ES2643555T3

ES2643555T3 - Método y sistema de cribado de neurogénesis utilizando células madre derivadas de tejido adiposo

Info

Publication number: ES2643555T3
Application number: ES13703492.2T
Authority: ES
Inventors: Chenzhong Kuang; Yan Xiao; Zeina Jouni; Eduard K. POELS; Dirk Hondmann
Original assignee: MJN US Holdings LLC
Current assignee: MJN US Holdings LLC
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2013-01-25
Publication date: 2017-11-23
Anticipated expiration: 2033-01-25
Also published as: AR089987A1; IN2014DN05638A; EP2820415A1; NO2929506T3; PE20142280A1; MX357503B; MX2014009489A; HK1206098A1; SG11201403789SA; RU2014132220A; US20130224782A1; WO2013130196A1; MY167127A; CN104285147B; TWI613446B; TW201346082A; CN104285147A; BR112014019902A8; EP2820415B1; CA2865735A1

Description

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DESCRIPCION

Metodo y sistema de cribado de neurogenesis utilizando celulas madre derivadas de tejido adiposo Campo tecnico

La presente divulgacion se refiere a metodos para identificar compuestos moduladores de neurogenesis, por ejemplo, compuestos que promueven o inhiben la neurogenesis. Mas espedficamente, la divulgacion se refiere a metodos para identificar compuestos que modulan la neurogenesis usando celulas madre derivadas de tejido adiposo (ADSC), y mas particularmente, celulas madre derivadas de tejido adiposo humano (hADSC). La presente invencion esta definida por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier objeto identificado en la solicitud como "invencion", "realizacion", "aspecto", etc., que excede el alcance de la invencion tal como se representa mediante las reivindicaciones, no forma parte de la invencion reivindicada, sino que solo sirve como informacion de fondo para comprender mejor la invencion.

Estado de la tecnica

Los nutrientes cerebrales se han convertido en aditivos cada vez mas importantes en las dietas de bebes, ninos y mujeres embarazadas y lactantes debido a su capacidad para promover el desarrollo temprano del cerebro. Adicionalmente, se buscan continuamente compuestos utiles para tratar enfermedades neurodegenerativas o lesiones cerebrales. Es necesario identificar compuestos neurotoxicos, tales como toxinas ambientales, industriales o dieteticas, con el fin de eliminar o reducir la exposicion a tales compuestos. Los metodos para descubrir tales nutrientes y toxinas a menudo consumen mucho tiempo y son ineficaces. Por consiguiente, existe la necesidad de proporcionar un metodo confiable, consistente y rapido para identificar compuestos que tengan beneficios de desarrollo neurologico. Ademas, es necesario identificar compuestos que son neurologicamente daninos.

Se ha demostrado que las celulas madre, tales como las celulas madre derivadas de tejido adiposo (ADSC), pueden diferenciarse en multiples fenotipos de celulas maduras, incluyendo celulas neuronales, de una manera reproducible (WO2011/050476). En particular, esto se ha demostrado en las celulas madre derivadas de tejido adiposo humano (hADSC). Las hADSC son una herramienta de investigacion particularmente util porque estan facilmente disponibles a partir de fuentes comerciales o procedimientos de liposuccion, y no implican las mismas controversias potenciales que surgen del uso de celulas madre embrionarias. Ademas, las hADSC se obtienen facilmente de un paciente individual, proporcionando asf una oportunidad para la medicina personalizada.

Descripcion de la invencion

Un aspecto de la presente divulgacion proporciona metodos para identificar un compuesto modulador de neurogenesis usando ADSC. Los metodos son utiles para identificar posibles nutrientes cerebrales que se pueden utilizar para complementar las dietas de los lactantes, ninos y mujeres embarazadas y lactantes. Los presentes metodos tambien son utiles para identificar potenciales candidatos a farmacos para el tratamiento de enfermedades neurologicas y lesiones neurologicas. Por ultimo, los presentes metodos son utiles para identificar compuestos que pueden ser neurotoxicos, por ejemplo, compuestos que son perjudiciales para el desarrollo neurologico en fetos, lactantes y ninos. Los compuestos neurotoxicos tambien pueden contribuir a enfermedades neurologicas o pueden interferir con el tratamiento y la curacion de enfermedades y lesiones neurologicas.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un metodo para identificar un compuesto modulador de neurogenesis, que comprende: cultivar celulas madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) en presencia de un compuesto candidato; y determinar el grado de neurogenesis en las ADSC. El procedimiento antes mencionado puede comprender ademas el cultivo de ADSC en ausencia del compuesto candidato, la determinacion del grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en ausencia del compuesto candidato y la comparacion del grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato el grado de neurogenesis de las ADSC cultivadas en ausencia del compuesto candidato. En algunas realizaciones, las celulas madre derivadas de tejido adiposo son celulas madre humanas derivadas de tejido adiposo (hADSC).

Sin estar limitado por ninguna teona en particular, se cree que un aumento en el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato en comparacion con el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en ausencia del compuesto candidato indica que el compuesto candidato es un compuesto promotor de neurogenesis. Por otra parte, una disminucion en el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato en comparacion con el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en ausencia del compuesto candidato indica que el compuesto candidato es un compuesto inhibidor de neurogenesis.

En ciertas realizaciones, el metodo comprende ademas cultivar ADSC en presencia de un compuesto conocido promotor de neurogenesis, tal como acido docosahexaenoico (DHA), determinar el grado de neurogenesis de las ADSC cultivadas en presencia de DHA y comparar el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato en el grado de neurogenesis en las ADSC cultivados en presencia de DHA, en donde un aumento en el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato en comparacion con el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia de DHA indica que el compuesto candidato es un compuesto promotor de neurogenesis.

