还可以源自包含多于单个细胞的iPS细胞群。所述细胞可以是人、小鼠或其他哺乳动物细胞。

在分化之前，可以在非细胞基质组分上培养多能干细胞。基质组分的非限制性实例可以包括胶原、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-D-鸟氨酸、层粘连蛋白、

玻连蛋白和纤连蛋白及其混合物，例如来自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞的蛋白质混合物(例如Matrigel^TM或

)和裂解细胞膜制剂(Klimanskaya et al.，2005)。为了消除由未表征的组分引入的变异，所述培养基可以基本上不含外部添加的动物来源的组分，例如血清、滋养细胞或动物来源的蛋白质，其中所述动物不是人。

所述培养基可以是化学确定的或未确定的(即，包含外部添加的化学上未确定的组分)。确定的培养基将具有所有成分的已知的量和化学组成。未确定的培养基可以具有一些未确定的组分，例如一些复杂成分，诸如细胞提取物，其由未知比例的化学物质的混合物组成。在具体实施例中，确定的培养基可以基于Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)、例如具有营养混合物F-12的DMEM培养基(DMEM/F12)、具有N2补充的DMEM/F12培养基、具有B-27补充的DMEM-F12培养基，或具有胰岛素、转铁蛋白和硒(ITS)补充的DMEM-F12培养基。

在一些方面，在聚集体形成前，细胞可在引发培养基(priming medium)中培养约4、8或12小时，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天(或其中可导出的任何范围)。细胞可以在约5、10、15、20、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500mL或其中可导出的任何范围的体积的引发培养基中培养。可以在每4、8或12小时，1、2、3、4、5天或其中可导出的任何范围内进行更换的引发培养基中培养细胞。在某些方面，细胞可在引发培养基中培养引发期。所述引发期可以是确定时间段或通过优化所选择的多能干细胞系或克隆或其他指定条件而鉴定的时间段。例如，确定的引发期可以在分化前约4、8或12小时，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天(或其中可导出的任何范围)，或其中可导出的任何范围开始。所述引发期可持续约4、8或12小时，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，或持续至进一步分化开始的时间(也可以包括任何中间时间段)。

在另外的方面，所述方法可以进一步包括在预定量的外部添加的TGFβ超家族信号传导抑制剂和/或FGF8的存在下培养多能干细胞或其子代细胞。这种培养可以是引发(在聚集体形成之前培养)、形成聚集体或进一步分化的步骤中的任何时间。在特定方面，在预定量的外部添加的TGFβ超家族信号传导抑制剂和/或FGF8的存在下，在引发期间和/或在聚集体形成期间可以在至多约一、二、三、四、五、六天(或其中可导出的任何范围)内培养细胞。在另一个特定方面，在预定量的外部添加的TGFβ超家族信号传导抑制剂和/或FGF8的存在下，在聚集体形成后培养至多约一、二、三、四。五、六、七、八、九、十天以进一步分化，然后在随后的时期中在不存在外部添加的TGFβ超家族信号传导抑制剂和/或FGF8的情况下培养。在某些方面，可以在引发、聚集体形成和/或进一步分化期间，在预定量的外部添加的TGFβ超家族信号传导抑制剂和/或FGF8的存在下培养细胞。在某些方面，可以在引发、聚集体形成和/或进一步分化期间，在不存在外部添加的TGFβ超家族信号传导抑制剂和/或FGF8的情况下培养细胞。

由于系至系和克隆至克隆的变异性(即细胞系和克隆变异性)，可以使用方法来确定用于多能干细胞群体的神经分化的TGFβ超家族信号传导抑制剂和/或FGF8的合适量。在某一方面，所述方法可以进一步包括测试多能干细胞群体的神经分化效率，以确定将导致高效神经分化以产生高纯度神经培养物所需的外部添加的TGFβ超家族信号传导抑制剂和/或FGF8的合适量(如果有的话)。神经分化效率可以根据所有神经元或神经细胞类型(例如星形胶质细胞)来测量。

