ES2252259T3

ES2252259T3 - Modelo de piel tridiminsional.

Info

Publication number: ES2252259T3
Application number: ES01953961T
Authority: ES
Inventors: Michaela Noll; Thomas Graeve
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2001-05-29
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2021-05-29
Also published as: US20090298042A1; US8222031B2; WO2001092477A2; CA2410956A1; US20040018149A1; EP1290145A2; ATE308610T1; DE50107916D1; EP1290145B1; CA2410956C; JP2004505614A; DK1290145T3; WO2001092477A3; US7553664B2; JP4751005B2; AU7634801A

Abstract

Procedimiento para la multiplicación de fibroblastos dermales, donde los fibroblastos dermales se cultivan incorporados en una biomatriz tridimensional semejante a un gel, que contiene de 3, 5 hasta 4, 5 mg/ml de colágeno en medio de cultivo celular tamponado que contiene suero, donde la solución de colágeno empleada para la preparación de la biomatriz contiene una proporción de 90% de colágeno nativo no desnaturalizado.

Description

Modelo de piel tridimensional.

La invención se refiere a un equivalente de la piel in vitro, típico de la piel, tridimensional, preferentemente humana, consistente en un equivalente de la dermis y un equivalente de la epidermis, y a procedimientos para la preparación, cultivo y aplicación de este equivalente de la piel así como de sus componentes.

Los modelos integrales de piel, típicos de la piel, que también pueden designarse como equivalentes de la piel in vitro, se pueden emplear especialmente en dermatología y en alergología como piel para ensayos con el fin de investigar sustancias, por ejemplo potenciales medicamentos o cosméticos, o agentes tales como la luz y el calor, en cuanto a sus efectos farmacológicos, en particular a sus efectos irritantes, toxicidad e inflamación así como a su compatibilidad. Un sistema de esta clase puede aplicarse además en numerosos y diversos estudios de carácter inmunológico, histológico y de biología molecular. Esto incluye, por ejemplo, estudios relativos a la curación de heridas y a la penetración y resorción de substancias. Las investigaciones o ensayos de substancias en estos modelos integrales de piel ofrecen considerables ventajas frente a los ensayos en animales y ensayos con probandos humanos, ya que los resultados obtenidos de este modo son más reproducibles y las investigaciones se pueden realizar con un menor coste y más rápidamente.

Para el ensayo de materias primas y productos, en los últimos años se vienen utilizando principalmente cultivos de células humanas como sistemas in vitro. Un perfeccionamiento de la técnica de cultivo de células lo representan las estructuras de células humanas tridimensionales, semejantes a los órganos y los sistemas de cocultivo. Los resultados obtenidos de este modo se pueden aplicar mejor a las personas que los resultados obtenidos mediante cultivos de células individuales. Con los desarrollos de Rheinwald y Green (Rheinwald, J.G. et al., "Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The formation of keratinizing colonies from single cells", Cell, 6 (1975), 331-344; Green, H. et al., "Growth of cultured human epidermal cells into múltiple epithelia suitable for grafting", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76 (1979), 5665-5668) se ha iniciado el cultivo de queratinocitos humanos y su aplicación en la medicina de quemaduras y de la dermatología in vitro. Hasta ahora se han preparado in vitro diversos modelos de piel reconstruida.

La patente EP 0 197 909 B1 describe un procedimiento para la formación de un equivalente de la piel, donde mezclando una solución ácida de colágeno con células contráctiles, por ejemplo fibroblastos, se prepara una retícula de colágeno hidratizada. Después de neutralizar el valor pH se precipitan fibrilos de colágeno en la retícula de colágeno. Las células contráctiles se depositan en la retícula de colágeno y provocan su contracción, con lo cual se forma un equivalente de la dermis. Introduciendo en la retícula de colágeno biopsias troqueladas de piel pueden crecer, sobre la superficie del equivalente de la dermis, queratinocitos procedentes de las biopsias troqueladas, con lo cual se forma un equivalente de la piel.

En la patente EP 0 285 474 B1 se describe un equivalente de la piel, que comprende un equivalente de la dermis obtenido a partir de colágeno y fibroblastos y un equivalente de la epidermis de capas múltiples. Para ello se inocula el equivalente de la dermis con un explantado humano o animal, por ejemplo un folículo capilar, para obtener el equivalente de la epidermis.

La patente EP 0 020 753 B1 describe un procedimiento para la formación de tejidos, en particular de tegumentos cutáneos, donde también se introducen fibroblastos en una retícula de colágeno hidratizada, y donde después de la contracción de la retícula de colágeno se forma un tejido. Sobre este tejido se pueden aplicar previamente queratinocitos cultivados in vitro o queratinocitos aislados de un tejido epitelial anterior, formándose así un sustitutivo de la piel.

Por la patente EP 0 418 035 B1 se conoce un equivalente de tejido que comprende una retícula de colágeno hidratizada que se contrae mediante un agente contráctil tal como fibroblastos, y un gel de colágeno que está en contacto con un elemento permeable. Para ello se aplica la mezcla de colágeno y del agente contráctil sobre el gel de colágeno, donde debido al contacto entre el gel de colágeno y un elemento permeable, por ejemplo una membrana de policarbonato, se impide la contracción radial o lateral de la retícula de colágeno, de manera que la retícula solamente se contrae con respecto a su espesor. Una vez formado el equivalente de la dermis se pueden sembrar queratinocitos con lo cual se forma un equivalente de la piel.

La patente US Nº 5.861.153 describe además un equivalente de la piel que se compone de un equivalente de la epidermis sobre un soporte, donde el equivalente de la epidermis comprende queratinocitos y precursores de células de Langerhans, inducidas o no inducidas. El soporte puede ser una retícula de colágeno que contenga fibroblastos, o trozos de dermis exentos de epidermis, membranas artificiales, un sustitutivo subcutáneo a base de colágeno o materiales sintéticos.

La patente US Nº 4.963.489 describe un tejido de estroma preparado in vitro, donde las células de estroma, por ejemplo fibroblastos, envuelven una estructura base que consiste en un material biológicamente compatible, por ejemplo celulosa. El sistema descrito se puede emplear entre otras cosas para la preparación de un sistema tridimensional de cultivo cutáneo, donde se esparcen queratinocitos y melanocitos sobre el equivalente de la dermis, es decir sobre la matriz portante de estroma tridimensional.

La patente US nº 5.755.814 describe un sistema de modelo cutáneo que se puede emplear tanto en sistemas de ensayo in vitro, como también para fines terapéuticos. El sistema comprende una matriz reticulada tridimensional de colágeno insoluble que contiene fibroblastos y capas estratificadas de células de epidermis diferenciadas, donde una capa de células de epidermis está en contacto directo con la superficie de la matriz de colágeno. La reticulación de la matriz puede efectuarse tanto mediante un tratamiento térmico con extracción de agua como también con productos químicos, por ejemplo carbodiimida.

