CN104285147B - 使用脂肪组织衍生的干细胞的神经发生筛选方法和系统 - Google Patents

使用脂肪组织衍生的干细胞的神经发生筛选方法和系统 Download PDF

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Abstract

本发明提供的是用于鉴定神经发生‑调节化合物的方法，包括：在候选化合物存在时培养脂肪衍生的干细胞(ADSC)，和确定ADSC中的神经发生程度；以及用于鉴定神经发生调节化合物的系统。还提供的是促进ADSC中的神经发生的方法。

Description

使用脂肪组织衍生的干细胞的神经发生筛选方法和系统
技术领域
本公开内容涉及用于鉴定神经发生-调节化合物(例如促进或抑制神经发生的化合物)的方法。更具体地讲，本公开内容涉及使用脂肪衍生的干细胞(ADSC)、更尤其是人脂肪衍生的干细胞(hADSC)鉴定神经发生-调节化合物的方法。
背景技术
脑营养素在婴儿、儿童以及孕妇和哺乳期妇女的饮食中已经成为日益重要的添加剂，因为它们能够促进早期脑发育。另外，一直都在寻找用于治疗神经变性性疾病或脑损伤的化合物。需要鉴定神经毒性化合物，例如环境毒素、工业毒素或饮食毒素，以便除去或减少对这类化合物的暴露。发现这样的营养素和毒素的方法通常特别耗时和低效。因此，需要提供用于鉴定具有神经学开发效益的化合物的可靠、稳定而快速的方法。另外，需要鉴定对神经有害的化合物。
已经证明了干细胞(例如脂肪衍生的干细胞(ADSC))可以以可复制的方式分化为多种成熟细胞表型，包括神经元细胞。具体地讲，在人类脂肪衍生的干细胞(hADSC)中已经证明了这一点。hADSC是特别有用的研究工具，因为它们容易得自商业来源或抽脂术，并且它们并不牵涉使用胚胎干细胞所产生的相同可能的争议。此外，hADSC容易得自单个患者，因而提供个性化医疗的机会。
发明内容
本公开内容一方面提供使用ADSC来鉴定神经发生-调节化合物的方法。所述方法用于鉴定可用于补充婴儿、儿童、孕妇和哺乳期妇女的饮食的潜在的脑营养素。本方法还用于鉴定用于治疗神经病和神经损伤的潜在药物候选物。最后，本方法用于鉴定可能具有神经毒性的化合物，例如对胎儿、婴儿和儿童的神经发育有害的化合物。神经毒性化合物还可能促成神经病或可能干扰对神经病和损伤的治疗和康复。
因此，在某些实施方案中，本公开内容提供用于鉴定神经发生-调节化合物的方法，包括：在候选化合物存在时培养脂肪衍生的干细胞(ADSC)；和确定ADSC中的神经发生程度。前述方法可以进一步包括在所述候选化合物不存在时培养ADSC，确定在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度，并且将在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度进行比较。在某些实施方案中，所述脂肪衍生的干细胞是人脂肪衍生的干细胞(hADSC)。
不受任何具体理论的束缚，认为与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度增加，表明所述候选化合物是神经发生-促进化合物。另一方面，与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度减少，表明所述候选化合物是神经发生-抑制化合物。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括在已知神经发生-促进化合物例如二十二碳六烯酸(DHA)存在时培养ADSC，确定在DHA存在时培养的ADSC的神经发生程度，并且将在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度与在DHA存在时培养的ADSC中的神经发生程度进行比较，其中与在DHA存在时培养的ADSC中的神经发生程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度增加，表明所述候选化合物是神经发生-促进化合物。
