ES2625768T3 - Método de reconstrucción de piel - Google Patents

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ES2625768T3 ES15305441.6T ES15305441T ES2625768T3 ES 2625768 T3 ES2625768 T3 ES 2625768T3 ES 15305441 T ES15305441 T ES 15305441T ES 2625768 T3 ES2625768 T3 ES 2625768T3
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Vincent Casoli
Muriel Cario-André
Jean-Christophe Lepivert
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Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux
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Abstract

Método de preparación de un sustituto de piel que comprende las siguientes etapas: a. cultivo de fibroblastos en un medio M1 de cultivo de fibroblastos; b. siembra de una matriz que comprende colágeno con fibroblastos obtenidos en la etapa a; c. cultivo de los fibroblastos sembrados en la matriz que comprende colágeno en un medio M2 de cultivo de fibroblastos, formando la matriz y los fibroblastos cultivados un sustituto de dermis; d. cultivo de melanocitos en un medio M3 de cultivo de melanocitos; e. cultivo de queratinocitos en un medio M4 de cultivo de queratinocitos; f. mezcla de melanocitos obtenidos en la etapa d con queratinocitos obtenidos en la etapa e; g. siembra del sustituto de dermis obtenido en la etapa c con la mezcla obtenida en la etapa f; h. cultivo del sustituto de dermis sembrado en la etapa g en un medio M5 de cultivo de piel formando de ese modo el sustituto de piel. en el que el medio M2 comprende ácido ascórbico o un ascorbato, el medio M5 comprende ácido hialurónico o un hialuronato o un derivado de los mismos, y la siembra en la etapa g se realiza con una proporción (queratinocitos + melanocitos)/fibroblastos de 9 a 19.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de reconstruccion de piel Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un metodo de preparacion de un sustituto de piel, a un sustituto de piel animal, preferentemente de mamifero y/o de ser humano, que puede obtenerse realizando el metodo y a un kit para la realizacion del metodo.
La presente invencion tambien se refiere a un injerto constituido por un sustituto de piel y su utilizacion como medio de tratamiento de un trastorno cutaneo y/o de una perdida de sustancia cutanea.
La presente invencion encuentra una aplicacion en particular en los campos farmacologico, medico, clinico.
En la descripcion que sigue a continuacion, las referencias entre corchetes ([ ]) envian de nuevo a la lista de referencias presentadas al final del texto.
Estado de la tecnica
La piel es un organo muy complejo que comprende una estructura estratificada muy particular. Esta comprende tres partes principales:
- una parte superficial, la mas fina, denominada epidermis,
- una parte interna mas gruesa, la dermis, a la que se une la epidermis, y
- una capa mas profunda, la hipodermis.
En particular asegura una barrera entre los medios externos y el medio interno de numerosos mamiferos, entre los cuales en particular el ser humano. Debido a esta funcion de « barrera », la piel asegura de manera natural la proteccion del organismo al tiempo que asegura una comunicacion entre el mismo y el entorno externo. La piel constituye el primer organo de defensa con respecto a cualquier agresion.
Las agresiones sufridas por la piel son multiples, por ejemplo se puede tratar de agresiones relacionadas con U.V. susceptibles de comportar reacciones inflamatorias/alteraciones celulares que son el origen de canceres, agresiones fisicas tales como quemaduras, escarificaciones, por ejemplo debidas a objetos cortantes, agresiones quimicas, por ejemplo relacionadas con productos quimicos, tales como detergentes. Estas diferentes agresiones pueden inducir en particular trastornos cutaneos susceptibles de modificar la estructura de la piel, de alterar su coloracion y/o de provocar la aparicion de heridas cutaneas.
De hecho se sabe que los productos quimicos y/o moleculas tales como la hidroquinona, cuando se usan a dosis elevadas puede inducir una fuerte despigmentacion, provocar cicatrices, estrias, patologias graves, por ejemplo, diabetes, hipertension, canceres de piel o complicaciones sistemicas, trastornos renales, un desarrollo de pilosidad y producir barba y una alteracion del olor corporal. Cuando la decoloracion va mas alla del efecto deseado estas consecuencias pueden ser irreversibles. La solucion principal sigue siendo entonces el injerto de piel para tratar de « encontrar » un aspecto normal.
