KR100806695B1 - 색소화 질환 치료용 세포치료 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 멜라닌세포 및 각질세포, 또는 (b) 멜라닌세포 및 섬유아세포를 유효성분으로 포함하는 색소화 질환 (pigmentation disorders)의 치료용 세포치료 (cell therapy) 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 세포치료 조성물은, 색소화 질환에 대한 최초의 세포치료제로서, 유효성분으로 멜라닌세포와 각질세포, 또는 멜라닌세포와 섬유아세포를 이용함으로써 우수한 색소 침착 효능을 달성함으로써 백반증과 같은 저색소화에 따른 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
멜라닌세포, 각질세포, 섬유아세포, 색소화, 저색소화, 백반증

Description

색소화 질환 치료용 세포치료 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Cell Therapy of Pigmentation Disorders}
도 1a-1c는 사람의 정상 피부 조직에서 분리한, 멜라닌세포, 각질세포 및 섬유아세포의 면역조직화학 염색 결과 사진이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 멜라닌세포의 수에 따른 멜라닌 색소의 양의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 멜라닌세포의 수에 따른 타이로시나아제의 활성도의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 4는 누드 마우스에 멜라닌세포, 멜라닌세포와 각질세포 또는 멜라닌세포와 섬유아세포를 이식한 결과를 보여주는 사진이다. M: 멜라닌 세포, K: 각질세포, F: 섬유아세포.
도 5는 누드 마우스에 멜라닌세포, 각질세포 및 섬유아세포 현탁액을 이식한 후 2주째의 피부 색깔 변화를 보여주는 사진이다. 세포 현탁액은 멜라닌세포 5 x 105cells/cm2, 각질세포 1 x 106cells/cm2 및 섬유아세포 1 x 106 cells/cm2로 이루어져 있다.
도 6은 누드 마우스에 멜라닌세포, 각질세포 및 섬유아세포 현탁액을 이식한 후 1주째의 헤마톡실린&에오신 (H&E) 염색 결과를 보여주는 사진이다. M: 멜라닌 세포, K: 각질세포, F: 섬유아세포. 대부분 멜라닌 세포는 진피층에서 관찰되며, 뭉쳐서 발견되고 기저층쪽으로 이동하는 양상이 관찰된다.
도 7은 누드 마우스에 멜라닌세포, 각질세포 및 섬유아세포 현탁액을 이식한 후 2주째의 헤마톡실린&에오신 (H&E) 염색 결과를 보여주는 사진이다. M: 멜라닌 세포, K: 각질세포, F: 섬유아세포. 진피에 뭉쳐 있던 멜라닌세포가 기저층쪽으로 이동하고 기저층을 따라 옆으로 이동하여 시술부위에 고르게 퍼지는 것이 관찰된다.
도 8은 멜라닌세포와 각질세포의 공동 배양 시 각질세포로의 멜라닌색소 전달 결과를 보여주는 사진이다.
도 9는 인 비트로 색소화 피부 재구성 결과를 보여주는 사진이다.
도 10은 인 비트로 색소화 피부 재구성시 각질세포와 멜라닌세포의 배양 방식을 보여주는 그림이다. 최저층은 진피 대응물, 클로즈드 (closed) 박스는 배지의 높이, 손톱 모양은 각질세포와 멜라닌세포를 각각 나타낸다.
본 발명은 색소화 질환 치료용 세포치료 약제학적 조성물 및 색소화 피부 재 구성 모델에 관한 것이다.
백반증과 같은 색소화 질환의 치료법은 크게 약물요법과 수술적요법으로 나눌 수 있다. 약물요법으로는 스테로이드제를 복용하거나 도포하는 방법, 광 감각제를 복용하고 자외선을 조사하는 광선요법이 일반적이나 색소 재침착의 정도가 낮고 약물의 부작용으로 인한 위험성을 충분히 고려해야 한다. 한편, 수술적 방법으로는 백반증 부위의 표피를 제거하고 그 부위에 정상 자가 표피를 이식하는 표피 이식술 등이 있다.
대한민국 특허 제293736호는 당결합 단백질이 함유된 백반증 치료 효능이 있는 고련피 (MELIAE CORTEX)의 추출물을 개시하고 있다. 대한민국 특허출원 제 2003-0056823호는 광감작제를 투여한 후 국소적으로 케미컬 라이트를 조사하는 방식의 백반증 등의 치료에 유효한 광역학 치료법을 개시한다. 또한, 대한민국 특허출원 제2003-7017182호는 백반증 등 피부상의 상당한 이점을 제공할 수 있는 살아있는 조직을 광 변조시키는 시스템 및 방법을 개시하고 있다. 대한민국 특허출원 제2003-0049725호는 건선, 백반증 등의 피부질환 치료에 유용한 310 nm의 자외선 광원 생성을 위한 전 고체식 레이저 방사 시스템을 개시하고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 색소화 질환, 특히 멜라닌세포의 소실 혹은 멜라닌 생산의 감소에 따르는 저색소화 (hypopigmentation) 증상을 치료하기 위한 세포 치료제를 개발하고자 노력하였고, 그 결과 유효성분으로서 멜라닌세포 이외에 각질세포 또는 섬유아세포를 동시에 이용하여 피부에 적용하면 피부에 색소 침착 (pigment deposition)을 크게 증진시킬 수 있다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 색소화 질환 (pigmentation disorders)의 치료용 세포치료 (cell therapy) 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 색소화 피부 재구성 (reconstruction) 모델을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 멜라닌세포 및 각질세포, 또는 (b) 멜라닌세포 및 섬유아세포를 유효성분으로 포함하는 색소화 질환 (pigmentation disorders)의 치료용 세포치료 (cell therapy) 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 색소화 질환, 특히 멜라닌세포의 소실 혹은 멜라닌 생산의 감소에 따르는 저색소화 (hypopigmentation) 증상을 치료하기 위한 세포 치료제를 개발하고자 노력하였고, 그 결과 유효성분으로서 멜라닌세포 이외에 각질세포 또는 섬유아세포를 동시에 이용하여 피부에 적용하면 피부에 색소 침착 (pigment deposition)을 크게 증진시킬 수 있다는 사실을 발견하였다.