在某些实施方案中，神经发生程度是通过观测ADSC的细胞形态学变化而确定。细胞形态学的变化包括但不限于细胞质收缩、神经突形成、树突样突出的形成、轴突形成或其任何组合。细胞形态学的变化可通过细胞分析或目测的任何方法而确定。例如，细胞形态学的变化可通过显微镜例如相差显微术而观测。在其它实施方案中，神经发生程度通过观测指示神经发生的细胞生物标记而确定。
在任何前述方法中，在所述候选化合物存在时培养ADSC足以发生神经发生的一段时间，例如大约1至大约5天。此外，可以在升高的温度例如大约25至大约45℃下培养ADSC。
用于培养ADSC的培养器皿可包含促进或支持神经发生的涂层(coating)，例如模拟中枢神经环境的涂层。例如，培养器皿可包含包括多聚-L-鸟氨酸和牛纤连蛋白的涂层。
在某些实施方案中，用于培养ADSC的培养基促进或支持神经发生。例如，所述培养基可包含神经基础培养基、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、N2补充物和L-谷氨酰胺。
在某些实施方案中，所述方法包括在所述候选化合物存在时培养所述细胞之前，在启动培养基(priming medium)中启动ADSC大约1至大约5天。所述启动培养基可包含神经基础培养基、EGF、b-FGF和N2补充物。启动之后，ADSC可以在包含完全MesenPRO和所述候选化合物的培养基中培养大约1至大约5天。
本公开内容的另一方面提供促进ADSC中的神经发生的方法，包括：在神经发生促进化合物存在时培养ADSC。在某些实施方案中，所述方法进一步包括确定ADSC中的神经发生程度。
本公开内容的再一方面涉及用于鉴定神经发生-调节化合物的系统，包括：ADSC；包含模拟中枢神经系统的涂层的培养器皿；和促进神经发生的培养基。用于培养器皿的涂层可包含例如，牛纤连蛋白和多聚-L-鸟氨酸。所述培养基可包含神经基础培养基、EGF、b-FGF、N2补充物和L-谷氨酰胺。在其它实施方案中，所述系统包括：ADSC、包含模拟中枢神经系统的涂层的培养器皿、启动培养基和培养基。所述启动培养基可包含神经基础培养基、EGF、b-FGF和N2补充物，而所述培养基可包含完全MesenPRO。
附图简述
图1是描绘根据本公开内容的实施方案的快速神经元分化平台(RNDP)的图解。将hADSC在合适的培养基和合适量的候选化合物中(处理)培养24-72小时。然后评价hADSC以确定神经发生程度。
图2是描绘根据本公开内容的实施方案的扩展的神经元分化平台(ENDP)的图解。将hADSC在合适的启动培养基中培养至多3天。然后将启动培养基更换为合适的培养基(分化培养基)和合适量的候选化合物并培养1-5天。然后评价hADSC以确定神经发生程度。
图3A描绘了对照实验中的ADSC的相差图像。图3B描绘了脑营养素处理后的ADSC的相差图像。
图4A是来自细胞表达研究的对照图像，其中细胞用针对微管相关蛋白2 (MAP2)(一种神经元标记)的抗体染色。图4B是在MAP2表达研究中的脑营养素处理后图像。红色荧光(用白色条纹指示)显示MAP2的表达。
图5A是来自细胞表达研究的对照图像，其中细胞用针对巢蛋白(一种神经元标记)的抗体染色。图5B是在巢蛋白表达研究中的脑营养素处理后图像。红色荧光(用白色条纹指示)显示巢蛋白的表达。
图6A是来自细胞表达研究的对照图像，其中细胞用针对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(一种神经元标记)的抗体染色。图6B是在GFAP表达研究中的脑营养素处理后图像。红色荧光(用白色条纹指示)显示GFAP的表达。
图7A是来自细胞表达研究的对照图像，其中细胞用针对βIII微管蛋白(一种神经元标记)的抗体染色。图7B是在βIII微管蛋白表达研究中的脑营养素处理后图像。红色荧光(用白色条纹指示)显示βIII微管蛋白的表达。
实施本发明的最佳方式
本公开内容提供用于鉴定神经发生-调节化合物的方法，包括：在候选化合物存在时培养脂肪衍生的干细胞(ADSC)，和确定ADSC中的神经发生程度。
