DE10062623A1 - Dreidimensionales Hautmodell - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Kultivierung dermaler Fibroblasten, Verfahren zur Herstellung von in vitro-Dermisäquivalenten, Verfahren zur Herstellung von dreidimensionalen in vitro-Hautäquivalenten, ein in vitro-Dermisäquivalent, ein dreidimensionales in vitro-Hauptäquivalent und Verfahren zur Bestimmung der Wirkung einer chemischen Substanz oder eines Agens auf menschliche Hautzellen unter Verwendung des in vitro-Dermisäquivalents und/oder des in vitro-Hautäquivalents.

Description

Die Erfindung betrifft ein hauttypisches, dreidi­ mensionales, vorzugsweise humanes in vitro- Hautäquivalent, bestehend aus einem Dermisäquiva­ lent und einem Epidermisäquivalent, und Verfahren zur Herstellung, Kultivierung und Anwendung dieses Hautäquivalents sowie dessen Bestandteile.

Hauttypische Vollhautmodelle, die auch als in vitro-Hautäquivalente bezeichnet werden, können insbesondere in der Dermatologie und in der Aller­ gologie als Testhaut verwendet werden, um Substan­ zen, beispielsweise potentielle Arzneimittel oder Kosmetika, oder Agenzien, wie Licht und Wärme, auf ihre pharmakologischen Wirkungen, insbesondere Reiz-, Toxizitäts- und Entzündungswirkungen, und auf ihre Verträglichkeit zu untersuchen. Ein sol­ ches System kann darüber hinaus für vielfältige im­ munologische, histologische und molekularbiologi­ sche Fragestellungen eingesetzt werden. Dazu zählen zum Beispiel Studien zur Wundheilung und zur Penet­ ration und Resorption von Substanzen. Die Untersu­ chungen beziehungsweise Tests von Substanzen an solchen Vollhautmodellen bieten gegenüber Tierver­ suchen und Versuchen mit menschlichen Probanden we­ sentliche Vorteile, da die damit erzielten Ergeb­ nisse reproduzierbarer sind und die Untersuchungen kostengünstiger und schneller durchgeführt werden können.

Zur Prüfung von Rohstoffen und Produkten sind in den letzten Jahren zumeist humane Zellkulturen als in vitro-Systeme verwendet wurden. Eine Weiterent­ wicklung der Zellkulturtechnik stellen dreidimensi­ onale, organähnliche, humane Zellstrukturen und Co­ kultursysteme dar. Die damit gewonnenen Ergebnisse lassen sich noch besser auf den Menschen übertragen als die an Einzelzellkulturen gewonnenen Ergebnis­ se. Mit den Entwicklungen von Rheinwald und Green (Rheinwald, J. G. et al., "Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The for­ mation of keratinizing colonies from single cells", Cell, 6 (1975), 331-344; Green, H. et al., "Growth of cultured human epidermal cells into multiple e­ pithelia suitable for grafting", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76 (1979), 5665-5668) hat die Kultivierung von humanen Keratinocyten und deren Anwendung in der Verbrennungsmedizin und der in vitro- Dermatologie ihre Anfänge genommen. Bislang wurden unterschiedliche Modelle rekonstruierter Haut in vitro hergestellt.

Die EP 0 197 090 B1 offenbart ein Verfahren zur Bildung eines Hautäquivalents, wobei durch Mischen einer saure Kollagenlösung mit kontraktilen Zellen, beispielsweise Fibroblasten, ein hydratisiertes Kollagengitter hergestellt wird. Nach Neutralisie­ rung des pH-Wertes werden in dem Kollagengitter Kollagenfibrillen ausgefällt. Die kontraktilen Zel­ len lagern sich an das Kollagengitter an und bewir­ ken dessen Kontraktion, wobei sich ein Dermisäqui­ valent bildet. Durch das Einbringen von Haut- Stanzbiopsien in das Kollagengitter können Kerati­ nocyten aus den Stanzbiopsien auf der Oberfläche des Dermisäquivalentes wachsen, wobei sich ein Hautäquivalent bildet.

In der EP 0 285 474 B1 wird ein Hautäquivalent of­ fenbart, das ein aus Kollagen und Fibroblasten er­ haltenes Dermisäquivalent und ein mehrschichtiges Epidermisäquivalent umfaßt. Dabei wird das Dermis­ äquivalent mit einem menschlichen oder tierischen Explantat, beispielsweise einem Haarfollikel, be­ impft, um das Epidermisäquivalent zu erhalten.

Die EP 0 020 753 B1 beschreibt ein Verfahren zur Bildung von Gewebe, insbesondere Hautgewebe, wobei ebenfalls Fibroblasten in ein hydratisiertes Kolla­ gengitter eingebracht werden und sich nach Kontrak­ tion des Kollagengitters ein Gewebe bildet. Auf dieses Gewebe können zuvor in vitro kultivierte Ke­ racinocyten oder aus Vorhaut isolierte Keratinocy­ ten aufgebracht werden, wobei sich ein Hautersatz bildet.

Aus der EP 0 418 035 B1 ist ein Gewebeäquivalent bekannt, das ein hydratisiertes Kollagengitter, welches mittels eines kontraktilen Agens wie Fibroblasten kontrahiert wird, und ein Kollagengel, welches mit einem permeablen Element in Kontakt steht, umfasst. Dabei wird das Gemisch aus Kollagen und kontraktilem Agens auf das Kollagengel aufge­ tragen, wobei durch den Kontakt zwischen Kollagen­ gel und permeablem Element, beispielsweise einer Polycarbonatmembran, die radiale oder laterale Kon­ traktion des Kollagengitters unterbunden wird, so dass das Gitter nur bezüglich seiner Dicke kontra­ hiert. Nach Bildung des Dermisäquivalents können dann Keratinocyten ausgesät werden, wobei sich ein Hautäquivalent bildet.

Ferner offenbart das US-Patent Nr. 5,861,153 ein Hautäquivalent, das aus einem Epidermisäquivalent auf einem Träger besteht, wobei das Epidermisäqui­ valent Keratinocyten und induzierte oder nicht in­ duzierte Vorläufer von Langerhans-Zellen umfasst. Bei dem Träger kann es sich um ein Fibroblasten enthaltendes Kollagengitter handeln oder um von der Epidermis befreite Dermisabschnitte, künstliche Membranen, einen Subkutanersatz auf der Basis von Kollagen oder synthetische Materialien.

Das US-Patent Nr. 4,963,489 beschreibt ein in vitro hergestelltes Stroma-Gewebe, wobei die Stromazel­ len, beispielsweise Fibroblasten, ein Grundgerüst umhüllen, das aus einem biologisch verträglichen Material, beispielsweise Cellulose, besteht. Das beschriebene System läßt sich unter anderem zur Herstellung eines dreidimensionalen Hautkultursys­ tems verwenden, wobei Keratinocyten und Melanocyten auf dem Dermisäquivalent, das heisst der dreidimen­ sionalen Stroma-Trägermatrix, ausgebracht werden.

Das US-Patent Nr. 5,755,814 beschreibt ein Hautmo­ dellsystem, das sich sowohl als in vitro-Testsystemen als auch für therapeutische Zwecke einsetzen lässt. Das System umfasst eine dreidimensionale vernetzte Matrix von unlöslichem Kollagen mit darin enthalte­ nen Fibroblasten und stratifizierte Schichten dif­ ferenzierter Epidermiszellen, wobei eine Epidermis­ zell-Schicht in direktem Kontakt zu der Oberfläche der Kollagen-Matrix steht. Die Vernetzung der Mat­ rix kann sowohl mittels thermischer Behandlung un­ ter Wasserentzug als auch durch chemische Mittel, beispielsweise Carbodiimid, erfolgen.

