KR20170014678A

KR20170014678A - 저온배양을 이용한 3차원 인공피부모델 제조방법 및 이를 이용한 인체 독성물질의 평가방법

Info

Publication number: KR20170014678A
Application number: KR1020150108415A
Authority: KR
Inventors: 이수현; 정행선; 김설영; 김혜수; 조선영
Original assignee: 주식회사 바이오솔루션
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2015-07-31
Publication date: 2017-02-08
Also published as: KR101770983B1

Abstract

본 발명은 저온배양을 이용한 3차원 인공피부모델 제조방법 및 이를 이용한 인체 독성물질의 평가방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 인체에서 분리된 피부각질세포를 3차원 배양하여 인공피부모델을 만드는데 있어서, 3차원 배양 중 37℃에서 기-액 배양(air-liquid culture) 이후에 추가적으로 31~33℃에서 저온배양하여 인체 독성물질 평가용 인공피부모델의 제조방법 및 이를 이용한 인체 독성물질의 평가방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 저온배양하여 인공피부모델을 제조하는 경우, 인공피부 세포들의 분화 및 이주와 인공피부의 각질층 형성을 촉진시켜 더욱 안정적인 인공피부모델을 제공함으로써, 독성물질 시험 또는 피부자극시험에 있어서 위양성 오류와 같은 문제점을 개선을 하선하고 높은 재연성을 제공할 수 있다.

Description

저온배양을 이용한 3차원 인공피부모델 제조방법 및 이를 이용한 인체 독성물질의 평가방법{Manufacturing method of 3D human skin model and method for estimating Human toxicoid chemicals using the same}

본 발명은 저온배양을 이용한 3차원 인공피부모델 제조방법 및 이를 이용한 인체 독성물질의 평가방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 인체에서 분리된 피부각질세포를 3차원 배양하여 인공피부모델을 만드는데 있어서, 3차원 배양 중 37℃에서 기-액 배양(air-liquid culture) 이후에 추가적으로 31~33℃에서 저온배양하는 인체 독성물질 평가용 인공피부모델의 제조방법 및 이를 이용한 인체 독성물질의 평가방법에 관한 것이다.

인체의 피부는 사람이 지니고 있는 장기 중 가장 큰 장기로서, 체외로 수분과 열을 빼앗기지 않도록 보호막을 형성하여 인체를 보호하는 역할을 한다. 또한 피부는 외부와의 정보전달의 수단으로 사용될 뿐 아니라, 땀을 배출하여 체온을 조절하고, 때로는 미적 기준이 되기도 하는 외관상으로도 중요한 역할을 담당하는 기관이다. 표피를 구성하는 각질세포의 주된 기능이 케라틴 단백질과 지질을 합성하여 피부장벽을 형성함으로써 외부의 오염원이나 자극으로부터 인체를 보호하는 것이라면, 표피의 또 다른 구성세포인 멜라닌세포는 멜라닌을 합성하고 이를 각질세포의 핵 위에 전달함으로써 유해한 자외선을 차단하여 인체의 유전정보를 보호하는 역할을 담당한다.

인체의 피부는 외부에 직접 노출되어 있기 때문에 화학물질 또는 자극성 물질에 의한 손상을 받기 쉬운 신체부위로서, 화학물질과 또는 자극성 물질의 접촉은 피부 손상을 가져올 수 있다. 또한, 현재 수많은 화학물질들이 사용되고 있고, 새로운 화학물질들이 끊임없이 개발되고 있기 때문에 이러한 화학물질을 사용하기에 앞서 인체 피부의 독성 시험이 정확히 이루어 져야 한다.