“神经发生”是指在体外或体内自干细胞或祖细胞向神经细胞的分化、产生或增殖。神经发生程度可通过本领域已知的多种技术来确定，例如通过观测细胞形态学变化。细胞分析或目测的任何方法都适用于本方法。例如，可使用显微镜技术例如相差显微术观测ADSC的形态学变化。指示神经发生的形态学变化包括但不限于细胞质收缩以及神经突、轴突和树突的存在。在其它实施方案中，通过观测指示神经发生的细胞生物标记，例如通过使用生物标记表达实验，确定神经发生程度。这样的生物标记的实例包括但不限于蛋白质例如神经丝、髓鞘碱性蛋白、微管相关蛋白2(MAP2)、巢蛋白、β-III微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、S100 (一种钙结合蛋白)、CNPase和GABA受体。
“神经发生-调节化合物”是指通过促进或抑制神经发生而影响神经发生的化合物。因此，在某些实施方案中，神经发生-调节化合物促进神经发生(“神经发生-促进化合物”)，而在其它实施方案中，神经发生-调节化合物抑制或减少神经发生(“神经发生-抑制化合物”)。鉴定为促进神经发生的化合物可以有利地用作婴儿、儿童、孕妇和哺乳母亲的饮食补充物，以促进和支持早期脑发育。这些化合物也可用于治疗神经变性疾病或神经损伤。鉴定为抑制神经发生的化合物可以是从婴儿、儿童、孕妇和哺乳期妇女的饮食和环境中需要避免或去除的潜在毒素。这些化合物还可能干扰神经病或损伤的治疗和康复。因此，在患有神经病或损伤的个体的饮食和环境中也可避免神经发生-抑制化合物。
“候选化合物”是指用本文所述的方法来测试神经发生-调节特性的任何化合物。所述候选化合物包括但不限于天然存在的物质、合成的化合物或提取物，例如植物或动物组织、真菌或细菌的提取物。可以单独测试所述候选化合物或可与其它候选化合物或已知的神经发生-调节化合物组合测试，以观测协同效应或达到更高通量的化合物筛选。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括提供ADSC的阴性对照培养物，用于与候选化合物进行比较。因此，所述方法进一步包括在所述候选化合物不存在时培养ADSC，确定在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度，和将在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度进行比较。与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度增加，表明所述候选化合物是神经发生-促进化合物。另一方面，与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度减少，表明所述候选化合物是神经发生-抑制化合物。阴性对照培养物提供了所述候选化合物的神经发生调节性质的额外的相关信息。
在其它实施方案中，所述方法进一步包括提供阳性对照培养物。因此，所述方法进一步包括在已知神经发生-促进化合物存在时培养ADSC，和确定在所述神经发生-促进化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度。例如，DHA已知能促进早期脑发育并且可用作阳性对照。因此，所述方法可以进一步包括在DHA存在时培养ADSC。与在DHA存在时培养的ADSC中的神经发生程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度增加，表明所述候选化合物是优于DHA的神经发生-促进化合物。
在神经发生期间，ADSC可以分化为神经元细胞、神经元细胞的祖细胞和具有神经元性能的细胞。因此，神经发生程度可通过观测细胞形态学变化而确定。指示神经发生的细胞形态学的变化包括但不限于细胞质收缩、神经突形成、树突样突出形成、轴突形成或其组合。指示神经发生的细胞形态学的其它变化包括类似于两极、三极和多极神经元细胞的形态学发育。
