KR20230165846A - 도파민성 전구세포 및 사용 방법 - Google Patents

도파민성 전구세포 및 사용 방법 Download PDF

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랜달 리어리쉬
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후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드
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Abstract

뇌 장애를 치료하기 위해 사용할 수 있는 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포가 본원에 제공된다. 만능 세포를 중뇌 도파민성(DA) 뉴런 또는 중뇌 뉴런 전구체로 분화시키는 데 사용할 수 있는 개선된 단일-SMAD 방법이 제공된다. 일부 양상에서 예를 들어, 파킨슨 질환과 같은 뇌 장애의 치료를 위해 상당히 개선된 성질을 갖는 도파민성 뉴런 전구세포를 생성하는 데 사용할 수 있는 단일-SMAD 배양 프로토콜 및 배양 기간에 대한 방법이 제공된다. 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포로 파킨슨 질환 및 기타 뇌 질환을 치료하는 방법도 제공된다.

Description

도파민성 전구세포 및 사용 방법
우선권 주장
[0001] 본 출원은 2021년 4월 7일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/171,837호; 및 2021년 11월 4일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/275,691호의 우선권 이득을 주장하고, 이들의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
발명의 배경
1. 발명의 분야
[0002] 본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 의약 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 만능 줄기세포로부터 신경 전구세포를 생산하는 방법과 관련 치료 방법에 관한 것이다.
2. 관련 분야의 기재
[0003] 파킨슨 질환(PD)은 A9 중뇌 도파민성(mDA) 뉴런의 손실과 그에 따른 도파민 뉴런 신호전달의 손실로 인해 운동 장애가 나타나는 쇠약성 신경 퇴행성 질환이다. 도파민성 약물 치료요법 및 심부 뇌 자극(DBS)을 포함한 현재 PD 치료요법은 운동 증상 개선을 목표로 한다.
[0004] PD로 인한 임상적, 사회적 비용은 증가할 것으로 예상되며 현재 치료 옵션은 상당한 한계를 나타내고 있다. 인구 고령화가 지속됨에 따라 2040년까지 전 세계적으로 1,400만 명 이상의 희생자가 발생할 것으로 보수적 추산과 함께 PD는 급격히 증가할 것으로 예상된다(Dorsey & Bloem, 2018). PD 환자는 다양한 비운동적 특성을 나타낼 수 있지만, 대표적인 증상은 도파민성 흑색질 뉴런의 손실에 부수적인 선조체 도파민성 기능 부전으로 인한 진행성 운동 결손이다. 현재의 치료요법은 대부분 운동 결손을 개선하는 데 초점을 맞춘 대증 치료요법이다.
[0005] 도파민 효능제 전달은 일반적으로 중간에서 중간 정도의 완화 효과만 제공한다. L-도파를 사용한 치료는 신중한 용량 관리가 필요하고, 보통 4~6년 동안만 효과가 있으며, 흔히 운동 이상증을 유발한다. 예를 들어, 경구용 L-DOPA 또는 도파민성 효능제는 초기에는 운동 증상을 완화할 수 있지만, 5-10년 후에는 대부분의 환자는 쇠약해진 운동 변동과 운동 이상증을 경험한다.(Ahlskog & Muenter, 2001). DBS는 침습적 임플란트를 사용해야 하고, 신경정신과적 부작용을 갖고, 일반적으로 10년 미만 동안 효과적이다. 시상하핵(STN) 또는 담창구 내부 절편의 DBS 자극은 일부 환자의 DA 손실을 보상할 수 있지만, 상기 접근법은 주로 인지 저하를 나타내지 않고 주기적인 배터리 교체가 필요한 젊은 환자용으로 지적된다. 이들 치료법 중 어느 것도 근본적인 질환 병리, 즉 mDA 뉴런의 점진적인 손실을 해결하지 못한다.
[0006] 세포 이식 치료요법이 시험되었지만, 이러한 노력에는 상당한 한계가 있었다. 손실된 세포를 대체하고 10-15년 동안 PD 운동 증상을 완화하는 세포 기반 치료요법은 PD의 치료를 위한 주요 목표이다. 태아 조직을 사용한 연구가 수행되었다(Brundin et al., 1986; Doucet et al., 1989; Freeman, Sanberg, et al., 1995). 중뇌 신경 선조체의 공급원으로서 태아 복측 중뇌(fVM) 세포를 사용한 연구가 수행되었지만(문헌참조: Barker et al., 2013); 세포 이식과 관련된 여러 상이한 연구들 간의 효능 결과는 엇갈리거나 일관되지 않았다(e.g., Barbuti et al., 2021; Barker, Drouin-Ouellet, & Parmar, 2015).
[0007] fVM 세포로의 투여를 포함하는 대체 치료요법은 인종적 및 기술적 한계 둘다를 나타낸다. 설치류 및 사람 태아 복측 중뇌(hfVM) 공여자 조직으로부터의 도파민 뉴런을 도파민이 고갈된 실험 동물의 선조체에 생착되면 치료에 도움이 될 수 있다(문헌참조: Steinbeck & Studer, 2015; Wianny & Vezoli, 2017). 개방 표지 hfVM 시험에서 일부 환자(Freeman, Olanow, et al., 1995; Lindvall et al., 1990)는 임상적 개선을 나타냈다. 그러나 무작위 배정된 이중 맹검, 위약 제어된 임상 시험에 따르면 이들 이득은 사전 정의된 2차 평가변수(통합 파킨슨 질환 평가 스케일, UPDRS)가 보다 젊은(<60세 연령; (Freed et al., 2001)) 또는 덜 손상된(< 49 UPDRS; (Olanow et al., 2003)) 대상체에서 통계적으로 유의적인 이득을 보였음에도 불구하고 시험의 1차 평가변수를 충족하기에는 너무 가변적임을 지적하였다. 추가로, 일부 환자는 이식편 유도된 운동 이상(GID)을 나타냈고 (문헌참조: Freed et al., 2001; Hagell et al., 2002; Ma et al., 2002), 이는 능히 기존의 L-DOPA-유도된 운동 이상증 및 목적하는 도파민성 뉴런을 따라 존재하는 세로토닌성 세포를 함유하는 이식체와 관련된다(문헌참조: Hagell & Cenci, 2005; Lane & Smith, 2010). 이들 발견은 접근법의 재평가를 촉진하였다. 보다 최근에는 유럽 협력 컨소시엄인 TRANSEURO에서 생착전 L-DOPA 유도된 운동 이상증이 발생하지 않은 비교적 초기 질환 단계의 환자 11명과 함께 개방 표지 시험(NCT01898390)에서 태아 이식을 재검토하였다(문헌참조: Barker & consortium, 2019).
[0008] 현재 치료 요법은 질환 진행을 정지시키거나 역전시키지 못하기 때문에 새롭고 효과적인 PD 치료법에 대한 필요성이 크게 충족되지 않고 있다. 공여자 조직 가용성이 제한적이고 태아 조직을 사용할 때 윤리적 문제가 있기 때문에 fVM 치료요법은 광범위한 임상 사용에 유용하지 않을 가능성이 높고 따라서 배아 줄기 세포(ESC) 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)와 같은 다른 세포 공급원을 연구하고 있다. 예를 들어 PD를 치료하기 위해 사용될 수 있는 만능 세포로부터 도파민성 뉴런을 생성하기 위한 새롭고 개선된 방법이 명백하게 필요하다.
발명의 개요
[0009] 일부 양상에서, 본원 개시내용은 질환의 치료 또는 포유동물 대상체로의 생착을 위해 개선된 치료학적 성질을 갖는 도파민성(DA) 선조체 세포, 바람직하게는 선조체 중뇌 도파민성(mDA) 세포 배양물을 제공함으로써 종래 기술의 한계를 극복한다. 유도만능줄기(iPS) 세포와 같은 만능 줄기세포로부터 이러한 DA 선조체 세포 배양을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 분화 배양 37일째까지 여러 시점에서 DA 선조체에 대한 동등한 패터닝이 관찰된 WO2018/035214에 기재된 단일-SMAD 방법론을 사용한 이전 실험과는 대조적으로, 본원 개시내용은 부분적으로 단일-SMAD 방법을 사용한 분화 배양 약 360-456시간, 보다 바람직하게는 약 384-432시간 후에 활용된 DA 선조체 세포가 파킨슨 질환(PD) 치료와 같은 치료학적 적용에 놀랍도록 우수한 성질을 나타낼 수 있다는 발견에 기반한다. 아래 실시예에 나타낸 바와 같이, 이들 시간 범위내 이들 조건하에서 분화된 이들 세포는 PD의 6-OHDA 무흉선 누드 래트 모델을 사용하여 생체 내 생착 및 신경 분포가 극적으로 개선되는 것으로 관찰되었다. 따라서 본원에 제공된 단일-SMAD 분화 방법에서 이러한 시간 범위는 극적으로 개선된 치료학적 잠재력을 가진 세포 배양을 생성하는 데 중요한 것으로 나타난다. 선조체에 세포를 투여받은 래트에 대한 행동 실험 결과, PD 증상 치료와 생체 내 회복의 개선된 치료를 초래하였다. 이식된 mDA 선조체의 생존 및 효능에 대한 세포 성숙도, 미성숙한 뉴런 및 유사분열 후 뉴런은 헤미파킨슨병 래트에서 시험하였다. 중뇌 DA 선조체 세포는 생존, 신경 분포, 효능 측면에서 미성숙 또는 성숙 뉴런보다 현저히 우수하였다. 동위치(흑색질) 생착은 mDA 선조체가 미성숙 뉴런보다 장거리 전뇌 구조에 신경을 공급하는 능력이 더 크다는 것을 입증하였다. 광범위한 용량 범위에서 선조체를 평가했을 때, 명확한 구조적 및 기능적 용량 반응이 관찰되었다. 이식편은 iPSC에서 유래되었지만 기형 종이나 현저한 세포 증식은 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 PD를 치료하기 위한 이식에 사람 iPSC 유래 mDA 선조체의 사용을 뒷받침한다. 본원에 제공된 세포 배양물 또는 DA 선조체를 사용하여 PD와 같은 뇌 질환을 치료하는 방법도 제공된다.
[0010] 일부 양상에서, iPSC 유래 중뇌 DA 뉴런 선조체 세포(예를 들어, "FCDI DAPC-1" 또는 D17 세포)를 포함하는 동결 보존 단일 세포 현탁액이 제공된다. DA 선조체 세포는 본원에 제공된 단일-SMAD 방법을 사용하여 약 360~456시간, 보다 바람직하게는 약 384~432시간의 배양 분화를 통해 생성될 수 있다. 이들 세포는 동종이계 사람 iPS 세포 또는 iPS 세포주에서 직접 분화를 통해 유래하여 DA 뉴런 선조체 세포 집단을 수득할 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 상기 DA 뉴런 선조체 세포는 표현형 마커(예를 들어, 도 1 및 도 2)와 발달 중뇌의 흑질 영역에서 발견되는 도파민 뉴런 전구체와 유사한 발달 잠재력을 갖는 것으로 관찰되었다(예를 들어, 도 3, 도 13 및 도 14). FCDI DAPC-1은 치료학적 용도에 해로울 수 있는 전뇌 뉴런과 잔류 iPSC의 수가 상당히 부족한 것으로 관찰되었다(예를 들어, 도 5, 도 6 및 표 3). 치료학적 사용을 위해 고려되어 온 다른 DA 세포와 달리, FCDI DAPC-1은 EdU 통합으로 입증된 바와 같이 증식하는 신경 선조체 세포 집단이다(도 7). FCDI DAPC-1은 PD의 6-OHDA 무흉선 래트 모델에서 개선된 회복과 관련된 특징인 우수한 생착 및 신경 분포를 나타냈다(도 9, 도 10 및 도 14).
[0011] 일부 양상에서, 도파민성 뉴런 전구세포(예를 들어, FCDI DAPC-1)는 단일-SMAD 방법론을 사용하여 iPS 세포와 같은 만능 줄기 세포를 배양함으로써 제조될 수 있고, 여기서 상기 세포는 약 360-456시간, 또는 더 바람직하게는 약 384-432시간 동안 분화 조건 하에서 배양된다. 단일-SMAD 분화 방법론("단일-SMAD 억제" 또는 "단일-SMADi" 방법이라고도 함)은 예를 들어, 본원에 이의 전문이 참조로 인용되는 WO2018/035214에 기재되어 있다. 단일-SMADi 방법은 2개 이상의 SMAD 억제제를 이용하는 SMAD 신호전달의 억제가 필요한 방법에 비해 이점을 제공할 수 있다. 일반적으로 모노 SMAD 방법은 단지 하나의 SMAD 억제제(즉, 두 번째 SMAD 억제제가 아닌 단일 SMAD 억제제)만 사용함을 포함한다. 단일-SMAD 방법은 다음을 포함할 수 있다: (i) Wnt 작용제 (예를 들어, CHIR99021)의 첨가에 있어서 2일 또는 3일까지 시차를 두는 단계, (ii) CHIR 농도를 재최적화하는 단계 (예를 들어, 약 0.5 - 3.0 μM, 0.7 - 3 μM, 1 - 2.5 μM, 1.25 - 2.25 μM, 약 1.25 μM 초과 내지 약 2 μM 또는 약 1.55, 1.65, 1.75 μM 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위를 이용), 및/또는 (iii) 3-5일째에 분화 배지에 MEK 억제제 (예를 들어, PD0325901)를 포함시키는 단계. 상기 방법은 예를 들어, 상기 양태 (i 및 ii), (ii 및 iii), (i 및 iii) 또는 (i, ii 및 iii)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 TGF-β 억제제, 예를 들어, SB431542에는 노출시키지 말고 BMP 억제제 (예를 들어, 도르소모르핀 또는 LDN-193189)에 노출시킨다. 세포는 중뇌 DA 뉴런 또는 FOXA2+/LMX1A+ 세포로 분화될 수 있습니다. 이들 방법은 단일 SMAD 억제제만 (예를 들어, 도르소모르핀만을 포함하거나 또는 LDN-193189만을 포함하는)을 포함하는 배지를 사용하여 iPS 세포주로부터 mDA 선조체 형성을 위해 사용될 수 있다.
[0012] 본원 개시내용의 양상은 하기 신호전달 조절제의 존재 하에 사람 만능 세포를 배양함으로써 생성된 중뇌 도파민성(mDA) 뉴런 전구세포를 포함하는 배양물에 관한 것이다: (a) 데카펜타플레직에 대한 작은 모체(Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)) 신호 전달의 제1 억제제, (b) SHH(Sonic hedgehog) 신호 전달의 적어도 하나의 활성화 인자, 및 (c) 윙리스(wingless)(Wnt) 신호 전달의 적어도 하나의 활성화 인자이고, 여기서 방법은 데카펜타플레직에 대한 작은 모체(SMAD) 신호전달의 제2 억제제의 존재 하에 사람 만능 세포를 배양하는 것을 포함하지 않고; 사람 만능 세포는 약 360 내지 약 456시간 동안 분화를 유도하는 조건 하에 배양된 후 냉장 또는 냉동보존되고; 중뇌 도파민성 전구세포는 포크헤드 박스 단백질 A2(FOXA2) 및 LIM 호메오박스 전사 인자 1(LMX1)(FOXA2+/LMX1+ 세포) 둘 다를 발현한다. 일부 구현예에서, 사람 만능 세포는 약 384시간 내지 약 432시간 동안 분화를 유도하는 조건 하에서 배양한다. 일부 구현예에서, mDA 뉴런 전구세포는 NURR1을 발현하지 않는다. mDA 뉴런 전구세포는 포크헤드 박스 단백질 A2(FOXA2), LIM 호메오박스 전사 인자 1(LMX1) 및 EN1을 발현할 수 있다. mDA 뉴런 전구세포는 OTX2를 추가로 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 포크헤드 박스 단백질 A2(FOXA2) 및 LIM 호메오박스 전사인자 1(LMX1)은 mDA 뉴런 전구세포의 약 60% 내지 약 100% 또는 약 85% 내지 약 95% 이상으로 동시 발현된다. 일부 구현예에서, mDA 뉴런 전구세포의 약 65-75%는 FOXA2와 LMX1을 둘다 동시 발현한다. 일부 구현예에서, 중뇌 도파민성 전구세포는 (FOXA2, LMX1A, ETV5 및 EN1)을 발현하고, 중뇌 도파민성 전구세포는 (NURR1, TH, CALB1, BARHL1 또는 GRIK2)를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, mDA 뉴런 전구세포는 증식 또는 분열하는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 약 40% 이상 또는 약 50-75%의 mDA 뉴런 전구세포는 증식 또는 분열하고 있다. 배양액은 세로토닌성 뉴런 전구세포의 약 5% 이하를 추가로 포함할 수 있다. 세로토닌성 뉴런 전구세포는 BARLH1을 발현할 수 있다. 배양액은 신경교 전구세포를 추가로 포함할 수 있다. 신경교 전구세포는 GLAST, SLC13A, CD44, 및/또는 hGFAP를 발현할 수 있다. SMAD 신호전달의 억제제는 BMP 억제제, 예를 들어, LDN-193189, 도르소모르핀, DMH-1, 또는 노긴(noggin)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 BMP 억제제는 LDN-193189이다. LDN-193189는 약 0.2 μM 내지 약 4 μM, 보다 바람직하게는 약 1 μM 내지 약 4 μM, 약 1 μM 내지 약 3 μM, 약 0.5 μM 내지 약 4 μM, 약 0. 5 μM 내지 약 2 μM, 약 0.2 μM 내지 약 4 μM, 약 0.2 μM 내지 약 2 μM, 또는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2 μM 또는 여기서 유래 가능한 임의의 범위의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 SMAD 신호전달 억제제는 TGFβ 억제제이다. TGFβ 억제제는 Sb431542일 수 있다. 일부 구현예에서, SB431542는 약 1-20 μM, 약 5-15 μM, 약 9-11 μM, 또는 약 10 μM의 농도로 존재한다. 상기 만능 세포는 배양 1-15, 1-16 또는 1-17일에 SMAD의 억제제와 함께 배양할 수 있다. 만능 세포는 배양 1-17일에 SMAD 억제제와 함께 배양할 수 있다. 상기 만능 세포를 실질적으로 연속적으로 또는 15, 16 또는 17일 동안 매일 SMAD의 억제제와 함께 배양할 수 있다. 상기 만능 세포를 실질적으로 연속적으로 또는 17일 동안 매일 SMAD의 억제제와 함께 배양할 수 있다. SMAD의 억제제는 약 50-2000 또는 50-500 nM의 농도로 존재할 수 있다. SMAD의 억제제는 약 180-240nm의 농도로 존재할 수 있다. 상기 방법은 상기 만능 세포를 MEK 억제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 MEK 억제제는 PD0325901이다. PD0325901은 약 0.25-2.5 μM의 농도로 존재할 수 있다. 상기 MEK 억제제를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 1-3일 동안, 또는 1-3일, 2-4일, 3-5일째에, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5일째에 상기 만능 세포와 접촉시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 MEK 억제제를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 24시간 내지 약 48시간 상기 만능 세포와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 상기 MEK 억제제는, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 1-2일에서 시작하여 약 3-4일 동안 매일 또는 실질적으로 연속적으로 상기 만능 세포에 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 상기 MEK 억제제는, 1일째에 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 2-5일 또는 3-6일째에 상기 만능 세포와 접촉시킨다. Wnt 신호전달의 활성화제는 GSK3 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, GSK3 억제제는 CHIR99021이다. CHIR99021은 약 1.5-2 μM, 약 1.5-1.7 μM, 약 1.6-1.7 μM, 또는 약 1.65 μM의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 CHIR99021은 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 9-17일째에 약 4-7 μM의 농도로 존재한다. Wnt 신호전달의 활성화제는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 1-3일에 상기 만능 세포에 접촉시킬 수 있다. Wnt 신호전달의 활성화제는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 12-48시간내에 상기 만능 세포에 접촉시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 만능 세포를 14, 15 또는 약 16일 동안 실질적으로 연속적으로 또는 매일 Wnt 신호전달의 활성화제와 함께 배양한다. 일부 구현예에서, Wnt 신호전달의 활성화제는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 2-17일에 상기 만능 세포에 접촉시킨다. 일부 구현예에서, SHH 신호전달의 활성화제는 퍼모파민(purmorphamine) 또는 C25II Shh이다. 상기 방법은 SHH 신호전달의 2개의 활성화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. SHH 신호전달의 두 가지 활성화제는 퍼모파민 및 C25II Shh일 수 있다. 일부 구현예에서, SHH 신호전달의 적어도 하나의 활성화제는, SMAD 신호전달의 억제제와 접촉을 개시한 날과 동일한 날에 또는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 24-48시간 이내에 상기 만능 세포에 접촉시킨다. 일부 구현예에서, SHH 신호전달의 적어도 하나의 활성화제는, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시와 함께 또는 접촉 개시 후 1-7일째에 상기 만능 세포에 접촉시킨다. 상기 방법은 상기 만능 세포를 FGF-8과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 FGF-8은 SMAD 신호전달의 억제제와 접촉을 개시한 날과 동일한 날에 상기 만능 세포와 접촉시키지 않는다. 일부 구현예에서, FGF-8은, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 9-17일 또는 11-17일째에 상기 만능 세포와 접촉시킨다. FGF-8은 약 50-200 ng/mL의 농도로 존재할 수 있다. 상기 만능 세포는 뉴런 프로모터의 제어 하에 항생제 내성 전이유전자를 포함할 수 있다. 상기 방법은 항생제, 화학치료요법제, DNA 가교제, DNA 합성 억제제 또는 유사분열 억제제와 세포를 접촉시켜 만능 세포로부터 유래한 뉴런 세포, 중뇌 DA 뉴런 또는 mDA 뉴런 전구세포를 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 만능 세포를 항생제 또는 화학치료제 (예를 들어, 미토마이신 C)와 접촉하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 미토마이신 C는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 27, 28, 28 및/또는 30일째에 상기 만능 세포와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 항생제는 G418 (제네티신)이다. 상기 방법은 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 전에 ROCK 억제제를 포함하는 배지 중에서 상기 만능 세포를 배양 또는 항온배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 만능 세포를 블레비스타틴과 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 블레비스타틴을 분화 5일 및 17일째에 세포와 접촉시킬 수 있다. 일부 구현예에서, mDA 도파민성 전구세포는 NURR1, MAP2, 또는 Th를 발현하지 않는다. 그럼에도 불구하고 mDA 도파민성 전구세포는 향후 추가 성장 또는 분화 후에도 NURR1, MAP2 및/또는 TH를 발현할 수 있는 잠재력을 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, mDA 도파민성 전구세포는 EN1을 발현한다. mDA 도파민성 전구세포는 성숙한 도파민성 뉴런에서 이들 마커 둘다가 모두 관찰되었지만, 낮은 수준의 PITX2 또는 PITX3를 발현하거나 실질적으로 발현하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, mDA 도파민성 전구세포는 GBX2, OTX1, OTX2, ETV5, CORIN, 및/또는 DCX를 발현한다. 일부 구현예에서, 만능 세포는 사람 유도된 만능 줄기(iPS) 세포이다. LMX1은 LIM 호메오박스 전사인자 1 알파(LMX1A)일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 조성물 내의 세포 중 약 5% 이하(예를 들어, 약 1% 이하, 또는 0.5% 이하)는 세로토닌성 세포 또는 세로토닌성 전구세포이다. 상기 방법은 DNase 또는 엔도뉴클레아제(예를 들어, DNase I 또는 Benzonase®)의 존재 하에서 사람 만능 세포를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. DNase I 또는 Benzonase®은 약 10-20 U/mL 또는 약 10-15 U/mL의 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 단일 세포 제제와 같은 세포 제제에서 세포 응집을 감소시키기 위해 배양 17일째에 DNase I Benzonase®를 첨가할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 사람 만능 세포는, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 4-6일 중 적어도 하나의 날에 엔도뉴클레아제의 존재 하에 배양한다. 사람 만능 세포는, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 5일째에 엔도뉴클레아제의 존재 하에 배양할 수 있다. 상기 배양액은 용기 수단에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 중뇌 도파민성 뉴런 또는 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포는 약제학적 제제 내에 포함된다. 약제학적 제제는 주사를 위해 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 제제는 히알루론산 매트릭스를 포함한다. 배양물은 약 2,500 세포/μL 내지 약 150,000 세포/μL, 약 2,500 세포/μL 내지 약 100,000 세포/μL, 약 10,000 세포/μL 내지 약 150,000 세포/μL, 약 40,000 세포/μL 내지 약 100,000 세포/μL, 또는 약 15,000-45,000 세포/μL을 포함할 수 있다. 세포는 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포 또는 DAPC-1 세포일 수 있다. 배양액은 약 1e6 내지 약 25e6, 보다 바람직하게는 약 3e6 내지 약 9e6 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 배양물 내 세포의 약 10% 이하, 보다 바람직하게는 약 7% 이하가 세로토닌성 전구세포이다. 일부 구현예에서, 배양물 내 세포의 약 5% 이하가 세로토닌성 전구세포이다. 일부 구현예에서, 배양물 내 세포의 약 5% 이하가 SERT 및 TPH2를 발현한다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 배양물은 14일째에 SERT 및 TPH2의 발현을 기준으로 대략 5%의 세로토닌성 세포(세로토닌성 전구세포)가 포함되어 있는 것으로 관찰되었고, 세로토닌성 뉴런은 생착 후 생존하지 못하였다. 일부 바람직한 구현예에서, 총 세로토닌성 세포의 수는 약 5% 이하이지만, 일부 구현예에서, 배양물은 약 6%, 7%, 8% 또는 그 이상의 세로토닌성 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 배양물 내 세포의 약 0.1-5% 이하가 FOXG1을 발현하고/하거나 배양물 내 세포의 약 0.1-5% 이하가 PAX6을 발현한다. 일부 구현예에서, 배양물 내 세포의 약 1% 미만이 FOXG1을 발현하고/하거나 배양물 내 세포의 약 1% 미만이 PAX6을 발현한다.
[0013] 본원 개시내용의 또 다른 양상은 포유동물 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 또는 본원에 기재된 치료학적 유효량의 배양물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 예를 들어, 바람직하게는 배양물을 대상체의 뇌에 투여한다. 상기 포유동물 대상체는 사람일 수 있다. 상기 질환은 중추 신경계 (CNS) 질환일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 질환은 파킨슨 질환 (PD) 또는 파킨슨 플러스 증후군 (PPS)이다. 일부 구현예에서, 배양물은 Engrailed 1(EN1)을 발현하지만 NURR1을 발현하지 않는 mDA 전구세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양물은 완전히 분화되지 않은 도파민성 뉴런을 포함한다. 배양물은 대상체의 피각 또는 흑질과 같은 선조체에 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 배양물은 대상체의 선조체 또는 피각에 하나 초과의 위치에 투여된다. 배양물은 대상체의 선조체 또는 피각으로 다중 위치에서 및/또는 다중 바늘관에 투여할 수 있다. 상기 배양물은 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 약제학적 조성물은 히알루론산 매트릭스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 배양물은 약 15,000-45,000 세포/μL, 또는 약 2e5, 2.5e5, 3e5, 4e5, 4.5e5, 또는 본원에서 유래가능한 임의의 범위의 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포를 포함한다. 배양물은 약 1e6 내지 약 25e6, 보다 바람직하게는 약 3e6 내지 약 9e6 세포를 포함할 수 있다. 배양물은 약 2,500 세포/μL 내지 약 150,000 세포/μL, 약 10,000 세포/μL 내지 약 150,000 세포/μL, 약 40,000 세포/μL 내지 약 100,000 세포/μL, 또는 약 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000 세포/μL 또는 본원에서 유래가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 파킨슨 질환을 갖고, 대상체는 배양물의 투여 후 적어도 하나의 운동 증상이 개선되는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체는 떨림, 근육 경직, 움직임 둔화, 낙상, 현기증, 움직임 정지, 근육 경련 또는 근긴장이상증 중 하나 이상의 감소를 나타낸다. 중뇌 도파민성 전구세포는 적어도 부분적으로 대상체의 선조체 또는 피각을 재신경화할 수 있다. 일부 구현예에서, 중뇌 도파민성 전구세포는 투여 후 제한적으로, 거의 또는 전혀 증식을 나타내지 않는다. 그럼에도 불구하고 중뇌 도파민성 전구세포는 여전히 분열 또는 증식 중인 적어도 일부 세포를 포함할 수 있고, 중뇌 도파민성 전구세포는 투여 후에도 계속 분화할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양물에서 세포의 약 1% 미만, 또는 바람직하게는 0.5% 미만이 세로토닌성 세포이다. 일부 구현예에서, 투여된 세포의 적어도 80%는 대상체에게 투여된 후 FOXA2 및 LMX1 둘다를 발현하는 분화 세포로 분화한다. 일부 구현예에서, 분화 세포의 적어도 85%는 FOXA2 및 LMX1 둘다를 발현한다. 일부 구현예에서, 투여된 세포의 적어도 약 60%는 FOXA2 및 LMX1 둘다를 발현한다. 배양물을 투여하기 전에 극저온 동결(예를 들어, 액체 질소에서 극저온 동결)될 수 있다. 예를 들어, 세포를 저장을 위해 극저온 동결될 수 있고 이후 실온이 되게 하여 대상체에게 세포를 투여한다. FOXA2 및 LMX1을 발현하는 상기 분화된 세포는 engrailed(EN1), 티로신 키나제(TH), 오르토덴티클 호메오박스 2 (OTX2), 핵 수용체 관련 1 단백질 (NURR1), 뉴런 특이적 부류 III 베타 튜블린 (Tuj1), TTF3, 쌍을 이룬 유사(paired-like) 호메오도메인 3 (PITX3), 아케트-스큐트(achaete-scute) 복합체 (ASCL), 조기 B-세포 인자 1 (EBF-1), 조기 B-세포 인자 3 (EBF-3), 트랜스티레틴 (TTR), 시냅신, 도파민 수송체 (DAT), 및 G-단백질 커플링된, 내향 정류식 칼륨 채널(inwardly rectifying potassium channel) (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 및 CD99로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커를 추가로 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, FOXA2 및 LMX1, 또는 FOXA2 및 TH를 발현하는 분화된 세포는 engrailed, PITX3 및 NURR1을 추가로 발현한다. 일부 구현예에서, 세포 배양에서 세포의 약 10-25%가 FOXA2와 티로신 하이드록실라제 (TH)를 동시 발현한다. 만능 세포는 사람 유도된 만능 줄기(iPS) 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 LMX1은 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (LMX1A)이다. 일부 구현예에서, 세포 조성물에서 세포의 약 5% 미만, 약 1% 미만 또는 0.5% 미만은 세로토닌성 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 투여는 숙주 신경아교증을 초래하지 않는다. 상기 투여는 대상체의 뇌에서 비-뉴런 세포의 성장이나 증식이 없거나 본질적으로 없을 수 있다. 상기 투여는 대상체의 뇌에 mDA 전구세포의 생착 및/또는 mDA 전구세포에 의한 대상체 뇌의 적어도 일부의 신경화를 초래할 수 있다. 상기 투여는 주사(예를 들어, 정위 주사)를 통한 것일 수 있다.