可以在解离多能干细胞或不解离多能干细胞的情况下开始分化。在一些实施方式中，分化可包括将干细胞解离成基本上单细胞培养物。所述解离包括使用现在已知或以后开发的能够产生基本上单细胞培养物的任何方法。在一个示例性实施方式中，可以通过蛋白酶处理或机械处理(例如移液)将细胞解离。例如，所述蛋白酶可以是胶原酶、胰蛋白酶-EDTA、分散酶或其组合。另外一种方式，可以使用螯合剂来解离细胞，例如柠檬酸钠、EGTA、EDTA或其组合。基本上单细胞培养物可以是其中期望生长的细胞彼此解离，使得大多数细胞是单细胞或至多两个细胞保持结合(双联体)的的细胞培养物。优选地，期望培养的细胞中超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的细胞是单个体或双联体。

分化方法包括使用现在已知或以后开发的能够分化多能干细胞的任何方法。分化可以包括形成细胞聚集体(类胚体)或可以不需要形成细胞聚集体。在特定实施方式中，解离的细胞可在培养基(聚集体形成培养基)中形成细胞聚集体。所述聚集体形成培养基可以含有或可以基本上不含TGFβ超家族信号调节剂和bFGF。

任何引发、聚集体形成和/或进一步分化培养基可以含有外部添加的至少或至多约5至约200ng/ml FGF8，例如至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、180、200ng/ml或其中可导出的任何范围。外部添加的FGF8或TGFβ超家族信号传导抑制剂的量可以为能有效地改善高纯度神经细胞类型的产生的至少、约或至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、150、200ng/ml，至少、约或至多0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50μM或其中可导出的任何范围，或任何浓度。

为了促进解离细胞的存活，所述培养基可以包含外部添加的肌球蛋白II抑制剂或Rho相关激酶(ROCK)抑制剂。所述肌球蛋白II抑制剂可以是肌球蛋白抑制剂(blebbistatin)。所述ROCK抑制剂可以是Y27632、HA-100或H1152。这样的抑制剂可以具有约0.05至约50μM的浓度，例如至少或约0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、45或50μM，包括其中可导出的任何范围，或者有效促进细胞生长或存活的任何浓度。

由多能干细胞形成的聚集体可以是约、至少或至多5、10、15、20、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500μm直径。直径可以是平均值、中值或平均直径。在另一方面，聚集体的至少约20％、30％、40％、50％、80％、90％、95％或99％(其中可导出的任何范围)可包含至少或约10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100、150、200、250、300、400、500、1000个细胞，或其中可导出的任何范围的个数的细胞。在某些方面，聚集体的大部分(例如，至少约50％，80％，90％，95％，99％或其中可导出的任何范围)的直径为约80至200μm。聚集体尺寸的最佳范围的近似均匀性可以促进分化，因为分化由各种细胞类型之间的空间线索和相互作用引导，这可以通过改变聚集体大小来操控。

分化可以包括在贴壁或悬浮培养物中培养多能干细胞和/或其后代细胞。在一个具体的实施方式中，在分化期间，细胞可以转移到贴壁培养物。例如，所述贴壁培养物可以具有非细胞基质成分。在优选的实施方式中，所述方法可以用于在悬浮培养物中分化多能干细胞以产生神经细胞。所述多能干细胞或其后代细胞可以在悬浮培养物中温育。在另一个实施方式中，所述多能干细胞聚集体可以在悬浮培养物中形成。所述悬浮培养物，例如在生物反应器中可以具有约、至少或至多2mL、5mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1升、3升、5升、10升、20升、25升、30升、40升、50升，或其中可导出的任何范围的体积。一些实施方式涉及在其体积大于标准培养皿或96孔板的空间中生长的细胞；因此，一些实施例不包括这些容器的使用。

为了优化细胞聚集体的大小和生长，所述悬浮培养物可以以至少或约5、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100rpm，或其中可导出的任何速度范围运动。作为非限制性示例，所述运动可以包括搅拌、摇动、摇摆或旋转。

分化中使用的培养基可以包括或不包括使用外部添加的TGFβ超家族信号传导抑制剂、bFGF抑制剂或两者。TGFβ超家族抑制剂可以是BMP信号传导抑制剂和/或活化素/Nodal/TGFβ/GDF信号传导抑制剂。bFGF信号传导抑制剂可以是PD166866。随着通过引发的神经诱导的改善，该方法可以消除在分化中使用这种抑制剂的需要。