In dem US-Patent Nr. 5,882,248 ist ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung chemischer Substanzen oder Agenzien auf ein menschliches Hautmodellsystem gemäß US-Patent Nr. 5,755,814 beschrieben. Die Wechselwirkung zwischen dem Hautmodellsystem und den zu testenden Substanzen wird anhand der Frei­ setzung von Stoffen durch Zellen des Hautmodellsys­ tems sowie der Wirkungen auf Stoffwechsel, Prolife­ ration, Differenzierung und Reorganisation dieser Zellen bestimmt.

In der WO 95/10600 ist darüber hinaus ein Verfahren beschrieben, mit dem ein Epidermisäquivalent gewon­ nen werden kann. Dieses Epidermisäquivalent kann für pharmazeutische und/oder kosmetische Son­ nenbräunungs-Tests verwendet werden.

Bei den bekannten Hautmodellen wirkt sich nachtei­ lig aus, dass diese zumeist nur aus einer oder meh­ reren epidermalen Schicht(en) aus Keratinocyten be­ stehen. In den Fällen, wo eine stratifizierte Epi­ dermis erhalten wird, werden Gewebe-Explantate ein­ gesetzt, die die Gefahr einer Kontamination mit Er­ regern in sich bergen, was bei einer späteren Ver­ wendung des Hautäquivalents als Testhaut zu Ergeb­ nisverfälschungen führen kann. Sofern die beschrie­ benen Hautmodelle einen Dermalteil besitzen, be­ steht dieser häufig aus spongiösem, quervernetztem Material, das neben Kollagen außerdem noch andere nicht-hauttypische Materialien enthalten kann. So­ fern bei den im Stand der Technik beschriebenen Hautäquivalenten der Dermalteil nur aus Kollagen und Fibroblasten besteht, ist er einem undefinier­ ten Schrumpfungsprozess unterworfen, der auf eine starke Schrumpfung des Kollagengels und einen Flüs­ sigkeitsaustritt daraus zurückzuführen ist. Dies führt dazu, dass die im Stand der Technik beschrie­ benen Hautäquivalente sich nur in beschränktem Maße als Testhaut definierter Größe eignen und die damit erhaltenen Ergebnisse sich nur bedingt auf native menschliche Haut übertragen lassen.

Das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende technische Problem besteht also darin, ein weitge­ hend nativer menschlicher Haut entsprechendes drei­ dimensionales humanes in vitro-Vollhautmodell sowie Verfahren und Mittel zu dessen Herstellung bereit zu stellen, das sowohl eine Epidermisschicht als auch eine Dermisschicht besitzt, die keinem undefi­ nierten Schrumpfungsprozess unterworfen ist, und das sich als Testhaut definierter Größe beispiels­ weise zur Untersuchung pharmakologischer und kosme­ tischer Wirkungen einsetzen lässt.

Die Erfindung löst das ihr zu Grunde liegende Prob­ lem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Differenzierung und/oder Vermehrung isolierter der­ maler Fibroblasten, wobei die Fibroblasten in einer dreidimensionalen gelartigen Biomatrix kultiviert werden und sich dort vermehren können. Diese Bio­ matrix enthält neben den zu kultivierenden Fibroblasten ein aus einer Kollagenlösung konstitu­ iertes Gerüst aus menschlichem oder tierischem Kol­ lagen, also gewebetypische Matrixproteine. Dieses Kollagen-Fibroblasten-Gel wird erfindungsgemäß be­ vorzugt einer ein- bis zweitägigen Submers-Kultur unterworfen. Auf die Fibroblasten enthaltende Bio­ matrix werden danach Keratinocyten-Stammzellen aus­ gesät. In besonders bevorzugter Ausführungsform werden vorzugsweise Keratinocyten mit einem ver­ gleichsweise hohen Anteil, beispielsweise 0,5%, 1%, 2%, 5%, 8%, oder 10% an der Keratinocyten-Zellpopu­ lation, oder umfassend nur undifferenzierte Stamm­ zellen, eingesetzt. Unter Verwendung spezifischer Kulturbedingungen, die insbesondere eine mehrtägige Submerskultur und eine nachfolgende mehrtägige Air­ lift-Kultur des Biomatrix-Systems umfassen, und spezifischer Kulturmedien durchlaufen die Keratino­ cyten eine Differenzierung zu einer mehrschichtigen Epidermisschicht. Erfindungsgemäß ist darüber hin­ aus in einer bevorzugten Ausführung vorgesehen, dass vor, während oder nach der Aussaat der Kerati­ nocyten auch andere Zelltypen und/oder andere Zel­ len anderer Gewebetypen auf der Biomatrix ausgesät werden können, zum Beispiel Immunsystemzellen.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren wird so­ mit ein organoides in vitro-Hautmodell erhalten, das aus zwei gewebetypischen Schichten, nämlich ei­ nem Dermisäquivalent und einem Epidermisäquivalent, aufgebaut ist. Das organotypische Hautmodell ent­ spricht sowohl histologisch als auch funktionell weitgehend der nativen Haut.

Durch ein spezielles Verfahren zur Kollagenextrak­ tion und durch die Zusammensetzung der zur Bildung der Biomatrix verwendeten Kollagen-Suspension wird erreicht, dass das Dermisäquivalent im Verlauf der Kultivierungsdauer keinem undefinierten Schrump­ fungsprozess unterworfen ist. Aufgrund der verwen­ deten Kulturverfahren und der Verwendung von Zell­ kulturinserts mit einer speziellen Oberflächenbe­ schichtung wird erreicht, dass der Dermalteil le­ diglich einer definierten Schrumpfung in vertikaler Richtung unterworfen wird, während eine Schrumpfung in horizontaler Richtung verhindert wird. Dadurch werden Hautäquivalente mit definiertem Durchmesser, einheitlicher Oberfläche und einem definierten Ab­ schluss zum Rand des Kulturinserts erhalten. Durch die einheitliche Größe und einheitliche Beschaffen­ heit des als Testoberfläche verwendeten Vollhautmö­ delle wird erreicht, dass bei Tests von Substanzen auf pharmakologische und/oder kosmetische Effekte die Qualität der Ergebnisse gesteigert und die Testergebnisse reproduzierbarer werden.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Er­ findung umfasst die Kultivierung dermaler Fibroblasten in einer dreidimensionalen gelartigen Biomatrix zur Vermehrung der Fibroblasten oder zur Herstellung eines Dermisäquivalentes und/oder eines Hautäquivalentes.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung be­ deutet der Begriff "Kultivieren von Zellen" ein, vorzugsweise in vitro stattfindendes Aufrechter­ halten der Lebensfunktionen von Zellen, beispiels­ weise Fibroblasten, in einer geeigneten Umgebung, beispielsweise unter Zu- und Abfuhr von Stoffwech­ seledukten und -produkten, insbesondere auch eine Vermehrung der Zellen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer­ den unter dermalen Fibroblasten natürlicherweise vorkommende, insbesondere in der Dermis vorkommende Fibroblasten oder gentechnisch veränderte Fibroblasten oder deren Vorläufer verstanden. Fibroblasten stellen die Vorläufer dermaler Fibro­ cyten, das heisst spindelförmiger Zellen des Haut- Bindegewebes mit ovalem Kern und langen Fortsätzen, dar. Die Fibroblasten können tierischer oder menschlicher Herkunft sein.