기존의 실험실내 독성도 검사법은 인체 피부의 표피를 구성하는 각질형성세포 또는 섬유모세포를 각각 단층 배양한 후 배양액에 화학물질을 처리하여 MTT 환원시험법, NRU 시험법, Alamar Blue 시험법, Kenacid Blue 시험법 및 LDH 시험법과 같은 시험방법으로 독성도를 측정하였다. 그러나, 상기 단층 배양법을 이용한 독성도 검사법은 각질형성세포를 배양액에 잠긴 채로 단층 배양하면 피부의 특징인 중층편평상피를 형성하지 못하고 대부분의 배양세포가 표피의 기저층에 해당하는 세포의 성질을 갖게 되므로 인체 표피가 가진 성상을 반영하지 못하며, 표피의 가장 바깥층인 각질층이 형성되지 못하여 화학물질이 인체 피부에 접촉 시 가장 먼저 접촉하는 각질층에 대한 독성결과를 정확히 판단하지 못하게 된다.

그렇기 때문에 화학물질의 독성 결과를 명확히 평가하기 위해 많은 실험동물을 사용하고 있다. 그러나, 최근 각국에서 동물실험에 대한 생명윤리 강화와 3R 원칙(Reduction, Replacement, Refinement) 으로 실험동물 보호를 위해 동물시험에 대하여 규제를 강화하고 있으며, 이에 실험동물 대체법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다 (Botham, 2004; Fentem, 2001; Kimber, 1999).

외국의 경우, 피부자극성 대체시험법에서 사용되는 Epiderm은 MatTek(USA)에서 개발한 세포로 정상인체에서 얻은 epidermal keratinocytes(NHEK)를 Millicell cell culture insert에서 배양시켜 multi-layered, differentiated in vitro human epidermis를 형성시켜 사용한다. Episkin은 Episkin-SNC(france)에서 개발한 Dermis에 해당하는 type I, III collagen 층 위에 type IV human collagen 층을 넣고 그 위에 human keratinocyte로 이루어 epidermis층을 구성된 것이다(ECVAM, 2007a, 2007b).

일반적으로, 인공피부모델은 인체에서 피부각질세포를 37℃에서 3차원 배양하여 만들어서 실험에 이용한다. 상기와 같이 인공피부모델을 이용한 시험은 용해도 문제의 해결 및 사람피부와 유사하다는 장점이 있어 피부부식시험, 피부자극시험 등에 대한 대체시험법 연구에도 활용되고 있다.

그러나, 상기와 같은 방법으로 만든 인공피부모델은 각질층이 일반 피부의 각질층과 비교할 때 미흡하게 형성되어 피부자극시험에 있어서 위양성 오류가 빈번하게 나타난다. 즉, 일반적으로는 음성으로 나타나야 할 독성물질이 각질층이 미흡하게 형성된 인공피부에서는 양성으로 나타나 독성물질에 대한 평가가 정확히 이루어지지 못한다는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구, 노력한 결과, 인체에서 분리된 피부각질세포를 3차원 배양하여 인공피부모델을 만드는데 있어서, 3차원 배양 중 37℃에서 기-액 배양(air-liquid culture) 이후에 추가적으로 31~33℃에서 저온배양하여 인공피부모델을 제조하는 경우, 인공피부 세포들의 분화 및 이주와 인공피부의 각질층 형성을 촉진시켜 더욱 안정적인 인공피부모델을 제공함으로써, 독성물질 시험 또는 피부자극시험에 있어서 위양성 오류와 같은 문제점을 개선하고 높은 재연성을 제공할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 인공피부 세포들의 분화 및 이주와 인공피부의 각질층 형성을 촉진시켜 더욱 안정적인 인공피부모델을 제공함으로써, 독성물질 시험 또는 피부자극시험에 있어서 위양성 오류와 같은 문제점을 개선하고 높은 재연성을 갖는 저온배양을 이용한 3차원 인공피부모델 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 저온배양을 이용한 3차원 인공피부모델 제조된 인공피부모델을 이용한 인체 독성물질의 피부자극시험방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 인체에서 분리된 피부각질세포를 3차원 배양하여 인공피부모델을 만드는데 있어서, 3차원 배양 중 37℃에서 기-액 배양(air-liquid culture) 이후에 추가적으로 31~33℃에서 저온배양하는 것을 특징으로 하는 인체독성 평가용 인공피부모델의 제조방법을 제공한다.