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En ciertas realizaciones, el grado de neurogenesis se determina observando un cambio en la morfologfa celular de las ADSC. El cambio en la morfologfa celular incluye, sin limitacion, la contraccion del citoplasma celular, la formacion de una neurita, la formacion de una proyeccion de tipo dendntico, la formacion de un axon o cualquier combinacion de los mismos. Los cambios en la morfologfa celular pueden determinarse mediante cualquier metodo de analisis o visualizacion celular. Por ejemplo, el cambio en la morfologfa celular se puede observar mediante microscopfa, tal como la microscopfa de contraste de fases. En otras realizaciones, el grado de neurogenesis se determina observando biomarcadores celulares indicativos de neurogenesis.

En cualquiera de los metodos antes mencionados, las ADSC se cultivan en presencia del compuesto candidato durante un penodo de tiempo suficiente para que se produzca la neurogenesis, por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 dfas. Ademas, las ADSC pueden cultivarse a una temperatura elevada, tal como desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 45°C.

La placa de cultivo utilizado para cultivar las ADSC puede comprender un recubrimiento que promueva o apoya la neurogenesis, tal como un recubrimiento que imita el entorno del nervio central. Por ejemplo, la placa de cultivo puede comprender un recubrimiento que comprende poli-L-ornitina y fibronectina bovina.

El medio utilizado para cultivar las ADSC, en algunas realizaciones, promueve o apoya la neurogenesis. Por ejemplo, el medio puede comprender un medio basal neural, factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico (b-FGF), suplemento de N2 y L-glutamina.

En ciertas realizaciones, el metodo comprende cebar las ADSC durante aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 dfas en un medio de cebado antes de cultivar las celulas en presencia del compuesto candidato. El medio de cebado puede comprender un medio basal neural, EGF, b-FGF y suplemento de N2. Despues del cebado, las ADSC pueden cultivarse en un medio que comprende MesenPRO completo y el compuesto candidato durante aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 dfas.

Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona un metodo para promover la neurogenesis en ADSC, que comprende: cultivar las ADSC en presencia de un compuesto promotor de neurogenesis. En ciertas realizaciones, el metodo comprende ademas determinar el grado de neurogenesis en las ADSC.

Aun otro aspecto de la divulgacion se refiere a un sistema para identificar un compuesto modulador de neurogenesis, que comprende: ADSC, placa de cultivo que comprende un recubrimiento que imita el sistema nervioso central; y un medio de cultivo para promover la neurogenesis. El recubrimiento para la placa de cultivo puede comprender, por ejemplo, fibronectina bovina y poli-L-ornitina. El medio de cultivo puede comprender un medio basal neural, EGF, b- FGF, suplemento de N2 y L-glutamina. En otras realizaciones, el sistema comprende: ADSC, placa de cultivo que comprende un recubrimiento que imita el sistema nervioso central, un medio de cebado y un medio de cultivo. El medio de cebado puede comprender un medio basal neural, EGF, b-FGF y suplemento de N2, mientras que el medio de cultivo puede comprender MesenPRO completo.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama que representa una plataforma de diferenciacion neuronal rapida (RNDP) de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion. Las hADSC se cultivan en un medio de cultivo adecuado y una cantidad apropiada de un compuesto candidato (tratamiento) durante 24-72 horas. Las hADSC se evaluan a continuacion para determinar el grado de neurogenesis.

La Figura 2 es un diagrama que representa una plataforma de diferenciacion neuronal extendida (ENDP) de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion. Las hADSC se cultivan en un medio de cebado adecuado durante un maximo de tres dfas. El medio de cebado se reemplaza entonces con un medio de cultivo adecuado (medio de diferenciacion) y una cantidad apropiada de un compuesto candidato y se cultiva durante 1 a 5 dfas. Las hADSC se evaluan a continuacion para determinar el grado de neurogenesis.

La Figura 3A representa una imagen de contraste de fases de ADSC en un experimento de control. La Figura 3B representa una imagen de contraste de fases de ADSC luego del tratamiento con nutriente cerebral.

La Figura 4A es una imagen de control de un estudio de expresion celular en el que las celulas se tinen con un

anticuerpo contra la protema 2 asociada a los microtubulos (MAP2), un marcador neuronal. La Figura 4B es una imagen

despues del tratamiento con nutriente cerebral en el estudio de expresion con MAP2. La fluorescencia roja (indicada por las franjas blancas) demuestra la expresion de MAP2.

La Figura 5A es una imagen de control de un estudio de expresion celular en el que las celulas se tinen con un

anticuerpo contra nestina, un marcador neuronal. La Figura 5B es una imagen posterior al tratamiento con nutriente

cerebral en el estudio de expresion de nestina. La fluorescencia roja (indicada por las franjas blancas) demuestra la expresion de nestina.

La Figura 6A es una imagen de control de un estudio de expresion celular en el que las celulas se tinen con un anticuerpo contra la protema acida fibrilar glial (GFAP), un marcador neuronal. La Figura 6B es una imagen posterior al

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tratamiento con nutriente cerebral en el estudio de expresion GFAP. La fluorescencia roja (indicada por las franjas blancas) demuestra la expresion de GFAP.

La Figura 7A es una imagen de control de a. estudio de expresion celular en el que las celulas se tinen con un anticuerpo contra tubulina beta III, un marcador neuronal. La Figura 7B es una imagen posterior al tratamiento con nutriente cerebral en el estudio de expresion de tubulina beta III. La fluorescencia roja (indicada por las franjas blancas) demuestra la expresion de tubulina beta III.