前述细胞形态学的变化可通过显微镜技术例如通过相差显微术来观测。ADSC的相差显微术图像可在ADSC培养期间多次采集。例如，可在与候选化合物培养之前、在加入候选化合物之后一次或多次例如之后3小时、和此后每天一次采集图像。
神经发生程度可以进一步通过测定显示神经元分化的ADSC百分率和细胞中的细胞质突出例如神经突、轴突和树突的长度而确定。可使用具有合适插件的Image J开放软件测定显示神经元分化的ADSC百分率和细胞质突出的长度。
在神经发生期间发生细胞生物标记的变化。因此，在某些实施方案中，神经元标记的细胞表达研究用于确定神经发生程度。这样的生物标记的实例包括但不限于蛋白质例如神经丝、髓鞘碱性蛋白、巢蛋白、β-III微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、S100 (一种钙结合蛋白)、微管相关蛋白2 (MAP2)、CNPase和GABA受体。确定神经元分化的其它技术包括神经元标记的免疫组织染色、神经元兴奋性测定和用于神经蛋白表达的蛋白质印迹。
在某些实施方案中，所述ADSC是人脂肪衍生的干细胞(hADSC)。hADSC可以有利地维持在培养基中并且容易传代，以提供多个传代培养物。此外，hADSC容易得到，因为它们可分离自在常规抽脂术期间采集的人脂肪组织并可冷冻保存。hADSC具有容易得自个体患者的额外优势。这样获得的hADSC可用于本文所述的方法以筛选候选化合物，用于个性化使用。因此，使用本公开内容的方法可以实现个性化和优化营养、药物治疗或对神经毒素的敏感性的测定。
可以培养ADSC足以发生神经发生的时间。神经发生可在不同时间观测，这取决于所测的脑营养素。因此，在某些实施方案中，神经发生可以在培养数小时后观测，而在其它实施方案中，神经发生可以在培养若干天后观测。例如，ADSC可以培养大约1小时至大约5天、大约1小时至大约3天、大约3小时至大约36小时、大约12小时至大约24小时、或大约24至大约36小时。此外，ADSC的培养可以持续1、2、3或4周，以达到更完全的神经元分化。ADSC的培养可以进一步在升高的温度例如高于室温的温度下进行。这样的温度包括大约25至大约45℃、大约30至大约40℃、或大约37℃。
在前述方法中，ADSC可以在支持或促进神经发生(例如通过引导ADSC分化为神经元细胞)的培养基中有利地培养。在某些实施方案中，所述培养基包含神经基础培养基、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子b-FGF、N2补充物和L-谷氨酰胺。培养基的成分是市售来源可得的。例如，神经基础培养基可以是NeurobasalTM培养基，其可得自Invitrogen。神经基础培养基™可包括下表1所列出的成分：
表1：NeurobasalTM培养基
成分 分子量 浓度(mg/L) mM
氨基酸
甘氨酸 75 30 0.4
L-丙氨酸 89 2 0.0225
L-精氨酸盐酸盐 211 84 0.398
L-天冬酰胺-H2O 150 0.83 0.00553
L-半胱氨酸 121 31.5 0.26
L-组氨酸盐酸盐-H2O 210 42 0.2
L-异亮氨酸 131 105 0.802
L-亮氨酸 131 105 0.802
L-赖氨酸盐酸盐 183 146 0.798
L-甲硫氨酸 149 30 0.201
L-苯丙氨酸 165 66 0.4
L-脯氨酸 115 7.76 0.0675
L-丝氨酸 105 42 0.4
L-苏氨酸 119 95 0.798
L-色氨酸 204 16 0.0784
L-酪氨酸 181 72 0.398
L-缬氨酸 117 94 0.803
维生素
氯化胆碱 140 4 0.0286
D-泛酸钙 477 4 0.00839
叶酸 441 4 0.00907
烟酰胺 122 4 0.0328
吡哆醇盐酸盐 204 4 0.0196
核黄素 376 0.4 0.00106
硫胺素盐酸盐 337 4 0.0119
维生素B12 1355 0.0068 0.000005
i-肌醇 180 7.2 0.04
无机盐