종래에 피부각질세포를 37℃에서 3차원 배양하여 만들어진 인공피부모델의 경우, 각질층이 미흡하게 형성되어 피부자극시험에 있어서 위양성 오류가 빈번하게 나타나는 문제점이 있었다. 이에, 본 발명자는 저온배양을 이용하여 인공피부모델을 제조하는 경우, 인공피부 세포들의 분화 및 이주와 인공피부의 각질층 형성을 촉진시켜 더욱 안정적인 인공피부모델을 제공할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 있어서, 다음 단계들을 포함하는 인체독성 평가용 인공피부모델의 제조방법을 제공한다.

a) 사람의 피부조직으로부터 피부각질세포를 분리하고 계대배양하는 단계;

b) 상기 피부각질세포를 배양삽입체(culture insert)에 넣는 단계;

c) 상기 배양삽입체를 배양액으로 덮여 있는 서브머지(submerge) 상태로 37℃에서 배양하여 상피세포가 고르게 자라도록 하는 단계;

d) 상기 상피세포층을 공기에 노출시키는 기-액 배양(air-liquid culture)법으로 37℃에서 배양하는 단계; 및

e) 추가적으로 상기 기-액 배양을 31~33℃에서 저온배양하여 분화를 유도하는 단계.

좀 더 구체적으로, 상기 b) 단계에서 피부각질세포는 1x10⁵cell/200㎕로 접종하는 것이 바람직하다. 또한, 제 c) 단계에서 서브머지상태는 4~7일간 배양하여 상피세포가 고르게 자랄 수 있도록 해주며, 상기 d) 단계의 기-액 배양법은 이른바 에어 리프팅법으로 세포가 중층화되도록 분화를 유도하기 위한 방법이다. 상기 기-액 배양법은 12~16일간 배양하며, 이때 배지는 2~3일에 한 번씩 교환해주는 것이 바람직하다. 상기 배양은 모두 37℃에서 이루어지는 것이 바람직하다.

기존의 배양방법은 상기와 같이 37℃에서 이루어지나, 본원발명은 상기 배양방법 후 31~33℃에서 3일간 저온배양이 이루어지는 단계가 추가되는 것이 특징이다. 상기 저온배양 온도는 31~33℃, 바람직하게는 32℃인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 인공피부 세포들의 분화 및 이주를 촉진시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 인공피부의 각질층 형성을 촉진시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실험예에 따르면, 본원발명의 배양방법으로 제조한 인공피부모델은 기존의 배양방법을 통해 제조한 인공피부모델보다 각질층 형성이 촉진된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때, 본 발명의 인공피부모델 제조방법은 세포들의 분화 및 이주와 각질층의 형성을 촉진시킴으로써, 인공피부모델 제작의 안정화에 기여할 수 있음을 의미한다(실시예 2, 도 1 참조).

본 발명에 있어서, 상기 인공피부모델은 피부자극시험에 있어서 위양성 오류가 개선된 것을 특징으로 한다.

인체피부에 대한 자극성의 평가는 실험용 토끼를 이용하여 홍반 발진 등을 점수화하여 자극성 유무를 평가하는 것이 기존의 방법이다. 인공피부를 이용하여 인체피부자극 시험에 대한 독성평가 가이드라인은 OECD에서 제공하고 있으며, 그 가이드라인(OECD Test Guideline 439) 에는 자극, 비자극 표준물질 리스트와 독성평가의 기준(세포생존율 50 이상이면 비자극, 50 이하면 자극)이 명시되어 있다.