Mejor modo para llevar a cabo la invencion

La presente divulgacion proporciona metodos para identificar un compuesto modulador de neurogenesis que comprende: cultivar celulas madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) en presencia de un compuesto candidato, y determinar el grado de neurogenesis en las ADSC.

"Neurogenesis" se refiere a la diferenciacion, generacion o proliferacion de celulas neurales de celulas madre o progenitoras in vitro o in vivo. El grado de neurogenesis se puede determinar mediante una variedad de tecnicas conocidas en el arte, tal como mediante la observacion de cambios morfologicos en las celulas. Cualquier metodo para analisis celular o visualizacion es adecuado para su uso en los presentes metodos. Por ejemplo, los cambios morfologicos en las ADSC pueden observarse usando una tecnica microscopica, tal como microscopfa de contraste de fases. Los cambios morfologicos que indican neurogenesis incluyen, pero no se limitan a, la contraccion del citoplasma y la presencia de neuritas, axones y dendritas. En otras realizaciones, el grado de neurogenesis se determina observando biomarcadores celulares indicativos de neurogenesis, tal como mediante el uso de experimentos de expresion con biomarcadores. Ejemplos de tales biomarcadores incluyen, pero no se limitan a, protemas tales como neurofilamentos, protema basica de mielina, protema 2 asociada a microtubulos (MAP2), nestina, tubulina pIII, protema acida fibrilar glial (GFAP), S100 (una protema de union a calcio), CNPasa y receptor GABA.

Un "compuesto modulador de neurogenesis" se refiere a un compuesto que afecta la neurogenesis, ya sea promoviendo o inhibiendo la neurogenesis. Por tanto, en algunas realizaciones, los compuestos moduladores de neurogenesis promueven la neurogenesis ("compuestos promotores de neurogenesis"), mientras que, en otras realizaciones, los compuestos moduladores de neurogenesis inhiben o reducen la neurogenesis ("compuestos inhibidores de neurogenesis"). Los compuestos identificados como promotores de neurogenesis pueden utilizarse ventajosamente como suplementos en las dietas de los lactantes, ninos y madres embarazadas y lactantes con el fin de promover y apoyar el desarrollo temprano del cerebro. Estos compuestos tambien pueden ser utiles en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas o lesiones neurologicas. Los compuestos identificados como inhibidores de neurogenesis pueden ser toxinas potenciales que deben evitarse o eliminarse de las dietas y ambientes de los lactantes, ninos y mujeres embarazadas y lactantes. Estos compuestos tambien pueden interferir con el tratamiento o curacion de enfermedades o lesiones neurologicas. Por lo tanto, los compuestos inhibidores de neurogenesis tambien pueden evitarse en las dietas y ambientes de individuos que sufren de enfermedad o lesion neurologica.

Un "compuesto candidato" se refiere a cualquier compuesto a ensayar para propiedades moduladoras de neurogenesis utilizando los metodos descritos en la presente memoria. Los compuestos candidatos incluyen, sin limitacion, sustancias de origen natural, compuestos sinteticos o extractos, tales como extractos de tejidos de plantas o animales, hongos o bacterias. El compuesto candidato se puede ensayar individualmente o puede ensayarse en combinacion con otros compuestos candidatos o compuestos moduladores de neurogenesis conocidos con el fin de observar efectos sinergicos o para lograr un cribado de alto rendimiento de compuestos.

En ciertas realizaciones, el metodo comprende ademas proporcionar un cultivo de control negativo de ADSC para comparacion con el compuesto candidato. Por consiguiente, el metodo comprende ademas cultivar ADSC en ausencia del compuesto candidato, determinar el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en ausencia del compuesto candidato y comparar el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato con el punto de neurogenesis de las ADSC cultivadas en ausencia del compuesto candidato. Un aumento en el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato en comparacion con el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en ausencia del compuesto candidato indica que el compuesto candidato es un compuesto promotor de neurogenesis. Por otra parte, una disminucion en el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato en comparacion con el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en ausencia del compuesto candidato indica que el compuesto candidato es un compuesto inhibidor de neurogenesis. El cultivo de control negativo proporciona informacion adicional con respecto a las propiedades moduladoras de neurogenesis de los compuestos candidatos.

En otras realizaciones, el metodo comprende ademas proporcionar un cultivo de control positivo. Por lo tanto, el metodo comprende ademas cultivar ADSC en presencia de un compuesto promotor de neurogenesis conocido, y determinar el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto promotor de neurogenesis. Por ejemplo, se sabe que DHA promueve el desarrollo temprano del cerebro y puede usarse como un control positivo. Por consiguiente, el metodo puede comprender ademas el cultivo de ADSC en presencia de DHA. Un aumento en el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato en comparacion con el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia de DHA indica que el compuesto candidato es un compuesto promotor de neurogenesis superior a DHA.

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Durante la neurogenesis, las ADSC pueden diferenciarse en celulas neuronales, precursores de celulas neuronales y celulas que tienen propiedades neuronales. En consecuencia, el grado de neurogenesis se puede determinar observando cambios morfologicos en las celulas. Los cambios en la morfologfa celular que son indicativos de neurogenesis incluyen, pero no se limitan a, la contraccion del citoplasma celular, la formacion de una neurita, la formacion de una proyeccion tipo dendrita, la formacion de un axon o una combinacion de los mismos. Otros cambios en la morfologfa celular indicativos de neurogenesis incluyen el desarrollo de una morfologfa que se parece a las celulas neuronales bipolares, tripolares y multipolares.

