JP2001518621A - 血管形成の多細胞インビトロ・アッセイ - Google Patents
血管形成の多細胞インビトロ・アッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
血管形成の組合せ段階、つまり細胞発生の増殖、移動および分化の段階をモデル化するための多細胞インビトロ・アッセイであって、ここで、該アッセイは、内皮細胞と他の細胞タイプ、例えば、それとの相互作用を発揮する線維芽細胞との二重培養物を提供して、インビトロで血管形成の組合せ段階を発揮させることを包含する。
Description
【０００１】 本発明は、血管形成のインビトロ・アッセイ、特に血管形成の多細胞インビト
ロ・アッセイに関する。
ロ・アッセイに関する。
【０００２】 脊椎動物における、分化細胞の殆どのポピュレーションは、細胞の死および再
生によるターンオーバーに従う。肝臓の肝実質細胞および血管に一列に並ぶ内皮
細胞のような幾つかの充分に分化した細胞は、単純に分裂して同じ分化タイプの
娘細胞を生じる。そのような細胞の増殖速度は、トータルの細胞数を維持するよ
うにコントロールされる。従って、肝臓の大部分が破壊された場合、残りの肝実
質細胞は、その損失を回復するように、それらの分裂速度を増加する。
生によるターンオーバーに従う。肝臓の肝実質細胞および血管に一列に並ぶ内皮
細胞のような幾つかの充分に分化した細胞は、単純に分裂して同じ分化タイプの
娘細胞を生じる。そのような細胞の増殖速度は、トータルの細胞数を維持するよ
うにコントロールされる。従って、肝臓の大部分が破壊された場合、残りの肝実
質細胞は、その損失を回復するように、それらの分裂速度を増加する。
【０００３】 内皮細胞は、全ての血管に一列に並ぶ細胞の単層を形成し、血流と周辺組織と
の間での交換を制御している。新しい血管は、これらの内皮細胞の外殖により既
存の小血管壁から発生し、該内皮細胞は、培養中で単離されたときでも中空の毛
細管を形成する能力を有する。インビボでは、傷害された細胞および幾つかの腫
瘍は、近隣の内皮細胞に毛細血管の新芽を構築するよう刺激する因子を分泌する
ことによって、血液供給を引き寄せる。血液供給を引き寄せ得ない腫瘍は、それ
らの増殖を著しく制限される。
の間での交換を制御している。新しい血管は、これらの内皮細胞の外殖により既
存の小血管壁から発生し、該内皮細胞は、培養中で単離されたときでも中空の毛
細管を形成する能力を有する。インビボでは、傷害された細胞および幾つかの腫
瘍は、近隣の内皮細胞に毛細血管の新芽を構築するよう刺激する因子を分泌する
ことによって、血液供給を引き寄せる。血液供給を引き寄せ得ない腫瘍は、それ
らの増殖を著しく制限される。
【０００４】 新しい血管が、既存の小血管から出芽する毛細血管として創始するプロセスは
、血管形成(angiogenesis)と呼ばれる。従って、血管形成は、正常な組織発生と
修復および幾つかの病理学的状態の進行において主要な役割を果たすと見ること
ができる。
、血管形成(angiogenesis)と呼ばれる。従って、血管形成は、正常な組織発生と
修復および幾つかの病理学的状態の進行において主要な役割を果たすと見ること
ができる。
【０００５】 一旦、血管系が充分に発生すると、血管の内皮細胞は通常は静止状態を維持し
て、新しい血管を形成しない。疾病や外傷が起きた場合、新しい血管の形成は、
自然な創傷治癒につれて正常に進行し得るか、或いは、慢性皮膚潰瘍でのように
不充分であり得るか増殖の脱調節があって、腫瘍形成、糖尿病性網膜症、乾癬お
よび炎症でのように、血管密度の異常な増加が後から起こる。非治癒創傷での不
適切な血管形成の阻害または血管形成の増強は、従って、薬物発見プログラムに
とって極めて重要なターゲットである。しかしながら、新薬開発を導く、この領
域での研究は、血管形成のインビトロモデルの欠如により妨げられてきた。
て、新しい血管を形成しない。疾病や外傷が起きた場合、新しい血管の形成は、
自然な創傷治癒につれて正常に進行し得るか、或いは、慢性皮膚潰瘍でのように
不充分であり得るか増殖の脱調節があって、腫瘍形成、糖尿病性網膜症、乾癬お
よび炎症でのように、血管密度の異常な増加が後から起こる。非治癒創傷での不
適切な血管形成の阻害または血管形成の増強は、従って、薬物発見プログラムに
とって極めて重要なターゲットである。しかしながら、新薬開発を導く、この領
域での研究は、血管形成のインビトロモデルの欠如により妨げられてきた。
【０００６】 血管形成は、広範囲の増殖因子、細胞外マトリックス分子、酵素および様々な
細胞タイプを包含する極めて複雑なプロセスである。そのような複雑な関連性は
、インビボでのプロセス全体をモデル化するインビトロ・アッセイを開発するの
に主要な困難を生じた。血管形成は、増殖、移動および分化という３相に亜分類
され得る。これらの相それぞれを別々にモデル化するアッセイは、存在する。単
純なインビトロ・テストは、或る範囲の細胞タイプの増殖の変化を測定し、基底
膜タンパク質の上での移動を評価する。タンパク質マトリックスの提供に依存す
る最近のインビトロアッセイ・システムは、分化する内皮細胞の能力を効果的に
測定する。
細胞タイプを包含する極めて複雑なプロセスである。そのような複雑な関連性は
、インビボでのプロセス全体をモデル化するインビトロ・アッセイを開発するの
に主要な困難を生じた。血管形成は、増殖、移動および分化という３相に亜分類
され得る。これらの相それぞれを別々にモデル化するアッセイは、存在する。単
純なインビトロ・テストは、或る範囲の細胞タイプの増殖の変化を測定し、基底
膜タンパク質の上での移動を評価する。タンパク質マトリックスの提供に依存す
る最近のインビトロアッセイ・システムは、分化する内皮細胞の能力を効果的に
測定する。
【０００７】 分化を測定するアッセイ・システムは、内皮細胞によるヒモ様構造の形成を包
含する。全てのそのようなシステムは、その上に細胞が移動して細管を形成する
外因性基底膜タンパク質の細胞への供給に依存する。細胞移動は、2-16時間とい
う比較的に短時間で起こり、３次元構造を生じる。タンパク質に加えて、システ
ムの多くは、増殖因子の提供を要求し、許容し得る細管形成を生じる。細管が形
成される時間スケールは、分化の阻害に関する優れたテストを提供するが、増強
をテストするときにはそれほど有用ではない。
含する。全てのそのようなシステムは、その上に細胞が移動して細管を形成する
外因性基底膜タンパク質の細胞への供給に依存する。細胞移動は、2-16時間とい
う比較的に短時間で起こり、３次元構造を生じる。タンパク質に加えて、システ
ムの多くは、増殖因子の提供を要求し、許容し得る細管形成を生じる。細管が形
成される時間スケールは、分化の阻害に関する優れたテストを提供するが、増強
をテストするときにはそれほど有用ではない。
【０００８】 上述のアッセイ・システムは、血管形成のモデル化に最も近くなるが、それら
のいずれも血管形成に要求される３つの段階全てを組合せるものではない。
のいずれも血管形成に要求される３つの段階全てを組合せるものではない。
【０００９】 本発明の目的は、血管形成の３つの段階全てに依存する血管形成のインビトロ
・アッセイを提供することによって、上述の不利な点を取り除く又は軽減するこ
とであり、血管形成の刺激および阻害の両方を調べるために使用され得る。
・アッセイを提供することによって、上述の不利な点を取り除く又は軽減するこ
とであり、血管形成の刺激および阻害の両方を調べるために使用され得る。
【００１０】 本発明の１つの局面によると、血管形成の組合せ段階(combined stages)、即 ち、細胞発生の増殖、移動および分化の段階をモデル化するための多細胞インビ
トロ・アッセイが提供され、そこでは、該アッセイは、内皮細胞およびそれとの
相互作用を発揮する他の細胞タイプとの二重培養物を提供して、インビトロでの
血管形成の組合せ段階を発揮することを包含する。
トロ・アッセイが提供され、そこでは、該アッセイは、内皮細胞およびそれとの
相互作用を発揮する他の細胞タイプとの二重培養物を提供して、インビトロでの
血管形成の組合せ段階を発揮することを包含する。
【００１１】 本発明の１つの局面によれば、そのようなアッセイは、線維芽細胞および内皮
細胞の二重培養物の使用に依存し、標準培養培地における以外の更なる増殖因子
を要求しない。これらの細胞タイプの相互作用は、それらの間での細胞シグナリ
ング・メカニズムに依存すると仮定されている。更なる増殖因子に依存しないこ
とは、本課題の過去の研究を考慮すると、驚くべきことであり予測しなかったこ
とである。
細胞の二重培養物の使用に依存し、標準培養培地における以外の更なる増殖因子
を要求しない。これらの細胞タイプの相互作用は、それらの間での細胞シグナリ
ング・メカニズムに依存すると仮定されている。更なる増殖因子に依存しないこ
とは、本課題の過去の研究を考慮すると、驚くべきことであり予測しなかったこ
とである。
【００１２】 本発明の他の局面によると、血管形成を促進または阻害するための薬剤をスク
リーニングする方法が提供され、該方法は、内皮細胞と他の細胞タイプ(好まし くは、線維芽細胞のような間質細胞)との共同培養物を培養すること、それとの 相互作用を起こさせて血管形成の組合せ段階を発揮させること、同じ目的の複数
のテスト容器を用意して該培養物にコントロールされた量の該薬剤を提供するこ
と、および容器を観察して血管形成をモニターすること、を包含する。スクリー
ニング方法は、容易に自動化され得、血管形成は公知の自動化されたカウント技
術、画像分析またはスペクトログラフによってモニターされ得る。
リーニングする方法が提供され、該方法は、内皮細胞と他の細胞タイプ(好まし くは、線維芽細胞のような間質細胞)との共同培養物を培養すること、それとの 相互作用を起こさせて血管形成の組合せ段階を発揮させること、同じ目的の複数
のテスト容器を用意して該培養物にコントロールされた量の該薬剤を提供するこ
と、および容器を観察して血管形成をモニターすること、を包含する。スクリー
ニング方法は、容易に自動化され得、血管形成は公知の自動化されたカウント技
術、画像分析またはスペクトログラフによってモニターされ得る。
【００１３】 好ましくは、アッセイは、下記の、 (a)二重細胞培養物を維持するのに好適であり、その中で少なくとも内皮細胞の 増殖を維持するのに好適な培養培地を有する増殖容器をセットアップする工程、 (b)ヒト線維芽細胞およびヒト内皮細胞の二重培養物を播き、その予め決められ た標的比率を得る工程、 (c)いかなる外因性増殖因子も提供することなく、それをインキュベートする工 程、 (d)コンフルエントな単層が得られるまで初期増殖相からの細胞の経過をモニタ ーする工程、 (e)細胞発生の増殖、移動および分化の段階を通して、一定時間毎に培養培地を 交換する工程、を包含する。
【００１４】 好ましくは、線維芽細胞は、ヒト成人皮膚線維芽細胞であり、内皮細胞は、ヒ
ト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)である。
ト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)である。
【００１５】 ヒト成人皮膚線維芽細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対する二重培養物 中の細胞比率は、好ましくは、約2:1〜8:1である。
【００１６】 有利には、二重培養物の培養培地は、48時間毎に変えられる。
【００１７】 本発明の他の局面によれば、線維芽細胞および内皮細胞を維持するのに好適な
培養培地が提供され、二重培養物としての予め決められた比率で該細胞を播かれ
た容器を含むアッセイ・キットが提供され、ここで、細胞はそれぞれ好ましくは
、ヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)であり、該容器 中の細胞の生存度は、取引先に送られる約24時間前にモニターされる。
培養培地が提供され、二重培養物としての予め決められた比率で該細胞を播かれ
た容器を含むアッセイ・キットが提供され、ここで、細胞はそれぞれ好ましくは
、ヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)であり、該容器 中の細胞の生存度は、取引先に送られる約24時間前にモニターされる。
【００１８】 好ましくは、容器は、ヒト成人皮膚線維芽細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC
)に対する約2:1〜8:1の細胞比率で含む。
)に対する約2:1〜8:1の細胞比率で含む。
【００１９】 多細胞インビトロ・アッセイに使用するための好ましいテスト・キットは、ヒ
ト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を約2:1〜8:1の細胞 比率で有する二重培養物を播かれた培養容器を含み、該キットはさらに、内皮細
胞増殖を維持し得る増殖培地、固定液、ブロッキング緩衝液、洗浄用緩衝液、好
適に可視化するための試薬および抗体を含む。
ト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を約2:1〜8:1の細胞 比率で有する二重培養物を播かれた培養容器を含み、該キットはさらに、内皮細
胞増殖を維持し得る増殖培地、固定液、ブロッキング緩衝液、洗浄用緩衝液、好
適に可視化するための試薬および抗体を含む。
【００２０】 好ましくは、可視化するための試薬は、フォンビルブラント・イムノアッセイ
またはPECAM-1イムノアッセイに使用されるものである。
またはPECAM-1イムノアッセイに使用されるものである。
【００２１】 本発明の更なる局面によると、多細胞インビトロ・アッセイが提供され、該ア
ッセイは、内皮細胞および線維芽細胞、好ましくはヒト成人皮膚線維芽細胞およ
びヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の二重培養物を含み、培養培地中で維持可能で あり、該培養培地は内皮細胞増殖を少なくとも維持し得、二重培養物はヒト成人
皮膚線維芽細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対する約2:1〜8:1の細胞比率 で播かれ、ここで、該アッセイは特に、薬物研究または腫瘍治療などで使用され
るインビボ血管形成をモデル化するために使用され、こうして供試薬物による血
管形成モデルの阻害が、腫瘍治療で使用されるその好適性を示すことになる。供
試薬物による血管形成モデルの強化は、創傷治療剤として使用されるその好適性
を示すことになる。
ッセイは、内皮細胞および線維芽細胞、好ましくはヒト成人皮膚線維芽細胞およ
びヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の二重培養物を含み、培養培地中で維持可能で あり、該培養培地は内皮細胞増殖を少なくとも維持し得、二重培養物はヒト成人
皮膚線維芽細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対する約2:1〜8:1の細胞比率 で播かれ、ここで、該アッセイは特に、薬物研究または腫瘍治療などで使用され
るインビボ血管形成をモデル化するために使用され、こうして供試薬物による血
管形成モデルの阻害が、腫瘍治療で使用されるその好適性を示すことになる。供
試薬物による血管形成モデルの強化は、創傷治療剤として使用されるその好適性
を示すことになる。
【００２２】 本発明によれば、血管形成の各段階、つまり細胞発生の増殖、移動および分化
の各段階のための、検査およびモデル化を可能にする多細胞インビトロ・アッセ
イが提供される。
の各段階のための、検査およびモデル化を可能にする多細胞インビトロ・アッセ
イが提供される。
【００２３】 本発明は、ここで、下記の図面および更に以下の実施例を参照して説明される
。
。
【００２４】 図2aおよび2bの培養物は14日間培養され、従って、図1cと直接比較可能である
。
。
【００２５】 図１−３での可視化は、DAB基質を用いたフォンビルブラント因子イムノアッ セイ、およびヘマトキシリン対比染色による。
【００２６】 本発明によれば、二重培養物を用い、更なる増殖因子を要求せずに好適な細胞
シグナリング・メカニズムに依存する、血管形成のためのインビトロ・アッセイ
が提供される。血管形成の刺激および阻害の両方とも、この技術を用いて実証で
きる。
シグナリング・メカニズムに依存する、血管形成のためのインビトロ・アッセイ
が提供される。血管形成の刺激および阻害の両方とも、この技術を用いて実証で
きる。
【００２７】 さらに、本発明のアッセイ・システムは、血管形成の３つの段階全て、即ち、
増殖、移動および分化を組合せるものである。
増殖、移動および分化を組合せるものである。
【００２８】 該アッセイ・システムは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をヒト成人皮膚線維 芽細胞と共に共同培養することを包含する。提供された条件下で、細胞は、一連
の網状の細管を形成する。
の網状の細管を形成する。
【００２９】 ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)は、好適な販路から市販されており、この場合 、低温保存された形態で購入される。細管アッセイで使用する前に、細胞を、2%
のウシ胎児血清を含む任意の好適な市販されている内皮増殖培地EGM中で、ルー チンに継代し培養する。HUVECは、アッセイ中で2〜6継代で使用される。
のウシ胎児血清を含む任意の好適な市販されている内皮増殖培地EGM中で、ルー チンに継代し培養する。HUVECは、アッセイ中で2〜6継代で使用される。
【００３０】 ヒト成人皮膚線維芽細胞は、地方病院から得られた皮膚サンプルから屋内で培
養する。細管アッセイで使用する前に、細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地プ
ラス10%ウシ胎児血清中で、ルーチンに継代し培養する。線維芽細胞は、アッセ イ中で6〜10継代で使用される。
養する。細管アッセイで使用する前に、細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地プ
ラス10%ウシ胎児血清中で、ルーチンに継代し培養する。線維芽細胞は、アッセ イ中で6〜10継代で使用される。
【００３１】 アッセイで使用される組織培養物で処理した容器は、EGMプラスおよびマイナ ス処理により、30分間37℃で5% CO2加湿雰囲気でプレインキュベーションするこ
とによって平衡化される。12-ウェルおよび24-ウェルの組織培養処理されたプレ
ートが通常使用されるが、他のものが同等に使用され得、添加される体積は12- ウェルプレートについてはウェル当り1 mlおよび24-ウェルプレートについては ウェル当り0.5 mlである。細胞は、線維芽細胞については任意の好適な市販され
ているトリプシン溶液、HUVECについては任意の好適な市販されているトリプシ ン-EDTA溶液を用いて回収される。細胞を、EGM中に再懸濁し、カウントする。使
用する直前に、細胞を注射器および針(23G×1・1/4)を通して絞り出し、優れた散
布を確認する。
とによって平衡化される。12-ウェルおよび24-ウェルの組織培養処理されたプレ
ートが通常使用されるが、他のものが同等に使用され得、添加される体積は12- ウェルプレートについてはウェル当り1 mlおよび24-ウェルプレートについては ウェル当り0.5 mlである。細胞は、線維芽細胞については任意の好適な市販され
ているトリプシン溶液、HUVECについては任意の好適な市販されているトリプシ ン-EDTA溶液を用いて回収される。細胞を、EGM中に再懸濁し、カウントする。使
用する直前に、細胞を注射器および針(23G×1・1/4)を通して絞り出し、優れた散
布を確認する。
【００３２】 ２タイプの細胞を、要求された密度および播種率(それは、線維芽細胞対HUVEC
が2:1〜8:1であり得る)で完全に混合し、プレートに加える。増殖表面にわたり 均一な分布を確実にするために、プレートを穏やかに無作為に攪拌する。これは
、ウェルの中心で細胞がたまるのを妨げる。
が2:1〜8:1であり得る)で完全に混合し、プレートに加える。増殖表面にわたり 均一な分布を確実にするために、プレートを穏やかに無作為に攪拌する。これは
、ウェルの中心で細胞がたまるのを妨げる。
【００３３】 細胞比率および播種密度は、このアッセイにおいて、とりわけ重要性がある。
これらは、使用されるそれぞれのHUVEC系と共に変化し得、新しい系が導入され るときはいつも、細管形成の条件を最適にするよう確立されなければならない。
これらは、使用されるそれぞれのHUVEC系と共に変化し得、新しい系が導入され るときはいつも、細管形成の条件を最適にするよう確立されなければならない。
【００３４】 共同培養物は、通常は、完全な培地交換を約２日毎に行なって、14日間にわた
りインキュベーションされる。痕跡の細管の発生は、約４日目からであるが、全
ての細胞タイプを有するときに変化が起こり得、細管がより早期に形成し得る。
全プロセスは、播種密度を増加しながら確立された比率を維持することによって
、７日間以下に加速し得る。これは、しかしながら、あらゆる処置の効果が短期
間よりむしろ長期間にわたってより良く見られ得るので、常に望ましいわけでは
ない。
りインキュベーションされる。痕跡の細管の発生は、約４日目からであるが、全
ての細胞タイプを有するときに変化が起こり得、細管がより早期に形成し得る。
全プロセスは、播種密度を増加しながら確立された比率を維持することによって
、７日間以下に加速し得る。これは、しかしながら、あらゆる処置の効果が短期
間よりむしろ長期間にわたってより良く見られ得るので、常に望ましいわけでは
ない。
【００３５】 アッセイの進行をモニターするために、14日間の増殖期間において４つの時点
を通常使用する。これは、要件に適合するように変更し得る。それぞれの時点で
、培地は増殖容器から捨てられ、細胞を、冷却(-20℃)70%エタノール中で30分間
室温で固定する。この時点で、プレートは、リン酸緩衝整理食塩水中で実験が完
了するまで４℃で洗浄および貯蔵され得、そのときには全ての培養物は同時に発
生し、それぞれの時点は別々に対処され得る。
を通常使用する。これは、要件に適合するように変更し得る。それぞれの時点で
、培地は増殖容器から捨てられ、細胞を、冷却(-20℃)70%エタノール中で30分間
室温で固定する。この時点で、プレートは、リン酸緩衝整理食塩水中で実験が完
了するまで４℃で洗浄および貯蔵され得、そのときには全ての培養物は同時に発
生し、それぞれの時点は別々に対処され得る。
【００３６】 今日まで、細管の可視化は、イムノアッセイにより、HUVEC系中の２つの細胞 マーカーの１つを標的化することを包含する。これらのマーカーは、糖タンパク
質フォンビルブラント因子および細胞接着分子PECAM-1である。
質フォンビルブラント因子および細胞接着分子PECAM-1である。
【００３７】 ヒトのフォンビルブラント因子(因子VIII R:Ag)は、多量体の血漿糖タンパク 質である。それは、容器壁への血小板付着を仲介し、凝固因子VIIIに関する担体
および安定化剤として機能する。該因子は、内皮細胞によって構成的に合成され
る。血小板内皮細胞接着分子つまりPECAM-1は、Igスーパーファミリーのメンバ ーであり、内皮細胞の表面とくに細胞間結合部で構成的に見い出される130-KDの
内在性膜糖タンパク質である。それは、血小板および白血球の表面でも発現され
る。
および安定化剤として機能する。該因子は、内皮細胞によって構成的に合成され
る。血小板内皮細胞接着分子つまりPECAM-1は、Igスーパーファミリーのメンバ ーであり、内皮細胞の表面とくに細胞間結合部で構成的に見い出される130-KDの
内在性膜糖タンパク質である。それは、血小板および白血球の表面でも発現され
る。
【００３８】 イムノアッセイ・プロセスは、酵素複合体化された二次抗体が、細胞マーカー
に結合した非標識一次抗体と反応する、２段階の間接的方法を包含する。基質溶
液が加えられ、これは酵素複合体と反応して、不溶性の着色した最終産物を生じ
る。この様にして、内皮細管は可視化される。共同培養物は、ヘマトキシリン核