Die zur Kultivierung der Fibroblasten vorgesehene Biomatrix enthält also die zu kultivierenden Fibroblasten und ein aus einer, vorzugsweise fri­ schen, Kollagenlösung menschlichen oder tierischen Ursprungs neu konstituiertes Kollagengerüst einer Konzentration von mindestens 3 mg Kollagen pro ml Biomatrix, vorzugsweise 3,5 bis 4,5 mg Kollagen pro ml Biomatrix. Das Kollagengerüst wird aus einer, vorzugsweise zellfreien, sauren Lösung von Kollagen I, gewonnen, wobei die Proteinkonzentration der Kollagenlösung vorzugsweise 5 bis 7 mg/ml beträgt. Der pH-Wert der Kollagenlösung beträgt 0,1 bis 6,9, vorzugsweise 2,0 bis 5,0, bevorzugt 3,0 bis 4,5, insbesondere 3,2 bis 4,2 und besonders bevorzugt 3,8. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Fibroblasten-haltigen Biomatrix wird die Kollagen­ lösung bei 2°C bis 10°C, vorzugsweise bei 4°C, mit einer Lösung, enthaltend ein vorzugsweise fünffach konzentriertes Zellkulturmedium, vorzugsweise fünffach konzentriertes M199-Zellkulturmedium, Puf­ fer, vorzugsweise Hepes-Puffer, Serum, vorzugsweise fötales Kälberserum (FCS), und Chondroitin-(4/6)- sulfat, und vorzugsweise 1,5 × 10⁵/ml Fibroblasten, insbesondere vorkultivierten Fibroblasten, versetzt und gut gemischt. Dieses Gemisch wird in die Ver­ tiefungen einer Mikrokulturplatte mit 24 Vertiefun­ gen, wobei jede Vertiefung einen Durchmesser von 10 mm aufweist, gegeben und durch Erhöhung der Tempe­ ratur auf beispielsweise Raumtemperatur oder 37° erfolgt eine Gelierung. Nach dem Gelieren der Fibroblasten-Kollagengele wird Fibronectin, vor­ zugsweise humanes Fibronectin, auf die Gele gege­ ben. Bei Fibronectinen handelt es sich um in Fibroblasten produzierte Struktur- beziehungsweise Adhäsionsproteine, deren Funktion in vivo in der Bindung an andere Makromoleküle, beispielsweise Kollagen, und in der Anheftung von Zellen an Nach­ barzellen besteht. Durch die Zugabe von Fibronekti­ nen zur Fibroblasten-Kollagenmatrix wird also die Bindung der Fibroblasten sowohl an Kollagen als auch untereinander begünstigt. Die anschließende Kultivierung der Fibroblasten im Kollagengel er­ folgt vorzugsweise in Submers-Kultur. Im Zusammen­ hang mit der vorliegenden Erfindung wird unter ei­ ner "Submers-Kultivierung" oder einer "Submers- Kultur" ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen verstanden, wobei die Zellen mit einer Nährlösung bedeckt sind. Die Fibroblasten enthaltende Biomat­ rix wird also mit Zellkulturmedium überschichtet und bei 37°C inkubiert.

In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfin­ dung können die in der Biomatrix kultivierten Fibroblasten wieder aus der Biomatrix herausgelöst und gegebenenfalls erneut in eine Biomatrix einge­ bracht werden, wobei die Zellen nach Herauslösen ihre spezifischen Stoffwechselleistungen und ihren Differenzierungsstatus nicht verlieren. Das erfin­ dungsgemäße Verfahren gestattet es also, eine Zwi­ schenkultivierung der Fibroblasten in der Biomatrix durchzuführen. Bei einer geringen Ausgangsmenge an Fibroblasten bietet das erfindungsgemäße Verfahren daher den Vorteil, dass genügend Zellmaterial für die Herstellung von Dermisäquivalenten und/oder Hautäquivalenten zur Verfügung gestellt werden kann.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfin­ dung sieht vor, dass dermale Fibroblasten, die in ihrer Funktion, ihrer Morphologie und/oder ihrem Differenzierungsstatus überprüft werden sollen, in eine vorstehend genannte dreidimensionale Biomatrix eingebracht, kultiviert und dabei und/oder danach überprüft werden. Die Erfindung betrifft daher auch unter Verwendung dermaler Fibroblasten durchgeführ­ te Screening- und Diagnoseverfahren, wobei die Fibroblasten gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren kultiviert und dabei und/oder anschlie­ ßend untersucht werden können, zum Beispiel auf pharmakologische, toxikologische, physiologische, morphologische und/oder molekularbiologische Para­ meter.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die dermalen Fibroblasten in der dreidimensionalen Biomatrix, wie vorstehend be­ schrieben, so kultiviert, dass anschließend ein Dermisäquivalent gewonnen werden kann. Im Zusammen­ hang mit der vorliegenden Erfindung wird unter ei­ nem "Dermisäquivalent" eine Bindegewebe-artige Schicht aus Kollagen und Fibroblasten verstanden, die weitgehend der nativen Dermis entspricht.

Das so erhaltene Dermisäquivalent kann für Scree­ ning- und Diagnoseverfahren verwendet werden, ins­ besondere zur Untersuchung der Wirkungen chemischer Substanzen, beispielsweise potentieller Arzneimit­ tel oder Bestandteile von Kosmetika, oder anderer Agenzien. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Er­ findung werden unter dem Begriff "Agens" oder "Agenzien" insbesondere auf die Haut oder Hautzel­ len wirkende physikalische Mittel wie Licht, Wärme, oder ähnliches, verstanden. Die Erfindung betrifft daher auch Screening- und Diagnoseverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Dermis­ äquivalente.

Eine bevorzugte Ausführung der Erfindung umfasst die Behandlung des Dermisäquivalents in An- und Ab­ wesenheit der zu untersuchenden Substanz und/oder des zu untersuchenden Agens und den Vergleich der beobachteten Auswirkungen auf die Zellen oder Zell­ bestandteile des Dermisäquivalents.