Otros elementos pueden estar en el origen de una alteracion de la piel, por ejemplo de los parametros de orden genetico y/o relacionados con trastornos endocrinos y/o autoinmunes sistemicos. En particular se puede tratar de patologias que provocan un trastorno pigmentario tal como vitiligo, hipermelanosis, hipomelanosis o un nevus. Uno de los metodos de tratamiento de los trastornos de este tipo incluye injerto de piel y/o implante de celulas de pigmentarias. Sin embargo, estos metodos presentan eficacias relativas o relacionadas a menudo con la estabilidad de las pieles y/o celulas pigmentarias aplicadas.
La piel tambien se puede lesionar, por ejemplo, mediante factores externos tales como objetos cortantes, que provocan heridas mas o menos profundas. La piel presenta capacidades de regeneracion y de cicatrizacion muy significativas que permiten, la mayoria de las veces, una cicatrizacion a mayor o menor plazo. El tiempo y/o la capacidad de cicatrizacion dependeran en particular de la profundidad/extension de la herida y tambien del estado fisiologico del individuo. De hecho, en el caso de heridas profundas, estas pueden representar « puertas abiertas » para los patogenos que requieren una mayor vigilancia y/o la necesidad de cirugia para cerrar la herida, por ejemplo, con puntos de sutura o aplicando en la misma un injerto de piel para permitir en particular que la piel se regenere, en particular para reparar diferentes partes lesionadas.
En el estado de la tecnica existen sustitutos de dermis artificiales que en particular permiten de manera temporal la formacion de un entorno favorable para la regeneracion de la piel. La estructura y el entorno constituidos por estos sustitutos a menudo son similares a los de la dermis. Sin embargo, estos sustitutos son dispositivos medicos, esencialmente sinteticos y de coste elevado.
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En el estado de la tecnica tambien existen sistemas de cultivos celulares, en particular queratinocitos, obtenidos a partir de una muestra de piel de un individuo que despues de varias semanas forma de un cultivo que se puede depositar/vaporizar sobre una herida, por ejemplo, una herida cronica o una quemadura para favorecer su cicatrizacion.
La patente de Estados Unidos N.° 5 755 814 describe por ejemplo un metodo para preparar un modelo de piel que comprende la provision de una matriz tridimensional de colageno reticulado, la siembra de la matriz con fibroblastos y cultivo de dicha matriz sembrada, la siembra de la superficie de la matriz con las celulas epidermicas, una primera etapa de cultivo en condiciones que permitan la union de las celulas epidermicas y su proliferacion con el fin de formar una capa, y una segunda etapa de cultivo.
Sin embargo, estos metodos y alternativas no se constituyen como sustitutos de piel que comprenden las celulas mayoria que componen la piel, tales como fibroblastos, queratinocitos y melanocitos. En particular, estos sustitutos no comprenden melanocitos y por lo tanto no permiten obtener sustitutos de piel pigmentados y/o susceptibles de ser pigmentados. Por otra parte, estas alternativas no se pueden utilizar por ejemplo para el tratamiento de trastornos pigmentarios, el tratamiento de heridas profundas, por ejemplo, debidas a intervenciones quirurgicas, accidentes que provoquen por ejemplo una perdida significativa de la piel que puede ir hasta la perdida total de la piel.
Ademas, los metodos de obtencion de los sustitutos de dermis disponibles son metodos « lentos » que no permitir, por ejemplo, la obtencion de sustitutos en plazos compatibles para el tratamiento de heridas especificas tales como quemaduras profundas.
Por ultimo, la mayoria de los sustitutos de la piel disponibles en el mercado son productos fragiles tanto a nivel estructural como epidemiologico. Ademas, estos productos a menudo son de pequeno tamano, en particular para evitar un posible desgarro del producto durante su manipulacion.