染色で対比染色され得る。これは、線維芽細胞単層の可視化を助ける。
に結合した非標識一次抗体と反応する、２段階の間接的方法を包含する。基質溶
液が加えられ、これは酵素複合体と反応して、不溶性の着色した最終産物を生じ
る。この様にして、内皮細管は可視化される。共同培養物は、ヘマトキシリン核
染色で対比染色され得る。これは、線維芽細胞単層の可視化を助ける。
【００３９】 細管の定量的評価は、手動によるカウントからビデオ画像化およびコンピュー
ター化された画像分析にわたる様々な方法によって達成され得る。
ター化された画像分析にわたる様々な方法によって達成され得る。
【００４０】 HUVEC細胞および線維芽細胞が、任意の外因性成長因子を含まないが培養培地 の完全な入れ替えを２日毎に行って共同培養物中で共にインキュベートされると
き、細胞は、増殖段階を初めに通過し、それはコンフルエントな単層が生じるま
で継続する。１日目に、培養物は、内皮細胞の小さな島と共に線維芽細胞のバッ
クグラウンドからなる(図１a)。内皮細胞は、増殖を続けながら移動相に入り、 そこでそれらは線維芽細胞層内で移動して、約７日目に糸様細管構造物を形成す
るのを見ることができる(図1b)。これらの構造物は、実質的に伸張し集合して、
約14日目にヒヨコ漿尿膜の毛細血管床に似た網状のネットワークを形成する(図1
c)。このプロセスで形成された「血管」は、増殖相の間に形成されたHUVECの島 を起源とするのを、しばしば見ることができる。高濃度の線維芽細胞は、そこか
らHUVECが移動してきた領域で殆ど常に見られる。14日目までに、細管は、開存 管腔を有して、より広くより厚くなり、それらは位相差顕微鏡で可視化され得る
。
き、細胞は、増殖段階を初めに通過し、それはコンフルエントな単層が生じるま
で継続する。１日目に、培養物は、内皮細胞の小さな島と共に線維芽細胞のバッ
クグラウンドからなる(図１a)。内皮細胞は、増殖を続けながら移動相に入り、 そこでそれらは線維芽細胞層内で移動して、約７日目に糸様細管構造物を形成す
るのを見ることができる(図1b)。これらの構造物は、実質的に伸張し集合して、
約14日目にヒヨコ漿尿膜の毛細血管床に似た網状のネットワークを形成する(図1
c)。このプロセスで形成された「血管」は、増殖相の間に形成されたHUVECの島 を起源とするのを、しばしば見ることができる。高濃度の線維芽細胞は、そこか
らHUVECが移動してきた領域で殆ど常に見られる。14日目までに、細管は、開存 管腔を有して、より広くより厚くなり、それらは位相差顕微鏡で可視化され得る
。
【００４１】 ２つの細胞タイプの播種密度およびHUVECの線維芽細胞に対する比率は、共に 極めて重要である。HUVECが分裂する速度も、重要であるように見える。大きく 変動する倍加時間を有するHUVECを用いることによって、倍加時間が短く、従っ てHUVECが非常に迅速に増殖するとき、結果は、未分化HUVECの大きな島となる傾
向があることが見られ得る。これは、そのプロセスの間に、線維芽細胞とHUVEC との間の細胞内シグナルが分化プロセスを開始する臨界点があることを示す結果
となるであろう。
向があることが見られ得る。これは、そのプロセスの間に、線維芽細胞とHUVEC との間の細胞内シグナルが分化プロセスを開始する臨界点があることを示す結果
となるであろう。
【００４２】 実験は、例えば、新しい薬剤の効果をテストする試験下にあるサンプルによる
、血管形成の阻害または刺激を明示するためのアッセイを使用する可能性を示す
ためにも行われた。
、血管形成の阻害または刺激を明示するためのアッセイを使用する可能性を示す
ためにも行われた。
【００４３】 血管内皮増殖因子(VEGF)は、内皮細胞の認められた分裂促進因子であり、血管
形成を刺激する。インビトロ・システムの操作は、実験の最初およびそれぞれの
培地交換の際に、ヒト組換えVEGFを添加することにより確認した。結果として、
細管形成は、多くのアーケードのネットワークとともに非常に増強された(図2a)
。
形成を刺激する。インビトロ・システムの操作は、実験の最初およびそれぞれの
培地交換の際に、ヒト組換えVEGFを添加することにより確認した。結果として、
細管形成は、多くのアーケードのネットワークとともに非常に増強された(図2a)
。
【００４４】 逆に、抗ヒト組換えVEGF中和抗体をVEGFとともに添加したとき、細管形成は顕
著に低下した(図2b)。該システムは、地方病院から入手されたU-87-MG(ヒト神経
膠芽細胞腫細胞系)およびヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル ・カルチャーズ(ECACC)から入手されるGO-G-CCM(ヒト脳神経膠星状細胞腫)から のものを含む様々な腫瘍細胞系からの馴化培地(血清を含まない)を用いてもテス
トされた、というのも、腫瘍細胞は血管形成をコントロールし得、続いて、増殖
を援助し得ることが仮定されているからである。U-87-MGは、非常に小さな細管 形成を伴うHUVECの塊状増殖を生じたが(図3a)、GO-G-CCMはHUVEC増殖および細管
形成を大きく低下した(図3b)。
著に低下した(図2b)。該システムは、地方病院から入手されたU-87-MG(ヒト神経
膠芽細胞腫細胞系)およびヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル ・カルチャーズ(ECACC)から入手されるGO-G-CCM(ヒト脳神経膠星状細胞腫)から のものを含む様々な腫瘍細胞系からの馴化培地(血清を含まない)を用いてもテス
トされた、というのも、腫瘍細胞は血管形成をコントロールし得、続いて、増殖
を援助し得ることが仮定されているからである。U-87-MGは、非常に小さな細管 形成を伴うHUVECの塊状増殖を生じたが(図3a)、GO-G-CCMはHUVEC増殖および細管
形成を大きく低下した(図3b)。
【００４５】 これらの結果は、アッセイの柔軟性、および異なるモードの作用を有する材料
への応答性を実証する。
への応答性を実証する。
【００４６】 この様にして、アッセイは、血管形成の阻害剤および増強剤をスクリーニング
するために使用され得る。
するために使用され得る。
【００４７】 図５には、14日目での細管におけるコラーゲンIV発現の画像を示している。イ
ンビボでは、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質が、新脈管構造の毛細管を発 生させることによって貯蔵され、このインビトロ画像は、コラーゲンIVが内皮細
胞によって選択的に発現されることを示す。このことは、該アッセイが、実際に
、血管のインビボ発生を模倣していることの更なる証拠である。
ンビボでは、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質が、新脈管構造の毛細管を発 生させることによって貯蔵され、このインビトロ画像は、コラーゲンIVが内皮細
胞によって選択的に発現されることを示す。このことは、該アッセイが、実際に
、血管のインビボ発生を模倣していることの更なる証拠である。
【００４８】 図６は、電子顕微鏡(初期倍率×7,500)を通して見られる、細管アッセイ(14日
目)における細胞層の垂直クロスセクションの写真像を示す。これは、中心管腔(
矢印で示される)を包む幾つかの内皮細胞(矢頭で示される)からなる細管を非常 に明確に示す。これは、アッセイが、中心「腔(cavity)」つまり管腔(lumen)を 有する細管を実際に作製している更なる証拠を示すものである。
目)における細胞層の垂直クロスセクションの写真像を示す。これは、中心管腔(
矢印で示される)を包む幾つかの内皮細胞(矢頭で示される)からなる細管を非常 に明確に示す。これは、アッセイが、中心「腔(cavity)」つまり管腔(lumen)を 有する細管を実際に作製している更なる証拠を示すものである。
【００４９】 全ての細胞が、本発明のアッセイで現在使用されるものに置き換えられる場合
に機能する訳ではないということを示すために、コントロール研究もセットアッ
プされた。コントロール研究は、ヒト臍帯動脈平滑筋細胞(HUASMC)、つまりイン
ビボで内皮細胞と密接な関連を形成する細胞とHUVECとの共同培養を示した。細 管は、形成されなかった。
に機能する訳ではないということを示すために、コントロール研究もセットアッ
プされた。コントロール研究は、ヒト臍帯動脈平滑筋細胞(HUASMC)、つまりイン
ビボで内皮細胞と密接な関連を形成する細胞とHUVECとの共同培養を示した。細 管は、形成されなかった。
【００５０】 上記の発明は、実験のためのインビトロ・モデルを用いて、インビボ血管形成
のより正確な研究を提供し、実験はそれに対する様々な外部因子の効果を見るも
のと認識される。例えば、特定の薬剤(特に、腫瘍治療の分野における)の効果の
研究が、本発明によって多大に援助される。該アッセイは、試験中の特定の薬剤
が血管形成を阻害して、それにより腫瘍増殖を阻害するかどうか、或いは、それ
が血管形成を増強して、それにより創傷治癒治療に適用性を有するかどうかを決
定するのに使用され得る。インビボでは、傷害を受けた組織および幾つかの腫瘍
は、近隣の内皮細胞を刺激して新しい毛細血管新芽を構築する因子を分泌するこ
とにより、血液供給を引き寄せる。従って、このアッセイを使うことにより、特
定の供試薬剤が内皮細胞の刺激を妨げて、それにより腫瘍に血液供給を引き寄せ
るのを妨げ得るかどうかが、示され得る。血液供給を引き寄せ得ない腫瘍は、そ
れらの成長を著しく制限される。本発明は、血管形成それ自身の研究において、
極めて有益なものでもある。
のより正確な研究を提供し、実験はそれに対する様々な外部因子の効果を見るも
のと認識される。例えば、特定の薬剤(特に、腫瘍治療の分野における)の効果の
研究が、本発明によって多大に援助される。該アッセイは、試験中の特定の薬剤
が血管形成を阻害して、それにより腫瘍増殖を阻害するかどうか、或いは、それ
が血管形成を増強して、それにより創傷治癒治療に適用性を有するかどうかを決
定するのに使用され得る。インビボでは、傷害を受けた組織および幾つかの腫瘍
は、近隣の内皮細胞を刺激して新しい毛細血管新芽を構築する因子を分泌するこ
とにより、血液供給を引き寄せる。従って、このアッセイを使うことにより、特
定の供試薬剤が内皮細胞の刺激を妨げて、それにより腫瘍に血液供給を引き寄せ
るのを妨げ得るかどうかが、示され得る。血液供給を引き寄せ得ない腫瘍は、そ
れらの成長を著しく制限される。本発明は、血管形成それ自身の研究において、
極めて有益なものでもある。
【００５１】 培養容器は、線維芽細胞対HUVECの好ましい細胞比率が約2:1〜8:1で増殖する 、生存可能な共同培養物とともに播かれるとも考えられる。約24時間の共同培養
後、次に、バイアルは、キットの形態で好適にパッケージ化されるであろう。キ
ットは、共同培養物を生存可能に維持するために、および(フォンビルブラント ・イムノアッセイまたはPECAM-1イムノアッセイにより)結果を可視化するために
も要求される必要成分も含む。
後、次に、バイアルは、キットの形態で好適にパッケージ化されるであろう。キ
ットは、共同培養物を生存可能に維持するために、および(フォンビルブラント ・イムノアッセイまたはPECAM-1イムノアッセイにより)結果を可視化するために
も要求される必要成分も含む。
【００５２】 多細胞インビトロ・アッセイで使用されるための好ましいテスト・キットは、
約2:1〜8:1の細胞比率のヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(H
UVEC)の二重培養物とともに播かれた培養容器、内皮細胞増殖を維持可能にする 量の増殖培地、固定液、ブロッキング緩衝液、洗浄用緩衝液、並びにフォンビル
ブラント・イムノアッセイまたはPECAM-1イムノアッセイによる好適な可視化の ための試薬および抗体を有する。
約2:1〜8:1の細胞比率のヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(H
UVEC)の二重培養物とともに播かれた培養容器、内皮細胞増殖を維持可能にする 量の増殖培地、固定液、ブロッキング緩衝液、洗浄用緩衝液、並びにフォンビル