Los cambios anteriormente mencionados en la morfologfa celular se pueden observar mediante una tecnica microscopica, tal como microscopfa de contraste de fases. Las imagenes de microscopfa de contraste de fases de las ADSC pueden tomarse multiples veces durante el cultivo de las ADSC. Por ejemplo, las imagenes pueden tomarse antes del cultivo con el compuesto candidato, y una o mas veces despues de la adicion del compuesto candidato, tal como tres horas despues, y luego una vez al dfa despues de eso.

El grado de neurogenesis puede determinarse adicionalmente midiendo el porcentaje de ADSC que exhiben diferenciacion neuronal y la longitud de las proyecciones citoplasmaticas en las celulas, tales como neuritas, axones y dendritas. El porcentaje de ADSC que exhiben diferenciacion neuronal y longitud de proyecciones citoplasmaticas puede medirse utilizando el software abierto Image J con un conector apropiado.

Los cambios en los biomarcadores celulares se producen durante la neurogenesis. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se utiliza un estudio de expresion celular para marcadores neuronales para determinar el grado de neurogenesis. Ejemplos de tales biomarcadores incluyen, pero no se limitan a, protemas tales como neurofilamentos, protema basica de mielina, nestina, tubulina p-III, protema acida fibrilar glial (GFAP), S100 (una protema de union al calcio), protema 2 asociada a microtubulos (MAP2), CNPasa y receptor GABA. Otras tecnicas para determinar la diferenciacion neuronal incluyen tincion inmunohistologica para marcadores neuronales, mediciones de excitabilidad neuronal y transferencia de Western para la expresion de protemas neurales.

En algunas realizaciones, las ADSC son celulas madre derivadas de tejido adiposo humano (hADSC). Las hADSC pueden mantenerse ventajosamente en cultivo y pasarse facilmente para proporcionar multiples subcultivos. Ademas, las hADSC estan facilmente disponibles porque pueden aislarse del tejido adiposo humano recogido durante los procedimientos de liposuccion de rutina y crioconservarse. Las hADSC tienen la ventaja adicional de que se obtienen facilmente de un paciente individual. Las hADSC obtenidas de este modo pueden utilizarse en los metodos descritos en la presente memoria para cribar un compuesto candidato para uso individualizado. En consecuencia, se puede lograr una nutricion personalizada y optimizada, tratamiento con farmacos o determinacion de la sensibilidad a las neurotoxinas usando los metodos de la presente divulgacion.

Las ADSC pueden cultivarse durante un tiempo suficiente para que se produzca la neurogenesis. La neurogenesis puede ser observada en diferentes tiempos, dependiendo del nutriente cerebral analizado. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la neurogenesis se puede observar despues de unas pocas horas de cultivo, mientras que, en otras realizaciones, la neurogenesis se puede observar despues de varios dfas de cultivo. Por ejemplo, las ADSC pueden cultivarse durante aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 5 dfas, aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 3 dfas, aproximadamente 3 horas hasta aproximadamente 36 horas, aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 24 horas, o aproximadamente 24 hasta aproximadamente 36 horas. Ademas, el cultivo de ADSC puede continuar durante una, dos, tres o cuatro semanas con el fin de lograr una diferenciacion neuronal mas completa. El cultivo de las ADSC puede realizarse adicionalmente a una temperatura elevada, tal como una temperatura por encima de la temperatura ambiente. Tales temperaturas incluyen desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 45°C, aproximadamente 30 hasta aproximadamente 40°C, o aproximadamente 37°C.

En los metodos anteriormente mencionados, las ADSC pueden cultivarse ventajosamente en un medio que apoya o promueve la neurogenesis, por ejemplo, guiando las ADSC para diferenciarse en celulas neuronales. En algunas realizaciones, el medio comprende un medio basal neural, factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico b-FGF, suplemento de N2 y L-glutamina. Los ingredientes para el medio de cultivo estan disponibles a traves de fuentes comerciales. Por ejemplo, el medio basal neural puede ser medio NeurobasalMR, que esta disponible a traves de Invitrogen. El medio NeurobasalMR puede incluir los ingredientes enumerados en la Tabla 1:

Tabla 1: Medio NeurobasalMR

Componentes: Peso Molecular Concentracion (mg/L) mM

Aminoacidos

Glicina: 75 30 0,4

L-Alanina: 89 2 0,0225

Clorhidrato de L-Arginina: 211 84 0,398

L-Asparagina-H2O: 150 0,83 0,00553

L-Cistema: 121 31,5 0,26

Clorhidrato de L-Histidina -H2O: 210 42 0,2

L-Isoleucina: 131 105 0,802

L-Leucina: 131 105 0,802

Clorhidrato de L-Lisina: 183 146 0,798

L-Metionina: 149 30 0,201

L-Fenilalanina: 165 66 0,4

L-Prolina: 115 7,76 0,0675

L-Serina: 105 42 0,4

L-Treonina: 119 95 0,798

L-Triptofano: 204 16 0,0784

L-Tirosina: 181 72 0,398

L-Valina: 117 94 0,803

Vitaminas

Cloruro de Colina: 140 4 0,0286

Pantotenato de D-Calcio: 477 4 0,00839

Acido Folico: 441 4 0,00907

Niacinamida: 122 4 0,0328

Clorhidrato de Piridoxina: 204 4 0,0196

Riboflavina: 376 0,4 0,00106

Clorhidrato de Tiamina: 337 4 0,0119

Vitamina B12: 1355 0,0068 0,000005

i-Inositol: 180 7,2 0,04

Sales Inorganicas

Cloruro de Calcio (CaCh) (anhidro): 111 200 1,8

Nitrato Ferrico (Fe(NOa)a*9H2O): 404 0,1 0,000248

Cloruro de Magnesio (anhidro): 95 77,3 0,814

Cloruro de Potasio (KCl): 75 400 5,33

Bicarbonato de Sodio (NaHCO3): 84 2200 26,19

Cloruro de Sodio (NaCl): 58 3000 51,72

Fosfato de Sodio monobasico (NaH2PO4-H2O): 138 125 0,906

Sulfato de Zinc (ZnSO4-7H2O): 288 0,194 0,000674

Otros Componentes

D-Glucosa (Dextrosa): 180 4500 25

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HEPES: 238 2600 10,92

Piruvato de Sodio: 110 25 0,227

El suplemento de N2 puede ser adquirido a traves de Invitrogen. El suplemento de N2 de Invitrogen puede comprender los siguientes ingredientes:

