DE69805644T2

DE69805644T2 - In vitro multizellular test von angiogenesis

Info

Publication number: DE69805644T2
Application number: DE69805644T
Authority: DE
Inventors: Graham Thomas Bell; Stephen Bloor; Tennant Grant
Original assignee: Biocure Ltd
Current assignee: Biocure Ltd
Priority date: 1997-10-01
Filing date: 1998-09-25
Publication date: 2002-09-12
Anticipated expiration: 2018-09-26
Also published as: EP1023599B1; GB9720987D0; EP1023599A1; NO20001608D0; WO1999017116A1; CA2301171A1; ZA988936B; JP3404572B2; AU9178598A; MY119061A; CA2301171C; ES2174486T3; AU732538B2; IL135386A0; NZ502962A; NO20001608L; DK1023599T3; ATE218209T1; DE69805644D1; JP2001518621A

Description

Diese Erfindung betrifft einen In-vitro-Angiogenese-Assay und insbesondere einen multizellulären In-vitro-Angiogenese-Assay.
Die meisten Populationen differenzierter Zellen von Wirbeltieren unterliegen infolge des Absterbens und der Erneuerung von Zellen einem ständigen Wandel. Bei einigen vollständig differenzierten Zellen, beispielsweise Hepatozyten in der Leber und Endothelzellen, welche die Blutgefäße auskleiden, erfolgt die Bildung von Tochterzellen der gleichen differenzierten Art einfach durch Teilung. Die Proliferationsgeschwindigkeit solcher Zellen wird gesteuert, um die Gesamtzahl der Zellen konstant zu halten. Wird ein großer Teil der Leber zerstört, erhöhen somit die verbliebenen Hepatozyten ihre Teilungsgeschwindigkeit, um den Verlust auszugleichen.
Endothelzellen bilden eine einfache Zellschicht, die alle Blutgefäße auskleidet und Austauschvorgänge zwischen dem Blutstrom und den umgebenden Geweben regelt. Neue Blutgefäße entwickeln sich aus den Wänden existierender kleiner Gefäße durch das Nach-Außen-Wachsen dieser Endothelzellen, die über die Fähigkeit verfügen, hohle Kapillarröhrchen zu bilden, selbst wenn sie isoliert in Kultur vorliegen. In vivo bewirken beschädigte Gewebe und einige Tumoren eine Blutzufuhr zu sich hin, indem sie Faktoren sekretieren, die nahegelegene Endothelzellen stimulieren, neue Kapillarzweige aufzubauen. Tumoren, denen es nicht gelingt, eine Blutzufuhr zu sich hin zu bewirken, sind in ihrem Wachstum erheblich eingeschränkt.
Der Prozeß der Entstehung neuer Gefäße in Form von Kapillaren, die von existierenden kleinen Gefäßen abzweigen, heißt Angiogenese. Es ist somit zu erkennen, daß die Angiogenese bei der normalen Entwicklung und Reparatur von Gewebe als auch beim Fortschreiten einiger pathologischer Zustände eine zentrale Rolle spielt.
Ist das Gefäßsystem vollständig entwickelt, verhalten sich die Endothelzellen der Blutgefäße normalerweise ruhig, und es werden keine neuen Gefäße gebildet. Im Fall einer Krankheit oder Verletzung kann die Bildung neuer Blutgefäße normal verlaufen, beispielsweise bei der natürlichen Wundheilung, oder unzureichend sein, beispielsweise bei chronischen Hautgeschwüren, oder es kann eine Deregulation des Wachstums eintreten, gefolgt von einer anormalen Zunahme der Gefäßdichte, beispielsweise bei der Tumorgenese, bei Rhetinopathia diabetica, Psoriasis und Entzündungen. Die Hemmung unerwünschter Angiogenese bzw. die Anregung der Angiogenese bei nicht heilenden Wunden ist daher ein äußerst wichtiges Target für Medikamentenentwicklungsprogramme. Die Forschung auf diesem Gebiet hin zur Entwicklung neuer Medikamente wurde jedoch durch das Fehlen von In-vitro-Angiogenese-Modellen behindert.
Die Angiogenese ist ein äußerst komplexer Prozeß, an dem eine große Anzahl von Wachstumsfaktoren, extrazellulären Matrixmolekülen, Enzymen und verschiedenen Zellarten beteiligt ist. Diese Komplexität der Beziehungen bedingte erhebliche Schwierigkeiten bei der Entwicklung eines In-vitro-Assays, der den gesamten In-vivo-Prozeß modelliert. Die Angiogenese kann in drei Phasen untergliedert werden: Proliferation, Migration und Differenzierung. Es existieren Assays, die jede dieser Phasen separat modellieren. Mit Hilfe von einfachen In-vitro-Tests können Veränderungen bezüglich der Proliferation einer Reihe von Zellarten gemessen und die Migration über Basalmembranproteine abgeschätzt werden. Derzeitige Invitro-Assay-Systeme, welche die Bereitstellung einer Proteinmatrix erfordern, gestatten eine wirksame Messung der Differenzierungsfähigkeit von Endothelzellen.
Assay-Systeme zur Messung der Differenzierung beinhalten die Bildung von strangförmigen Strukturen durch die Endothelzellen. Alle diese Systeme erfordern die Bereitstellung exogener Basalmembranproteine für die Zellen, auf denen die Zellen migrieren, um Tubuli zu bilden. Die Zellmigration vollzieht sich während relativ kurzer Zeiträume von 2-16 Stunden, in denen eine dreidimensionale Struktur entsteht. Viele Systeme erfordern neben den Proteinen die Bereitstellung von Wachstumsfaktoren, um eine akzeptable Tubulusbildung zu bewirken. Der zeitliche Rahmen, in dem die Tubulusbildung erfolgt, liefert einen ausgezeichneten Test bezüglich der Hemmung der Differenzierung, ist jedoch bei Tests im Hinblick auf die Anregung weniger geeignet.