在某些方面，iPS细胞群体或分化细胞群体可以源自单个iPS细胞克隆。在另一方面，可以提供至少或约10⁷、10⁸、10⁹，或多至约10¹⁰个(或其中可导出的任何范围)细胞的细胞群体。所提供的细胞群体可以包含至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可导出的任何范围)的细胞，例如神经细胞。在一个具体实施方式中，细胞群体可以包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％(或其中可导出的任何范围)的神经细胞。与目前已知的方法和没有使用引发的方法相比，本发明可以实现来自多能干细胞分化的神经细胞的意想不到的高产率。

还可以提供包含由上述任何方法提供的神经细胞或星形胶质细胞的细胞群。其它实施方式可以提供至少或约10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰个神经细胞(或其中可导出的任何范围)的分离的细胞群体。分化的细胞可以包含至少90％(例如，至少或约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或其中可导出的任何范围)的神经细胞或星形胶质细胞。在具体实施例中，所述细胞群体可以在神经细胞特异性的启动子下包含转基因(例如，编码可选择和/或可筛选标记)。例如，所述转基因可以是抗生素抗性基因或荧光蛋白编码基因。神经特异性启动子的非限制性实例包括双皮质素(DCX)、神经元III型β-微管蛋白(TUJ-1)、突触蛋白I(SYN1)、烯醇酶2/神经元特异性烯醇酶(ENO2/NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管蛋白α-1A链(TUBA1A)、神经元配基2(neurogenin 2)(NGN2)或微管相关蛋白-2(MAP-2)。所述方法还可以包括例如基于可选择或可筛选标记的神经元特异性或星形胶质细胞特异性表达来分离或富集神经细胞或星形胶质细胞。

B.神经元谱系表征

为了鉴定神经细胞、确定朝向神经谱系的分化效率、选择或分离神经细胞或富集神经细胞，可以评估神经谱系特征(Schwartz et al.，2008)。

在具体的实施方式中，祖细胞神经谱系细胞，例如培养的细胞，可以基于该细胞对巢蛋白、Sox1、Pax6、FORSE-1、N-CAD、CD133、CD11、FOXG1和3CB2中的一种或多种的表达来鉴定为神经细胞。这种细胞培养物可以通过本文所述的方法或通过其它方法(包括那些以后开发的方法)产生。在具体的实施方式中，通过Dcx、MAP-2、突触素1、TuJ1、NSE、Map2a、Gap43、NF、CD24、CDH2/CD325、突触泡蛋白和CD56/NCAM中一种或多种的表达，可以将成熟神经细胞，包括培养的细胞，鉴定为成熟神经细胞。这种细胞培养物可以通过本文所述的方法或通过其它方法(包括那些以后开发的方法)产生。

神经细胞可以根据许多表型标准来表征。标准包括但不限于形态特征的显微镜观察、表达的细胞标记、酶活性、神经递质及其受体的检测或定量，以及电生理功能。

可以用于各种实施方式的某些细胞具有神经元细胞的特有形态特征。这些特征是本领域技术人员所熟知的。例如，神经元包括小细胞体，和轴突和树突回忆多重过程(multiple processes reminiscent of axons and dendrites)。

神经细胞还可以根据它们是否表达特定种类的神经细胞特有的表型标记来表征，所述特定种类的神经细胞包括但不限于多巴胺能神经元(标记包括TH、AaDC、Dat、Otx-2、FoxA2、LMX1A和VMAT2)、胆碱能神经元(标记包括NGF、ChAT)、GABA能神经元(标记包括GAD67和vGAT)、谷氨酸能神经元(标记包括vGLUT1)、血清素能神经元、运动神经元(标记包括HB9、SMN、ChAT、NKX6)、感觉神经元(标记包括POU4F1和外周蛋白)、星形胶质细胞(标记包括GFAP和Tapal)和少突胶质细胞(标记包括O1、O4、CNPase和MBP)。所述神经细胞可以表达特定种类的神经细胞类型的1、2、3、4、5或更多种标记物。

特定神经亚型，特别是终末分化细胞如多巴胺能、GABA能、谷氨酸能、5-羟色胺能和胆碱能神经元所特有的是，在神经递质的生物合成、释放和再摄取中涉及的受体和酶，以及与突触传递相关的去极化和复极化事件中参与涉及的离子通道。突触形成的证据可以通过对突触素染色来获得。可以通过例如检测γ氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(glutamate)、多巴胺、3，4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)、去甲肾上腺素、乙酰胆碱和5-羟色胺的受体来获得对某些神经递质的接受性的证据。