본 발명의 특징은 색소화 질환의 세포치료제로서 멜라닌세포와 각질세포 또는 섬유아세포를 동시에 이용한다는 것이다. 피부에 투입된 각질세포는 표피를 제거한 환부에서 표피 재생을 촉진할 뿐만 아니라 멜라닌세포의 부착과 증식에 필요한 성장인자와 기저막 성분 등의 세포간물질을 제공함으로써 멜라닌세포가 기저막에 부착되는 것을 돕고 결국 더욱 더 많은 멜라닌세포가 형성되도록 하여 색소 침착을 크게 증진시킨다. 또한, 멜라닌세포와 동시에 이용되는 섬유아세포는 기저막 성분 등의 세포간물질을 제공하여 기저막 형성에 관여할 뿐만 아니라, 표피의 멜라닌세포 또는 각질세포가 기저막에 결합하는 결합점인 반부착반점(hemidesmosome)의 형성을 촉진하여 새로이 형성된 색소 재침착된 표피층과 진피층간의 결합을 증진시킴으로써 피부의 기계적 강도를 증진시키는 작용을 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 포함되는 멜라닌세포, 각질세포, 섬유아세포 또는 멜라닌세포, 각질세포와 섬유아세포는 체외 분리 또는 체외 분리 후 배양된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 혼합 세포치료제는 멜라닌세포 및 각질세포로 이루어져 있는 것이다. 멜라닌세포와 각질세포로 이루어진 혼합 세포치료제는, 멜라닌세포와 섬유아세포로 이루어진 혼합 세포치료제보다 더 멜라닌세포에 의한 색소 침착을 증진시킨다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 유효성분으로서, 멜라닌세포, 각질세포 및 섬유아세포를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 색소화 질환은 저색소화증 (hypopigmentation), 부분 백피증 (piebaldism), 점상 백피증 (leukoderma), 화학물질에 의한 백피증 (leukoderma), 백색 비강진 (piryriasis alba), 탈색소 모반, 염증 후 탈색증 또는 백반증 (vitiligo)이며, 가장 바람직하게는 백반증이다.
본 발명의 조성물에서 멜라닌세포의 수는 바람직하게는 1 x 103 - 1 x 107 cells/cm2, 보다 바람직하게는 1 x 103 - 1 x 106 cells/cm2, 보다 더 바람직하게는 1 x 104 - 1 x 106 cells/cm2, 가장 바람직하게는 1-5 x 105 cells/cm2이고, 각질세포의 수는 바람직하게는 1 x 104 - 1 x 108 cells/cm2, 보다 바람직하게는 1 x 104 - 1 x 107 cells/cm2, 보다 더 바람직하게는 1 x 105 - 1 x 107 cells/cm2, 가장 바람직하게는 약 1 x 106 cells/cm2이다. 본 발명의 조성물에서 멜라닌세포와 각질세포의 개 수의 비율은 바람직하게는 1:1-1:1000이고, 보다 바람직하게는 1:1-1:100이며, 가장 바람직하게는 1:2-1:10이다.
본 발명의 조성물에서 섬유아세포의 수는 바람직하게는 1 x 103 - 1 x 107 cells/cm2, 보다 바람직하게는 1 x 103 - 1 x 106 cells/cm2, 보다 더 바람직하게는 1 x 104 - 1 x 106 cells/cm2, 가장 바람직하게는 약 1 x 105 cells/cm2이다. 본 발명의 조성물에서 멜라닌세포와 섬유아세포의 개수의 비율은 바람직하게는 1:1-1:1000이고, 보다 바람직하게는 1:1-1:100이며, 가장 바람직하게는 약 1:1이다.
이용 가능한 섬유아세포는 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는, 사람 정상 섬유아세포, 방사선이나 마이토마이신을 처리한 비활성 유사분열상태의 사람 섬유아세포, 동물의 정상 섬유아세포, 방사선이나 마이토마이신을 처리한 비활성 유사분열상태의 동물 섬유아세포 또는 섬유아세포 세포주(예컨대, Swiss 3T3)이다. 가장 바람직하게는, 사람 정상 섬유아세포이다.
본 발명의 약제학적 세포치료 조성물은, 유효성분으로서 상기 혼합 세포성분들 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 피부에 직접 이식할 목적으로 개발되었다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 103-109 세포이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 필름 형태로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포 외의 담체를 사용하지 않고, 정상조직으로부터 분리된 멜라닌세포와 각질세포 또는 멜라닌세포와 섬유아세포를 한 장의 필름으로 공동배양하여 이 필름을 환부에 적용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 멜라닌세포와 각질세포 또는 멜라닌세포와 섬유아세포를 동시 투여하도록 제조된 제형뿐만 아니라, 멜라닌세포와 각질세포 또는 멜라닌세포와 섬유아세포를 분할 투여하여 결국 동시 투여와 동일한 효과를 발휘하도록 제조된 제형도 포함한다.
본 발명의 세포치료 조성물은, 색소화 질환에 대한 최초의 세포치료제로서, 유효성분으로서 멜라닌세포와 각질세포 또는 멜라닌세포와 섬유아세포를 이용함으로써 우수한 색소 침착 효능을 달성함으로써 백반증과 같은 저색소화에 따른 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 진피대응물로서 타입 I 콜라겐과 타입 I 콜라겐에 포배된 섬유아세포, (ⅱ) 상기 타입 I 콜라겐 상에 코팅된 타입 Ⅳ 콜라겐과 라미닌 및 (ⅲ) 상기 타입 Ⅳ 콜라겐과 라미닌 상에 접종되어 배양된 각질세포와 멜라닌세포를 포함하는 색소화 피부 재구성 (reconstruction) 모델을 제공한다.