Tabla 2: Suplemento de N2

Componentes: Peso Molecular Concentracion (mg/L) mM

Protemas

Transferrina Humana (Holo): 10000 10000 1

cadena completa recombinante de Insulina: 5807,7 500 0,0861

Otros componentes

Progesterona: 314,47 0,63 0,002

Putrescina: 161 1611 10,01

selenita: 173 0,52 0,00301

Por ejemplo, el medio puede comprender desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100, aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50, aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25 o aproximadamente 20 ng/mL de EGF. El medio comprende ademas desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 ng/mL, aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50, aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25, o aproximadamente 20 ng/mL de b-FGF. El suplemento de N2 puede estar presente en el medio a una concentracion de aproximadamente 1x y la L-glutamina puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 mM, aproximadamente de 1 hasta aproximadamente 5 mM, o de aproximadamente 1,3 hasta aproximadamente 3 mM. El medio puede comprender ademas una cantidad adecuada del compuesto candidato, por ejemplo, desde aproximadamente 0,1 nM hasta aproximadamente 10 mM, o de 1 nM hasta aproximadamente 1 mM.

En ciertas realizaciones, el medio de cultivo esta sustancialmente libre de suero o, preferiblemente, completamente libre de suero. Un medio de cultivo sustancialmente libre de suero se refiere a un medio que tiene aproximadamente menos de 10% de suero, mas particularmente aproximadamente menos de 2% o 0,1% de suero; en ciertas realizaciones, sustancialmente libre de suero se refiere a menos de aproximadamente 0,5% de suero. Un medio de cultivo completamente libre de suero tiene 0% de suero. Aunque no esta limitado por ninguna teona en particular, se cree que el suero puede contener cantidades inconsistentes e indeterminadas de factores de crecimiento, lo que tiene el potencial de afectar el grado de neurogenesis. Por consiguiente, el medio libre de suero elimina los efectos del suero sobre el grado de neurogenesis. La neurogenesis observada en ADSC cultivadas en medio libre de suero puede atribuirse por lo tanto al compuesto candidato en vez de a la presencia de suero.

Los metodos antes mencionados son utiles en una plataforma de diferenciacion neuronal rapida ("RNDP"). La RNDP puede usarse ventajosamente para cribar rapidamente un gran numero de compuestos moduladores de neurogenesis potenciales. Los compuestos pueden ser cribados rapidamente usando placas de multiples pozos y/o probando varios compuestos a la vez o bibliotecas de compuestos para obtener resultados de alto rendimiento. Los compuestos identificados en la RNDP se investigan adicionalmente usando una plataforma extendida, si se desea.

Un protocolo de diferenciacion neuronal extendido ("ENDP") comprende ademas una etapa de cebado. El ENDP es util para investigar y confirmar los resultados de una RNDP. Aunque no esta limitado por ninguna teona en particular, se cree que el cebado de las ADSC permite una morfologfa neuronal mejorada, proporcionando de este modo un vistazo adicional en el potencial modulador de neurogenesis de un compuesto dado. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las ADSC se ceban antes de cultivar en presencia de un compuesto candidato. Por ejemplo, las ADSC pueden cebarse durante aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 dfas en un medio de cebado adecuado antes de cultivar con el compuesto candidato. En otras realizaciones, las ADSC se ceban durante aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 dfas, o durante aproximadamente 3 dfas.

En algunas realizaciones, el medio de cebado comprende un medio basal neural (tal como Medio NeurobasalMR de Invitrogen), con concentraciones adecuadas de EGF, b-FGF y suplemento de N2. Las concentraciones adecuadas de EGF incluyen aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 ng/mL, aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50, aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25 o aproximadamente 20 ng/mL. Las concentraciones adecuadas de b-

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FGF incluyen aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100, aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50, aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25, o aproximadamente 20 ng/mL de b-FGF. El suplemento de N2 puede estar presente en el medio a una concentracion de aproximadamente 1x. El medio de cebado puede estar sustancialmente libre de suero o, mas preferiblemente, completamente libre de suero. Un medio de cebado sustancialmente libre de suero se refiere a un medio que tiene menos de aproximadamente 10% de suero, por ejemplo, menos de aproximadamente 2% o 0,1% de suero, mientras que un medio de cultivo completamente libre de suero tiene 0% de suero. Ademas, el medio de cebado puede estar libre o sustancialmente libre del compuesto candidato.

En realizaciones en las que las ADSC se ceban antes de cultivarse en presencia de un compuesto candidato, las ADSC se cultivan posteriormente en un medio de cultivo adecuado durante aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 dfas. En otras realizaciones, las ADSC se cultivan durante aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 dfas, o durante aproximadamente 3 dfas. Despues del cebado, el medio de cebado se retira y se anade un medio de cultivo a las ADSC. El medio de cultivo comprende, por ejemplo, MesenPRO completo, disponible a traves de Invitrogen. El medio de cultivo puede comprender ademas una cantidad adecuada del compuesto candidato, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 nM hasta aproximadamente 10 mM, o de 1 nM hasta aproximadamente 1 mM del compuesto candidato. En un experimento de control negativo, el medio de cultivo esta libre o sustancialmente libre del compuesto candidato. En un experimento de control positivo, el medio de cultivo comprende un compuesto promotor de neurogenesis conocido, tal como DHA.