在一个特定方面，星形胶质细胞可以与神经元一起培养或共培养。星形胶质细胞是中枢神经系统中神经胶质细胞的亚型。它们也称为星形的胶质细胞(astrocytic glialcell)。一般为星形，它们的许多过程通常包括由神经元在体内产生的突触。星形胶质细胞通常使用组织学分析鉴定；许多这些细胞表达中间丝胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。在CNS中存在星形胶质细胞的三种形式，即纤维状、原生质状和径向。纤维性胶质通常位于白质内，具有相对较少的细胞器，并表现出长的无分支的细胞过程。这种类型通常具有“血管足”，当它们靠近毛细管壁外部的细胞时将与其物理连接。原生质神经胶质存在于灰质组织中，具有更大量的细胞器，并表现出短的和高度支化的三级过程。径向神经胶质被设置在垂直于心室轴线的平面中。径向胶质细胞主要存在于发育期间，并且可在体内的神经元迁移中起作用。视网膜的穆勒细胞(Mueller cell)和小脑皮质的伯格曼胶质细胞(Bergmann gliacell)则是例外，并且在成年期仍然存在。

C.细胞的遗传改变

可以通过在分化之前、期间或之后对细胞进行遗传工程改造，使在本文所述的各个方面中使用的细胞(例如神经元、星形胶质细胞等)含有一个或多个遗传改变(美国专利公开2002/0168766)。通常，当多核苷酸已通过任何合适的人工操作手段转移到细胞中时，或者当细胞是遗传了该多核苷酸的最初改变的细胞的后代时，细胞是“遗传改变的”或“转基因的”。例如，可以通过在细胞进展为限制性发育谱系细胞或终末分化细胞之前或之后遗传改变细胞以表达端粒酶逆转录酶来加工细胞以增加其复制潜力(US 2003/0022367)。在另一个实施例中，细胞可包含在神经启动子(例如，MAP2启动子)的控制下的可筛选或可选择标记，允许有效选择或筛选神经元细胞。具体地，多能细胞可以用标记物工程化，分化为神经细胞，然后基于该标记物选择以获得纯化的神经细胞群体(例如神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、谷氨酸能神经元、GABA神经元等)。

IV.神经培养物的使用

显示同步神经元放电或同步动作电位的神经细胞培养物也可用于例如测试分子对神经分化或存活的影响，或用于毒性测试或测试分子对神经或神经元功能的影响。这可以包括鉴定影响神经元活性、可塑性(例如，长期增强)或功能的化合物的筛选。细胞培养物可用于发现、开发和测试与神经干细胞、神经祖细胞或分化的神经或神经元细胞类型相互作用并影响其生物学的新药物和化合物。神经细胞也可以在设计用于鉴定神经发育和功能障碍的细胞和分子基础的研究中具有很大的效用，所述神经发育和功能障碍包括但不限于轴突导向、神经变性疾病、神经元可塑性以及学习和记忆。这样的神经生物学研究可用于鉴定这些过程的新型分子组分，并提供现有药物和化合物的新用途，以及鉴定新的药物靶标或药物候选物。

在一些实施方式中，可以测试一种或多种特定化合物以确定该化合物是否具有可能有益于治疗疾病的效果。例如，化合物改变神经网络活性(例如同步簇放电)的能力可通过暴露包含兴奋性和抑制性神经元的培养物来使用，任选地还包括星形胶质细胞，其中所述兴奋性神经元、抑制性神经元和/或星形胶质细胞来源于从健康供体获得的iPS细胞。基于化合物对神经活性的影响，然后能够确定所述化合物是否可用于治疗疾病。例如，显示出减少神经元同步放电的化合物可用于治疗以太多同步放电(例如癫痫、孤独症、精神分裂症等)为特征的疾病。在一些实施方式中，兴奋性神经元、抑制性神经元和/或星形胶质细胞源自患有疾病(例如遗传性疾病或具有遗传组分或风险因子的疾病)的受试者的iPS细胞，所述疾病例如神经或神经变性疾病(例如，自闭症、癫痫、ADHD、精神分裂症、双相性精神障碍等)。在一些实施方式中，可以在第一化合物或毒素的存在下培养神经元，使得神经培养物将显示与疾病状态相似的性质；在这些实施方式中，可以向神经培养物提供第二化合物，以观察第二化合物是否可以减轻或降低第一化合物或毒素的作用。在其他实施方式中，神经培养物可用于确定化合物是否对神经培养物产生毒性或不利影响。