Die vorstehend beschriebenen Assay-Systeme kommen einer Modellierung der Angiogenese am nächsten, jedoch kombiniert keines von ihnen alle drei Phasen, die für die Angiogenese erforderlich sind.
Es sind dreidimensionale Zellkultursysteme bekannt, bei denen primär eine exogene Matrix verwendet wird, um die Rolle der Basalmembranproteine nachzuahmen, und Basalmembranproteine als solche nicht erforderlich sind, da an ihrer Stelle die Matrix verwendet wird. Die Matrix gestattet es, daß sich Zellen an ihr anlagern und nachfolgend in mehr als einer Schicht wachsen. Die Matrizes müssen Öffnungen mit einer angemessenen Größe aufweisen, damit sich die Stromazellen über die Öffnungen hinweg erstrecken können. Es muß daher in Abhängigkeit von den zu kultivierenden Zellen, die richtige Art von Matrix ausgewählt werden. Die Systeme können verwendet werden, um große Volumina von differenziertem Gewebe bereitzustellen, oder als Modellsysteme für das Studium physiologischer oder pathologischer Zustände.
WO 96/39191 offenbart die Züchtung von Stromazellen auf einem biologisch abbaubaren bzw. nicht biologisch abbaubaren dreidimensionalen Stützgerüst, wobei die Stromazellen auf dem Gerüst eine humane extrazelluläre Matrix, wie sie in normalem menschlichen Gewebe produziert wird, synthetisieren und diese auf dem dreidimensionalen Gestell deponieren. Die extrazelluläre Matrix enthält verschiedene faserbildende Proteine, die in einem hydratisierten, aus einem Netz von Glykosaminoglykanketten bestehenden Gel verwoben sind. Das faserbildende Protein kann zum Beispiel Kollagen oder Elastin sein. Nach verschiedenen Aufbereitungsschritten kann die aufbereitete extrazelluläre Matrix zwecks einer Vermehrung der Weichteile, einer Reparatur oder Korrektur angeborener Anomalien, erworbener oder kosmetischer Defekte einem Patienten intradermal oder subkutan injiziert werden.
Andererseits offenbart WO 96/40175 ebenfalls ein auf Stromazellen basierendes, dreidimensionales Zellkultursystem, insbesondere für die Verwendung bei der Kultur einer Vielzahl verschiedener Zellen und Gewebe für die Verwendung bei der Bildung von Röhren, Sehnen, Bändern und korrektiven Strukturen. Die für die Matrix verwendeten Materialarten können biologisch abbaubar sein, wie z. B. künstliche Polymere wie Kollagen.
Das dreidimensionale Gewebekultursystem, das in EP 0 358 506 offenbart wird, basiert auf der Tatsache, daß die Züchtung von Stromazellen in drei Dimensionen die aktive Proliferation von Zellen in Kultur über längere Zeiträume aufrecht erhält, als dies bei Monolayer-Systemen der Fall ist. Es wird angegeben, daß solche Gewebe wie Knochenmark, Haut, Leber, Pankreas, etc. allesamt in einem solchen dreidimensionalen System gezüchtet werden können. Es wird ebenfalls beschrieben, daß die resultierende Kultur als Modellsystem für das Studium physiologischer oder pathologischer Zustände verwendet werden kann. Die Matrix kann aus einem beliebigen Material oder Materialgemisch (zum Beispiel behandeltes Nylon, Gelatine, Zellulose, Baumwolle u. a.) gefertigt sein, wobei diese üblicherweise zu einem Netz verwoben sind, um die dreidimensionale Struktur zu bilden. Zellen, die auf einer biologisch abbaubaren Matrix kultiviert wurden, können dem Patienten in situ implantiert werden. Zellen, die auf nicht biologisch abbaubaren Matrizes kultiviert wurden, müssen aus der Kultur erhalten und dann verwendet werden.
US 5 160 490 beschreibt schließlich ein dreidimensionales Kultursystem, das verwendet werden kann, um eine Vielzahl verschiedener Zellen und Gewebe über lange Zeiträume in vitro zu kultivieren. Es werden Zellen aus einem gewünschten Gewebe auf eine vorher angelegte Matrix geimpft und dort gezüchtet. Die Stroma-Stützmatrix umfaßt Stromazellen, die aktiv auf einer dreidimensionalen Matrix wachsen. Wie in EP 0 358 506 kann die Matrix wiederum aus jeden beliebigen Material oder Materialgemisch (zum Beispiel behandeltes Nylon, Gelatine, Zellulose, Baumwolle u. a.) gefertigt sein, wobei diese üblicherweise zu einem Netz verwoben werden, um die dreidimensionale Struktur zu bilden. Für die nachfolgende Implantation in den Körper von Patienten sollten biologisch abbaubare Matrizes verwendet werden, beispielsweise Gelatine. Für Langzeit-Kulturen wird hingegen eine nylonnetzartige Matrix bevorzugt.