氯化钙(CaCl2) (无水) 111 200 1.8
硝酸铁(Fe(NO3)3"9H2O) 404 0.1 0.000248
氯化镁(无水) 95 77.3 0.814
氯化钾(KCl) 75 400 5.33
碳酸氢钠(NaHCO3) 84 2200 26.19
氯化钠(NaCl) 58 3000 51.72
磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O) 138 125 0.906
硫酸锌(ZnSO4-7H2O) 288 0.194 0.000674
其它成分
D-葡萄糖(右旋糖) 180 4500 25
HEPES 238 2600 10.92
丙酮酸钠 110 25 0.227
N2补充物可购自Invitrogen。Invitrogen N2补充物可包含以下成分：
表2：N2补充物
成分 分子量 浓度(mg/L) mM
蛋白质
人转铁蛋白(Holo) 10000 10000 1
胰岛素重组完整链 5807.7 500 0.0861
其它成分
黄体酮 314.47 0.63 0.002
腐胺 161 1611 10.01
亚硒酸盐 173 0.52 0.00301
例如，所述培养基可包含大约1至大约100、大约5至大约50、大约10至大约25或大约20 ng/mL EGF。所述培养基进一步包含大约1至大约100 ng/mL、大约5至大约50、大约10至大约25、或大约20 ng/mL b-FGF。N2补充物在培养基中存在的浓度为大约1×，和L-谷氨酰胺的存在量可以为大约0.1至大约10 mM、大约1至大约5 mM、或大约1.3至大约3 mM。所述培养基可以进一步包含合适量的候选化合物，例如大约0.1 nM至大约10 mM、或1 nM至大约1 mM。
在某些实施方案中，所述培养基基本上不含血清，或者优选完全不含血清。基本上不含血清的培养基是指含有小于大约10%血清、更尤其是小于大约2%或0.1%血清的培养基；在某些实施方案中，基本上不含血清是指小于大约0.5%血清。完全不含血清的培养基具有0%血清。不受任何具体理论的束缚，认为血清可含有不一致的和不确定量的生长因子，其具有影响神经发生程度的可能性。因此，无血清培养基消除了血清对神经发生程度的影响。因此，在无血清培养基中培养的ADSC中观测的神经发生可归因于候选化合物，而非血清的存在。
前述方法可用于快速神经元分化平台(“RNDP”)。RNDP可以有利地用于快速筛选大量潜在的神经发生调节化合物。可使用多孔板和/或通过一次性测试若干化合物或用于高通量结果的化合物文库而快速筛选化合物。如果需要的话，使用扩展的平台，进一步研究在RNDP中鉴定的化合物。
扩展的神经元分化方案(“ENDP”)进一步包括启动步骤。ENDP可用于进一步研究和证实RNDP的结果。不受任何具体理论的束缚，认为启动ADSC允许改进的神经元形态学，因而提供了给定化合物的神经发生调节潜力的额外的理解。因此，在某些实施方案中，在候选化合物存在时培养之前启动ADSC。例如，在用所述候选化合物培养之前，可以在合适的启动培养基中启动ADSC大约1至大约5天。在其它实施方案中，启动ADSC大约1至大约3天，或大约3天。
在某些实施方案中，所述启动培养基包含神经基础培养基(例如来自Invitrogen的Neurobasal Medium™)以及合适浓度的EGF、b-FGF和N2补充物。合适浓度的EGF包括大约1至大约100 ng/mL、大约5至大约50、大约10至大约25或大约20 ng/mL。合适浓度的b-FGF包括大约1至大约100、大约5至大约50、大约10至大约25、或大约20 ng/mL b-FGF。N2补充物在培养基中存在的浓度可为大约1×。所述启动培养基可以基本上不含血清，或者更优选地，完全不含血清。基本上不含血清的启动培养基是指具有小于大约10%血清，例如小于大约2%或0.1%血清的培养基，而完全不含血清的培养基具有0%血清。此外，启动培养基可以不含或基本上不含候选化合物。