实施例

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表由发明人发现的在本发明的实践中良好地起作用的技术，因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方式进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。

实施例1

在Mestro多电极阵列上来自iPS细胞的神经元的细胞外单一单元记录

以下方法可用于在Mestro多电极阵列(Mestro Multielectrode Array，MEA)上培养神经细胞。解冻

神经元，并铺板到用50％聚乙烯亚胺(PEI；Sigma)溶液预包被的48孔MEA板中。在铺板后第1天，用Neurobasal-A培养基(NBA；Life Technologies)+10％敲除血清替换物(KnockOut Serum Replacement，KSR；Life Technologies)替换100％的用过的培养基。在铺板后第5天，用NBA+10％KSR替换50％的用过的培养基。在铺板后第8天，记录基线活性，细胞用化合物处理，并随后记录活性。

准备48孔MEA板：

1.通过将3.10g硼酸和4.75g四硼酸钠溶解在蒸馏水中制备1L硼酸盐缓冲液。将pH调节至8.4。如有必要，增加或减少体积。

2.通过在硼酸盐缓冲液中稀释50％PEI的溶液制备0.05-0.1％PEI溶液。通过0.22μm过滤器过滤0.05-0.1％PEI溶液。注意：0.05-0.1％PEI溶液可在4℃下储存长达1个月。

3.将125μl/孔的0.05-0.1％PEI溶液加入到48孔MEA板。在室温下温育1小时。

4.从48孔MEA板中吸出PEI溶液。不要让孔干燥。

5.用至少300μl/孔的无菌水冲洗4次。

6.在无菌生物安全柜中敞开盖子将48孔MEA板风干过夜。可以使48孔MEA板风干过夜以达到最佳的细胞附着和最大的性能。

解冻

神经元(

Neurons)：以下程序详述将1瓶

神经元解冻到48孔MEA板中。相应地调整2瓶

神经元的体积。一次不要准备多于两块48孔MEA板。

1.根据

神经元用户指南，准备完整的

神经元维持培养基(Complete

Neurons Maintenance Medium)(Complete Maintenance Medium，完全维持培养基)。任选地，青霉素-链霉素可以1X终浓度加入到完全维持培养基中。

2.通过添加250μl层粘连蛋白到25ml完全维持培养基中以稀释储备层粘连蛋白溶液(1mg/ml)至最终浓度为10μg/ml。通过颠倒管轻轻混合。储备层粘连蛋白溶液可在室温或4℃解冻过夜。

3.根据用户指南解冻

神经元，并在含有10μg/ml层粘连蛋白的完全保持培养基中将细胞悬浮液稀释至最终体积为10ml。

4.任选地，可以移出细胞悬浮液的样品，并使用血细胞计数器计数神经元以确定细胞的存活率和总数。

5.将细胞悬浮液转移到15ml离心管中。

6.通过在380×g离心5分钟浓缩神经元。

7.吸出上清液至刚好在细胞沉淀上方，留下大约50μl，小心不要搅动沉淀。由于真空抽吸的不精确的性质，近似地提供该体积。

8.加入125μl含有10μg/ml层粘连蛋白的完整维持培养基到细胞沉淀中，并通过上下吹吸轻轻地重悬。

9.用移液器测量细胞悬液的总体积。添加含有10μg/ml层粘连蛋白的完整维持培养基至最终体积为220μl。轻轻吹打混匀。

10.转移细胞悬浮液到1.5ml离心管。

将

神经元铺板到48孔MEA板中：

1.通过轻轻颠倒管2-3次彻底混合细胞悬液。以一定角度倾斜48孔MEA板，使得所有孔的底部可见。立即将4μl/孔的细胞悬液液滴直接分配在用PEI溶液预包被的48孔MEA的孔的记录电极区域上。