In keiner der vorgenannten Schriften wird die Verwendung von diesen Systemen für das Überwachen der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese erwähnt. Darüber hinaus erschwert die Verwendung eines dreidimensionalen Systems als Modell sowohl die Visualisierung als auch die Quantifizierung in erheblichem Maße. Es geht daher aus der Offenbarung deutlich hervor, daß die vorliegende Anmeldung einen zweidimensionalen Assay betrifft und insofern einen Vorteil gegenüber diesen, den Stand der Technik darstellenden Schriften aufweist, als sie für die Zwecke der Visualisierung und Abbildung zwecks Quantifizierung wesentlich geeigneter ist als die dreidimensionalen Assays nach dem Stand der Technik.
Es ist leicht erkennbar, daß alle genannten Schriften die Verwendung zusätzlicher exogener Matrizes beschreiben, die offenbar Basalmembranproteine nachahmen, um die Kultur einer Vielzahl verschiedener Gewebe in vitro über lange Zeiträume zu unterstützen. Das Gesamtziel der vorliegenden Erfindung bestand darin, von der Verwendung solcher Systeme abzugehen und ein einfaches duales Kultursystem zu schaffen, das den in vivo ablaufenden Angiogeneseprozeß in vitro modelliert.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die vorstehend genannten Nachteile auszuräumen bzw. abzumildern, indem ein In-vitro- Angiogenese-Assay geschaffen wird, der von allen drei Phasen der Angiogenese abhängig ist und verwendet werden kann, um sowohl die Stimulation als auch die Inhibition der Angiogenese zu untersuchen.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein multizellulärer In-vitro-Assay für das Modellieren der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese, d. h. der Proliferations-, Migrations- und Differenzierungsphase der Zellentwicklung, geschaffen, wobei der Assay die Bereitstellung einer dualen Kultur von Endothelzellen zusammen mit einer anderen Zellart, die mit den vorgenannten interagiert, umfaßt, um die miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese in vitro darzustellen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung basiert ein solcher Assay auf der Verwendung einer dualen Kultur von Fibroblasten und Endothelzellen und erfordert lediglich Standard-Kulturmedium ohne zusätzliche Wachstumsfaktoren. Es wird postuliert, daß die Interaktion dieser Zellarten von zwischen ihnen ablaufenden Zellsignalgebungsmechanismen abhängig ist.
Betrachtet man die bisherige diesbezügliche Forschung, ist der Verzicht auf zusätzliche Wachstumsfaktoren bemerkenswert und überraschend. Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren des Screenings von Agenzien für die Anregung oder Hemmung der Angiogenese geschaffen, umfassend die Züchtung einer Co-Kultur von Endothelzellen zusammen mit einer anderen Zellart (vorzugsweise Interstitialzellen, wie z. B. Fibroblasten), die mit den vorgenannten interagiert, um die miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese darzustellen, das Bereitstellen einer Vielzahl von Testgefäßen dafür und das Einbringen kontrollierter Mengen des Agens in die Kulturen und Beobachten der Gefäße zwecks Überwachung der Angiogenese. Das Screeningverfahren ist leicht zu automatisieren, und die Angiogenese kann mittels bekannter automatischer Zählverfahren, Bildanalyse oder mittels spektrographischer Verfahren überwacht werden.
Vorzugsweise umfaßt der Assay folgende Schritte:
(a) Vorbereiten von Züchtungsgefäßen, die für die Aufrechterhaltung dualer Zellkulturen geeignet sind und ein geeignetes Kulturmedium aufweisen, das zumindest das Wachsen von Endothelzellen in den Gefäßen aufrecht erhält;
(b) Säen einer dualen Kultur humaner Fibroblasten und humaner Endothelzellen, um ein bestimmtes Soll-Verhältnis derselben zu erhalten;
(c) Inkubieren derselben ohne die Bereitstellung exogener Wachstumsfaktoren;
(d) Überwachen der Fortentwicklung der Zellen von einer anfänglichen Proliferationsphase bis zur Bildung einer sich vereinenden Monolayer;
(e) regelmäßiges Erneuern des Kulturmediums während der Proliferations-, Migrations- und Differenzierungsphase der Zellentwicklung; Vorzugsweise sind die Fibroblasten Human Adult Dermal Fibroblasts und die Endothelzellen Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC).
Das Verhältnis der Zellen von Human Adult Dermal Fibroblasts zu Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) in der dualen Kultur beträgt vorzugsweise 2 : 1 bis 8 : 1.
Das Kulturmedium der dualen Kultur wird vorteilhafterweise alle 48 Stunden erneuert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Assay-Kit geschaffen, der einschließt: ein Gefäß mit Kulturmedium, das für die Erhaltung von Fibroblasten und Endothelzellen geeignet und in Form einer dualen Kultur mit diesen Zellen in einem bestimmten Verhältnis besät ist, wobei die Zellen vorzugsweise Human Adult Dermal Fibroblasts und Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) sind und die Lebensfähigkeit der Zellen in dem Gefäß vor dem Versand an Kunden 24 Stunden lang überwacht wird.