Por lo tanto, existe una necesidad real de encontrar un metodo de preparacion de un sustituto de piel para superar estas deficiencias, inconvenientes y obstaculos de la tecnica anterior, en particular un metodo que permita obtener un sustituto de piel que comprende las celulas mayoria que componen de la piel, en particular fibroblastos, queratinocitos y melanocitos, para reducir los costes y el tiempo de preparacion del sustituto.
Tambien existe una necesidad real en el estado de la tecnica de encontrar un metodo que permita la produccion de un modelo de piel reproducible y fiable.
Ademas existe una necesidad real de encontrar un nuevo sustituto de piel que se pueda utilizar para el tratamiento de trastornos cutaneos y/o perdidas de sustancia cutanea.
Todavia existe una necesidad real de encontrar un nuevo sustituto de piel que se pueda manipular facilmente y que no represente un alto riesgo de desgarro durante su manipulacion.
Descripcion de la invencion
Precisamente, la presente invencion tiene como objeto responder a esta necesidad proporcionando un metodo de preparacion de un sustituto de piel que comprende las siguientes etapas:
a. cultivo de fibroblastos en un medio M1 de cultivo de fibroblastos;
b. siembra de una matriz que comprende colageno con fibroblastos obtenidos en la etapa a;
c. cultivo de los fibroblastos sembrados en la matriz que comprende colageno en un medio fibroblastos, formando la matriz y los fibroblastos cultivados un sustituto de dermis;
d. cultivo de melanocitos en un medio M3 de cultivo de melanocitos;
e. cultivo de queratinocitos en un medio M4 de cultivo de queratinocitos;
f. mezcla de melanocitos obtenidos en la etapa d con queratinocitos obtenidos en la etapa e;
g. siembra del sustituto de dermis obtenido en la etapa c con la mezcla obtenida en la etapa f;
h. cultivo del sustituto de dermis sembrado en la etapa g en un medio M5 de cultivo de piel modo el sustituto de piel.
en el que el medio M2 comprende acido ascorbico o un ascorbato, el medio M5 comprende acido hialuronico o un hialuronato y la siembra en la etapa g se realiza con una proporcion (queratinocitos + melanocitos)/fibroblastos de 9 a 19.
En la presente, el termino "comprender" puede significar del mismo modo "incluir", "contener" o "englobar" por una parte asi como "constituir" o "consistir en" por otra parte.
En la presente, el sustituto de dermis obtenido de acuerdo con el metodo de la invencion es un tejido completo que reproduce las caracteristicas de una dermis in vivo, es decir, que comprende macromoleculas de tipo proteico, en
M2 de cultivo de
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particular fibras de colagena, glucosaminoglucanos, proteinas y fibroblastos funcionales.
En la presente, el sustituto de piel obtenido de acuerdo con el metodo de la invencion es un tejido completo que reproduce las caracteristicas de una piel in vivo, es decir, que comprende un epitelio pluriestratificado queratinizado que comprende queratinocitos que reproduce un estrato basal, un estrato espinoso, un estrato granuloso y un estrato corneo histologicamente normales, melanocitos basales en contacto con un sustituto de dermis que contiene fibroblastos funcionales.
En la presente, todos los fibroblastos, melanocitos, queratinocitos susceptibles de ser utilizados en el metodo de la invencion pueden ser fibroblastos, melanocitos, queratinocitos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar de fibroblastos, melanocitos y/o de queratinocitos obtenidos a partir de bancos de celulas que provienen, por ejemplo de la Coleccion Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur, N.° 25 de la calle Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15. Tambien se puede tratar de fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos disponibles en el mercado, por ejemplo las celulas comercializadas por la compania Thermofischer scientific, la compania CelInTec o la compania Promocell. Tambien se puede tratar de de fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos aislados a partir de una muestra biologica de un animal, preferentemente un mamifero y/o de un ser humano, previamente aislada. Los fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos pueden ser fibroblastos, melanocitos, queratinocitos aislados independientemente de una biopsia o varias biopsias. Los fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos se pueden aislar independientemente de una biopsia o varias biopsias de un individuo, preferentemente un mamifero y/o un ser humano, con fines de un injerto de dicho sustituto de piel sobre dicho paciente. De manera independiente se puede tratar de fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos autologos o heterologos de un individuo.