2.加入2ml无菌水到48孔MEA板的孔周围的区域，以防止液滴蒸发。不要让水进入48孔MEA板的孔中。可以在铺板细胞悬浮液之后加入水，以避免当板倾斜时水漏入孔中。只要48孔MEA板保持湿润的环境，水的准确体积并不是关键。

3.用无菌MicroClime环境盖(MicroClime Environmental lid)覆盖48孔MEA板，并在37℃、5％CO₂、95％湿度的细胞培养箱中温育约40分钟。

4.在添加培养基之前，加载带有无菌吸头的12通道移液器，并根据需要移除吸头，以便分配到48孔MEA板中。

5.以陡峭的角度(～75-80度)倾斜平板。沿48孔MEA板的孔的侧壁轻轻地加入150μl/孔的含有10μg/ml层粘连蛋白的完整维持培养基，使用12通道移液器一次一行。培养基添加太快可能驱散附着的神经元。在该步骤中，时间掌控可能是关键的。如果使得液滴干燥，表现可能受损。可以首先向所有孔中加入小体积的培养基，而不是在每个孔中一次性加入总体积。

6.将48孔MEA板缓慢地放回到生物安全柜表面上的平整位置，以使得培养基轻轻地覆盖液滴。

7.重复步骤5，直至300μl/孔的最终体积。

8.用无菌MicroClime环境盖覆盖48孔MEA板，并在37℃、5％CO₂、95％湿度的细胞培养箱中温育。

在48孔MEA板上维持

神经元：

1.制备补充有10％KSR和1X青霉素-链霉素的NBA培养基(NBA+KSR培养基)。通过0.22μm过滤器过滤。任选地，青霉素-链霉素可以1X终浓度加入培养基中。

2.在铺板后第1天，在水浴中将NBA+KSR培养基平衡至37℃。

3.如上所述装载具有无菌尖端的12通道移液器，以便一次一行地从48孔MEA板中分配和移出用过的培养基。

4.使用12通道移液器，一次一行地向48孔MEA板的孔的侧壁轻轻地加入150μl/孔的37℃NBA+KSR培养基。培养基添加太快会驱散附着的神经元。

5.重复步骤4，直至300μl/孔的最终体积。

6.用无菌MicroClime环境盖覆盖48孔MEA板，并在37℃、5％CO₂、95％湿度的细胞培养箱中温育4天。

7.在铺板后第5天，用150μl/孔的新鲜37℃NBA+KSR培养基替换50％用过的培养基(150μl/孔)。

8.在37℃、5％CO₂、95％湿度的细胞培养箱中温育3天。为了最佳性能，可以在铺板后第8天进行数据采集。

可以使用AxIS软件(Axion Integrated Studio，Axion BioSystems)进行数据分析和获取。在铺板后第8天或之后，神经元制备物可适合于数据采集。数据采集可以包括应用前记录(基线)，复合应用记录，随后是应用后记录(剂量)。可以使用AxIS软件获取电活动。CDIneuronconfig.datastream文件可以确保将适当的数据采集设置加载到AxIS软件中。

实施例2

通过使用人类iPSC衍生的细胞类型滴定E/I比率来调节神经网络簇放电和同步性

神经元：本发明人利用iPSC技术将来自正常健康供体或特定疾病供体的成人细胞重编程回多能性状态。在这种状态下，iPS细胞具有分化成几乎任何细胞类型的能力-包括先前难以实现的人类神经元。重要的是，

神经元作为冷冻保存的材料提供，可以在一周的任何一天解冻和使用。用于产生冷冻保存的

神经元的一般示意图如图1所示。

细胞样品的特征如下突出显示。

神经元是基于阳性βIII-微管蛋白和巢蛋白阴性染色的人iPSC衍生的皮质神经元的高纯度群体(＞95％)。它们具有经典神经元形态学，具有在培养第1天开始的双极或多极神经突生长。这些细胞已被确定为抑制性(GABA能；～70％)和兴奋性(谷氨酸能；～30％)神经元的混合物，并且已经在基因表达水平和通过特征分子标记的表型分析进行了分析。