Eine weitere bevorzugte Ausführung der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Untersuchung der Penetra­ tion von Substanzen unter Verwendung des erfin­ dungsgemäß hergestellten Dermisäquivalents und un­ ter Verwendung eines erfindungsgemäßen Hautäquiva­ lents, das aus einem Dermisäquivalent und einem Epi­ dermisäquivalent besteht.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Er­ findung betrifft auch ein vorgenanntes Verfahren zur Kultivierung dermaler Fibroblasten in einer Biomatrix zur Herstellung eines aus Dermisäquiva­ lent und Epidermisäquivalent bestehenden Hautäqui­ valentes. Dabei werden ein bis drei Tage, vorzugs­ weise zwei Tage, nach der vorstehend beschriebenen Herstellung und Inkubation der Kollagen- Fibroblasten-Gele Keratinocyten auf das Gel ausge­ sät.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer­ den unter "Keratinocyten" Zellen der Epidermis, die verhornendes Plattenepithel bilden, oder gentech­ nisch veränderte Keratinocyten oder deren Vorläufer verstanden, die tierischer oder menschlicher Her­ kunft sein können. Da die Ausbildung einer gut dif­ ferenzierten Epidermis mit intakter Verhornung in starkem Maße vom Anteil basaler Stammzellen in den verwendeten Keratinocyten abhängt, handelt es sich bei den auf das Kollagengel ausgesäten Keratinocy­ ten vorzugsweise um möglichst undifferenzierte Ke­ ratinocyten-Stammzellen aus humanem Biopsiegewebe, das heisst Cytokeratin 19- beziehungsweise Integrin β1-positive basale Stammzellen. Vorzugsweise han­ delt es sich dabei um vorkultivierte Zellen, beson­ ders bevorzugt um Keratinocyten in der ersten oder in der zweiten Zellpassage. Die Aussaat der Kerati­ nocyten auf die Biomatrix erfolgt vorzugsweise in einem Zellkulturmedium, besonders bevorzugt in KBM- Medium (Clonetics), das 5% fötales Kälberserum ent­ hält. Anschließend wird die Biomatrix mit KBM- Medium, enthaltend humanen epidermalen Wachstums­ faktor (hEGF) (0,1 µg/500 ml Medium), BPE (15 mg/500 ml Medium) und 0,8 mM CaCl₂, überschichtet und einer vorzugsweise 1- bis 3-tägigen Submers- Kultivierung unterworfen. Eine vollständige Diffe­ renzierung der Keratinocytenschichten wird durch eine Airlift-Kultur mit 1,8 mM CaCl₂ enthaltendem KBM-Medium ohne hEGF und BPE erreicht. Im Zusammen­ hang mit der vorliegenden Erfindung wird unter ei­ ner "Airlift-Kultur" eine Kultur verstanden, wobei die Höhe des Nährmedienspiegels genau auf die Höhe der Biomatrix abgestimmt ist, während die Keratino­ cyten oder durch die Keratinocyten gebildete Zell­ schichten über dem Nährmedienspiegel liegen und vom Nährmedium nicht bedeckt werden, das heisst, die Kultivierung erfolgt an der Grenzschicht Luft- Nährmedium, wobei die Versorgung der Kulturen von unten her erfolgt. Dazu werden die Inserts aus der Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen in die Vertie­ fungen einer Mikrotiterplatte mit 6 Vertiefungen mit jeweils einem Durchmesser von 3,5 cm übertra­ gen. Nach einer vorzugsweise 12- bis 14-tägigen Airlift-Kultur entwickelt sich ein hauttypisches, aus Dermisäquivalent und Epidermisäquivalent beste­ hendes in vitro-Vollhautmodell.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung ei­ nes in vitro-Vollhautmodells kann vorteilhafterwei­ se so modifiziert werden, dass vor, während oder nach der Aussaat von Keratinocyten weitere Haut­ zelltypen, wie Melanocyten, Immunzellen und/oder Endothelzellen, auf der Biomatrix ausgesät und wei­ ter kultiviert werden können.

Die Erfindung betrifft daher auch ein hauttypisches in vitro-Vollhautmodell, insbesondere ein humanes in vitro-Vollhautmodell, das nach dem erfindungsge­ mäßen Verfahren und einem gegebenenfalls anschlie­ ßenden und/oder vorausgehenden Kultivierungsverfah­ ren herkömmlicher Art hergestellt wurde und das mindestens 2 bis 4 proliferative, einige differen­ zierende und mindestens 4 bis 5 verhornte Zell­ schichten umfasst, wobei das Epidermisäquivalent Stratum basale, Stratum spinosum, Stratum granulo­ sum und Stratum corneum umfasst und wobei zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent eine funktionsfähige Basalmembran aus Matrixprotei­ nen enthalten ist und wobei darüber hinaus hautty­ pische Proteine wie Fillgrin, Ki-67 und Cytokeratin 10 exprimiert werden.

Aufgrund der Komplexität des hergestellten Hautmo­ dells kann dieses gezielt für verschiedene Frage­ stellungen der chemisch-pharmazeutischen Industrie und der kosmetischen Industrie verwendet werden. Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäß herge­ stellte Hautäquivalent zur Produktprüfung, bei­ spielsweise im Hinblick auf Wirksamkeit, uner­ wünschte Nebenwirkungen, beispielsweise Reiz-, To­ xizitäts- und Entzündungswirkungen oder allergie­ auslösende Wirkungen, oder Verträglichkeit von Sub­ stanzen. Dabei kann es sich um Substanzen handeln, die potentielle Verwendung als Arzneimittel, insbe­ sondere als Dermatika, finden sollen, oder um Sub­ stanzen, die Bestandteil von Kosmetika sind. Das erfindungsgemäß hergestellte Hautäquivalent kann beispielsweise auch für Studien zur Resorption, zum Transport und/oder zur Penetration von Substanzen verwendet werden. Darüber hinaus eignet es sich auch zur Untersuchung anderer Agenzien, wie Licht oder Wärme, beispielsweise zur Untersuchung der Phototoxizität, also der schädigenden Wirkung von Licht unterschiedlicher Wellenlänge, auf Zellstruk­ turen. Das erfindungsgemäß hergestellte Hautäquiva­ lent kann selbstverständlich auch zur Untersuchung der Wundheilung eingesetzt werden.

Die Wirkungen von Substanzen oder Agenzien auf menschliche Haut lassen sich beispielsweise anhand der Freisetzung von Stoffen, beispielsweise Cytoki­ nen oder Mediatoren, durch Zellen des humanen Haut­ modellsystems, sowie der Wirkungen auf Genexpressi­ on, Stoffwechsel, Proliferation, Differenzierung und Reorganisation dieser Zellen ermitteln. Unter Verwendung von Verfahren zur Quantifizierung der Zellschädigung, insbesondere unter Verwendung eine Vitalfarbstoffes, wie eines Tetrazoliumderiyates, können beispielsweise cytotoxische Wirkungen auf Hautzellen nachgewiesen werden. Die Tests von Sub­ stanzen oder Agenzien an dem erfindungsgemäßen hu­ manen Hautäquivalent können sowohl histologische Verfahren als auch immunologische und/oder moleku­ larbiologische Verfahren umfassen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung um­ fasst daher Verfahren zur Untersuchung der Wirkung, insbesondere der pharmakologischen Wirkungen, von Substanzen oder Agenzien auf menschliche Haut unter Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten huma­ nen Hautäquivalentes. In einer besonders bevorzug­ ten Ausführungsform wird dabei ein EZ4U-Test durch­ geführt. EZ4U ist ein nicht-toxisches wasserlösli­ ches gelbes Tetrazoliumsalz, das von lebenden Zel­ len zu intensiv gefärbten Formazanen reduziert wer­ den kann. Die Reduktion erfordert intakte Mito­ chondrien, und der Test kann daher zum Nachweis der Vitalität von Zellen eingesetzt werden.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfin­ dung umfasst ein Verfahren zur Untersuchung der Pe­ netration von Substanzen, wobei sowohl ein erfin­ dungsgemäß hergestelltes Dermisäquivalent als auch ein erfindungsgemäß hergestelltes Hautäquivalent mit den zu untersuchenden Substanzen behandelt wer­ den und die bei beiden Systemen erhaltenen Ergeb­ nisse miteinander verglichen werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Wirkungen chemischer Substan­ zen oder anderer Agenzien auf spezielle Hauttypen untersucht. Dabei werden Zellen definierter Hautty­ pen, beispielsweise Hauttypen mit wenig Pigmenten und/oder Hauttypen mit vielen Pigmenten, zur Etab­ lierung erfindungsgemäßer Hautäquivalente einge­ setzt und diese werden im Hinblick auf die Wirkung von Substanzen oder Agenzien getestet.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfüh­ rungsform der Erfindung wird das erfindungsgemäß hergestellte Hautäquivalent als Modellsystem zu Un­ tersuchungen von Hautkrankheiten und zur Entwick­ lung neuer Behandlungsmöglichkeiten für Hautleiden verwendet. Beispielsweise können Zelllinien von Pa­ tienten mit einer bestimmten Hautkrankheit verwen­ det werden, um daraus patientenspezifische Hautmo­ dellsysteme zu etablieren und daran die Wirksamkeit bestimmter Therapien und/oder Medikamente zu unter­ suchen und zu beurteilen.