En la patente US Nº 5.882.248 se describe un procedimiento para la determinación del efecto de las substancias o agentes químicos sobre un sistema de modelo cutáneo humano conforme a la patente US Nº 5.755.814. La interacción entre el sistema de modelo cutáneo y las substancias que se trata de ensayar se determina mediante la liberación de substancias por las células del sistema de modelo cutáneo así como por los efectos sobre el metabolismo, la proliferación, diferenciación y reorganización de estas células.

En la patente WO 95/10600 se describe además un procedimiento mediante el cual se puede obtener un equivalente de la epidermis. Este equivalente de la epidermis se puede emplear para ensayos farmacéuticos y/o cosméticos para bronceado de la piel.

En los modelos cutáneos conocidos, el inconveniente es que éstos, en su mayor parte consisten solamente de una o varias capas epidermales a base de queratinocitos. En aquellos casos en los que se obtiene una epidermis estratificada se emplean explantados de tejido que entrañan un peligro de contaminación con estimulantes, lo que puede dar lugar a falsear resultados si después se emplea el equivalente de la piel como piel para ensayo. En la medida en que los modelos cutáneos descritos contienen una parte dermal, ésta se compone con frecuencia de un material esponjoso de reticulación transversal, que además del colágeno puede contener también otros materiales no típicos de la piel. En la medida en que en los equivalentes de la piel descritos en el estado de la técnica la parte dermal se compone únicamente de colágeno y fibroblastos, ésta está sujeta a un proceso de contracción indefinido, que debe achacarse a una fuerte contracción del gel de colágeno y a una salida de líquido de la misma. Esto da lugar a que los equivalentes de la piel descritos en el estado de la técnica solamente sean adecuados en medida limitada como piel de ensayo de una magnitud definida, y que los resultados obtenidos con ella solamente se puedan aplicar de forma condicional a piel humana nativa.

El problema técnico que constituye la base de la presente invención es por lo tanto el de preparar un modelo cutáneo integral in vitro, humano, tridimensional, que se corresponda en gran medida con piel humana nativa, así como los procedimientos y medios para su preparación, que tenga no sólo una capa de epidermis sino también una capa de dermis que no esté sujeta a un proceso de contracción indefinido y que se pueda utilizar como piel de ensayo de una magnitud definida, por ejemplo para la investigación de efectos farmacológicos y cosmé-
ticos.

La invención resuelve el problema que constituye su base ofreciendo un procedimiento que permite diferenciar y/o multiplicar fibroblastos dermales aislados, de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14, donde los fibroblastos se cultivan y se pueden multiplicar en una biomatriz tridimensional a modo de gel que contiene de 3,5 a 4,5 mg/ml de colágeno en un medio de cultivo celular tamponado que contiene suero, donde la solución de colágeno empleado para la preparación de la biomatriz contiene una proporción de \geq 90% de colágeno nativo, no desnaturalizado. Esta biomatriz contiene, además de los fibroblastos que se trata de cultivar, una estructura constituida por una solución de colágeno a base de colágeno humano o animal, es decir proteína matricial típica del tejido. Este gel de fibroblastos y colágeno se somete, de acuerdo con la invención, preferentemente a un cultivo submerso de uno a dos días. Sobre la matriz que contiene los fibroblastos se esparcen a continuación células madre de queratinocitos. En una forma de realización especialmente preferida se emplean preferentemente queratinocitos con una proporción relativamente alta, por ejemplo del 0,5%, 1%, 2%, 5%, 8% ó 10% de la población de células de queratinocitos, o globalmente sólo células madre no diferenciadas. Aplicando unas condiciones de cultivo específicas, que comprenden en particular un cultivo submerso de varios días, seguido de un cultivo Airlift de varios días del sistema de la biomatriz, así como unos medios de cultivo específicos, los queratinocitos sufren una diferenciación hasta una capa de epidermis multicapa. De acuerdo con la invención está previsto además, en una realización preferida, que antes, durante o después de esparcer los queratinocitos se puedan esparcer sobre la biomatriz también otros tipos de células y/o otras células de otros tipos de tejidos, por ejemplo células de un sistema inmune.

Mediante los procedimientos objeto de la invención se obtiene por lo tanto un modelo cutáneo in vitro organoide, que está constituido por dos capas típicas de tejido, concretamente un equivalente de la dermis y un equivalente de la epidermis. El modelo cutáneo organotípico se corresponde ampliamente con la piel nativa, tanto bajo el aspecto histológico como también funcional.

Mediante un procedimiento especial para la extracción de colágeno y mediante la composición de la suspensión de colágeno empleado para la formación de la biomatriz se consigue que el equivalente de la dermis no quede sometido a un proceso de contracción indefinido en el transcurso del tiempo que dure el cultivo. Debido al procedimiento de cultivo empleado y al empleo de insertos de cultivo celular con un recubrimiento superficial especial se consigue que la parte dermal se someta únicamente a una contracción definida en dirección vertical, mientras que se impide la contracción en dirección horizontal. De este modo se obtienen equivalentes de la piel con un diámetro definido, una superficie unitaria y una terminación definida hacia el borde del inserto de cultivo. Gracias a las dimensiones uniformes y al acabado uniforme del modelo integral cutáneo empleado como superficie de ensayo se consigue que al ensayar substancias, en cuanto a sus efectos farmacológicos y/o cosméticos, se incremente la calidad de los resultados y los resultados de ensayo resulten más reproducibles.

Una forma de realización especialmente preferida de la invención comprende el cultivo de fibroblastos dermales en una biomatriz tridimensional a modo de gel formada conforme a las reivindicaciones 1 a 14 para la multiplicación de los fibroblastos o para la preparación de un equivalente de la dermis y/o de un equivalente de la piel.

En relación con la presente invención, el concepto de "cultivo de células" significa mantener las funciones vitales de las células, preferentemente in vitro, por ejemplo de fibroblastos, en un entorno adecuado, por ejemplo con adición o eliminación de eductos y productos metabólicos, en particular también una multiplicación de las células.

En relación con la presente invención se entiende por fibroblastos dermales los fibroblastos que aparecen naturalmente, especialmente en la dermis o los fibroblastos alterados mediante técnica genética, o sus precursores. Los fibroblastos representan los precursores de los fibroblastos dermales, es decir células fusiformes del tejido conjuntivo cutáneo con núcleo ovalado y prolongaciones largas. Los fibroblastos pueden ser de procedencia animal o
humana.