ブラント・イムノアッセイまたはPECAM-1イムノアッセイによる好適な可視化の ための試薬および抗体を有する。
【００５３】 従って、キットは、フォンビルブラント・イムノアッセイで使用されるために
、下記の成分： (i)一次抗体 − ウサギ抗ヒトフォンビルブラント因子； (ii)二次抗体 − ヤギ抗ウサギIgG(全分子)西洋ワサビペルオキシダーゼ複合 体；および (iii)基質 − 不溶性末端産物を有する西洋ワサビペルオキシダーゼ基質 およびPECAM-1イムノアッセイで使用されるために、下記成分： (i)一次抗体 − マウス抗ヒトPECAM-1； (ii)二次抗体 − ヤギ抗ウサギIgG(全分子)アルカリ性ホスファターゼ複合体 ；および (iii)基質 − 不溶性末端産物を有するアルカリ性ホスファターゼ基質、 も含む。
、下記の成分： (i)一次抗体 − ウサギ抗ヒトフォンビルブラント因子； (ii)二次抗体 − ヤギ抗ウサギIgG(全分子)西洋ワサビペルオキシダーゼ複合 体；および (iii)基質 − 不溶性末端産物を有する西洋ワサビペルオキシダーゼ基質 およびPECAM-1イムノアッセイで使用されるために、下記成分： (i)一次抗体 − マウス抗ヒトPECAM-1； (ii)二次抗体 − ヤギ抗ウサギIgG(全分子)アルカリ性ホスファターゼ複合体 ；および (iii)基質 − 不溶性末端産物を有するアルカリ性ホスファターゼ基質、 も含む。
【００５４】 完成されたキットは、続いて、血管形成研究、薬剤研究グループおよび／また
は創傷修復研究のような、それら自身の研究に使用されるために取引先に搬出さ
れる。
は創傷修復研究のような、それら自身の研究に使用されるために取引先に搬出さ
れる。
【図１】 図１a-c：１、７および14日間をかけた細管の発生を示す。 図１a：１日目。暗く染色されたHUVEC(茶色)がはっきりと見られ、線維芽細 胞(青色)単層の表面上に位置している(×85)。 図１b：７日目。糸様細管が、コンフルエントな線維芽細胞単層中に形成して いる(×34)。 図１c：14日目。厚みを増した解剖学的構造の血管の込み入ったネットワーク が形成され、多くは、高い線維芽細胞濃度を有する領域から生じてい る(×34)。
【図２】 図2a：ヒト組換え血管内皮成長因子(VEGF)、10ngml-1の添加による、細管形 成の顕著な増加(×34)。 図2b：ヒト組換えVEGF、10ngml-1と組合せた抗ヒト組換えVEGF中和抗体、 10μgml-1添加による、細管形成の顕著な増加(×34)。
【図３】 図3a：U-87-MG馴化培地とともにインキュベーションすると、細管形成の阻 害だけでなくHUVEC数の塊状増加もまたもたらされる。幾つかの細管 は、大きいHUVEC"島"の縁で形成することに注目のこと(×34)。 図3b：GO-G-CCM馴化培地とともにインキュベーションすると、HUVEC増 殖の顕著な減少を生じる。しかしながら、存在するそれらの細胞は、小 さい長さの細管を形成した(×34)。
【図４】 図４：BCIP/NBT基質(アルカリ性ホスファターゼ適合性)を用い、PECAM-1 イムノアッセイによって発色された、14日目の細管形成の画像を示す (×34)。
【図５】 図５：14日目の細管におけるコラーゲンIV発現の画像を示す(×85)。
【図６】 図６：電子顕微鏡で見られる14日目の細管アッセイにおける細胞層の垂直ク ロスセクションの写真画像(初期倍率×7,500)。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月２４日（２０００．３．２４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 血管形成の多細胞インビトロ・アッセイ
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、血管形成のインビトロ・アッセイ、特に血管形成の多細胞インビト
ロ・アッセイに関する。
ロ・アッセイに関する。
【０００２】 脊椎動物における、分化細胞の殆どのポピュレーションは、細胞の死および再
生によるターンオーバーに従う。肝臓の肝実質細胞および血管に一列に並ぶ内皮
細胞のような幾つかの充分に分化した細胞は、単純に分裂して同じ分化タイプの
娘細胞を生じる。そのような細胞の増殖速度は、トータルの細胞数を維持するよ
うにコントロールされる。従って、肝臓の大部分が破壊された場合、残りの肝実
質細胞は、その損失を回復するように、それらの分裂速度を増加する。
生によるターンオーバーに従う。肝臓の肝実質細胞および血管に一列に並ぶ内皮
細胞のような幾つかの充分に分化した細胞は、単純に分裂して同じ分化タイプの
娘細胞を生じる。そのような細胞の増殖速度は、トータルの細胞数を維持するよ
うにコントロールされる。従って、肝臓の大部分が破壊された場合、残りの肝実
質細胞は、その損失を回復するように、それらの分裂速度を増加する。
【０００３】 内皮細胞は、全ての血管に一列に並ぶ細胞の単層を形成し、血流と周辺組織と
の間での交換を制御している。新しい血管は、これらの内皮細胞の外殖により既
存の小血管壁から発生し、該内皮細胞は、培養中で単離されたときでも中空の毛
細管を形成する能力を有する。インビボでは、傷害された細胞および幾つかの腫
瘍は、近隣の内皮細胞に毛細血管の新芽を構築するよう刺激する因子を分泌する
ことによって、血液供給を引き寄せる。血液供給を引き寄せ得ない腫瘍は、それ
らの増殖を著しく制限される。
の間での交換を制御している。新しい血管は、これらの内皮細胞の外殖により既
存の小血管壁から発生し、該内皮細胞は、培養中で単離されたときでも中空の毛
細管を形成する能力を有する。インビボでは、傷害された細胞および幾つかの腫
瘍は、近隣の内皮細胞に毛細血管の新芽を構築するよう刺激する因子を分泌する
ことによって、血液供給を引き寄せる。血液供給を引き寄せ得ない腫瘍は、それ
らの増殖を著しく制限される。
【０００４】 新しい血管が、既存の小血管から出芽する毛細血管として創始するプロセスは
、血管形成(angiogenesis)と呼ばれる。従って、血管形成は、正常な組織発生と
修復および幾つかの病理学的状態の進行において主要な役割を果たすと見ること
ができる。
、血管形成(angiogenesis)と呼ばれる。従って、血管形成は、正常な組織発生と
修復および幾つかの病理学的状態の進行において主要な役割を果たすと見ること
ができる。
【０００５】 一旦、血管系が充分に発生すると、血管の内皮細胞は通常は静止状態を維持し
て、新しい血管を形成しない。疾病や外傷が起きた場合、新しい血管の形成は、
自然な創傷治癒につれて正常に進行し得るか、或いは、慢性皮膚潰瘍でのように
不充分であり得るか増殖の脱調節があって、腫瘍形成、糖尿病性網膜症、乾癬お
よび炎症でのように、血管密度の異常な増加が後から起こる。非治癒創傷での不
適切な血管形成の阻害または血管形成の増強は、従って、薬物発見プログラムに
とって極めて重要なターゲットである。しかしながら、新薬開発を導く、この領
域での研究は、血管形成のインビトロモデルの欠如により妨げられてきた。
て、新しい血管を形成しない。疾病や外傷が起きた場合、新しい血管の形成は、
自然な創傷治癒につれて正常に進行し得るか、或いは、慢性皮膚潰瘍でのように
不充分であり得るか増殖の脱調節があって、腫瘍形成、糖尿病性網膜症、乾癬お
よび炎症でのように、血管密度の異常な増加が後から起こる。非治癒創傷での不
適切な血管形成の阻害または血管形成の増強は、従って、薬物発見プログラムに
とって極めて重要なターゲットである。しかしながら、新薬開発を導く、この領
域での研究は、血管形成のインビトロモデルの欠如により妨げられてきた。
【０００６】 血管形成は、広範囲の増殖因子、細胞外マトリックス分子、酵素および様々な
細胞タイプを包含する極めて複雑なプロセスである。そのような複雑な関連性は
、インビボでのプロセス全体をモデル化するインビトロ・アッセイを開発するの
に主要な困難を生じた。血管形成は、増殖、移動および分化という３相に亜分類
され得る。これらの相それぞれを別々にモデル化するアッセイは、存在する。単
純なインビトロ・テストは、或る範囲の細胞タイプの増殖の変化を測定し、基底
膜タンパク質の上での移動を評価する。タンパク質マトリックスの提供に依存す
る最近のインビトロアッセイ・システムは、分化する内皮細胞の能力を効果的に
測定する。
細胞タイプを包含する極めて複雑なプロセスである。そのような複雑な関連性は
、インビボでのプロセス全体をモデル化するインビトロ・アッセイを開発するの
に主要な困難を生じた。血管形成は、増殖、移動および分化という３相に亜分類
され得る。これらの相それぞれを別々にモデル化するアッセイは、存在する。単
純なインビトロ・テストは、或る範囲の細胞タイプの増殖の変化を測定し、基底
膜タンパク質の上での移動を評価する。タンパク質マトリックスの提供に依存す
る最近のインビトロアッセイ・システムは、分化する内皮細胞の能力を効果的に
測定する。
【０００７】 分化を測定するアッセイ・システムは、内皮細胞によるヒモ様構造の形成を包
含する。全てのそのようなシステムは、その上に細胞が移動して細管を形成する
外因性基底膜タンパク質の細胞への供給に依存する。細胞移動は、2-16時間とい
う比較的に短時間で起こり、３次元構造を生じる。タンパク質に加えて、システ
ムの多くは、増殖因子の提供を要求し、許容し得る細管形成を生じる。細管が形
成される時間スケールは、分化の阻害に関する優れたテストを提供するが、増強
をテストするときにはそれほど有用ではない。
含する。全てのそのようなシステムは、その上に細胞が移動して細管を形成する
外因性基底膜タンパク質の細胞への供給に依存する。細胞移動は、2-16時間とい
う比較的に短時間で起こり、３次元構造を生じる。タンパク質に加えて、システ
ムの多くは、増殖因子の提供を要求し、許容し得る細管形成を生じる。細管が形
成される時間スケールは、分化の阻害に関する優れたテストを提供するが、増強
をテストするときにはそれほど有用ではない。
【０００８】 上述のアッセイ・システムは、血管形成のモデル化に最も近くなるが、それら
のいずれも血管形成に要求される３つの段階全てを組合せるものではない。
のいずれも血管形成に要求される３つの段階全てを組合せるものではない。
【０００９】 ３次元細胞培養システムの従来技術には、外因性マトリックスが主として基底
膜タンパク質の役割を模倣するよう利用する例があり、基底膜タンパク質それ自
体は、マトリックスがその代わりに利用されるように要求されない。マトリック
スは、細胞がそれに接着するのを可能にし、その結果、１層以上で増殖する。マ
トリックスは、ストロマ細胞が、開口部を貫いて伸張可能にするよう好適なサイ
ズの開口部を有していなければならない。従って、正しいタイプのマトリックス
は、培養される細胞に依存して、選択されなければならない。該システムは、多
量の分化した組織を提供するために使用され得、または生理学的もしくは病理学
的条件の研究のためのモデル・システムとして使用され得る。
膜タンパク質の役割を模倣するよう利用する例があり、基底膜タンパク質それ自
体は、マトリックスがその代わりに利用されるように要求されない。マトリック
スは、細胞がそれに接着するのを可能にし、その結果、１層以上で増殖する。マ
トリックスは、ストロマ細胞が、開口部を貫いて伸張可能にするよう好適なサイ
ズの開口部を有していなければならない。従って、正しいタイプのマトリックス
は、培養される細胞に依存して、選択されなければならない。該システムは、多
量の分化した組織を提供するために使用され得、または生理学的もしくは病理学
的条件の研究のためのモデル・システムとして使用され得る。
【００１０】 WO96/39101は、生分解性または非生分解性の３次元の支持体フレームワーク上
でのストロマ細胞の増殖を開示しており、ストロマ細胞は、正常ヒト組織で産生
されるように、該フレームワーク上でヒト細胞外マトリックスを合成し、そして
３次元フレームワーク上に堆積する。細胞外マトリックスは、グリコサミノグリ
カン鎖のネットワークからなる水和ゲル中で編み合わされた様々な繊維形成タン
パク質を含む。繊維形成タンパク質は、例えば、コラーゲンおよびエラスチンで