Das Verhältnis der Zellen zueinander, d. h. Human Adult Dermal Fibroblasts zu Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC), in dem Gefäß beträgt vorzugsweise etwa 2 : 1 bis 8 : 1.
Ein bevorzugter Test-Kit für die Verwendung in einem multizellulären Invitro-Assay umfaßt ein Kulturgefäß, das mit einer dualen Kultur von Human Adult Dermal Fibroblasts und Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) besät ist, wobei das Verhältnis der Zellen etwa 2 : 1 bis 8 : 1 beträgt und besagter Kit weiterhin ein Wachstumsmedium, das in der Lage ist, das Wachstum von Endothelzellen aufrecht zu erhalten, Fixativ, Blockungspuffer, Waschpuffer, Reagenzien und Antikörper für eine geeignete Visualisierung umfaßt.
Die Reagenzien für die Visualisierung sind vorzugsweise diejenigen, die im Willebrand-Immungssay bzw. im PECAM-1-Immungssay verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein multizellulärer In-vitro-Assay geschaffen, der eine duale Kultur von Endothelzellen und Fibroblasten umfaßt, vorzugsweise Human Adult Dermal Fibroblasts und Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) und in einem Kulturmedium aufrecht erhaltbar, wobei das Kulturmedium in der Lage ist, zumindest das Wachstum von Endothelzellen aufrecht zu erhalten, die duale Kultur mit einem Verhältnis der Zellen, d. h. Human Adult Dermal Fibroblasts zu Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC), von etwa 2 : 1 bis 8 : 1 gesät wurde und wobei der Assay verwendet wird, um die Invivo-Angiogenese zu modellieren, zwecks Verwendung insbesondere in Bereichen wie der Medikamentenforschung oder Tumortherapie, wobei eine Hemmung des Angiogenese-Modells durch ein Testmedikament anzeigen würde, daß dieses für die Verwendung in der Tumortherapie geeignet ist. Eine Anregung des Angiogenese-Modells durch ein Testmedikament würde anzeigen, daß dieses für die Verwendung als Wundheilungsagens geeignet ist.
Durch diese Erfindung wird ein multizellulärer In-vitro-Assay geschaffen, der es ermöglicht, jede Phase der Angiogenese, insbesondere die Proliferations-, Migrations- und Differenzierungsphase der Zellentwicklung, zu untersuchen und zu modellieren.
Die Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Zeichnungen sowie mittels der folgenden Beispiele beschrieben.
Fig. 1a-c: zeigen die Entwicklung der Tubuli über einen Zeitraum von 1, 7 und 14 Tagen;
Fig. 1a: 1. Tag. Die dunkel eingefärbten HUVEC (braun) sind deutlich erkennbar; sie sind auf der Oberfläche der Monolayer aus Fibroblasten (blau) angeordnet. (x 85);
Fig. 1b: 7. Tag. In der sich vereinenden Fibroblasten-Monolayer bilden sich strangförmige Tubuli. (x 34);
Fig. 1c: 14. Tag. Es hat sich ein verzweigtes Netz aus dicker gewordenen, anastomisierenden Gefäßen gebildet, wobei viele derselben ihren Ursprung in Bereichen mit hoher Fibroblasten-Konzentration haben. (x 34);
Fig. 2a: deutliche Zunahme der Tubulusbildung nach Zugabe von humanem rekombinanten Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF), 10 ngml&supmin;¹. (x 34);
Fig. 2b: deutliche Verringerung der Tubulusbildung nach Zugabe von anti-Mensch-, rekombinantem VEGF- neutralisierenden Antikörper, 10 ugml&supmin;¹ in Kombination mit humanem rekombinanten VEGF 10 ngml&supmin;¹. (x 34);
Fig. 3a: Inkubation mit U-87-MG-konditioniertem Medium hat nicht nur die Inhibition der Tubulusbildung, sondern auch eine massive Zunahme der Anzahl der HUVEC zur Folge. Es ist zu beachten, daß sich einige Tubuli an den Rändern der großen HUVEC-"Inseln" bilden. (x 34);
Fig. 3b: Inkubation mit GO-G-CCM-konditioniertem Medium bewirkt eine deutliche Verminderung der HUVEC- Proliferation. Die vorhandenen Zellen haben jedoch kleine Tubulusabschnitte gebildet. [x 34];
Fig. 4: zeigt ein Bild der Tubulusbildung am 14. Tag, entwickelt mittels des PECAM-1-Immungssays unter Verwendung von BCIP/NBT-Substrat (mit alkalischer Phosphatase kompatibel). (x 34);
Fig. 5: zeigt ein Bild der Kollagen-IV-Expression in den Tubuli am 14. Tag. (x 85);
Fig. 6: fotografisches Bild eines vertikalen Querschnitts durch die Zellschicht in dem Tubulus-Assay am 14. Tag, wie es durch ein Elektronenmikroskop zu sehen ist (ursprüngliche Vergrößerung · 7.500).
Die Kulturen aus Fig. 2a und 2b wurden 14 Tage lang inkubiert und sind daher direkt mit Fig. 1c vergleichbar.
Die Visualisierung in Fig. 1-3 erfolgt mittels Willebrand-Faktor- Immungssay unter Verwendung von DAB-Substrat und des Kontrastfarbstoffs Hämatoxylin.
Erfindungsgemäß wird ein In-vitro-Angiogenese-Assay geschaffen, der von geeigneten Zellsignalgebungsmechanismen abhängig ist, bei dem eine duale Kultur verwendet wird und keine zusätzlichen Wachstumsfaktoren erforderlich sind. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann sowohl die Stimulation als auch die Inhibition der Angiogenese demonstriert werden.