[0014] 본원 개시내용의 하나의 양상은 하기의 신호전달 조절제의 존재 하에 사람 만능 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 포크헤드 박스(forkhead box) 단백질 A2 (FOXA2) 및 LIM 호메오박스 전사 인자 1 (LMX1) (FOXA2+/LMX1+ 세포) 둘다를 발현하는 사람 세포를 포함하는 세포 조성물을 제조하는 시험관내 방법에 관한 것이다: (a) 데카펜타플레직에 대한 작은 모체(SMAD) 신호 전달의 제1 억제제, (b) 소닉 헤지호그(Sonic hedgehog(SHH)) 신호 전달의 적어도 하나의 활성화 인자, 및 (c) 윙리스(Wnt) 신호 전달의 적어도 하나의 활성화 인자이고, 여기서 방법은 데카펜타플레직에 대한 작은 모체(SMAD) 신호 전달의 제2 억제제의 존재 하에 사람 만능 세포를 배양하는 것을 포함하지 않고; 사람 만능 세포는 약 360 내지 약 456시간, 또는 본원의 유래가능한 임의의 범위의 시간 동안 분화를 유도하는 조건 하에 배양된 후 세포를 냉장 또는 동결보존한다. 일부 구현예에서, 사람 만능 세포는 약 384시간 내지 약 432시간 동안 분화를 유도하는 조건 하에서 배양한다. 일부 구현예에서, 사람 세포는 NURR1을 발현하지 않는다. 사람 세포는 포크헤드 박스 단백질 A2(FOXA2), LIM 호메오박스 전사 인자 1(LMX1) 및 Engrailed 호메오박스 1(EN1)을 발현할 수 있다. 사람 세포는 추가로 OTX2를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 포크헤드 박스 단백질 A2(FOXA2)는 세포의 약 85-95%에서 발현된다. 일부 구현예에서, FOXA2 및 LIM 호메오박스 전사인자 1(LMX1)은 사람 세포의 약 65% 내지 약 85% 이상, 또는 약 65% 내지 약 75% 이상으로 동시 발현된다. SMAD 신호 전달의 억제제는 BMP 억제제(예를 들어, LDN-193189, 도르소모르핀, DMH-1, 또는 노긴)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 BMP 억제제는 LDN-193189이다. LDN-193189는 예를 들어, 약 0.2 μM 내지 약 4 μM의 농도, 또는 약 1 μM 내지 약 3 μM, 약 0.5 μM 내지 약 4 μM, 약 0. 5 μM 내지 약 2 μM, 약 0.2 μM 내지 약 4 μM, 약 0.2 μM 내지 약 2 μM, 또는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2 μM 또는 여기서 유래 가능한 임의의 범위의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 SMAD 신호전달 억제제는 TGFβ 억제제(예를 들어, SB431542)이다. SB431542는 약 1-20 μM, 약 5-15 μM, 약 9-11 μM, 또는 약 10 μM의 농도로 존재할 수 있다. 상기 만능 세포는 배양 1-15, 1-16 또는 1-17일에 SMAD의 억제제와 함께 배양할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 만능 세포를 배양 1-17일에 SMAD의 억제제를 사용하여 배양한다. 상기 만능 세포를 실질적으로 연속적으로 또는 15, 16 또는 17일 동안 매일 SMAD의 억제제와 함께 배양할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 만능 세포를 17일 동안 실질적으로 연속적으로 또는 매일 SMAD의 억제제와 함께 배양한다. SMAD의 억제제는 약 50-2000 또는 약 50-500 nM의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 SMAD의 억제제가 약 180-240 nM의 농도로 존재한다. 상기 방법은 상기 만능 세포를 MEK 억제제(예를 들어, PD0325901)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. PD0325901은 약 0.25-2.5 μM의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 MEK 억제제를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 1-3일 동안, 또는 1-3일, 2-4일, 3-5일째에, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5일째에 상기 만능 세포와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 상기 MEK 억제제를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 24시간 내지 약 48시간 상기 만능 세포와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 상기 MEK 억제제는, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 1-2일에서 시작하여 약 3-4일 동안 매일 또는 실질적으로 연속적으로 상기 만능 세포에 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 상기 MEK 억제제는, 1일째에 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 2-5일 또는 3-6일째에 상기 만능 세포와 접촉시킨다. Wnt 신호전달의 활성화제는 GSK3 억제제(예를 들어, CHIR99021)일 수 있다. 일부 구현예에서, CHIR99021은 약 1.5-1.7 μM, 약 1.6-1.7 μM, 약 1.65 μM, 또는 여기서 유래가능한 임의의 범위의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 CHIR99021은 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 9-17일째에 약 4-7 μM의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, Wnt 신호전달의 활성화제는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 1-3일에 상기 만능 세포에 접촉시킨다. Wnt 신호전달의 활성화제는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 12-48시간내에 상기 만능 세포에 접촉시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 만능 세포를 14, 15 또는 약 16일 동안 실질적으로 연속적으로 또는 매일 Wnt 신호전달의 활성화제와 함께 배양한다. 일부 구현예에서, Wnt 신호전달의 활성화제는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 2-17일에 상기 만능 세포에 접촉시킨다. SHH 신호전달의 활성화제는 퍼모파민 및 C25II Shh일 수 있다. 상기 방법은 상기 만능 세포를 SHH 신호전달의 2개 활성화제(예를 들어, 퍼모파민 및 C25II Shh)와 접촉하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, SHH 신호전달의 적어도 하나의 활성화제는, SMAD 신호전달의 억제제와 접촉을 개시한 날과 동일한 날에 또는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 24-48시간 이내에 상기 만능 세포에 접촉시킨다. SHH 신호전달의 적어도 하나의 활성화제는, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시와 함께 또는 접촉 개시 후 1-7일째에 상기 만능 세포에 접촉시킬 수 있다. 상기 방법은 상기 만능 세포를 FGF-8과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 FGF-8은 SMAD 신호전달의 억제제와 접촉을 개시한 날과 동일한 날에 상기 만능 세포와 접촉시키지 않는다. 일부 구현예에서, FGF-8은, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 9-17일 또는 11-17일째에 상기 만능 세포와 접촉시킨다. FGF-8은 약 50-200 ng/mL의 농도로 존재할 수 있다. 상기 만능 세포는 뉴런 프로모터의 제어 하에 항생제 내성 전이유전자를 포함할 수 있다. 상기 방법은 항생제, 화학치료제, DNA 가교제, DNA 합성 억제제 또는 유사분열 억제제와 세포를 접촉시켜 만능 세포로부터 유래한 뉴런 세포, 중뇌 DA 뉴런 또는 mDA 뉴런 전구세포를 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 만능 세포를 항생제 또는 화학치료제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 화학치료제는 미토마이신 C일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 미토마이신 C는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 27, 28, 28 및/또는 29일째에 상기 만능 세포와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 항생제는 G418 (제네티신)이다. 상기 방법은 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 전에 ROCK 억제제를 포함하는 배지 중에서 상기 만능 세포를 배양 또는 항온배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 만능 세포를 블레비스타틴과 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 블레비스타틴을 분화 5일 및 17일째에 세포와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 사람 만능 세포의 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80%, 또는 적어도 85%는 분화하고 FOXA2 및 LMX1 둘다를 발현한다. 일부 구현예에서, 사람 만능 세포의 약 10-25%는 분화하고 FOXA2 및 티로신 하이드록실라제(TH) 둘다를 발현한다. 만능 세포는 사람 유도된 만능 줄기(iPS) 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 LMX1은 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (LMX1A)이다. 일부 구현예에서, FOXA2 및 LMX1 또는 FOXA2 및 TH를 발현하는 상기 분화된 세포는 오르토덴티클 호메오박스 2 (OTX2), 핵 수용체 관련 1 단백질 (NURR1), 신경세포 특이적 클래스 III 베타 튜블린 (Tuj1), TTF3, 쌍형 유사(paired-like) 호메오도메인 3 (PITX3), 아케트-스큐트(achaete-scute) 복합체 (ASCL), 조기 B-세포 인자 1 (EBF-1), 조기 B-세포 인자 3 (EBF-3), 트랜스티레틴 (TTR), 시냅신, 도파민 수송체 (DAT), 및 G-단백질 커플링된, 내향 정류식 칼륨 채널(inwardly rectifying potassium channel) (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 및 CD99으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커를 추가로 발현한다. FOXA2+/LMX1+ 세포는 추가로 engrailed En1을 발현할 수 있다. FOXA2+/LMX1+ 세포는 추가로 EN1, Pax8, 및 ETV5를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, FOXA2+/LMX1+ 세포는 NURR1을 발현하지 않는다. FOXA2+/LMX1+ 세포는 GBX2, OTX1, OTX2, ETV5, CORIN, 및/또는 DCX를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 조성물에서 세포의 약 1% 미만, 바람직하게는 0.5% 미만이 세로토닌성 세포이다. 상기 방법은 DNase 또는 엔도뉴클레아제의 존재 하에서 사람 만능 세포를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 엔도뉴클레아제는 DNase I 또는 Benzonase®일 수 있다. DNase I 또는 Benzonase®은 약 10-20 U/mL 또는 약 10-15 U/mL의 농도 또는 여기에서 유래가능한 임의의 범위의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 사람 만능 세포는, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 4-6일 중 적어도 하나의 날에 엔도뉴클레아제의 존재 하에 배양한다. 일부 구현예에서, 상기 사람 만능 세포는, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 5일에 엔도뉴클레아제의 존재 하에 배양한다.
[0015] 일부 구현예에서, 본원에 제공된 단일-SMAD 방법을 사용하여 상기한 것보다 더 길거나 더 짧은 기간 동안 분화된 세포가 제공된다. 예를 들어, D17 세포 이외에, D24 세포 및/또는 D37 세포와 같은 분화 후기 단계의 세포가 본원에 제공되고, 신경학적 또는 뇌 질환을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일 또는 37일 동안 또는 그로부터 유래가능한 임의의 범위의 날 동안 본원에 제공된 단일-SMAD 방법론을 사용하여 분화시킨 세포를 포함하는 배양물이 제공되고, 예를 들어, 약제학적 조성물에 포함되거나 시험관 내 시험(예를 들어, 독성학 시험, 약물 스크리닝, 전기 생리학적 시험 등)에 사용되거나 생체 내 신경학적 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 본원에 제공된 단일-SMAD 방법론을 사용하여 약 12일, 13일, 14일, 15일, 16일의 기간 또는 그로부터 유래가능한 임의의 기간 동안 분화되고, 그러한 세포는 예를 들어, PD와 같은 본원에 기재된 신경학적 질환을 치료하기 위해 포유동물 대상체에 투여될 수 있을 것으로 예상된다. 하기 실시에에 나타낸 바와 같이, D17, D24, D37 세포는 다음과 같은 세포 마커를 발현할 수 있다:
표 X1:
“+” = 관찰된 발현; “―” = 매우 낮은 발현 또는 관찰되지 않은 발현
[0016] 본원 개시내용의 또 다른 양상은 상기 또는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 중뇌 도파민성 뉴런 또는 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포를 포함하는 배양물에 관한 것이다. 상기 배양액은 용기 수단에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 중뇌 도파민성 뉴런 또는 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포는 약제학적 제제 내에 포함된다. 약제학적 제제는 주사를 위해 제형화될 수 있다.
[0017] 본원 개시내용의 또 다른 양상은 시험 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: (a) 상기 또는 본원에 기재된 방법으로 분화된 FOXA2+/LMX1A+ 세포 또는 상기 또는 본원에 기재된 mDA 전구세포(예를 들어, D17 세포)와 시험 화합물을 접촉시키는 단계, 및 (b) 세포의 기능, 생리 또는 생존률을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 측정은 세포의 독성학적 반응 또는 변경된 전기생리학적 반응에 대한 시험을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 중뇌 도파민성 뉴런 또는 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포이다.
[0018] 본 발명과 조합하여 사용할 수 있는 추가의 조건과 방법은, 예를 들어, U.S. 2015/0265652호, U.S. 2015/0010514호 및 WO2013/067362호에서 찾아볼 수 있고, 이들 문헌은 전문이 본원에 참조로 인용된다. 본 발명과 조합하여 사용할 수 있는 만능 세포의 신경 또는 중뇌 DA 뉴런으로의 분화를 정제하거나 또는 촉진하는 추가의 방법으로는, 예를 들어, 문헌 [Kirkeby et al. (2012)], [Kriks, et al. (2011)]; [Chung, et al. (2011)], [Xi et al. (2012)]; [Young et al. (2014)]; [Jaeger et al. (2011)], [Jiang et al. (2012)] 및 US2016/0177260호를 포함한다.
[0019] 본원에서, "분화 일자"는 배지 중에서 세포를 항온배양한 날짜를 지칭하는 것으로, 여기서 1일째에 분화 배지에 대한 만능 세포의 노출이 개시된다. 일부 바람직한 구현예에서, 1일째의 분화 배지는 단일 SMAD 억제제를 포함한다. 분화 배지 중에서 항온처리 또는 배양 전에, 필수 8TM 기본 배지 및 필수 8TM 보충제 [미국 매사추세츠주 월섬 소재의 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사 제조]를 포함하거나 이로써 이루어지고, 임의로 ROCK 억제제 (예를 들어, -2일째에 약 0.25-5 μM, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 3, 4 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 H1152 포함) 및/또는 블레비스타틴 (예를 들어, 약 0.1-20 μM, 보다 바람직하게는 약 1.25-5 μM 또는 약 2.5 μM의 농도)를 첨가하는 배지 중에서, 예를 들어, 분화 배지 중에서 항온배양 전에 (즉, 0일, -1일 및/또는 -2일) 세포를 1, 2 또는 3일 동안 항온배양시킬 수 있다.
[0020] 본원에 사용된 바와 같은 특정 성분과 관련하여 “필수적으로 부재”는 본원에서 특정 성분의 어느 것도 의도적으로 조성물에 제형화되지 않고/않거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재함을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로부터 비롯된 특정 성분의 총량은 바람직하게는 0.01%미만이다. 표준 분석 방법으로 특정 성분의 양이 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
[0021] 본원 명세서에서, 단수형 관사("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 청구항(들)에서 사용된 바와 같은, 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, 용어 “a” 또는 “an”은 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
[0022] 청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 "또 다른" 이라는 말은 적어도 두번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
[0023] 본 출원 전반에 걸쳐, “약” 이라는 용어는 어떠한 값이 해당 장치, 그 값을 측정하는데 사용되는 방법에 대한 고유의 오차 변화, 또는 해당 연구 대상들 간에 존재하는 변화를 포함함을 나타내는데 사용된다.
[0024] 본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명을 보면 명백해 질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 구현예를 제시하는 구체적인 실시예는, 상기 상세한 설명으로부터 본 발명의 개념과 범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 줄 수 있음이 당업계의 숙련자에게는 명백하기 때문에, 단지 예시로서만 제공되는 것임을 알아야 한다.
[0025] 특허 또는 출원 파일은 컬러로 나타낸 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 상기 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 필요한 비용의 요구 및 지불에 의해 사무소에 의해 제공된다.
[0026] 하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제공된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 보다 잘 이해될 수 있다.
[0027] 도 1: 최종 생성물의 FOXA2 유동 세포측정.
[0028] 도 2: DA 선조체 순도 (FOXA2+/LMX1+).
[0029] 도 3: DA 뉴런 분화 잠재력 (NURR1+/S100β-).
[0030] 도 4: 뉴런 분화 잠재력 (MAP2+/네스틴-).
[0031] 도 5a-b: 전뇌 뉴런. FCDI DAPC-1 세포는 (도 5a) 항-PAX6 (Biolegend #901301) 또는 (도 5b) 항-FOXG1으로 염색시켰다. 양성 대조군으로 표시된 i세포 GABA 뉴런(FCDI)은 전뇌 표현형에 패턴화된 세포로, 주로 GABAergic이며 PAX6+ 뉴런의 서브집단과 FOXG1+ 뉴런도 포함한다.
[0032] 도 6: 잔여 iPSC에 대한 RT-QPCR.
[0033] 도 7a-c: FCDI DAPC-1은 증식하는 세포로 이루어진다. (도 7a) FCDI DAPC-1 제조 전반에 걸친 EdU 통합의 시간 경과. FCDI DAPC-1 세포의 거의 절반은 증식하고 있다. (도 7b) 해동 후 배양에서 FCDI DAPC-1의 FOXA2+ 집단에서 EdU 통합의 시간 경과. 세포가 mDA 선조체 단계에서 성숙한 DA 뉴런으로 분화함에 따라 증식이 감소한다. (도 7c)　17일째에 mDA 선조체 세포에 24시간 동안 통합된 EdU는 선조체 세포가 성숙된 후 12일이 지난 후에도 Nurr1+ 세포에 유지된다.
[0034] 도 8: 누드 래트에서 암페타민 회전. 표시된 회전은 촬영한 모든 녹화의 평균이다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타내고, n= 그룹 당 10~12마리 동물이다.
[0035] 도 9: 이식 후 6개월에 선조체 재신경화. TH 양성 세포에 대한 염색을 사용하여 재신경화를 보여준다. 이식편 내 TH+ 세포의 수에서 D17과 D24 사이에 통계학적 차이는 없었지만, D17 세포에 의한 선조체의 신경 분포는 D24 세포보다 더 양호한 것으로 관찰되었다.
[0036] 도 10: 선조체 내 이식편은 신경을 공급한다. 세포를 흑색질에 직접 주사한 경우 D17 이식편은 D24 세포에 비해 내측 전뇌 다발과 선조체에 더 양호한 신경 분포를 보여주었다.
[0037] 도 11: qPCR 선조체 마커 시간 과정. 선조체 마커는 D17과 D24 세포 간에 약간 다양하다. Lmx1, Pitx2, Nurr1, 및 Pitx3은 D24 세포에서 보다 높은 수준으로 발현되는 반면, En-1, Pax8, ETV5, 및 Glast는 D17 세포에서 보다 높은 수준으로 발현된다.
[0038] 도 12: qPCR 마커 시간 과정. 성숙한 마커의 발현도 다양하고; AQP4와 티로신 하이드록실라제 (TH)는 D17 세포에 비해 D24 세포에서 보다 높은 수준으로 발현된다.
[0039] 도 13: D17과 D24 배양의 면역세포화학(ICC) 비교.
[0040] 도 14: 유전자 발현의 바이올린 플롯.
[0041] 도 15: 대안적 세포 유형을 사용한 암페타민 회전. 표시된 회전은 촬영한 모든 녹화의 평균이다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타내고, n= 4-10마리 동물이다.
[0042] 도 16a-c: 세포 집단 퍼센트. 퍼센트 hNuc는 hNuc+ 세포의 수를 주사된 세포 450,000개로 나누어 계산하고, TH 및 Ki67은 동일한 이식편에서 생착된 hNuc의 퍼센트이다. 결과는 hNuc (도 16a), TH (도 16b), 및 Ki67 (도 16c)에 대해 나타낸다. 래트 기원의 조직 슬라이스로부터의 데이터를 나타낸다. 각 집단의 퍼센트는 각 그래프의 표제에 나열된다(총 인풋으로부터 hNuc, 계산된 총 hNuc로부터 TH, 계산된 총 hNuc로부터 Ki67).
[0043] 도 17a-c: hNuc, TH, 및 Ki67에 대한 입체학 분석. 모든 12번째 섹션(1/2 시리즈)을 h핵(hNuclei), TH 또는 hKi67로 염색하고 편견 없는 입체학으로 정량화하였다. 각 동물에 대해 이식편 영역의 윤곽을 나타내고 계수하였다. 각각의 그래프는 특유의 Y-축을 갖는다. 도 17a, 각 시험 그룹에서 각 동물로부터의 hNuc 양성 세포 수, 평균 및 표준 오차(SEM)가 나타낸다. 도 17B,, 평균 및 SEM을 포함한, 각 그룹에서 각 동물로부터의 TH 양성 세포 수를 나타낸다. 도 17C, 평균 및 SEM을 포함한, 각 그룹에서 각 동물로부터의 Ki67 양성 세포 수를 나타낸다.
[0044] 도 18a-c: 패널 1(상부)은 1.50uM CHIR(도 18a), 1.75uM CHIR(도 18b), 2.00uM CHIR(도 18c)로 만든 세포에서 유동 세포측정에 의한 FoxA2 발현을 보여준다.　　패널 2(하부)는 유동 세포측정에 의한 FoxA2(y-축)/Lmx(x-축) 발현을 보여준다.
[0045] 도 19: 다양한 분화 일수 후에 생성된 세포의 유전자 발현을 qPCR을 사용하여 측정한다.
[0046] 도 20a-j: 생체 내 D17 선조체의 기능, 생존율 및 신경 분포에 대한 특징화 및 분석. 수술 전과 생착 후 2, 4, 6개월 시점에 측정한 d-암페타민 유도 회전의 시간 기반 분석(도 20a). (도 20b) 낮은 용량, 중간 용량, 높은 용량 또는 최대 가능한 용량의 이식편에 포함된 h핵-ir 세포의 입체학적 추정치. (도 20c) TH-ir 세포의 입체학적 추정치 및 (도 20d) 각 그룹에 대한 입체학적 추정치의 정량화. (E) hGFAP(스케일 막대 200 * m) 및 (F) 5-HT(스케일 막대 1mm(인셋 25 * m))로 염색된 이식편 섹션의 대표적인 이미지. DAB 가공된 (도 20g) h핵 및 (도 20h) TH 또는 면역형광 삼중 표지된 (도 20I) h핵/TH/FoxA2(녹색/적색/청색) 및 (도 20j) TH/Girk2/칼빈딘(녹색/적색/청색)의 낮은, 중간, 높고, 최대 가능 용량의 이식편을 포함하는 대표적인 이미지. 스케일 막대 = 500 * m.
[0047] 도 21a-b: 시험관내 분화 및 유전자 발현. (도 21a) 분화 및 이식의 개략적 도식. MMC = 미토마이신 c. (도 21b) 표적 및 비표적 지역, 세포 유형 및 신경 성숙 마커의 iPSC-mDA 분화 17일, 24일 및 37일째에 mRNA 발현을 비교하는 qPCR. 각 프로세스 시점에 대해 3개의 생물학적 복제물을 기술적으로 3회 분석하였다. 평균 Ct 값은 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)(ΔCt)에 대한 상대적인 값으로 나타낸다. 오차 막대는 SEM이다. 표 7에 나타낸 유의성.
[0048] 도 22a-b 시험관내 단백질 발현. (도 22a) mDA 표적 마커의 iPSC-mDA 분화 17일, 24일 및 37일째에 면역 반응 집단을 비교하는 유동 세포측정. FOXA2+, FOXA2+/LMX1+, NURR1+, MAP2+ 및 FOXA2+/TH+에 대해 나타낸 생존 세포의 양성 세포 집단의 정량화. 3개의 생물학적 복제물은 각각의 시점에 대해 분석하였다 (평균 ± SEM). (도 22b) mDA 표적 및 비표적 마커의 iPSC-mDA 분화 17일, 24일 및 37일째에 면역 반응 집단을 비교하는 면역세포화학측정. 이미지는 각 시점에 대해 분석된 3개의 생물학적 복제물을 대표한다.
[0049] 도 23a-e: 이식편 생존율 및 기능. 수술 전과 생착 후 2, 4, 6개월 시점에 측정한 d-암페타민 유도 회전의 시간 기반 분석(도 23a). 이식 후 4개월 시점에서 D17의 경우 P <0.0005, G418의 경우 P <0.005; 이식 후 6개월 시점에서 D17 및 D24의 경우 P <0.0005, 및 G418의 경우 P <0.05였다. 데이터는 터키(Tukey) 조정과 함께 혼합 ANOVA에 의해 분석하였고; 오차 막대는 SEM이었다. 비히클 그룹에 대해 비교하였다. (도 23b) h핵 및 (도 23c) hKi-67에 염색된 대표적인 이식편 절편이고, 이식편 경계는 검은색 윤곽선으로 나타낸다. (도 23d) h핵-ir (P < 0.0001 D17 대 D37/G418; 각각 D24 대 D37/G418의 경우 P < 0.0005 및 P < 0.005) 및 (도 23e) hKi-67-ir 세포(D17 대 D37의 경우 P < 0.05; D17 대 G418의 경우 P < 0.01; D24 대 D37의 경우 P < 0.05)의 비편견 입체학에 의한 정량화. 스케일 막대 = (도 23b)에서 500 μM; (도 23c, 인셋) 50 μM. h핵 추정치는 터키 조정이 적용된 일원 ANOVA로 분석하였고; 오차 막대는 SD를 나타낸다. hKi-67 추정치는 크러스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 시험과 드와스-스틸-크리치로우-플리너(Dwass-Steele-Critchlow-Fligner) 사후 분석으로 분석하였다.
[0050] 도 24a-d: 생체내 도파민성 표현형의 가시화. DAB 가공된 TH(도 24a)에 대해 염색된 대표적인 이식편 함유 절편. 생체 내 6개월 후 이식편에 포함된 (도 24b) TH-ir 세포의 정량화(D17 대 D37/G418의 경우 각각 P <0.0001 및 P <0.005; D24 대 D37/G418의 경우 각각 P <0.0005 및 P <0.01). (도 24c) 이식편 유래된 Th-ir 핑거의 광학 밀도. 유의적인 P-값은 D17 대 D24, D37, 및 G418 (P　< .0005,　P　< .0001,　P　< .05); D24 vs D37 (P　< .001); 및 G418 대 D37 (P　< .0005)에 대해 계산하였다. (도 24d) TH/FOXA2/h핵 (녹색/적색/청색)에 대해 면역형광성으로 3중 표지됨. 스케일 막대 (A) = 500 μM; (D) = 20 μM.
[0051] 도 25: 흑색질에 이식된 이식 세포의 긴 범위의 신경 분포. 전뇌에서 흑색질 내 이식 부위까지 이어지는 관상 절편에서 hNCAM 면역 반응의 대표적인 컴퓨터 반전 현미경 사진. DAB 가공된 이미지는 신경 분포 정도를 보여주기 위해 반전 및 조정되었고; 모든 개선 사항은 각 샘플에 동일한 방식으로 적용하였다. AC = 전측 교련, AON = 전후각 핵, cc = 뇌량, CPu = 미상/피각, Fr = 전두엽 피질, NAc = 측좌핵, PrL = 전변연 영역, Sept = 중격, T = 이식체, Tu = 후각 결절.
[0052] 도 26a-f: 생체 내 D17 선조체의 기능, 생존율 및 신경 분포의 정량 분석. 수술 전과 생착 후 2, 4, 6개월 시점에 측정한 d-암페타민 유도 회전의 시간 기반 분석(도 26a). 이식 후 4개월 시점에서 MFD의 경우 P <0.0001, 고용량의 경우 P <0.0005; 이식 후 6개월 시점에서, MFD 및 고용량의 경우 P <0.0001; 중간 용량의 경우 P<0.005; 및 터키 조정과 함께 혼합 ANOVA에 의한 분석. 비히클 그룹에 대해 비교하였다. (도 26b) 낮은 용량, 중간 용량, 높은 용량 또는 ‘최대 가능한’ 용량의 이식편에 포함된 h핵-ir 세포(도 26 e에 가시화된)의 입체학적 추정치. 터키 조정이 적용된 일원 ANOVA에 의한 모든 비교의 경우 P < 0.0001. 낮은 용량, 중간 용량, 높은 용량 또는 '최대 가능 용량'의 이식편에 포함된 (도 26f에 가시화된) TH-ir 세포에 대한 입체학적 추정치(도 26c). 모든 그룹에 대한 MFD의 경우 P < 0.0001; 높은 용량과 중간 및 낮은 용량 그룹의 경우 각각 P < 0.005 및 P < 0.05; 터키 조정이 적용된 일원 ANOVA에 의해 분석됨. (도 26d) 이식편 유래 TH 광학 밀도의 정량화. 터키의 조정을 사용한 일원 ANOVA는 MFD 대 중간 및 낮은 용량, 및 높은 용량 대 중간 및 낮은 용량의 경우 P <0.0001; MFD 대 높은 용량에 대해 P <0.05를 보여주었다. 조직학적 데이터 또는 행동 데이터에 대한 터키 조정이 각각 적용된 일원 또는 혼합 효과 ANOVA; 오차 막대는 각각 조직학적 데이터 또는 행동 데이터에 대한 SD 또는 SEM을 나타낸다. 낮은 용량 그룹에 대한 이미지는 이식편이 상당 부분 생존한 래트의 이미지이다. 스케일 막대 = 500 μM.
[0053] 도 27a-c: 도파민성 표현형과 행동 회복의 상관관계 및 mDA 서브타입의 가시화. (도 27a) 네트 d-암페타민 유도 회전의 변화 크기의 절대값에 대해 플롯팅하고 대수적 회귀 곡선에 맞춘 추정된 TH-ir 세포 수 및 TH 광학 밀도 측정값. 낮은/중간 또는 높은/'최대 가능한' 용량 및 행동 회복을 위한 선형 회귀. 면역 형광 3중 표지된 (도 27b) h핵/TH/FOXA2(청색/녹색/적색) 및 (도 27c) TH/GIRK2/칼빈딘(녹색/적색/청색)에 대한 낮은, 중간, 높은 및 '최대 가능한' 용량의 이식편을 포함하는 대표적 이미지.
[0054] 도 28a-e: 이식편에 관찰된 비-도파킨성 세포 유형. hKi-67로 염색된 이식편 절편의 대표적인 (도 28a) 현미경 사진 및 (도 28b) 각 그룹에 대한 입체학적 추정치. (도 28c) hGFAP(신경교세포), (도 28d), Iba1(미세아교세포), 및 (도 28e) 5-HT(세로토닌성 뉴런)로 염색된 이식편 절편의 대표적 이미지. 스케일 막대 (도 28a) = 100 μM; (도 28c) = 200 μM; (도 28d) = 500 μM; (도 28e) = 1 mm (E, 인셋) = 25 μM. 중간 대 낮은 용량의 경우 P < 0.05; Dwass, Steel, Critchlow-Fligner 방법을 사용한 Kruskal-Wallis 시험에 의한 다른 모든 비교의 경우 P <0.005.
[0055] 도 29: 시험관내 단백질 발현의 가시화. mDA 표적 및 비표적 마커의 iPSC-mDA 분화 17일, 24일 및 37일째에 면역 반응 집단을 비교하는 면역세포화학측정. 이미지는 각 시점에 대해 분석된 3개의 생물학적 복제물을 대표한다.
[0056] 도 30a-b: 단기 생착. 주사 후 3개월이 지난 온전한 래트의 양측 G418, D37, D24 또는 D17 선조체 이식편을 포함하는 관상 절편은 (도 30a) hNCAM 또는 (도 30b) TH로 염색됨.
[0057] 도 31a-i: 시험관내 단일 세포 유전자 발현. A) FoxA2, B) LMX1A, C) NURR1, D)TH, E) CALB1, F) ETV5, G) EN1, H) BARHL1 및 I) GIRK2에 대한 표적 마커의 iPSC-mDA 분화 17일, 24일, 36일에 mRNA 발현을 비교하는 단일 세포 qPCR(Fluidigm). 각 가공 시점에 대해 96개의 개별 세포를 평가하였다. 각 세포에 대한 Log2 표현 값이 그래프상에 단일 마크로 나타낸다. 오차 막대는 SEM이다.
[0058] 도 32: 잠재적으로 위험한 비표적 세포 마커 FOXG1+ 및 PAX6+ 세포에 대한 FCDI DAPC-1 유동 세포측정 분석은 전뇌 뉴런 선조체의 매우 낮은 비율을 입증한다.
[0059] 도 33: 0-19DPT로부터의 세로토닌성 세포 집단에 대한 FCDI DAPC-1 qPCR 검정.
[0060] 도 34: 14DPT에서 SERT에 대한 FCDI DAPC-1 qPCR 검정은 배치 전반에 걸쳐 일관되게 낮은 발현을 보여준다.
[0061] 도 35: 세로토닌성 마커, 5-HT에 대한 FCDI DAPC-1 ICC 검정은 SERT 및 TPH2에 대한 qPCR 결과를 지지한다. 1-, 8-, 15-, 20-DPT 시점에 대한 5-HT(적색) ICC 염색에 대한 대표적 이미지를 나타낸다.
[0062] 일부 양상에서, 본 발명은 유도 만능 줄기 세포와 같은 만능 세포를 생체 내에서 뇌 질환 치료를 위해 현저하게 개선된 성질을 나타낼 수 있는 도파민성(DA) 뉴런 전구세포로 분화시키는 조성물 및 방법을 제공함으로써 종래 기술의 한계를 극복한다. 상기 방법은 특정 양의 시간, 예를 들어, 약360-456시간, 또는 보다 바람직하게 약 384-432 시간 동안 , 단일-SMAD 조건하에 단일 SMAD 억제제 (“단일-SMAD 억제”)의 존재하에 만능 세포를 분화시킴을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이전의 이중 SMAD 방법과는 달리, 단일 SMAD 방법은 2개의 SMAD 억제제를 사용하는 이중 SMAD 방법과는 대조적으로 한 가지 SMAD 억제제만 사용함을 포함한다. NURR1을 발현하는 미성숙한 뉴런이 NURR1을 발현하지 않는 덜 성숙한 선조체 보다 더 효과적임을 결론짓는 이전 연구와는 대조적으로(Ganat et al., 2012; Qiu et al., 2017),NURR1을 발현하지 않고 NURR1을 발현하는 mDA 전구세포와 비교하여 보다 우수한 생체내 효능(예를 들어, PD의 치료를 위한)을 나타낸 중뇌 도파민성 (mDA) 전구세포(예를 들어, D17 세포)가 본원에 제공된다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 이들 특정 양의 시간 동안 분화된 중뇌 DA 뉴런 전구세포를 포함하는 세포 배양은 이러한 단일-SMAD 방법을 사용하여 다른 기간 동안 분화된 세포 배양에 비해 생체 내에서 우수한 성질을 나타내는 것이 놀랍게도 관찰되었고, 이러한 세포 배양을 사용하여 PD 래트 모델을 치료할 때 생착 및 신경 분포가 크게 개선되어 기능 회복이 증가한 것으로 관찰되었다. 관련 세포 배양 및 뇌 질환(예를 들어, PD)을 치료하는 방법도 제공된다.
[0063] 일부 양상에서, 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 분화된 mDA 세포의 세포 대체 치료요법을 투여하여 대상체에서 PD를 치료한다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, iPSC 유래 유사 분열 후 mDA 뉴런과 달리 mDA 선조체 세포는 PD와 같은 세포 이식 치료요법과 관련된 뇌 질환 치료에 우수한 결과를 제공하는 것으로 관찰되었다. 세포 성숙도가 이식체의 생존율과 효능에 대한 세포 성숙도의 효과는 면역손상된 헤미파킨슨병 래트에 mDA 선조체(분화 17일 후 동결 보존, D17), 미성숙 뉴런(D24), 유사 분열 후 뉴런(D37)을 생착시켜 조사하였다. D17 선조체는 세포 생존률, 섬유 성장, 생체 내 운동 결손에 대한 유익한 효과에서 미성숙한 D24 또는 성숙한 D37 뉴런보다 현저히 우수한 것으로 관찰되었다. 복부 중뇌에 대한 관찰된 흑색질내 생착은 D17 세포가 선조체를 포함하여 전뇌 구조에 더 먼 거리에 걸쳐 신경 분포하는 D24 세포보다 더 큰 능력을 갖고 있음을 입증하였다. D17 세포를 광범위 용량 범위(선조체당 7,500~450,000개의 주사된 세포)에 걸쳐 시험한 경우, 생존하는 뉴런의 수, 신경 분포 및 기능 회복과 관련하여 명확한 용량 반응이 관찰되었다. 중요한 것은 이들 이식편이 iPSC로부터 유래되었지만 어떤 동물에서도 기형종 형성이나 다른 세포의 유의적인 파생물이 관찰되지 않았다는 것이다. 이들 데이터는 PD의 임상 치료학적 치료를 위한 이들 iPSC 유래 D17 mDA 선조체 세포를 사용하는 것을 뒷받침한다.
I. 정의
[0064] “만능성" 또는 "만능"은 하나 이상의 조직 또는 장기를 구성하는 모든 세포, 예를 들어 3개의 배엽층: 내배엽 (예를 들어, 위내벽, 소화관, 폐), 중배엽 (예를 들어, 근육, 뼈, 혈액, 비뇨 생식기) 또는 외배엽 (예를 들어, 상피 조직 및 신경계) 중 어느 하나로 분화할 수 있는 잠재력을 갖는 줄기 세포 또는 미분화 세포를 지칭한다.
[0065] 보통 iPS 세포 또는 iPSC로 약칭하는 "유도성 만능 줄기 세포"는 비만능성 세포를 재프로그래밍 인자를 도입하거나 이것과 접촉시킴으로써 비만능성 세포, 일반적으로 성체의 체세포 또는 최종 분화된 세포, 예를 들어, 섬유아세포, 조혈 세포, 근육 세포, 뉴런, 상피 세포 등으로부터 인공적으로 제조된 만능 줄기 세포 유형을 지칭한다.