La biomatriz prevista para el cultivo de los fibroblastos contiene por lo tanto los fibroblastos que se trata de cultivar así como una estructura de colágeno recién constituida a partir de una solución de colágeno, preferentemente fresca, de origen humano o animal, con una concentración mínima de 3 mg de colágeno por ml de biomatriz, según la invención de 3,5 a 4,5 mg de colágeno por ml de biomatriz. La estructura de colágeno se obtiene a partir de una solución ácida de colágeno I, preferentemente exenta de células, siendo la concentración de proteínas de la solución de colágeno preferentemente de 5 a 7 mg/ml. El valor pH de la solución de colágeno es de 0,1 a 6,9, preferentemente de 2,0 a 5,0, más preferentemente de 3,0 a 4,5 y en particular de 3,2 a 4,2, y de forma especialmente preferentemente de 3,8. Para la preparación de la biomatriz conforme a la invención que contiene los fibroblastos se combina y mezcla bien a 2ºC a 10ºC preferentemente a 4ºC, con una solución que contiene un medio de cultivo celular, preferentemente cinco veces concentrado, preferentemente un medio de cultivo celular M199 cinco veces concentrado, un tampón, preferentemente tampón Hepes, suero, preferentemente suero de ternera fetal (FCS) y sulfato de condroitina - (4/6) -, y preferentemente 1,5 x 10^{5}/ml de fibroblastos, en particular fibroblastos precultivados. Esta mezcla se vierte en los pocillos de una placa de microcultivo con 24 pocillos, donde cada pocillo presenta un diámetro de 10 mm, y mediante el aumento de la temperatura hasta por ejemplo la temperatura ambiente de 37ºC se produce una gelificación. Después de gelificar los geles de colágeno y fibroblastos, se añade a los geles fibronectina, preferentemente fibronectina humana. Las fibronectinas son proteínas estructurales o de adhesión producidas en los fibroblastos, cuya función in vivo consiste en el enlace con otras macromoléculas, por ejemplo colágeno, y en la adherencia de las células a las células contiguas. Mediante la adición de las fibronectinas a la matriz de colágeno y fibroblastos se favorece por lo tanto el enlace de los fibroblastos, tanto con el colágeno como entre sí. El subsiguiente cultivo de los fibroblastos en el gel de colágeno se realiza preferentemente en cultivo submerso. En relación con la presente invención se entiende por una "cultivación submersa" o un "cultivo submerso" un procedimiento para el cultivo de células donde las células quedan cubiertas con una solución nutriente. La matriz que contiene los fibroblastos se recubre por lo tanto con el medio de cultivo celular y se incuba a 37ºC.

En una forma de realización ventajosa de la invención, los fibroblastos cultivados en la biomatriz se pueden volver a desprender de la biomatriz, introduciéndolos eventualmente de nuevo en una biomatriz, donde las células no pierden su estatus de diferenciación ni sus rendimientos metabólicos específicos después del desprendimiento. El procedimiento conforme a la invención permite por lo tanto llevar a cabo un cultivo intermedio de los fibroblastos en la biomatriz. Partiendo de un número reducido de fibroblastos, el procedimiento objeto de la invención ofrece por lo tanto la ventaja de que se puede disponer de suficiente material celular para la preparación de equivalentes de la dermis y/o de equivalentes de la piel.

En otra realización ventajosa de la invención se ha previsto introducir, cultivar y verificar entonces y/o después fibroblastos dermales, que se deben verificar en cuanto a su función, su morfología y/o su estatus de diferenciación, en la biomatriz tridimensional antes mencionada. Por lo tanto, la invención se refiere también a procedimientos de clasificación y diagnóstico realizados empleando fibroblastos dermales, donde los fibroblastos se pueden cultivar de acuerdo con el procedimiento antes descrito y al mismo tiempo y/o a continuación se pueden investigar, por ejemplo en cuanto a sus parámetros farmacológicos, toxicológicos, morfológicos y/o de biología molecular.

En otra forma de realización ventajosa de la invención, los fibroblastos dermales se cultivan en la biomatriz tridimensional, en la forma antes descrita, de tal manera que a continuación se pueda obtener un equivalente de la dermis. En relación con la presente invención se entiende por "equivalente de la dermis" una capa semejante a un tejido conjuntivo, a base de colágeno y fibroblastos, que se corresponde en gran medida con la dermis nativa.

El equivalente de la dermis obtenido de esta manera se puede emplear para procedimientos de clasificación y diagnóstico, en particular para investigar los efectos de sustancias químicas, por ejemplo de medicamentos potenciales o componentes de cosméticos u otros agentes. En relación con la presente invención se entiende bajo el concepto de "agente" o "agentes", en particular los medios físicos que actúen sobre la piel o sobre las células de la piel, tales como la luz, el calor o similares. La invención se refiere también a procedimientos de clasificación y diagnóstico con empleo de los equivalentes de dermis preparados conforme a la invención.

Una realización preferida de la invención comprende el tratamiento del equivalente de la dermis en presencia y en ausencia de la sustancia que se trata de investigar y/o de la fuente que se trata de investigar, y la comparación de los efectos observados sobre las células o componentes celulares del equivalente de la dermis.

Otra realización preferida de la invención comprende un procedimiento para investigar la penetración de sustancias, con empleo del equivalente de la dermis preparado conforme a la invención y utilizando un equivalente de la piel conforme a la invención, compuesto por un equivalente de la dermis y un equivalente de la epidermis.

Una forma de realización especialmente preferida de la invención se refiere también a un procedimiento antes citado destinado al cultivo de fibroblastos dermales en una biomatriz para la preparación de un equivalente de la piel compuesto por un equivalente de la dermis y un equivalente de la epidermis. Para ello se esparcen sobre el gel queratinocitos durante 1 a 3 días, preferentemente 2 días, después de la preparación e incubación antes descrita de los geles de fibroblastos y colágeno.