본 발명의 색소화 피부 (pigmented skin) 인 비트로 모델은 동물실험 모델을 대체하기 위하여 개발된 것이다.
본 발명의 인 비트로 모델에서, 가장 아래쪽에 위치하는 것은 진피대응물로 이용된 타입 I 콜라겐이다. 진피대응물 층을 제조할 때, 섬유아세포를 포함시킨다. 이용 가능한 섬유아세포는 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는, 사람 정상 섬유아세포, 방사선이나 마이토마이신을 처리한 비활성 유사분열상태의 사람 섬 유아세포, 동물의 정상 섬유아세포, 방사선이나 마이토마이신을 처리한 비활성 유사분열상태의 동물 섬유아세포 또는 섬유아세포 세포주(예컨대, Swiss 3T3)이다. 가장 바람직하게는, 사람 정상 섬유아세포이다. 섬유아세포의 접종 개수는 1 x 103 - 1 x 107 cells/㎖, 바람직하게는 1 x 104 - 1 x 106 cells/㎖, 가장 바람직하게는 약 1.5 x 105 cells/㎖이다.
타입 I 콜라겐 상에는 타입 Ⅳ 콜라겐과 라미닌이 코팅되어 있다. 타입 Ⅳ 콜라겐과 라미닌은 기저막 (basement membrane)의 성분으로서 멜라닌세포와 각질세포의 부착을 돕는 역할을 한다.
타입 Ⅳ 콜라겐과 라미닌이 코팅된 진피대응물 층에 각질세포와 멜라닌세포가 위치한다. 각질세포와 멜라닌세포는 진피대응물 층에 접종되어 배양된 것이다. 각질세포와 멜라닌세포의 배양 조건은 공기 노출도에 따라 크게 3가지 조건을 선택할 수 있다: 공기-건조 (air-dry) 조건, 반-건조 (semi-dry) 조건 및 서브머지 (submerged) 조건.
본 명세서에서 공기-건조 조건은 타입 I 콜라겐 젤 매트릭스에 접종한 각질세포층, 즉 표피층이 공기 중에 완전히 노출된 상태를 의미한다 (참조: 도 10의 패널 A)
본 명세서에서 반-건조 조건은 타입 I 콜라겐 젤 매트릭스에 접종한 각질세포층이 가능한 최소 높이의 배양액으로 덮여 있는 상태를 의미한다 (참조: 도 10의 패널 B). 이 조건에서는 각질세포층 바로 위에 배앵액이 가능한 얇게 덮여 있게 되며, 각질세포층에 영향을 주는 요소들은 배양액과 공기를 통하여 작용을 하게 된다.
본 명세서에서 서브머지 조건은 타입 I 콜라겐 젤 매트릭스에 접종한 각질세포층이 가능한 최대 높이의 배양액으로 덮여 있는 상태를 의미한다 (참조: 도 10의 패널 C). 이 조건에서는 각질세포층에 영향을 주는 요소들이 배양액을 통하여 작용을 하게 된다.
접종한 각질세포와 멜라닌세포의 배양은 크게 2 단계로 실시된다. 첫 번째 배양단계 (타입 I 콜라겐 층 상이 각질세포층으로 1차적으로 도포되는 시기까지의 배양)는 통상적인 배양 조건인 서브머지 조건에서 실시된다. 첫 번째 배양의 기간은 3-10일이 바람직하고, 7일이 가장 바람직하다. 두 번째 배양 단계는 공기-건조 조건에서 실시되며, 두 번째 배양의 기간은 8-20일이 바람직하고, 14일이 가장 바람직하다.
각질세포의 접종 개수는 1 x 103 - 1 x 107 cells/㎠, 바람직하게는 1 x 104 - 1 x 106 cells/㎠, 가장 바람직하게는 약 3 x 105 cells/㎠이다. 멜라닌세포의 접종 밀도는 1 x 102 - 1 x 106 cells/㎠, 바람직하게는 1 x 103 - 1 x 105 cells/㎠, 가장 바람직하게는 약 3 x 104 cells/㎠이다. 본 발명의 피부 재구성 모델에서, 멜라닌세포와 각질세포의 개수의 비율은 바람직하게는 1:1-1:1000이고, 보다 바람직하게는 1:1-1:100이며, 가장 바람직하게는 1:2-1:10이다.
진피대응물 층에서 배양된 각질세포와 멜라닌세포에서, 멜라닌세포는 기저막 성분층이 있는 아래쪽에 위치하게 되며, 각질세포는 가장 바깥쪽에 표피층을 형성한다. 멜라닌세포는 멜라닌을 생성하고, 각질세포층 쪽으로 멜라닌이 이동되는 멜라닌 유니트가 구성되며, 결국 색소화 피부가 재구성된다.
이러한 재구성 모델은 멜라닌세포의 멜라닌 합성과 각질세포로의 전달, 멜라닌세포와 각질세포의 상호작용, 기능성 화장품 (예컨대, 미백 화장품)의 효능평가 기능을 연구하기 위한 좋은 모델로 이용될 수 있다. 또한, 피부 광노화/광손상 전임상과 동물실험의 대체모델로써 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 멜라닌세포 , 각질세포 및 섬유아세포의 분리 및 배양
사람의 정상조직으로부터 피부 멜라닌세포, 각질세포와 섬유아세포를 분리하고 배양하였다.