본 발명의 실험예에 따르면, OECD TG439에서 발표한 피부의 비자극성 물질인 naphthalene acetic acid, allyl phenoxy-acetate, isopropanol를 통해 피부자극시험을 한 결과, 기존 배양방법으로 제조된 인공피부에서는 양성(자극성 물질)으로 나타났으나(세포 생존률이 50% 이하), 본원발명의 배양방법으로 제조된 인공피부에서는 음성(비자극성 물질) 으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다(세포 생존률이 50% 이상). 이러한 결과로 볼 때, 본원발명의 배양방법으로 제조된 인공피부는 피부자극시험에 있어서 피부독성물질 또는 자극성물질의 위양성 오류를 개선할 수 있음을 의미한다(실시예 3, 도 2 참조).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 인체 독성물질의 피부자극시험방법을 제공한다.

a) 상기 제 1항에 따라 피부각질세포를 3차원 배양하여 인공피부모델을 준비하는 단계;

b) 상기 인공피부모델에 인체 독성 후보 물질을 처리하는 단계;

c) 상기 인공피부모델에서 피부각질세포의 생존률을 측정하는 단계.

이상 설명한 바와 같이, 저온배양하여 인공피부모델을 제조하는 경우, 인공피부 세포들의 분화 및 이주와 인공피부의 각질층 형성을 촉진시켜 더욱 안정적인 인공피부모델을 제공함으로써, 독성물질시험 또는 피부자극시험에 있어서 위양성 오류와 같은 문제점을 개선할 수 있다.

도 1은 두 배양조건(기존의 배양법(모든 기간 37℃배양)과 저온배양(기-액배양 3일 동안, 32℃에서 배양)으로 제조된 인공피부모델을 헤마톡실린&에오신(H&E)염색한 도면이다.
도 2는 기존의 배양법(모든 기간 37℃배양)과 저온배양법(기-액배양 3일 동안, 32℃에서 배양)을 통해 제작된 인체 피부모델을 이용하여 피부자극시험 후, 세포 생존률을 측정하나 결과를 그래프화한 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 각질세포의 분리 및 배양

절제된 피부조직을 50 ㎍/㎖의 항생제 (gentamicin, Gibco)가 포함된 인산완충용액(WelGENE)으로 8번 이상 세척하여 응고된 혈액과 오염물들을 제거하였다. 이어, 진피부분의 지방층을 제거하고, 조직을 5 mm 정도로 가능한 한 잘게 절단하고, 절단된 피부 조직을 50 ㎖ 튜브에 옮긴 후 트립신용액 (0.125% 트립신: versene = 1:1 , Gibco) 10 ㎖을 첨가한 후, 마그네틱 바를 이용하여 상온에서 45분간 물리적인 자극을 주어 각질세포가 떨어져 나오도록 하였다. 세포가 떨어져 나온 트립신 용액에 0.1 mg/㎖의 트립신 억제자 (Gibco)를 첨가하여 50 ㎖ 튜브로 옮긴 다음 300 xg에서 원심분리 하고, 상층액을 제거한 다음, 각질세포배양 배지인 KGM (Cambrex)을 첨가하여 세포를 단일화하였다. 세포수를 계산하여 직경 100 mm 배양접시에 1x10⁶개의 세포가 되도록 분주하였다. 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하고 배지는 2일에 한 번 교체하여 주었으며, 배양접시의 세포가 과밀해지면 배양접시의 각질세포 배양배지를 제거하고, 인산완충용액으로 한번 세척하였다. 이어, 트립신-EDTA 용액 2 ㎖을 첨가하여 배양기에서 4분간 효소 반응시키고, 배양용기로부터 각질세포를 회수하여 세포수를 계산하고 300 xg에서 원심분리 하였다. 원심분리한 상등액을 제거하고, 각질세포 배양배지를 첨가하여 각질세포를 고르게 현탁한 후, 100 mm 배양접시에 3 x 10⁵개의 세포수가 되도록 세포현탁액을 첨가해 계대 배양하였다.