En relación con la presente invención se entiende por "queratinocitos" células de epidermis que forman un epitelio de placas queratinizadas o queratinocitos alterados mediante técnica genética, o sus precursores, que pueden ser de procedencia animal o humana. Dado que la formación de una epidermis bien diferenciada con queratinización intacta depende en gran medida de la proporción de células madre basales en los queratinocitos empleados, en el caso de los queratinocitos esparcidos sobre el gel de colágeno, se trata preferentemente de células madre de queratinocitos, a ser posible no diferenciadas, procedentes de tejidos de biopsias humanas, es decir de células madre basales de citoqueratina 19 ó integrina \beta1-positivas. Se trata preferentemente de células precultivadas, muy preferentemente de queratinocitos en el primer o segundo paso celular. La siembra de queratinocitos sobre la biomatriz se efectúa preferentemente en un medio de cultivo celular, muy preferentemente en un medio KBM (Clonetics), que contiene un 5% de suero de ternera fetal. A continuación se recubre la biomatriz con el medio KBM, que contiene factor de crecimiento epidermal humano (hEGF) (0,1 \mug/500 ml de medio), BPE (15 mg/500 ml de medio) y 0,8 mM CaCl_{2}, y se somete a un cultivo submerso de preferentemente 1 a 3 días de duración. Se consigue una diferenciación completa de las capas de queratinocitos mediante un cultivo Airlift con medio KBM que contiene 1,8 mM de CaCl_{2} sin hEGF y BPE. En relación con la presente invención se entiende por un cultivo "Airlift" un cultivo en el que la altura del nivel del medio nutriente está ajustada exactamente a la altura de la biomatriz, mientras que los queratinocitos o las capas de células formadas por los queratinocitos están por encima del nivel del medio nutriente y no quedan recubiertas por el medio nutriente, es decir que el cultivo tiene lugar en la capa límite entre el aire y el medio nutriente, efectuándose el abastecimiento de los cultivos desde abajo. Para ello se transfieren los insertos de la placa de microtitrado con 24 pocillos a los pocillos de una placa de microtitrado con 6 pocillos, cada uno con un diámetro de 3,5 cm. Después de un cultivo Airlift, preferentemente de 12 a 14 días, se desarrolla un modelo integral de piel in vitro, típico de la piel, compuesto de equivalente de la dermis y equivalente de la epidermis.

El procedimiento objeto de la invención para la preparación de un modelo integral de piel in vitro se puede modificar ventajosamente de manera que antes, durante o después de la siembra de queratinocitos se extienden sobre la biomatriz otros tipos de células cutáneas tales como melanocitos, células inmunes y/o células de endotelios, y se puedan seguir cultivando.

La invención se refiere por ejemplo también a un modelo integral de piel in vitro, típico de la piel, en particular un modelo integral de piel in vitro humana, que haya sido preparado de acuerdo con el procedimiento objeto de la invención y eventualmente un procedimiento de cultivo previo y/o posterior de tipo convencional, y que comprende por lo menos 2 a 4 capas de células proliferativas, algunas diferenciantes y por lo menos 4 a 5 queratinizadas, donde el equivalente de la epidermis comprende Stratum basale, Stratum spinosum, Stratum granulosum y Stratum corneum, y donde entre el equivalente de la dermis y el equivalente de la epidermis está contenida una membrana basal con capacidad de funcionamiento a base de proteínas matriciales, y donde además se exprimen proteínas típicas de la piel tales como fillgrin, Ki-67 y citoqueratina 10.

Debido a la complejidad del modelo cutáneo preparado, éste se puede aplicar de forma controlada en diversos planteamientos de la industria químico-farmacéutica y de la industria cosmética. El equivalente de la dermis preparado conforme a la invención resulta especialmente adecuado para el ensayo de productos, por ejemplo con vistas a determinar su eficacia, efectos secundarios indeseables, por ejemplo efectos de irritación, toxicidad e inflamación o efectos que provoquen alergias, o la compatibilidad de substancias. En estos casos se puede tratar de substancias que vayan a tener una aplicación potencial como medicamentos, en particular como productos dérmicos o substancias que sean componentes de cosméticos. El equivalente de la dermis preparado conforme a la invención se puede emplear, por ejemplo, también en estudios de resorción, para el transporte y/o la penetración de substancias. Asimismo también es adecuado para la investigación de otros agentes tales como la luz o el calor, por ejemplo, para investigar la fototoxicidad, es decir el efecto nocivo de la luz de diferentes longitudes de onda sobre las estructuras celulares. El equivalente de la piel preparado de acuerdo con la invención se puede emplear obviamente también para investigar la curación de heridas.

Los efectos de las substancias o agentes sobre la piel humana se pueden determinar por ejemplo mediante la liberación de substancias, por ejemplo citoquinas o mediadores, mediante células del sistema de modelo de piel humana, así como por los efectos sobre la expresión genética, el metabolismo, la proliferación, diferenciación y reorganización de estas células. Utilizando procedimientos para la cuantificación del daño de las células, en particular empleando un colorante vital tal como un derivado de tetrazolium, se pueden demostrar por ejemplo los efectos citotóxicos sobre las células cutáneas. Los ensayos de substancias o agentes en el equivalente de la piel humana objeto de la invención pueden comprender no sólo procedimientos histológicos sino también procedimientos inmunológicos y/o de biología molecular.

Una forma de realización preferida de la invención comprende un procedimiento para la investigación del efecto, en particular de los efectos farmacológicos de substancias o agentes sobre la piel humana, utilizando el equivalente de la piel humana preparado de acuerdo con la invención. En una forma de realización especialmente preferida se lleva a cabo para ello un ensayo EZ4U. EZ4U es una sal de tetrazolium amarilla soluble en agua, no tóxica, que por las células vivas se puede reducir para dar lugar a formazanos de coloración intensa. La reducción exige mitocondrios intactos, y por lo tanto se puede emplear el ensayo para demostrar la vitalidad de las células.

Otra forma de realización preferida de la invención comprende un procedimiento para investigar la penetración de substancias, para lo cual se trata con las substancias que se desea investigar no sólo un equivalente de la dermis preparado conforme a la invención sino también un equivalente de la piel preparado de acuerdo con la invención, y se comparan entre sí los resultados obtenidos en los dos sistemas.

En una forma de realización especialmente preferida de la invención se investigan los efectos de las substancias químicas u otros agentes sobre tipos de piel especiales. Para ello se emplean células de tipos de piel definidos, por ejemplo tipos de piel escasos en pigmentos y/o tipos de piel con muchos pigmentos, para establecer equivalentes de la piel conforme a la invención, y éstos se ensayan para determinar el efecto de las substancias o agentes.

En otra forma de realización especialmente preferida de la invención se emplea el equivalente de la dermis preparado conforme a la invención como sistema modelo para investigaciones de enfermedades de la piel y para desarrollar nuevas posibilidades de tratamiento para dolencias de la piel. Por ejemplo, se pueden utilizar líneas de células de pacientes que tengan una determinada enfermedad de la piel, para establecer a partir de ahí sistemas de modelos de piel específicos de los pacientes, e investigar y evaluar en ellos la eficacia de determinadas terapias y/o medicamentos.

La invención se refiere también a una biomatriz, preferentemente en forma de gel, en la que se pueden llevar a cabo los procedimientos de cultivo antes citados, y concretamente una biomatriz con fibroblastos dermales. La combinación prevista conforme a la invención a base de biomatriz y los fibroblastos dermales cultivados en ella se puede utilizar, tal como se ha descrito anteriormente, para la preparación de un equivalente de la dermis y/o de un modelo de piel integral organoide.