En la presente, de manera ventajosa al menos dos tipos celulares entre los tres tipos celulares representados por los fibroblastos, melanocitos et queratinocitos son autologos de un individuo.
En un modo de realizacion en particular, los fibroblastos, melanocitos y queratinocitos son de manera ventajosa celulas autologas de un individuo.
Los fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos se pueden aislar independientemente de una biopsia o varias biopsias que provienen, por ejemplo de una piel de raza blanca, asiatica o africana, de diferentes sitios anatomicos, por ejemplo de la espalda, cara, pecho, dorso de las manos, palmas de un ser humano.
De manera independiente se puede tratar de fibroblastos, melanocitos y/o de queratinocitos aislados independientemente de biopsias de piel, preferentemente de un ser humano, que presenta una o varias patologias cutaneas, por ejemplo manchas de envejecimiento (lentigo actinico), melasma, vitiligo, nevus o melanoma.
Tambien se puede tratar de de fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos independientemente modificados por via genetica, por ejemplo con retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno asociados (AAV). Por ejemplo, se puede tratar de fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos que sobreexpresan independientemente al menos una proteina, por ejemplo una proteina elegida entre el colageno VII, las queratinas 5, 14, y/o que subexpresan al menos una proteina, por ejemplo a traves de la tecnica ARN horquillado corto (ARNsh) o ARN de interferencia corto (ARNsi), por ejemplo el colageno VII. Por ejemplo, se puede tratar de fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos independientemente modificados por via genetica tal como se describe en Pendaries V et al., JID 2012 [1]; Petek LM et al., Mol ther 2010 [2]. Por ejemplo, se puede tratar de fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos independientemente modificados por via genetica o no, por ejemplo la celula Ker-CT identificada con la referencia CRL-4048 de la ATCC, la celula TeICOFS02MA con la referencia CrL-4005 de la ATCC.
Tambien se puede tratar de de fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos obtenidos de la linea celular, por ejemplo la linea de queratinocitos HaCaT, la linea de fibroblastos WS1.
De manera preferente, los fibroblastos susceptibles de ser utilizados no comprenden fibroblastos irradiados 3T3.
Tambien se puede tratar de fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos obtenidos de manera independiente a partir de celulas madre adultas, celulas madre pluripotentes inducidas, por ejemplo mediante mantenimiento de dichas celulas madre adultas y/o de celulas madre pluripotentes inducidas por ejemplo mediante la introduccion de genes Oct3/4,Sox 2, KLF4, c-Myc y a continuacion diferenciadas gracias cocteles de factores, por ejemplo acido retinoico y/o BMP-4, en una linea celular. Tambien se puede tratar de celulas madre adultas y/o celulas madre pluripotentes inducidas mediante tecnicas no virales basadas en la utilizacion de nanoparticulas, por ejemplo nanoparticulas de poliamidoamina terminadas con arginina. El experto en la materia, a partir de sus conocimientos generales, sabra elegir el metodo y/o las celulas. Por ejemplo, se puede tratar de fibroblastos, melanocitos y/o queratinocitos obtenidos con el metodo que se describe en Kogut et al., Methods Mol Biol 2014 [3], en Ohta et al., Methods Mol Biol, 2013 [4], y/o en Revilla et al., J Tissue Eng Regen Med, 2015 [5].