실시예 2: 인공피부의 3차원 배양 및 저온배양

피부 상피세포의 분화를 유도하는 주된 요인은 칼슘과 공기-건조 (air-dry) 상태이다. 3차원 배양은 표피세포를 접종하면 이것이 배양되어 다층의 고도로 분화된 인간 표피모델을 형성하는 3차원적 배양법이다. 표피세포는 공기층과 물층의 중간에서 배양됨으로써 중층편평상피로 분화하며 각질화된다. 먼저 피부각질세포를 얻기 위해 100mm dish에 배양한 피부각질세포에 트립신 처리하여 배양 접시로부터 회수한 후 수를 측정하고 원침하여 한 millicell 당 1x10⁵cell/200㎕로 배양삽입체에 넣어 접종 후 배양하였다. 배지로는 동물세포 배양을 위하여 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)과 Ham's F12의 3:1 혼합배지를 사용하였다. 이 배지는 동물세포 증식을 위해, 10% 우태아혈청(FBS), 5㎍/mL 인슐린, 5㎍/mL 트랜스페린, 400ng/mL 하이드로코티손, 10-9M 콜레라독소, 10㎍/mL 상피성장인자(EGF), 10unit/mL 페니실린 및 10㎍/mL스트렙토마이신을 포함한다. 상기 배양액으로 덮여 있는 서브머지(submerge) 상태로 5일 배양하여 상피세포가 고르게 자라도록 한 후, 상피세포층을 공기에 노출시키는 기-액 배양(air-liquid culture), 이른바 에어 리프팅법으로 14일 추가 배양하여 중층화되도록 분화를 유도하였다. 배지교환은 2-3일에 한 번씩 이루어졌다. 기존의 배양은 배양하는 모든 기간에 걸쳐 37℃에서 이루어지며, 이번 저온 배양에서는 마지막 3일의 기-액 배양기간 동안에 32℃의 incubator에 옮겨서 배양하였다.

도 1은 기존의 배양법(모든 기간 37℃배양)과 저온배양(기-액배양 3일동안, 32℃에서 배양)의 차이를 알아보기 위해서 H&E염색을 시행하여 조직병리학적 차이를 확인한 결과이다. 도 1에서 나타나는 바와 같이, 저온배양 시 각질층의 형성이 촉진됨을 확인 할 수 있었다.

실시예 3: 인공피부를 이용한 피부자극성 시험

3-1: 전배양

Water bath안에서 따뜻하게 유지 시킨 배양배지 E-media를 6 well plate에 well당 0.9 ㎖을 넣는다. 그 후 제작한 인체피부모델을 각 well마다 공기방울이 생기지 않도록 plate를 기울이면서 조심스럽게 옮긴다. 37 ℃, 5 % CO₂ incubator에서 약 22±2시간 동안 안정화시킨다.

3-2: 시험물질의 적용

시험물질의 적용을 위해 37 ℃, 5 % CO₂ incubator에서 22±2시간 동안 안정화시킨 인체피부모델을 물질 적용직전에 꺼내어 사용한다. 시험물질별로 6 well plate를 다르게 사용한다. 시험물질은 성상에 따라 액체와 고체의 적용방법을 다르게 한다. 액체는 시험물질 30 ㎕를 인체피부모델 안쪽 중앙에 천천히 떨어뜨린 후 insert를 잡고 돌려주어 골고루 적용되도록 한 다음, 기포가 생기지 않게 나일론 메시로 덮는다. 고체는 시험 물질 적용 전, 미리 1/4크기의 유산지에 30 mg의 시험물질을 측정하여 준비한다. 시험물질 적용 시, 먼저 DPBS 30 ㎕를 인체피부모델 안쪽 중앙에 떨어뜨리고 insert를 잡고 돌려주어 골고루 퍼지게 한 다음 그 위에 고체시료 30mg을 적용시켜 준다. insert를 잡고 원을 그리며 톡톡 쳐주어 인체피부모델 표면에 시험물질이 고루 적용될 수 있게 한다. 실제로 시험에 사용된 물질인 음성대조물질인 DPBS와 액체 시료인 allyl phenoxy-acetate, isopropanol, 고체시료인 naphthalene acetic acid는 각 성상에 맞는 적용방법에 따라 시험물질을 적용하였다. 시험물질이 적용된 후 plate cover film을 이용하여 증발이나 휘발성을 막기 위해 덮어준 상태로 37 ℃, 5 % CO₂incubator에 넣어 45분간 적용한다.