[0066] "배아 줄기 (ES) 세포"는 초기배에서 유도한 만능 줄기 세포이다.
[0067] "부착 배양"은 세포 또는 세포의 응집체를 표면에 부착시키는 배양을 가리킨다.
[0068] "부유 배양"은 세포 또는 세포의 응집체를 액체 배지 중에서 현탁된 상태로 증식시키는 배양을 지칭한다.
[0069] 외부에서 첨가된 성분이 "본질적으로 없는"이라는 말은 해당 배지가 그 안의 세포들 이외의 공급원에서 유래한 특정 성분을 전혀 포함하지 않거나 또는 본질적으로 이들을 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 외부에서 첨가된 성장 인자 또는 신호전달 억제제, 예를 들어 TGFβ, bFGF, TGFβ 상과(superfamily) 신호전달 억제제 등이 "본질적으로 없는"이라는 말은, 외부에서 첨가된 성분이 최소량 또는 검출불가능한 양으로 존재한다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, TGFβ 또는 bFGF가 본질적으로 없는 배지 또는 환경은5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001 ng/mL 미만 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 양으로 상기 TGFβ 또는 bFGF를 포함할 수 있다. 예를 들어, 신호전달 억제제가 본질적으로 없는 배지 또는 환경은 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001 μM 미만 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 양으로 상기 신호전달 억제제를 포함할 수 있다.
[0070] "분화"는 덜 전문화된 한 세포가 보다 전문화된 적어도 새로운 세포 유형의 후대 자손을 형성하는 과정이다. 예를 들어, 줄기 세포는 뉴런 전구세포로 분화할 수 있고, 뉴런 전구세포가 DA 뉴런으로 분화할 수 있다.
[0071] "응집 촉진 매질"이라는 용어는 해당 작용 기전에 어떠한 방해도 없이 세포의 응집체 형성을 촉진하는 임의의 매질을 의미한다.
[0072] "응집체", 즉 배양체라는 용어는 현탁액에서 배양시킨 분화된 세포, 부분적으로 분화된 세포 및/또는 만능 줄기 세포를 포함하는 세포의 동종성 또는 이종성 클러스터를 가리킨다.
[0073] "뉴런" 또는 "신경 세포" 또는 "신경 세포 유형" 또는 "신경 계통"은 임의의 신경 계통의 세포를 포함할 수 있으며, 달리 특정하지 않는 한, 제한없이 신경 개체발생의 임의의 단계에서의 세포를 지칭하는데 취할 수도 있다. 예를 들어, 뉴런에는 뉴런 전구세포 및/또는 성숙한 뉴런이 모두 포함될 수 있다. "신경 세포" 또는 "신경 세포 유형" 및 "신경 계통" 세포는 달리 명시되지 않는 한 제한 없이 모든 뉴런 계통 및/또는 신경 발생 단계의 모든 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 신경 세포에는 뉴런 전구세포, 신경교 전구세포, 성숙한 뉴런 및/또는 신경교세포가 포함될 수 있다.
[0074] 특정 단백질을 암호화하는 "유전자," "폴리뉴클레오타이드," "암호화 영역," "서열," "절편" 또는 "단편"은, 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓인 경우 시험관내 또는 생체내에서 전사되고 필요하다면 해독도 되어서 유전자 생성물, 예를 들어, 폴리펩타이드가 되는 핵산 분자이다. 상기 암호화 영역은 cDNA, 유전체 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA의 형태로 존재하는 경우, 핵산 분자는 단일 가닥 (즉, 센스 가닥) 또는 이중 가닥일 수 있다.
[0075] "전이유전자"라는 용어는 인공적 또는 자연적 수단, 예를 들어 외인성 핵산에 의해 세포 또는 유기체 내로 도입된 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 외인성 핵산은 상이한 유기체 또는 세포로부터 유래할 수 있거나, 또는 상기 유기체 또는 세포 내에서 자연적으로 발생하는 핵산의 하나 이상의 추가의 복제물일 수도 있다.
[0076] “프로모터"라는 용어는 본원에서 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 영역을 지칭하는 통상적인 의미로 사용되며, 여기서, 상기 조절 서열은 RNA 중합효소에 결합하여 다운스트림 (3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자이다.
[0077] 본원에 사용되는 "중뇌 DA 뉴런 전구세포", "mDA 뉴런 전구세포", "mDA 뉴런 전구세포" 및 "mDA 전구세포"는 상호 교환적으로 사용되고 FoxA2, Lmx1 및 EN1(중뇌 특이적 마커)을 발현하는 뉴런 전구세포를 지칭하지만, 해당 세포는 Nurr1을 발현하지 않는다. 중뇌 DA 뉴런 전구세포는 하기 중 하나 이상을 발현할 수 있다: GBX2, OTX2, ETV5, DBX1TPH2, TH, BARHL1, SLC6A4, GATA2, NR4A2, GAD1, DCX, NXK6-1, RBFOX3, KCNJ6, CORIN, CD44, SPRY1, FABP7, SLC17A7, OTX1, 및/또는 FGFR3. 일부 구현예에서, mDA 전구세포는 TH를 발현하고; 예를 들어, mDA 전구세포는 아직 TH를 발현하지 않을 수 있지만, 추가 분화 후에 TH를 발현하는 능력을 보유할 수 있다. mDA 전구세포는 명확한 분화 단계에 따라 선택된 유전자를 발현할 수 있다.
[0078] "신경 줄기세포(NSC)"는 제한 없이 잠재적으로 자가 재생 및 증식할 수 있는 다능성 세포로, 뉴런, 성상세포 및/또는 희돌기아교세포로 최종 분화할 수 있는 자손 세포를 생성할 수 있다. NSC의 비-줄기 세포 자손은 신경 선조체 세포로 지칭한다. "신경 선조체 세포"는 하나 초과의 세포 유형으로 증식하고 분화할 수 있는 능력을 가진 선조체 세포이다. 신경 선조체 세포는 단능성, 이능성 또는 다능성일 수 있다. 신경 선조체 세포의 명확한 특징은 줄기세포와 달리 증식 능력이 제한적이며 자가 재생이 일어나지 않는다는 점이다. "신경 전구세포"(NPC)는 신경 선조체 세포와 신경 줄기 세포를 모두 포함하여 신경 줄기 세포의 모든 미분화 자손으로 이루어진 세포의 혼합 집단을 지칭한다. 신경 전구세포라는 용어는 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 NSC와 신경 선조체 세포의 혼합 집단을 기재하는 데 사용할 수 있다.
II. 단일-SMAD 억제에 대한 SMAD 억제제
[0079] 일부 양상에서, 만능 세포는 약 360-456 시간, 보다 바람직하게는 약 384-432 시간의 기간 동안 단일-SMAD 방법을 사용하여 분화되어 신경 세포의 배양물을 생성한다. 단일-SMAD 방법에서, 단일 BMP 신호전달 억제제 또는 단일 TGF-β 신호전달 억제제와 같은 단일 SMAD 억제제는 만능 세포 (예를 들어, iPS 세포, ES 세포)를 뉴런 세포, 예를 들어, 중뇌 도파민성 세포로 전환시키는 방법에서 SMAD 신호전달을 억제하는데 사용된다. 일반적으로 다른 이중 SMAD 분화 방법과 달리 단일-SMAD 분화 방법은 단일 SMAD 억제제만 사용하고, 두 번째 SMAD 억제제는 분화 배지에 포함되지 않는다. 예를 들어, 일부 양상에서, 만능 세포는 중뇌 DA 뉴런 전구세포를 포함하는 뉴런 전구세포의 집단으로 전환되는데, 여기서 분화는 단일 BMP 신호전달 억제제를 포함하는 매질 중에서 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 BMP 억제제는 LDN-193189, 도르소모르핀 또는 DMH-1이다. BMP 신호전달의 억제제의 비제한적인 예로는, 도르소모르핀, 우성형-음성(dominant-negative) BMP, 절두된 BMP 수용체, 가용성 BMP 수용체, BMP 수용체-Fc 키메라, 노긴, LDN-193189, 폴리스타틴, 초르딘(chordin), 그렘린(gremlin), 세르베루스(cerberus)/DAN 계열의 단백질, 벤트로핀(ventropin), 고용량 액티빈, 및 암니온리스(amnionless)를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산, 안티센스, RNAi, siRNA 또는 기타 유전학적 방법이 BMP 신호전달을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서, BMP 신호전달 억제제를 간단하게 "BMP 억제제"로도 지칭할 수 있다. 상기 BMP 억제제는 분화 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16일 및/또는 17일 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위 (예를 들어, 1-17, 1-16, 1-15, 2-15일 등)의 일자에 분화 배지 중에 포함시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 BMP 억제제는 분화 1-17일의 모든 일자에 분화 배지 중에 포함된다. 하지만, 특정 시점, 예를 들어, 상기 일자 중 1, 2 또는 3일째에 분화 배지로부터 상기 BMP 억제제를 제외시키는 것도 가능할 수 있을 것으로 예상된다. 일부 구현예에서, 상기 BMP 억제제는 임의로 11-17일째에 분화 배지 중에 포함되지 않을 수도 있고, 일부 바람직한 구현예에서, 상기 BMP 억제제는 1-10일째에 분화 배지 중에 포함되지 않는다. 단일-SMAD 방법은 WO2018/035214에서 추가로 논의된다.
[0080] 일부 구현예에서, 상기 BMP 억제제는 LDN-193189, 도르소모르핀, DMH-1 또는 노긴이다. 예를 들어, 세포를 약 1-2500, 1-2000 또는 1-1,000 nM의 LDN-193189 (예를 들어, 약 10 내지 500, 50 내지 500, 50 내지 300, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250 또는 약 2500 nM의 LDN-193189 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위)를 포함하는 배지 중에서 배양할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 약 0.1 내지 10 μM의 도르소모르핀(예를 들어, 약 0.1 내지 10, 0.5 내지 7.5, 0.75 내지 5, 0.5 내지 3, 1 내지 3, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.55, 1.6, 1.65, 1.7, 1.75, 2, 2.25, 2.5, 2.75, 3 또는 약 2 μM의 도르소모르핀 또는 상기 수치에서 유래할 수 있는 임의의 범위)을 포함하는 매질 중에서 배양할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 약 1 μM의 DMH-1 (예를 들어, 약 0.2-8, 0.5-2 또는 약 1 μM의 DMH-1 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위)을 포함하는 배지 중에서 배양할 수 있다. LDN-193189, 도르소모르핀 및 DMH-1은 모노 SMAD 억제 방법에 성공적으로 사용되어 iPS 세포에서 중뇌 도파민성 뉴런 또는 mDA 전구세포를 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, BMP 억제제는 K 02288 또는 DMH2이다.
[0081] 일부 양상에서, TGFβ 억제제는 모노 SMAD 방법에서 SMAD를 억제하는데 사용되어, 만능 세포, 예를 들어, iPS 세포로부터 중뇌 도파민성 뉴런 또는 mDA 전구세포를 생성할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 분화 배지는 TGFβ 신호전달 억제제를 포함한다. TGFβ 신호전달 억제제의 비제한적인 예는 LDN-193189, SB-525334, GW788388, A-83-01, GW6604, IN-1130, Κi26894, LY2157299, LY364947 (HTS-466284), A-83-01, LY550410, LY573636, LY580276, NPC-30345, SB-431542, SB-505124, SD-093, Sml6, SM305, SX-007, Antp-Sm2A, 및 Ly2109761을 포함한다. 예를 들어, 분화 배지 중의 TGFβ 억제제는 SB431542일 수 있다. 일부 양상에서, 세포를 약 0.1 내지 100 μM의 SB431542 (예를 들어, 약 1 내지 100, 10 내지 80, 15 내지 60, 20-50 또는 약 40 μM의 SB431542)를 포함하는 배지 중에서 배양한다. 본원에서, TGFβ 수용체 억제제를 비롯한 TGFβ 신호전달 억제제를 간단히 "TGFβ 억제제"로도 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, TGFβ 억제제는 상기 분화 배지 중에 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, TGFβ 억제제 (예를 들어, SB431542)는 1-3 또는 1, 2, 3 및/또는 4일째에 모노 SMAD 억제제로서 분화 배지 중에 포함된다. 하기 실시예에 나타낸 것과 같이, 일부 구현예에서, BMP 억제제를 모노 SMAD 억제제로 사용하는데, 그 이유는 이들 화합물이 TGFβ 억제제를 사용했을 때에 비해 만능 세포의 중뇌 DA 뉴런 또는 mDA 전구세포로의 월등한 분화를 유도하는 것으로 관찰되었기 때문이다.
III. MEK 억제제 포함
[0082] 일부 양상에서, MEK 억제제를 예를 들어, 상기 BMP 억제제 또는 모노 SMAD 억제제와 조합하여 분화 배지 중에 포함시켜, 만능 세포, 예를 들어, iPS 세포로부터 중뇌 도파민성 뉴런 또는 mDA 전구세포를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 MEK 억제제는 PD0325901이다. 사용될 수 있는 MEK 억제제의 비제한적인 예는 PD0325901, 트라메티닙 (GSK1120212), 셀루메티닙 (AZD6244), 피마세르팁 (AS-703026), MEK162, 코비메티닙, PD184352, PD173074, BIX 02189, AZD8330 및 PD98059를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 약 0.1 내지 10 μM (예를 들어, 약 0.1 내지 5; 0.5 내지 3 또는 0.5 내지 1.5 μM)의 MEK 억제제, 예를 들어 PD0325901의 존재 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포를 분화 3, 4, 5 또는 3-5일째에 상기 MEK 억제제 (예를 들어, PD0325901)와 접촉시킨다.
[0083] 따라서, 특정 양상에서, 세포의 분화는 BMP 억제제; 소닉 헤지호그 (SHH) 신호전달의 활성화제; Wnt 신호전달의 활성화제, MEK 억제제 또는 상술한 것들의 조합을 포함하는 배지 중에서 만능 세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 배지는 외부에서 첨가된 FGF8b를 함유하지 않는다. 일부의 경우, TGFβ 억제제를 BMP 억제제 대신에 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 DA 특이적 마커를 사용한 세포의 정제를 포함하지 않는다. 일부 양상에서, 상기 만능 세포는 신경 세포의 정제를 위해 사용될 수 있는 신경세포 프로모터의 제어 하의 내성 유전자를 포함한다 (예를 들어, 항생제에 노출시 항생제 내성 유전자를 발현하는 신경 세포는 생존할 것인 반면, 그렇지 않은 신경 세포는 사멸할 것임).
[0084] 일부 구현예에서, 중뇌 DA 뉴런 전구세포는 만능 세포의 집단을 수득하는 단계; 상기 세포를 MEK 억제제 (예를 들어, PD0325901)를 포함하는 배지 중에서 신경 계통 세포 집단으로 분화시키는 단계로서, 상기 배지가 분화 1일째에 외부에서 첨가된 FGF8b를 함유하지 않는 단계; 및 상기 신경 계통 세포 집단의 세포들을 추가로 분화시켜 중뇌 DA 뉴런 또는 mDA 전구세포의 집적된 집단을 제공하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 1일째에 상기 분화 배지 중에 FGF8 (예를 들어, FGF8b)을 포함시키는 것이, 일부의 경우 세포의 중뇌 DA 뉴런 전구체로의 분화를 지연시키거나 방해할 수 있음을 관찰하였다. 일부 구현예에서, FGF8은 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17일 또는 상기 수치에서 유래할 수 있는 임의의 범위의 일자와 같은 분화 중 추후 일자에 분화 배지 중에 임의로 포함시킬 수 있으며, 예를 들어, 바람직하게는 만능 세포의 단일 SMAD 억제제와의 접촉은 1일째에 분화 배지 중에서 개시한다.
IV. Wnt 활성화제 또는 GSK 억제제 포함
[0085] 일부 양상에서, Wnt 활성화제 (예를 들어, GSK3 억제제)를 예를 들어, 상기 BMP 억제제 또는 모노 SMAD 억제제와 조합하여 분화 배지 중에 포함시켜, 만능 세포, 예를 들어, iPS 세포로부터 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포를 생성한다. 일부 구현예에서, 만능 세포는 중뇌 DA 뉴런 또는 mDA 전구세포를 포함하는 뉴런 세포의 집단으로 전환되는데, 여기서 분화는 적어도 Wnt 신호전달의 제1 활성화제를 포함하는 배지 중에서 일어난다.
[0086] 다양한 Wnt 활성화제 또는 GSK3 억제제를 본원 개시내용의 다양한 양상에서 사용할 수 있다. 예를 들어, Wnt 신호전달의 활성화제는 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK3) 억제제일 수 있다. GSK3 억제제의 비제한적인 예로는 NP031112, TWS119, SB216763, CHIR-98014, AZD2858, AZD1080, SB415286, LY2090314 및 CHIR99021을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능 세포를 SB415286이 아닌 단일 SMAD 억제제와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, Wnt 신호전달의 활성화제는 CHIR99021이다. 따라서, 일부 양상에서, 구현예에 따라 사용하기 위한 배양 배지는 약 0.1 내지 약 10 μM의 CHIR99021 (예를 들어, 약 0.1 내지 5, 0.5 내지 5, 0.5 내지 3, 약 1.25 초과 내지 2.25, 약 1.25, 1.5, 1.55, 1.65, 1.7, 1.75, 1.8, 1.9, 2.0 또는 약 1.75 μM의 CHIR99021 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위)을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 약 1.6-1.7 μM, 또는 약 1.65 μM의 CHIR99021을 사용한다.
[0087] 일부 바람직한 구현예에서, 상기 Wnt 활성화제 (예를 들어, GSK3 억제제)는 분화 1일째에 분화 배지 중에 임의로 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 Wnt 활성화제 또는 GSK 억제제 (예를 들어, CHR99021)를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16일 및/또는 17일 또는 상기 모든 날짜들 또는 이들을 임의로 조합한 날짜에 분화 배지 중에 포함시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 Wnt 활성화제 또는 GSK 억제제는 2-17 또는 3-17일에 분화 배지 중에 포함된다.
V. 소닉 헤지호그 활성화제
[0088] 일부 양상에서, 소닉 헤지호그 (SHH) 신호전달의 활성화제를 예를 들어, 상기 BMP 억제제 또는 모노 SMAD 억제제와 조합하여 분화 배지 중에 포함시켜, 만능 세포, 예를 들어, iPS 세포로부터 중뇌 도파민성 뉴런 또는 mDA 전구세포를 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 소닉 헤지호그 활성화제는 소닉 헤지호그 (Shh) 또는 돌연변이체 Shh이다. 상기 Shh는 예를 들어, 사람 또는 마우스 단백질일 수 있거나, 사람 또는 마우스 Shh로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 Shh는 돌연변이체 마우스 Shh 단백질, 예를 들어 마우스 C25II Shh 또는 사람 C24II Shh이다. 일부 구현예에서, 상기 분화 배지는 Shh (예를 들어, C25II Shh) 및 예를 들어, 퍼모파민과 같은 SHH의 소분자 활성화제 모두를 포함한다. 임의의 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 상기 Shh 및/또는 소닉 헤지호그의 활성화제는 신경 층판 분화를 촉진할수 있다.
[0089] 일부 구현예에서, mDA 전구세포는, 적어도 SHH 신호전달의 제1 활성화제를 포함하는 배지 중에서 만능 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 만능 세포로부터 생성된다. 예를 들어, SHH 신호전달의 활성화제는 재조합 SHH 폴리펩타이드 (또는 이의 부분) 또는 소분자 활성화제일 수 있다. 특정 양상에서, SHH의 활성화제는 Shh C25II, 퍼모파민 또는 퍼모파민 유사체 (예를 들어, 평활화 작용제, 예를 들어, SAG-1 또는 3-클로로-N-[(1r,4r)-4-(메틸아미노)사이클로헥실]-N-[3-(피리딘-4-일)벤질]벤조[b]티오펜-2-카복사미드)일 수 있다. 따라서, 특정 양상에서, 구현예에 따라 사용하기 위한 배양 배지는 약 0.1 내지 10 μM의 퍼모파민 (예를 들어, 약 0.1 내지 20, 0.5 내지 10, 0.5 내지 5 또는 약 2 μM의 퍼모파민)을 포함한다. 추가의 양상에서, 배양 배지는 약 1 내지 1,000 ng/ml의 Shh C25II (예를 들어, 약 10 내지 1,000, 10 내지 500, 50 내지 500 또는 약 100 ng/ml의 Shh C25II)를 포함한다. 일부 구현예에서, SHH 신호전달의 활성화제는 Shh C25II 및 퍼모파민을 모두 포함한다. 예를 들어, 세포는 약 0.1 내지 10 μM의 퍼모파민 및 약 1 내지 1,000 ng/ml의 Shh C25II를 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다. 상기 SHH 활성화제(들) (예를 들어, Shh C25II 및 퍼모파민)은 1, 2, 3, 4, 5, 6 및/또는 7일째에 분화 배지 중에 포함시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 SHH 활성화제를 1일째에 분화 배지로부터 제외시킨다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 상기 SHH 활성화제(들)은 1-6 또는 2-7일에 분화 배지 중에 포함시킨다.
[0090] 따라서, 특정 양상에서, 만능 세포는 B27 보충제, 1-3000 또는 1-1000 nM의 LDN-193189 (또는 0.1 내지 100 μM의 SB431542), 0.1 내지 50 μM의 퍼모파민, 1 내지 1,000 ng/ml의 Shh C25II 및 0.1 내지 10 μM의 CHIR99021을 포함하는 DMEM/F12 배지를 사용하는 부착 배양 시스템 중에서 1-6일 동안 분화 배지 중에서 배양될 수 있다. 하나의 양상에서, 상기 배지는 B27 보충제, 200 nM의 LDN-193189 (또는 10 μM의 SB431542), 2 μM의 퍼모파민, 100 ng/ml의 Shh C25II 및 1.25 μM의 CHIR99021을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 MEK 억제제를 1-2일 후에 배지 중에 포함시킨다 (예를 들어, 상기 MEK 억제제를 분화 2-4일 또는 2, 3 및/또는 4일째에 포함시킨다).
VI. 만능 줄기 세포의 공급원
[0091] 만능 줄기 세포는 뉴런 유도를 위해 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료학적 성질이 개선된(예를 들어, PD와 같은 신경 퇴행성 질환의 치료를 위해) 중뇌 DA 뉴런 전구세포를 생산하는 데 사용될 수 있는 방법 및 조성물이 본원에 기재되어 있다.
[0092] "만능 줄기 세포" 또는 "만능 세포"라는 용어는 3개의 모든 배엽층, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 세포로 될 수 있는 세포를 지칭한다. 이론상, 만능 줄기 세포는 신체의 어떤 세포로도 분화할 수는 있으나, 만능에 대한 실험적 결정은 전형적으로 만능 세포의 각 배엽층의 수개의 세포 유형으로의 분화를 기준으로 한다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래한 배아 줄기 (ES) 세포이다. 다른 구현예에서, 만능 줄기 세포는 체세포를 재프로그래밍하여 유래된 유도성 만능 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포는 체세포 핵 전달에 의해 유도된 배아 줄기 세포이다. 만능 줄기 세포는 건강한 대상체 (예를 들어, 건강한 사람) 또는 질환 (예를 들어, 신경퇴행성 질환, 파킨슨 질환 등)이 있는 대상체로부터 수득되거나 유래할 수 있다.
A. 배아 줄기 세포
[0093] 배아 줄기 (ES) 세포는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래한 만능 세포이다. ES 세포는 발달기 배아의 외부 영양외배엽층을 제거한 후, 성장하지 않는 세포의 배양보조세포(feeder) 층에서 내부 덩어리 세포를 배양함으로써 단리할 수 있다. 조건이 적절하면, 증식성인 미분화 ES 세포의 콜로니가 생성된다. 상기 콜로니를 제거하여 각 개별 세포에 해리시킨 후, 새로운 배양보조세포층 위에 재플레이팅할 수 있다. 상기 재플레이팅한 세포들을 계속 증식시켜, 미분화 ES 세포의 새로운 콜로니를 생성할 수도 있다. 이어서, 상기 새로운 콜로니들을 제거하여 해리, 다시 재플레이팅하여 성장시킬 수 있다. 이러한 미분화 ES 세포의 "계대배양(subculturing) 또는 계대하는(passaging)" 과정을 여러번 반복하여 미분화 ES 세포를 함유하는 세포주를 생성할 수 있다 (미국특허 제5,843,780호; 제6,200,806호; 제7,029,913호). "1차 세포 배양물"은 예를 들어 배반포의 내부 세포 덩어리와 같은 조직에서 직접 수득된 세포의 배양물이다. "계대배양물"은 상기 1차 세포 배양물로부터 유도된 임의의 배양물이다.
[0094] 마우스 ES 세포를 수득하기 위한 방법은 널리 공지되어 있다. 하나의 방법에서, 129개의 마우스 균주의 착상전 배반포를 마우스 항혈청으로 처리하여 영양외배엽을 제거하고, 소태아 혈청을 함유하는 배지 중에서 화학적으로 활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 배양보조세포층 위에 내부 세포 덩어리를 배양시킨다. 발달기의 미분화 ES 세포의 콜로니를 소태아 혈청의 존재 하에 마우스 배아 섬유아세포 배양보조세포층 위에 계대배양시켜 ES 세포의 집단을 생성한다. 일부 방법에서, 마우스 ES 세포는 배양보조세포층의 부재 하에 혈청 함유 배양 배지에 사이토킨 백혈병 억제인자 (LIF)를 첨가함으로서 성장시킬 수 있다 (Smith, 2000). 다른 방법에서, 마우스 ES 세포는 뼈형성 단백질 및 LIF의 존재 하에 무혈청 배지 중에서 성장시킬 수 있다 (Ying et al., 2003).
[0095] 사람 ES 세포는 이전에 기재된 방법들(Thomson et al., 1995; Thomson et al., 1998; Thomson and Marshall, 1998; Reubinoff et al, 2000.)을 사용하여 배반포로부터 수득할 수 있다. 하나의 방법에서, 5일째의 사람 배반포를 토끼 항-사람 비장 세포 항혈청에 노출시킨 다음, 1:5로 희석한 기니피그 보체(Guinea pig complement)에 노출시켜 영양외배엽 세포를 용해시킨다. 상기 용해된 영양외배엽 세포를 온전한 내부 세포 덩어리에서 제거한 후, 감마선으로 불활성화시킨 마우스 배아 섬유아세포의 배양보조세포층 위에서 소태아 혈청의 존재 하에 상기 내부 세포 덩어리를 배양한다. 9일 내지 15일 후, 내부 세포 덩어리로부터 유래된 세포 응집 덩어리를 화학적으로 해리시키거나 (즉, 트립신에 노출시키거나) 또는 기계적으로 해리시키고, 소태아 혈청과 마우스 배아 섬유아세포의 배양보조세포층을 함유하는 새로운 배지 중에서 재플레이팅할 수 있다. 추가 증식시, 미분화된 형태를 갖는 콜로니들을 마이크로 피펫을 사용하여 선택하고, 세포 덩어리들을 기계적으로 해리시킨 후, 재플레이팅한다 (미국 특허 제6,833,269호 참조). ES 유사 형태는 세포질에 대한 핵의 비율이 매우 높고 두드러진 핵소체를 갖는 작은 콜로니를 특징으로 한다. 생성된 ES 세포는 단시간의 트립신 처리에 의해, 또는 마이크로 피펫을 사용한 개별 콜로니의 선발에 의하여 통상적으로 계대배양할 수 있다. 일부 방법에서, 사람 ES 세포는 염기성 섬유아세포 성장 인자의 존재 하에 섬유아세포의 배양보조세포층 상에 ES 세포를 배양함으로써 혈청없이 성장시킬 수 있다 (Amit et al., 2000). 다른 방법으로는 사람 ES 세포는, 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자를 함유하는 "컨디셔닝된" 배지의 존재 하에 단백질 매트릭스, 예를 들어 MatrigelTM 또는 라미닌 상에서 배양함으로써 배양보조세포층 없이도 성장시킬 수 있다 (Xu et al., 2001). 상기 배지는 섬유아세포와 함께 배양하여 사전에 미리 컨디셔닝할 수 있다.
[0096] 붉은털 원숭이와 흔한 마모셋 원숭이의 ES 세포를 단리하는 방법도 널리 공지되어 있다(문헌참조: Thomson, and Marshall, 1998; Thomson et al., 1995; Thomson and Odorico, 2000).
[0097] ES 세포의 또 다른 공급원으로는 확립된 ES 세포주를 들 수 있다. 다양한 마우스 세포주 및 사람 ES 세포주들이 공지되어 있고, 이들을 성장시키고 증식시키기 위한 조건들도 확립되어 있다. 예를 들어, 상기 마우스 CGR8 세포주는 마우스 균주 129 배아의 내부 세포 덩어리에서 확립되었으며, CGR8 세포의 배양물은 LIF의 존재 하에 배양보조세포층 없이 성장시킬 수 있다. 추가의 예로서, 사람 ES 세포주 H1, H7, H9, H13 및 H14는 문헌 (참조: Thomson et al. (2000))에서 확립되었다. 또한, H9 세포주의 서브클론 H9.1 내지 H9.2도 개발되었다. 사실상 당업계에 공지된 임의의 모든 ES 세포주 또는 줄기세포주, 예를 들어, 본원에 참조로 인용되는 문헌 [Yu and Thomson, 2008]에 기재된 것들을 본원 개시내용에서 사용할 수 있을 것으로 예상된다.
[0098] ES 세포의 공급원은 배반포, 배반포의 내부 세포 덩어리를 배양하여 유래된 세포 또는 확립된 세포주의 배양물로부터 수득된 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서, "ES 세포"라는 용어는 배반포의 내부 세포 덩어리, 세포 내부 세포 덩어리를 배양하여 얻은 ES 세포, 및 ES 세포주의 배양으로 얻어진 ES 세포를 지칭할 수 있다.
B. 유도성 만능 줄기 세포
[0099] 유도성 만능 줄기 (iPS) 세포는 ES 세포의 특징을 갖지만 분화된 체세포의 재프로그래밍에 의해 수득된 세포이다. 유도성 만능 줄기 세포는 다양한 방법으로 수득되었다. 하나의 방법에서, 성인 사람의 피부 섬유아세포를 레트로바이러스 형질도입을 이용하여 전사 인자 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4로 형질감염시킨다 (Takahashi et al., 2006, 2007). 상기 형질감염된 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)로 보충된 배지 중에서 SNL 배양보조세포 (LIF를 생성하는 마우스 세포 섬유아세포 세포주) 상에 플레이팅한다. 대략 25일후, 사람 ES 세포 콜로니를 닮은 콜로니가 배양액 중에 나타난다. ES 세포 유사 콜로니들을 선별하여 bFGF의 존재 하에 이들을 배양보조세포상에서 증식시킨다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 iPS 세포는 사람 iPS 세포이다.
[00100] 상기 유도성 만능 줄기 세포는 형태학적으로 사람 ES 세포와 유사하고, 다양한 사람 ES 세포 마커를 발현한다. 또한, 사람 ES 세포의 분화를 유도하는 것으로 공지된 조건 하에 성장시키는 경우, 상기 유도성 만능 줄기 세포는 그에 따라 적절히 분화한다. 예를 들어, 상기 유도성 만능 줄기 세포는 신경세포의 구조 및 신경 마커를 갖는 세포로 분화할 수 있다. 사실상 임의의 모든 iPS 세포 또는 세포주, 예를 들어. 문헌 [참조: Yu and Thomson, 2008]에 기재된 것들을 본 발명에서 사용할 수 있을 것으로 예상된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 다양한 iPS 세포주들이 생성되어 왔으며, 이러한 확립된 세포주로부터의 iPS 세포는 본원 개시내용의 다양한 구현예에 사용될 수 있다.
[00101] 또 다른 방법으로, 사람 태아 또는 신생아 섬유아세포를 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 4개의 유전자 Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28로 형질감염시킨다(문헌참조: Yu et al., 2007). 감염 후 12-20일째에, 사람 ES 세포 형태를 갖는 콜로니들이 보이게 된다. 상기 콜로니들을 선별하여 증식시킨다. 상기 콜로니들을 구성하고 있는 유도성 만능 줄기 세포는 형태학적으로 사람 ES 세포와 유사하고, 다양한 사람 ES 세포 마커를 발현하며, 마우스에 주입 후에 신경 조직, 연골 및 장 상피를 갖는 기형종을 형성한다.
[00102] 마우스 세포로부터 유도성 만능 줄기 세포를 제조하는 방법도 공지되어 있다 (문헌참조: Takahashi and Yamanaka, 2006). iPS 세포의 유도는 일반적으로 Sox 부류의 구성원 중 적어도 하나 및 Oct 부류의 구성원 중 적어도 하나를 발현시키거나, 또는 이들에 노출하는 것이 필요하다. Sox 및 Oct는 ES 세포의 동일성을 규정하는 전사 조절 체계의 중심적인 역할을 담당하고 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, Sox는 Sox-1, Sox-2, Sox-3, Sox-15 또는 Sox-18일 수 있고; Oct는 Oct-4일 수 있다. 추가의 인자들은 Nanog, Lin28, Klf4 또는 c-Myc와 같이 재프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있고; 구체적인 재프로그래밍 인자의 세트는 Sox-2, Oct-4, Nanog 및 경우에 따라 Lin-28을 포함하는 세트; 또는 Sox-2, Oct4, Klf 및 경우에 따라 c-Myc를 포함하는 세트일 수 있다.
[00103] ES 세포와 같이 iPS 세포는 SSEA-1, SSEA-3 및 SSEA-4 [발생학 연구 하이브리도마 은행(Developmental Studies Hybridoma Bank), 메릴랜드 주 베데스다 소재의 미국 국립아동보건 및 사람 발달 연구소(National Institute of Child Health and Human Development)] 및 TRA-1-60 및 TRA-1-81(Andrews et al., 1987)에 대한 항체를 사용하여 면역조직화학법 또는 유세포분석법으로 동정 및 확인할 수 있는 특징적인 항원을 갖는다. 배아 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 8-12주령의 수컷 SCID 마우스의 뒷다리 근육에 대략 0.5-10 X 106개의 세포를 주사하여 확인할 수 있다. 각 3개의 배엽층 중 적어도 하나의 세포 유형을 나타내는 기형종이 발생한다.