在其中在候选化合物存在时培养之前启动ADSC的实施方案中，将ADSC随后在合适的培养基中培养大约1至大约5天。在其它实施方案中，将ADSC培养大约1至大约3天、或大约3天。启动之后，去除启动培养基并将培养基加入到ADSC中。所述培养基包含例如得自Invitrogen的完全MesenPRO。所述培养基可以进一步包含合适量的所述候选化合物，例如大约0.1nM至大约10 mM、或1 nM至大约1 mM所述候选化合物。在阴性对照实验中，所述培养基不含或基本上不含所述候选化合物。在阳性对照实验中，所述培养基包含已知的神经发生促进化合物，例如DHA。
在某些实施方案中，用于培养ADSC的培养器皿用用基质蛋白的独特组合涂层，所述蛋白设计用于模拟中枢神经系统的体内环境，使细胞神经元分化活力最大化，并且增强细胞附着。在一个实施方案中，涂层包含多聚-L-鸟氨酸和牛血浆纤连蛋白。可通过将培养器皿与多聚-L-鸟氨酸溶液和牛纤连蛋白溶液接触，制备涂层的培养器皿。接触步骤可以任何顺序、同时或基本同时地进行。例如，可使培养器皿在牛纤连蛋白之前或在纤连蛋白之后与多聚-L-鸟氨酸接触。或者，多聚-L-鸟氨酸和牛纤连蛋白与培养器皿同时或基本同时接触。
本公开内容的另一方面涉及促进ADSC中的神经发生的体外方法，包括：在神经发生-促进化合物存在时培养ADSC。可将前述方法产生的神经元细胞和神经元-样细胞维持在培养基中，传代或冷冻保存。因此，所述方法可提供人神经元细胞和神经元-样细胞，用于实验室，例如用于药物筛选。在某些实施方案中，所述方法进一步包括确定ADSC中的神经发生程度，如前述筛选方法所述。
本公开内容的另一方面涉及用于鉴定神经发生-调节化合物的系统，包括：ADSC；包含模拟中枢神经系统的涂层的培养器皿；和培养基。在某些实施方案中，涂层包含牛纤连蛋白和多聚-L-鸟氨酸。在用于RNDP的系统中，培养基包含神经基础培养基、EGF、b-FGF、N2补充物和L-谷氨酰胺。用于ENDP的系统进一步包含启动培养基例如包含神经基础培养基、EGF、b-FGF、N2补充物的培养基，和包含完全MesenPRO的培养基。
实施例
hADSC
用于以下程序的hADSC购自商业来源并生长在维持培养基中，所述维持培养基由完全MesenPRO RS培养基以及补充物和L-谷氨酰胺组成。当细胞培养物达到汇合时，进行hADSC的传代培养。为了使hADSC传代，采用以下步骤：i) 从细胞中吸出完全MesenPRO RS培养基；ii) 通过将Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DBPS)缓冲液加入到附着细胞层对侧的容器壁，并前后摇动容器若干次，用DBPS漂洗细胞层表面；iii) 通过抽吸取出DPBS并弃去；iv)通过加入足够体积的预保温的无酚红的胰蛋白酶-EDTA溶液以覆盖细胞层而分开细胞；v)在37℃孵育大约7分钟；vi) 在显微镜下观察细胞，以确定是否需要另外孵育；vii) 将3mL维持培养基加入板中，混合细胞悬液，将悬液加入到15mL离心管并在210g离心5分钟；viii)使用血细胞计数器确定细胞总量和活力百分率；ix) 将完全MesenPRO RS培养基加入到各容器中，使得最终培养体积为0.2mL – 0.5mL/cm2；x) 通过将合适体积的细胞加入各容器中来接种细胞并在37℃、5%CO2和90%湿度下孵育；和xi) 接种后3或4天，完全去除培养基并更换为等体积的完全MesenPRO RS培养基。
涂层
将传代的hADSC接种在新鲜培养板之前，将培养器皿的表面用无菌DPBS溶液洗涤3次，再用无菌水漂洗多次。涂层的第一层是多聚-L-鸟氨酸。通过加入0.1 mg/mL多聚-L-鸟氨酸并在37℃孵育1小时而制备涂层。将板用DPBS洗涤3次，每次洗涤15分钟。涂层的第二层是牛血浆纤连蛋白。将纤连蛋白在DPBS中从贮液稀释至1:1000并且将500μL加入各孔。将板在室温下放置1小时。用500μL/孔的DPBS进行最后一次洗涤，然后立即使用板。
培养基
使用不同培养基，可将hADSC维持在未分化状态或将其引导至分化。某些培养基能够引导ADSC分化为神经元细胞。示例性的培养基见下表3、4和5。
表3.