3-3: 세척

37℃, 5 % CO₂ incubator에서 시험물질을 적용한 인체피부모델을 꺼내어, DPBS 10 ㎖을 insert내부에 4 ㎖씩 나누어 overflowing시키면서 물질 및 나일론 메시를 제거하고, 이 과정에서 나일론 메시가 떨어지지 않는 경우는 핀셋으로 제거한다. 나일론 메시가 제거된 것을 확인한 후, DPBS 10 ㎖을 insert내부에 4 ㎖씩 overflowing시키면서 물질을 제거한다. 멸균된 거즈에 insert를 올려 톡톡 털어내듯이 내외부의 물질 및 DPBS를 제거한다. 12 well plate에 insert를 넣고 10초 간격으로 DPBS 4 ㎖로 overflowing시킨 상태에서 1분간 정체시킨 후에 꺼내면서 흔들어준다. 마지막으로 DPBS 10 ㎖로 insert 안팎 세척을 천천히 4 ㎖씩 나누어 2회 실시한다. 세척 후, 200 ㎕ 피펫과 멸균된 거즈와 멸균된 면봉을 이용하여 insert 내·외부의 DPBS를 제거한다.

3-4: 후 배양

세척과정에 들어가기 전에 미리 모델 개수에 맞게 6 well plate를 준비하여 놓고 배양액을 waterbath에 따듯하게 유지시켜 놓는다. 그리고 준비해둔 6 well plate에 well당 0.9 ㎖의 배양액을 넣고 37 ℃, 5 % CO₂ incubator에 세척과정 동안 warming 시킨다. 세척된 인체피부모델은 well 당 0.9 ㎖의 배양액을 넣은 6 well plate에 옮겨 37℃, 5% CO₂ incubator에서 후 배양을 42±2시간 동안 실시한다.

3-5: 세포의 생존율 측정 (MTT측정)

하기에 기재된 MTT 분석을 사용하여, 시험 동안 조직의 세포 생존율을 평가하였다. MTT 조직 생존율 분석은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 의해서 황색 메틸티아졸릴다이페닐-테트라졸륨 브로마이드 (MTT)가 불용성 자색 생성물로 환원되는 것을 측정하는 비색 분석 시스템이다.

먼저 후 배양 후 200㎕ 피펫을 이용하여 인체피부모델의 내외부의 배지를 제거한다. 미리 준비된 0.3 ㎎/㎖ MTT 용액을 새로운 24 well plate에 well당 200 ㎕씩 넣고 인체피부모델을 옮긴 후, MTT 용액 100 ㎕를 인체피부모델내부에 처리한다. MTT를 적용한 24 well plate는 차광상태로 37℃, 5% CO₂ incubator에서 3시간 동안 배양한다. MTT 적용이 끝나면 200 ㎕ 피펫을 이용하여 내·외부의 MTT 등 이물질을 제거한다. 이어 Isopropanol을 1.9 ㎖/well씩 넣어 놓은 새로운 6 well plate에 이를 옮긴 후, isopropanol 100 ㎕씩을 내부에 처리한다. Isopropanol을 적용한 6 well plate는 알루미늄 호일로 차광하고 지퍼백에 넣어 3시간 동안 shaker 에 올려 formazan을 추출한다. Formazan 추출 후, 인체피부모델 내부에 추출액을 외부의 추출액과 합하고, 각 well의 formazan 결정체가 보이지 않을 정도로 충분히 피펫팅하여 섞어준다. Well 당 250 ㎕를 96 well plate로 2개 well씩 옮겨준 다음, 96 well plate 분광광도계(파장 570 nm)를 이용하여 흡광도(Optical Density, OD)를 측정한다. 최종 값은 2개 well의 평균 값을 사용한다.