[00104] iPS 세포는 상기된 바와 같이 Oct 패밀리 구성원과 Oct4 및 Sox2와 같은 Sox 패밀리 구성원을 포함하는 재프로그래밍 인자를 Klf 또는 Nanog와 함께 발현하도록 변형된 체세포를 사용하여 생성할 수 있다. 상기 체세포는 만능성으로 유도할 수 있는 임의의 체세포, 예를 들어 섬유아세포, 케라틴세포, 조혈 세포, 중간엽 세포, 간세포, 위세포 또는 β 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포도 재프로그래밍을 위한 체세포의 공급원으로 사용될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 WO 2010/141801호 참조).
[00105] 재프로그래밍 인자를 하나 이상의 벡터, 예를 들어 통합 벡터, 염색체성 비통합 RNA 바이러스 벡터 (본원에 참조로 포함되는, 미국 출원 13/054,022호 참조) 또는 에피솜 벡터, 예를 들어 EBV 성분 기반의 시스템 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 WO 2009/149233호; Yu et al., 2009 참조)에 포함되어 있는 발현 카세트로부터 발현시킬 수 있다. 추가의 양상에서, 재프로그래밍 단백질 또는 RNA (예를 들어, mRNA 또는 miRNA)를 단백질 또는 RNA 형질감염의 의해 체세포에 직접 도입할 수 있다(문헌참조: Yakubov et al., 2010).
C. 체세포 핵이식에 의해 유도된 배아 줄기 세포
[00106] 만능 줄기 세포는, 공여체의 핵을 방추체가 없는 난모세포로 이식시키는 체세포 핵이식 방법에 의해 제조할 수 있다. 핵이식에 의해 제조된 줄기 세포는 공여자 핵과 유전학적으로 동일하다. 체세포 핵 이식에 의해 유래된 배아 줄기세포를 생성하는 방법은 문헌(참조: Tachibana et al., 2013)에 제공된다. 본원에 사용되는 "ES 세포"라는 용어는 수정된 핵을 포함하는 배아에서 유래한 배아 줄기세포를 지칭하고, 핵 이식에 의해 생산된 배아 줄기세포는 "NT-ESC"로 지칭된다.
VII. 분화를 위한 배지
[00107] 본원 개시내용의 특정 양상에 따른 분화 배지는 동물 세포를 배양하는데 사용되는 배지를 이의 기본 배지로 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 BMP 억제제 또는 단일 TGF-베타 억제제만을 이용하여 만능 세포를 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포(예를 들어, D17 세포)로 분화시키는데 분화 배지를 사용한다. 예를 들어, 만능 세포의 분화 (예를 들어, 중뇌 도파민성 전구세포로의 분화)를 촉진하는데 사용되는 분화 배지는, 단일 BMP 억제제 (예를 들어, LDN-193189 또는 도르소모르핀; 예를 들어, 분화 1-17일째); 소닉 헤지호그 (SHH) 신호전달의 활성화제 (예를 들어, 퍼모파민, 사람 C25II SHH 또는 마우스 C24II SHH; 예를 들어, 1-6, 2-7 또는 1-7일째); Wnt 신호전달의 활성화제 (예를 들어, GSK 억제제, 예를 들어, CHIR99021; 예를 들어, 2-17 또는 3-17일째) 및/또는 MEK 억제제 (예를 들어, PD0325901; 예를 들어, 2-4 또는 3-5일째)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 TGFβ 억제제 (예를 들어, SB-431542; 예를 들어, 1-4일째)를 단일 BMP 억제제 대신에 사용할 수 있으나; 일부 구현예에서, 단일 BMP 억제제는, 단일 TGF-β 억제제의 사용과 비교할 때, 세포의 FOXA2+/LMX1A+ 세포로의 월등한 분화를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, FGF-8 (예를 들어, FGF-8b)은 첫째날에 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9일 또는 10일, 또는 이들의 임의의 조합일 (예를 들어, 1-8일)에 분화 배지 중에 포함시키지 않으며; 예를 들어, 일부 구현예에서, FGF-8은 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17일 또는 이들의 임의의 조합일에 분화 배지 중에 포함시킨다. 다양한 구현예에서, 상기 분화 배지는 TGFβ 및 bFGF를 함유할 수 있거나, 또는, 다르게는, 상기 분화 배지는 본질적으로 TGFβ 및 bFGF를 함유하지 않을 수도 있다.
[00108] 특정 양상에서, 구현예에 따른 분화의 방법은 다양한 배지 조건을 이용한 세포의 계대배양을 수반하는데, 예를 들어 세포들을
- 단일 BMP 억제제 (또는 TGFβ 억제제); 소닉 헤지호그 (SHH) 신호전달의 활성화제; 및 Wnt 신호전달의 활성화제를 포함하는 배지 중의 부착 배양물 중에서 배양하거나;
- 단일 BMP 억제제 (또는 TGFβ 억제제); SHH 신호전달의 활성화제; 및 Wnt 신호전달의 활성화제를 포함하는 배지 중의 현탁액 중에서 배양하여 세포 응집체를 형성하거나;
- 성숙화를 위한 B27 보충제, L-글루타민, BDNF, GDNF, TGFβ, 아스코르브산, 디부티릴 cAMP 및 DAPT (및 임의로 외부에서 추가된 레티놀 또는 레티노산을 결핍시킴)를 포함하는 신경기본 배지를 사용한 부착 배양물에서 배양한다.
[00109] 기본 배지로는 조성이 화학적으로 명백한 임의의 한정 배지, 예를 들어 이글 기본 배지 (BME), BGJb, CMRL 1066, 글래스고(Glasgow) MEM, 개량된 MEM 아연 옵션, 이스코브의 변형된 둘베코 배지 (IMDM), 배지 199, 이글 MEM, αMEM, DMEM, 햄(Ham), RPMI 1640 및 피셔 배지, 및 이들의 변이형 또는 조합을 사용할 수 있으며, 여기서 TGFβ 및 bFGF는 포함시키거나 포함시키지 않아도 된다.
[00110] 추가의 구현예에서, 상기 세포 분화 환경은 보충제, 예를 들어 B-27 보충제, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄 (ITS) 보충제, L-글루타민, NEAA (비-필수 아미노산), P/S (페니실린/스트렙토마이신), N2 보충제 (5 μg/mL의 인슐린, 100 μg/mL의 트랜스페린, 20 nM의 프로게스테론, 30 nM의 셀레늄, 100 μM의 푸트레신 [보텐슈타인(Bottenstein) 및 사토(Sato), 1979 PNAS USA 76, 514-517) 및/또는 β-머캅토에탄올 (β-ME)도 함유할 수 있다. 피브로넥틴, 라미닌, 헤파린, 헤파린 설페이트, 레티노산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 인자들을 포함시키거나 포함시키지 않을 수도 있다.
[00111] 분화 배지에 성장 인자를 첨가하거나 첨가하지 않을 수도 있다. 상기 개괄한 인자들 이외에 또는 이들 대신에, 상피 성장 인자 부류 (EGF)의 구성원, FGF2 및/또는 FGF8을 비롯한 섬유아세포 성장 인자 부류 (FGF)의 구성원, 혈소판 유래 성장 인자 부류 (PDGF)의 구성원, 형질전환 성장 인자 (TGF)/뼈 형성 단백질 (BMP)/성장 및 분화 인자 (GDF) 인자 부류 길항제와 같은 성장 인자들을 공정 중의 다양한 단계에서 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, FGF-8을 본원에 기술된 바와 같은 분화 배지 중에 포함시킨다. 분화 배지에 첨가하거나 첨가하지 않을 수도 있는 기타 인자들로는, 노치 (Notch) 수용체 부류를 통해 신호전달을 활성화 또는 비활성화할 수 있는 분자, 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 델타 유사 부류 및 지그재그 (Jagged) 부류의 단백질 및 감마 세크레타아제 억제제, 및 노치의 처리 또는 절단에 대한 기타 억제제, 예를 들어 DAPT를 포함한다. 기타 성장 인자로는 인슐린 유사 성장 인자 부류 (IGF), 윙리스(wingless) 관련 (WNT) 인자 부류, 및 헤지호그 인자 부류의 구성원들을 포함할 수 있다.
[00112] 신경 줄기 세포/전구세포의 증식과 생존, 및 신경세포의 생존과 분화를 촉진시키기 위해, 응집체 형성 및/또는 분화 배지 중에 추가의 인자들을 첨가할 수 있다. 이러한 신경영양 인자들로는, 이에 제한되지는 않지만, 신경 성장 인자 (NGF), 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 신경성장인자-3 (NT-3), 신경성장인자-4/5 (NT-4/5), 인터류킨-6 (IL-6), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 백혈병 억제 인자 (LIF), 카디오트로핀, 상기 형질전환 성장 인자 (TGF)/뼈 형성 단백질 (BMP)/성장 및 분화 인자 (GDF) 부류의 구성원, 교세포 유래 신경영양 인자 (GDNF) 부류, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, 뉴투린, 뉴블라스틴/아르테민 및 페르세핀, 및 간세포 성장 인자를 비롯한 인자들과 이와 관련된 인자를 포함한다. 최종 분화되어 유사분열 후의 신경세포를 형성하는 신경 배양물도 유사분열 억제제 또는 유사분열 억제제의 혼합물을 포함할 수 있는데, 그러한 분열 억제제로는 이에 한정되지는 않지만, 5-플루오로 2'-데옥시우리딘, 미토마이신 C 및/또는 사이토신 β-D-아라비노-후라노사이드 (Ara-C)를 포함할 수 있다.
[00113] 배지는 혈청을 함유하거나 무혈청 배지일 수 있다. 상기 무혈청 배지는 처리되지 않거나 정제되지 않은 혈청이 포함되지 않은 배지를 가리킬 수 있고, 이에 따라 정제된 혈액 유래 성분들 또는 동물 조직에서 유래하는 성분들 (예를 들어, 성장 인자)을 갖는 배지를 포함할 수 있다. 이종성인 동물 유래의 성분에 의한 오염을 방지한다는 측면에서, 혈청은 줄기 세포(들)의 것과 동일한 동물로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 배지는 한정된 배지이고, 상기 배지는 혈청 또는 다른 동물의 조직에서 유래한 성분을 함유하지 않는다 (예를 들어, 방사능을 조사한 마우스 섬유아세포 또는 배지는 방사능을 조사한 섬유아세포 배양보조세포로 컨디셔닝시킴).
[00114] 배지는 혈청에 대한 임의의 대체물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대체물로는 알부민 (예를 들어, 지질이 풍부한 알부민, 알부민 대체물, 예를 들어 재조합 알부민, 식물성 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해산물), 트랜스페린 (또는 다른 철 운반체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 또는 이의 균등물을 적절하게 함유하는 물질을 포함할 수 있다. 혈청에 대한 대체물은, 예를 들어 국제특허공보 WO 98/30679호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 다르게는, 보다 편리하게 임의의 시판중인 물질을 사용할 수 있다. 상기 시판중인 물질로는 녹아웃 혈청 대체물 (KSR) 및 화학적으로 한정된 지질 농축물 (Gibco)을 포함한다.
[00115] 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어 비필수 아미노산), 비타민(들), 성장 인자, 사이토킨, 항산화 물질, 2-머캅토에탄올, 피루브산, 완충제 및 무기 염을 포함할 수도 있다. 2-머캅토에탄올의 농도는, 예를 들어, 약 0.05 내지 1.0 mM, 특히 약 0.1 내지 0.5 또는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 0.8, 1, 1.5, 2, 2.5, 5, 7.5, 10 mM 또는 상기 임의의 중간 농도값일 수 있지만, 상기 농도는, 줄기 세포(들)을 배양하는데 적절하기만 하다면, 특별히 제한을 두지 않는다.
[00116] 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포를 응집체가 형성되기 전에 배지 중에서 배양하여 신경 유도 및 층판 패터닝을 향상시킨다 (예를 들어, 응집체 형성을 유도하기 위해 하나의 세포 또는 작은 응집체로 해리되기 전에). 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 줄기 세포는 배양보조세포, 배양보조세포 추출물 및/또는 혈청의 부재 하에 배양할 수 있다.
B. 배양 조건
[00117] 세포를 배양하는데 사용되는 배양 용기는, 줄기 세포를 배양할 수 있는 것이라면 특별히 제한을 두지는 않지만, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 접시, 페트리 접시, 조직 배양용 접시, 멀티 접시, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CellSTACK® 챔버, 배양백 및 회전병을 포함할 수 있다. 세포는 배양의 필요에 따라 적어도 또는 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 800, 1000, 1500 mL 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 용적 중에서 배양될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 배양 용기는 생물학적으로 활성인 환경을 지원하는 임의의 장치 또는 시스템으로 지칭할 수 있는 생물반응기일 수 있다. 상기 생물반응기는 적어도 또는 약 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 리터, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 입방 미터 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 용적을 가질 수 있다.
[00118] 상기 배양 용기 표면은 용도에 따라 세포 접착제를 사용하거나 사용하지 않고 제조할 수 있다. 상기 세포 부착성 배양 용기는, 용기 표면의 세포에 대한 부착성을 향상시키기 위해 세포 부착을 위한 임의의 기질, 예를 들어 세포외 기질 (ECM)로 코팅할 수 있다. 세포 부착에 사용되는 기질은 (사용되는 경우) 줄기 세포 또는 배양보조세포를 부착시키기 위한 임의의 물질일 수 있다. 세포를 부착시키기 위한 기질의 비제한적인 예로는 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 폴리-L-오르니틴, 라미닌, 비트로넥틴 및 피브로넥틴, 및 이들의 혼합물, 예를 들어, 엥겔브레스-홀름-스왐(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포 (예를 들어 MatrigelTM 또는 Geltrex)의 단백질 혼합물 및 용해된 세포막 제제 (Klimanskaya et al., 2005)를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 부착 배양 용기는 캐드헤린 단백질, 예를 들어, 상피 캐드헤린 (E-캐드헤린)으로 코팅시킨다.
[00119] 다른 배양 조건들은 적절하게 정의될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 약 30 내지 40°C, 예를 들어, 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39°C일 수 있지만, 특별히 이들에 제한되지 않는다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어, 약 2 내지 7% 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다. 산소 분압은 적어도 또는 약 1, 5, 8, 10, 20% 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.
[00120] 특정 양상에서, 부착 배양을 사용할 수 있다. 경우에 따라, 세포를 배양보조세포의 존재 하에 배양할 수 있다. 배양보조세포가 사용된 경우에, 태아 섬유아세포와 같은 기질 세포는 배양보조세포로서 사용될 수 있다(예를 들어, 하기를 참조한다; Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual (1994); Gene Targeting, A Practical Approach (1993); Martin (1981); Evans et al. (1981); Jainchill et al., (1969); Nakano et al., (1996); Kodama et al. (1982); 및 국제특허공보 01/088100호 및 2005/080554호). 일부 구현예에서, 배양보조 세포는 세포 배양 배지에 포함되지 않으며, 세포는 한정된 조건을 사용하여 배양될 수 있다.
[00121] 다른 양상에서, 현탁 배양을 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 현탁 배양은 담체(문헌참조: Fernandes et al., 2007) 또는 겔/생중합체 캡슐화(미국 특허 공개 공보 2007/0116680호)를 포함한다. 줄기 세포의 현탁 배양은 일반적으로 배양 용기 또는 배지 중의 배양보조세포 (사용하는 경우)에 대하여 비부착 조건 하에 세포(예를 들어, 줄기 세포)의 배양을 포함한다. 줄기 세포의 현탁 배양은 일반적으로 줄기 세포의 해리 배양 및 줄기 세포의 응집 현탁 배양을 포함한다. 줄기 세포의 해리 배양은 현탁된 줄기 세포, 예를 들어, 단일 줄기 세포 또는 다수의 줄기 세포(예를 들어, 약 2 내지 400 개의 세포)로 구성되어 있는 소세포 응집체의 배양을 포함한다. 해리 배양을 계속하는 경우, 상기 배양된 해리된 세포들은 정상적으로 줄기 세포의 더 큰 응집체를 형성한 후, 응집 현탁 배양물을 생성하거나 사용할 수 있다. 상기 응집물 현탁 배양 방법은 배아 배양 방법 (Keller et al., 1995 참조) 및 SFEB (무혈청 분리 배아체) 방법 (Watanabe et al., 2005; 국제특허공보 2005/123902호)을 포함한다.
C. 만능 줄기 세포의 배양
[00122] 만능 줄기 세포, 예를 들어 ES 세포를 제조하고 배양하는 방법은 세포 생물학, 조직 배양, 및 예를 들어 기형암종 및 배아 줄기 세포를 포함하는 발생학의 표준 교본과 총설에서 찾아볼 수 있다: [Guide to Techniques in Mouse Development (1993)]; [Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (1993)]; [Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (1998)], 상기 모두 본원에 참조로 포함됨. 조직 배양에 사용되는 표준 방법들은 일반적으로 [Animal Cell Culture (1987)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology (1987 & 1995)]에 기술되어 있다.
[00123] 체세포를 재프로그래밍 인자들에 도입하거나 이들과 접촉시킨 후, 상기 세포들을 만능성 및 미분화 상태를 유지하기에 충분한 배지 중에서 배양할 수 있다. 유도성 만능 줄기 (iPS) 세포의 배양은, 예를 들어 미국 특허 공개 공보 2007/0238170호, 미국 특허 공개 공보 2003/0211603호 및 미국 특허 공개 공보 2008/0171385호 (이들은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 영장류 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포를 배양하기 위해 개발된 다양한 배지와 기법들을 사용할 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이 만능 줄기 세포의 배양 및 유지를 위한 추가의 방법이 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
[00124] 특정 구현예에서, 비한정 조건이 사용될 수 있는데; 예를 들어, 만능 세포는 섬유아세포 배양보조 세포 또는 줄기 세포를 미분화 상태로 유지하기 위해 섬유아세포 배양보조 세포에 노출된 배지 상에서 배양될 수 있다. 다르게는, 만능 세포를 한정된, 배양보조세포 독립적인 배양 시스템, 예를 들어 TeSR 배지 (Ludwig et al., 2006a; Ludwig et al., 2006b) 또는 E8 배지 (Chen et al., 2011; PCT/US2011/046796호)를 사용해 본질적으로 미분화된 상태로 배양 및 유지할 수 있다. 배양보조세포 독립적인 배양 시스템 및 배지를 사용하여 만능 세포를 배양 및 유지할 수 있다. 이러한 접근법으로 마우스 섬유아세포의 "배양보조세포층"을 사용하지 않고도 사람 만능 줄기 세포를 본질적으로 미분화된 상태로 유지할 수 있다.
[00125] 사람 만능 줄기 세포를 배양, 유지 또는 분화시키는데 다양한 매트릭스 성분들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Ludwig et al. (2006a; 2006b)]에 기재된 바와 같이, 만능 세포 성장을 위한 고체 지지체를 제공하는 수단으로서 배양 표면을 코팅하는데 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌 및 비트로넥틴을 조합하여 사용할 수 있다.
[00126] MatrigelTM도 사람 만능 줄기 세포의 세포 배양 및 유지를 위한 기질을 제공하는데 사용될 수 있다. MatrigelTM은 마우스 종양 세포에 의해 분비되는 젤라틴성 단백질 혼합물로서, BD 바이오사이언시즈(Biosciences) (미국 뉴저지주 소재)에서 시판된다. 상기 혼합물은 여러 조직에서 볼 수 있는 복잡한 세포외 환경을 모방하고 있으며, 세포 배양 기질로 세포 생물학자들에 의해 사용되고 있다. 일부 구현예에서, E-캐드헤린(예를 들어, 재조합 E-캐드헤린 기층)은 사람 만능 세포 또는 사람 iPS 세포와 같은 만능 세포의 배양 및 유지를 위한 기질로서 제공된다. 관련 방법은 예를 들어, 문헌(참조: Nagaoka et al. (2010))에 제공된다.
D. 단일 세포 계대배양
[00127] 만능 줄기 세포 배양의 일부 구현예에서, 일단 배양 용기가 가득 차게 되면, 임의의 적합한 분리 방법에 의해 콜로니를 응집된 세포 또는 심지어 단일 세포까지 나눈 후, 세포들을 계대배양을 위한 새로운 배양 용기로 옮긴다. 세포 계대배양 또는 분할은 세포가 배양 조건에서 장기간 동안 생존 및 성장할 수 있게 하는 기법이다. 세포는 일반적으로 약 70%-100% 전면생장(confluent)시 계대배양한다.
[00128] 만능 줄기 세포의 단일 세포 분리 후 단일 세포 계대배양을 본 발명에 사용하면, 분화를 위한 세포 증식, 세포의 선별 및 확립된 분주과정을 촉진하고, 배양 절차의 기계화 및 클론의 증식을 가능하게 할 수 있는 것과 같은 여러 가지 이점이 있다. 예를 들어, 하나의 세포로부터 클론에 의해 유도된 후대 자손 세포는 유전자 구조가 상동성이 있고/있거나 세포 주기가 일치할 수 있어, 이로써 목적한 분화율을 증가시킬 수 있다. 단일 세포 계대배양을 위한 예시적인 방법은 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 공개 공보 제2008/0171385호에 기재되어 있다.
[00129] 특정 구현예에서, 만능 줄기 세포를 개별 단일 세포 또는 개별 단일 세포와 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 세포 또는 그 이상을 포함하는 작은 세포 클러스터의 조합으로 분리시킬 수 있다. 상기 해리는 기계적인 힘에 의해, 또는 세포 해리제, 예를 들어, 킬레이트제, 시트르산나트륨(NaCitrate), 효소, 예를 들면, 트립신, 트립신-EDTA, 아큐타제(Accutase), TrypLE 셀렉트(Select) 등에 의해 성취될 수 있다. 세포의 해리는 화학적 분리 (예를 들어, 킬레이트제 또는 효소를 사용) 및/또는 기계적 교반을 이용하여 달성할 수 있다.
[00130] 만능 줄기 세포의 공급원 및 증식의 필요에 따라, 분리된 세포들을, 개별적으로 또는 작은 클러스터로서, 적어도 또는 약 1:2, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20, 1:40, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위와 같은 분할 비율로 새로운 배양 용기에 옮길 수 있다. 부유 배양 세포주의 분할 비율은 배양 세포 현탁액의 용적에 따라 결정할 수 있다. 계대배양 간격은 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일마다 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다. 예를 들어, 서로 다른 효소적 계대배양 프로토콜에서 달성가능한 분할 비율은 3-7일마다 1:2의 비율, 4-7일마다 1:3의 비율, 약 7일마다 1:5 내지 1:10의 비율, 7일마다 1:50 내지 1:100의 비율일 수 있다. 분할 비율이 높은 경우에는 계대배양 간격을 적어도 12-14 일, 또는 과도한 자발적 분화 또는 세포 사멸로 인한 세포 손실이 일어나지 않는 임의의 기간으로 연장할 수 있다.
[00131] 특정 양상에서, 단일 세포 계대배양은 클로닝 효능과 세포의 생존율을 증가시키기에 효과적인 소분자, 예를 들어, ROCK 억제제 또는 미오신 II 억제제의 존재 하에서 수행할 수 있다. 상기 ROCK 억제제 또는 미오신 II 억제제, 예를 들어, Y-27632, HA-1077, H-1152 또는 블레비스타틴은, 예를 들어, 적어도 또는 약 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 내지 약 100 μM 또는 상기 수치에서 유래할 수 있는 임의의 범위의 유효 농도로 사용할 수 있다.
E. 줄기 세포의 분화
[00132] 치료학적 성질이 개선된 (예를 들어, 파킨슨 질환 등을 치료하기 위해)mDA 전구세포를 생성하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 만능 줄기 세포의 분화는, 부착된 콜로니 중에서, 또는 예를 들어, 저부착성 환경에서 세포 응집체의 형성[상기 응집체를 배양체(EB)라 칭함]에 의해서와 같이 다양한 방식으로 유도할 수 있다. EB 내에서의 분자 및 세포 형태형성 신호 및 사건들은 발달중인 배아에 있어서 이러한 세포들의 자연적 개체발생의 여러가지 양상들을 모방하고 있다. 세포를 신경세포 분화로 유도하는 방법은, 예를 들어, 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 공개 공보 2012/0276063호에 제공된다. DA 신경세포 분화를 위한 보다 상세하고 구체적인 프로토콜은 본원에 참조로 포함되는 PCT 공보 WO2013/067362호에 제시되어 있다.
[00133] 배아체 (EB)는 만능 줄기 세포, 예를 들어, ES 세포 또는 iPS 세포로부터 유래된 세포의 응집체이며, 마우스 배아 줄기 세포와 함께 수년간 연구되어 왔다. 생체내 분화에 관련된 신호의 일부를 재현하기 위해, 중간 단계로 3차원 응집체 (즉, 배아체)를 생성할 수 있다. 세포 응집이 개시되면, 분화가 개시될 수 있고, 세포는 제한된 정도로 배아 발생을 재개할 수 있다. 이들은 (태반을 포함하는) 영양외배엽 조직을 형성할 수는 없지만, 생물체 내에 존재하는 사실상 모든 다른 형태의 세포가 발생할 수 있다. 신경 분화는 응집체 형성 후 촉진될 수 있다.
[00134] 세포 응집은 비조직 배양으로 처리된 플레이트 또는 스피너 플라스크에 플레이팅하는 현적(hanging drop)에 의해 실시할 수 있는데, 어떤 방법을 사용하던 간에 세포가 표면에 부착하여 통상적인 콜로니를 형성하는 것을 방지한다. 만능 줄기 세포를 배양하기 위해 응집 형성 전, 응집 형성 동안 또는 응집 형성 후에 ROCK 억제제 또는 미오신 II 억제제를 사용할 수 있다.
[00135] 세포 배양 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 응집 촉진 배지 중에 만능 줄기 세포를 분주할 수 있다. 예를 들어, 만능 줄기 세포를 단일 콜로니 또는 클론 그룹으로 응집 촉진 배지 중에 분주할 수 있으며, 만능 줄기 세포를 본질적으로 개별 세포로 분주할 수도 있다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포를 당업계에 공지된 기계적 또는 효소적 방법을 사용하여 본질적으로 개별 세포들로 해리시킬 수 있다. 비제한적인 예로서, 만능 줄기 세포를 세포와 배양 표면 간 및 세포들 간의 연결을 끊는 단백질분해 효소에 노출시킬 수 있다. 응집 형성 및 분화를 위한, 만능 줄기 세포를 개별적으로 분리하는데 사용될 수 있는 효소로는, 이에 제한되지는 않지만, TrypLE와 같은 다양한 시판 제제의 트립신, 또는 아큐타제®와 같은 효소들의 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 배양 표면에 배양물을 형성하기 위해 만능 세포를 본질적으로 개별 (또는 분산된) 세포로 배지에 첨가 또는 분주할 수 있다.
[00136] 예를 들어, 분산된 만능 세포를 배양 배지 중에 분주할 수 있다. 이러한 구현예에서, 배양 표면은 본질적으로 당업계의 표준 무균 세포 배양법에 적합한 임의의 물질, 예를 들어, 비부착성 표면으로 이루어질 수 있다. 배양 표면은 본원에 기술된 바와 같은 매트릭스 성분을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 매트릭스 성분은 배양 표면을 세포 및 배지와 접촉시키기 전에 상기 배양 표면에 도포할 수 있다.
[00137] 분화를 유도하는데 사용될 수 있는 기질로는 예를 들어 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, Matrigel 등을 들 수 있다. 또한, 세포를 증식 유도성 성장 인자의 존재 하에 현탁액 중에 방치하여 증식을 재개시키지 않으면서 (즉, 신경구를 해리시키지 않으면서) 분화를 유도할 수도 있다.
[00138] 일부 구현예에서, 세포를 배양 배지 중의 고정된 기질 위에서 배양한다. 이후, 증식 유도성 성장 인자를 상기 세포에 투여할 있다. 상기 증식 유도성 성장 인자는 세포를 기질 (예를 들어, 폴리오르니틴으로 처리된 플라스틱 또는 유리)에 부착시키고, 편평하게 하여, 서로 다른 세포 형태로 분화되도록 할 수 있다.
V. 비정치(Non-static) 배양
[00139] 특정 양태에서, 만능 줄기 세포의 배양 및 분화를 위해 비정치 배양을 이용할 수 있다. 비정치 배양은 예를 들어, 진탕식, 회전식 또는 교반식 플랫폼 또는 배양 용기, 특히 대용량 회전식 생물반응기를 사용함으로써 세포의 운동 속도를 일정하게 제어하는 임의의 배양일 수 있다. 일부 구현예에서, 락커 테이블(rocker table)을 사용할 수 있다. 교반은 영양분 및 세포 노폐물 순환을 개선시킬 수 있고, 보다 균일한 환경을 제공함으로써 세포의 응집을 제어하기 위해서도 사용된다. 예를 들어, 회전 속도는 적어도 또는 최대 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 rpm 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위로 설정할 수 있다. 만능 줄기 세포, 세포 응집체, 분화된 줄기 세포 또는 여기서 유래된 후대 자손 세포의 비정치 배양에서의 배양 기간은 적어도 또는 약 4시간, 8시간, 16시간, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6일 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7주 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.
VI. 세포의 유전학적 변경 및 정제
[00140] 일부 구현예에서, mDA 전구세포와 같이 본원에 제공된 세포는 유전학적으로 변경될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 임의의 적절한 인위적 조작 방법에 의해 세포 내로 도입시킨 경우, 또는 해당 세포가 상기 폴리뉴클레오타이드를 물려받은 당초 변형된 세포의 후대 자손인 경우의 세포를 "유전자 변형되거나" 또는 "유전자 이식되었다"라고 한다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어, MAP2 프로모터와 같은 신경세포 프로모터의 제어 하에 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 마커 유전자는 항생제 내성 유전자이고, 세포 배양물을 항생제에 노출시키기 때문에, 뉴런 세포로 분화되지 않은 세포를 사멸시킴으로써 뉴런 세포를 정제할 수 있다. 예를 들어, MAP2 프로모터의 제어 하에 네오마이신 유전자를 발현하는 세포를 G418에 노출시켜 비뉴런를 사멸시킬 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 추가의 방법은 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 14/664,245호(해당 특허에 대한 권리에 대한 포기 없이 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.
[00141] 일부 구현예에서, 해당 세포를 유사분열 억제제 또는 화학요법제에 노출시켜 분열하는 세포를 사멸시킴으로써 도파민성 뉴런을 포함하는 세포의 집단을 정제할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 방법으로 생성된 미성숙한 중뇌 DA뉴런(예를 들어, D27-D31 세포)을 포함하는 세포의 집단은, 예를 들어, 해당 세포를 미토마이신 C에 접촉시켜 분열하는 세포를 사멸시킴으로써 정제할 수 있다.
VII. 도파민성 뉴런 및 도파민성 뉴런 전구체의 사용
[00142] 본원에서 제공하는 mDA 전구세포(예를 들어, D17 세포)는 다양한 응용 분야에 사용할 수 있다. 이들 방법은 이에 제한되지 않지만 다음을 포함한다: 생체내 세포의 이식 또는 주입; 세포 독성 화합물, 발암물질, 돌연변이원 성장/조절 인자, 약제학적 화합물 등의 시험관내 스크리닝; 신경퇴행 기전에 대한 해명; 약물 및/또는 성장 인자가 작용하는 기전에 대한 연구; 유전자 치료요법; 및 생물학적 활성 생성물의 제조.
A. 시험 화합물 스크리닝
[00143] 본원에 제공된 중뇌 DA 전구체(예를 들어, D17 세포)를 사용하여 본원에 제공된 DA 뉴런 또는 DA 전구세포의 특징에 영향을 주는 인자 (예를 들어, 용매, 소분자 약물, 펩타이드, 및 폴리뉴클레오타이드) 또는 환경 조건 (예를 들어, 배양 조건 또는 조작)에 대하여 스크리닝을 할 수 있다.
[00144] 일부 적용에서, 줄기 세포 (분화 또는 미분화)를 사용하여 신경 계통을 따라 세포의 성숙을 촉진하거나, 또는 장기간의 배양에 있어서 이러한 세포들의 증식 또는 유지를 촉진하는 인자들을 스크리닝한다. 예를 들어, 신경 성숙 인자 또는 성장 인자에 대한 후보물질을 서로 다른 웰 중의 줄기 세포에 첨가한 후, 세포에 대한 추가의 배양 및 사용에 대한 바람직한 기준에 따라 결과적으로 나타난 임의의 표현형 변화를 살펴봄으로써 상기 후보물질을 시험할 수 있다.
[00145] 본원의 개시내용의 스크리닝 적용은 약물 연구에서 약제학적 화합물의 시험을 포함한다. 표준 시험 방법은 예를 들어, 문헌 [In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997]에 제시되어 있다. 구현예 중 특정 양태에서, 본원에 상술한 방법으로 생성된 세포는, 이전에 단기간의 배양으로 1차 신경세포에 대하여 실시된 바와 같이, (예를 들어, 기능에 대한 세부사항을 식별, 확인 및 시험하기 위해서나, 또는 세포 계통 특이적인 질환을 치료하기 위해 치료 분자의 전달에 대해 시험하기 위해) 표준 약물 스크리닝 및 독성 분석을 위한 시험 세포로 사용할 수 있다. 후보 약학 화합물에 대한 활성 평가는, 일반적으로 본 발명의 특정 양태에 제공된 신경세포를 후보 화합물과 혼합하는 단계, 상기 화합물로 인한 세포에 있어서의 전기생리학, 형태, 마커 표현형 또는 대사 활성의 임의의 모든 변화를 (처리되지 않은 세포 또는 비활성 화합물로 처리된 세포와 비교하여) 측정하는 단계, 및 이후 상기 화합물의 효과를 관찰된 변화를 연관시키는 단계를 수반한다. 상기 스크리닝은, 해당 화합물이 신경세포에 대하여 약리학적 효과를 가지도록 고안되었기 때문에, 또는 어딘가 효과를 갖도록 고안된 화합물이 의도치 않은 부작용을 가질 수 있기 때문에 수행할 수 있다. 있을 수 있는 약물-약물간 상호작용 효과를 검출하기 위해, 2개 이상의 약물을 조합 (세포와 동시에 혼합 또는 연속적으로 혼합)하여 시험할 수도 있다.