多巴神经元：多巴胺能(DA)神经元可以被培养延长的时间。两个星期后，存在显著程度的神经突向外生长，并且在这一点形成的复杂网络使人想起经典神经元表型。

多巴神经元是＞80％TH阳性。

多巴神经元也是抑制性(GABA；～30％)和兴奋性(谷氨酸能；～70％)神经元的混合物。使用免疫组织化学来确认神经元为兴奋性神经元或抑制性神经元(图2)。

在这些实验中，从Cellular Dynamics International，Inc.(Madison，WI)获得

多巴神经元，

神经元和

星形胶质细胞，如实施例1所述混合并在MEA板上培养。细胞在从Salk Institute(La Jolla，CA)获得的BrainPhys培养基(Bardy et al.，2015)中培养。

在这些实验中，神经元细胞类型被混合以在每个单独的细胞类型重新悬浮之后且在点板之前滴定E/I比率。例如，如果50％

多巴神经元的混合物与50％

冲经元混合，将40微升(μL)的重悬的

多巴神经元与40μL重悬的

神经元混合。在细胞类型混合完成后，将该混合物溶液用于对MEA板进行点板。

Brain phys培养基有助于建立/稳定神经元网络

解冻后，

多巴神经元在维持培养基(MM)或Brain Phys(BP)培养基中培养～12天。描绘神经元网络活动/连通性的簇放电动力学分析显示，与在MM中生长的培养物相比，BP处理的培养物显示出更强健的、稳定的大网络簇放电。更具体地，网络行为从在MM中看到的不具有更大网络活性的强的小网络(单通道)簇放电变化为在BP处理的培养基中的大的涵盖整个培养物(全通道)网络簇放电，其中仍然包括强的小网络(单通道)簇放电。分析和结果示于图10中。

滴定E/I比率：E对I是不同步的

具有增加的抑制量的8个孔的示例光栅图和速度图。通过混合

多巴神经元(70∶30，E∶I％)与

神经元(30∶70)设置E/I比率(细胞类型的百分比在图上显示)。速度图表示4分钟记录的每500毫秒的瞬时平均放电速率。同步网络簇放电在培养的第6-10天开始。结果示于图3中。

Axion的Neural Metrics分析工具盒评估(每个通道)平均放电率、通道簇放电率(poisson surprise)和簇放电强度，以及(所有通道)网络簇放电和包括在每个网络簇放电(扩张)内的通道数量。使用该工具盒，在所述混合培养物的所有孔中评估活性。注意，随着抑制量的增加，放电速率(firing rate)和簇放电速率(bursting rate)降低，而抑制不改变每个簇放电的强度。网络簇放电随着抑制量的增加而完全消除。结果示于图4中。

滴定E/I比率：I对E是超同步的

随着兴奋量的增加，8个孔的示例原始数据轨迹和速度图。通过混合

神经元(30∶70，E∶I％)与谷氨酸能95(95∶5，E∶I％)细胞来设置E/I比率。培养物继续显示同步网络簇放电达多个星期。注意扩张(图5，框)和随着兴奋增加而提高的网络簇放电强度。还要注意在达到兴奋阈值之后网络癫痫发作(network seizures)的外观。结果示于图5中。

平均放电速率、通道簇放电速率和簇放电强度都显示不同的E/I比率峰和分布。通道簇放电和强度随着兴奋水平的增加而下降。注意，在更低的兴奋量下保持恒定的扩张水平也随着过度兴奋而下降。结果示于图6中。

含有星形胶质细胞的神经网络是稳定的

使用与用于滴定E/I比率的培养物相同的培养物，除了将

星形胶质细胞加入细胞培养物中。添加

星形胶质细胞后7天的结果显示在图7中。在星形胶质细胞加入后，通道簇放电速率E/I比率分布发生变化，所有E/I比率上的强度、网络簇放电和扩张水平被归一化。结果示于图8中。

表达相似E/I比率(70∶30)的神经元培养物的两个实例(第12天)显示在图9中。

多巴神经元(顶部)是中脑神经元，而谷氨酸能70(底部)细胞类型是皮层神经元。注意两个网络显示类似的网络簇放电强度水平和簇放电后低鸣(rumbling)水平，这在

多巴神经元中更加明显。

多巴神经元培养物上的兴奋药理学的两个例子，THIP(顶部)和L-655，708(下部)示于图11中。THIP激活紧张性抑制，而L-655，708减少紧张性抑制。这两种药理学试剂无一改变网络簇放电强度，但都改变簇放电后行为。THIP缩短了整个簇放电的时间，以及簇放电后的低鸣时间。相反，L-655，708消除了“之后的安静”，并使网络失去同步，引发了主导活动的持续活动低鸣(rumble)。