En algunas realizaciones, la placa de cultivo utilizado para cultivar las ADSC esta recubierto con una combinacion unica de protemas de matriz disenadas para imitar el entorno in vivo del sistema nervioso central, maximizar la actividad de diferenciacion neuronal celular y mejorar la union celular. En una realizacion, el recubrimiento comprende poli-L-ornitina y fibronectina plasmatica bovina. La placa de cultivo recubierto puede prepararse poniendo en contacto la placa de cultivo con una solucion de poli-L-ornitina y una solucion de fibronectina bovina. Las etapas de contacto pueden realizarse en cualquier orden, simultaneamente o sustancialmente simultaneamente. Por ejemplo, la placa de cultivo puede ponerse en contacto con la poli-L-ornitina antes de la fibronectina bovina o despues de la fibronectina. Alternativamente, la poli-L-ornitina y la fibronectina bovina se ponen en contacto con la placa de cultivo simultaneamente o sustancialmente simultaneamente.

Otro aspecto de la divulgacion se refiere a un metodo in vitro de promocion de neurogenesis en ADSC que comprende: cultivar las ADSC en presencia de un compuesto promotor de neurogenesis. Las celulas neuronales y las celulas similares a las neuronas generadas por los metodos antes mencionados pueden mantenerse en cultivo, pasadas o crioconservadas. De este modo, el metodo puede proporcionar celulas neuronales humanas y celulas semejantes a neuronas para su uso en el laboratorio, tal como para el cribado de farmacos. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas determinar el grado de neurogenesis en las ADSC, como se describe en los metodos de cribado mencionados anteriormente.

Otro aspecto de la divulgacion se refiere a un sistema para identificar un compuesto modulador de neurogenesis, que comprende: ADSC, placa de cultivo que comprende recubrimiento que imita el sistema nervioso central; y un medio de cultivo. En algunas realizaciones, el recubrimiento comprende fibronectina bovina y poli-L-ornitina. En los sistemas utiles en la RNDP, el medio de cultivo comprende un medio basal neural, EGF, b-FGF, suplemento de N2 y L-glutamina. Los sistemas utiles en el ENDP, comprenden ademas un medio cebador, tal como un medio que comprende un medio basal neural, EGF, b-FGF, suplemento de N2, y medio de cultivo que comprende MesenPRO completo.

Ejemplos

hADSC

Las hADSC utilizadas en los procedimientos siguientes se adquieren a partir de fuentes comerciales y se cultivan en el medio de mantenimiento que consiste en medio MesenPRO Rs completo con suplemento y L-glutamina. El subcultivo de hADSC se realiza cuando el cultivo de celulas alcanza confluencia. Para pasar hADSC, se utiliza el siguiente procedimiento: i) aspirar el medio MesenPRO RS completo de las celulas; ii) enjuagar el area superficial de la capa celular con regulador de solucion salina amortiguada con fosfato (DBPS) de Dulbecco anadiendo DPBS al lado del recipiente opuesto a la capa celular unida y balanceando el recipiente varias veces hacia delante y hacia atras; iii) eliminar el DPBS por aspiracion y descartarlo; iv) separar las celulas anadiendo un volumen suficiente de solucion de tripsina-EDTA precalentada sin rojo de fenol para cubrir la capa de celulas; v) incubar a 37°C durante aproximadamente 7 minutos; vi) observar las celulas bajo un microscopio para determinar si se necesita incubacion adicional; vii) anadir 3 mL del medio de mantenimiento a la placa, mezclar la suspension celular, anadir la suspension a un tubo de centrifugacion de 15 mL y centrifugar a 210 g durante 5 minutos; viii) determinar el numero total de celulas y el porcentaje de viabilidad utilizando un hemacitometro; ix) anadir medio MesenPRO RS completo a cada recipiente de modo que el volumen de cultivo final sea de 0,2 mL - 0,5 mL por cm2; x) sembrar las celulas anadiendo el volumen apropiado de celulas a cada recipiente e incubar a 37°C, 5% de CO2 y 90% de humedad; y xi) tres o cuatro dfas despues de la siembra, retirar completamente el medio y reemplazarlo con un volumen igual de medio MesenPRO RS completo.

Recubrimiento

Antes de sembrar los hADSC pasados en placas de cultivo nuevas, las superficies de la placa de cultivo se lavan tres veces con solucion de DPBS esteril, seguido de multiples enjuagues con agua esteril. La primera capa de recubrimiento es poli-L-ornitina. El recubrimiento se prepara anadiendo 0,1 mg/mL de poli-L-ornitina e incubando a 37°C durante una hora. La placa se lava tres veces con DPBS, 15 minutos por lavado. La segunda capa de recubrimiento es fibronectina 5 plasmatica bovina. La fibronectina se diluye en DPBS a partir de la solucion patron hasta 1:1000 y se anaden 500 |jL a cada pozo. La placa se deja a temperatura ambiente durante una hora. Se realiza un lavado final con 500 jL por pozo de DPBS y se utiliza inmediatamente la placa.

Medios

Las hADSC se pueden mantener en un estado indiferenciado o guiadas para diferenciarse usando diferentes medios de 10 cultivo. Ciertos medios de cultivo son capaces de guiar las ADSC para diferenciarse en celulas neuronales. Los ejemplos de medios se exponen en las Tablas 3, 4 y 5.