[00146] 일부 적용에서, 화합물을 잠재적인 신경독성에 대하여 스크리닝하거나 시험할 수 있다. 세포독성은 세포 생존력, 생존, 형태 또는 배양액 배지로의 효소의 누출에 대한 영향에 의해 우선적으로 먼저 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 시험은 해당 화합물(들)이 독성을 유발하지 않으면서 세포 기능 (예를 들어, 신경전달 또는 전기생리학)에 영향을 주는지의 여부를 결정하기 위해 수행한다.
B. 중추 신경계 질환의 치료
1. 중추 신경계 질환
[00147] 본원에 제공된 도파민성 뉴런 및 mDA 전구세포 (예를 들어, D17 세포)를 이식하여 중추 신경계 (CNS)의 질환을 갖는 개체에서 신경 세포를 재생할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 mDA 전구세포를 CNS 질환을 치료하기 위해 대상체에 투여할 수 있다(예를 들어, 파킨슨 질환을 치료하기 위해 대뇌 또는 중뇌, 예를 들어, 미상핵, 피각 또는 흑색질에 투여함). 이러한 질환으로는, 이에 제한되지는 않지만, 신경퇴행성 질환, 예를 들어 파킨슨병을 포함할 수 있다.
[00148] 본원에서, "파킨슨병"이라는 용어는 움직임을 제어하는 대뇌의 한 부분인 기저핵에서 도파민 부족과 연관된 일군의 질환을 일컫는다. 그 증상으로는 떨림, 운동완만증(움직임이 매우 느려짐), 굽은 자세, 자세 불안정, 및 경직을 포함한다. 파킨슨병으로 진단되려면 상기 증상들 중 적어도 2개가 있어야 하며, 그 중 하나는 떨림 또는 운동완만증이어야 한다. 가장 일반적인 형태의 파킨슨병은 특발성 또는 고전적 파킨슨 지로한 (PD)이나, 진단된 전체 환자 중 상당히 소수인 약 15%는 파킨슨 플러스 증후군 (PPS) 중 하나가 존재할 수 있다. 이러한 증후군은 비정형 파킨슨병으로도 알려져 있으며, 대뇌피질기저핵 변성, 루이소체 치매, 다계통 위축증 및 진행성 핵상마비를 포함한다. 일반적으로, 파킨슨 질환은 대뇌에서, 주로 흑질이라 불리는 대뇌의 영역에서의 중요한 신경 세포의 기능 부전 및 사멸과 관련이 있다. 이러한 중요한 신경 세포 대다수가 도파민을 생성한다. 이러한 뉴런이 죽게되면, 도파민의 양이 감소하여 사람이 정상적으로 움직임을 제어할 수 없게 된다. 파킨슨 질환 환자는 장에도 퇴행중인 도파민 세포를 가지고 있어, 이것이 파킨슨 질환의 일부인 위장 증상의 중요한 발생 원인일 수 있다. 개개인이 경험하는 구체적인 증상들은 사람마다 각기 다를 수 있다. 파킨슨 질환의 1차적인 운동 징후로는 손, 팔, 다리, 턱 및 안면의 떨림, 운동완만증 즉 움직임의 느림, 사지와 몸통의 경직 또는 경축, 및 자세 불안정 또는 균형력과 조정력의 손상을 포함한다.
[00149] 일부 구현예에서, iPSC 유래 mDA 전구세포(예를 들어, D17 세포)는 다른 iPSC 유래 성숙 mDA 뉴런에 비해 PD의 임상 치료에 대해 개선된 성질을 나타낼 수 있다. 바닥판 중간체를 통해 분화된 iPSC 유래 mDA 뉴런은 일측성 6-하이드록시도파민(6-OHDA) 병변을 가진 무도병 래트에서 생착, 장기 생존, 약물 유발 운동 비대칭을 감소시키거나 역전시킬 수 있다(Hiller et al., 2020; Wakeman et al., 2017). 다양한 발달 단계에서 세포는 이전에 이식되었다(Bye, Thompson, & Parish, 2012; Kirkeby et al., 2012; Kriks et al., 2011; Niclis et al., 2017).
[00150] 일부 구현예에서, 본원에 제공된 mDA 전구세포는 PD와 같은 질환의 임상 치료에 대해 우수한 성질을 나타낼 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 1) 임상적으로 사용할 수 있는 mDA 전구세포의 생성을 유도하는 분화 과정과 iPSC 라인이 개발되었고; 2) 면역손상된 래트에서 iPSC 유래 mDA 전구체(시험관 내에서 17일째 동결 보존)의 선조체내 이식편은 6-OHDA 유도된 운동 비대칭을 완전히 역전시키고, 대량으로 생존하며 숙주 선조체를 조밀하게 재신경화하며, 24일 및 37일에 동결 보존된 세포의 이식편보다 우수하고; 3) 상기 D17 선조체는 생체 내에서 성숙하고 적절한 mDA 계통을 유지하는 것이 관찰되었고; 4) 흑색질에 배치된 D17 및 D24 이식편이 중뇌 도파민 시스템에 의해 정상적으로 신경 분포되는 여러 숙주 표적에 대한 장거리 축삭 성장을 나타내고; 5) 보다 고용량의 D17 선조체가 저용량보다 세포 생존 및 이식편 유래 TH 신경 분포의 증가와 함께 보다 빠르고 완전한 기능 회복을 제공하고; 6) 본 발명의 분화 프로토콜에 따른 iPSC 이식 시 기형종이나 세포의 과도한 증식이 관찰되지 않았다. 본원에 제공된 mDA 전구세포는 임상적으로 사용될 경우 상기 열거된 장점 중 하나 이상 또는 전부를 나타낼 수 있다.
[00151] 일부 구현예에서, mDA 전구세포(예를 들어, D17 세포)는 예를 들어, 파킨슨 질환(PD)과 같은 도파민성 뉴런의 사멸을 수반하는 뇌 질환 또는 뇌 손상을 치료하기 위해 환자에게 투여된다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, mDA 선조체 세포는 PD 동물 모델(즉, 헤미파킨슨 래트)을 사용하여 생체 내에서 mDA 전구세포의 생착, 신경 분포 및 기능적 효능을 관찰하였다. mDA 선조체 또는 전구세포(17일째, "D17"에 동결 보존), 미성숙 mDA 뉴런("D24") 및 정제된 mDA 뉴런("D37")을 시험하고 상업적으로 시판되는 R&D 등급의 정제된 mDA 뉴런(D38, "G418")과 비교하였다(Hiller et al., 2020; Wakeman et al., 2017). D17 또는 D24 세포는 흑색질(SN)에 이식했을 때 장거리 신경 분포를 제공하는 것으로 관찰되었다. D17 mDA 선조체는 가장 강력한 생존력과 섬유 성장을 보이는 것으로 관찰되었고, 용량 범위 실험을 사용하여 헤미파킨슨병 래트에서 기능 회복을 조기에 개시하는 최저 용량을 결정하였다. 이들 결과는 사람과 같은 포유동물 대상체에서 PD를 치료하는 데 본 발명에 제공된 mDA 전구 세포를 사용할 수 있음을 입증한다.
[00152] 본원에 개시된 바와 같은 다양한 용량의 mDA 전구세포(예를 들어, D17 세포)를 사람과 같은 포유동물 대상체에 치료적으로 투여할 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어, 약 2,500 세포/μL 내지 약 150,000 세포/μL, 약 10,000 세포/μL 내지 약 150,000 세포/μL, 약 40,000 세포/μL 내지 약 100,000 세포/μL, 약 15,000 세포/μL 내지 약 45,000 세포/μL, 약 3e6-9e6 세포, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 1e4, 2e4, 3e4, 4e4, 5e4, 6e4, 7e4, 8e4, 9e4, 1e5, 1.1e5, 1.2e5, 1.3e5, 1.4e5, 또는 1.5e5 세포/μL 또는 본원에서 유래가능한 임의의 범위의 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포는 사람과 같은 포유동물 대상체에게 투여될 수 있다. 사람 환자와 같은 포유동물 대상체에게 투여되는 총 세포 수는 약 1e5 내지 약 100e6 범위일 것으로 예상되고, 총 세포 수는 대상체의 증상 및 기타 특징을 기준으로 임상의에 의해 선택될 수 있다. 바람직하게, 세포는 대상체의 뇌에 투여된다. 예를 들어, mDA 전구세포는 대상체의 피각 또는 흑색질과 같은 선조체에 투여될 수 있다. 일부 경우에, 대상체 뇌의 한 위치에서 mDA 전구세포를 투여하기에 충분할 수 있다. 다른 구현예에서, mDA 전구세포는 대상체의 뇌(예를 들어, 선조체 또는 피각)에 여러 부위 및/또는 여러 바늘 관을 통해 투여된다. 사람 대상체에서, 선조체의 여러 부위에 mDA 세포를 투여하면 일부 경우에 mDA 전구세포에 의한 더 광범위한 신경 분포가 촉진될 수 있을 것으로 예상된다.
2. 세포 투여 방법
[00153] 본원에 제공된 세포는 대상체에게 국소 또는 전신으로 투여할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, mDA 전구세포 (예를 들어, D17 세포)는 대상체의 뇌로 투여된다. 뇌에 정위적 투여와 같은 DA 뉴런을 대상체에 투여하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 본원에 제공된 세포 및 세포 배양물에 적용될 수 있다. 환자가 자신의 세포로부터 유래된 세포를 투여받는 경우, 이를 자가 이식이라 부르며; 이러한 이식은 거부 반응이 생길 가능성이 낮다.
[00154] 대상체, 특히 사람 대상체에 줄기 세포 또는 분화 뉴런 세포를 투여하는 예시적인 방법으로는, 대상체 내 표적 부위 (예를 들어, 선조체 및/또는 흑색질)로 세포를 주사하거나 이식하는 것을 포함한다. mDA 전구 세포는, 주사 또는 이식에 의하여 해당 세포를 대상체 내로 용이하게 도입하게 해주는 전달 장치에 삽입할 수 있다. 이러한 전달 장치로는, 예를 들어, 세포 및 유체를 수용자 대상체의 체내로 주사하기 위한 관, 예를 들어, 카테터를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 관은 예를 들어 주사기와 같이 추가로 바늘을 구비하여, 이를 통하여 본 발명의 세포를 대상체의 원하는 부위에 도입할 수 있다. 상기 줄기 세포를 이러한 전달 장치, 예를 들어, 서로 다른 형태의 주사기에 삽입할 수 있다. 예를 들어, 세포를 용액 중에 현탁시키거나, 세포 응집체 중에 포함시키거나, 또는 다르게는 상기 전달 장치 중에 함유되어 있는 경우에는 지지 기질에 매립시킬 수 있다.
[00155] 상기 줄기 세포, 뉴런 또는 뉴런 전구세포가 혼입되거나 포매될 수 있는 지지체 매트릭스는, 수용자에게 거부 반응을 일으키지 않고 해당 수용자에 무해한 산물로 분해되는 매트릭스를 포함한다. 상기 지지 매트릭스는 자연적 (예를 들어, 하이알루론산, 콜라겐 등) 및/또는 합성 생분해성 매트릭스일 수 있다. 사용될 수 있는 합성 생분해성 기질로는 폴리무수물, 폴리오르쏘에스테르 및 폴리락트산과 같은 합성 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 도파민성 뉴런(예를 들어, 완전하게 분화되지 않은 도파민성 뉴런)을 하이알루론산 매트릭스에 포매되고 이를 대상체에 투여하여 신경퇴행성 질환 (예를 들어, 파킨슨 질환)을 치료한다.
[00156] 본원에서, "용액"이라는 용어는 본 발명의 세포가 생존가능한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제로는 식염수, 수성 완충 용액, 용매 및/또는 분산매를 들 수 있다. 이러한 담체 및 희석제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 상기 용액은 무균성이며 용이한 주사기 주입성(Syringeability) 정도의 유체인 것이 바람직하다.
[00157] 상기 용액은 제조 및 저장 조건 하에 안정하여 세균 및 곰팡이류와 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, DA 전구세포(예를 들어, D17 세포)를 함유하는 용액을 BSS PLUS [미국 텍사스주 포트워스 소재의 알콘(Alcon)사 제조]의 멸균 용액으로 환자에게 투여한다. 필요하다면, 투여용 약제학적 조성물에 보존제 또는 항생제를 포함시킬 수 있다. 본 발명의 용액은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 중의 본원에 기재된 바와 같은 mDA 뉴런 전구세포 및 필요에 따라 기타 성분들을 도입하여 제조할 수 있다.
3. 용량 및 투여
[00158] 하나의 양상에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 뉴런 선조체 세포(예를 들어, D17 세포) 또는 DA 뉴런의 생착을 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 포유류, 예를 들어, 사람이다.
[00159] 조성물은 해당 제형에 적절한 방식으로 투여하고, 치료에 유효한 양으로 투여된다. 투여되는 양과 시기는 치료되는 대상체, 활성 성분을 이용함에 있어서 대상체 시스템의 수용력 및 목적하는 치료 효과의 정도에 따라 다르다. 투여될 각 활성 성분의 정확한 필요량은 의사의 판단에 따라 다르고, 각 환자 또는 대상체에 따라 특유할 수 있다. 적합한 용량 범위는 투여 경로에 의존할 수 있고 다양한 투여 방법이 사용될 수 있다.
[00160] 본원에 기재된 바와 같은 다양한 용량의 mDA 전구세포(예를 들어, D17 세포)를 포유동물 대상체에 치료학적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포의 약 2,500 세포/μL 내지 약 150,000 세포/μL, 약 10,000 세포/μL 내지 약 150,000 세포/μL, 약 40,000 세포/μL 내지 약 100,000 세포/μL, 약 15,000 세포/μL 내지 약 45000 세포/μL, 약 1e6-9e6 세포/μL, 약 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 1e4, 2e4, 3e4, 4e4, 5e4, 6e4, 7e4, 8e4, 9e4, 1e5, 1.1e5, 1.2e5, 1.3e5, 1.4e5, 또는 1.5e5 세포/μL 또는 본원에서 유래가능한 임의의 범위는 사람과 같은 포유동물 대상체에게 투여될 수 있다. 사람 환자와 같은 포유동물 대상체에게 투여되는 총 세포 수는 약 1e5 내지 약 100e6 범위일 것으로 예상되고, 총 세포 수는 대상체의 증상 및 기타 특징을 기준으로 임상의에 의해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, mDA 전구세포는 포유동물 대상체, 바람직하게는 사람 환자의 뇌 또는 중추 신경계에 주사를 통해(예를 들어, 단일 부위 또는 뇌의 여러 부위, 예를 들어 선조체 또는 피각에서) 투여된다.
4. 효능
[00161] 당업자라면 DA 신경세포 이식을 향상시기키 위한 주어진 치료의 효능을 측정할 수 있다. 그러나, 예를 들어, 좋지 않은 DA 신경세포 이식의 징후 또는 증상 중 어느 하나 또는 모두가 유익한 방식으로 변화하거나, 다른 임상적으로 허용가능한 증상들이 호전되거나, 또는 심지어 예를 들어, 본원에 기술된 세포 집단을 사용하여 치료한 후 적어도 10% 개선되는 경우, 그 치료는 본원에서 사용하는 용어인 "효과적인 치료"로 간주된다. 또한, 효능은 입원, 의료적 개입 (즉, 질병의 진행을 정지시킬) 필요성, 또는 이식 실패의 빈도로 평가했을 때 환자 상태의 악화 실패로 측정할 수도 있다. 이러한 지표를 측정하는 방법은 당업자에게 알려져 있고/있거나 본원에 기재되어 있다. 치료는 개체 또는 동물 (일부 비제한적인 예로 사람이나 포유류를 포함함)의 질환에 대한 임의의 치료를 포함하고, 하기를 포함한다: (1) 질환을 억제하는 것, 예를 들어, 생착 실패를 방지하는 것; 또는 (2) 질환을 완화시키는 것, 예를 들어, 하나 이상의 증상의 퇴행을 유발하는 것. 질병의 치료에 대한 유효량이라는 것은, 치료가 필요한 포유동물에 투여하는 경우, 해당 질병에 대한 치료 또는 치료적 효과를 유도하기에 충분한 양을 의미한다. 제제의 효능은 예를 들어, DA 뉴런 생착에 대한 물리적인 지표, 예를 들어, 떨림, 운동완만증, 굽은 자세, 균형력과 조정력을 평가함으로써 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 생착 또는 신경 기능은, 대사, 활성, 도파민성 신경전달을 검출하기 위한 PET 스캔을 사용하여 (예를 들어, 도파민성 시스템의 이미지화를 위한 PET 트레이서를 사용하여) 생체내에서 (예를 들어, 사람에서) 측정할 수 있다. 효능은 파킨슨 질환의 동물 모델에서 예를 들어, 단계 시험 또는 실린더 시험과 같은 행동기능 시험을 수행하여 평가할 수 있다.
C. 상업적, 치료적 및 연구 목적을 위한 유통
[00162] 제조, 유통 및 사용의 목적을 위해, 본원에 기재된 신경 세포, 예를 들어, 중뇌 DA 뉴런 전구세포는 등장성 부형제 또는 배양 배지 중의 세포 배양액 또는 현탁액의 형태로 제공될 수 있고, 필요에 따라서 운송 또는 보관을 용이하게 하기 위해 동결되어 제공된다.
[00163] 본원에 기재된 mDA 전구세포는 예를 들어, 제조, 유통 또는 사용하는 동안 어느때라도 생존하는 세포의 세트 또는 조합을 포함하는 서로 다른 시약 시스템을 사용하여 제공될 수 있다. 세포의 세트는 본 발명에 기재된 2종 이상의 세포 집단의 임의의 조합, 예를 들어, 이에 한정되지는 않지만, 프로그래밍 유래 세포 (신경 계통 세포, 이들의 전구체 및 하위 유형)와 미분화된 줄기 세포 또는 다른 미분화된 세포 유형의 조합을 포함할 수 있다. 상기 세트의 세포 집단은 동일한 유전체 또는 이의 유전자 변형된 형태를 공유할 수 있다. 상기 세트의 각 세포 유형은 동일한 단체 또는 사업상 관계를 공유하는 서로 다른 단체들의 관리 하에, 동시에 또는 다른 시기에, 동일한 시설 내에서 또는 서로 다른 장소에서, 함께 또는 별도의 용기로 포장될 수 있다.
IV. 실시예
[00164] 하기의 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 구현예를 설명한다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 구현예에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1
세포 배양물을 생성하기 위한 재료 및 방법
[00165] 표 1에 상세히 기재된 다양한 분화 배지 조성과 일정을 사용하여, 소분자 및 성장 인자 유도로 필수 8 배지 중 VTN-TN 상에서 증식된 사람 유도성 만능 줄기 세포 (iPS) 세포주의 중뇌 뉴런 분화를 수행하였다. 일반적으로, 상기 iPS 세포를 1일째에 D1 DA 신경세포 유도 배지, 2일째에 D2 신경세포 유도 배지, 3일과 4일째에 D3-D4 DA 유도 배지 중에서 배양하였다. 5일째에, 상기 세포들을 TrypLE로 15분간 해리시켜 DA 급랭(Quench) 배지 중에 수집한 후, 상기 세포를 스피너 플라스크 현탁 배양물에 옮겨 D5 DA 신경세포 응집 형성 배지 중에서 응집체를 형성시켰다.
[00166] 6일째에, 상기 응집체를 고정시키고 배지의 약 66%를 제거한 후, 상기 응집체에 DA 신경세포 유도 배지를 공급하였다. 7-16일째에, 상기 응집체에 매일 DA 신경세포 응집 유지 배지를 공급하고, 11-16일째에 상기 배지를 교체하였다. 17일째에, 응집체를 TrypLE를 사용하여 단일세포 현탁액으로 해리하고, D17 DA 신경세포 응집 플레이팅 배지 중의 Matrigel 상에 플레이팅하였다. 18, 20, 22일째에, 상기 배지를 DopaNeuron 성숙 배지로 대체하였다. 24일째에, 상기 세포들을 아큐타제를 사용하여 해리시키고 DA 신경세포 성숙 플레이팅 배지 중에서 플레이팅하였다 다음날, 상기 배지를 DopaNeuron 성숙 배지로 대체하였다.
[00167] 27일과 29일째에, 상기 배지를 DA 신경세포 성숙 배지 + 미토마이신 C로 대체하였다. 31일째에, 상기 세포들을 아큐타제를 사용하여 해리시키고 DA 신경세포 성숙 플레이팅 배지 중의 폴리-L-오르니틴 (PLO)/라미닌-코팅된 플라스크 상에 재플레이팅하였다 다음으로, 32일, 34일 및 36일째에, 상기 세포에 DopaNeuron 성숙 배지를 공급하였다. 37일 또는 38일째에, 상기 세포들을 다시 아큐타제로 해리시키고 분석을 수행하거나 차후 사용을 위해 저온보존하였다.
표 1: 규칙적으로 시기를 조절한 배지 조건 (200 nM의 LDN)
[00168] 표 2에 상세히 기재된 다양한 분화 배지 조성과 일정을 사용하여, 소분자 및 성장 인자 유도로 필수 8 배지 중 VTN-TN 상에서 증식된 사람 유도성 만능 줄기 세포 (iPS) 세포주의 중뇌 뉴런 분화를 수행하였다. 일반적으로, 상기 iPS 세포를 1일째에 D1 DA 신경세포 유도 배지, 2일째에 D2 신경세포 유도 배지, 3일과 4일째에 D3-D4 DA 유도 배지 중에서 배양하였다. 5일째에, 상기 세포들을 TrypLE로 15분간 해리시켜 DA 급랭(Quench) 배지 중에 수집한 후, 상기 세포를 스피너 플라스크 현탁 배양물에 옮겨 D5 DA 신경세포 응집 형성 배지 중에서 응집체를 형성시켰다.
[00169] 6일 및 7일째에, 상기 응집체를 침강시키고 배지의 약 66%를 제거한 후, 상기 응집체에 D6-7 DA 유도 배지를 공급하였다(6-7일째). 8 내지 10일째에, 응집체에 매일 D8-10 DA 응집체 유지 배지를 공급하였다. 11 내지 16일째에, 응집체에 매일 D11-16 DA 응집체 유지 배지를 공급하였다. 17일째에 응집체를 TrypLE로 단일 세포 현탁액으로 해리시키고 15분 동안 켄치(quench)(DA 켄치 배지 1)에 방치한 후 세척하여 동결 보존 배지에 동결 보존하였다. 동결 보존된 세포는 액체 질소의 증기 상에 저장하였다.
[00170] 표 2: FCDI DAPC-1
실시예 2
mDA 선조체 패터닝
[00171] 공정 17일째에 FoxA2와 Lmx1을 동시 발현하는 세포의 비율로 측정한 mDA 전구세포의 효율적인 패터닝은 일반적으로 상기 제조 공정의 종료시에 mDA 신경세포의 고집적화된 집단을 수득하는데 있어서 필요하다. 17일째에 상기 세포들 중 대부분이 mDA 전구세포가 아닌 경우, 수득된 뉴런들은 다수의 비-중뇌 표현형 뉴런을 가지게 될 것이거나, 또는 통상 신경세포 탈리(detachment)를 초래하거나, 또는 유사분열 후 뉴런 정제를 어렵게하거나 불가하게 만드는 증식성 세포의 부산물을 가지게 될 것이다.
[00172] 5일째 되는 날에 benzonase® [엔도뉴클레아제, EMD 밀리포어(Millipore)사 제조]를 10 U/mL의 농도로 항온배양에 포함시키는 변화를 주어 이러한 단일-SMAD 실험을 반복하였다. 5일째에 항온배양에서 benzonase®의 첨가는 응집 형성에 있어서 과도한 응괴 형성을 감소시키거나 방지하는 것으로 관찰되었다.
실시예 3
FoxA2/ Lmx1 동시 발현에 대한 유세포분석법
[00173] FoxA2/Lmx1 동시 발현은 성공적인 도파민 신경 세포 전구세포 패터닝에 대한 매우 중요한 판독 정보이므로, 면역세포화학 이미지에 대해 구동시킨 세포 계수 소프트웨어를 사용하여 유도한 결과보다 덜 주관적이고 변동성이 적은 세포내 유세포분석법을 개발하였다. 상기 분석법은 공정 17일 내지 24일에 FoxA2 및 Lmx1를 동시 발현하는 세포의 비율을 정확하게 정량할 수 있으며, 그 결과들은 분석된 ICC 이미지의 개수와 관련이 있다. 선조체 패터닝은, 세포가 17일째에 >65% FoxA2+/Lmx1+이라면 성공적인 것으로 사료된다(도 2).
실시예 4
iPSC-mDA 뉴런으로부터의 도파민 방출
[00174] iPSC 라인 "K"(21534.101)를 분화하여 공정 완료(37일차)하고 동결 보존하였다. 세포를 해동시켜 고밀도 (8.8 x105/cm2)로 플레이팅하였다. 상기 세포에 총 14일 동안 3일마다 DAPT가 없는 성숙 배지를 공급하였다. 분석 당일에, 세포를 세척하고 HBSS (56 mM의 KCl 첨가 또는 무첨가)를 사용하여 30분 항온배양하였다. 경쟁적 도파민 ELISA 키트 [이글 바이오사이언시즈(Eagle Biosciences)사 제조]를 사용하여 방출액 중의 도파민 농도를 측정하였다. iPSC 유래된 전뇌 뉴런 (i세포(iCell) Neuron)로부터는 도파민 방출이 검출되지 않았다. 반대로, 최적화된 모노 SMADi 공정을 사용하여 유래된 iPSC-mDA 세포 (DA Therapy Neuron)는 적어도 최적화된 이중 SMAD 공정을 사용하여 유래된 세포 (i세포 DopaNeuron)만큼 많은 도파민을 분비하였다. 따라서, 상기 세포들은 성숙한 도파민 신경세포의 중요한 기능적 속성을 수행할 수 있다.
실시예 5
iPSC-mDA 뉴런의 전기적 활성.
[00175] 동결보존된 iPSC-mDA 뉴런을 해동시킨 후 PEI-코팅된 48-웰 다전극 어레이 (MEA) 플레이트 상에 플레이팅하였다. FUJIFILM 셀룰러 다이내믹스 인터내셔날 출원 프로토콜인 미국 출원 제14/830,162호에서의 "마에스트로 다전극 어레이 상의 동시적 신경 활성 측정"에 따라 세포를 배양하였다. 최적화된 모노 SMADi 프로토콜로 제조된 뉴런 (DA Therapy)는 최적화된 이중 SMADi 프로토콜로 제조된 세포 (i세포 Dopa G100)와 비교했을 때, 평균 활성화율 (mFR), 돌발적 활성화 (bursting) (마크로 BPM) 및 연결성을 비롯한 유사한 전기적 활성을 입증하였다. 평균 활성화율 (mFR), 주파수 및 연결성 돌발 활성화 강도는 시간의 경과에 따라 증가하였으며, 해동후 약 16일까지는 안정한 상태를 유지하였다. 시간에 따른 래스터 플롯은 명백한 스파이크간 간격, 높은 돌발 활성화 강도, 및 웰 중의 모든 전극에 걸친 돌발 활성화를 보여주고 있는데, 이는 전기적 활성도가 높다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 6
FCDI DAPC-1 뉴런의 정량적 유전자 발현 프로필
[00176] 공정 37일째에 최적화된 단일-SMADi 공정을 사용하여 유도된 iPSC-mDA 세포의 4개의 배치 (배치 1-4) 및 최적화된 이중-SMADi 프로토콜을 사용하여 유도된 iPSC-mDA 세포 (i세포 DopaNeuron)의 1개의 배치로부터 RNA를 추출하였다. RNA 분리 후, TaqMan 유전자 발현 분석법 [어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사 제조]을 이용하여 실시간 정량 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였으며, 그 결과는 GAPDH 대조군에 대한 상대적인 발현으로 나타냈다. <10-4 인 값을 백그라운드로 간주하였다 (음영처리된 박스). 중뇌 및 mDA 뉴런 마커의 발현은 서로 다른 프로토콜을 사용하여 제조된 배치들 간 및 세포들 간에서 유사하였다. 비-중뇌 영역 또는 비-mDA 세포 유형에 대한 마커들은 저조하였으며, 단일-SMADi 및 이중-SMADi 유도된 세포들 간에서도 유사하였다. 결과는 도 12 및 도 13에 나타낸다.
실시예 7
래트 파킨슨 질환 모델 시스템에서 iPSC-DA 선조체 및 뉴런의 생착
[00177] 최적화된 모노 SMADi 프로토콜을 이용하여 iPS 세포주 "K"를 분화시키고, 상기 분화 공정의 서로 다른 단계에서 동결보존하였다 (17일, 24일 및 37일). 또한, 최적화된 이중-SMADi 프로토콜을 사용하여 유도된 iPSC-mDA 세포 (i세포 Dopa)를 공정 37일째에 저온보존시켰다. 세포들을 해동하여, 6-OHDA-처리했지만 증상이 없는 누드 (RNU) 랫트의 선조체에 양측으로 이식 (1회 주입당 4.5 x105 개의 세포)하였다 (군당 n=3). 3개월 후, 상기 세포의 이식과 신경분포를 관상 절편의 조직학에 의해 평가하였다. 4개의 모든 그룹 (사람 NCAM 균주)에서 신경세포 이식과 신경분포가 관찰되었지만, 상기 iPSC-DA 전구세포 세포 (17일)와 미성숙 mDA 뉴런(24일)은, 상기 보다 성숙한 단일-SMADi 및 이중-SMADi 유도된 mDA 뉴런(각각 37일 및 37일 i세포 Dopa)에 비해 훨씬 더 큰 이식물과 더 큰 신경분포를 나타내었다. 또한, 선조체와 미성숙 DA 뉴런 이식편 중에서 다수의 DA 뉴런들 (TH+)이 관찰되었다. Ki67 염색을 통해, 37일째 세포의 이식물 중에서 증식성 세포가 거의 없었으며, 17일 및 24일째의 세포의 이식물 중에 Ki67+ 세포가 소수 존재하였음을 알 수 있었다. 상기 임의의 동물에서 종양, 신경 생장 또는 기타 부작용들은 관찰되지 않았다. 상기 결과는 최적화된 단일-SMADi 분화 공정 (17-24일) 초기에 유도된 세포들이 보다 성숙한 세포에 비해 더욱 잘 이식 및 자극할 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 결과는 도 9에 나타낸다.
실시예 8
[00178] 상기 실험은 다양한 CHIR 농도를 사용하여 반복하였다. 결과는 도 18에 나타낸다. 결과에 나타낸 바와 같이, 약 1.5 내지 약 1.75 μM의 CHIR99012 농도를 사용하는 경우 현저한 개선을 관찰하였다.
실시예 9
mDA 선조체 세포의 특징 분석
[00179] 상기 실시예에 기재된 방법을 통해 iPSC 유래된 중뇌 도파민 뉴런 선조체 세포("FCDI DAPC-1")를 포함하는 동결 보존된 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 세포는 도파민성 뉴런 선조체 세포 집단을 수득하기 위해 직접 분화를 통해 동종이계 사람 iPSC 세로주(FCDI 명칭 21534.101)로부터 유래하였다.
[00180] 상기 실시예에 기재된 바와 같이 생성된 mDA 선조체 세포에 대해 FOXA2 유동 세포측정 검정을 수행하였다. FOXA2 유동 세포측정 검정은 mDA 선조체 세포가 FCDI DAPC-1의 올바른 바닥판 패터닝을 나타냄을 지적하였다. 결과는 도 1에 나타낸다.
[00181] FOXA2/LMX 유동 세포측정 검정은 FCDI DAPC-1 mDA 선조체 세포에서 FOXA2와 LMX의 동시 발현을 밝혔다. 비교를 위해 병행하는 ICC 염색을 수행한 결과, 노란색으로 나타나는 동시 발현 세포가 관찰되었다. 결과는 도 2에 나타낸다.
[00182] 해동 후 12일 동안 배양한 후, FCDI DAPC-1 mDA 선조체 세포는 NURR1 발현에 의해 입증된 바와 같이 미성숙 DA 뉴런으로 분화할 수 있는 잠재력을 갖고 있다. 병행하는 ICC 염색을 또한 수행하였다. 결과는 도 3에 나타낸다.
[00183] MAP2/네스틴 유동 세포측정 검정을 사용하여 해동 후 14일까지 성숙화(유사 분열 후) 뉴런이 될 가능성이 있는 세포의 퍼센트를 확인하였다. 대표적인 배치로부터의 결과는 도 4에 나타낸다. MAP2+ 집단에 대한 보다 양호한 분리 및 게이팅을 위해 상호 배타적인 네스틴 동시 염색을 포함하였다.
표 6
표 7. qPCR의 유의성(도 1). 본페로니 사후 시험을 사용한 일원 ANOVA. (* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001)
[00184] 성숙 배지에서 5주 동안 배양한 후 FCDI DAPC-1과 유사한 세포("PD 치료요법 세포", 개발 초기의 공정 변형)에 의한 도파민 분비를 측정하였다. HBSS에서 30분 동안 항온처리하는 동안 방출된 도파민의 농도를 측정하였다. 세포 탈분극 후 더 높은 값을 수득하였다(HBSS + 56mM KCl).
[00185] FCDI DAPC-1 세포를 항-PAX6(바이오레전드 #901301)(도 5a) 또는 항-FOXG1(도 5b)로 염색하였다. 양성 대조군으로 표시된 i세포 GABA 뉴런(FCDI)은 전뇌 표현형에 패턴화된 세포로, 주로 GABAergic이며 PAX6+ 뉴런의 서브집단과 FOXG1+ 뉴런도 포함한다. 결과는 도 5a-b에 나타낸다.