Die Erfindung betrifft auch eine, vorzugsweise gel­ artige Biomatrix, in der die vorgenannten Kulti­ vierungsverfahren durchgeführt werden können, und zwar eine Biomatrix mit dermalen Fibroblasten. Die erfindungsgemäß vorgesehene Kombination aus Biomat­ rix und darin kultivierten dermalen Fibroblasten kann, wie vorstehend beschrieben, zur Herstellung eines Dermisäquivalentes und/oder eines organoiden Vollhautmodells verwendet werden.

Unter einer Biomatrix wird eine Gelstruktur ver­ standen, die Kollagen, Zellkulturmedium, Serum und Puffer, beispielsweise Hepes-Puffer, enthält. Die Kollagenlösung, die für die Herstellung der Biomat­ rix verwendet wird, ist eine Lösung, die einen ho­ hen Anteil an nicht denaturiertem, nativem Kollagen in saurem, wässrigem Medium enthält, vorzugsweise mit einem pH-Wert von 3,8, beispielsweise in Essig­ säure, bevorzugt in 0,1%iger Essigsäurelösung. Ein hoher Anteil von nicht denaturiertem Kollagen be­ deutet einen Anteil am Gesamtkollagen in Lösung von ≧ 50%, insbesondere ≧ 60%, ≧ 70%, ≧ 80%, ≧ 90% oder ≧ 95%, vorzugsweise ≧ 99%. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei kein lyophilisiertes Kollagen verwendet. Der Kollagengehalt der Lösung beträgt vorteilhafterweise 3 mg Kollagen pro ml Lö­ sung bis 8 mg Kollagen pro ml Lösung, bevorzugter 5 mg Kollagen pro ml Lösung bis 7 mg Kollagen pro ml Lösung, am bevorzugtesten 6 mg Kollagen pro ml Lö­ sung. Vorzugsweise wird dabei Kollagen verwendet, das nach Isolierung, beispielsweise aus Ratten­ schwänzen, in 0,1%iger Essigsäure drei bis vier­ zehn Tage bei 4°C unter Rühren inkubiert wurde und wobei nicht gelöste Kollagenanteile abzentrifugiert wurden. Bevorzugte Zellkulturmedien sind DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) und M199. Jedoch kann auch jedes andere beliebige Zellkulturmedium verwendet werden, welches die Kultivierung von Fibroblasten ermöglicht. Als Serum wird vorzugswei­ se fötales Kälberserum (FCS) verwendet und als Puf­ fer zum Beispiel Hepes-Puffer. Der pH-Wert der Lö­ sung aus Zellkulturmedium, Puffer und Serum beträgt in bevorzugter Ausführung 7,5 bis 8,5, beispiels­ weise 7,6 bis 8,2, insbesondere 7,8. Selbstver­ ständlich kann die Biomatrix weitere Faktoren, bei­ spielsweise Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmittel, An­ tibiotika, Selektionsmittel und ähnliche enthalten.

Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung einer dermale Fibroblasten enthaltenden Biomatrix, wobei in einem ersten Schritt frisches Kollagen menschlichen oder tierischen Ursprungs, beispielsweise aus Rattenschwänzen, hergestellt wird, indem aus kollagenhaltigem Gewebe isolierte Kollagenfasern in Pufferlösung gesammelt, in Alko­ hol oberflächlich desinfiziert und anschließend in Pufferlösung gewaschen und anschließend in eine saure Lösung eines pH-Wertes von 0,1 bis 6,9, vor­ zugsweise 2,0 bis 5,0, besonders bevorzugt 3,0 bis 4,0, insbesondere 3,3, zum Beispiel eine 0,1%ige Essigsäurelösung, überführt werden. Anschließend wird in einem weiteren Schritt das in der Lösung befindliche Kollagen bei 2 bis 10°C, insbesondere 4°C, für einige Tage, zum Beispiel 3 bis 14 Tage, gerührt; die nicht gelösten Kollagenanteile werden abzentrifugiert und eine Kollagenlösung mit einem Kollagengehalt von 3 mg/ml bis 8 mg/ml bei 2 bis 10°C, zum Beispiel 4°C, aufbewahrt. Selbstverständ­ lich ist es möglich, die Lösung in gefrorenem Zu­ stand zwischenzulagern, zum Beispiel bei -10°C bis -80°C, insbesondere -20°C. Zur Herstellung der er­ findungsgemäßen Fibroblasten-haltigen Biomatrix wird in einem dritten Schritt die Lösung aus, vor­ zugsweise fünffach konzentriertem Zellkulturmedi­ um, Serum und Puffer mit vorkultivierten und ab­ zentrifugierten Fibroblasten gemischt, wobei vor­ zugsweise 1 × 10⁵ bis 2 × 10⁵ Zellen pro ml, bevor­ zugt 1,5 × 10⁵ Zellen pro ml, verwendet werden. Diese Lösung beziehungsweise Suspension eines pH- Wertes von 7,5 bis 8,5, bevorzugt 7,6 bis 8,2, ins­ besondere 7,8, wird anschließend, besonders bevor­ zugt im Verhältnis 1 : 2, mit der vorgenannten Kolla­ genlösung bei 2 bis 10°C, insbesondere 4°C, ge­ mischt. Anschließend wird die Gellösung in Kultur­ gefäße pipettiert und nach Gelieren bei 37°C mit Medium überschichtet. Sodann wird die Biomatrix mindestens 2 Tage kultiviert, und anschließend kön­ nen Keratinocyten darauf ausgebracht werden.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele näher erläutert.

Fig. 1 zeigt einen Längsschnitt nativer menschli­ cher Haut und einen Längsschnitt eines erfindungs­ gemäß hergestellten humanen Hautäquivalents.

Fig. 2 stellt ein Säulendiagramm dar, das die pro­ zentuale Veränderung des Zellmetabolismus von Haut­ äquivalenten zeigt, die im EZ4U-Test 48 Stunden mit zu testenden Substanzen inkubiert wurden.

Fig. 3 stellt in grafischer Form die Veränderung des Interleukin 1 α-Gehaltes in den Medienüberstän­ den von Hautäquivalenten dar, die 24 Stunden (24h-1) und 48 Stunden (24h-2) mit unterschiedlichen SDS-Konzentrationen inkubiert worden waren.

Fig. 4 zeigt die Veränderung des Interleukin 1 α- Gehaltes in den Medienüberständen von Hautäquiva­ lenten, die 24 Stunden (24h-1) und 48 Stunden (24h-2) mit zu testenden Substanzen inkubiert worden wa­ ren.

Fig. 5 zeigt die Veränderung des PGE₂-Gehaltes in den Medienüberständen von Hautäquivalenten dar, die 24 Stunden (24h-1) und 48 Stunden (24h-2) mit un­ terschiedlichen SDS-Konzentrationen inkubiert wor­ den waren.

Fig. 6 zeigt in grafischer Form die Veränderung des PGE₂-Gehaltes in den Medienüberständen von Hautäquivalenten, die 24 Stunden (24h-1) und 48 Stunden (24h-2) mit zu testenden Substanzen inku­ biert worden waren.