Se entiende por biomatriz una estructura de gel que contiene colágeno, un medio de cultivo celular, suero y un tampón, por ejemplo tampón Hepes. La solución de colágeno que se emplea para la preparación de la biomatriz es una solución que contiene una alta proporción de colágeno nativo, no desnaturalizado, en medio acuoso ácido, preferentemente con un valor pH de 3,8, por ejemplo en ácido acético, preferentemente una solución de ácido acético al 0,1%. Una proporción alta de colágeno no desnaturalizado significa una proporción en colágeno total en solución de \geq 50%, en particular \geq 60%, \geq 70%, \geq 80%, de acuerdo con la invención \geq 90% o \geq 95%, preferente-
mente \geq 99%. En una forma de realización preferida no se emplea para ello colágeno liofilizado. El contenido de colágeno en la solución representa ventajosamente de 3 mg de colágeno por ml de solución, hasta 8 mg de colágeno por ml de solución, preferentemente 5 mg de colágeno por ml de solución hasta 7 mg de colágeno por ml de solución, y más preferentemente 6 mg de colágeno por ml de solución. Para ello se emplea preferentemente colágeno que haya sido incubado, después de su aislamiento, por ejemplo a partir de rabos de rata, durante 3 a 14 días a 4ºC en ácido acético al 0,1%, agitando, y donde las partes de colágeno no disueltas se separaron por centrifugación. Los medios de cultivo preferidos son DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) y M199. Sin embargo, se puede utilizar también cualquier otro medio de cultivo celular que se desee, que permita el cultivo de fibroblastos. Como suero se emplea preferentemente suero de ternera fetal (FCS) y como tampón, por ejemplo, tampón Hepes. El valor pH de la solución a base del medio de cultivo celular, del tampón y del suero representa en la realización preferida de 7,5 a 8,5, por ejemplo de 7,6 a 8,2, en particular 7,8. La biomatriz naturalmente puede contener también otros factores, por ejemplo factores de crecimiento, medios de adherencias, antibióticos, medios de selección y similares.

Por lo tanto, la invención se refiere también a procedimientos para la preparación de una biomatriz que contenga fibroblastos dermales, donde en una primera fase se prepara colágeno fresco de origen humano o animal, por ejemplo rabos de ratas, para lo cual las fibras de colágeno aisladas de un tejido que contenga colágeno se recogen, se desinfectan superficialmente en alcohol y a continuación se lavan en una solución tampón y después se pasan a una solución ácida con un valor pH de 0,1 a 6,9, preferentemente de 2,0 a 5,0, más preferentemente de 3,0 a 4,0, en particular 3,3, por ejemplo una solución de ácido acético al 0,1%. A continuación, el colágeno que se encuentra en la solución se agita en otra fase durante unos días, por ejemplo 3 a 14 días, a 2 hasta 10ºC, en particular a 4ºC, se separan por centrifugación las partes de colágeno que no estén disueltas y se conserva la solución de colágeno con un contenido de colágeno de 3 mg/ml a 8 mg/ml, a 2 hasta 10ºC, por ejemplo a 4ºC. Naturalmente existe la posibilidad de proceder a un almacenamiento intermedio de la solución en estado congelado, por ejemplo a -10ºC hasta -80ºC, en particular a -20ºC. Para la preparación de la biomatriz que contenga fibroblastos conforme a la invención se mezcla la solución, a base de preferentemente un medio de cultivo celular, suero y tampón, con fibroblastos precultivados y separados por centrifugación, empleando preferentemente 1 x 10^{5} a 2 x 10^{5} células por ml, preferentemente 1,5 x 10^{5} células por ml. Esta solución o suspensión, con un valor pH de 7,5 a 8,5, preferentemente 7,6 a 8,2, especialmente 7,8, se mezcla a continuación, muy preferentemente en la proporción 1:2, con la solución de colágeno antes citada, a 2 hasta 10ºC, en particular a 4ºC. A continuación se pipetea la solución del gel en recipientes de cultivo, y después de gelificar a 37ºC se recubre con el medio. Después se cultiva la biomatriz durante un mínimo de dos días y a continuación se pueden esparcir sobre ella queratinocitos.

Otras realizaciones ventajosas de la invención se deducen de la descripción.

La invención se describe a continuación con mayor detalle sirviéndose de las siguientes figuras y ejemplos.

La figura 1 muestra una sección longitudinal de piel humana nativa y una sección longitudinal de un equivalente de piel humana preparado conforme a la invención.

La figura 2 representa un diagrama de columnas que muestra la modificación porcentual del metabolismo celular de los equivalentes de piel, que se incubaron en el ensayo EZ4U durante 48 horas con las sustancias que se trataba de ensayar.

La figura 3 representa en forma gráfica la modificación del contenido de interleucina 1\alpha en los sobrantes de medios de los equivalentes de la piel que habían sido incubados durante 24 horas (24 h - 1) y 48 horas (24 h - 2) con diferentes concentraciones de SDS.

La figura 4 muestra la modificación del contenido de interleucina 1 \alpha en los sobrantes de medios de los equivalentes de la piel que habían sido incubados durante 24 horas (24 h - 1) y 48 horas (24 h - 2) con las sustancias que se trataba de ensayar.

La figura 5 muestra la modificación del contenido de PGE_{2} en los sobrantes de medios de los equivalentes de la piel que habían sido incubados durante 24 horas (24 h - 1) y 48 horas (24 h - 2) con diferentes concentraciones de SDS.

La figura 6 muestra en forma gráfica la modificación del contenido de PGE_{2} en los sobrantes de medios de equivalentes de la piel que habían sido incubados durante 24 horas (24 h - 1) 6 48 horas (24 h - 2) con las substancias que se trataba de ensayar.

Ejemplo 1 Preparación de un equivalente de la piel humana tridimensional Preparación de una solución de gel

20 partes de medio de cultivo celular M 199 (Life Technologies), concentrado cinco veces, 10 partes de tampón Hepes (4,76 g en 100 ml de solución PBS, valor pH 7,3), y 1 parte de sulfato de condroitina- (4,6) (5 mg/ml en PBS) se mezclan y se ajusta el valor pH de la mezcla a 7,8. La mezcla se filtra estéril y a continuación se mezcla con 10 partes de suero de ternera fetal.