表4.
表5.
RNDP方案
描述了2种独立的筛选方案，称为快速神经元分化平台(RNDP)和扩展的神经元分化平台(ENDP)。RNDP方案提供在相对短时间内快速筛选大量候选化合物。RNDP允许快速鉴定促进或抑制神经发生的化合物，或对神经发生无影响的化合物。RNDP后可接着ENDP，以便进一步研究和证实结果。
从培养皿中除去上述hADSC的传代培养基，并将培养皿用5-10 mL无菌DPBS温和洗涤。去除DPBS并加入1.5 mL胰蛋白酶-EDTA以完全覆盖细胞层。将培养皿放回温箱达7分钟。再将板轻轻拍打以完全分开细胞，将3 mL维持培养基加入板中，并混合细胞悬液，然后加入到15 mL离心管中。将所需细胞密度(1x104细胞/孔)加入到另一15 mL管中并在210g离心5分钟。将细胞沉淀物重悬于合适体积的预保温的表1所示的无血清快速神经元分化培养基中，并接种到组织培养板的各孔中。对于各孔，序贯加入候选化合物。将板放回温箱中。使用相差显微术图像快速而容易地观测候选化合物的效果，所述图像通常在紧接处理前、在处理后3小时以及在此后的3天中的每天采集一次。随着快速的周转时间，最好的结果通常发生在36小时内。图像采集之后，进行数据分析和比较以确定每种化合物或化合物的混合物在调节神经发生中的效果。通过观测神经元形态学确定神经元分化。细胞的某些变化包括细胞质收缩、轴突和树突样胞质突出的形成。这些变化开始于hADSC的细胞质向核收缩，形成具有胞质延伸的收缩的细胞体。细胞最终发展成类似于两极、三极和多极神经元细胞的形态学。
ENDP方案
ENDP方案提供了进一步研究RNDP的结果的方法并且也允许启动hADSC的额外时间以进一步分化为不同神经元细胞谱系。不受任何具体理论的束缚，所述启动驱动hADSC从中胚层谱系向神经外胚层转分化。
将hADSC接种在具有涂层表面的培养板上并在无血清ENDP启动培养基(参见表2)中生长至少72小时。去除启动培养基并在至少一个候选化合物存在或不存在时加入神经元分化培养基(参见表3)。然后将培养物孵育延长的一段时间，让神经元进一步发育。孵育3天后，在显微镜下检查细胞的形态学变化。可通过使用具有合适插件的Image J开放软件测定百分率和神经突的长度。可以进一步研究细胞的多种神经元标记，以进一步证实神经元分化。
脑营养素的发现
本研究的目的是使用RNDP和ENDP平台来确定不同营养素(候选化合物)的神经发生效应。单独测试候选化合物并与阳性对照、二十二碳六烯酸(DHA)和阴性对照进行比较。预保温的无血清培养基含有神经基础培养基以及L-谷氨酰胺、20ng/mL b-FGF、20ng/mLEGF和N2补充物。将在无血清培养基中的不同浓度的候选化合物加入到各孔中。所述候选化合物选自ARA、EPA (顺-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)和白藜芦醇。测试不同浓度的化合物，浓度范围从纳摩尔到微摩尔范围。单独测试化合物并与阳性对照、二十二碳六烯酸(DHA)和阴性对照进行比较。实验重复三次。对于发现促进神经发生或证明可用作药物的营养素，以不同组合进行进一步筛选。这些实验也重复三次。
至多一周，在相差显微术下容易而快速地观测到候选化合物的效果，其图像通常在紧接候选化合物处理前、在处理后3小时和此后的3天中的每天采集一次。随着快速的周转时间，最好的结果通常发生在36小时内。图像采集之后，进行数据分析和比较以确定每种化合物或化合物的组合在促进神经发生中的效果。通过神经元形态学确定神经元分化。这些变化中的一些包括细胞质收缩以及轴突和树突样胞质突出(神经突)的形成。这些变化开始于hADSC的细胞质向核收缩，形成具有胞质延伸的收缩的细胞体。细胞最终发展成类似于两极、三极和多极神经元细胞的形态学。