あり得る。幾つかのプロセッシング工程の後、プロセッシングされた細胞外マト
リックスは、患者の皮内または皮下に注射され、軟組織を強化し、先天的異常、
後天的欠陥または美容上の欠陥を修復または矯正し得る。
でのストロマ細胞の増殖を開示しており、ストロマ細胞は、正常ヒト組織で産生
されるように、該フレームワーク上でヒト細胞外マトリックスを合成し、そして
３次元フレームワーク上に堆積する。細胞外マトリックスは、グリコサミノグリ
カン鎖のネットワークからなる水和ゲル中で編み合わされた様々な繊維形成タン
パク質を含む。繊維形成タンパク質は、例えば、コラーゲンおよびエラスチンで
あり得る。幾つかのプロセッシング工程の後、プロセッシングされた細胞外マト
リックスは、患者の皮内または皮下に注射され、軟組織を強化し、先天的異常、
後天的欠陥または美容上の欠陥を修復または矯正し得る。
【００１１】 他方、WO96/40175も、特に様々な異なる細胞を培養するのに使用されるための
ストロマ細胞に基づく３次元細胞培養システム、ならびに細管、腱、靱帯および
矯正的構造物の形成に使用されるための組織を開示している。マトリックスのた
めに使用されるこのタイプの材料は、人工ポリマー様コラーゲンのような生分解
性のものであり得る。
ストロマ細胞に基づく３次元細胞培養システム、ならびに細管、腱、靱帯および
矯正的構造物の形成に使用されるための組織を開示している。マトリックスのた
めに使用されるこのタイプの材料は、人工ポリマー様コラーゲンのような生分解
性のものであり得る。
【００１２】 EP0358506に開示される３次元組織培養システムは、ストロマ細胞の３次元で の増殖が、長期間の培養で、単層システムでよりも細胞の活発な増殖を維持する
という事実に基づく。骨髄、皮膚、肝臓、膵臓などの組織は全て、そのような３
次元システム中で増殖し得ることが示されている。得られた培養物は、生理学ま
たは病理学的状態を研究するモデル・システムとして使用され得ることも記載さ
れている。該マトリックスは、任意の材料または材料の混合物(例えば、就中、 処理されたナイロン、ゼラチン、セルロースおよび綿)から作製され得、それら 材料は一般に、メッシュに織られて３次元構造を形成する。生分解性マトリック
ス上で培養されたそれらの細胞は、in situで患者にインプラントされ得る。非 生分解性マトリックス上で培養されたそれらの細胞は、培養物から得られ、続い
て、使用されなければならない。
という事実に基づく。骨髄、皮膚、肝臓、膵臓などの組織は全て、そのような３
次元システム中で増殖し得ることが示されている。得られた培養物は、生理学ま
たは病理学的状態を研究するモデル・システムとして使用され得ることも記載さ
れている。該マトリックスは、任意の材料または材料の混合物(例えば、就中、 処理されたナイロン、ゼラチン、セルロースおよび綿)から作製され得、それら 材料は一般に、メッシュに織られて３次元構造を形成する。生分解性マトリック
ス上で培養されたそれらの細胞は、in situで患者にインプラントされ得る。非 生分解性マトリックス上で培養されたそれらの細胞は、培養物から得られ、続い
て、使用されなければならない。
【００１３】 最後に、US5160490は、インビトロで長期間にわたり、様々な異なる細胞およ び組織を培養するのに使用さ得る３次元培養システムを記載している。所望の組
織からの細胞は、予め確立されたマトリックス上で接種され増殖される。ストロ
マ支持体マトリックスは、３次元マトリックス上で活発に増殖するストロマ細胞
を含む。再度、EP0358506にあるように、マトリックスは、任意の材料または材 料の混合物(例えば、就中、処理されたナイロン、ゼラチン、セルロースおよび 綿)から作製され得、それら材料は一般に、メッシュに織られて３次元構造を形 成する。その後で患者にインプラントするために、生分解性マトリックスは、ゼ
ラチンのように使用されるべきである。他方、培養物が長時間にわたり維持され
る場合は、ナイロンメッシュタイプのマトリックスが好ましい。
織からの細胞は、予め確立されたマトリックス上で接種され増殖される。ストロ
マ支持体マトリックスは、３次元マトリックス上で活発に増殖するストロマ細胞
を含む。再度、EP0358506にあるように、マトリックスは、任意の材料または材 料の混合物(例えば、就中、処理されたナイロン、ゼラチン、セルロースおよび 綿)から作製され得、それら材料は一般に、メッシュに織られて３次元構造を形 成する。その後で患者にインプラントするために、生分解性マトリックスは、ゼ
ラチンのように使用されるべきである。他方、培養物が長時間にわたり維持され
る場合は、ナイロンメッシュタイプのマトリックスが好ましい。
【００１４】 これらの文献のいずれも、血管形成の組合せ段階をモニターするための、これ
らシステムの使用について何ら言及していない。さらに、モデルとして使用する
ための３次元システムの使用は、実際には、可視化および定量化とも、極めて困
難なものにする。従って、本出願が、２次元アッセイに関するものであり、従来
技術の３次元アッセイよりも可視化および定量的画像化を目的として非常により
好適であるという点で、これらの従来技術文献に勝る利点を有することが、開示
から全く明らかである。
らシステムの使用について何ら言及していない。さらに、モデルとして使用する
ための３次元システムの使用は、実際には、可視化および定量化とも、極めて困
難なものにする。従って、本出願が、２次元アッセイに関するものであり、従来
技術の３次元アッセイよりも可視化および定量的画像化を目的として非常により
好適であるという点で、これらの従来技術文献に勝る利点を有することが、開示
から全く明らかである。
【００１５】 全ての引用された文献が、インビトロで延長された時間、様々な異なる組織の
培養を援助する基底膜タンパク質を明らかに模倣する更なる外因性マトリックス
の使用を記載していることは容易に判り得る。本発明の全体的な目的は、そのよ
うなシステムの使用から外れることであり、インビトロでインビボ血管形成プロ
セスをモデル化した単純な二重培養システムを提供することである。
培養を援助する基底膜タンパク質を明らかに模倣する更なる外因性マトリックス
の使用を記載していることは容易に判り得る。本発明の全体的な目的は、そのよ
うなシステムの使用から外れることであり、インビトロでインビボ血管形成プロ
セスをモデル化した単純な二重培養システムを提供することである。
【００１６】 本発明の目的は、血管形成の３つの段階全てに依存する血管形成のインビトロ
・アッセイを提供することによって、上述の不利な点を取り除く又は軽減するこ
とであり、血管形成の刺激および阻害の両方を調べるために使用され得る。
・アッセイを提供することによって、上述の不利な点を取り除く又は軽減するこ
とであり、血管形成の刺激および阻害の両方を調べるために使用され得る。
【００１７】 本発明の１つの局面によると、血管形成の組合せ段階(combined stages)、即 ち、細胞発生の増殖、移動および分化の段階をモデル化するための多細胞インビ
トロ・アッセイが提供され、そこでは、該アッセイは、内皮細胞およびそれとの
相互作用を発揮する他の細胞タイプとの二重培養物を提供して、インビトロでの
血管形成の組合せ段階を発揮することを包含する。
トロ・アッセイが提供され、そこでは、該アッセイは、内皮細胞およびそれとの
相互作用を発揮する他の細胞タイプとの二重培養物を提供して、インビトロでの
血管形成の組合せ段階を発揮することを包含する。
【００１８】 本発明の１つの局面によれば、そのようなアッセイは、線維芽細胞および内皮
細胞の二重培養物の使用に依存し、標準培養培地における以外の更なる増殖因子
を要求しない。これらの細胞タイプの相互作用は、それらの間での細胞シグナリ
ング・メカニズムに依存すると仮定されている。更なる増殖因子に依存しないこ
とは、本課題の過去の研究を考慮すると、驚くべきことであり予測しなかったこ
とである。
細胞の二重培養物の使用に依存し、標準培養培地における以外の更なる増殖因子
を要求しない。これらの細胞タイプの相互作用は、それらの間での細胞シグナリ
ング・メカニズムに依存すると仮定されている。更なる増殖因子に依存しないこ
とは、本課題の過去の研究を考慮すると、驚くべきことであり予測しなかったこ
とである。
【００１９】 本発明の他の局面によると、血管形成を促進または阻害するための薬剤をスク
リーニングする方法が提供され、該方法は、内皮細胞と他の細胞タイプ(好まし くは、線維芽細胞のような間質細胞)との共同培養物を培養すること、それとの 相互作用を起こさせて血管形成の組合せ段階を発揮させること、同じ目的の複数
のテスト容器を用意して該培養物にコントロールされた量の該薬剤を提供するこ
と、および容器を観察して血管形成をモニターすること、を包含する。スクリー
ニング方法は、容易に自動化され得、血管形成は公知の自動化されたカウント技
術、画像分析またはスペクトログラフによってモニターされ得る。
リーニングする方法が提供され、該方法は、内皮細胞と他の細胞タイプ(好まし くは、線維芽細胞のような間質細胞)との共同培養物を培養すること、それとの 相互作用を起こさせて血管形成の組合せ段階を発揮させること、同じ目的の複数
のテスト容器を用意して該培養物にコントロールされた量の該薬剤を提供するこ
と、および容器を観察して血管形成をモニターすること、を包含する。スクリー
ニング方法は、容易に自動化され得、血管形成は公知の自動化されたカウント技
術、画像分析またはスペクトログラフによってモニターされ得る。
【００２０】 好ましくは、アッセイは、下記の、 (a)二重細胞培養物を維持するのに好適であり、その中で少なくとも内皮細胞の 増殖を維持するのに好適な培養培地を有する増殖容器をセットアップする工程、
(b)ヒト線維芽細胞およびヒト内皮細胞の二重培養物を播き、その予め決められ た標的比率を得る工程、 (c)いかなる外因性増殖因子も提供することなく、それをインキュベートする工 程、 (d)コンフルエントな単層が得られるまで初期増殖相からの細胞の経過をモニタ ーする工程、 (e)細胞発生の増殖、移動および分化の段階を通して、一定時間毎に培養培地を 交換する工程、を包含する。
(b)ヒト線維芽細胞およびヒト内皮細胞の二重培養物を播き、その予め決められ た標的比率を得る工程、 (c)いかなる外因性増殖因子も提供することなく、それをインキュベートする工 程、 (d)コンフルエントな単層が得られるまで初期増殖相からの細胞の経過をモニタ ーする工程、 (e)細胞発生の増殖、移動および分化の段階を通して、一定時間毎に培養培地を 交換する工程、を包含する。
【００２１】 好ましくは、線維芽細胞は、ヒト成人皮膚線維芽細胞であり、内皮細胞は、ヒ
ト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)である。
ト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)である。
【００２２】 ヒト成人皮膚線維芽細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対する二重培養物 中の細胞比率は、好ましくは、約2:1〜8:1である。
【００２３】 有利には、二重培養物の培養培地は、48時間毎に変えられる。
【００２４】 本発明の他の局面によれば、線維芽細胞および内皮細胞を維持するのに好適な
培養培地が提供され、二重培養物としての予め決められた比率で該細胞を播かれ
た容器を含むアッセイ・キットが提供され、ここで、細胞はそれぞれ好ましくは
、ヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)であり、該容器 中の細胞の生存度は、取引先に送られる約24時間前にモニターされる。
培養培地が提供され、二重培養物としての予め決められた比率で該細胞を播かれ
た容器を含むアッセイ・キットが提供され、ここで、細胞はそれぞれ好ましくは
、ヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)であり、該容器 中の細胞の生存度は、取引先に送られる約24時間前にモニターされる。