Preparación de una solución de colágeno

Para la preparación de una solución de colágeno se emplea un tejido que contenga colágeno, como por ejemplo tendones de rabos de rata. Todos los trabajos se realizan en condiciones estériles empleando materiales estériles. Los rabos de rata se someten a una desinfección superficial después de su almacenamiento a -20ºC empleando alcohol de 70%. Se quita la piel de los rabos de rata y se extraen las distintas fibras de colágeno. Si se emplean otros tejidos de partida eventualmente se pueden eliminar de forma cuidadosa las células existentes mediante tratamiento mecánico, enzimático o químico. Las fibras de colágeno se reúnen en una solución de sal de cocina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,2), se desinfectan superficialmente durante 10 minutos en alcohol de 70%, y a continuación se lavan a fondo con PBS. Se determina el peso de las fibras y se pasan las fibras a una solución de ácido acético al 0,1% (concentración final aproximadamente 8 a 12 mg/ml). Esta preparación se agita durante unos 3 a 14 días a 4ºC, y a continuación se eliminan las partes de colágeno que no se hayan disuelto mediante centrifugación (1000 rpm, 1 h, 8ºC). De este modo, el colágeno está presente en solución y no en forma de fibras, estructura o matriz.

Preparación de los geles de colágeno que contienen fibroblastos dermales (preparación para 24 insertos)

16 ml de solución de colágeno se vierten en una probeta de centrifugadora de 50 ml, y se colocan sobre hielo. Los fibroblastos dermales precultivados se cosechan y recuentan. 1,2 x 10^{6} fibroblastos se recogen en 8 ml de solución de gel a la temperatura del hielo, se suspenden bien y se echan en la solución de colágeno exentos de burbujas de aire. Se mezclan bien la solución de colágeno, la solución de gel y los fibroblastos. Cada 600 \mul de la mezcla se vierten cuidadosamente en los pocillos de una placa de microtitrado con 24 pocillos (diámetro de cada pocillo 10 mm). Mediante la incubación durante 2 minutos a 37ºC se produce la gelificación de la mezcla. Una vez que la mezcla ha gelificado se vierten sobre cada inserto, respectivamente, 50 \mul de fibronectina (5 \mug/ml). Después de una incubación de 10 minutos a 37ºC o una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente se añade en cada pocillo 1 ml de medio M199, con lo cual los insertos quedan recubiertos por el medio. Los fibroblastos contenidos en el gel se someten durante aproximadamente 1 a 2 días a este cultivo submerso a 37ºC, substituyendo al cabo de 12 horas el medio por medio fresco.

Siembra de los queratinocitos y cultivo de equivalentes de la dermis

Antes de la siembra de los queratinocitos se aspira primero cuidadosamente el medio en los pocillos de la placa de microtitrato y de los geles. A continuación se vierten en cada pocillo 500 \mul de medio KBM (Clonetics) que contiene un 5% de FCS. Los geles se recubren respectivamente con 50 \mul de solución de fibronectina y se incuban durante 1 hora a 37ºC. A continuación se esparcen por cada gel 100.000 queratinocitos en 50-100 \mul de medio KBM, que contiene un 5% de FCS, y se incuban durante 1 a 2 horas a 37ºC. A continuación se añaden 500 \mul de medio KBM, que contiene un 5% de FCS, 8 mM de CaCl_{2} hEGF (0,1 \mug/500 de medio) y BPE (15 mg/500 ml de medio), y se someten los geles durante 1 a 3 días a un cultivo submerso, substituyendo el medio diariamente por medio fresco. A continuación se someten los geles durante otros 2 a 3 días a un cultivo submerso en respectivamente 1 a 1,5 ml de medio KBM, que contiene un 2% de FCS, 8 ml de CaCl_{2}, hEGF y BPE. Después se someten los geles a un cultivo Airlift con el equivalente de la piel que se va desarrollando. Para ello se pasan los geles a una placa con 6 pocillos y por cada pocillo se añaden 1,5 a 2 ml de medio KBM con un contenido de CaCl_{2} de 1,88 mM sin hEGF y BPE, ajustando el nivel del medio exactamente a la altura del gel, mientras que los queratinocitos o las capas formadas por los queratinocitos no se recubren por el medio. El cultivo Airlift se prosigue como mínimo durante 12 a 14 días. La figura 1 muestra a título comparativo piel humana nativa y equivalente de la piel humana conforme a la invención.

Ejemplo 2 Ensayo de substancias químicas en un equivalente de la piel humana tridimensional

Se emplearon substancias de prueba para el ensayo en el equivalente de la piel humana. Se trataba de comprobar un posible efecto irritativo de las muestras sobre el modelo de dermis integral después de 48 horas de incubación, por medio del metabolismo EZ4U. Se debería determinar la secreción de Il1\alpha y PGE_{2} en los sobrantes de medios después de 24 horas y después de 48 horas mediante ELISA. Como sustancia de referencia se acompañaron diferentes concentraciones de SDS. Finalmente se fijaron todos los equivalentes de la piel ensayados y se comprobó y evaluó la estructura morfológica mediante capas de parafina teñidas.

En el SDS empleado como sustancia de referencia se determinaron el tiempo de exposición (Et50) de SDS al 1% y las concentraciones de Ec50 al cabo de 24 horas o 48 horas, respectivamente, de tiempo de incubación.

Los equivalentes de la piel se prepararon cada uno en una placa de 6 pocillos con 1 ml de medio (KGM sin hEGF sin BPE, y con 1,8 mM de CaCl_{2}). La incubación de las muestras en la superficie de los correspondientes modelos de dermis se efectuó de acuerdo con el esquema siguiente:

Día 1: Aplicación de 34 \mul de sustancia por la mañana y por la tarde.

Día 2: Cambio del medio y congelación de los sobrantes de medio para la determinación de Il1\alpha y PGE_{2}. Tratamiento con 3 \mul de sustancia por la mañana y por la tarde.

Día 3: Congelación de los sobrantes de medio para la determinación de Il1\alpha- y PGE_{2}. Determinación del metabolismo celular en el ensayo EZ4U a lo largo de un período de tiempo de 2 horas. Fijación de las preparaciones y preparación de cortes teñidos de parafina para la evaluación histológica.

Los controles negativo acompañantes se trataron correspondientemente con 3 \mul de BPS. Como sustancia de referencia o control positivo se empleó SDS en diferentes concentraciones (0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%). De todas las muestras se prepararon valores dobles.