Tabla 3.

Medio RNDP libre de suero

Componente: Concentracion final

medio basal neural: 500 mL

EGF: 20 ng/mL

b-FGF: 20 ng/mL

Suplemento de N2: 1X

L - glutamina: 2 mM

Tabla 4

Medio de cebado ENDP libre de suero

Componente: Concentracion final

medio basal neural: 500 mL

EGF: 20 ng/mL

b-FGF: 20 ng/mL

Suplemento de N2: 1X

Tabla 5

Medio de diferenciacion ENDP

Componente: Concentracion final

MesenPRO completo: 500 mL

Protocolo RNDP

Se describen dos protocolos de cribado independientes, designados como plataforma de diferenciacion neuronal rapida 20 (RNDP) y plataforma de diferenciacion neuronal extendida (ENDP). El protocolo RNDP proporciona un cribado rapido de un gran numero de compuestos candidatos en un periodo de tiempo relativamente corto. RNDP permite la rapida identificacion de compuestos que promueven o inhiben la neurogenesis, o que no tienen ningun efecto sobre la neurogenesis. El RNDP puede ser seguido por un ENDP con el fin de investigar y confirmar los resultados.

El medio de subcultivo de las hADSC descritas anteriormente se retira de la placa de cultivo y luego se lava suavemente 25 la placa con 5-10 mL de DPBS esteril. Se separa el DPBS y se anaden 1,5 mL de tripsina-EDTA para cubrir completamente la capa celular. La placa se coloca de nuevo en la incubadora durante siete minutos. La placa se golpea suavemente para separar las celulas por completo, se anaden 3 mL del medio de mantenimiento a la placa y la

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50

suspension celular se mezcla y se anade a un tubo de centnfuga de 15 mL. La densidad celular deseada (1 x 104 celulas/pozo) se lleva a otro tubo de 15 mL y se coloca para centrifugar a 210 g durante 5 minutes. El sedimento celular se resuspende en un volumen apropiado de medio de diferenciacion neuronal rapido libre de suero precalentado como se expone en la Tabla 1 y se siembra en cada pozo de la placa de cultivo de tejidos. Los compuestos candidatos para cada pozo se anaden secuencialmente. La placa se pone de nuevo en la incubadora. Los efectos de los compuestos candidatos se observan rapida y facilmente usando imagenes de microscopfa de contraste de fases, que se toman generalmente una vez inmediatamente antes del tratamiento, tres horas despues del tratamiento y cada dfa durante tres dfas. Con un tiempo de rotacion rapido, los mejores resultados tfpicamente ocurren dentro de las 36 horas. Despues de recolectar las imagenes, se realiza el analisis de datos y la comparacion para determinar la efectividad de cada compuesto o mezcla de compuestos en la modulacion de neurogenesis. La diferenciacion neuronal se determina observando la morfologfa neuronal. Algunos cambios en las celulas incluyen el encogimiento del citoplasma, la formacion de axones y proyecciones citoplasmaticas de tipo dendntico. Estos cambios comienzan con el citoplasma de las hADSC retrocediendo hacia el nucleo para formar cuerpos celulares contrafdos con extensiones citoplasmaticas. Las celulas eventualmente desarrollan una morfologfa que se parece a las celulas neuronales bipolares, tripolares y multipolares.

Protocolo ENDP

El protocolo ENDP proporciona un metodo para una investigacion adicional de los resultados del RNDP y tambien permite un tiempo adicional para cebar las hADSC para diferenciacion adicional en varios linajes de celulas neuronales. Aunque no esta limitado por ninguna teona en particular, el cebado impulsa la transdiferenciacion de las hADSC desde linajes mesodermicos hasta ectodermo neural.

Las hADSC se siembran en placas de cultivo con superficies recubiertas y se hacen crecer en medio de cebado ENDP sin suero (vease la >tabla 2) durante al menos 72 horas. El medio de cebado se retira y se anade medio de diferenciacion neuronal (vease la Tabla 3) en presencia o ausencia de al menos un compuesto candidato. Los cultivos se incuban a continuacion durante un pertedo de tiempo prolongado para un desarrollo neuronal adicional. Despues de tres dfas de incubacion, las celulas se examinan bajo microscopio para cambios morfologicos. El porcentaje y la longitud de las neuritas se pueden medir usando software abierto de Imagen J con un conector apropiado. Las celulas pueden estudiarse adicionalmente para diversos marcadores neuronales para confirmar adicionalmente la diferenciacion neuronal.

Descubrimiento de nutrientes cerebrales

El proposito de esta investigacion es determinar el efecto de neurogenesis de diversos nutrientes (compuestos candidatos) utilizando plataformas tanto RNDP como ENDP. Los compuestos candidatos se ensayan individualmente y se comparan con el control positivo, acido docosahexaenoico (DHA), y el control negativo. El medio libre de suero precalentado contiene medio basal neural con L-glutamina, 20 ng/mL de b-FGF, 20 ng/mL de EGF y suplemento de N2. El compuesto candidato se anade a pozos individuales a diversas concentraciones en el medio libre de suero. Los compuestos candidatos se seleccionan del grupo que consiste en ARA, EPA (acido cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoico) y resveratrol. Los compuestos se ensayan en concentraciones variables, que vanan en el intervalo nanomolar a micromolar. Los compuestos se ensayan individualmente y se comparan con el control positivo, acido docosahexaenoico (DHA), y el control negativo. Los experimentos se repiten por triplicado. Los nutrientes que se encuentran que promueven neurogenesis o que demuestran uso como medicamento se criban adicionalmente en diversas combinaciones. Estos experimentos tambien se repiten por triplicado.