Weiterhin kombiniert das erfindungsgemäße Assay-System alle drei Phasen der Angiogenese, d. h. Proliferation, Migration und Differenzierung.
Das Assay-System beinhaltet die Co-Kultur von Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) mit Human Adult Dermal Fibroblasts. Unter den geschaffenen Bedingungen bilden die Zellen eine Reihe anastomisierter Tubuli.
Die Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) sind handelsüblich und können von entsprechenden Verkaufseinrichtungen bezogen werden; in diesem Fall werden sie in tiefgefrorener Form gekauft. Vor ihrer Verwendung in dem Tubulus-Assay passieren die Zellen routinemäßig durch ein geeignetes handelsübliches Endothelial Growth Medium (EGM), das 2% Serum von Kalbsfeten enthält, und werden in diesem kultiviert. Die HUVEC werden in den Schritten 2 bis 6 des Assays verwendet.
Die Human Adult Dermal Fibroblasts werden im Haus selbst gezüchtet, und zwar aus Hautproben, die von den ortsansässigen Krankenhäusern bezogen werden. Vor ihrer Verwendung in dem Tubulus-Assay passieren die Zellen routinemäßig durch Dulbecco's Modified Eagle's Medium, dem 10% Serum von Kalbsfeten zugegeben wurden, und werden in diesem kultiviert. Die Fibroblasten werden in den Schritten 6 bis 10 des Assays verwendet.
Die mit Gewebekulturen behandelten Gefäße, die in dem Assay verwendet werden sollen, werden durch Preinkubation mit EGM, plus und minus Behandlungen, 30 Minuten lang bei 37ºC, in befeuchteter Atmosphäre mit einem CO&sub2;-Gehalt von 5% äquilibriert. Normalerweise werden 12 bzw. 24 Vertiefungen aufweisende, mit Gewebekulturen behandelte Platten verwendet, jedoch können ebensogut andere eingesetzt werden; die zugegebenen Volumina betragen 1 ml pro Vertiefung für Platten mit 12 Vertiefungen und 0,5 ml pro Vertiefung für Platten mit 24 Vertiefungen. Das Ernten der Zellen erfolgt unter Verwendung einer geeigneten handelsüblichen Trypsinlösung für die Fibroblasten und einer geeigneten handelsüblichen Trypsin-EDTA-Lösung für die HUVEC. Die Zellen werden in EGM resuspendiert und gezählt. Unmittelbar vor ihrer Verwendung werden die Zellen durch eine Spritze und Nadel (23 G · 1%) exprimiert, um eine gute Verteilung sicherzustellen.
Die zwei Zellarten werden in den erforderlichen Dichten und im erforderlichen Säverhältnis (das zwischen 2 : 1 und 8 : 1, Fibroblasten zu HUVEC, liegen kann) gründlich miteinander vermischt und auf die Platten aufgebracht. Um eine gleichmäßige Verteilung über die gesamte Wachstumsfläche hinweg sicherzustellen, werden die Platten in beliebiger Weise sanft hin- und herbewegt. Dies verhindert, daß sich die Zellen in der Mitte der Vertiefungen sammeln.
Die Verhältnisse der Zellen und die Sädichten sind bei diesem Assay von äußerster Wichtigkeit. Sie können bei jeder eingesetzen HUVEC-Linie variieren und müssen festgelegt werden, wenn eine neue Linie eingeführt wird, um die Bedingungen für die Tubulusbildung zu maximieren.
Die Co-Kulturen werden normalerweise 14 Tage lang inkubiert, wobei das Medium etwa aller zwei Tage vollständig erneuert wird. Die Entwicklung rudimentärer Tubuli ist ungefähr ab dem 4. Tag erkennbar, jedoch können - wie bei allen Zellarten - Abweichungen auftreten, und die Tubuli können sich früher bilden. Der gesamte Prozeß kann auf einen Zeitraum von sieben oder weniger Tagen beschleunigt werden, indem unter Beibehaltung des festgelegten Verhältnisses die Sädichten erhöht werden. Dies ist jedoch nicht immer wünschenswert, da die Wirkungen von Behandlungen über lange Zeiträume besser erkennbar sind als über kurze Zeiträume.
Um die Fortentwicklung des Assays zu überwachen, werden während eines vierzehntägigen Wachstumszeitraums normalerweise vier Zeitpunkte verwendet. Erforderlichenfalls sind hier jedoch Änderungen möglich. Zu jedem Zeitpunkt wird das Medium aus dem Wachstumsgefäß entnommen, und die Zellen werden in kaltem (-20ºC), 70%igen Ethanol bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang fixiert. An diesem Punkt kann die Platte in phosphatgepufferter Salzlösung bei 4ºC gewaschen und gelagert werden, bis das Experiment abgeschlossen ist, wenn alle Kulturen gleichzeitig entwickelt werden; es kann aber auch jeder Zeitpunkt separat bearbeitet werden.
Derzeit bedingt die Visualisierung der Tubuli das Targeting eines von zwei Zellmarkern in der HUVEC-Linie mittels Immungssay. Diese Marker sind das Glykoprotein Willebrand-Faktor und das Zelladhäsionsmolekül PE- CAM-1.