실시예 1-1: 멜라닌세포의 분리 및 배양
절제된 피부조직을 50 ㎍/㎖의 항생제 (gentamicin, Gibco)가 포함된 인산완 충용액 (WelGENE)으로 8번 이상 세척하여 응고된 혈액과 오염물들을 제거하였다. 이어, 진피부분의 지방층을 제거하고, 조직을 5 mm 정도로 가능한 한 잘게 절단하고, 절단한 피부 조직을 1 mg/㎖ 디스파아제 (Roche)에 넣고 4℃에서 16시간 반응시켰다. 그런 다음, 핀셋을 이용하여 피부조직으로부터 표피를 분리하고, 분리된 표피를 인산완충용액으로 세척한 후 트립신-EDTA 용액 (0.05% trypsin - 0.53 mM EDTAㆍ4Na , Gibco)을 넣고 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 표피가 담긴 트립신-EDTA 용액을 수차례 파이펫팅하여 표피로부터 세포가 떨어져 나오도록 하였고, 이때 멜라닌세포와 각질세포가 함께 분리된다.
멜라닌세포와 각질세포가 떨어져 나온 트립신-EDTA 용액에 멜라닌세포 배양배지인 MGM-3 (Cambrex)를 첨가하여 50 ㎖ 튜브로 옮긴 다음 300 x g에서 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 멜라닌세포 배양배지를 첨가하여 분리된 세포를 단일화 하고, 세포수를 계산하여 직경 100 mm 배양접시에 107개의 세포가 되도록 분주하였다. 37℃ CO2 배양기에서 배양하고 배지는 2일에 한 번 교체하였으며, 배양접시의 세포가 과밀해지면 배양접시의 멜라닌세포 배양배지를 제거하고, 인산완충용액으로 한번 세척하였다. 트립신-EDTA 용액 1.5 ㎖을 첨가하여 배양기에서 5분간 효소 반응시키고, 각질세포에 비하여 멜라닌세포가 트립신 처리에 의해 배양용기로부터 빨리 떨어지는 것을 이용하여 배양된 표피세포로부터 멜라닌세포만을 회수하였다. 멜라닌세포의 수를 계산하고 300 x g에서 원심분리하여 멜라닌세포만을 남겼다. 원심분리한 상등액을 제거하고, 멜라닌세포 배양배지를 첨가하여 멜라닌세포를 고르게 현탁한 후, 100 mm 배양접시에 3 x 105개의 세포수가 되도록 세포현탁액을 첨가해 계대 배양하였다. 배양된 세포는 멜라닌세포의 확인 표지 마커인 HMB-45에 대한 항체에 양성반응이 나타나는 것으로 멜라닌세포임을 확인하였다.
실시예 1-2: 각질세포의 분리 및 배양
절제된 피부조직을 50 ㎍/㎖의 항생제 (gentamicin, Gibco)가 포함된 인산완충용액(WelGENE)으로 8번 이상 세척하여 응고된 혈액과 오염물들을 제거하였다. 이어, 진피부분의 지방층을 제거하고, 조직을 5 mm 정도로 가능한 한 잘게 절단하고, 절단된 피부 조직을 50 ㎖ 튜브에 옮긴 후 트립신용액 (0.125% 트립신: versene = 1:1 , Gibco) 10 ㎖을 첨가한 후, 마그네틱 바를 이용하여 상온에서 45분간 물리적인 자극을 주어 각질세포가 떨어져 나오도록 하였다. 세포가 떨어져 나온 트립신 용액에 0.1 mg/㎖의 트립신 억제자 (Gibco)를 첨가하여 50 ㎖ 튜브로 옮긴 다음 300 x g에서 원심분리 하고, 상층액을 제거한 다음, 각질세포배양 배지인 KGM (Cambrex)을 첨가하여 세포를 단일화하였다. 세포수를 계산하여 직경 100 mm 배양접시에 3 x 105개의 세포가 되도록 분주하였다. 37℃ CO2 배양기에서 배양하고 배지는 2일에 한 번 교체하여 주었으며, 배양접시의 세포가 과밀해지면 배양접시의 각질세포 배양배지를 제거하고, 인산완충용액으로 한번 세척하였다. 이어, 트립신-EDTA 용액 1.5 ㎖을 첨가하여 배양기에서 10분간 효소 반응시키고, 배 양용기로부터 각질세포를 회수하여 세포수를 계산하고 300 x g에서 원심분리 하였다. 원심분리한 상등액을 제거하고, 각질세포 배양배지를 첨가하여 각질세포를 고르게 현탁한 후, 100 mm 배양접시에 3 x 105개의 세포수가 되도록 세포현탁액을 첨가해 계대 배양하였다. 배양된 세포는 각질세포의 확인 표지 마커인인 판-사이토케라틴에 대한 항체에 양성반응이 나타나는 것으로 각질세포임을 확인하였다.
실시예 1-3: 섬유아세포의 분리 및 배양
절제된 피부조직을 50 ㎍/mL의 항생제 (gentamicin, Gibco)가 포함된 인산완충용액(WelGENE)으로 8번 이상 세척하여 응고된 혈액과 오염물들을 제거하였다. 이어, 조직을 5 mm 정도로 가능한 한 잘게 절단하고, 절단된 피부 조직을 1 mg/㎖디스파아제 (Roche)에 넣고 4℃에서 16시간 반응시켰다. 핀셋을 이용하여 피부조직으로부터 표피를 벗겨낸 다음, 진피를 인산완충용액으로 세척하고, 1 mg/㎖ 콜라게나아제 (Roche)를 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 섬유아세포가 떨어져 나온 콜라게나아제 용액에 섬유아세포 배양배지인 FGM (Cambrex)을 첨가하여 50 ㎖ 튜브로 옮긴 다음 300 x g에서 원심분리하고, 원심분리 후 상등액을 제거하고 섬유아세포 배양배지을 첨가하여 세포를 단일화하였다. 세포수를 계산하여 직경 100 mm 배양접시에 1 x 105개의 세포가 되도록 분주하고, 37℃ CO2 배양기에서 배양하고 배지는 3일에 한 번 교체하였으며, 배양접시의 세포가 과밀해지면 배양접시의 섬유아세포 배양배지를 제거하고, 인산완충용액으로 한번 세척하였다. 트립신-EDTA 용액 1.5 ㎖을 첨가하여 배양기에서 10분간 효소 반응시킨 다음, 배양용기로부터 섬유아세포를 회수하여 세포수를 계산하고 300 x g에서 원심분리하였다. 원심분리한 상등액을 제거하고, 섬유아세포 배양배지를 첨가하여 섬유아세포를 고르게 현탁한 후, 100 mm 배양접시에 1 x 105개의 세포수가 되도록 세포현탁액을 첨가해 계대 배양하였다. 배양된 세포는 섬유아세포의 확인 표지 마커인 바이멘틴에 대한 양성반응이 나타나는 것으로 섬유아세포임을 확인하였다.