En la presente, por medio M1 de cultivo de fibroblastos se hace referencia a cualquier medio conocido por el experto en la materia adaptado para el cultivo de fibroblastos. Por ejemplo, se puede tratar de un medio disponible en el
mercado, por ejemplo un medio: medio esencial minimo de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) comercializado por la compania Gibco que comprende en particular una mezcla de aminoacidos, vitaminas, sales inorganicas de azucares, por ejemplo glucosa, o un medio Fibrolife comercializado por la compania Cell Systems
5 Tabla 1: composicion del medio: medio esencial minimo de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM)
Composicion
Concentracion (mg/l)
Aminoacidos
Glicina
84
Clorhidrato de L-arginina
84
L-Cistina 2HCl
63
L-Glutamina
580
Clorhidrato de L-histidina-H2O
42
L-Isoleucina
105
L-Leucina
105
Clorhidrato de L-lisina
146
L-Metionina
30
L-Fenilalanina
66
L-Serina
42
L-Treonina
95
L-Triptofano
16
L-Tirosina
72
L-Valina
94
Vitaminas
Cloruro de colina
4
Pantotenato de D-calcio
4
Acido Folico
4
Niacinamida
4
Clorhidrato de piridoxina
4
Riboflavina
0,4
Clorhidrato de Tiamina
4
i-Inositol
7,2
Sales inorganicas
Cloruro de Calcio (CaCl2-2H2O)
264
Nitrato Ferrico (Fe(NO3)3"9H2O)
0,1
Sulfato de Magnesio (MgSO4-7H2O)
200
Cloruro de Potasio (KCI)
400
Bicarbonato de Sodio (NaHCO3)
3700
Cloruro de Sodio (NaCl)
6400
Fosfato de Sodio monobasico (NaH2PO4-2H2O)
141
Otros compuestos
D-Glucosa (Dextrosa)
1000
Piruvato Sodico
110
En la presente, el medio M1 puede comprender ademas complementos, en particular suero de ternero fetal (SVF).
En la presente, el medio M1 puede comprender por ejemplo de un 5 a un 15 % en peso, de un 7,5 a un 12,5 % en 10 peso, 10 % en peso de suero de ternero fetal (SVF) con respecto al peso total del medio.
En la presente, el medio M1 puede comprender al menos un compuesto antifungico y/o antibiotico. Por ejemplo, se puede tratar de cualquier compuesto antifungico y/o antibiotico conocido por el experto en la materia y/o disponible en el mercado. Por ejemplo, se puede tratar de al menos un compuesto antifungico elegido entre el grupo que 15 comprende Anfotericina B, ketoconazol y una mezcla de los mismos. Por ejemplo, se puede tratar de al menos un compuesto antibiotico elegido entre el grupo que comprende penicilina, estreptomicina, ciprofloxacina y una mezcla de los mismos.
En la presente, el medio M1 puede comprender de un 0,1 a un 10 % en peso, de un 5 a un 5 % en peso, 1 % en 20 peso de antifungico con respecto al peso total del medio.
En la presente, el medio M1 puede comprender de un 0,1 a un 10 % en peso, de un 5 a un 5 % en peso, 1 % en peso de antibioticos con respecto al peso total del medio.
25 En la presente el medio M1 y/o el conjunto de sus componentes puede(n) ser de calidad clinica.
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Por « de calidad clfnica » en la presente se hace referenda al hecho que el componente o el medio haya sido reconocido por la autoridad competente, adaptado para una utilizacion en clfnica en un territorio dado.
En la presente, la etapa a. de cultivo de fibroblastos se puede realizar a una temperatura comprendida de 30 a 40 °C, de 35 a 39 °C, igual a 37 °C.
En la presente, la duracion del cultivo de fibroblastos de la etapa a. puede comprender de 5 a 21 dias, de 5 a 15 dias, de 8 a 15 dias.
En la presente, la duracion del cultivo de fibroblastos de la etapa a. se puede realizar en una atmosfera controlada que comprende de un 5 a un 10 % de CO2, por ejemplo en una atmosfera que comprende al menos un 5 % de CO2.
De acuerdo con la invencion, la etapa a. de cultivo de fibroblastos se puede realizar en un autoclave a una temperatura de 30 a 40 °C, de 32 a 40 °C, igual a 37 °C y en una atmosfera controlada que comprende al menos un 5 % de CO2.
De acuerdo con la invencion, la etapa a. de cultivo de fibroblastos se puede realizar en cualquier recipiente de cultivo adaptado conocido por el experto en la materia. Se puede tratar de una placa de Petri, un matraz de cultivo con una capacidad de 25 a 75 cm2, de 25, 75 o 175 cm2.