El ensayo EZ4U se realizó en la forma siguiente: Después de 48 horas de incubación se determinó fotométricamente el metabolismo celular de los distintos equivalentes de la dermis mediante un colorante vital (derivado de tetrazolium). Antes de realizar el ensayo EZ4U, todos los equivalentes se lavaron tres veces cuidadosamente con
1,5 ml de PBS. A lo largo de un período de tiempo de dos horas se estableció una cinética de conversión de los controles negativos, controles positivos y de los equivalentes tratados con las muestras, a 450 nm (con 620 nm como longitud de onda de referencia). Para ello se incubaron a 37ºC, tal como ya se ha descrito, 750 ml de medio de ensayo y 75 \mul de colorante por inserto. Para SDS se determinó tanto la Ec50 como la Et50. La determinación de la Et50 se efectuó después de diferentes tiempos de exposición de 1% SDS (3 seg, 30 seg, 50 seg, 5 min, 15 min.).

El contenido de Il1\alpha y PGE_{2} en los sobrantes de los medios, después de 24 horas y 48 horas de incubación de las muestras, se determinó empleando kits de ensayo ELISA de tipo comercial, siguiendo las instrucciones.

Los equivalentes de la piel se investigaron histológicamente, para lo cual las preparaciones se fijaron en solución de Bouin, y se incorporaron en parafina, se prepararon cortes histológicos y se tiñeron.

La determinación del metabolismo celular del control negativo, de la referencia o control positivo y del equivalente de las muestras se efectuó mediante el cálculo de la diferencia de absorción (\DeltaOD). La variación de \DeltaOD por el patrón de referencia en diferentes concentraciones y mediante incubación durante 48 horas de las muestras se calculó en tanto por ciento referido al control sin tratar (control negativo, 100%).

A partir de los valores determinados se estableció para SDS una curva de efecto en función de la dosis o una curva de efecto en función del tiempo, y se determinó el tiempo de exposición (Et50) o la concentración (Ec50), respectivamente, que provoca un 50% de daño celular. Dado que las muestras se incubaron únicamente sin diluir y todas se incubaron a lo largo de un período de tiempo de 48 horas, se representó el \DeltaOD determinado en cada caso porcentualmente para el control.

Resultados a) Citotoxicidad de las muestras

El metabolismo celular de las muestras se determinó fotométricamente después de 48 horas de incubación. Mediante las cinéticas de conversión EZ4U se determinó la respectiva variación del metabolismo celular, se calculó porcentualmente con respecto al control sin tratar y se comparó con la sustancia de referencia acompañante. En la Tabla 1 están representados los resultados de este ensayo. La figura 2 muestra la variación del metabolismo celular de los equivalentes de la piel después de 48 horas de incubación de los equivalentes de la piel con diferentes concentraciones de la sustancia de referencia SDS.

TABLA 1 Variación porcentual del metabolismo celular después de 48 horas de incubación con las muestras, en relación con el control sin tratar (100%)

Muestra Nº	AST-2000
0 (control)	100%
SDS 0,73%	50%
186	47,6 \pm 17,3%
187	56,6 \pm 23,4%
188	45 \pm 13,8%
189	46,5 \pm 22,8%
190	67 \pm 25,6%
191	55,7 \pm 25,9%
342	39,7 \pm 13,6
355	46,1 \pm 12,5

b) Precipitación de citocina mediante el ejemplo de interleucina 1a (Il1a)

La secreción inducida de citocina Il1\alpha se cuantificó después de una incubación de 24 horas y después de una subsiguiente nueva incubación de 24 horas con substancias de ensayo en los sobrantes del medio de los equivalentes, mediante ELISA. Como substancias de ensayo se emplearon las muestras así como diferentes concentraciones
de SDS.

Secreción de Il1\alpha después de estimulación con SDS

La precipitación de Il1\alpha aumenta en el modelo cutáneo de forma continua según aumenta la concentración de SDS, alcanzando su valor máximo para 1% de SDS, con más de 100 pg/ml por equivalente de la piel. Los valores están todavía más aumentados en conjunto después de la segunda incubación.

Secreción de Il1\alpha después de incubación con las muestras

La precipitación de Il1\alpha por las muestras fue relativamente escasa en el modelo cutáneo después de 24 horas de incubación (15-25 pg/ml), sin embargo después de una segunda incubación de 24 horas se pudieron medir unos valores Il1\alpha notablemente superiores.

En la figura 3 están representados los resultados obtenidos con la sustancia de referencia SDS., La figura 4 muestra los resultados obtenidos con las muestras ensayadas.

c) Expresión del eicosanoide prostaglandina E_{2} (PGE_{2})

La síntesis del mediador de inflamación PGE_{2} se determinó cuantitativamente mediante ELISA en el modelo cutáneo después de una primera incubación de 24 horas y después de una subsiguiente segunda incubación de 24 horas, con sustancias de ensayo en los sobrantes de medio de los equivalentes. Como substancias de ensayo se emplearon las muestras 186-355 así como diferentes concentraciones de SDS.

Síntesis de PGE_{2} después de estimulación con SDS

La síntesis de PGE_{2} se mantiene casi invariablemente reducida en el modelo cutáneo hasta una concentración de SDS del 0,5%, pero a partir de las primeras 24 horas ya aumenta rápidamente para una concentración de 1% SDS hasta alcanzar más de 4000 pg/ml por equivalente de la piel. Los valores se mantienen prácticamente inalterados después de la segunda incubación de 24 horas (figura 5).

Síntesis de PGE_{2} después de la incubación con las muestras

En el modelo cutáneo se indujo mediante las muestras una clara síntesis de PGE_{2}.

La figura 5 muestra la influencia de la sustancia de referencia SDS en la síntesis de PGE_{2} en los equivalentes de la piel objeto de la invención, mientras que la figura 6 muestra la influencia de las muestras ensayadas sobre la síntesis de PGE_{2}.

En resumen se puede establecer que el modelo cutáneo reacciona de forma muy sensible y diferenciada ante las irritaciones. Así, por ejemplo, se observa en la precipitación de Il1\alpha mediante SDS un incremento que depende de la concentración. Las muestras investigadas mostraron también una secreción de Il1\alpha notablemente más intensa al aumentar el tiempo de incubación.

La investigación de la síntesis de PGE_{2} muestra que en el modelo cutáneo se provoca una precipitación multiplicada debido a la irritación. Así aumenta notablemente la síntesis de PGE_{2}. Estos valores son comparables con el umbral de irritación de SDS Ec50, de 0,73%. También se pudieron medir valores precisos después de la incubación de las muestras.

d) Alteraciones histológicas de los equivalentes de la piel

A continuación de los ensayos DZ4U se investigó histológicamente y se evaluó la estructura morfológica de todos los equivalentes ensayados. Los cortes histológicos mostraron un daño diferenciado en función del grado de irritación. Después de dos veces 24 horas de incubación con repetidas aplicaciones de la muestra, en las muestras investigadas se ha reblandecido parcialmente la queratinización, se han relajado y han quedado más o menos dañadas las capas de células proliferativas.