【００２５】 好ましくは、容器は、ヒト成人皮膚線維芽細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC
)に対する約2:1〜8:1の細胞比率で含む。
)に対する約2:1〜8:1の細胞比率で含む。
【００２６】 多細胞インビトロ・アッセイに使用するための好ましいテスト・キットは、ヒ
ト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を約2:1〜8:1の細胞 比率で有する二重培養物を播かれた培養容器を含み、該キットはさらに、内皮細
胞増殖を維持し得る増殖培地、固定液、ブロッキング緩衝液、洗浄用緩衝液、好
適に可視化するための試薬および抗体を含む。
ト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を約2:1〜8:1の細胞 比率で有する二重培養物を播かれた培養容器を含み、該キットはさらに、内皮細
胞増殖を維持し得る増殖培地、固定液、ブロッキング緩衝液、洗浄用緩衝液、好
適に可視化するための試薬および抗体を含む。
【００２７】 好ましくは、可視化するための試薬は、フォンビルブラント・イムノアッセイ
またはPECAM-1イムノアッセイに使用されるものである。
またはPECAM-1イムノアッセイに使用されるものである。
【００２８】 本発明の更なる局面によると、多細胞インビトロ・アッセイが提供され、該ア
ッセイは、内皮細胞および線維芽細胞、好ましくはヒト成人皮膚線維芽細胞およ
びヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の二重培養物を含み、培養培地中で維持可能で あり、該培養培地は内皮細胞増殖を少なくとも維持し得、二重培養物はヒト成人
皮膚線維芽細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対する約2:1〜8:1の細胞比率 で播かれ、ここで、該アッセイは特に、薬物研究または腫瘍治療などで使用され
るインビボ血管形成をモデル化するために使用され、こうして供試薬物による血
管形成モデルの阻害が、腫瘍治療で使用されるその好適性を示すことになる。供
試薬物による血管形成モデルの強化は、創傷治療剤として使用されるその好適性
を示すことになる。
ッセイは、内皮細胞および線維芽細胞、好ましくはヒト成人皮膚線維芽細胞およ
びヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の二重培養物を含み、培養培地中で維持可能で あり、該培養培地は内皮細胞増殖を少なくとも維持し得、二重培養物はヒト成人
皮膚線維芽細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対する約2:1〜8:1の細胞比率 で播かれ、ここで、該アッセイは特に、薬物研究または腫瘍治療などで使用され
るインビボ血管形成をモデル化するために使用され、こうして供試薬物による血
管形成モデルの阻害が、腫瘍治療で使用されるその好適性を示すことになる。供
試薬物による血管形成モデルの強化は、創傷治療剤として使用されるその好適性
を示すことになる。
【００２９】 本発明によれば、血管形成の各段階、つまり細胞発生の増殖、移動および分化
の各段階のための、検査およびモデル化を可能にする多細胞インビトロ・アッセ
イが提供される。
の各段階のための、検査およびモデル化を可能にする多細胞インビトロ・アッセ
イが提供される。
【００３０】 本発明は、ここで、下記の図面および更に以下の実施例を参照して説明される
。
。
【００３１】 図2aおよび2bの培養物は14日間培養され、従って、図1cと直接比較可能である
。
。
【００３２】 図１−３での可視化は、DAB基質を用いたフォンビルブラント因子イムノアッ セイ、およびヘマトキシリン対比染色による。
【００３３】 本発明によれば、二重培養物を用い、更なる増殖因子を要求せずに好適な細胞
シグナリング・メカニズムに依存する、血管形成のためのインビトロ・アッセイ
が提供される。血管形成の刺激および阻害の両方とも、この技術を用いて実証で
きる。
シグナリング・メカニズムに依存する、血管形成のためのインビトロ・アッセイ
が提供される。血管形成の刺激および阻害の両方とも、この技術を用いて実証で
きる。
【００３４】 さらに、本発明のアッセイ・システムは、血管形成の３つの段階全て、即ち、
増殖、移動および分化を組合せるものである。
増殖、移動および分化を組合せるものである。
【００３５】 該アッセイ・システムは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をヒト成人皮膚線維 芽細胞と共に共同培養することを包含する。提供された条件下で、細胞は、一連
の網状の細管を形成する。
の網状の細管を形成する。
【００３６】 ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)は、好適な販路から市販されており、この場合 、低温保存された形態で購入される。細管アッセイで使用する前に、細胞を、2%
のウシ胎児血清を含む任意の好適な市販されている内皮増殖培地EGM中で、ルー チンに継代し培養する。HUVECは、アッセイ中で2〜6継代で使用される。
のウシ胎児血清を含む任意の好適な市販されている内皮増殖培地EGM中で、ルー チンに継代し培養する。HUVECは、アッセイ中で2〜6継代で使用される。
【００３７】 ヒト成人皮膚線維芽細胞は、地方病院から得られた皮膚サンプルから屋内で培
養する。細管アッセイで使用する前に、細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地プ
ラス10%ウシ胎児血清中で、ルーチンに継代し培養する。線維芽細胞は、アッセ イ中で6〜10継代で使用される。
養する。細管アッセイで使用する前に、細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地プ
ラス10%ウシ胎児血清中で、ルーチンに継代し培養する。線維芽細胞は、アッセ イ中で6〜10継代で使用される。
【００３８】 アッセイで使用される組織培養物で処理した容器は、EGMプラスおよびマイナ ス処理により、30分間37℃で5% CO2加湿雰囲気でプレインキュベーションするこ
とによって平衡化される。12-ウェルおよび24-ウェルの組織培養処理されたプレ
ートが通常使用されるが、他のものが同等に使用され得、添加される体積は12- ウェルプレートについてはウェル当り1 mlおよび24-ウェルプレートについては ウェル当り0.5 mlである。細胞は、線維芽細胞については任意の好適な市販され
ているトリプシン溶液、HUVECについては任意の好適な市販されているトリプシ ン-EDTA溶液を用いて回収される。細胞を、EGM中に再懸濁し、カウントする。使
用する直前に、細胞を注射器および針(23G×1・1/4)を通して絞り出し、優れた散
布を確認する。
とによって平衡化される。12-ウェルおよび24-ウェルの組織培養処理されたプレ
ートが通常使用されるが、他のものが同等に使用され得、添加される体積は12- ウェルプレートについてはウェル当り1 mlおよび24-ウェルプレートについては ウェル当り0.5 mlである。細胞は、線維芽細胞については任意の好適な市販され
ているトリプシン溶液、HUVECについては任意の好適な市販されているトリプシ ン-EDTA溶液を用いて回収される。細胞を、EGM中に再懸濁し、カウントする。使
用する直前に、細胞を注射器および針(23G×1・1/4)を通して絞り出し、優れた散
布を確認する。
【００３９】 ２タイプの細胞を、要求された密度および播種率(それは、線維芽細胞対HUVEC
が2:1〜8:1であり得る)で完全に混合し、プレートに加える。増殖表面にわたり 均一な分布を確実にするために、プレートを穏やかに無作為に攪拌する。これは
、ウェルの中心で細胞がたまるのを妨げる。
が2:1〜8:1であり得る)で完全に混合し、プレートに加える。増殖表面にわたり 均一な分布を確実にするために、プレートを穏やかに無作為に攪拌する。これは
、ウェルの中心で細胞がたまるのを妨げる。
【００４０】 細胞比率および播種密度は、このアッセイにおいて、とりわけ重要性がある。
これらは、使用されるそれぞれのHUVEC系と共に変化し得、新しい系が導入され るときはいつも、細管形成の条件を最適にするよう確立されなければならない。
これらは、使用されるそれぞれのHUVEC系と共に変化し得、新しい系が導入され るときはいつも、細管形成の条件を最適にするよう確立されなければならない。
【００４１】 共同培養物は、通常は、完全な培地交換を約２日毎に行なって、14日間にわた
りインキュベーションされる。痕跡の細管の発生は、約４日目からであるが、全
ての細胞タイプを有するときに変化が起こり得、細管がより早期に形成し得る。
全プロセスは、播種密度を増加しながら確立された比率を維持することによって
、７日間以下に加速し得る。これは、しかしながら、あらゆる処置の効果が短期
間よりむしろ長期間にわたってより良く見られ得るので、常に望ましいわけでは
ない。
りインキュベーションされる。痕跡の細管の発生は、約４日目からであるが、全
ての細胞タイプを有するときに変化が起こり得、細管がより早期に形成し得る。
全プロセスは、播種密度を増加しながら確立された比率を維持することによって
、７日間以下に加速し得る。これは、しかしながら、あらゆる処置の効果が短期
間よりむしろ長期間にわたってより良く見られ得るので、常に望ましいわけでは
ない。
【００４２】 アッセイの進行をモニターするために、14日間の増殖期間において４つの時点
を通常使用する。これは、要件に適合するように変更し得る。それぞれの時点で
、培地は増殖容器から捨てられ、細胞を、冷却(-20℃)70%エタノール中で30分間
室温で固定する。この時点で、プレートは、リン酸緩衝整理食塩水中で実験が完
了するまで４℃で洗浄および貯蔵され得、そのときには全ての培養物は同時に発
生し、それぞれの時点は別々に対処され得る。
を通常使用する。これは、要件に適合するように変更し得る。それぞれの時点で
、培地は増殖容器から捨てられ、細胞を、冷却(-20℃)70%エタノール中で30分間
室温で固定する。この時点で、プレートは、リン酸緩衝整理食塩水中で実験が完
了するまで４℃で洗浄および貯蔵され得、そのときには全ての培養物は同時に発
生し、それぞれの時点は別々に対処され得る。
【００４３】 今日まで、細管の可視化は、イムノアッセイにより、HUVEC系中の２つの細胞 マーカーの１つを標的化することを包含する。これらのマーカーは、糖タンパク
質フォンビルブラント因子および細胞接着分子PECAM-1である。
質フォンビルブラント因子および細胞接着分子PECAM-1である。
【００４４】 ヒトのフォンビルブラント因子(因子VIII R:Ag)は、多量体の血漿糖タンパク 質である。それは、容器壁への血小板付着を仲介し、凝固因子VIIIに関する担体
および安定化剤として機能する。該因子は、内皮細胞によって構成的に合成され
る。血小板内皮細胞接着分子つまりPECAM-1は、Igスーパーファミリーのメンバ ーであり、内皮細胞の表面とくに細胞間結合部で構成的に見い出される130-KDの
内在性膜糖タンパク質である。それは、血小板および白血球の表面でも発現され
る。
および安定化剤として機能する。該因子は、内皮細胞によって構成的に合成され
る。血小板内皮細胞接着分子つまりPECAM-1は、Igスーパーファミリーのメンバ ーであり、内皮細胞の表面とくに細胞間結合部で構成的に見い出される130-KDの
内在性膜糖タンパク質である。それは、血小板および白血球の表面でも発現され
る。
【００４５】 イムノアッセイ・プロセスは、酵素複合体化された二次抗体が、細胞マーカー
に結合した非標識一次抗体と反応する、２段階の間接的方法を包含する。基質溶
液が加えられ、これは酵素複合体と反応して、不溶性の着色した最終産物を生じ
る。この様にして、内皮細管は可視化される。共同培養物は、ヘマトキシリン核
染色で対比染色され得る。これは、線維芽細胞単層の可視化を助ける。
に結合した非標識一次抗体と反応する、２段階の間接的方法を包含する。基質溶