[00186] REX1, TDGF1 및 NODAL에 대한 RT-QPCR 검정은 DA 선조체 세포(FCDI DAPC-1 공정)에 스파이킹된 억제성 시냅스 후 전류(iPSC)를 검출할 수 있다. REX1 검정은 가장 민감하여 100,000개의 FCDI DAPC-1 공정 세포에서 하나의 iPSC를 재현 가능하게 검출한다. 결과는 도 6에 나타낸다.
표 3: 공정 5일째에 FCDI DAPC-1 공정(5%)으로 스파이킹된 iPSC의 검출.
[00187] 상기 나타낸 바와 같이, 도파민성 뉴런 선조체 세포는 발달 중인 중뇌의 흑색질 영역에서 발견되는 도파민 뉴런 전구체(도 3 및 도 4)와 유사한 표현형 마커(도 1, 도 2)와 발달 잠재력을 나타냈다. FCDI DAPC-1은 치료학적 용도에 해로울 수 있는 유의적인 전뇌 뉴런과 잔류 iPSC의 수가 상당히 결핍되어 있다(예를 들어, 도 5a-b, 도 6 및 표 3). 중요한 것은 다른 DA 세포 치료요법과는 달리 FCDI DAPC-1은 EdU 혼입에 의해 입증된 바와 같이 증식하는 선조체 세포 집단인 것으로 관찰되었다(도 7).
실시예 10
생체내 PD 동물 모델에서 운동 결손의 감소
[00188] 추가 연구를 위해 파킨슨 질환(PD) 동물 모델인 6-OHDA 병변이 있는 무흉선 누드 래트(RNU, Crl:NIH-Foxn1rnu)를 사용하였다. 이들 동물들은 암페타민 유도 회전 시험을 사용하여 관찰할 수 있는 심각한 운동 결함을 나타낸다(문헌참조: Blesa et al., 2014; Campos et al., 2013; Deumens et al., 2002; Vermilyea, et al., 2018). 상기 실시예에 기재된 바와 같이 생성된 도파민성 선조체 뉴런(D19)을 마우스의 흑색질에 투여하여 암페타민 유도 회전 시험을 사용하여 관찰된 동물의 운동 결함을 완화할 수 있는지를 결정하였다. 하기 논의된 바와 같이 성숙한 D37 뉴런은 동물의 운동 결함을 개선하지 못했지만, 마우스에 D17 및 D19 도파민성 선조체 뉴런을 투여하면 생체 내 6개월까지 이들 운동 결함을 완전히 되돌릴 수 있었다.
[00189] 흑색질 도파민 시스템에 일방적인 손상을 입은 래트(예를 들어, 6-하이드록시도파민과 같은 신경독소, α-시누클레인의 과발현 또는 독성 시누클레인 원섬유 주사로 유도)를 실험 모델로 사용하여 파킨슨 질환에서 보이는 도파민 뉴런의 손실을 모방하였다. 암페타민 회전 시험은 통상적으로 병변에 의해 유발된 운동 장애의 정도를 모니터링하는 데 사용되고, 상기 검사는 이식 유도된 기능 회복 또는 DA 뉴런 기능의 보존 또는 회복을 목표로 하는 신경 보호 중재의 효능을 입증하는 표준 도구가 되었다. 상기 시험은 예를 들어 문헌(Wakeman et al., 2017)에 기재된다.
[00190] 상기된 바와 같이 래트 PD 모델에서 암페타민 순환을 시험하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 도파민성 뉴런 전구세포를 17일째(D17) 투여한 결과 암페타민 회전 시험에서 관찰된 바와 같이 래트의 운동 증상이 6개월까지 완화되었다. D24 미성숙 뉴런은 운동 수행능을 개선시켰지만, D24 뉴런의 효과는 D17 뉴런의 효과보다 적은 것으로 보였고, 이는 특히 4개월과 6개월 시점에서 두드러졌다.
[00191] 래트의 선조체에 뉴런을 투여한 후 6개월에 뇌 슬라이스의 면역조직화학 염색을 수행하였다. 성숙한 D37 또는 iCell® 도파 뉴런에 비해 D17 또는 D24 뉴런을 투여한 후 NCAM 발현 증가가 관찰되었다. 이들 결과는 선조체(D17) 및 미성숙(D24) mDA 뉴런이 생착에서 더 성숙한(D37) mDA 뉴런보다 성능이 뛰어나다는 것을 나타낸다.
[00192] 이식 후 6개월에 선조체 재신경화가 관찰되었다. D17 세포에 의한 선조체의 신경 분포는 시험된 다른 뉴런과 비교했을 때 가장 높은 것으로 나타났다. D17 및 D24 세포는 D37 또는 iCell® 도파 뉴런에 비해 신경 분포가 현저히 개선된 것으로 나타났다. 결과는 도 9에 나타내고, 선조체로의 이식편의 흑색질 내 신경 분포의 예는 도 10에 나타낸다.
[00193] 선조체 마커는 qPCR을 사용하여 D17, D24 및 D37 세포에서 측정하였다. D17 세포와 D24 세포를 비교했을 때, Lmx1, Nurr1, 및 Pitx3은 D24 세포에서 보다 높은 수준으로 발현되는 반면, En-1, Pax8, ETV5 및 Glast는 D17 세포에서 보다 높은 수준으로 발현된다(도 11). 성숙화 마커도 세포 전체에서 측정한 결과, AQP4와 티로신 하이드 록실라제 (TH)가 D17 세포에 비해 D24 세포에서 보다 높은 수준으로 발현된다(도 12). 다양한 분화 기간(D17, D24, D37 시점) 후에 생성된 다양한 세포 유형에서 다양한 유전자의 정규화된 발현에 관한 추가 데이터는 도 19에 나타낸다. 이들 결과는 D17 도파민성 뉴런 전구세포에 비해 D24 세포가 성숙한 도파민성 뉴런으로의 분화 증가와 일치한다. 면역세포화학은 D24 및 D17 세포에 대해서도 수행되었고 결과는 도 13에 나타낸다. 면역세포화학(ICC) 실험 결과는 qPCR 결과와 일치하였다.
[00194] 대안적 세포 유형의 기능성 시험은 D19 "중간" 도파민성 세포를 투여하면 6개월 시점에 운동 결손을 완전히 되돌릴 수 있는 것으로 나타났다. 이들 세포들은 표 2에 기재된 방법을 따랐고, D15까지는 D17 플레이팅 배지에서 LN521에 플레이팅한 다음 D16-18을 뺀 뉴런 성숙 배지를 공급하고 D19에서 동결하였고; CHIR 농도를 1.75에서 1.65 μM으로 변화시키고 D5 및 D17 켄치 배지에 벤조나제를 첨가하였다. D19 동물은 4개월까지 기능적 개선을 보이기 시작했고, 상기 그룹은 재응집체(D17 세포가 밤새 해리되어 작은 크기로 재응집된 후 D18에 동결된 세포) 또는 대조군 세포(재응집체를 만든 D17 세포)에 비해 더 빠른 개선 효과를 보였다. 재응집체와 이의 대조군 세포는 개선이 실현되기 전 4개월 시점까지 운동 결손을 유지하였다. 각 동물에 주사된 총 세포 수는 동물당 평균 290k, 재응집체 평균 333k, 재응집체 대조군 평균 369k였다. 재응집체 및 재응집체 대조군 그룹(N=3)에 각각 다수의 동물을 시험하였다. D19 동물 그룹은 N=10 동물을 가졌다. 결과는 도 15에 나타낸다.
실시예 11
D17 도파민성 전구체 뉴런의 발현
[00195] 생착 6개월 후 뇌 슬라이스를 염색하여 사람 nuclie(hNuc), 티로신 하이드록실라제(TH) 및 Ki67의 존재 여부를 확인하였다. TH는 도파민성 뉴런과 도파민성 뉴런 전구체 뉴런에 의한 도파민 생성에 관여한다. Ki67은 세포 증식과 관련된 유전자이다. h-Nuc는 뉴런 전구세포에서 발현되는 유전자 마커로, 생착 후 추가적인 세포 확장이 일어나는지 평가하기 위해 측정하였다. 결과는 도 16에 나타낸다. DAB 방법을 사용하여 HuNuclei로 염색된 40μm 관상 절편 전체를 스테레오 연구자(Stereo Investigator) 광학 분획기를 사용하여 60배율로 계수하였다(Microbrightfield Bioscience, Version10.40). TH(12번째 연속 절편마다) 및 HuNuclei(12번째 연속 절편마다) 입체학적 파라미터는 프레임 크기(75 μm x 75 μm) 및 그리드 크기 250 μm x 250 μm로 전체 이식편 면적의 9%를 계산하여 HuNuclei의 평균 CE = 0.13(군더센 m=1), 프레임 크기(80 μm x 80 μm) 및 그리드 크기 225 μm x 225 μm로 전체 이식 면적의 12.6%를 계산하여 TH의 평균 CE = 0.17(군더센 m=1)이었다. 퍼센트는 각 이식편에서 계산된 hNuc, TH 및 Ki67 양성 세포의 수를 기준으로 계산되었다. 계산된 총 세포 수를 총 입력 세포 수로 나눈 값은 양성의 퍼센트를 초래하였다.
[00196] 도 16a-c에 나타낸 바와 같이, 각 그룹 평균은 생착 후 세포 확장을 나타내는 hNuc에 대해 100% 이상의 양성 반응을 보여준다. 희생 6개월 시점에 Ki67 양성 집단은 D18 및 재응집체를 제외하고 평균적으로 hNuc 집단에서 1% 미만을 차지한다. 상기 낮은 Ki67 퍼센트는 생착 6개월후 세포가 더 이상 증식하지 않는다는 생각을 뒷받침하지만, 생착일 이후 초기에는 생착된 세포의 증식 능력을 반영하지 않는다. 모든 그룹에서 평균 hNuc 양성이 100% 이상이면 생착 후 초기에 증식성 세포 유형이 더 이상 증식하지 않지만 사람 기원 마커를 유지하는 최종 세포 유형으로 변화되었음을 시사한다. TH 양성 세포의 퍼센트는 이전에 나타난 것 보다 상기 동물 연구에서 매우 낮았다. 이들 그룹에 대한 평균은 약 10-15%인 반면, 이전에 본원 발명자들은 20-30% 범위의 평균 TH+ 퍼센트를 보였다.
[00197] hNuc, TH, 및 Ki67에 대한 입체학 분석을 수행하였다. 모든 12번째 절편(1/2 시리즈)을 h핵, TH 또는 hKi67에 대해 염색하고 편견 없는 입체학으로 정량화하였다. 각 동물에 대해 이식편 영역의 윤곽을 나타내고 계수하였다. 각각의 그래프는 특유의 Y-축을 갖는다. 결과는 도 17a-c에 나타낸다.
[00198] 평균 및 평균의 표준 오차(SEM)를 포함하는 각 시험 그룹에서 각 동물로부터의 hNuc 양성 세포 수를 도 17a에 나타낸다. 상기 마커를 사용하면 h핵-ir 세포가 사람 기원(주사된 시험 물질)임을 입증한다. D17 T75 새로운 그룹은 다른 모든 그룹에 비해 가장 큰 범위의 생착된 hNuc+ 세포를 보여준다. 다른 모든 그룹은 해당 그룹의 모든 동물 간에 세포가 일관되게 생착하는 것으로 보인다. 각 그룹에 대한 평균은 샘플에 따라 다양하다. 일원 ANOVA 시험을 사용한 분석에 따르면 D17 T75의 평균 h핵+ 세포 수에 통계적으로 유의적 차이가 있는 것으로 나타난다. 새로운 그룹 및 D19 그룹 (p=0.0384).
[00199] 17B,, 평균 및 SEM을 포함한, 각 그룹에서 각 동물로부터의 TH 양성 세포 수를 도 17b에 나타낸다. TH-ir 양성 세포는 도파민을 생성할 수 있는 세포 유형이며 이식 전에 수행된 절제술로 인해 시험 물질에서 나온 세포임을 나타낸다. D17 T75 6시간 그룹(정량화하기 위해 하나의 동물로부터의 염색만 가짐)을 제외한 모든 그룹은 대략 60,000개의 세포로 비슷한 수의 TH+ 세포가 생착됨을 보여준다. 일원 ANOVA 시험은 TH 생착에 대해 이들 치료 그룹 간에 통계적 차이가 없음을 나타낸다.
[00200] 도 17c는 각 그룹에서 각 동물로부터 Ki67 양성 세포 수, 평균 및 SEM을 보여준다. Ki67-ir 세포는 분열/증식할 수 있는 세포 유형을 지적한다. 본 검정에 사용되는 특정 항체는 사람 특이적이고 사람 기원의 세포에만 결합한다. 이들 결과는 투여된 세포가 매우 낮은 세포 증식율을 나타냄을 지적한다.
[00201] 생체 내 행동의 개선은 D17 세포를 투여받은 6-OHDA 병변 동물에서 관찰되었다. 생체 내 D17 선조체의 기능, 생존율 및 신경 분포에 대한 특징화 및 분석은 도 20a-j에 나타낸다. 수술 전과 생착 후 2, 4, 6개월 시점에 측정한 d-암페타민 유도 회전의 시간 기반 분석(도 20a). 낮은 용량, 중간 용량, 높은 용량 또는 최대 가능한 용량의 이식편에 포함된 h핵-ir 세포의 입체학적 추정치(도 20b). TH-ir 세포의 입체학적 추정치(도 20c)와 각 그룹에 대한 입체학적 추정치(도 20d)의 정량화를 수행하였다. 이식편 절편은 hGFAP (도 20e), 5-HT (도 20f)에 대해 양성 염색을 보여주었다. 낮은 용량, 중간 용량, 높은 용량 및 최대 가능한 용량의 D17 세포는 h핵 (도 20g), TH (도 20h), 면역형광 3중 표지된 h핵/TH/FoxA2 (도 20i), 및 TH/Girk2/칼빈딘 (도 20j)에 대해 이미지화하였다. 이들 결과는 파킨슨 질환 동물 모델을 사용하여 관찰한 바와 같이 생체 내에서 행동 능력을 회복하기 위해 D17 세포를 투여할 수 있음을 입증한다.
실시예 12
재료 및 방법
[00202] 하기의 방법은 실시예 10-12에 기재된 실험에 사용하였다.
[00203] 병변 및 생착: 암컷 누드 래트는 8-9주령에 병변에 6-OHDA를 투여받았다. 래트가 정위 장치에서 마취된 상태에서 신경 독소를 내측 전뇌 다발에 직접 투여하였다. 래트에게 암페타민을 사용한 병변 치료 후 3주마다 회전계(Rotometer)를 사용하여 측정한 회전 스코어를 매겼다. 성공적인 병변 치료(30분 기간 동안 > 5분 회전)를 나타내는 동물은 암페타민 회전 데이터를 기반으로 실험 치료 그룹에 무작위로 분배하여 세포 또는 차량 대조군을 투여하였다. 새롭게 준비된 세포를 3μL(동물당 45만 세포)의 용적에 150,000세포/μL의 농도로 래트의 선조체에 직접 주사하였다.
[00204] 회전 측정: 병변 치료 후, 동물은 병변 부위 측면을 향해 회전 행동(서클링)을 보여주었고 이는 병변 치료 성공을 지적한다. 상기 행동은 뇌에서 도파민 양을 증가시키는 암페타민을 사용하여 유도되었다. 래트가 5분 동안 챔버에 적응하도록 방치한 후, 90분 동안 회전을 추적하고 5분마다 구간을 지정하여 분당 평균 순 회전 수를 계산하였다. 암페타민 회전은 생착 후 2개월마다 측정하였다(도 1). 아포모르핀 주사를 사용하여 병변이 있는 반구의 반대 방향으로 회전을 추적하였다. 아포모르핀으로 유도된 회전을 60분 동안 추적하고 생착 후 3개월마다 측정하였다(도 2).
[00205] 사후 분석: 래트(6개월)를 마취하고 빙냉 0.9% 식염수에 이어서 4% 파라포름알데히드를 경심동맥으로 관류시켰다. 뇌를 제거하고 4% 파라포름알데히드에 18-24시간 동안 고정시킨 후 슈크로스 농도 구배(10%, 20%, 30%)에 위치시키고 가라앉도록 방치하였다. 모든 뇌를 동결된 슬레지(sledge) 마이크로톰으로 40μm 관상 절편으로 절편화하여 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)과 해당되는 경우 니켈 증진 또는 형광 면역 조직화학을 사용하여 면역조직화학을 위해 가공하였다. TH 및 HuNuclei(1/2 시리즈)의 입체 파라미터는 프레임 크기(80μm x 80μm)와 그리드 크기(350μm x 350μm)로 전체 면적의 9%를 계산하였고 60배율로 계산한 TH(군더센 m=1)의 평균 CE = 0.14를 사용하였다. 이식편을 함유하는 절편 (12번째 절편 마다)은 Ki-67에 대해 염색하였다. 이식편체 전체 면적(100%)은 Olympus Bx61을 사용하여 계산하였다. Ki67+ 세포의 수는 계산된 5개 절편에서 Ki-67+ 세포 수를 합한 값의 12배로 계산한다
실시예 13
시험관내 전구세포의 특징 분석
[00206] 이전의 이식 연구에서는 연구용 iPSC 유래 mDA 뉴런과 동일한 분화 프로토콜을 변형하여 만든 세포를 사용하였다(Hiller et al., 2020; Wakeman et al., 2017). 세포 치료요법 개발의 다음 단계를 위해, cGMP 제조 및 임상 사용에 적합한 공정으로 전환하기 위한 추가 단계를 수행하였다. 임상용 사람 iPSC 라인을 사용하였다. iPSC 마스터 세포 은행과 작업 세포 은행은 cGMP 조건에서 제조되었다. 소분자 억제제의 타이밍과 농도를 변경하여 iPSC-mDA 분화의 초기 단계를 조정하였다. 안전 및 규제 문제를 해결하기 위해 차별화 공정에 사용된 원료는 가능한 경우 임상 등급을 사용하였다. 가장 발달된 성숙 단계(D37)로 분화된 iPSC-mDA 뉴런은 이전에 기재한바 대로 증식 세포를 제거하기 위해 저농도의 미토마이신 C를 사용하여 분화 공정에서 집적되었다. (Hiller et al., 2020) (도 21a). 이러한 접근법은 R&D 등급 G418 세포에 사용되는 약물 선택 카세트의 필요성을 우회하였다. mDA 선조체(D17)와 미성숙(D24) mDA 뉴런은 아직 증식성이 있기 때문에 미토마이신 C로 집적할 수 없으므로, 이 실험의 주요 목표는 (집적 단계 없이) 적응 분화 과정이 이식된 D17 및 D24 세포에서 원치 않는 세포 증식을 방지하기에 적절한지 확인하는 결정하는 것이었다.
[00207] 이전 연구에서는 사람 iPSC-mDA 뉴런이 높은 수준의 국소 중뇌 마커를 발현하고 낮은 수준의 전뇌 및 후뇌 마커를 발현할 수 있다는 증거를 제공했하였다(Hiller et al., 2020; Wakeman et al., 2017). 유사한 유전자 발현 패널을 사용하여 해독 용도에 적합한 분화 공정을 사용하여 만든 세포를 특징 분석하였다(도 21b, 표 5). 모든 분화 단계 (17, 24, 및 37일)는 고수준으로 국소 중뇌 마커 OTX2, FOXA2, 및 LMX1A를 발현하였다. EN1은 D17에서 가장 높게 발현되었고, D24까지 감소했으며, D37 동안 이의 발현 수준을 유지하였다. 보다 성숙한 mDA 마커(NURR1, TH, DAP, GIRK, CALB)는 D17에서 매우 낮은 수준으로 발현되거나 전혀 발현되지 않았으며, D24에서 D37까지 점진적으로 증가함을 보여주었다. PITX3 발현은 D24에서 최고였다. 양호한 생착을 예측하는 것으로 보고된 마커(Kirkeby et al., 2017)인, ETV5 및 SPRY1는 모든 단계에서 발현된 반면 CNPY1은 D17 및 D24에서 낮은 수준으로 발현되었고, D37에서는 거의 검출가능하지 않았다. 운동성(PHOX2A, HB9), 콜린성(CHAT), 글루탐산성(VGLUT1), GABA성(GAD1), 세로토닌성(SERT) 뉴런과 같은 비-mDA 세포 유형에 대한 마커의 발현 수준은 모든 분화 단계에서 낮거나 발현되지 않았다. 가장 많이 발현된 오프-표적 마커는 GLAST로, 배양액에 성상세포 전구체가 일부 존재함을 나타낸다. mDA 뉴런의 동일한 분자 마커의 일부를 발현하는 STN 뉴런의 존재와 일관되게(Kee et al., 2017; Nouri & Awatramani, 2017), DBX1, PITX2, 및 BARHL1의 발현은 모든 분화 단계에서 관찰되었다. 후뇌 마커인 HOXA2는 발현되지 않고, D17-37 전체에서 낮은 수준의 전뇌 마커가 검출되었다. 유동 세포측정은 < 1%의 D17 세포가 FOXG1 또는 PAX6을 발현함을 밝혔고, 이는 전뇌 뉴런 선조체의 부재를 지적한다. 중뇌에서 적핵에서 발현되는 BRN3A이(Agarwala, Sanders, & Ragsdale, 2001; Wallen et al., 1999) 또한 검출되었다. 시험된 모든 시점(D17, D24 및 D37)에서 신경 줄기 세포의 마커인 SOX1이 발현되지 않았고, 이는 배양된 세포가 줄기세포 분화 단계를 통과했음을 지적한다. 3가지 시점 각각에서 신경 선조체 마커 DCX가 발현된 반면, 보다 성숙한 신경 마커 NEUN의 발현은 D17에서 D37로 증가하였다.
표 5
[00208] 이어서 유동 세포측정을 사용하여 단백질 수준에서 mDA 집단을 검사하고(도 22a) 단일 세포 PCR을 사용하여 RNA 수준에서 mDA 집단을 검사하였다(도 31a-i). FOXA2 면역 반응(ir) 세포의 퍼센트는 D17부터 D37까지 높은 비율(>80%)을 유지한 반면, FOXA2와 LMX1의 동시 발현은 D17에서 약 70%였으며, D24에는 90% 이상으로 증가하였다. 상기 FOXA2/LMX1-ir 세포 집단은 D37 배양에서 높은 비율(~85%)을 유지하였다. 예상된 바와 같고 qPCR 결과와 일관되게, D17 샘플에서는 NURR1, MAP2, TH와 같은 더 성숙한 마커가 검출되지 않았다. 이들 3개의 마커의 총 집단 퍼센트는 시간 경과에 따라 증가하여 D24 샘플에서는 각각 약 20%가 면역 반응이 있었고, D37 샘플에서는 50%(NURR1, FOXA2/TH) 또는 90%(MAP2)가 면역 반응이 있었다. 면역세포화학을 사용하여 이러한 세포 집단을 가시적으로 동정하였다(도 22b, 도 29). 유동 세포측정 결과와 일관되게 각 발달 시점의 세포에서 LMX1A와 FOXA2가 높은 퍼센트로 동시 발현되었다. 또한 유동 세포측정과 일관되게 D17에서는 NURR1 및 TH-ir 세포가 존재하지 않았고, D24에서는 소수가 관찰되었으며, D37에서는 더 많은 수의 세포와 더 밝은 개별 세포가 관찰되었다. MAP2는 D17 샘플에서는 검출되지 않았지만 시간 경과에 따라 D37에서 강력한 MAP2-ir로 점점 더 많이 발현되었다. 반대로 네스틴-ir 세포는 D17과 D24 모두에서 풍부했지만 D37에서는 거의 검출되지 않았다. STN 마커인 BARHL1과 PITX2는 모든 시점에서 검출되었고, D17에는 면역 반응 세포가 거의 존재하지 않았고 시간 경과에 따라 검출된 세포 수가 증가하였다. 작은 퍼센트의 D37 세포가 BARHL1을 발현하는데, 이는 STN 뉴런이 NURR1-ir 세포의 소수 서브세트이고 미성숙한 mDA 뉴런보다 훨씬 적다는 것을 시사한다.
[00209] 함께, 이들 데이터는 분화 프로토콜이 STN 및 적핵 세포를 포함하여 SN에 가까운 영역의 세포를 포함하는 주로 중뇌 표현형을 갖는 배양물의 생성을 초래한다는 것을 보여준다. 또한, 전뇌 또는 후뇌 세포의 최소한의 오염이 관찰되었다. D17 세포는 선조체 단계에 있는 것으로 관찰되었고, EN1 이외의 성숙한 mDA 뉴런의 특징인 NURR1 또는 기타 마커를 발현하지 않았다.
실시예 14
이식체 생존율 및 기능에 대한 세포 성숙도의 효과
[00210] 세포 성숙도가 이식체 생존율에 미치는 영향을 평가하기 위해 온전한 무흉선 래트의 선조체에 D17, D24, D37 또는 G418 세포 이식편을 양측으로 주사하였다. 이식 후 3개월 후(도 30a-b), 사람 특이적 신경 세포 부착 분자(hNCAM)에 대해 염색된 관상 절편은 상대적으로 작은 G418 및 D37 이식편을 보여주었고, 숙주 선조체에 신경을 분포시키는 hNCAM-ir 섬유는 거의 없었다. 대조적으로, 대형 hNCAM-ir 이식편 및 이들의 공정은 D17 또는 D24 세포가 생착된 동물에서 볼 수 있었다. 모든 이식편에는 TH-ir 뉴런이 포함되어 있었지만 D17 이식편만 fVM 이식체에서 특징적으로 보이는 것과 유사한 방식으로 세포 구조적으로 배열되었고, 도파민성 세포체가 이식편 주변에 국한되어 있었다 (L. Thompson, Barraud, Andersson, Kirik, & Bjorklund, 2005).
[00211] 변형된 분화 프로토콜이 면역손상된 온전한 래트의 뇌에서 생존 가능한 세포를 생성한 것을 관찰한 후, 본원 발명자들은 장기적인 기능 연구를 수행하였다. 반복적인 d-암페타민 유도 회전으로 확인된 일측 6-OHDA 유도 내측 전뇌 다발(MFB) 병변이 있는 래트에게 비히클 대조군 또는 D17, D24, D37 또는 G418 세포(150,000개 세포/μL, 3μL, n = 9-11/그룹) 및 주사 후 6개월에 희생시켰다. 요약 표 (표 4)는 각각의 세포 유형 및 투여 그룹에 대한 병력학적 및 행동적 소견을 기재한다.
표 4
[00212] 각 세포 유형의 기능적 능력을 입증하기 위해 이식 후 2, 4, 6개월에 기준선(6-OHDA 병변 후 10-11주)에서 d-암페타민 유도 회전 시험을 수행하였다(도 24a). 비히클 또는 D37 이식편을 수용한 헤미파킨슨병 래트는 기능 회복을 입증하지 못하였다. 터키(Tukey)의 사후 시험을 사용한 혼합 효과 ANOVA는 D17, D24 또는 G418 세포를 수용한 래트는가 주사 후 6개월까지 운동 비대칭이 유의적으로(P <0.005, P <0.005, P <0.05) 회복된 것으로 나타났음을 밝혔다. 추가로, D17 이식편을 수용한 동물은 주사 후 4개월까지 회전이 완전히 정규화(P <0.0005)된 것으로 나타났다. 이들 놀라운 결과는 PD 동물 모델을 사용하여 관찰한 것처럼 생체 내 기능 회복을 촉진하는 D17 세포의 우수성을 입증한다.
[00213] 각 세포 유형의 이식체 생존율을 정량화하기 위해 편향되지 않은 정위법을 사용하여 이식편에서 사람 특이적 핵(h핵)을 계수하였다(도 23b, 도 23d). 이들 실험을 바탕으로 추정된 평균(± SD)은 D17 그룹에서 304,303 ± 140,487개의 h핵-ir 세포; D24 그룹에서 266,956 ± 95,419개; D37 그룹에서 52,623 ± 22,955개; 및 G418 그룹에서 108,093 ± 188,944개로 각각 이식된 세포의 67.6%, 59.3%, 11.7%, 24.0%를 나타낸다. 터키 사후 조정을 사용한 일원 ANOVA는 D17(P < 0.005, P < 0.01) 및 D24(P < 0.005, P < 0.05) 세포로 구성된 이식편의 생착과 생존율이 각각 D37 및 G418에 비해 우수함을 입증하였다.
[00214] 과도한 수준의 증식은 뇌내 기형종 발생 위험 증가 또는 계통 제한된 세포(예를 들어, 신경 선조체)의 과다 성장으로 인해 모든 세포 유형을 임상에서 사용할 수 없게 된다. 사람 특이적 Ki-67(hKi-67)의 입체학적 추정 결과, D17 이식편에서 3,412 ± 1,391개의 hKi-67-ir 세포; D24 이식편에서 1,858 ± 2,275개; D37 이식편에서 0 ± 180개; G418 이식편에서 352 ± 697개의 중앙값(±IQR)을 나타냈고, 이는 각각 h핵-ir 세포의 1.2%, 0.6%, 0.0% 및 0.6%만을 나타낸다(도 23c, 도 23e). D17과 G418(P < 0.01) 또는 D37(P < 0.05)와 D24와 D37(P < 0.05), D17과 D37(P < 0.005)의 총 hKi-67-ir 세포 수 간에 h핵-ir 세포 비율로서 Kruskal-Wallis 순위 합계 시험 및 Dwass-Steele-Critchlow-Fligner 사후 시험을 사용한 h핵-ir 세포의 비율로서의 수에 대해 유의미한 차이가 있음을 검출하였다. 이들 발견은 분화 초기에 이식된 세포의 이식편이 이식 후 더 많이 증식하는 세포를 포함하고 있음을 입증한다. D17 및 D24 이식편은 3개월 및 6개월 시점에서 크기가 정성적으로 유사하였고, 이는 이식 직후 증식과 관련된 용적 팽창이 가라앉았음을 시사한다. 중요한 것은 기형종이나 파생물이 인접한 뇌 영역을 압박한다는 증거가 없었다는 것이다.
[00215] 입체학을 사용하여 각 이식편에서 TH-ir 세포의 수를 추정하였고, D17 이식편에서 79,061 ± 44,167개; D24 이식편에서 67,830 ± 25,944개; D37 이식편에서 9,318 ± 5,523개, G418 이식편에서 20,355 ± 23,452개의 평균(± SD)이 관찰되었고, 이들은 각각 추정된 h핵-ir 세포의 24.0%, 25.5%, 16.1%, 및 23.5%를 나타낸다(도 24a-b). 터키 사후 시험을 사용한 일원 ANOVA에서 TH-ir 집단은 D17(P <0.0001, P <0.005) 및 D24(P <0.0005 및 P <0.01) 이식체에서 D37 및 G418 이식체에 비해 각각 유의적으로 보다 컸다. 또한 TH-ir 세포 수율에 있어서도 D17과 D37 간에 유의적인 차이가 있었다(P <0.05).
[00216] 각 세포 유형이 TH-ir 축삭으로 숙주 선조체를 재신경화하는 능력을 평가하기 위해, 발명자들은 이식편의 몸체를 제외한 선조체에서 TH 광학 밀도를 측정하였다. 비히클 처리된 동물의 TH-탈신경화된 선조체와 반대측 온전한 선조체를 기준점으로 사용하여 각각 수득된 최소값과 최대값에 따라 데이터를 0에서 1로 재스케일하고 광학 밀도 단위(ODU)로 전환하였다(도 24c). 본원 발명자들은 D17 처리 동물에서 0.46 ± 0.14 ODU; D24 처리 래트에서 0.29 ± 0.03 ODU; D37 처리 래트에서 0.13 ± 0.09 ODU; 및 G418 처리 래트에서 0.33 ± 0.03 ODU의 평균(± SD)을 계산하였다. D17 이식편은 임의의 다른 세포 유형보다 유의적으로 보다 많은 TH-ir 공정을 갖고(각각 D24, D37, G418에 비해 P <0.0005, P <0.0001, P <0.05), D24(P <0.001) 및 G418(P <0.0005) 세포 둘다는 터키 사후 조정된 일원 AnOVA를 사용한 결과 D37 이식체보다 유의적으로 더 많이 나타났다. 종합하면, 이들 데이터는 발달 초기(즉, D17)에 이식된 세포가 TH와 신경세포의 성장을 위해 집적된 집단을 포함하고 있음을 입증한다.
[00217] FOXA2는 실제 mDA 뉴런의 유도 및 유지에 중요한 역할을 수행한다 (Domanskyi, Alter, Vogt, Gass, & Vinnikov, 2014; Kittappa, Chang, Awatramani, & McKay, 2007). 면역 형광 동시 표지화를 사용하여 h핵/TH-ir 뉴런에서 FOXA2 발현을 결정하였고(도 24d), 대부분의 이식된 세포가 FOXA2를 발현함을 보여주었다. h핵/FOXA2-ir 세포의 상당한 서브세트도 TH를 발현하여 실제 mDA 표현형을 확인하였다.
실시예 15
mDA 전구세포에 의한 긴범위의 부위별 신경 분포
[00218] 장거리 신경 분포 능력은 사람 뇌의 PD를 치료하기 위해 줄기세포 이식을 투여하여 치료학적 반응을 촉진하는 데 매우 유용하다. 세포의 이러한 능력을 평가하기 위해 본원 발명자는 D17 세포 또는 D24 세포를 래트의 SN에 이식하고 전뇌의 이들의 표적에 대한 긴범위의 돌기가 형성되는지 여부를 조사하였다. 이식 후 6개월에서 관상 절편에서 hNCAM 면역 반응성을 평가하여 이식편에서 나오는 섬유와 이들의 표적을 동정하였다(도 25). D24 이식편에서 나온 돌기는 주로 전변연 피질, 후각 결절, 전후각핵, 중격 및 측좌핵의 A10 구조에 신경을 공급하였고, A9 표적인 선조체에는 섬유가 드문드문 분포하였다. 본원 발명자들은 D17 이식편에 의해 전두엽 피질(A10) 외에 동일한 A9 및 A10 표적의 신경 분포가 현저히 더 조밀해지는 것을 관찰하였다. D17 이식 동물과 D24 이식 동물 둘다에서 본원 발명자들은 검사된 대부분의 측두엽 뇌 영역(SN에서 이식편의 가장 측두엽에서 대략 7~8mm)에서 hNCAM-ir 섬유를 관찰하여 섬유가 장거리에 걸쳐 돌기되는 능력을 입증하였다. 이들 결과는 D17 세포가 장거리에서 천연 표적에 신경을 공급하는 데 우수하다는 것을 입증한다.