Humaner Willebrand-Faktor (Faktor VIII R : Ag) ist ein multimerisches Plasma-Glykoprotein. Es vermittelt die Thrombozytenadhäsion an den Gefäßwänden und dient als Träger und Stabilisator des Koagulationsfaktors VIII. Dieser Faktor wird konstitutiv durch die Endothelzellen synthetisiert. Platelet Endothelial Cellular Adhesion Molecule bzw. PECAM-1 ist ein 130-kD-, integrales Membran-Glykoprotein, das zur großen Familie der Immunglobuline gehört, und kommt konstitutiv auf der Oberfläche von Endothelzellen vor, insbesondere an Verbindungsstellen zwischen den Zellen. Es wird ebenfalls auf der Oberfläche von Thrombozyten und Leukozyten exprimiert.
Der Immungssay-Prozeß beinhaltet ein zweistufiges indirektes Verfahren, in dem ein mit einem Enzym konjugierter, sekundärer Antikörper mit einem nicht markierten primären Antikörper reagiert, der an den Zellmarker gebunden ist. Es wird eine Substratlösung zugegeben, die mit dem Enzymkomplex reagiert, um ein unlöslichles farbiges Endprodukt zu bilden. Auf diese Weise werden die Endotheltubuli sichtbar gemacht. Eine Kontrastfärbung der Co-Kulturen mit dem Kernfarbstoff Hämatoxylin ist möglich. Dies unterstützt die Visualisierung der Fibroblasten-Monolayer.
Eine quantitative Abschätzung der Tubuli kann mit Hilfe einer Vielzahl von Verfahren erreicht werden, die vom manuellen Zählen über die Abbildung mittels Video bis zur computergestützten Bildanalyse reichen.
Werden die HUVEC-Zellen und die Fibroblasten zusammen in Co-Kultur inkubiert, ahne Zugabe exogener Wachstumsfaktoren, jedoch mit vollständiger Erneuerung des Kulturmediums alle zwei Tage, durchlaufen die Zellen zunächst eine Proliferationsphase, die bis zur Bildung einer sich vereinenden Monolayer andauert. Am 1. Tag besteht die Kultur aus einem Hintergrund aus Fibroblasten mit kleinen Inseln aus Endothelzellen (Fig. 1a). Parallel zu ihrer weiteren Proliferation treten die Endothelzellen in eine Migrationsphase ein, in der sie sich sichtbar in der Fibroblasten- Schicht bewegen, um ungefähr am 7. Tag strangförmige röhrenförmige Strukturen zu bilden (Fig. 1b). Diese Strukturen dehnen sich schließlich aus und verbinden sich miteinander, um etwa am 14. Tag ein verzweigtes Netz zu bilden, das dem Kapillarbett der chorioallantoischen Membran von Hühnern ähnelt (Fig. 1c). Oft ist zu beobachten, daß die im Zuge dieses Prozesses gebildeten "Gefäße" ihren Ursprung an den HUVEC-Inseln haben, die während der Proliferationsphase gebildet wurden. In dem Bereich, aus dem die HUVEC migriert sind, sind fast immer hohe Konzentrationen von Fibroblasten sichtbar. Am 14. Tag sind die Röhren breiter und dicker und weisen offensichtliche Lumina auf, die mittels Phasenkontrastmikroskopie sichtbar gemacht werden können.
Sowohl die Sädichte der zwei Zellarten als auch das Verhältnis von HU- VEC zu Fibroblasten sind äußerst kritisch. Die Teilungsgeschwindigkeit der HUVEC scheint ebenfalls kritisch zu sein. Verwendet man HUVEC, deren Verdopplungszeiten sehr unterschiedlich sind, kann beobachtet werden, daß bei kurzer Verdopplungszeit, d. h. wenn die HUVEC sehr rasch wachsen, in der Tendenz große Inseln undifferenzierter HUVEC entstehen. Dies zeigt vermutlich an, daß es während des Prozesses einen kritischen Punkt gibt, an dem die interzellulären Signale zwischen Fibroblasten und HUVEC den Differenzierungsprozeß einleiten.
Es wurden ebenfalls Experimente durchgeführt, um zu zeigen, inwieweit der Assay verwendet werden kann, um mittels einer zu testenden Probe die Inhibition bzw. Stimulation der Angiogenese zu zeigen, zum Beispiel im Hinblick auf das Testen der Wirkungen neuer Medikamente.
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) ist ein anerkanntes Mitogen der Endothelzellen, das die Angiogenese stimuliert. Die Manipulation des In-vitro-Systems wurde dadurch bestätigt, daß zu Beginn des Experiments und bei jeder Erneuerung des Mediums humaner rekombinanter VEGF zugegeben wurde. Im Ergebnis wurde(n) die Tubulusbildung erheblich angeregt und aus einer Vielzahl von Bogen bestehende Netze gebildet (Fig. 2a).
Wurde hingegen zusammen mit dem VEGF anti-Mensch-, rekombinanter VEGF-neutralisierender Antikörper zugegeben, verminderte sich die Tubulusbildung erheblich (Fig. 2b). Das System wurde auch unter Verwendung von konditioniertem Medium (serumfrei) aus verschiedenen Tumorzellinien, einschließlich solchem aus U-87-MG (humane Glioblastomzellinie), das vom ortsansässigen Krankenhaus erhältlich war, und GO-G- CCM (humanes Gehirnastrozytom), das von der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) erhältlich war, getestet, da die Hypothese aufgestellt worden war, daß Tumorzellen die Angiogenese steuern und im Gegenzug das Wachstum begünstigen können. U-87-MG bewirkte eine massive Proliferation der HUVEC bei geringer Tubulusbildung (Fig. 3a), während GO-G-CCM sowohl die HUVEC-Proliferation als auch die Tubulusbildung erheblich verminderte (Fig. 3b).
Diese Ergebnisse demonstrieren die Flexibilität des Assays und das Ansprechen auf Materialien, deren Wirkungsweisen verschieden sind.