液が加えられ、これは酵素複合体と反応して、不溶性の着色した最終産物を生じ
る。この様にして、内皮細管は可視化される。共同培養物は、ヘマトキシリン核
染色で対比染色され得る。これは、線維芽細胞単層の可視化を助ける。
【００４６】 細管の定量的評価は、手動によるカウントからビデオ画像化およびコンピュー
ター化された画像分析にわたる様々な方法によって達成され得る。
ター化された画像分析にわたる様々な方法によって達成され得る。
【００４７】 HUVEC細胞および線維芽細胞が、任意の外因性成長因子を含まないが培養培地 の完全な入れ替えを２日毎に行って共同培養物中で共にインキュベートされると
き、細胞は、増殖段階を初めに通過し、それはコンフルエントな単層が生じるま
で継続する。１日目に、培養物は、内皮細胞の小さな島と共に線維芽細胞のバッ
クグラウンドからなる(図１a)。内皮細胞は、増殖を続けながら移動相に入り、 そこでそれらは線維芽細胞層内で移動して、約７日目に糸様細管構造物を形成す
るのを見ることができる(図1b)。これらの構造物は、実質的に伸張し集合して、
約14日目にヒヨコ漿尿膜の毛細血管床に似た網状のネットワークを形成する(図1
c)。このプロセスで形成された「血管」は、増殖相の間に形成されたHUVECの島 を起源とするのを、しばしば見ることができる。高濃度の線維芽細胞は、そこか
らHUVECが移動してきた領域で殆ど常に見られる。14日目までに、細管は、開存 管腔を有して、より広くより厚くなり、それらは位相差顕微鏡で可視化され得る
。
き、細胞は、増殖段階を初めに通過し、それはコンフルエントな単層が生じるま
で継続する。１日目に、培養物は、内皮細胞の小さな島と共に線維芽細胞のバッ
クグラウンドからなる(図１a)。内皮細胞は、増殖を続けながら移動相に入り、 そこでそれらは線維芽細胞層内で移動して、約７日目に糸様細管構造物を形成す
るのを見ることができる(図1b)。これらの構造物は、実質的に伸張し集合して、
約14日目にヒヨコ漿尿膜の毛細血管床に似た網状のネットワークを形成する(図1
c)。このプロセスで形成された「血管」は、増殖相の間に形成されたHUVECの島 を起源とするのを、しばしば見ることができる。高濃度の線維芽細胞は、そこか
らHUVECが移動してきた領域で殆ど常に見られる。14日目までに、細管は、開存 管腔を有して、より広くより厚くなり、それらは位相差顕微鏡で可視化され得る
。
【００４８】 ２つの細胞タイプの播種密度およびHUVECの線維芽細胞に対する比率は、共に 極めて重要である。HUVECが分裂する速度も、重要であるように見える。大きく 変動する倍加時間を有するHUVECを用いることによって、倍加時間が短く、従っ てHUVECが非常に迅速に増殖するとき、結果は、未分化HUVECの大きな島となる傾
向があることが見られ得る。これは、そのプロセスの間に、線維芽細胞とHUVEC との間の細胞内シグナルが分化プロセスを開始する臨界点があることを示す結果
となるであろう。
向があることが見られ得る。これは、そのプロセスの間に、線維芽細胞とHUVEC との間の細胞内シグナルが分化プロセスを開始する臨界点があることを示す結果
となるであろう。
【００４９】 実験は、例えば、新しい薬剤の効果をテストする試験下にあるサンプルによる
、血管形成の阻害または刺激を明示するためのアッセイを使用する可能性を示す
ためにも行われた。
、血管形成の阻害または刺激を明示するためのアッセイを使用する可能性を示す
ためにも行われた。
【００５０】 血管内皮増殖因子(VEGF)は、内皮細胞の認められた分裂促進因子であり、血管
形成を刺激する。インビトロ・システムの操作は、実験の最初およびそれぞれの
培地交換の際に、ヒト組換えVEGFを添加することにより確認した。結果として、
細管形成は、多くのアーケードのネットワークとともに非常に増強された(図2a)
。
形成を刺激する。インビトロ・システムの操作は、実験の最初およびそれぞれの
培地交換の際に、ヒト組換えVEGFを添加することにより確認した。結果として、
細管形成は、多くのアーケードのネットワークとともに非常に増強された(図2a)
。
【００５１】 逆に、抗ヒト組換えVEGF中和抗体をVEGFとともに添加したとき、細管形成は顕
著に低下した(図2b)。該システムは、地方病院から入手されたU-87-MG(ヒト神経
膠芽細胞腫細胞系)およびヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル ・カルチャーズ(ECACC)から入手されるGO-G-CCM(ヒト脳神経膠星状細胞腫)から のものを含む様々な腫瘍細胞系からの馴化培地(血清を含まない)を用いてもテス
トされた、というのも、腫瘍細胞は血管形成をコントロールし得、続いて、増殖
を援助し得ることが仮定されているからである。U-87-MGは、非常に小さな細管 形成を伴うHUVECの塊状増殖を生じたが(図3a)、GO-G-CCMはHUVEC増殖および細管
形成を大きく低下した(図3b)。
著に低下した(図2b)。該システムは、地方病院から入手されたU-87-MG(ヒト神経
膠芽細胞腫細胞系)およびヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル ・カルチャーズ(ECACC)から入手されるGO-G-CCM(ヒト脳神経膠星状細胞腫)から のものを含む様々な腫瘍細胞系からの馴化培地(血清を含まない)を用いてもテス
トされた、というのも、腫瘍細胞は血管形成をコントロールし得、続いて、増殖
を援助し得ることが仮定されているからである。U-87-MGは、非常に小さな細管 形成を伴うHUVECの塊状増殖を生じたが(図3a)、GO-G-CCMはHUVEC増殖および細管
形成を大きく低下した(図3b)。
【００５２】 これらの結果は、アッセイの柔軟性、および異なるモードの作用を有する材料
への応答性を実証する。
への応答性を実証する。
【００５３】 この様にして、アッセイは、血管形成の阻害剤および増強剤をスクリーニング
するために使用され得る。
するために使用され得る。
【００５４】 図５には、14日目での細管におけるコラーゲンIV発現の画像を示している。イ
ンビボでは、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質が、新脈管構造の毛細管を発 生させることによって貯蔵され、このインビトロ画像は、コラーゲンIVが内皮細
胞によって選択的に発現されることを示す。このことは、該アッセイが、実際に
、血管のインビボ発生を模倣していることの更なる証拠である。
ンビボでは、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質が、新脈管構造の毛細管を発 生させることによって貯蔵され、このインビトロ画像は、コラーゲンIVが内皮細
胞によって選択的に発現されることを示す。このことは、該アッセイが、実際に
、血管のインビボ発生を模倣していることの更なる証拠である。
【００５５】 図６は、電子顕微鏡(初期倍率×7,500)を通して見られる、細管アッセイ(14日
目)における細胞層の垂直クロスセクションの写真像を示す。これは、中心管腔(
矢印で示される)を包む幾つかの内皮細胞(矢頭で示される)からなる細管を非常 に明確に示す。これは、アッセイが、中心「腔(cavity)」つまり管腔(lumen)を 有する細管を実際に作製している更なる証拠を示すものである。
目)における細胞層の垂直クロスセクションの写真像を示す。これは、中心管腔(
矢印で示される)を包む幾つかの内皮細胞(矢頭で示される)からなる細管を非常 に明確に示す。これは、アッセイが、中心「腔(cavity)」つまり管腔(lumen)を 有する細管を実際に作製している更なる証拠を示すものである。
【００５６】 全ての細胞が、本発明のアッセイで現在使用されるものに置き換えられる場合
に機能する訳ではないということを示すために、コントロール研究もセットアッ
プされた。コントロール研究は、ヒト臍帯動脈平滑筋細胞(HUASMC)、つまりイン
ビボで内皮細胞と密接な関連を形成する細胞とHUVECとの共同培養を示した。細 管は、形成されなかった。
に機能する訳ではないということを示すために、コントロール研究もセットアッ
プされた。コントロール研究は、ヒト臍帯動脈平滑筋細胞(HUASMC)、つまりイン
ビボで内皮細胞と密接な関連を形成する細胞とHUVECとの共同培養を示した。細 管は、形成されなかった。
【００５７】 上記の発明は、実験のためのインビトロ・モデルを用いて、インビボ血管形成
のより正確な研究を提供し、実験はそれに対する様々な外部因子の効果を見るも
のと認識される。例えば、特定の薬剤(特に、腫瘍治療の分野における)の効果の
研究が、本発明によって多大に援助される。該アッセイは、試験中の特定の薬剤
が血管形成を阻害して、それにより腫瘍増殖を阻害するかどうか、或いは、それ
が血管形成を増強して、それにより創傷治癒治療に適用性を有するかどうかを決
定するのに使用され得る。インビボでは、傷害を受けた組織および幾つかの腫瘍
は、近隣の内皮細胞を刺激して新しい毛細血管新芽を構築する因子を分泌するこ
とにより、血液供給を引き寄せる。従って、このアッセイを使うことにより、特
定の供試薬剤が内皮細胞の刺激を妨げて、それにより腫瘍に血液供給を引き寄せ
るのを妨げ得るかどうかが、示され得る。血液供給を引き寄せ得ない腫瘍は、そ
れらの成長を著しく制限される。本発明は、血管形成それ自身の研究において、
極めて有益なものでもある。
のより正確な研究を提供し、実験はそれに対する様々な外部因子の効果を見るも
のと認識される。例えば、特定の薬剤(特に、腫瘍治療の分野における)の効果の
研究が、本発明によって多大に援助される。該アッセイは、試験中の特定の薬剤
が血管形成を阻害して、それにより腫瘍増殖を阻害するかどうか、或いは、それ
が血管形成を増強して、それにより創傷治癒治療に適用性を有するかどうかを決
定するのに使用され得る。インビボでは、傷害を受けた組織および幾つかの腫瘍
は、近隣の内皮細胞を刺激して新しい毛細血管新芽を構築する因子を分泌するこ
とにより、血液供給を引き寄せる。従って、このアッセイを使うことにより、特
定の供試薬剤が内皮細胞の刺激を妨げて、それにより腫瘍に血液供給を引き寄せ
るのを妨げ得るかどうかが、示され得る。血液供給を引き寄せ得ない腫瘍は、そ
れらの成長を著しく制限される。本発明は、血管形成それ自身の研究において、
極めて有益なものでもある。
【００５８】 培養容器は、線維芽細胞対HUVECの好ましい細胞比率が約2:1〜8:1で増殖する 、生存可能な共同培養物とともに播かれるとも考えられる。約24時間の共同培養
後、次に、バイアルは、キットの形態で好適にパッケージ化されるであろう。キ
ットは、共同培養物を生存可能に維持するために、および(フォンビルブラント ・イムノアッセイまたはPECAM-1イムノアッセイにより)結果を可視化するために
も要求される必要成分も含む。
後、次に、バイアルは、キットの形態で好適にパッケージ化されるであろう。キ
ットは、共同培養物を生存可能に維持するために、および(フォンビルブラント ・イムノアッセイまたはPECAM-1イムノアッセイにより)結果を可視化するために
も要求される必要成分も含む。
【００５９】 多細胞インビトロ・アッセイで使用されるための好ましいテスト・キットは、
約2:1〜8:1の細胞比率のヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(H
UVEC)の二重培養物とともに播かれた培養容器、内皮細胞増殖を維持可能にする 量の増殖培地、固定液、ブロッキング緩衝液、洗浄用緩衝液、並びにフォンビル
ブラント・イムノアッセイまたはPECAM-1イムノアッセイによる好適な可視化の ための試薬および抗体を有する。
約2:1〜8:1の細胞比率のヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(H
UVEC)の二重培養物とともに播かれた培養容器、内皮細胞増殖を維持可能にする 量の増殖培地、固定液、ブロッキング緩衝液、洗浄用緩衝液、並びにフォンビル
ブラント・イムノアッセイまたはPECAM-1イムノアッセイによる好適な可視化の ための試薬および抗体を有する。