실시예 1-4: 면역조직화학 염색 방법
배양용기에 트립신을 처리하여 각각의 세포를 회수한 다음, 세포를 각각의 배양배지 1 ㎖에 현탁하고 커버글라스가 담긴 24-멀티 웰 배양용기에 분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하여 세포를 커버글라스에 부착시켰다: 멜라닌세포: 2 x 104 개/웰, 각질세포: 1 x 104 개/웰, 섬유아세포: 1 x 104 개/웰. 배양용기의 배양액을 제거하고, 웰 당 인산완충용액 (WelGENE) 1 ㎖로 세척한 후, -20℃ 메탄올 1 ㎖을 넣어 4℃에서 20분간 고정화 하였다. 메탄올을 제거하고 인산완충용액으로 2회 세척한 후, Triton X-100 (USB)을 인산완충용액에 0.2%로 희석하여 웰 당 1 ㎖씩 넣어 실온에서 10분간 처리하고, 0.2% Triton X-100을 제거하고 인산완충용액으로 2회 세척하였다. 염소혈청 (normal goat serum, Sigma)을 인산완충용액에 20%로 희석하여 웰 당 1 ㎖씩 넣어 실온에서 1시간 반응시켜 비 특이적 결합을 블록킹 하였다. 각각의 세포에 대한 확인 표지 마커인 마우스-항-사람 항 체를 20% 염소혈청에 1:50으로 희석하여 얇은 파라핀 필름 위에 희석된 항체용액을 100 ㎕씩 떨어뜨렸다: 멜라닌세포, HMB-45 항체 (DAKO); 각질세포, 판-사이토케라틴 항체 (DAKO); 섬유아세포, 바이멘틴 항체 (DAKO). 배양용기에서 커버글라스를 조심스럽게 꺼내서 세포가 붙어 있는 면이 항체 희석액과 닿도록 덮어서 1시간동안 실온에서 반응시킨 다음, 커버글라스의 세포가 붙어 있는 면이 위로 가도록 조심스럽게 다시 배양용기로 옮긴 후, 웰 당 1 ㎖의 인산완충용액으로 2회 세척하였다. 형광물질인 FITC가 결합된 염소-항-마우스 항체 (Vector)를 인산완충용액에 1:100으로 희석하여 파라핀 필름 위에 100 ㎕씩 떨어뜨린 다음, 배양용기에서 커버글라스를 조심스럽게 꺼내서 세포가 붙어 있는 면이 항체 희석액과 닿도록 덮어서 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 커버글라스의 세포가 붙어 있는 면이 위로 가도록 조심스럽게 다시 배양용기로 옮긴 후, 웰 당 1 ㎖의 인산완충용액으로 2회 세척하였다. 핵 염색시약인 DAPI (Sigma)를 인산완충용액에 1:1000으로 희석하여 웰 당 1 ㎖을 첨가하여 실온에서 5분 반응시켰다. 웰 당 1 ㎖의 증류수로 2회 세척하고, 형광염색용 마운팅 용액 (Vectashield, Vector)을 깨끗한 슬라이드 위에 50 ㎕씩 떨어뜨렸다. 배양용기에서 커버글라스를 조심스럽게 꺼내서 세포가 붙어 있는 면이 마운팅 용액과 닿도록 덮은 다음, 형광현미경 하에서 관찰 하였다.
도 1에서 볼 수 있듯이, 분리된 멜라닌세포, 각질세포 및 섬유아세포는 동정 마커인 HMB45, 판 사이토케라틴 및 바이멘틴에 의해 각각 염색되었고, 이 결과는 본 발명에 의해 분리된 세포가 멜라닌세포, 각질세포 및 섬유아세포임을 나타낸다.
실시예 2: 분리된 멜라닌세포의 역가 분석
상기 실시예 1에서 분리 및 배양된 멜라닌세포의 역가을 확인하기 위하여, 실험실에서 배양된 멜라닌세포의 역가를 확인하기 위하여 멜라닌세포내 멜라닌 총량과 멜라닌 합성효소인 타이로시나아제 (tyrosinase)의 활성도를 측정하였다.
멜라닌 총량은 다음과 같이 측정 하였다: 멜라닌세포와 음성대조군인 각질세포를 배양용기로부터 트립신 처리하여 회수하였다. 회수한 세포수를 측정하고 각각의 50 ㎖ 튜브에 멜라닌세포는 1 x 103, 1 x 104, 2.5 x 104, 5 x 104, 7.5 x 104 및 1 x 105 이 되도록, 음성대조군인 각질세포는 1 x 105 농도가 되도록 준비하였다. 300 x g에서 원심분리하여 상등액을 제거하고 세포만을 남긴 다음, 각각의 세포 덩어리에 1 N NaOH 용액을 100 ㎕씩 첨가하여 세포를 현탁 하였다. 합성멜라닌 (Sigma) 농도별 기준용액을 준비하였다. 1 N NaOH 용액 100 ㎕을 이용하여 멜라닌을 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖이 되도록 준비하였다. 합성멜라닌 기준용액과 농도별 세포 현탁액을 60℃의 항온수조에서 1시간 처리하여 멜라닌을 용출하였다. 스펙트로포토미터를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 양을 정량하였다.