Los efectos de los compuestos candidatos se observan facil y rapidamente bajo microscopfa de contraste de fases durante hasta una semana con imagenes usualmente tomadas una vez inmediatamente antes del tratamiento con el compuesto candidato, tres horas despues del tratamiento y despues cada dfa durante tres dfas. Con un tiempo de rotacion rapido, los mejores resultados tfpicamente ocurren dentro de las 36 horas. Despues de recolectar las imagenes, se realiza el analisis de datos y la comparacion para determinar la eficacia de cada compuesto o combinacion de compuestos en la promocion de neurogenesis. La diferenciacion neuronal esta determinada por la morfologfa neuronal. Algunos de estos cambios incluyen la contraccion del citoplasma y la formacion de axones y proyecciones citoplasmaticas tipo dendrita (neuritas). Estos cambios comienzan con el citoplasma de las hADSC retrocediendo hacia el nucleo para formar cuerpos celulares contrafdos con extensiones citoplasmaticas. Las celulas eventualmente desarrollan una morfologfa que se parece a las celulas neuronales bipolares, tripolares y multipolares.

De los compuestos candidatos anteriores, resveratrol, ARA, EPA, colesterol y DHA son ejemplos de compuestos que efectivamente promueven la neurogenesis. Las concentraciones de ensayo y las concentraciones eficaces se muestran en la tabla 6:

Tabla 6: Ejemplos de compuestos identificados como promotores eficaces de neurogenesis

Compuesto: Intervalo de analisis Intervalo de efectividad

DHA: 1nM -1mM 5-20 |jM

ARA: 1nM -1mM 2-10 jM

EPA (Acido Cs-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoico): 1nM -1mM 10-40 jM

Colesterol: 1|jM - 10|jM 50-200 jM

Resveratrol: 100nM -50mM 20 jM -20 mM

Todas las referencias a caractensticas o limitaciones singulares de la presente divulgacion incluiran la correspondiente caractenstica o limitacion plural, y viceversa, a menos que se especifique lo contrario o se indique claramente lo contrario por el contexto en el que se hace la referencia.

5 Todas las combinaciones de procedimientos o etapas de procedimiento tal como se usan en la presente memoria pueden realizarse en cualquier orden, a menos que se especifique de otro modo o este claramente implfcito lo contrario por el contexto en el que se hace la combinacion referenciada.

Los metodos y composiciones de la presente divulgacion, incluyendo sus componentes, pueden comprender, consistir o consistir esencialmente en los elementos esenciales y limitaciones de las realizaciones descritas en la presente 10 memoria, asf como cualquiera de los ingredientes, componentes o limitaciones adicionales u opcionales descritos en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el termino "aproximadamente" debe interpretarse para referirse a ambos numeros especificados en cualquier intervalo. Cualquier referencia a un intervalo debe considerarse como soporte de cualquier subconjunto dentro de ese intervalo.

15

Claims

5

10

15

20

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30

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo para identificar un compuesto modulador de neurogenesis, que comprende:

cultivar celulas madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) en presencia de un compuesto candidate;

determinar el grado de neurogenesis en las ADSC;

cultivar ADSC en presencia de acido docosahexaenoico (DHA);

determinar el grado de neurogenesis de las ADSC cultivadas en presencia de DHA; y

comparar el grado de neurogenesis en las ADSC cultivados en presencia del compuesto candidato con el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia de DHA, en donde un aumento en el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato comparado con el grado de neurogenesis en las ADSC cultivados en presencia de DHA indica que el compuesto candidato es un compuesto promotor de neurogenesis.
2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende, ademas: cultivar ADSC en ausencia del compuesto candidato,

determinar el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en ausencia del compuesto candidato, y

comparar el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato con el grado de neurogenesis de las ADSC cultivadas en ausencia del compuesto candidato.
3. El metodo de la reivindicacion 2, en donde un aumento en el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato comparado con el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en ausencia del compuesto candidato indica que el compuesto candidato es un compuesto promotor de neurogenesis.
4. El metodo de la reivindicacion 2, en donde una disminucion en el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en presencia del compuesto candidato comparado con el grado de neurogenesis en las ADSC cultivadas en ausencia del compuesto candidato indica que el compuesto candidato es un compuesto inhibidor de neurogenesis.
5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el grado de neurogenesis se determina observando un cambio en la morfologfa celular de las ADSC.
6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el cambio en la morfologfa celular es la contraccion del citoplasma celular, la formacion de una neurita, la formacion de una proyeccion similar a la dendrita, la formacion de un axon o una combinacion de los mismos.
7. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el cambio en la morfologfa celular se observa por microscopfa.
8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que el cambio en la morfologfa celular se observa mediante microscopfa de contraste.
9. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las celulas madre derivadas de tejido adiposo son celulas madre derivadas de tejido adiposo humano (hADSC).
10. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las ADSC se cultivan en presencia del compuesto candidato durante 1 a 5 dfas.
11. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las ADSC se cultivan en un medio que comprende un medio basal neural, EGF, b-FGF, suplemento de N2 y L-glutamina.
12. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas el cebado de las ADSC durante 1 a 5 dfas en un medio de cebado antes de cultivar las celulas en presencia del compuesto candidato.
13. El metodo de la reivindicacion 12, en el que el medio de cebado comprende un medio basal neural, EGF, b-FGF y suplemento de N2.
14. El metodo de la reivindicacion 12, en el que las ADSC se cultivan en presencia del compuesto candidato durante 1 a 5 dfas.