【００６０】 従って、キットは、フォンビルブラント・イムノアッセイで使用されるために
、下記の成分： (i)一次抗体 − ウサギ抗ヒトフォンビルブラント因子； (ii)二次抗体 − ヤギ抗ウサギIgG(全分子)西洋ワサビペルオキシダーゼ複合
体；および (iii)基質 − 不溶性末端産物を有する西洋ワサビペルオキシダーゼ基質
およびPECAM-1イムノアッセイで使用されるために、下記成分： (i)一次抗体 − マウス抗ヒトPECAM-1； (ii)二次抗体 − ヤギ抗ウサギIgG(全分子)アルカリ性ホスファターゼ複合体
；および (iii)基質 − 不溶性末端産物を有するアルカリ性ホスファターゼ基質、
も含む。
、下記の成分： (i)一次抗体 − ウサギ抗ヒトフォンビルブラント因子； (ii)二次抗体 − ヤギ抗ウサギIgG(全分子)西洋ワサビペルオキシダーゼ複合
体；および (iii)基質 − 不溶性末端産物を有する西洋ワサビペルオキシダーゼ基質
およびPECAM-1イムノアッセイで使用されるために、下記成分： (i)一次抗体 − マウス抗ヒトPECAM-1； (ii)二次抗体 − ヤギ抗ウサギIgG(全分子)アルカリ性ホスファターゼ複合体
；および (iii)基質 − 不溶性末端産物を有するアルカリ性ホスファターゼ基質、
も含む。
【００６１】 完成されたキットは、続いて、血管形成研究、薬剤研究グループおよび／また
は創傷修復研究のような、それら自身の研究に使用されるために取引先に搬出さ
れる。
は創傷修復研究のような、それら自身の研究に使用されるために取引先に搬出さ
れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１a-c：１、７および14日間をかけた細管の発生を示す。 図１a：１日目。暗く染色されたHUVEC(茶色)がはっきりと見られ、線維芽細
胞(青色)単層の表面上に位置している(×85)。 図１b：７日目。糸様細管が、コンフルエントな線維芽細胞単層中に形成して いる(×34)。 図１c：14日目。厚みを増した解剖学的構造の血管の込み入ったネットワーク が形成され、多くは、高い線維芽細胞濃度を有する領域から生じてい
る(×34)。
胞(青色)単層の表面上に位置している(×85)。 図１b：７日目。糸様細管が、コンフルエントな線維芽細胞単層中に形成して いる(×34)。 図１c：14日目。厚みを増した解剖学的構造の血管の込み入ったネットワーク が形成され、多くは、高い線維芽細胞濃度を有する領域から生じてい
る(×34)。
【図２】 図2a：ヒト組換え血管内皮成長因子(VEGF)、10ngml-1の添加による、細管形
成の顕著な増加(×34)。 図2b：ヒト組換えVEGF、10ngml-1と組合せた抗ヒト組換えVEGF中和抗体、
10μgml-1添加による、細管形成の顕著な増加(×34)。
成の顕著な増加(×34)。 図2b：ヒト組換えVEGF、10ngml-1と組合せた抗ヒト組換えVEGF中和抗体、
10μgml-1添加による、細管形成の顕著な増加(×34)。
【図３】 図3a：U-87-MG馴化培地とともにインキュベーションすると、細管形成の阻 害だけでなくHUVEC数の塊状増加もまたもたらされる。幾つかの細管 は、大きいHUVEC"島"の縁で形成することに注目のこと(×34)。 図3b：GO-G-CCM馴化培地とともにインキュベーションすると、HUVEC増 殖の顕著な減少を生じる。しかしながら、存在するそれらの細胞は、小
さい長さの細管を形成した(×34)。
さい長さの細管を形成した(×34)。
【図４】 図４：BCIP/NBT基質(アルカリ性ホスファターゼ適合性)を用い、PECAM-1
イムノアッセイによって発色された、14日目の細管形成の画像を示す (×34)。
イムノアッセイによって発色された、14日目の細管形成の画像を示す (×34)。
【図５】 図５：14日目の細管におけるコラーゲンIV発現の画像を示す(×85)。
【図６】 図６：電子顕微鏡で見られる14日目の細管アッセイにおける細胞層の垂直ク
ロスセクションの写真画像(初期倍率×7,500)。
ロスセクションの写真画像(初期倍率×7,500)。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＴＲ，ＹＵ (72)発明者 ブロアー ステファン イギリス国 ピーアール６ ７キューエル ランカシャー コーリィ ウィットル レ ウッズ ハーヴェスト ドライブ 40 Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA40 BB14 BB20 BB22 BB52 CB01 CB30 FA19 FB03 4B065 AA93X CA44
Claims (21)
- 【請求項１】 血管形成の組合せ段階、つまり細胞発生の増殖、移動および
分化の段階をモデル化するための多細胞インビトロ・アッセイであって、ここで
、該アッセイは内皮細胞およびそれとの相互作用を発揮する他の細胞タイプとの
二重培養物を提供して、インビトロで血管形成の組合せ段階を発揮させることを
包含する、アッセイ。 - 【請求項２】 二重培養物が間質細胞、内皮細胞および標準培養培地の混合
物を含み、更なる成長因子を含まない、請求項１に記載の血管形成の組合せ段階
をモデル化するための多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項３】 血管形成の組合せ段階をモデル化するための、特に血管形成
を増進または阻害する薬剤をスクリーニングするための多細胞インビトロ・アッ
セイであって、内皮細胞およびそれとの相互作用を発揮する他の細胞タイプとの
共同培養物を培養して血管形成の組合せ段階を発揮させること、そのための複数
の試験容器を用意すること、および該薬剤をコントロールされた量で該培地に提
供すること、および容器を観察して血管形成をモニターすることを包含する、多
細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項４】 スクリーニング方法が自動化され、血管形成が公知の自動化
されたカウント技術によってモニターされる、請求項３に記載の血管形成の組合
せ段階をモデル化するための多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項５】 血管形成が画像分析によってモニターされる、請求項３に記
載の血管形成の組合せ段階をモデル化するための多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項６】 血管形成がスペクトログラフ(または分光写真法)によってモ
ニターされる、請求項３に記載の血管形成の組合せ段階をモデル化するための多
細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項７】 他の細胞タイプが間質細胞である、請求項３に記載の血管形
成の組合せ段階をモデル化するための多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項８】 間質細胞が線維芽細胞である、請求項２〜７に記載の血管形
成の組合せ段階をモデル化するための多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項９】 血管形成の組合せ段階をモデル化するための多細胞インビト
ロ・アッセイであって、該方法は、 (a)二重細胞培養物を維持するのに好適であり、その中で少なくとも内皮細胞の 増殖を維持するのに好適な培養培地を有する増殖容器をセットアップする工程、 (b)ヒト線維芽細胞およびヒト内皮細胞の二重培養物を播いて予め決められた標 的比率を得る工程、 (c)いかなる外因性成長因子も提供せずに、それをインキュベートする工程、 (d)コンフルエントな単層が得られるまで初期増殖相からの細胞の経過をモニタ ーする工程、 (e)細胞発生の増殖、移動および分化の段階を通して一定時間ごとに培養培地を 交換する工程、 を包含する、多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項１０】 線維芽細胞がヒト成人皮膚線維芽細胞であり、内皮細胞が
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)である、請求項８または９に記載の血管形成の組 合せ段階をモデル化するための多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項１１】 二重培養物におけるヒト成人皮膚線維芽細胞のヒト臍帯静
脈内皮細胞(HUVEC)に対する細胞比率が約2:1〜8:1である、請求項１０に記載の 血管形成の組合せ段階をモデル化するための多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項１２】 二重培養物の培養培地が48時間毎に交換される、請求項３
または９に記載の血管形成の組合せ段階をモデル化するための多細胞インビトロ
・アッセイ。 - 【請求項１３】 血管形成の組合せ段階をモデル化するための多細胞インビ
トロ・アッセイに使用されるためのキットであって、ここで、キットは、線維芽
細胞および内皮細胞を維持するのに好適であり、二重培養物として予め決められ
た比率で該細胞が播かれる培養培地を提供された容器を含み、細胞は好ましくは
、それぞれヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)である 、キット。 - 【請求項１４】 容器が、ヒト成人皮膚線維芽細胞対ヒト臍帯静脈内皮細胞
(HUVEC)を約2:1〜8:1の細胞比率で有する二重培養物を含む、請求項１３に記載 のキット。 - 【請求項１５】 キットが、二重培養物が播かれる培養容器を含み、該キッ
トはさらに、内皮細胞増殖を維持し得る増殖培地、固定液、ブロッキング緩衝液
、洗浄用緩衝液、可視化するための試薬および抗体を含む、請求項１４に記載の
キット。 - 【請求項１６】 可視化するための試薬がフォンビルブラント・イムノアッ
セイで使用されるものである、請求項１５に記載のキット。 - 【請求項１７】 可視化するための試薬がPECAM-1イムノアッセイで使用さ れるものである、請求項１５に記載のキット。
- 【請求項１８】 薬剤の適用の可能性を治療的評価するのに使用されるイン
ビボ血管形成をモデル化するのに好適な多細胞インビトロ・アッセイであって、
培養培地中に内皮細胞および間質細胞の二重培養物を提供すること、該二重培養
物はアッセイを完了するのに充分な時間該培養培地中で生存および維持可能であ
り、評価されるべき薬剤を二重培養物に導入すること、および細胞挙動に対する
特に血管形成に対するその効果を観察することを包含し、それによって、該薬剤
による血管形成阻害が腫瘍治療に使用される可能性を示し、該薬剤による血管形
成モデルの増強が創傷治癒剤としての使用の可能性を示す、アッセイ。 - 【請求項１９】 間質細胞が線維芽細胞である、請求項１８に記載の薬剤の
適用の可能性を治療的評価するのに使用される、インビボ血管形成をモデル化す
るのに好適な多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項２０】 線維芽細胞がヒト成人皮膚線維芽細胞であり、内皮細胞が
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)である、請求項１９に記載の薬剤の適用の可能性 を治療的評価するのに使用される、インビボ血管形成をモデル化するのに好適な
多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項２１】 提供された二重培養物が、ヒト成人皮膚線維芽細胞のヒト
臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対する細胞比率を約2:1〜8:1で播かれた、請求項１ ８〜２０に記載の薬剤の適用の可能性を治療的評価するのに使用される、インビ
ボ血管形成をモデル化するのに好適な多細胞インビトロ・アッセイ。
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