한편, 타이로시나아제 활성은 다음과 같이 측정 하였다: 멜라닌세포를 배양용기로부터 트립신 처리하여 회수하고, 회수한 세포수를 측정한 다음, 멜라닌세포 배양배지 (MGM, Cambrex) 200 ㎕를 이용하여 96-웰 배양용기에 멜라닌 세포를 웰 당 2 x 103, 5 x 103, 1 x 104 및 2 x 104 농도로 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양용기의 배지을 제거하고, 웰 당 인산완충용액 200 ㎕을 넣어 세척하고, Triton X-100(USB)을 인산완충용액에 1%로 희석하여 웰 당 90 ㎕씩 첨가하였다. 0.1% Triton X-100 용액 90 ㎕이 담긴 배양용기를 -70℃에 30분 방치하여 세포를 얼린 다음 실온에서 해동하는 과정을 통해 세포막을 파괴하여 멜라닌세포 추출액을 얻었다. 타이로시나아제의 기질인 10 mM L-DOPA (Sigma) 용액을 멜라닌세포 추출액이 들어있는 웰에 10 ㎕씩 첨가하여 멜라닌세포가 가지고 있는 타이로시나아제와 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. L-DOPA가 멜라닌세포 추출액 중의 타이로시나아제에 의해 갈색의 화합물을 형성하면 스펙트로 포토미터를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌세포가 가지고 있는 타이로시나아제의 활성을 측정하였다.
도 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명에서 분리된 멜라닌세포 수가 증가할수록 멜라닌 색소의 양도 증가함을 확인할 수 있다. 한편, 음성대조군으로 이용한 각질세포 (human epidermal keratinocyte: HEK)는 멜라닌 색소를 가지고 있지 않다는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명에서 분리된 멜라닌세포 수가 증가할수록 타이로시나아제 (tyrosinase)의 활성도가 증가함을 확인할 수 있다.
실시예 3: 누드 마우스에 멜라닌세포의 이식
우선, 멜라닌세포, 각질세포 및 섬유아세포의 현탁액을 준비하였다. 상기 실시예 1에서 분리 및 배양된 멜라닌세포, 각질세포와 섬유아세포의 배양접시의 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 트립신을 처리하여 37℃배양기에서 10분 동안 반응시켰다. 세포가 배양접시 바닥에서 떨어지면 DMEM 배지(Gibco)로 현탁하여 세포를 회수하고 수를 측정한 후 300 x g에서 원심분리 하였다. 원심분리된 상등액은 버리고 각각의 세포에 DMEM 배지를 첨가하여 멜라닌세포 5 x 105 cells/cm2, 각질세포 1 x 106 cells/cm2, 및 섬유아세포 1 x 106 cells/cm2 현탁액을 준비하였다.
6 주령된 BALB/c SI c-nu/nu 마우스 수컷 (중앙실험동물)을 일주일 동안 적응시킨 후, 케타민과 럼푼의 혼합액을 복강에 투여하여 마취시킨 다음, 표피를 제거할 등 부분을 베타딘과 70% 에탄올로 소독하였다. 누드 마우스의 등에서 척추를 피하여 약간 아래쪽 둔부 부위에 면도칼을 이용하여 1 x 1 ㎠ 크기로 표피를 제거하였다. 표피를 제거한 부분에 음성 대조군으로서 DMEM 배지 15 ㎕를 실험군으로서 세포현탁액 15 ㎕를 접종하였다. 실험군 1은 멜라닌세포만을 1 x 105 cells/cm2 농도로 접종하였고, 실험군 2는 멜라닌세포 1 x 105 cells/cm2과 각질세포 1 x 106 cells/cm2 함께 접종하였으며, 실험군 3은 멜라닌세포 5 x 105cells/cm2, 각질세포 1 x 106cells/cm2와 섬유아세포 1 x 106 cells/cm2 를 함께 접종하였다. 실 험군 4는 멜라닌세포 1 x 105 cells/cm2과 섬유아세포 1 x 106 cells/cm2를 함께 접종하였다.환부는 각질층이 제거되었을 뿐만 아니라 약간의 삼출물이 있어 주입한 세포 현탁액이 흐르지 않고 표피를 제거한 부분에만 유지되었다. 각질세포는 멜라닌세포의 부착을 돕고 표피재생을 촉진시키기 위해 함께 주입한 것이고, 섬유아세포는 진피 손상을 빠르게 회복시킬 뿐 아니라 기저층의 형성과 표피층과 기저층간의 결합점인 반부착반점(hemidesmosome)의 형성을 촉진하기 위해 함께 주입한 것이다.
시술 부위를 멸균된 실리콘 거즈 (Molnlycke Health Care AB)와 테가덤 (3M)으로 드레싱하였다. 실리콘 거즈는 폴리아마이드 재질의 거즈에 소프트실리콘이 코팅된 형태로 거즈의 기공들 사이에 세포현탁액을 머금고 있을 수 있다. 실리콘 거즈를 상처 크기보다 약간 큰 크기로 잘라 세포 현탁액이 접종된 피부 표면에 붙어주고 윗면을 테가덤으로 넓게 감싸주어 외부로부터 오염과 수분의 증발을 막아 환부를 습윤한 상태로 유지시켜 시술부위가 건조되는 것을 막는다. 시술 후 하루 2회씩 5일간 항생제 100 μl (세파졸린 5 mg/㎖)를 복강 주사하였다. 시술 1주일 혹은 2주일 후 시술부위에서 드레싱을 제거하고 환부의 오염원이나 염증 유무, 회복정도 및 색소 침착 여부를 판단하였다. 새로 형성된 누드 마우스 피부조직을 생검하여 10% 포르말린에서 고정한 후, 넣어준 색소세포를 관찰하기 위하여 헤마톡실린&에오신 (H&E) 염색을 실시하였다.