Beispiel 1 Herstellung eines dreidimensionalen humanen Haut­ äquivalents Herstellung einer Gellösung

20 Teile fünffach konzentriertes M 199-Zellkultur­ medium (Life Technologies), 10 Teile HEPES-Puffer (4,76 g in 100 ml PBS-Lösung, pH-Wert 7,3) und 1 Teil Chondroitin-(4,6)-sulfat (5 mg/ml in PBS) wer­ den gemischt, und der pH-Wert des Gemisches wird auf 7,8 eingestellt. Das Gemisch wird sterilfiltriert und anschließend mit 10 Teilen fötalem Kälberserum versetzt.

Herstellung einer Kollagenlösung

Zur Herstellung einer Kollagenlösung wird kollagen­ haltiges Gewebe, wie zum Beispiel Sehnen aus Rat­ tenschwänzen, verwendet. Alle Arbeiten werden unter sterilen Bedingungen mit sterilen Materialien durchgeführt. Die Rattenschwänze werden nach Lage­ rung bei -20°C mit 70%igem Alkohol oberflächlich desinfiziert. Die Haut der Rattenschwänze wird ab­ gezogen, und die einzelnen Kollagenfasern werden he­ rausgezogen. Bei Verwendung anderer Ausgangsgewebe können gegebenenfalls vorhandene Zellen schonend durch mechanische, enzymatische oder chemische Be­ handlung entfernt werden. Die Kollagenfasern werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,2) gesammelt, in 70%igem Alkohol 10 min ober­ flächlich desinfiziert und anschließend gründlich mit PBS gewaschen. Das Gewicht der Fasern wird be­ stimmt und die Fasern werden in eine 0,1%ige Es­ sigsäurelösung überführt (Endkonzentration etwa 8 bis 12 mg/ml). Dieser Ansatz wird etwa 3 bis 14 Ta­ ge bei 4°C gerührt, und anschließend werden die nicht gelösten Kollagenteile mittels Zentrifugation (1000 Upm, 1 Stunde, 8°C) entfernt. Dadurch liegt das Kollagen in Lösung und nicht in Faser-, Gerüst- oder Matrixform vor.

Herstellung der dermale Fibroblasten enthaltenden Kollagengele (Ansatz für 24 Inserts)

16 ml Kollagenlösung werden in ein 50 ml- Zentrifugenröhrchen gegeben und auf Eis gestellt. Vorkultivierte dermale Fibroblasten werden geernet und ausgezählt. 1, 2 × 106 Fibroblasten werden in 8 ml eiskalte Gellösung aufgenommen, gut suspendiert und luftblasenfrei in die Kollagenlösung gegeben. Kollagenlösung. Gellösung und Fibroblasten werden gut gemischt. Jeweils 600 µl des Gemisches werden vorsichtig in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen (Durchmesser je Vertiefung 10 mm) gegossen. Durch eine zweiminütige Inkubation bei 37°C erfolgt eine Gelierung des Gemisches. Nach dem Gelieren des Gemisches werden jeweils 50 µl Fibronectin (5 µg/ml) auf jedes Insert gegeben. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 37°C bezie­ hungsweise einer 30-minütigen Inkubation bei Raum­ temperatur wird pro Vertiefung 1 ml M199-Medium zu­ gegeben, wobei die Inserts mit dem Medium über­ schichtet werden. Die im Gel enthaltenen Fibroblasten werden etwa 1 bis 2 Tage dieser Sub­ mers-Kultivierung bei 37°C unterworfen, wobei je­ weils nach 12 Stunden das Medium gegen frisches Me­ dium ausgetauscht wird.

Aussaat der Keratinocyten und Kultivierung der Hautäquivalente

Vor der Aussaat der Keratinocyten wird zunächst vorsichtig das Medium in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte und von den Gelen abgesaugt. Dann werden pro Vertiefung 500 µl KBM-Medium (Clonetics), enthaltend 5% FCS. Die Gele werden mit jeweils 50 µl Fibronectin-Lösung beschichtet und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Dann werden pro Gel 100.000 Keratinocyten in 50-100 µl KBM-Medium, ent­ haltend 5% FCS, ausgesät und 1 bis 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 500 µl KBM- Medium, enthaltend 5% FCS, 8 mM CaCl₂, hEGF (0,1 µg/500 ml Medium) und BPE (15 mg/500 ml Medium), zugegeben, und die Gele werden 1 bis 3 Tage einer Submers-Kultivierung unterworfen, wobei das Medium täglich gegen frisches Medium ausgetauscht wird. Danach werden die Gele weitere 2 bis 3 Tage in je­ weils 1 bis 1,5 ml KBM-Medium, enthaltend 2% FCS, 8 mM CaCl₂, hEGF und BPE einer Submers-Kultivierung unterworfen. Danach werden die Gele mit dem sich entwickelnden Hautäquivalent einer Airlift- Kultivierung unterworfen. Dazu werden die Gele in eine Platte mit 6 Vertiefungen umgesetzt, und pro Vertiefung werden 1,5 bis 2 ml KBM-Medium mit einem CaCl₂-Gehalt von 1,88 mM ohne hEGF und BPE zugege­ ben, wobei der Spiegel des Mediums genau auf die Höhe des Gels abgestimmt wird, während die Kerati­ nocyten oder die durch Keratinocyten gebildeten Schichten nicht vom Medium bedeckt werden. Die Air­ lift-Kultivierung wird mindestens 12 bis 14 Tage fortgeführt.

Die Fig. 1 stellt vergleichend native menschliche Haut und ein erfindungsgemäßes humanes Hautäquiva­ lent dar.

Beispiel 2 Test chemischer Substanzen an einem dreidimensiona­ len humanen Hautäquivalent

Substanzproben wurden zur Testung am humanen Haut­ äquivalent eingesetzt. Eine möglicherweise irrita­ tive Wirkung der Proben auf das Vollhautmodell sollte nach 48 Stunden Inkubationszeit über den EZ4U-Metabolismus geprüft werden. Die Sekretion von Il1α und PGE₂ sollte in den Medienüberständen nach 24 Stunden und nach 48 Stunden mittels ELISA ermit­ telt werden. Als Referenzsubstanz wurden unter­ schiedliche Konzentrationen von SDS mitgeführt. Zum Abschluss wurden alle getesteten Hautäquivalente fixiert und der morphologische Aufbau an gefärbten Paraffinschnitten geprüft und ausgewertet.

Bei dem als Referenzsubstanz verwendeten SDS wurden die Expositionszeit (Et50) von 1%igem SDS und die Ec50-Konzentrationen über 24 Stunden beziehungswei­ se 48 Stunden Inkubationszeit ermittelt.

Die Hautäquivalente wurden je in einem 6-well mit 1 ml Medium angesetzt (KGM ohne hEGF ohne BPE, und mit 1,8 mM CaCl₂). Die Inkubation der Proben auf der Oberfläche der entsprechenden Hautmodelle er­ folgte nach folgendem Schema:

Tag 1: Aufbringen von 3 µl Substanz morgens und nachmittags.
Tag 2: Medienwechsel und Einfrieren der Medienüber­ stände für die Il1α- und PGE₂-Bestimmung. Behand­ lung mit 3 µl Substanz morgens und nachmittags.
Tag 3: Einfrieren der Medienüberstände für die Il1α- und PGE₂-Bestimmung. Ermittlung des Zellmeta­ bolismus im EZ4U-Test über einen Zeitraum von 2 Stunden. Fixierung der Präparate und Anfertigung von gefärbten Paraffinschnitten für die histologi­ sche Auswertung.