在培养的神经元中观察到同步簇放电。观察到在相同MEA孔内的所有16个电极的大部分上的同时放电。这些强烈簇放电尖峰表示神经元网络已经形成，且细胞一起同步放电。如图12所示，用人iPS细胞衍生的神经元培养物观察到簇放电表型；特别地，注意图11中的每个y轴的刻度。如图13所示，可以在多电极阵列(例如MEA)中共培养不同比例的兴奋性和抑制性神经元。

***

根据本公开，可以在没有过度实验的情况下进行和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经根据优选实施方式描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以将变化应用于所述方法和所述方法的步骤或步骤的顺序而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

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Claims

1.一种用于产生神经元群体的体外方法，其包括：

(a)在体外组合多个兴奋性神经元和抑制性神经元，和

(b)将神经元培养足够的时间以允许形成神经网络；

其中所述兴奋性神经元和所述抑制性神经元都源自诱导多能干(iPS)细胞；并且

其中所述兴奋性神经元与所述抑制性神经元的比率足以允许产生同步神经元放电或同步动作电位；

其中所述神经元群体包含30％至90％的兴奋性神经元和10％至70％的抑制性神经元；

其中所述兴奋性神经元是谷氨酸能神经元，并且其中所述抑制性神经元是GABA能神经元。

2.如权利要求1所述的方法，其中神经元培养物进一步包含星形胶质细胞，其中所述星形胶质细胞源自多能干细胞。

3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述诱导多能干(iPS)细胞是人诱导多能干(iPS)细胞。

4.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述诱导多能干(iPS)细胞是源自小鼠、大鼠、猿或猴的诱导多能干(iPS)细胞。

5.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述诱导多能干(iPS)细胞源自健康供体。

6.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述诱导多能干(iPS)细胞源自患有疾病的受试对象。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述疾病是神经疾病或神经变性疾病。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述疾病是自闭症、癫痫、精神分裂症、ADHD、ALS或双相性精神障碍。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述神经元群体还包含5％至25％的星形胶质细胞，其中所述星形胶质细胞源自诱导多能干(iPS)细胞。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述星形胶质细胞源自人诱导多能干(iPS)细胞。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述神经元群体包含源自诱导多能干(iPS)细胞的兴奋性神经元的第一培养物和源自诱导多能干(iPS)细胞的抑制性神经元的第二培养物的混合物；其中所述第一培养物包含至少90％的谷氨酸能神经元；并且其中所述第二培养物包含至少70％的GABA能神经元。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述诱导多能干(iPS)细胞是人诱导多能干(iPS)细胞。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述群体包含20％至90％的第一培养物和10％至80％的第二培养物。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述神经元群体进一步包含5％至25％的星形胶质细胞，其中所述星形胶质细胞源自诱导多能干(iPS)细胞。

15.如权利要求1-2和9-14中任一项所述的方法，其中在多电极阵列上培养神经元群体。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述多电极阵列是Maestro MEA。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述多电极阵列包括至少8个电极。

18.如权利要求15所述的方法，其中所述多电极阵列包括至少16个电极。

19.如权利要求15所述的方法，其中所述多电极阵列包括在多电极阵列中不同孔中的所述神经元的多种培养物，其中兴奋性与抑制性神经元的比率在培养物之间不同。

20.如权利要求1-2和9-14中任一项所述的方法，其中所述神经元群体包括皮质神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、海马神经元、杏仁核神经元、周围神经元或运动神经元。

21.如权利要求1-2和9-14中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使神经元群体与测试化合物接触。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述测试化合物能调节神经传递。

23.如权利要求1-2和9-14中任一项所述的方法，还包括检测或测量群体的电活性或神经元活性。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述检测或测量包括测量由所述群体产生的电压。

25.如权利要求24所述的方法，其中来自所述检测或测量的数据使用

神经分析仪进行分析。

26.由权利要求1-25中任一项所述的方法产生的神经元培养物。

27.如权利要求26所述的培养物，其中所述神经元包括在多电极阵列中或多电极阵列上。