실시예 16
mDA 전구세포의 용량 반응
[00219] D17 이식편은 증식 문제 없이 가장 강력한 효능, 생존력 및 도파민성 표현형 발현을 입증하였고, 추가 연구를 위해 본원 발명자들에 의해 선택되었다. 최적의 투여 전략을 결정하기 위해, D17 세포의 농도를 초기 검사에 사용된 양보다 낮게 적정하였다. 헤미파킨슨 무흉선 래트에게 3μL의 선조체 이식을 150,000 세포/μL의 최대 가능 용량(MFD), 고용량(40,000 세포/μL), 중간 용량(10,000 세포/μL), 저용량(2,500 세포/μL) 또는 비히클 대조군(n = 8-11/그룹)으로 실시하였다. 이식 후 2개월마다 6개월 동안 d-암페타민으로 유도한 회전을 통해 운동 비대칭을 평가하였고, 상기 시점에서 래트를 희생하고 뇌를 조직학적으로 평가하였다.
[00220] 본원 발명자들은 모든 행동 및 조직학적 분석에서 명확한 용량 반응을 관찰하였다. 비히클 또는 저용량의 이식 세포를 수용한 래트는 d-암페타민 유도 회전 시험에서 기능 회복을 입증하지 못하였다. 터키의 사후 조정을 사용한 혼합 효과 ANOVA에 따르면 중간(P = 0.002), 높음(P <0.0001) 또는 '가능한 최대'(P <0.0001) 용량을 투여한 래트는 이식 후 6개월까지 운동 비대칭이 완전히 정규화된 것으로 나타났다(도 26a). 특히, 높은(P = 0.0002) 또는 '최대 가능'(P < 0.0001) 용량의 이식편은 주사 후 4개월과 같이 조기에 회전을 정규화하는 데 효과적이었다. 또한, 가장 높은 용량을 투여한 2개 그룹의 쥐에서 광범위한 신경 분포로 인해 d-암페타민 유도된 회전이 과도하게 보상되어 이식 전과 반대 방향으로 원을 그리는 현상이 나타났다(도 26a).
[00221] 이식편에서 h핵 염색을 정량화했을 때(도 26b, 도 26e), 생존 세포 수는 용량과 직접적인 상관관계가 있었고, MFD 처리 동물에서 생존 세포의 추정 평균(± SD)은 611,588 ± 53,377, 고용량 동물에서 214,898 ± 91,906, 중간 용량 동물에서 36,848 ± 18,816, 저용량 동물에서 4,604 ± 5,904로 나타났다. 저용량, 중간 용량, 고용량과 비교한 MFD와 중간 용량 및 저용량과 비교한 고용량에 대한 터키 사후 시험(Tukey's post-hoc test)을 사용한 일원 ANOVA에 의해 유의적인 차이를 계산하였다(모든 비교에서 P <0.0001).
[00222] 본원 발명자들은 또한 편향되지 않은 입체학을 사용하여 각 이식편 내의 TH-ir 세포의 수를 정량화하였다(도 26c, 도 26f). 예상한 대로, TH-ir 세포의 수는 용량과 직접적인 상관관계가 있고, MFD 이식편에서 추정 평균(±SD) 59,929 ± 18,927 TH-ir 세포가 있었고; 고용량 이식편에서는 19,973 ± 5,759이었고; 중간 용량 이식편에서는 6,400 ± 4,709이었고; 저용량 이식편에서 1,087 ± 1,471 TH-ir 세포가 있었고, 각각 추정된 h핵-ir 세포의 10.2%, 10.0%, 15.0% 및 7.5%를 나타낸다. 저용량, 중간 용량, 고용량과 비교한 MFD(P < 0.0001)와 중간 용량(P = 0.03) 및 저용량(P = 0.002)과 비교한 고용량에 대해 투키 사후 조정을 사용한 일원 ANOVA를 통해 유의한 차이가 계산되었다.
[00223] TH-ir 공정으로 숙주 조직을 보충하는 각 세포 유형의 능력을 평가하기 위해, 본원 발명자들은 상기된 것과 동일한 방식으로 선조체의 TH 광학 밀도를 측정하고 처리하였다. 선조체를 재신경화하는 돌기는 용량과 상관관계가 있고, MFD, 높은, 중간, 및 낮은 용량 그룹에서 계산된 평균(±SD)은 0.51 ± 0.04 ODU, 0.36 ± 0.16 ODU, 0.13 ± 0.06 ODU, 및 0.09 ± 0.12 ODU이다(도 26d). 일원 ANOVA 및 터키 사후 시험을 통해 저용량(P < .0001), 중간 용량(P < .0001), 및 고용량(P < 0.05)과 MFD를 비교했을 때 유의적인 차이가 발견되었고, 고용량의 경우 중간 용량(P < 0.0001) 및 저용량(P < 0.0001)과 비교했을 때에도 유의적인 차이가 발견되었다.
[00224] 첫 번째 평가시 저용량 그룹은 4,604 ± 5,904개의 h핵-ir 세포와 1,087 ± 1,471개의 TH-ir 세포를 포함했음에도 불구하고 행동 교정이 나타나지 않았다. 추가 검사를 통해 운동 비대칭을 회복하지 못한 생존 이식편이 거의 또는 전혀 없는 5마리의 래트가 밝혀졌다. 대조적으로, 이식 후 6개월까지 이식편(1,827개; 2,068개; 4,100개의 TH-ir 세포가 포함된)이 상당 부분 생존한 래트는 다양한 정도(각각 18%; 49%; 85%의 회전 감소)로 회복되었다. 상이한 용량의 D17 mDA 선조체의 행동 효과를 더욱 면밀히 조사하기 위해 행동 회복을 TH-ir 세포 수 및 TH 광학 밀도와 비교하여 플롯팅하였다(도 27a). 데이터의 비선형적 품질의 관점에서 이러한 상관관계를 평가하기 위해 로그 회귀 분석을 사용하였다. TH 광학 밀도의 경우 r2의 결과 = 0.3625 (P <0.0005)이었고, TH-ir 세포의 경우 r2 = 0.4887 (P <0.00001)의 결과가 관찰되어 기능 회복과 중간 정도의 상관관계가 있음을 나타낸다. 본원 발명자들이 데이터를 저/중간 및 고/MFD 그룹으로 분할했을 때, TH 광학 밀도(r2 = 0.6340; P <0.0005) 및 TH-ir 세포(r2 = 0.3618; P <0.05)에 대해 저/중간 그룹에서 선형 관계가 관찰되었다. 이들 분석에 따르면 도파민성 표현형의 두 가지 측정치 모두에 대해 명확한 천장 효과가 있었지만, 이식편 유래 신경 분포는 더 낮은 용량에서 전반적인 이식편 기능을 나타내는 더 강력한 지표임을 나타낸다.
실시예 17
생체내 mDA 표현형의 특징 분석
[00225] mDA 표현형을 확인하기 위해 주사 후 6개월 시점의 이식편에 면역 형광 삼중 표지화 실험을 수행하였다(도 27b). 이식된 세포의 대부분은 TH/FOXA2를 발현하였고, 대부분의 TH 동시 발현 세포는 이식편 경계에 국한되어 있었다. 추가로, TH/GIRK2(62.6 ± 2.9%)를 발현하는 많은 h핵-ir 세포가 관찰되었고, TH/Calbindin-ir(31.8 ± 1.7%) 세포의 집단은 더 적었고(도 27c). 이는 SN에 이식된 D17 세포의 긴범위의 신경 분포 패턴과 일치하는 A9 및 A10 도파민성 아형을 둘다 나타낸다. TH를 발현하지 않는 일부 GIRK2-ir 세포(3.3 ± 1.2%)가 관찰되었는데, 이는 상완골 또는 상완골 유래일 수 있다. 이들 결과는 D17 세포가 다른 세포에 비해 긴범위 표적에 대한 우수한 신경 분포를 생성한다는 관찰을 뒷받침한다.
실시예 18
증식, 신경교증 또는 세로토닌성 오염에 대한 시험 검사
[00226] 결정적으로, 6개월 후 이식편에서 낮은 수준의 지속적인 증식이 관찰되었고, 이는 hKi-67에 대한 염색 절편에서 수행된 편향 없는 입체학을 통해 결정되었고(도 28a, b) 이전 연구와 일치하였다. 본원 발명자들은 MFD 이식편에서는 2,402 ± 1,006 hKi-67 세포; 고용량 이식편에서는 1,038 ± 741; 중간 용량 이식편에서는 532 ± 745; 저용량 이식편에서는 0 ± 5 TH-ir 세포를 추정하였고, 이들 각각은 추정된 h핵-ir 세포의 0.4%, 0.4%, 1.2% 및 0.0%를 나타낸다. 본원 발명자들은 Kruskal-Wallis 및 Dwass, Steel, Critchlow-Fligner 방법을 사용하여 총 hKi-67-ir 세포 수에 대한 고용량(P = 0.003), 중간 용량(P = 0.004), 낮은 선량(P = 0.003) 그룹과 비교하고 고용량(P = 0.003), 중간 용량(P = 0.04) 그룹과 비교하여 MFD에 대해 유의적인 차이를 계산하였고, 고용량 및 및 '최대 가능한' 용량(P < 0.05)의 퍼센트에 대해 계산하였다. 이번에도 본원 발명자들은기형종 형성의 증거를 보고하지 않았다.
[00227] 이식편 내의 성상세포증 정도를 평가하기 위해 절편을 사람 특이적 GFAP로 염색하였다(도 28c). 본원 발명자들은 면역 반응의 패턴을 관찰했는데, 이는 주로 성상세포체와 함께 이식편의 몸체를 관통하는 긴 섬유와 유사하고, qPCR로 검출된 GLAST 발현과 일치하고 뮤린의 fVM 이식편과 유사하다(L. H. Thompson, Kirik, & Bjorklund, 2008). 본원 발명자들은 이종 이식체에 대한 미세아교세포 반응이 상승했는지 결정하기 위해 Iba1-ir을 평가하였다. 개두술 부위, 경질막 천자 부위 및 이식편 주변부에 근접한 피질 내 주사 부위 근처를 제외하고는 일반적으로 Iba1-ir이 뚜렷하게 나타나지 않았으며, 동물들은 면역 반응성이 약간 증가하거나 미세아교세포가 활성화된 것으로 나타났다. 반응성 형태를 가진 Iba1-ir 미세아교세포는 이식체 둘레 또는 그 근처에서 관찰되었고(중간 용량 그룹의 한 동물은 이식편에서 보다 강한 Iba1-ir을 가졌다), 일부 동물은 개두술 및 경막 천자 부위에 근접한 이식편의 등쪽 부근에서 두꺼워진 공정과 더 강한 염색을 가진 미세아교세포 집단을 가졌다(도 28d). D17 이식편에는 세로토닌성(5-HT) 세포가 거의 포함되어 있지 않았고(도 28e), MFD 이식편에는 약 277 ± 194개의 5-HT-ir 세포(추정 h핵-ir 세포의 0.04%)가 있는 것으로 밝혀졌다(도 28f). 이들 데이터를 종합해 보면 오프-표적 세포 유형이나 숙주 교세포 증식이 전반적으로 부재함을 보여준다.
실시예 19
PD의 치료를 위한 iPSC-유래된 mDA 전구세포
[00228] 상기 실험에 나타낸 바와 같이 성숙한(D37/G418) 뉴런의 이식편은 행동 효과와 조직학적 특징 둘다에서 미성숙 뉴런(D24) 및 선조체(D17)의 이식체의 명백한 차이를 보였다. hNCAM 및 TH 면역 염색을 기반으로 한 이식편 크기 차이는 주사 후 3개월 초에 분명하게 나타났는데, 성숙한(D37/G418) 뉴런은 얇은 연필 모양의 이식편을 형성하고 보다 젊은(D17/D24) 세포는 비교적 큰 이식편을 형성한다. 이식 후 6개월째에, 본원 발명자들은 D17 및 D24 이식편에서 D37 또는 G418에 비해 강력한 도파민성 표현형을 관찰하였고, 이는 D17 및 D24 이식 래트에서 d-암페타민 유도된 운동 비대칭이 완전히 역전된 것으로도 반영되었다. 모든 세포 유형과 용량에서 이식된 세포는 TH/FOXA2를 발현하였고, 생체 내 이식 후 6개월 동안 성숙화가 지속되어 이식된 선조체와 미성숙 뉴런에서 유래한 성숙한 mDA 뉴런을 초래한다는 것으로 확인되었다. D17 및 D24 세포를 뇌내로 이식했을 때, 장거리에서 A9 및 A10 표적 둘다에 대한 우선적인 신경 분포가 관찰되었다. 이들 발견은 fVM 및 ESC-VM 조직에 대한 이전의 관찰 결과와 일치하고(Cardoso et al., 2018; Grealish et al., 2014) 또한 이식편 내 TH/GIRK2-ir 및 TH/Calbindin-ir 세포 둘다를 보여주는 상기 실험에 의해 지지된다. GIRK2와 CALBINDIN은 일반적으로 A9 및 A10 mDA를 구분하는 데 사용되며, 서열분석 및/또는 고급 멀티플렉싱을 사용하여 이들 집단을 추가로 정의할 수도 있다. 이식된 iPSC mDA 세포가 래트의 뇌에서 장거리에 걸쳐 섬유를 돌출할 수 있는 능력은 이들 접근법이 사람의 피각에 적용될 수 있음을 지적한다.
[00229] 사용된 분화 프로토콜에 따라 이식편 유래 TH 면역반응성 섬유가 숙주 선조체 내로 성장하는 데 현저한 차이가 관찰되었다. D17, D24, G418 세포를 이식한 래트는 선조체 전체를 덮고 있는 TH-ir 섬유를 나타냈고, 이식편 유도된 행동 회복이 나타나지 않은 D37 세포를 이식한 래트는 숙주에게 신경을 공급하는 이식편 유래 TH-ir 축삭이 거의 보이지 않았다. 실제로 고배율 이미지에 따르면 이들 이식편에는 TH-ir 세포와 섬유가 포함되어 있지만 이들의 축삭은 D37 이식편의 가장 바깥쪽 가장자리에 도달하자마자 갑자기 끝나는 것으로 나타났다. D17 및 D24 이식편과 D37 및 G418 이식편에서 유사한 수의 TH-ir 세포가 존재하는 것으로 보아, D17 및 G418 세포가 숙주를 신경화하는 성향이 상기 기능의 근간을 이루고 있을 가능성이 높다. 실제로, 더 큰(67,800 TH-ir 세포) D24 이식편과 더 작은(6,400 TH-ir 세포) D17 이식편에서 유사한 행동 결과가 관찰되었고; 어떠한 이론에 얽매이지 않으면서, 이들 발견은 숙주 선조체의 유사한 재신경화 때문일 것으로 예상된다. 회귀 분석 결과, D17 TH-ir 세포의 수와 이들의 공정에 대한 천장 효과가 나타났지만, 낮은 용량에서는 신경 분포가 TH-ir 세포 수보다 행동 회복과 더 높은 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 래트에서 관찰된 이들 결과는 특히 사람에서 개선된 치료학적 반응을 수득하기 위해 중요할 수 있고, 여기서 피각(PD 환자에서 3.96 cm3 (Yin et al., 2009))은 래트 선조체 보다 실질적으로 보다 크다. 사람에서 임상적 이득을 얻기 위해 더 많은 TH-ir 세포와 그 공정이 필요할 수 있고; 세포를 번갈아 또는 조합하여 여러 바늘 관을 따라 여러 부위에 침착시킬 수 있고 이는 아마도 래트에서 나타나는 큰 이식편과 연관된 수익 감소 없이 피각의 전체 재신경화에 도움이 되는 배열일 것이다. 여기서 D17 mDA 선조체가 광범위한 용량에 걸쳐 효과적이라는 것은 임상의가 세포 투여를 위해 다양한 수술적 접근법을 활용할 수 있는 여지가 있음을 지적한다. 사람에 대한 투여 용법을 더욱 최적화하기 위한 추가 연구가 수행될 수 있고 유사한 치료학적 결과가 관찰될 것으로 예상된다.
[00230] 성숙한 세포의 이식편에서 세포의 증식(G418, D37)은 단지 드물게 관찰되었고, 이는 이전의 관찰과 일치하였다(Hiller et al., 2020; Wakeman et al., 2017). D17 및 D24 이식편에는 G418/D37 세포 이식편보다 더 많은 hKi-67-ir 세포가 포함되어 있었지만, 생존한 이식편 세포의 비율로 증식하는 세포의 수는 낮았으며(D17/D24 이식편에서 100,000개의 h핵-ir 당 <1,000개), 이는 바람직하지 않은 세포 증식을 방지하기 위해 정제 단계가 필요하지 않다는 것을 입증한다. 또한, 이식된 임의의 래트에서 활성 세포 분열을 나타내는 클러스터에 hKi-67-ir 세포가 존재하지 않았다. 또 다른 안전성 우려는 fVM을 이식받은 환자 서브세트에서 보고된 GID의 발생이고(Freed et al., 2001; Hagell & Cenci, 2005; Olanow et al., 2009), 세로토닌성 뉴런의 비정상적인 이식이 GID의 발병에 기여함을 시사하였다. iPSC 유래 mDA 전구세포 이식편의 안전성에 대한 추가 증거로서, 본원 발명자들은 GID를 유도하는 것으로 가정된 수에 가까운 수의 세로토닌성 뉴런을 관찰하지 못했다(Carlsson et al., 2009).
[00231] 줄기세포 유래 mDA 세포를 사용한 상기 이식 연구는 일부 구현예에서 선조체 및 미성숙 뉴런 발달 단계를 활용한다. 어떤 이론에 얽매이고 싶지 않지만, 여기에 제공된 mDA 전구세포는 임상 시험에서 성공적으로 사용된 태아 조직의 많은 유익한 효과를 나타낼 수 있을 것으로 예상된다(Li & Li, 2021). 분화 프로토콜의 차이로 인해 여러 연구에 사용된 세포의 발달 단계를 직접 비교하기는 어렵지만, 중개적 용도에 맞게 조정하려는 노력의 초점이 되는 많은 세포는 BDNF, GDNF, TGF-3 및/또는 DAPT와 같은 뉴런 성숙화 인자에 대한 노출을 포함하고 있다(Doi et al., 2020; Kim et al., 2021; Kirkeby et al., 2017; Song et al., 2020). 다양한 발달 단계를 직접 비교한 연구에서 NURR1+ 미성숙 뉴런이 덜 성숙한 선조체보다 더 효과적이라는 결론을 얻었다(Ganat et al., 2012; Qiu et al., 2017). 이와 대조적으로, 상기 연구에 따르면 mDA 패터닝 인자(SMAD 억제, SHH, WNT, FGF8)에 노출되고 NURR1 발현 전에 동결 보존된 D17 세포가 성숙화 인자(D24, NURR1+/-)로 1주일 추가로 배양한 동일한 세포보다 이식편이 더 우수한 성능을 나타냈다. 성숙화 단계 둘다의 세포는 유사한 수로 mDA 뉴런으로 생착하고 성숙하며, 이는 성능 차이가 단순히 증식 잠재력의 차이 때문이 아니라 어떤 이론에 얽매이고 싶지 않지만 신경 분포, A9 패턴화 및/또는 생체 내에서 수신되는 기타 초기 mDA 성숙화 신호의 차이에서 기인할 수 있음을 시사한다. 이식된 세포의 단일 세포 시퀀싱은 이식편에 포함된 다른 비도파민성 세포를 추가로 분석하는 데 사용할 수 있다. 중요한 것은 D17 세포가 적절하게 패턴화되어 있으며 이식 전에 성숙화 인자에 노출될 필요가 없어 mDA 패턴화를 "고정"시키거나 바람직하지 않은(예를 들어, 세로토닌성) 세포 유형의 증식을 방지하는 것으로 관찰되었다는 점이다.
[00232] 어떤 이론에 얽매이고 싶지 않지만, 상기 제공된 데이터는 선조체에 이식할 때 mDA 뉴런이나 전구세포가 너무 성숙하면 일반적으로 생존율이 떨어지고 행동 효과가 덜 뚜렷하다는 생각을 뒷받침한다. 상기 연구는 또한 D17 선조체의 비교적 작은 이식편이 헤미파킨슨병 래트의 행동 회복을 유도하기에 충분한 도파민성 신경 분포를 일으킬 수 있음을 입증한다. 이들 데이터는 각 환자의 선조체의 소수의 위치에 상대적으로 적은 수의 세포를 주사하여 PD의 치료요법을 초래할 수 있다는 생각을 뒷받침하며, 또한 양호한 임상적 안전성이 관찰될 수 있음을 나타낸다.
[00233] 임상 시험에서 시험중인 일부 다른 mDA 선조체 세포는 ESC (NCT04802733) (Piao et al., 2021) 또는 iPSC (JMA-IIA00384, UMIN000033564)로부터 유래되었다(Doi et al., 2020). 상기 데이터는 본원에 제공된 mDA 전구세포(예를 들어, D17 세포)를 PD 치료를 위해 환자에게 투여할 수 있음을 보여준다. 경우에 따라, mDA 전구세포를 면역 억제 약물 또는 용법 및/또는 도파민 대체 치료요법과 함께 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 도파민 대체 치료요법은 mDA 전구세포를 투여한 후에 환자에게 투여되지 않는다. 본원에 제공된 mDA 전구세포(예를 들어, D17 세포)를 선택된 PD 환자에게 투여할 경우 도파민 세포 대체 치료요법을 사용하여 상당한 임상적 이득을 성취할 수 있을 것으로 예상된다.
실시예 20
오프-표적 세포 유형의 수준
[00234] 중뇌 DA 선조체 분화 동안에 부정확한 패턴화는 전뇌(로스트랄(rostral)) 표현형을 가진 신경 선조체와 세로토닌성 세포와 같은 위험한 오프-표적 세포 유형을 생성시킬 수 있다. 전뇌형 세포는 특히 문제가 될 수 있는데, 이는 이전의 DA 뉴런 분화 프로토콜에는 종종 생체 내에서 로제트 구조를 형성할 수 있는 로스트랄(FOXG1+) 및/또는 측면(PAX6+) 세포 유형을 가진 신경 선조체가 포함되어 있어 생착 후 수개월 동안 지속되는 신경 발육이 관찰되었기 때문이다(문헌참조: Kriks et al., 2011). 따라서 배양액에 오프-표적 또는 비도파민성 세포 유형이 있는지 시험하였다.
[00235] FCDI DAPC-1 (17일 DA 선조체) 세포는 실시에 1에 기재된 바와 같이 분화시키고 동결보존하였다(표 2). 세포를 해동하고 DPBS로 세척한 후 17일째 선조체 세포(해동 후 0일, 0DPT)에 대한 유동 세포측정 또는 qPCR 분석을 수행하였다. 대안적으로, 보다 성숙한 세포에서 발현되는 마커의 발현을 평가하기 위해 이후 시점(해동 후 7-20일, 7-20DPT)의 세포를 분석하기 위해 세포를 해동하고 DA 성숙 배지(표 1)에서 배양하였다.
[00236] 유동 세포측정 검정을 사용하여 해동 시 FOXG1 및 PAX6 발현을 모니터링하였다. 6개의 대표적인 가공 배치에 대해 각각 1 또는 2회 (n= 총 9) 개별적으로 해동시킨 후 FOXG1 및 PAX6 유동 세포측정 검정을 수행하였다. 해동 시 평균적으로 FCDI DAPC-1은 표준편차(SD)가 0.1%인 0.1% FOXG1+이고, Sd가 0.7%인 0.4% PAX6+로 나타나 FCDI DAPC-1에 이들 오프-표적 세포 유형에 대한 마커 발현이 부재함을 확인하였다(도 32). 유동 세포측정 검정을 기준으로 잠재적으로 위험한 세포에 의해 발현될 수 있는 비-표적 세포 마커 FOXG1+ 및 PAX6+는 세포 배양에 이러한 전뇌 뉴런 선조체가 매우 낮은 퍼센트로 포함되어 있다. 결과는 표 5에서 하기에 나타낸다.
[00237] 이식편에 세로토닌성 세포가 상당량 포함되면 잠재적으로 위험할 수 있으며 이식편 유도된 운동 이상증에 기여할 수 있다(문헌참조: Carlsson et al., 2009). 세로토닌성 세포의 확실한 마커는 세로토닌(5-HT)과 5-HT 합성의 속도 제한 효소인 트립토판 하이드록실라제-2(TPH2), 및 5-HT 수송체(SERT)를 포함한다. 이들 마커는 성숙한 세포에서만 발현되기 때문에 해동 직후(0DPT)에 FCDI DAPC-1에 대한 검정은 수행하지 않았다. 세로토닌성 세포 선조체에 대한 확실한 마커는 알려진 바가 없다. 세로토닌성 세포가 검출될 수 있는 가장 빠른 시점을 결정하기 위해 qPCR 및 면역조직화학(ICC)을 사용하여 0DPT(해동 후 0일), 7DPT, 14DPT 및 19-20DPT에서 FCDI DAPC-1을 평가하였다. qPCR에 의한 세로토닌성 마커 발현에 대한 양성 대조군으로서 세로토닌성 세포를 함유한 뇌 영역인 사람 폰스(Pons)의 총 RNA 샘플을 포함하였다.
[00238] SERT 및 TPH2의 발현 수준은 0DPT에서 그리고 배양 성숙기 전반에 걸쳐 폰스와 비교하여 FCDI DAPC-1에서 낮은 것으로 관찰되었다(도 33). 결과는 표 6에서 하기에 나타낸다. SERT 발현은 0DPT에서 7DPT 사이에 크게 증가하다가 14DPT 이후에는 현저하게 감소하였다. TPH2는 0DPT에서 19DPT까지 점진적으로 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 마커 둘다에 대해, 7DPT 또는 14DPT 중 어느 하나에서 피크 발현이 나타나며, 14DPT에서의 발현은 서로 다른 DAPC-1 배치에서 일관되게 나타난다(도 34). 결과는 표 7에서 하기에 나타낸다.
[00239] 로그2 정규화된 발현 값이 0.001 미만인 경우 마커로 간주하여 매우 낮은 발현인 것으로 간주되고, 0.0001 미만인 값은 검출되지 않는 것으로 간주되었다. 이들 결과는 qPCR을 사용한 결과 FCDI DAPC-1 배양액 중 세포가 세로토닌성 마커인 SERT 및 TPH2를 매우 낮은 수준으로 발현한다는 것을 나타낸다.
[00240] 세로토닌성 세포의 퍼센트를 결정하기 위해 본원 발명자들은 해동 후 배양 시간 경과에 따라 세포에서 5-HT에 대한 ICC 염색을 수행하였다(도 35). 결과는 표 8에서 하기에 나타낸다. 해동 후 1일(1DPT)에는 필수적으로 5-HT+ 세포가 관찰되지 않았다. 5-HT+ 세포의 유의적인 집단은 8DPT, 15DPT, 및 20DPT에서 관찰되었다. 고함량 이미지화 소프트웨어(Molecular Devices ImageXpress)를 사용하여 정량화한 결과 세로토닌성 뉴런의 퍼센트가 대략 0.2%(0DPT), 3.4%(8DPT), 2.1%(15DPT), 및 5.6%(20DPT)인 것으로 나타났다. 상기 데이터는 DAPC-1에 약 5%의 세로토닌성 뉴런 선조체가 포함되어 있으며, 8DPT를 통해 성숙한(유사 분열 후) 세로토닌 뉴런으로 가시화할 수 있음을 입증한다. 이러한 퍼센트는 시간 경과에 따라 증가하지 않는다.
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재료 및 방법
[00241] 하기의 재료 및 방법은 실시에 13-20에 사용되었다.
[00242] 통계학적 분석: 통계학적 분석은 SAS(투여 연구의 입체적 및 행동적 결과에 대해) 또는 Prism(버전 9.1.2, GraphPad)에서 수행되었다. 그래프는 Prism에서 작성하였다. 면역조직화학 분석 데이터는 사후에 Dwass, Steel, Critchlow-Fligner 방법을 사용한 Kruskal-Wallis 시험으로 분석된 hKi-67을 제외하고 사후에 터키 시험을 사용한 일원 분산 분석으로 분석하였다. 행동 데이터는 터키의 사후 시험을 사용한 일원 분산 분석의 혼합 효과 분석을 통해 분석하였다. 조직학적 데이터는 hKi-67(중앙값 ± IQR)을 제외한 평균 ± SD로 나타내었다. 각 동물에 대한 h핵-ir 세포의 비율로 TH- 또는 hKi-67-ir 세포의 중앙값 퍼센트가 보고되었다. 회전은 평균 ± SEM으로서 보고하였다.
[00243] 세포 분화: 연구용 G418 뉴런(i세포 도파뉴런, 후지필름 셀룰러 다이내믹스)은 앞서 기재한 바와 같이(Hiller et al., 2020; Wakeman et al., 2017) 분화 공정 동안에 뉴런의 G418 약물 선택을 허용하도록 가공된 iPSC 라인을 활용하고 38일차에 뉴런을 동결보존하여 도출하였다. 임상 개발을 위해 세포 치료요법 개발에 적합한 절차와 시약을 사용하여 재프로그래밍된 비가공된 iPSC 라인을 선택하여 cGMP 제조 시설(와이즈만 바이오매뉴팩처링, 위스콘신주 매디슨)에서 마스터 세포 은행(MCB) 및 작업 세포 은행(WCB)으로 확장하였다. 이러한 iPSC 라인에 대해 SMAD 신호전달 억제(LDN-193189, Reprocell)를 단순화하고 GSK-3 억제(CHIR99021, Reprocell)를 하루 늦게 이 시기에 맞게 조정된 더 높은 농도로 2일차를 처리하는 것을 포함하는 iPSC-mDA 분화 프로토콜을 조정하였다. 원료는 임상 개발에 적합하도록 업그레이드되었고, GMP 등급인 Shh C25II, BDNF, GDNF, TGF3(Bio-techne)의 사용을 포함한다. D37 뉴런은 이전에 기재된 바와 같이(Hiller et al., 2020) 미토마이신 C(Tocris, 공정 27일과 29일에 150ng/mL)를 사용하여 공정 중에 정제하고 공정 37일에 CryoStor(Biolife Solutions)를 사용하여 동결 보존하였다. D17 선조체는 동일한 분화 공정을 사용하여 제조되었으나, 전구세포 응집체는 성숙화 배지(Kriks et al., 2011) 또는 미토마이신 C 처리에 노출되지 않고 공정 17일째에 CTS TrypLE Select 효소(Thermo)로 해리되어 동결 보존되었다. D24 미성숙 뉴런을 성숙화 배지에 1주일 동안 배양한 후 미토마이신 C를 처리하지 않고 공정 후반부(공정 24일차)에 동결 보존하였다. iPSC DA 성숙화 단계를 비교하는 데 사용된 세포는 임상 해독에 적합한 제조 공정을 사용하여 연구실에서 생산되었다. 용량 범위 연구를 위해 사용된 D17 세포는 동일한 공정을 사용하여 기밀이 분류되지 않은 제어된 청정 실험실에서 제조되었다.
[00244] qPCR: 세포를 해동시키고, 1:100 베타-머캅토에탄올을 함유한 완충액 RLT Plus(Qiagen0을 사용하여 용해시켰다. 총 RNA는 RNeasy Plus 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하였다. cDNA는 500ng RNA 인풋을 사용한 고용량 RNA-대-cDNA 키트(ThermoFisher)를 사용하여 생성하였다. 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)은 TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스(ThermoFisher), TaqMan 검정(검정 목록에 대해 표 5를 참조한다), 및 2.5 ng의 cDNA 인풋을 사용한 LightCycler480 (Roche)상에서 수행하였다. 값은 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)에 대한 상대적인 값으로 나타낸다. 3개의 생물학적 복제물을 각각의 시점에 대해 분석하였다.
[00245] 유동 세포측정: 세포는 이전에 기재된 바와 같이 (Wakeman et al., 2017) 해동시켰다.세포를 원심분리하고 GhostDye510(Tonbo Biosciences)으로 염색시키고, 4% 포름알데하이드로 고정하고 세척 완충액(DPBS 중에 2% FBS)으로 세척하였다. 세포를 4°C에서 1x BD Perm/Wash(BD Biosciences) +0.2% Triton X-100(Triton X-100이 포함되지 않은 Map2 염색 제외)의 1차 항체로 염색하고(항체 및 희석액 목록은 표 6 참조) 실온에서 2차 항체(해당되는 경우)로 표지화하였다. 유동 세포측정은 MACSQuant® 분석기 10 유동 세포측정기(Miltenyi Biotec.)상에서 수행하였다. 3개의 생물학적 복제물은 각각의 성숙화 시점에 대해 분석하였다.
[00246] 면역세포화학: 세포를 해동하고 96웰 플레이트에 170,000 세포/웰로 씨딩한 후 하룻밤 동안 배양하고 4% 포름알데하이드로 고정하였다. 세포를 4°C에서 1차 항체로 염색 완충액(DPBS 중 2% FBS, 2% 당나귀 혈청, 0.2% Triton X-100)으로 염색하고(항체 및 희석액 목록은 표 6 참조), 실온에서 2차 항체(해당되는 경우) 및 Hoechst(ThermoFisher)로 표지화하였다. 세포는 10배 배율로 ImageXpress 고함량 이미지화기(Molecular Devices)상에서 분석하였다. 3개의 생물학적 복제물을 각각의 시점에 대해 분석하였다.
[00247] 동물 절차: 모든 동물 절차는 러시대학교 의료센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 승인을 받아 수행하였다.