Die mitgeführten Negativkontrollen wurden entspre­ chend mit 3 µl PBS behandelt. Als Referenzsubstanz beziehungsweise Positivkontrolle wurde SDS in un­ terschiedlichen Konzentrationen (0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%) verwendet. Von allen Proben wurden Doppelwerte angesetzt.

Der EZ4U-Test wurde wie folgt durchgeführt: Nach 48-stündiger Inkubation wurde der Zellmetabolismus der einzelnen Hautäquivalente anhand eines Vital­ farbstoffes (Tetrazoliumderivat) photometrisch er­ mittelt. Alle Äquivalente wurden vor der Durchfüh­ rung des EZ4U-Tests dreimal vorsichtig mit 1,5 ml PBS gewaschen. Eine Umsatzkinetik der Negativkon­ trollen, Positivkontrollen und der mit den Proben behandelten Äquivalente wurde bei 450 nm (mit 620 nm als Referenzwellenlänge) über einen Zeitraum von 2 Stunden erstellt. Hierfür wurden, wie bereits be­ schrieben, 750 ml Assay-Medium und 75 µl Farbstoff pro Insert bei 37°C inkubiert. Für SDS wurde sowohl die Ec50 als auch die Et50 bestimmt. Die Ermittlung der Et50 erfolgte nach unterschiedlichen Expositi­ onszeiten von 1% SDS (3 sec, 30 sec, 60 sec, 5 min, 15 min).

Der Gehalt an Il1α und PGE₂ in den Medienüberstän­ den nach 24 Stunden und 48 Stunden Inkubation der Proben wurde anhand kommerziell erhältlicher ELISA Testkits nach Vorschrift bestimmt.

Die Hautäquivalente wurden histologisch untersucht, wobei die Präparate in Bouin's Solution fixiert und in Paraffin eingebettet, histologische Schnitte an­ gefertigt und gefärbt wurden.

Die Ermittlung des Zellmetabolismus von Negativkon­ trolle, Referenz beziehungsweise Positivkontrolle und der Probenäquivalente erfolgte über die Berech­ nung der Absorptionsdifferenz (ΔOD). Die Veränderung der ΔOD durch den Referenzstandard in unterschied­ lichen Konzentrationen und durch 48-stündige Inku­ bation der Proben wurde bezogen auf die unbehandel­ te Kontrolle (Negativkontrolle, 100%) in Prozent umgerechnet.

Aus den ermittelten Werten wurde für SDS eine Do­ sis-Wirkungskurve beziehungsweise eine Zeit- Wirkungskurve erstellt und die Expositionszeit (Et50) beziehungsweise Konzentration (Ec50) ermit­ telt, die eine 50%ige Zellschädigung hervorruft. Da die Proben lediglich unverdünnt und alle über einen Zeitraum von 48 Stunden inkubiert wurden, wurde die jeweils ermittelte ΔOD prozentual zur Kontrolle dargestellt.

Ergebnisse a) Cytotoxizität der Proben

Der Zellmetabolismus der Proben wurde nach 48 Stunden Inkubation photometrisch bestimmt. An­ hand der EZ4U-Umsatzkinetiken wurde die jeweili­ ge Veränderung des Zellmetabolismus ermittelt, prozentual zur unbehandelten Kontrolle berechnet und mit der mitgeführten Referenzsubstanz ver­ glichen. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse dieses Testes dargestellt. Fig. 2 zeigt die Verände­ rungen des Zellmetabolismus von Hautäquivalenten nach 48-stündiger Inkubation von Hautäquivalen­ ten mit unterschiedlichen Konzentrationen der Referenzsubstanz SDS.

Tabelle 1

Prozentuale Veränderung des Zellmetabo­ lismus nach 48 Stunden Inkubation mit den Proben, relativ zur unbehandelten Kontrolle (100%)

b) Cytokinausschüttung am Beispiel von Interleukin 1a (II1a)

Die induzierte Sekretion des Cytokins Il1α wurde nach einmal 24 Stunden und nach einer anschlie­ ßenden weiteren Inkubation für 24 Stunden mit Testsubstanzen in den Medienüberständen der Äqui­ valente durch ELISA quantifiziert. Als Test­ substanzen wurden die Proben sowie unterschied­ liche Konzentrationen von SDS verwendet.

Sekretion von Il1α nach SDS Stimulation

Die Ausschüttung von Il1α steigt im Haut-Modell mit zunehmender SDS-Konzentration kontinuierlich an und erreicht ein Maximum bei 1% SDS von mehr als 100 pg/ml pro Hautäquivalent. Die Werte sind nach der zweiten Inkubation insgesamt noch er­ höht.

Sekretion von Il1α nach Inkubation mit den Pro­ ben

Die Il1α-Ausschüttung durch die Proben war im Haut-Modell nach 24 Stunden Inkubation relativ gering (15-25 pg/ml), nach einer zweiten Inkuba­ tion von 24 Stunden konnten jedoch deutlich er­ höhte Il1α Werte gemessen werden.

In Fig. 3 sind die mit der Referenzsubstanz SDS erhaltenen Ergebnisse gezeigt. Fig. 4 zeigt die mit den getesteten Proben erhaltenen Ergebnisse.

c) Expression des Eicosanoids Prostaglandin E₂ (PGE₂)

Die Synthese des Entzündungsmediators PGE₂ wurde bei dem Haut-Modell nach einmaliger Inkubation für 24 Stunden und nach einer anschließenden zweiten Inkubation für 24 Stunden Inkubation mit Testsubstanzen in den Medienüberständen der Äqui­ valente quantitativ durch ELISA ermittelt. Als Testsubstanzen wurden die Proben 186-355 so­ wie unterschiedliche Konzentrationen von SDS verwendet.

Synthese von PGE₂ nach SDS-Stimulation

Die Synthese von PGE₂ bleibt im Haut-Modell bis zu einer SDS Konzentration von 0,5% nahezu un­ verändert gering und steigt aber bereits nach den ersten 24 Stunden bei einer Konzentration von 1% SDS steil an bis auf mehr als 4000 pg/ml pro Hautäquivalent. Die Werte sind nach der zweiten Inkubation für 24 Stunden praktisch un­ verändert (Fig. 5).

Synthese von PGE₂ nach Inkubation mit den Proben

Im Haut-Modell wurde durch die Proben eine deut­ liche PGE₂-Synthese induziert.

Fig. 5 zeigt den Einfluss der Referenzsubstanz SDS auf die Synthese von PGE₂ in den erfindungs­ gemäßen Hautäquivalenten, während Fig. 6 den Einfluss der getesteten Proben auf die PGE₂- Synthese zeigt.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass das Haut-Modell sehr sensibel und differenziert auf Irritationen reagiert. So ist beispielsweise bei der Il1α-Ausschüttung durch SDS ein konzen­ trationsabhängiger Anstieg zu beobachten. Die un­ tersuchten Proben zeigten ebenfalls eine deut­ lich verstärkte Il1α-Sekretion mit zunehmender Inkubationszeit.

Die Untersuchung der PGE₂-Synthese zeigt, dass beim Haut-Modell durch Irritation eine vermehrte Ausschüttung ausgelöst wird. So steigt die PGE₂- Synthese stark an. Die Werte sind vergleichbar mit der Irritationsschwelle von SDS Ec50 von 0,73%. Deutliche Werte konnten auch nach Inkuba­ tion der Proben gemessen werden.

d) Histologische Veränderungen der Hautäquivalente

Der morphologische Aufbau aller getesteten Äqui­ valente wurde im Anschluss an die EZ4U-Versuche histologisch untersucht und ausgewertet. Die histologischen Schnitte zeigten eine differen­ zierte Schädigung in Abhängigkeit des Irritati­ onsgrades. Die untersuchten Proben haben nach zweimal 24 Stunden Inkubation mit mehrmaligem Auftragen der Probe die Verhornung teilweise aufgeweicht, die proliferativen Zellschichten aufgelockert und mehr oder weniger geschädigt.