Auf diese Weise kann der Assay für das Screening im Hinblick auf Substanzen verwendet werden, welche die Angiogenese hemmen bzw. anregen.
Fig. 5 zeigt ein Bild der Kollagen-IV-Expression in den Tubuli am 14. Tag. In vivo legen die sich entwickelnden Kapillaren des neuen Gefäßsystems extrazelluläre Matrixproteine ab, und dieses In-vitro-Bild zeigt, daß Kollagen IV durch die Endothelzellen selektiv exprimiert wird. Dies ist ein weiterer Beleg dafür, daß der Assay tatsächlich die In-vivo-Entwicklung von Gefäßen nachahmt.
Fig. 6 zeigt ein fotografisches Bild eines vertikalen Querschnitts durch die Zellschicht in dem Tubulus-Assay (14. Tag), wie es durch ein Elektronenmikroskop zu sehen ist (ursprüngliche Vergrößerung · 7.500). Das Bild zeigt recht deutlich einen Tubulus, der aus mehreren Endothelzellen (durch Pfeilspitzen gezeigt) besteht, die ein zentrales Lumen umschließen (durch Pfeil gezeigt). Dies liefert einen weiteren Beleg dafür, daß mit dem Assay tatsächlich Tubuli mit einem zentralen "Hohlraum" bzw. Lumen gebildet werden.
Es wurde auch eine Kontrollstudie durchgeführt, um zu zeigen, daß nicht alle Zellen funktionieren würden, wenn sie anstelle der derzeit in dem erfindungsgemäßen Assay verwendeten eingesetzt würden. Die Kontrollstudie zeigte HUVEC in Co-Kultur mit Human Umbilical Artery Smooth Muscle Cells (HUASMC), die in vivo eine enge Verbindung mit den Endothelzellen eingehen. Es wurden keine Tubuli gebildet.
Die vorstehende Erfindung soll ein genaueres Studium der In-vivo- Angiogenese ermöglichen, indem das In-vitro-Modell für Experimente im Hinblick auf die Wirkung verschiedener externer Faktoren auf dieselbe verwendet wird. Zum Beispiel unterstützt diese Erfindung in erheblichem Maße das Studium der Wirkung bestimmter Medikamente (insbesondere auf dem Gebiet der Tumortherapie). Der Assay kann verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein bestimmtes zu testendes Medikament die Angiogenese und damit das Tumorwachstum hemmen würde oder ob es die Angiogenese anregen würde und somit in der Wundheilungstherapie angewendet werden könnte. In vivo bewirken beschädigte Gewebe und einige Tumoren eine Blutzufuhr zu sich hin, indem sie Faktoren sekretieren, die nahegelegene Endothelzellen stimulieren, neue Kapillarzweige aufzubauen. Durch die Verwendung dieses Assays kann daher gezeigt werden, ob ein bestimmtes Testmedikament die Stimulation der Endothelzellen verhindern kann und damit verhindern kann, daß die Tumoren eine Blutzufuhr zu sich hin bewirken. Tumoren, denen es nicht gelingt, eine Blutzufuhr zu sich hin zu bewirken, sind in ihrem Wachstum erheblich eingeschränkt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch auch für das Studium der Angiogenese per se äußerst wertvoll.
Es ist ebenfalls vorgesehen, daß Kulturgefäße mit lebensfähigen Co- Kulturen besät werden, die in dem bevorzugten Verhältnis der Zellen von zwischen etwa 2 : 1 und 8 : 1, Fibroblasten zu HUVEC, gezüchtet werden. Nach etwa 24 Stunden Co-Kultur werden die Gefäße dann in geeigneter Weise in Form eines Kit verpackt. Der Kit enthält auch die Ingredienzen, die für den Erhalt der Lebensfähigkeit der Co-Kultur sowie für die Visualisierung der Ergebnisse (mittels Willebrand-Immungssay oder PECAM-1- Immungssay) erforderlich sind.
Der bevorzugte Test-Kit für die Verwendung in dem multizellulären Invitro-Assay umfaßt ein Kulturgefäß, das mit einer dualen Kultur aus Human Adult Dermal Fibroblasts und Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) besät ist, wobei das Verhältnis der Zellen etwa 2 : 1 bis 8 : 1 beträgt, eine Menge Wachstumsmedium, das in der Lage ist, das Wachstum von Endothelzellen aufrecht zu erhalten, Fixativ, Blockungspuffer, Waschpuffer und die Reagenzien und Antikörper für eine geeignete Visualisierung mittels Willebrand-Immungssay oder PECAM-1-Immungssay.
Daher enthält der Kit auch folgende Komponenten für die Verwendung in einem Willebrand-Immungssay:
(i) einen primären Antikörper Kaninchen-anti-Mensch- Willebrand-Faktor;
(ii) einen sekundären Antikörper Ziege-anti-Kaninchen-IgG (ganzes Molekül), Meerrettichperoxidase-Konjugat; und
(iii) ein Substrat Meerrettichperoxidase-Substrat mit unlöslichem Endprodukt;
und die folgenden Komponenten für die Verwendung in einem PECAM-1- Immungssay:
(i) einen primären Antikörper Maus-anti-Mensch-PECAM-1;
(ii) einen sekundären Antikörper Ziege-anti-Maus-IgG (ganzes Molekül), Alkalische Phosphatase-Konjugat; und
(iii) ein Substrat Alkalische Phosphatase- Substrat mit unlöslichem Endprodukt.
Die vollständigen Kits werden dann an Kunden versandt, die sie für ihre eigene Forschung, wie z. B. Angiogeneseforschung, Medikamentenstudiengruppen und/oder Forschung bezüglich der Wundheilung, verwenden können.