在上述候选化合物中，白藜芦醇、ARA、EPA、胆固醇和DHA是有效促进神经发生的化合物的实例。测试浓度和有效浓度见下表6：
表6：鉴定为有效促进神经发生的化合物的实例
本公开内容的单数特征或限制的所有引用应当包括相应的复数特征或限制，反之亦然，除非另有说明或通过进行引用的上下文明确相反地指出。
用于本文的方法或过程步骤的所有组合都可以任何顺序进行，除非另有说明或通过进行引用的组合的上下文明确相反地指出。
本公开内容的方法和组合物，包括其成分，可包含本文所述的实施方案的基本要素和限制以及本文所述的任何另外的或任选的成分、组分或限制，或者由其组成，或者基本上由其组成。
本文所用的术语“大约”应当视为是指任何范围中指定的数字。对范围的任何提及应当视为对该范围内的任何亚类提供支持。

Claims (14)

1.用于鉴定神经发生-调节化合物的方法，包括：
在候选化合物存在时培养脂肪衍生的干细胞(ADSC)；
确定ADSC中的神经发生程度；
在二十二碳六烯酸(DHA)存在时培养ADSC，
确定在DHA存在时培养的ADSC的神经发生程度；和
将在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度与在DHA存在时培养的ADSC中的神经发生程度进行比较，其中与在DHA存在时培养的ADSC中的神经发生程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度增加，表明所述候选化合物是神经发生-促进化合物。
2.权利要求1的方法，进一步包括：
在所述候选化合物不存在时培养ADSC，
确定在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度，和
将在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度进行比较。
3.权利要求2的方法，其中与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度增加，表明所述候选化合物是神经发生-促进化合物。
4.权利要求2的方法，其中与在所述候选化合物不存在时培养的ADSC中的神经发生程度相比，在所述候选化合物存在时培养的ADSC中的神经发生程度减少，表明所述候选化合物是神经发生-抑制化合物。
5.权利要求1的方法，其中神经发生程度通过观测ADSC的细胞形态学变化而确定。
6.权利要求5的方法，其中细胞形态学的变化是细胞质收缩、神经突形成、树突样突出的形成、轴突形成或其组合。
7.权利要求5的方法，其中细胞形态学的变化通过显微镜术观测。
8.权利要求7的方法，其中细胞形态学的变化通过相差显微术观测。
9.权利要求1的方法，其中所述脂肪衍生的干细胞是人脂肪衍生的干细胞(hADSC)。
10.权利要求1的方法，其中所述ADSC在所述候选化合物存在时培养1至5天。
11.权利要求1的方法，其中所述ADSC在包含神经基础培养基、EGF、b-FGF、N2补充物和L-谷氨酰胺的培养基中培养。
12.权利要求1的方法，进一步包括：在所述候选化合物存在时培养所述细胞之前，在启动培养基中启动ADSC1至5天。
13.权利要求12的方法，其中所述启动培养基包含神经基础培养基、EGF、b-FGF和N2补充物。
14.权利要求12的方法，其中所述ADSC在所述候选化合物存在时培养1至5天。
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