[00248] 병변 유도 및 이식체: 암컷 무흉선 누드 (rnu)래트는 접종 후 1주일 동안 적응시켰다. 9-10주령에 (170~200g) 래트에게 6-OHDA(0.5% 아스코르브산 3μL 중 15mg)를 우측 MFB(전방/후방[AP]: -4.0mm; 내측/측면측 [ML]: 브레그마에서 -1.3mm, 등쪽/중앙[DV]: 경막에서 -7.0mm)으로 단독으로 주사하였다. 병변 후 10주까지 병변이 확인된 동물은 선조체(AP: +0.5mm, ML: 브레그마에서 ±3.0mm, 경막에서 -5.3mm)에 iPSC-mDA 세포(n=8-11/그룹)를 주사하고 이식 후 3개월 또는 6개월에 희생하였다. 동결 보존된 세포를 해동하고 트립판 블루 배제를 통해 세포를 계수하였다. 세포를 원심분리하고 주사에 적합한 밀도로 재현탁하였다. 통합 이식편은 AP: +0.5mm; ML: 브레그마에서 -3.0mm, DV: 경막에서 -5.0mm에 배치하였다. 모든 실험에서 주사 용적은 3 μL이었다. 세포 성숙도 비교 및 통합 내 실험에는 150,000 세포/μL의 농도가 사용되었고, 용량 범위 실험에는 2,500, 10,000, 30,000 또는 150,000 세포/μL의 농도가 사용되었다.
[00249] D-암페타민-유도된 회전: 동물에게 d-암페타민(2.5mg/kg, Sigma)을 복강 내 주사하고, 반투명 챔버의 동력원에 넣은 후 회전계 시스템(San Diego Instruments)에 연결하였다. d-암페타민 투여 후 10~40분 시간동안 순 동측(시계 방향) 회전이 보고되었다.
[00250] 조직 처리: 조직을 처리하고 이전에 기재한 바와 같이 면역 조직학적 및 입체학적 분석을 수행하였다(Hiller et al., 2020). 간략하게, 래트를 케타민/자일라진 혼합물로 마취시키고 생리식염수를 관류한 후 4% 파라포름알데하이드를 관류하였다. 뇌를 제거하고 슈크로스 농도 구배에 놓고 슬라이딩 마이크로톰상에 40mM에서 절편화하였다. 표 6에 나열된 면역 형광 3중 표지화 또는 DAB 처리를 위한 항체 농도를 사용하여 자유 유동 절편을 염색하였다. 절편을 유리 젤라틴 코팅된 슬라이드에 탑재하고 덮개를 씌운 후 이미지화하였다.
[00251] 입체학: 커버 슬립 슬라이드는 편향되지 않은 입체학(StereoInvestigator v10.40, MBF biosciences)으로 분석하였다. 세포 성숙도 비교 실험을 위해 전체 이식편 면적의 5.22%를 염색된 조직의 절반 시리즈(1/12 시리얼 절편)에서 TH, h핵 또는 hKi-67에 대해 프로빙하였다. 용량 범위 실험을 위해 TH-ir 및 h핵-ir 이식편의 5.22%, hKi-67-ir 이식편의 28.4%, 또는 5-HT-ir 이식편의 20.3%를 염색된 조직의 절반 시리즈(1/12 시리얼 절편)에 대해 프로빙하였다. 군더슨 m = 1 오차 계수가 ≥0.45인 저용량 또는 중간 용량 그룹의 동물 또는 h핵- 또는 TH 염색 절편 중 어느 하나에서 세포가 계수되지 않은 경우, 동일한 파라미터를 사용하여 추가로 절반 시리즈(1/12 시리얼 절편)를 염색하고 다시 프로빙하였다. 이어서 전체 시리즈(1/6 시리얼 절편)에 대한 추정치를 계산하고 그 결과를 평균화하였다.
[00252] 광학 밀도: 각 동물에 대해 TH로 염색된 7개의(이식편 중심 ± 3) 관상면 절편의 회색스케일 이미지를 분석하였다. 각 절편에서 이식편의 몸체를 제외한 선조체 주위에 윤곽을 그리고 ImageJ를 사용하여 해당 영역의 평균 픽셀 강도를 기록하였다. 각 동물에 대한 값의 평균값을 구하고, 탈신경화된 선조체의 최소점을 0으로, 온전한 선조체의 최대점을 1로 고려하여 데이터를 재스케일링하였다. 세포 성숙도 비교 및 용량 범위 실험을 위한 데이터 세트는 별도로 재스케일링하였다.
[00253] mDA 서브타입 정량화: 4마리의 MFD 동물로부터의 이식편 절편을 TH/GIRK2/CALBINDIN에 대해 염색하고 NIS Elements AR 소프트웨어(버전 5.10.01)를 사용하여 니콘 A1RHD 카메라가 장착된 Nikon Eclipse Ti2 공초점 현미경으로 이미지화하여 .tiff 파일로 저장하였다. 각 이식편에 있는 53~80개 세포의 마커를 ImageJ(버전 1.53a)를 사용하여 z-스택으로부터 정량화하였다.
[00254] 0-19DPT로부터의 세로토닌성 세포 집단에 대한 qPCR 검정. 해동 시 및 7-, 14- 또는 19- DPT 배양 시 6개의 FCDI DAPC-1 배치에서 SERT 및 TPH2에 대한 RT-QPCR 검정. 각 음영은 해당 시점의 다른 배치를 나타낸다. 폰스는 양성의 대조군 뇌 영역이다. 표에 나타낸 6개 배치 중에서 각각의 검정에 대한 평균 ΔCq (Cq 검정 - Cq GAPDH) 및 표준 편차.
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[00255] 본원에 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 명세서의 내용을 고려하여 과도한 실험없이 만들어 수행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 당업계의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본원에 기술된 방법들, 상기 방법의 단계들 또는 상기 방법 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당업계의 숙련자들에게는 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제의 경우 이들을 사용하여도 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음도 명백할 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌들은, 본원에 기술된 내용에 대하여 예시적인 절차이거나 이를 보충하는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 상세하게 포함된다.

Claims (209)

  1. 하기 신호전달 조절제의 존재 하에 사람 만능 세포를 배양함으로써 생성된 중뇌 도파민성(mDA) 뉴런 전구세포를 포함하는 배양물로서,
    (a) 데카펜타플레직에 대한 작은 모체 (Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)) 신호전달에 대한 제1 억제제,
    (b) 소닉 헤지호그 (Sonic hedgehog(SHH)) 신호전달에 대한 적어도 하나의 활성화제, 및
    (c) 윙리스(wingless) (Wnt) 신호전달에 대한 적어도 하나의 활성화제;
    여기서, 방법이 데카펜타플레직에 대한 작은 모체 (SMAD) 신호전달의 제2 억제제의 존재하에 사람 만능 세포를 배양함을 포함하지 않고;
    상기 사람 만능 세포가 약 360 내지 약 456시간 동안 분화를 유도하기 위한 조건하에서 배양되고, 이어서 상기 세포를 냉장시키거나 동결 보존시키고;
    상기 중뇌 도파민성 전구세포가 포크헤드 박스 단백질 A2 (FOXA2) 및 LIM 호메오박스 전사 인자 1 (LMX1) (FOXA2+/LMX1+ 세포) 둘다를 발현하는, 배양물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 사람 만능 세포가 약 384시간 내지 약 432시간 동안 분화를 유도하기 위한 조건 하에서 배양되는, 배양물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 mDA 뉴런 전구세포가 NURR1을 발현하지 않는, 배양물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 mDA 뉴런 전구세포가 포크헤드 박스 단백질 A2(FOXA2), LIM 호메오박스 전사 인자 1(LMX1) 및 EN1을 발현하는, 배양물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 mDA 뉴런 전구세포가 OTX2을 추가로 발현하는, 배양물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 포크헤드 박스 단백질 A2(FOXA2) 및 LIM 호메오박스 전사 인자 1(LMX1)이 mDA 뉴런 전구세포의 약 60% 내지 약 100% 또는 약 85% 내지 약 95% 이상에 의해 동시 발현되는, 배양물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 mDA 뉴런 전구세포의 약 65-75%가 FOXA2와 LMX1 둘다를 동시 발현하는, 배양물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중뇌 도파민성 전구세포가 FOXA2, LMX1A, ETV5 및 EN1을 발현하고; 상기 중뇌 도파민성 전구세포가 NURR1, TH, CALB1, BARHL1 또는 GRIK2를 발현하지 않는, 배양물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mDA 뉴런 전구세포가 증식하거나 분열하는 세포를 포함하는, 배양물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 mDA 뉴런 전구세포의 적어도 약 40% 이상이 증식하거나 분열하는, 배양물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 mDA 뉴런 전구세포의 약 50-75%가 증식하거나 분열하는, 배양물.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 약 5% 이하의 세로토닌성 뉴런 전구세포를 추가로 포함하는, 배양물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세로토닌성 뉴런 전구세포가 BARLH1을 발현하는, 배양물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 신경교 선조체 세포를 추가로 포함하는, 배양물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 신경교 선조체 세포가 GLAST, SLC13A, CD44, 및/또는 hGFAP를 발현하는, 배양물.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SMAD 신호전달의 억제제가 BMP 억제제인, 배양물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 BMP 억제제가 LDN-193189, 도르소모르핀, DMH-1 또는 노긴(noggin)인, 배양물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 BMP 억제제가 LDN-193189인, 배양물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 LDN-193189가 약 0.2 μM 내지 약 4 μM의 농도, 보다 바람직하게는 약 1 μM 내지 약 4 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 LDN-193189가 약 1 μM 내지 약 3 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 LDN-193189가 약 0.5 μM 내지 약 4 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 LDN-193189가 약 0.5 μM 내지 약 2 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  23. 제19항에 있어서, 상기 LDN-193189가 약 0.2 μM 내지 약 4 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 LDN-193189가 약 0.2 μM 내지 약 2 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  25. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SMAD 신호전달 억제제가 TGFβ 억제제인, 배양물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 TGFβ 억제제가 SB431542인, 배양물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 SB431542가 약 1-20 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  28. 제26항에 있어서, 상기 SB431542가 약 5-15 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  29. 제26항에 있어서, 상기 SB431542가 약 10 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가 배양 1-15일, 1-16일 또는 1-17일째에 SMAD의 억제제와 함께 배양되는, 배양물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 만능 세포가 배양 1-17일째에 SMAD의 억제제와 함께 배양되는, 배양물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가 실질적으로 연속적으로 또는 15일, 16일 또는 17일 동안 매일 SMAD의 억제제와 함께 배양되는, 배양물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 만능 세포가 실질적으로 연속적으로 또는 17일 동안 매일 SMAD의 억제제와 함께 배양되는, 배양물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SMAD의 억제제가 약 50-2000 또는 50-500 nM의 농도로 존재하는, 배양물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 SMAD의 억제제가 약 180-240 nM의 농도로 존재하는, 배양물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 MEK 억제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 배양물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 MEK 억제제가 PD0325901인, 배양물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 PD0325901이 약 0.25-2.5 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MEK 억제제를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 1-3일 동안, 또는 1-3일, 2-4일, 3-5일째에, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 배양물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 MEK 억제제를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 24시간 내지 약 48시간 상기 만능 세포와 접촉시키는, 배양물.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MEK 억제제를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 1-2일에서 시작하여 약 3-4일 동안 매일 또는 실질적으로 연속적으로 상기 만능 세포와 접촉시키는, 배양물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 MEK 억제제를, 1일째에 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 2-5일 또는 3-6일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 배양물.
  43. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달의 활성화제가 GSK3 억제제인, 배양물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 GSK3 억제제가 CHIR99021인, 배양물.
  45. 제44항에 있어서, 상기 CHIR99021이 약 1.5-2 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  46. 제44항에 있어서, 상기 CHIR99021이 약 1.5-1.7 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  47. 제45항에 있어서, 상기 CHIR99021이 약 1.6-1.7 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  48. 제45항에 있어서, 상기 CHIR99021이 약 1.65 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  49. 제44항에 있어서, 상기 CHIR99021이 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 9-17일째에 약 4-7 μM의 농도로 존재하는, 배양물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달의 활성화제를 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 1-3일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 배양물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달의 활성화제를 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 24-48시간 내에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 배양물.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가 실질적으로 연속적으로 또는 14일, 15일 또는 약 16일 동안 매일 Wnt 신호전달의 활성화제와 함께 배양되는, 배양물.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달의 활성화제를 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 2-17일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 배양물.
  54. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SHH 신호전달의 활성화제가 퍼모파민(purmophamine) 또는 C25II Shh인, 배양물.
  55. 제54항에 있어서, 방법이 상기 만능 세포를 SHH 신호전달의 2개의 활성화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 배양물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 SHH 신호전달의 2개의 활성화제가 퍼모파민과 C25II Shh인, 배양물.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SHH 신호전달에 대한 적어도 하나의 활성화제를, SMAD 신호전달의 억제제와 접촉을 개시한 날과 동일한 날에 또는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 24-48시간 이내에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 배양물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 SHH 신호전달에 대한 적어도 하나의 활성화제를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시와 함께 또는 접촉 개시 후 1-7일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 배양물.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 상기 만능 세포를 FGF-8과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 배양물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 FGF-8을, SMAD 신호전달의 억제제와 접촉을 개시한 날과 동일한 날에 상기 만능 세포와 접촉시키지 않는, 배양물.
  61. 제59항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF-8을, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 9-17일 또는 11-17일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 배양물.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF-8이 약 50-200 ng/mL의 농도로 존재하는, 배양물.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가 뉴런 프로모터의 제어 하에 항생제 내성 전이유전자를 포함하는, 배양물.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 세포를 항생제, 화학치료제, DNA 가교결합제, DNA 합성 억제제 또는 유사분열 억제제와 접촉시켜 상기 만능 세포로부터 유래된 신경 세포 또는 중뇌 DA 뉴런을 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 배양물.
  65. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 항생제 또는 화학치료제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 배양물.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 화학치료제가 미토마이신 C인, 배양물.
  67. 제66항에 있어서, 상기 미토마이신 C를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 27, 28, 29 및/또는 30일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 배양물.
  68. 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 항생제가 G418 (게네티신)인, 배양물.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 전에 ROCK 억제제를 포함하는 배지 중에서 상기 만능 세포를 배양 또는 항온처리하는 단계를 추가로 포함하는, 배양물.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 상기 만능 세포를 블레비스타틴과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 배양물.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 블레비스타틴을 분화 5일 및 17일째에 세포와 접촉시키는, 배양물.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mDA 도파민성 전구세포가 NURR1, MAP2 또는 TH를 발현하지 않는, 배양물.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mDA 도파민성 전구세포가 EN1을 발현하는, 배양물.
  74. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mDA 도파민성 전구세포가 GBX2, OTX1, OTX2, ETV5, CORIN, 및/또는 DCX를 발현하는, 배양물.
  75. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가 사람 유도성 만능 줄기 (iPS) 세포인, 배양물.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LMX1이 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (LMX1A)인, 배양물.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 DNAse 또는 엔도뉴클레아제의 존재 하에 사람 만능 세포를 항온처리하는 단계를 추가로 포함하는, 배양물.
  78. 제77항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 DNase I 또는 benzonase®인, 배양물.
  79. 제78항에 있어서, 상기 DNase I 또는 benzonase®가 약 10-20 U/mL의 농도로 존재하는, 배양물.
  80. 제79항에 있어서, 상기 DNase I 또는 benzonase®가 약 10-15 U/mL의 농도로 존재하는, 배양물.
  81. 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사람 만능 세포가, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 4-6일 중 적어도 하나의 날에 엔도뉴클레아제의 존재 하에 배양되는, 배양물.
  82. 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사람 만능 세포가, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 5일째에 엔도뉴클레아제의 존재 하에 배양되는, 배양물.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 컨테이너 수단 중에 포함되는, 배양물.
  84. 제1항 또는 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포가 약제학적 제제 중에 포함되는, 배양물.
  85. 제5항에 있어서, 상기 약제학적 제제가 주사용으로 제형화되는, 배양물.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 약 2,500 세포/μL 내지 약 150,000 세포/μL, 약 2,500 세포/μL 내지 약 100,000 세포/μL, 약 10,000 세포/μL 내지 약 150,000 세포/μL, 약 40,000 세포/μL 내지 약 100,000 세포/μL, 또는 약 15,000-45,000 세포/μL의 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포를 포함하는, 배양물.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물 내 세포의 약 10% 이하, 보다 바람직하게는 약 7% 이하가 세로토닌성 전구세포인, 배양물.
  88. 제87항에 있어서, 상기 배양물 내 세포의 약 5% 이하가 세로토닌성 전구세포인, 배양물.
  89. 제87항에 있어서, 배양물 내 세포의 약 5% 이하가 SERT 및 TPH2를 발현하는, 배양물.
  90. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물 내 세포의 약 0.1-5% 이하가 FOXG1을 발현하고/하거나 배양물 내 세포의 약 0.1-5% 이하가 PAX6을 발현하는, 배양물.
  91. 제90항에 있어서, 상기 배양물 내 세포의 약 1% 미만이 FOXG1을 발현하고/하거나 상기 배양물 내 세포의 약 1% 미만이 PAX6을 발현하는, 배양물.
  92. 포유동물 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 제1항 내지제91항 중 어느 한 항의 치료학적 유효량의 배양물을 투여함을 포함하고, 바람직하게 상기 배양물이 상기 대상체의 뇌에 투여되는, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 포유동물 대상체가 사람인, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 질환이 중추 신경계 (CNS)의 질환인, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 질환이 파킨슨 질환 (PD) 또는 파킨슨 플러스 증후군 (PPS)인, 방법.
  96. 제92항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 engrailed를 발현하지만 NURR1을 발현하지 않는 mDA 전구세포를 포함하는, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 배양물이 대상체의 피각 또는 흑색질과 같은 선조체에 투여되는, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 배양물이 대상체의 선조체 또는 피각에 하나 초과의 위치에 투여되는, 방법.
  99. 제97항에 있어서, 상기 배양물이 대상체의 선조체 또는 피각으로 다중 위치에서 및/또는 다중 바늘관에 투여되는, 방법.
  100. 제96항에 있어서, 상기 배양물이 약제학적 조성물 중에 포함되는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 배양물이 히알루론산 매트릭스를 포함하는, 방법.
  102. 제92항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 약 1e6 내지 약 25e6, 보다 바람직하게 약 3e6 내지 약 9e6 세포를 포함하는, 방법.
  103. 제92항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 약 2,500 세포/μL 내지 약 150,000 세포/μL을 포함하는, 방법.
  104. 제103항에 있어서, 상기 배양물이 약 10,000 세포/μL 내지 약 150,000 세포/μL을 포함하는, 방법.
  105. 제103항에 있어서, 상기 배양물이 약 40,000 세포/μL 내지 약 100,000 세포/μL를 포함하는, 방법.
  106. 제92항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 파킨슨 질환을 갖고, 상기 대상체가 배양물의 투여 후 적어도 하나의 운동 증상에서 개선을 나타내는, 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 대상체가 떨림, 근육 경직, 움직임 둔화, 낙상, 현기증, 움직임 정지, 근육 경련 또는 근긴장이상증 중 하나 이상의 감소를 나타내는, 방법.
  108. 제92항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중뇌 도파민성 전구세포가 적어도 부분적으로 대상체의 선조체 또는 피각을 재신경화하는, 방법.
  109. 제92항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중뇌 도파민성 전구세포가 투여 후 제한된 증식을 나타내는, 방법.
  110. 제92항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물 내 세포의 약 5% 이하가 세로토닌성 세포 또는 세로토닌성 전구세포인, 방법.
  111. 제92항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 투여된 세포의 적어도 80%가 FOXA2 및 LMX1 둘다를 발현하는 분화된 세포로 분화하는, 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 분화된 세포의 적어도 85%가 FOXA2 및 LMX1 둘다를 발현하는, 방법.
  113. 제92항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여된 세포의 적어도 약 60%가 FOXA2 및 LMX1 둘다를 발현하는, 방법.
  114. 제92항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물이 투여 전 극저온으로 동결되는, 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 배양물이 투여 전 액체 질소에서 극저온으로 동결되는, 방법.
  116. 제111항에 있어서, FOXA2 및 LMX1을 발현하는 상기 분화된 세포가 engrailed(EN1), 티로신 키나제(TH), 오르토덴티클 호메오박스 2 (OTX2), 핵 수용체 관련 1 단백질 (NURR1), 뉴런 특이적 부류 III 베타 튜블린 (Tuj1), TTF3, 쌍을 이룬 유사(paired-like) 호메오도메인 3 (PITX3), 아케트-스큐트(achaete-scute) 복합체 (ASCL), 조기 B-세포 인자 1 (EBF-1), 조기 B-세포 인자 3 (EBF-3), 트랜스티레틴 (TTR), 시냅신, 도파민 수송체 (DAT), 및 G-단백질 커플링된, 내향 정류식 칼륨 채널(inwardly rectifying potassium channel) (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 및 CD99로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커를 추가로 발현하는, 방법.
  117. 제116항에 있어서, FOXA2 및 LMX1, 또는 FOXA2 및 TH를 발현하는 상기 분화된 세포가 engrailed, PITX3 및 NURR1을 추가로 발현하는, 방법.
  118. 제111항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물 내 세포의 약 10-25%가 FOXA2 및 티로신 하이드록실라제(TH)를 동시 발현하는, 방법.
  119. 제92항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가 사람 유도성 만능 줄기 (iPS) 세포인, 방법.
  120. 제92항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LMX1이 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (LMX1A)인, 방법.
  121. 제92항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 조성물에서 세포의 약 1% 미만, 바람직하게는 0.5% 미만이 세로토닌성 세포인, 방법.
  122. 제92항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 숙주 신경교증을 초래하지 않는, 방법.
  123. 제92항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 대상체의 뇌에서 비-뉴런 세포의 성장이나 증식이 없거나 본질적으로 없는, 방법.
  124. 제92항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 대상체의 뇌에 mDA 전구세포의 생착 및/또는 mDA 전구세포에 의한 대상체 뇌의 적어도 일부의 신경화를 초래하는, 방법.
  125. 제92항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 주사를 통한 것인, 방법.
  126. 제125항에 있어서, 상기 주사가 정위 주사인, 방법.
  127. 하기의 신호전달 조절제의 존재 하에 사람 만능 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 포크헤드 박스(forkhead box) 단백질 A2 (FOXA2) 및 LIM 호메오박스(homeobox) 전사 인자 1 (LMX1) (FOXA2+/LMX1+ 세포) 둘다를 발현하는 사람 세포를 포함하는 세포 조성물을 제조하는 시험관내 방법으로서,
    (a) 데카펜타플레직에 대한 작은 모체 (Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)) 신호전달에 대한 제1 억제제,
    (b) 소닉 헤지호그 (SHH) 신호전달에 대한 적어도 하나의 활성화제, 및
    (c) 윙리스(wingless) (Wnt) 신호전달에 대한 적어도 하나의 활성화제;
    여기서, 상기 방법이 데카펜타플레직에 대한 작은 모체 (SMAD) 신호전달의 제2 억제제의 존재하에 사람 만능 세포를 배양함을 포함하지 않고;
    상기 사람 만능 세포가 약 360 내지 약 456시간 동안 분화를 유도하기 위한 조건하에서 배양되고, 이어서 상기 세포를 냉장시키거나 동결 보존시키는, 시험관내 방법.
  128. 제127항에 있어서, 상기 사람 만능 세포가 약 384시간 내지 약 432시간 동안 분화를 유도하기 위한 조건 하에서 배양되는, 방법.
  129. 제127항에 있어서, 상기 사람 세포가 NURR1을 발현하지 않는, 방법.
  130. 제127항 또는 제128항에 있어서, 상기 사람 세포가 포크헤드 박스 단백질 A2(FOXA2), LIM 호메오박스 전사 인자 1(LMX1) 및 Engrailed 호메오박스 1(EN1)을 발현하는, 방법.
  131. 제130항에 있어서, 상기 사람 세포가 OTX2을 추가로 발현하는, 방법.
  132. 제127항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 포크헤드 박스 단백질 A2(FOXA2) 및 LIM 호메오박스 전사 인자 1(LMX1)이 사람 세포의 약 65% 내지 약 85% 이상에 의해 동시 발현되는, 배양물.
  133. 제127항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SMAD 신호전달의 억제제가 BMP 억제제인, 방법.
  134. 제133항에 있어서, 상기 BMP 억제제가 LDN-193189, 도르소모르핀, DMH-1 또는 노긴인, 방법.
  135. 제134항에 있어서, 상기 BMP 억제제가 LDN-193189인, 방법.
  136. 제135항에 있어서, 상기 LDN-193189가 약 0.2 μM 내지 약 4 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  137. 제136항에 있어서, 상기 LDN-193189가 약 1 μM 내지 약 3 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  138. 제136항에 있어서, 상기 LDN-193189가 약 0.5 μM 내지 약 4 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  139. 제138항에 있어서, 상기 LDN-193189가 약 0.5 μM 내지 약 2 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  140. 제136항에 있어서, 상기 LDN-193189가 약 0.2 μM 내지 약 4 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  141. 제140항에 있어서, 상기 LDN-193189가 약 0.2 μM 내지 약 2 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  142. 제127항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SMAD 신호전달 억제제가 TGFβ 억제제인, 방법.
  143. 제142항에 있어서, 상기 TGFβ 억제제가 SB431542인, 방법.
  144. 제143항에 있어서, 상기 SB431542가 약 1-20 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  145. 제143항에 있어서, 상기 SB431542가 약 5-15 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  146. 제143항에 있어서, 상기 SB431542가 약 10 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  147. 제127항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가 배양 1-15일, 1-16일 또는 1-17일째에 SMAD의 억제제와 함께 배양되는, 방법.
  148. 제147항에 있어서, 상기 만능 세포가 배양 1-17일째에 SMAD의 억제제와 함께 배양되는, 방법.
  149. 제127항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가 실질적으로 연속적으로 또는 15일, 16일 또는 17일 동안 매일 SMAD의 억제제와 함께 배양되는, 방법.
  150. 제149항에 있어서, 상기 만능 세포가 실질적으로 연속적으로 또는 17일 동안 매일 SMAD의 억제제와 함께 배양되는, 방법.
  151. 제127항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SMAD의 억제제가 약 50-2000 또는 50-500 nM의 농도로 존재하는, 방법.
  152. 제151항에 있어서, 상기 SMAD의 억제제가 약 180-240 nM의 농도로 존재하는, 방법.
  153. 제127항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 MEK 억제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  154. 제153항에 있어서, 상기 MEK 억제제가 PD0325901인, 방법.
  155. 제154항에 있어서, 상기 PD0325901이 약 0.25-2.5 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  156. 제152항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MEK 억제제를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 1-3일 동안, 또는 1-3일, 2-4일, 3-5일째에, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 방법.
  157. 제156항에 있어서, 상기 MEK 억제제를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 24시간 내지 약 48시간에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 방법.
  158. 제153항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MEK 억제제를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 1-2일에서 시작하여 약 3-4일 동안 매일 또는 실질적으로 연속적으로 상기 만능 세포와 접촉시키는, 방법.
  159. 제158항에 있어서, 상기 MEK 억제제를, 1일째에 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 2-5일 또는 3-6일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 방법.
  160. 제127항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달의 활성화제가 GSK3 억제제인, 방법.
  161. 제160항에 있어서, 상기 GSK3 억제제가 CHIR99021인, 방법.
  162. 제161항에 있어서, 상기 CHIR99021이 약 1.5-1.7 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  163. 제162항에 있어서, 상기 CHIR99021이 약 1.6-1.7 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  164. 제162항에 있어서, 상기 CHIR99021이 1.65 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  165. 제161항에 있어서, 상기 CHIR99021이 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 9-17일째에 약 4-7 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  166. 제127내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달의 활성화제를 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 1-3일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 방법.
  167. 제166항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달의 활성화제를 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 24-48시간 내에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 방법.
  168. 제127항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포를 실질적으로 연속적으로 또는 14일, 15일 또는 16일 동안 매일 Wnt 신호전달의 활성화제와 함께 배양되는, 방법.
  169. 제127항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달의 활성화제를 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 2-17일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 방법.
  170. 제127항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SHH 신호전달의 활성화제가 퍼모파민 또는 C25II Shh인, 방법.
  171. 제170항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 SHH 신호전달의 2개 활성화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  172. 제171항에 있어서, 상기 SHH 신호전달의 2개 활성화제가 퍼모파민 및 C25II Shh인, 방법.
  173. 제127항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SHH 신호전달에 대한 적어도 하나의 활성화제를, SMAD 신호전달의 억제제와 접촉을 개시한 날과 동일한 날에 또는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 24-48시간 이내에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 방법.
  174. 제173항에 있어서, 상기 SHH 신호전달에 대한 적어도 하나의 활성화제를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시와 함께 또는 접촉 개시 후 1-7일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 방법.
  175. 제127항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 FGF-8과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  176. 제175항에 있어서, 상기 FGF-8을, SMAD 신호전달의 억제제와 접촉을 개시한 날과 동일한 날에 상기 만능 세포와 접촉시키지 않는, 방법.
  177. 제175항 또는 제176항에 있어서, 상기 FGF-8을, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 9-17일 또는 11-17일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 방법.
  178. 제175항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF-8이 약 50-200 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  179. 제127항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가 뉴런 프로모터의 제어 하에 항생제 내성 전이유전자를 포함하는, 방법.
  180. 제127항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 세포를 항생제, 화학치료제, DNA 가교결합제, DNA 합성 억제제 또는 유사분열 억제제와 접촉시켜 상기 만능 세포로부터 유래된 신경 세포 또는 중뇌 DA 뉴런을 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  181. 제127항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 항생제 또는 화학치료제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  182. 제180항 또는 제181항에 있어서, 상기 화학치료제가 미토마이신 C인, 방법.
  183. 제182항에 있어서, 상기 미토마이신 C를, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 27, 28, 28 및/또는 29일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는, 방법.
  184. 제180항 또는 제181항에 있어서, 상기 항생제가 G418 (게네티신)인, 방법.
  185. 제127항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 전에 ROCK 억제제를 포함하는 배지 중에서 상기 만능 세포를 배양 또는 항온배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  186. 제127항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 블레비스타틴과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  187. 제127항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 블레비스타틴을 분화 5일 및 17일째에 세포와 접촉시키는, 방법.
  188. 제127항 내지 제141항 또는 제147항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 40%의 사람 만능 세포가 분화하여 FOXA2 및 LMX1 둘다를 발현하는, 방법.
  189. 제188항에 있어서, 적어도 60%의 사람 만능 세포가 분화하여 FOXA2 및 LMX1 둘다를 발현하는, 방법.
  190. 제189항에 있어서, 적어도 80%의 사람 만능 세포가 분화하여 FOXA2 및 LMX1 둘다를 발현하는, 방법.
  191. 제189항에 있어서, 적어도 85%의 사람 만능 세포가 분화하여 FOXA2 및 LMX1 둘다를 발현하는, 방법.
  192. 제127항 내지 제141항 또는 제147항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10-25%의 사람 만능 세포가 분화하여 FOXA2 및 티로신 하이드록실라제(TH) 둘다를 발현하는, 방법.
  193. 제127항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가 사람 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포인, 방법.
  194. 제127항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LMX1이 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (LMX1A)인, 방법.
  195. 제188항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, FOXA2 및 LMX1 또는 FOXA2 및 TH를 발현하는 상기 분화된 세포가, EN1, 오르토덴티클 호메오박스 2(OTX2), 뉴런 특이적 부류 III 베타 튜블린 (Tuj1), TTF3, 쌍형 호메오도메인 3 (PITX3), 아케트-스큐트(achaete-scute) 복합체 (ASCL), 조기 B-세포 인자 1 (EBF-1), 조기 B-세포 인자 3 (EBF-3), 트랜스티레틴 (TTR), 시냅신, 도파민 수송체 (DAT), 및 G-단백질 커플링된, 내향 정류식 칼륨 채널(inwardly rectifying potassium channel) (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 및 CD99로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커를 추가로 발현하는, 방법.
  196. 제127항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FOXA2+/LMX1+ 세포가 engrailed (EN1)을 추가로 발현하는, 방법.
  197. 제127항 내지 제194항 중 어느 한 항에 잇어서, 상기 FOXA2+/LMX1+ 세포가 EN1, Pax8, 및 ETV5를 추가로 발현하는, 방법.
  198. 제127항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FOXA2+/LMX1+ 세포가 NURR1을 발현하지 않는, 방법.
  199. 제197항에 있어서, 상기 FOXA2+/LMX1+ 세포가 GBX2, OTX1, OTX2, ETV5, CORIN, 및 DCX를 발현하는, 방법.
  200. 제127항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 조성물에서 세포의 약 5% 이하가 세로토닌성 세포인, 방법.
  201. 제127항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 DNAse 또는 엔도뉴클레아제의 존재 하에 사람 만능 세포를 항온처리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  202. 제201항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 DNase I 또는 benzonase®인, 방법.
  203. 제202항에 있어서, 상기 DNase I 또는 benzonase®가 약 10-20 U/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  204. 제203항에 있어서, 상기 DNase I 또는 benzonase®가 약 10-15 U/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  205. 제201항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사람 만능 세포가, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 4-6일 중 적어도 하나의 날에 엔도뉴클레아제의 존재 하에 배양되는, 방법.
  206. 제201항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사람 만능 세포가, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 5일째에 엔도뉴클레아제의 존재 하에 배양되는, 방법.
  207. 하기 단계를 포함하는 시험 화합물의 스크리닝 방법:
    (a) 제127항 내지 제206항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분화된 FOXA2+/LMX1A+ 세포 또는 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 mDA 전구세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계, 및
    (b) 상기 세포의 기능, 생리학 또는 생존력을 측정하는 단계.
  208. 제207항에 있어서, 상기 측정이 세포의 독성학적 반응 또는 변경된 전기생리학적 반응에 대한 시험을 포함하는, 방법.
  209. 제207항 또는 제208항에 있어서, 상기 세포가 중뇌 도파민성 뉴런 또는 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포인, 방법.
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