Claims

1. Multizellulärer In-vitro-Assay für das Modellieren der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese, d. h. der Proliferation, Migration und Differenzierungsphase der Zellentwicklung, dadurch gekennzeichnet, daß der Assay das Bereitstellen einer dualen Kultur von Endothelzellen zusammen mit Fibroblasten, die mit den vorgenannten interagieren, umfaßt, wobei die Zellen in der dualen Kultur mit einem Verhältnis von Fibroblasten zu Endothelzellen von etwa 2 : 1 bis 8 : 1 bereitgestellt werden, wobei die Fibroblasten eine Monolayer bilden, auf der die Endothelzellen die miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese präsentieren, so daß die betreffenden Phasen der Angiogenese während eines festgelegten Zeitraums überwacht werden können.

2. Multizellulärer In-vitro-Assay für das Modellieren der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die duale Kultur weiterhin ein Standard- Kulturmedium, ohne zusätzliche Wachstumsfaktoren oder exogene Matrixproteine, und eine Mischung aus interaktionsfähigen Endothelzellen und Fibroblasten umfaßt.

3. Multizellulärer In-vitro-Assay für das Modellieren der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere für das Screening von Agenzien für die Anregung oder Hemmung der Angiogenese, umfassend das Bereitstellen einer Vielzahl von Testgefäßen, welche die duale Kultur enthalten, das Einbringen eines solchen Agens in selektiv kontrollierten Mengen in die Kulturen und das Beobachten der Gefäße, um die Wirkung auf die Angiogenese zu überwachen.

4. Multizellulärer In-vitro-Assay für das Modellieren der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Screeningverfahren automatisiert ist und die Angiogenese mittels bekannter automatischer Zählverfahren beobachtet wird.

5. Multizellulärer In-vitro-Assay für das Modellieren der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Angiogenese mittels spektrographischer Verfahren überwacht wird.

6. Multizellulärer In-vitro-Assay für das Modellieren der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Angiogenese mittels spektrographischer Verfahren überwacht wird.

7. Multizellulärer In-vitro-Assay für das Modellieren der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten Human Adult Dermal Fibroblasts und die Endothelzellen Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) sind.

8. Multizellulärer In-vitro-Assay für das Modellieren der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Vorbereiten von Wachstumsgefäßen, die für die Aufrechterhaltung dualer Zellkulturen geeignet sind und ein geeignetes Kulturmedium aufweisen, das zumindest das Wachsen von Endothelzellen in den Gefäßen aufrecht erhält;

(b) Säen einer dualen Kultur humaner Fibroblasten und humaner Endothelzellen, um ein Soll-Verhältnis derselben von 2 : 1 bis 8 : 1 zu erhalten;

(c) Inkubieren derselben ohne die Bereitstellung exogener Wachstumsfaktoren oder exogener Matrixproteine;

(d) Überwachen der Fortentwicklung der Zellen von einer anfänglichen Proliferationsphase bis zur Bildung einer sich vereinenden Monolayer aus humanen Fibroblasten, auf der die Endothelzellen die Proliferations-, Migrations- und Differenzierungsphase der Angiogenese präsentieren;

(e) regelmäßiges Erneuern des Kulturmediums während der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese;

(f) Überwachen der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese oder der Wirkungen von Screeningagenzien auf dieselbe während eines festgelegten Zeitraums.

9. Multizellulärer In-vitro-Assay für das Modellieren der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten Human Adult Dermal Fibroblasts und die Endothelzellen Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) sind.

10. Multizellulärer In-vitro-Assay für das Modellieren der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium der dualen Kultur alle 48 Stunden erneuert wird.

11. Multizellulärer In-vitro-Assay, geeignet für das Modellieren der Invivo-Angiogenese, nach einem der Ansprüche 1-10 für die Verwendung in der Forschung bezüglich des Angiogeneseprozesses und in der therapeutischen Bewertung der potentiellen Indikation eines Medikaments, umfassend das Bereitstellen einer dualen Kultur aus Fibroblasten und Endothelzellen in einem Kulturmedium in einem Verhältnis derselben von etwa 2 : 1 bis 8 : 1, wobei die duale Kultur in dem Kulturmedium während eines Zeitraums lebensfähig und aufrecht erhaltbar ist, der ausreicht, um den Assay abzuschließen, das Einbringen des zu bewertenden Medikaments in die duale Kultur und das Beobachten der Wirkungen desselben auf das Verhalten der Zellen, insbesondere im Hinblick auf die Angiogenese, wobei eine Hemmung oder Anregung der Angiogenese durch das Medikament ein Potential für die Verwendung bei der Behandlung von angiogeneseabhängigen Krankheiten und Prozessen anzeigt.

12. Multizellulärer In-vitro-Assay, geeignet für das Modellieren der Invivo-Angiogenese und für die Verwendung bei der therapeutischen Bewertung der potentiellen Indikation eines Medikaments nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten Human Adult Dermal Fibroblasts und die Endothelzellen Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) sind.

13. Kit für die Verwendung in einem multizellulären In-vitro-Assay für das Modellieren der miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese, dadurch gekennzeichnet, daß der Kit ein Gefäß umfaßt, das mit einem Kulturmedium versehen ist, das geeignet ist, um Human Adult Dermal Fibroblasts und Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HU- VEC) zu erhalten und Interaktion zwischen denselben zu gestatten, und besät mit diesen Zellen in einem festgelegten Verhältnis von etwa 2 : 1 bis 8 : 1 in Form einer dualen Kultur, in der das Verhältnis von Fibroblasten zu Endothelzellen größer ist, so daß der Kit bei Aktivierung bewirkt, daß die Human Adult Dermal Fibroblasts eine Monolayer bilden, auf der die Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) die miteinander kombinierten Phasen der Angiogenese präsentieren.

14. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Kit ein Kulturgefäß umfaßt, das mit einer dualen Kultur besät ist, wobei der Kit weiterhin ein Wachstumsmedium, das in der Lage ist, das Wachstum von Endothelzellen aufrecht zu erhalten, Fixativ, Blockungspuffer, Waschpuffer, Reagenzien und Antikörper für die Visualisierung umfaßt.

15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Visualisierung mit Hilfe des Targetings geeigneter Marker erfolgt.

16. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien für die Visualisierung diejenigen sind, die in einem Willebrand- Immungssay verwendet werden.

17. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien für die Visualisierung diejenigen sind, die in einem PECAM-1- Immungssay verwendet werden.