Claims

1. Procedimiento para la multiplicación de fibroblastos dermales, donde los fibroblastos dermales se cultivan incorporados en una biomatriz tridimensional semejante a un gel, que contiene de 3,5 hasta 4,5 mg/ml de colágeno en medio de cultivo celular tamponado que contiene suero, donde la solución de colágeno empleada para la preparación de la biomatriz contiene una proporción de \geq 90% de colágeno nativo no desnaturalizado.

2. Procedimiento para la comprobación de la función, morfología y/o del estatus de diferenciación de fibroblastos dermales, donde los fibroblastos dermales que se trata de comprobar se introducen en una biomatriz tridimensional semejante a un gel que contiene de 3,5 a 4,5 mg/ml de colágeno en medio de cultivo celular tamponado que contiene suero, donde la solución de colágeno empleada para la preparación de la biomatriz contiene una proporción de \geq 90% de colágeno nativo no desnaturalizado, se cultiva en ésta y se comprueba al mismo tiempo o después.

3. Procedimiento para la preparación de un equivalente de la dermis in vitro, para lo cual se incorporan fibroblastos dermales en una biomatriz tridimensional semejante a un gel, que contiene de 3,5 hasta 4,5 mg/ml de colágeno en medio de cultivo celular tamponado que contiene suero, donde la solución de colágeno empleada para la preparación de la biomatriz contiene una proporción de \geq 90% de colágeno nativo no desnaturalizado, y se cultivan en ésta de manera que se obtiene un equivalente de la dermis in vitro.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el cultivo de los fibroblastos dermales comprende un cultivo submerso de por lo menos 1 a 2 días.

5. Procedimiento para la preparación de un equivalente de la dermis in vitro según la reivindicación 3 ó 4, que comprende el aislamiento de tejido que contiene colágeno, el traspaso del tejido que contiene colágeno a una solución ácida, la incubación del tejido de colágeno incorporado a la solución ácida a 2 hasta 10ºC, en particular a 4ºC, la separación por centrifugado de las partes de colágeno no disueltas, la mezcla de la solución de colágeno obtenida a 2 hasta 10ºC, preferentemente a 4ºC, con una solución que contiene los fibroblastos dermales, medio de cultivo celular, suero y tampón, y la gelificación de la solución mezclada mediante aumento de la temperatura.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 5, donde después del cultivo de los fibroblastos dermales en la biomatriz tridimensional semejante a un gel se extraen de ésta y se siguen cultivando con una densidad celular superior, de manera que se obtiene un equivalente de la dermis in vitro.

7. Procedimiento para la preparación de un equivalente de la piel tridimensional in vitro, para lo cual se incorporan fibroblastos dermales en una biomatriz tridimensional semejante a un gel, que contiene 3,5 hasta 4,5 mg/ml de colágeno en un medio de cultivo celular tamponado que contiene suero, donde la solución de colágeno empleada para la preparación de la biomatriz contiene una proporción de \geq 90% de colágeno nativo no desnaturalizado, y se someten en ésta a un cultivo submerso de por lo menos uno a dos días, y donde a continuación se siembran queratinocitos en un medio de cultivo celular sobre la biomatriz y después se siguen cultivando, de manera que se obtiene un equivalente de la piel in vitro tridimensional.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, donde el cultivo de los queratinocitos comprende un cultivo submerso de por lo menos 5 a 6 días y un cultivo Airlift de por lo menos 12 a 14 días.

9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8, donde los queratinocitos presentan una elevada proporción de células madre basales no diferenciadas.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 9, donde antes, durante o después de la siembra de los queratinocitos se siembran sobre la biomatriz y se cultivan otros tipos de células cutáneas tales como melanocitos, células inmunes y/o células endoteliales.

11. Procedimiento para la preparación de un equivalente de la piel tridimensional in vitro según una de las reivindicaciones 7 a 10, que comprende el aislamiento del tejido que contiene el colágeno, el traspaso del tejido que contiene colágeno a una solución ácida, la incubación del tejido de colágeno traspasado a la solución ácida a 2 hasta 10ºC, en particular a 4ºC, la separación por centrifugado de las partes de colágeno no disueltas, la mezcla de la solución de colágeno obtenida a 2 hasta 10ºC, preferentemente a 4ºC, con una solución que contiene los fibroblastos dermales, medio de cultivo celular, suero y tampón, la gelificación de la solución mezclada mediante aumento de la temperatura, la incubación de la mezcla gelificada a 37ºC y la siembra de los queratinocitos y/o los otros tipos de células cutáneas sobre la mezcla gelificada incubada.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, donde se prepara la biomatriz que contiene los fibroblastos dermales incorporados, para lo cual las fibras de colágeno aisladas de un tejido se agitan en solución ácida durante 3 a 14 días a 2 hasta 10ºC, preferentemente 4ºC, se separan por centrifugado las partes de colágeno no disueltas y se mezcla la solución de colágeno terminada obtenida con un contenido de colágeno de 3 mg/ml hasta 8 mg/ml, con una solución que contiene fibroblastos dermales, medio de cultivo celular, suero y tampón, a 2 hasta 10ºC, preferentemente 4ºC, y a continuación se gelifica a temperatura superior, preferentemente a temperatura ambiente
hasta 37ºC.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, donde la solución ácida es una solución de ácido acético, en particular una solución de ácido acético al 0,1%.

14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, donde la solución que contiene el medio de cultivo celular, el suero y el tampón, se mezcla en la proporción 1:2 con la solución que contiene colágeno.

15. Equivalente de la dermis in vitro, preparado según uno de los procedimientos conforme a una de las reivindicaciones 3 a 6 ó 12 a 14.

16. Equivalente de la dermis in vitro humano según la reivindicación 15, preparado empleando fibroblastos dermales humanos.

17. Equivalente de la piel in vitro tridimensional, preparado según un procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 14.

18. Equivalente de la piel in vitro tridimensional humana según la reivindicación 17, preparado empleando fibroblastos dermales humanos y queratinocitos humanos, y eventualmente otros tipos de células cutáneas humanas.

19. Procedimiento para la determinación del efecto de una sustancia química o de un agente sobre las células dérmicas, que comprende la puesta en contacto de la sustancia química o del agente con un equivalente de la dermis in vitro según la reivindicación 15 ó 16 y determinación de la interacción entre el equivalente de la dermis y la sustancia química o el agente.

20. Procedimiento para la determinación del efecto de una sustancia química o de un agente sobre las células cutáneas, que comprende la puesta en contacto de la sustancia química o del agente con un equivalente de la piel in vitro tridimensional conforme a la reivindicación 17 ó 18 y determinación de la interacción entre el equivalente de la piel y la sustancia química o el agente.