H&E 염색은 다음과 같이 실시하였다: 파라핀에 쌓여있는 조직을 절편하여 슬라이드에 붙인 다음, 슬라이드를 자일렌 (xylene)에 10분 동안 담궈 조직 주변의 파라핀을 제거하였다. 이어, 100%, 90%, 80% 및 70% 에탄올을 2분씩 순차적으로 처리하여 조직을 수화시킨 다음, 흐르는 물에 슬라이드를 10분 동안 수세하였다. 그런 다음, 헤마톡실린(Auto Hematoxylin, ResGen)을 5분 처리하여 핵을 염색하고, 슬라이드를 10분 동안 수세 하였다. 그리고 나서, 에오신 (Eosin, Sigma)을 1분 동안 처리하여 세포질을 염색한 다음, 슬라이드를 10분 동안 수세 하였다. 이어, 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올을 2분씩 순차적으로 처리하여 조직을 탈수시키고, 자일렌에 10분 동안 처리 하였다. 슬라이드의 조직이 있는 부분에 마운팅제(Shandon Synthetic Mountant, Thermo)를 한 방울 떨어뜨린 후 슬라이드커버를 붙여 마운팅 하였다.
모든 실험군과 대조군에서 환부의 오염이나 염증반응이 없었으며 소동물 실험시 문제가 되는 상처 수축이 거의 없이 초기 상처 크기가 유지 되었다. 이와 같은 결과는, 진피의 일부만을 제거함으로써, 진피층까지 제거하는 일반적인 총두께 상처주기 (full-thickness wound)에 비하여 상처수축이 적은 것으로 판단된다.
누드 마우스는 멜라닌세포를 가지고 있으나 멜라닌을 합성하지 않기 때문에 주입한 사람의 멜라닌세포는 멜라닌 색소로 인해 쉽게 판별이 가능하다. 실험군과 대조군 모두에서 정상적으로 피부조직이 재생되었으며 멜라닌세포 단독으로 넣어준 경우보다 각질세포를 함께 사용하였을 경우 더 많은 멜라닌세포가 기저층에서 관찰되었다 (도 4). 또한, 멜라닌세포와 섬유아세포를 함께 넣어준 경우, 더 많은 멜라닌세포가 기저층과 모낭 주변에서 관찰되었다(도 4). 각질세포는 표피재생을 촉진 할 뿐 아니라 멜라닌세포에게 필요한 성장인자 등을 제공하여 멜라닌세포의 부착을 돕는 것으로 판단된다. 이와 같은 결과로 멜라닌세포를 각질세포와 혼용하는 것이 표피가 제거된 피부에서 색소 재침착을 증진시킨다는 결론을 내릴 수 있다. 또한, 섬유아세포는 기저층의 형성과 표피층과 기저층간의 결합점인 반부착반점의 형성을 촉진하기 때문에, 멜라닌세포가 기저층에 부착되는 것을 돕는 것으로 판단된다.
육안 관찰결과 멜라닌세포에 각질세포와 섬유아세포를 함께 주입한 실험군 3의 2주일 경과 후 시술 부위가 주입한 사람 멜라닌세포로 인하여 회갈색 빛의 피부가 형성되어 있음을 볼 수 있었다 (도 5). 헤마톡실린&에오신 염색을 실시한 결과 배지만을 투여해준 음성대조군에서는 피부재생이 전체적으로 일어나 있고 재생된 피부표피층이 잘 분화되어 있었으나 멜라닌세포는 관찰되지 않았다. 반면, 멜라닌세포에 각질세포와 섬유아세포를 함께 넣어준 실험군 3에서 시술 1주일 후 멜라닌세포가 대부분 진피에서 발견되었으며 기저층에 자리잡은 멜라닌세포는 축색돌기를 형성하여 각질층으로 멜라닌을 전달하는 것을 확인하였다 (도 6). 같은 조건에서 2주일 후 진피에 존재하던 멜라닌세포가 기저층으로 이동하여 기저층 전층에 고르게 분포하고 있었으며 멜라닌을 각질세포로 활발하게 전달하고 있었다 (도 7). 이는 진피에 뭉쳐져서 존재하던 멜라닌세포가 시간이 지나면서 기저층으로 올라온 후 기저막을 따라 옆으로 이동하여 기저층 전체에 고르게 퍼진 후 멜라닌세포의 축색돌기를 통해 주변의 각질세포에게 멜라닌 전달하는 과정을 보여준다. 이러한 구조는 사람의 피부에서 보여지는 멜라닌유니트와 같은 구조로 마우스에 접종한 멜라닌세포에 의해 사람에서와 같이 색소가 침착된 피부가 형성되었음을 보여준다.
따라서, 백반증을 비롯한 색소질환을 가진 환자의 정상 피부조직에서 멜라닌세포를 분리, 배양하여 각질세포와 섬유아세포 등 다른 피부세포와 함께 현탁액의 형태로 백반증 부위에 투여하면, 위와 같은 색소 재침착의 효과를 얻을 수 있을 것으로 판단된다. 또한 이러한 동물 모델은 멜라노제네시스, 멜라닌세포와 각질세포의 상호작용, 미백이나 자외선차단제 등 기능성 화장품의 표능 평가의 전임상 모델로서 활용될 수 있다.
실시예 4: 색소화 피부 재구성 (Pigmented skin reconstruction)
피부 상피세포의 분화를 유도하는 주된 요인은 칼슘과 공기-건조 (air-dry) 상태이다. 3차원 배양은 콜라겐을 섬유아세포와 혼합하여 만든 진피층 위에 표피세포를 접종하여 배양하는 3차원적 배양법이다. 표피세포는 공기층과 물층의 중간에서 배양됨으로써 중층편평상피로 분화하며 각질화되고 멜라닌세포는 기저층에서 멜라닌을 합성하여 각질세포로 전달함으로써 멜라닌 유니트를 형성 인체 피부에서와 유사한 멜라닌세포를 포함한 피부 구조를 형성한다.