Claims (20)

1. Verfahren zur Vermehrung von dermalen Fibro­ blasten, wobei die dermalen Fibroblasten eingebet­ tet in einer dreidimensionalen, gelartigen Biomat­ rix, enthaltend mindestens 3 mg/ml Kollagen in ge­ puffertem, serumhaltigem Zellkulturmedium, kulti­ viert werden.

2. Verfahren zur Überprüfung der Funktion, Morpho­ logie und/oder des Differenzierungsstatus' von der­ malen Fibroblasten, wobei die zu überprüfenden der­ malen Fibroblasten in eine dreidimensionale, gelar­ tige Biomatrix, enthaltend mindestens 3 mg/ml Kol­ lagen in gepuffertem, serumhaltigem Zellkulturmedi­ um, eingebracht, in dieser kultiviert und gleich­ zeitig oder danach überprüft werden.

3. Verfahren zur Herstellung eines in vitro- Dermisäquivalentes, wobei dermale Fibroblasten in eine dreidimensionale, gelartige Biomatrix, enthal­ tend mindestens 3 mg/ml Kollagen in gepuffertem, se­ rumhaltigem Zellkulturmedium, eingebettet und in dieser so kultiviert werden, dass ein in vitro- Dermisäquivalent gewonnen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Kultivie­ rung der dermalen Fibroblasten eine mindestens ein- bis zweitägige Submerskultur umfasst.

5. Verfahren zur Herstellung eines in vitro- Dermisäquivalentes nach Anspruch 3 oder 4, umfas­ send das Isolieren von kollagenhaltigem Gewebe, das Überführen des kollagenhaltigen Gewebes in saure Lösung, das Inkubieren des in die saure Lösung über­ führten Kollagengewebe bei 2 bis 10°C, insbeson­ dere 4°C, das Abzentrifugieren nicht gelöster Kol­ lagenanteile, das Mischen der erhaltenen Kollagen­ lösung bei 2 bis 10°C, vorzugsweise 4°C, mit einer Lösung, enthaltend die dermalen Fibroblasten, Zell­ kulturmedium, Serum und Puffer, und das Gelieren der gemischten Lösung durch Erhöhung der Tempera­ tur.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wo­ bei die dermalen Fibroblasten nach Kultivierung in der dreidimensionalen, gelartigen Biomatrix aus dieser herausgelöst und in höherer Zelldichte wei­ ter kultiviert werden, so dass ein in vitro- Dermisäquivalent gewonnen wird.

7. Verfahren zur Herstellung eines dreidimensiona­ len in vitro-Hautäquivalentes, wobei dermale Fibroblasten in eine dreidimensionale, gelartige Biomatrix, enthaltend mindestens 3 mg/ml Kollagen in gepuffertem, serumhaltigem Zellkulturmedium, eingebettet und in dieser einer mindestens ein- bis zweitägigen Submers-Kultur unterworfen werden und wobei danach Keratinocyten in einem Zellkulturmedi­ um auf der Biomatrix ausgesät und danach weiter kultiviert werden, so dass ein dreidimensionales in vitro-Hautäquivalent gewonnen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kultivie­ rung der Keratinocyten mindestens eine 5- bis 6- tägige Submers-Kultur und mindestens eine 12- bis 14-tägige Airlift-Kultur umfasst.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Ke­ ratinocyten einen hohen Anteil undifferenzierter basaler Stammzellen aufweisen.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wo­ bei vor, während oder nach der Aussaat der Kerati­ nocyten andere Hautzelltypen, wie Melanocyten, Im­ munzellen und/oder Endothelzellen, auf der Biomat­ rix ausgesät und kultiviert werden.

11. Verfahren zur Herstellung eines dreidimensiona­ len in vitro-Hautäquivalentes nach einem der An­ sprüche 7 bis 10, umfassend das Isolieren von kol­ lagenhaltigem Gewebe, das Überführen des kollagen­ haltigen Gewebes in saure Lösung, das Inkubieren des in die saure Lösung überführten Kollagengewebes bei 2 bis 10°C, insbesondere 4°C, das Abzentrifu­ gieren nicht gelöster Kollagenanteile, das Mischen der erhaltenen Kollagenlösung bei 2 bis 10°C, vor­ zugsweise 4°C, mit einer Lösung, enthaltend die dermalen Fibroblasten, Zellkulturmedium, Serum und Puffer, das Gelieren der gemischten Lösung durch Erhöhung der Temperatur, das Inkubieren des gelier­ ten Gemisches bei 37°C und das Aussäen der Kerati­ nocyten und/oder der anderen Hautzelltypen auf das inkubierte, gelierte Gemisch.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die eingebettete dermale Fibroblasten enthal­ tende Biomatrix hergestellt wird, indem aus einem Gewebe isolierte Kollagenfasern in saurer Lösung 3 bis 14 Tage bei 2 bis 10°C, vorzugsweise 4°C, ge­ rührt, nicht gelöste Kollagenanteile abzentrifu­ giert und die erhaltene fertige Kollagenlösung mit einem Kollagengehalt von 3 mg/ml bis 8 mg/ml mit einer Lösung, enthaltend dermale Fibroblasten, Zellkulturmedium, Serum und Puffer, bei 2 bis 10°C, vorzugsweise 4°C, gemischt und anschließend bei hö­ herer Temperatur, vorzugsweise bei Raumtemperatur bis 37°C, geliert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die saure Lö­ sung Essigsäurelösung, insbesondere 0,1%ige Essig­ säurelösung, ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Lösung, enthaltend Zellkulturmedium, Serum und Puf­ fer, im 1 : 2-Verhältnis mit der kollagenhaltigen Lö­ sung gemischt wird.

15. In vitro-Dermisäquivalent, hergestellt nach ei­ nem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6 oder 12 bis 14.

16. Humanes in vitro-Dermisäquivalent gemäß An­ spruch 15, hergestellt unter Verwendung humaner dermaler Fibroblasten.

17. Dreidimensionales in vitro-Hautäquivalent, her­ gestellt nach einem Verfahren gemäß einem der An­ sprüche 7 bis 14.

18. Humanes dreidimensionales in vitro- Hautäquivalent gemäß Anspruch 17, hergestellt unter Verwendung humaner dermaler Fibroblasten und huma­ ner Keratinocyten und gegebenenfalls anderer huma­ ner Hautzelltypen.

19. Verfahren zur Bestimmung der Wirkung einer che­ mischen Substanz oder eines Agens auf Dermiszellen, umfassend das Inkontaktbringen der chemischen Sub­ stanz oder des Agens mit einem in vitro- Dermisäquivalent gemäß Anspruch 15 oder 16 und Be­ stimmung der Wechselwirkung zwischen Dermisäquiva­ lent und der chemischen Substanz oder dem Agens.

20. Verfahren zur Bestimmung der Wirkung einer che­ mischen Substanz oder eines Agens auf Hautzellen, umfassend das Inkontaktbringen der chemischen Sub­ stanz oder des Agens mit einem dreidimensionalen in vitro-Hautäquivalent gemäß Anspruch 17 oder 18 und Bestimmung der Wechselwirkung zwischen Hautäquiva­ lent und der chemischen Substanz oder dem Agens.