3-6: 물질의 피부자극성 여부 판정

피부 자극의 판정기준은 아래와 같고 이를 기준으로 하여 물질의 피부자극성 여부를 판단한다.

음성대조물질의 세포생존율을 100%으로 하고, 세포생존율이 50% 초과인 경우는 비자극물질로, 50% 이하인 경우는 자극물질로 판정한다.

Prediction model	Classification
Mean tissue viability is ≤ 50%	Irritant (I) R38
Mean tissue viability is > 50%	Non-Irritant (NI)

실제 naphthalene acetic acid, allyl phenoxy-acetate, isopropanol의 경우 비자극성물질로 알려져 있으며 따라서 50%이상의 cell viability를 나타내어야 한다. 도 2를 보면 기존의 배양법을 통해 제작된 인체피부모델에서 위양성 결과를 나타낸 독성물질은 저온배양을 통해 cell viability가 50% 이상을 나타내어 인체피부모델이 개선되었음을 확인할 수 있었다. 이는 본원발명의 저온배양방법을 통해 각질층의 형성이 촉진되어 보다 인체피부와 유사한 형태를 보임과 동시에 피부자극시험에 있어 위양성 오류를 나타내던 물질의 정확한 판단을 가능케 하도록 개선이 되어짐을 확인하였으며, 이를 통해 위의 방법이 높은 재연성과 모델 제작의 안정화에 기여할 것이라고 판단할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 저온배양하여 인공피부모델을 제조하는 경우, 인공피부 세포들의 분화 및 이주와 인공피부의 각질층 형성을 촉진시켜 더욱 안정적인 인공피부모델을 제공하여 독성물질시험 또는 피부자극시험에 있어서 위양성 오류와 같은 문제점을 개선함으로써, 높은 재연성을 제공할 수 있다.

Claims

인체에서 분리된 피부각질세포를 3차원 배양하여 인공피부모델을 만드는데 있어서, 3차원 배양 중 37℃에서 기-액 배양(air-liquid culture) 이후에 추가적으로 31~33℃에서 저온배양하는 것을 특징으로 하는 인체 독성물질 평가용 인공피부모델의 제조방법.
제1항에 있어서, 다음 단계들을 포함하는 인체 독성물질 평가용 인공피부모델의 제조방법:
a) 사람의 피부조직으로부터 피부각질세포를 분리하고 계대배양하는 단계;
b) 상기 피부각질세포를 배양삽입체(culture insert)에 넣는 단계;
c) 상기 배양삽입체를 배양액으로 덮여 있는 서브머지(submerge) 상태로 37℃에서 배양하여 상피세포가 고르게 자라도록 하는 단계;
d) 상기 상피세포층을 공기에 노출시키는 기-액 배양(air-liquid culture)법으로 37℃에서 배양하는 단계; 및
e) 추가적으로 상기 기-액 배양을 31~33℃에서 저온배양하여 분화를 유도하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 제조방법은 인공피부 세포들의 분화 및 이주를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 인체 독성물질 평가용 인공피부모델의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 제조방법은 인공피부의 각질층 형성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 인체 독성물질 평가용 인공피부모델의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 인공피부모델은 피부자극시험에 있어서 위양성 오류가 개선된 것을 특징으로 하는 인체 독성물질 평가용 인공피부모델의 제조방법.
다음 단계들을 포함하는 인체 독성물질의 피부자극시험방법:
a) 상기 제1항에 따라 피부각질세포를 3차원 배양하여 인공피부모델을 준비하는 단계;
b) 상기 인공피부모델에 인체 독성 후보 물질을 처리하는 단계;
c) 상기 인공피부모델에서 피부각질세포의 생존률을 측정하는 단계.