진피 대응물로서 콜라겐 혼합물을 준비하였다. 콜라겐 혼합물은 타입 I 콜라겐 (Nitta), 10 x E-배지 (DMEM : F12 를 3:1 로 혼합한 배지) 및 재구성 완충액(2.2 g NaHCO3와 4.77 g HEPES 을 0.05 N NaOH 용액 100 ㎖에 녹인 완충액)을 8:1:1의 비율로 혼합하여 준비하였다. 진피 대응물의 제조는 4℃에서 실시하였고, 이는 콜라겐의 겔화를 막기 위한 것이다. 한편, 0.6 cm2 Millicell (Millipore, Inc)을 24-웰에 필요한 만큼 준비해 두었다. 섬유아세포를 배양접시로부터 회수하여 1.5 x 105 cells/㎖의 농도로 콜라겐 혼합물에 현탁하였다. 이 과정에서 섬유아세포의 수를 측정하고, 원침하여, 먼저 배지에 현탁하는데 이때 배지의 부피가 콜라겐 혼합물의 10%가 넘지 않도록 맞춘 후 다시 콜라겐 혼합물에 현탁하였다. 200 μl의 콜라겐 혼합물을 Millicell에 부어 주고, 37℃ 배양기에 플레이트를 옮겨 콜라겐 혼합물을 30분-1시간 동안 고형화시켰다. 콜라겐 혼합물 위에 E-배지 (DMEM : F12 를 3:1 로 혼합한 배지)를 200 μl 넣고 Millicell 밖에 배지를 넣어 안팎의 높이를 맞추었다. 24시간 배양 후 진피대응물의 윗부분을 기저막의 성분인 타입 IV 콜라겐과 라미닌으로 코팅하여 멜라닌세포와 각질세포의 부착을 돕는다. 콜라겐 0.2 mg/㎖과 라미닌 30 μg/㎖ 혼합액 20 ㎕로 37℃ 1시간 동안 반응시켜 표면을 코팅하였다.
이어, 각질세포와 멜라닌세포를 각각 트립신 처리하여 배양 접시로부터 회수한 후 수를 측정하고 원침하여 1:10으로 혼합하여 코팅된 콜라겐 진피위에 각각 3 x 105 cells/㎠ 및 3 x 104 cells/㎠의 농도로 동시에 접종하였다. 각질세포와 멜라닌세포는 4시간 정도면 진피대응물의 윗면에 부착되었으며, 배지교환은 2-3일에 한 번 씩 하며 7일 동안 배양하였다. 멜라닌세포와 각질세포가 진피대응물의 윗부분에 고르게 자라면 표피층이 물과 공기의 접촉면에서 배양이 되도록 표피층 위의 배지를 제거하고, 진피대응물 높이를 맞추어 Millicell 밖에 배지를 넣어주어 14일 동안 공기-건조 상태에서 배양 하였다.
도 8 및 도 9에서 볼 수 있듯이, 14일 동안 공기-건조 배양 후 육안관찰 결과, 각질세포만으로 재구성된 피부에 반하여 각질세포와 멜라닌세포를 함께 접종한 경우 갈색의 멜라닌색소가 침착된 피부 형성을 확인할 수 있었다. 또한 이를 절편하여 조직 염색 한 결과, 각질세포가 실제 사람피부와 같은 형태로 분화하여 각질화된 피부를 형성하고 있으며 멜라닌 세포는 각질화된 피부의 기저층에 부착하여 멜라닌을 합성하고 이를 분화한 각질세포로 전달하고 있음을 확인 할 수 있었다.
배양 결과, 멜라닌세포는 기저층에 위치하고 멜라닌을 합성하여 각질세포층 쪽으로 전달하는 멜라닌 유니트가 관찰되었다. 따라서, 멜라닌세포를 포함하는 인간 피부-유사 구조를 인 비트로에서 구축할 수 있음을 알 수 있으며, 이는 동물실험 모델을 대체할 수 있다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 색소화 질환의 치료용 세포치료 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 색소화 피부 재구성 모델을 제공한다. 본 발명의 세포치료 조성물은, 색소화 질환에 대한 최초의 세포치료제로서, 유효성분으로서 멜라닌세포와 각질세포 또는 멜라닌세포와 섬유아세포를 이용함으로써 우수한 색소 침착 효능을 달성함으로써 백반증과 같은 저색소화에 따른 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 멜라닌세포, 각질세포 및 섬유아세포를 유효성분으로 포함하며, 상기 섬유아세포의 수는 1 x 103 - 1 x 107 cells/cm2인 색소화 질환 (pigmentation disorders)의 치료용 세포치료 (cell therapy) 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 멜라닌세포, 각질세포, 섬유아세포 또는 멜라닌세포, 각질세포와 섬유아세포는 체외 분리 또는 체외 분리 후 배양된 것을 특징으로 하는 색소화 질환의 치료용 세포치료 약제학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 색소화 질환은 저색소화증 (hypopigmentation), 부분 백피증 (piebaldism), 점상 백피증 (leukoderma), 화학물질에 의한 백피증(leukoderma), 백색 비강진 (piryriasis alba), 탈색소 모반, 염증 후 탈색증 또는 백반증인 것을 특징으로 하는 색소화 질환의 치료용 세포치료 약제학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물에서 상기 멜라닌세포의 수는 1 x 103 - 1 x 106 cells/cm2이고, 상기 각질세포의 수는 1 x 104 - 1 x 107 cells/cm2 이고, 상기 섬유아세포의 수는 1 x 103 - 1 x 106 cells/cm2인 것을 특징으로 하는 색소화 질환의 치료용 세포치료 약제학적 조성물.
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