De acuerdo con la invencion, los fibroblastos obtenidos por cultivo de acuerdo con la etapa a. pueden formar una capa de celulas de confluencia en el recipiente de cultivo. Por ejemplo, los fibroblastos pueden tener de un 70 a un 100 % de confluencia, preferentemente un 100 % de confluencia.
De acuerdo con la invencion, cuando el cultivo de acuerdo con la etapa a. corresponde a una capa de celulas de confluencia o no, el metodo puede comprender ademas:
- una etapa a’ de eliminacion del medio de cultivo, aclarado de las celulas con una solucion, eliminacion de la solucion de aclarado,
- una etapa a" de separacion de las celulas por tripsinizacion, y
- una etapa a’" de sedimentacion o centrifugacion.
De acuerdo con la invencion, en la etapa a’ la eliminacion del medio de cultivo se puede realizar mediante cualquier metodo conocido por el experto en la materia adaptado. Por ejemplo, se puede tratar de una aspiracion del medio, un cambio del contenido con el fin de eliminar el medio de cultivo.
De acuerdo con la invencion, en la etapa a’ el aclarado de las celulas se puede realizar mediante cualquier metodo conocido por el experto en la materia, por ejemplo, mediante inmersion, aspersion, incubacion de las celulas en una solucion de aclarado.
En la presente, por solucion de aclarado se hace referencia a cualquier solucion de aclarado de celulas conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar una solucion tampon HBSS (Solucion Salina Equilibrada de Hank) a pH comprendido de 7,2 a 7,4.
Tabla 2: composicion del medio HBSS
Compuestos
Peso molecular Concentracion (mg/l) mM
Sales inorganicas
Cloruro de potasio
75 400 5,333335
Fosfato de potasio monobasico (KH2PO4)
136 60 04411
Bicarbonato de Sodio
84 350 4.16
Cloruro de sodio
58 8000 137.93
Fosfato de Sodio dibasico anhidro (Na2HPO4)
142 48 0,338
Otros compuestos
D glucosa (Dextrosa)
180 1000 5,55
Rojo fenolico
376,4 10 0,0265
Tambien se puede tratar de una solucion tampon disponible en el mercado, por ejemplo un tampon fosfato salino (PBS), una solucion equilibrada de Hank comercializada respectivamente por la compania Gibco, Sigma Aldrich, Lonza.
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De acuerdo con la invencion, en la etapa a’ la eliminacion de la solucion de aclarado se puede realizar con cualquier metodo conocido por el experto en la materia adaptado. Por ejemplo, se puede tratar de una aspiracion de la solucion de aclarado, de un cambio del contenido con el fin de eliminar la solucion de aclarado.
De acuerdo con la invencion, la etapa a" de tripsinizacion se puede realizar por inmersion de las celulas en una solucion tampon (ST) que comprende tripsina, seguido por la adicion de Suero de Ternero Fetal (SVF) con el fin de detener la reaccion enzimatica.
De acuerdo con la invencion, la solucion tampon (ST) puede ser cualquier solucion tampon conocida por el experto en la materia susceptible de ser utilizada en un metodo de tripsinizacion. Por ejemplo, se puede tratar de un tampon fosfato salino (PBS), de una solucion equilibrada de Hank comercializada respectivamente por la compania Gibco, Sigma Aldrich, Lonza.
De acuerdo con la invencion la cantidad de tripsina anadida en la solucion tampon (ST) de esta comprendida entre un 0,01 y un 0,05 % en peso con respecto al peso total.
De acuerdo con la invencion la duracion de la incubacion en la solucion tampon que comprende tripsina antes de anadir SVF en la solucion tampon (ST) puede comprender entre 2 y 10 min.
De acuerdo con la invencion la cantidad de SVF anadida en la solucion tampon (ST) puede comprender de un 5 a un 20 % en volumen con respecto al volumen total.
De acuerdo con la invencion, la etapa a’" de sedimentacion se puede realizar mediante cualquier metodo conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar de una sedimentacion o una centrifugacion a una velocidad de 800 a 1400 vueltas por minuto, por ejemplo igual a 1200 vueltas por minuto.
De acuerdo con la invencion, la etapa a’" de centrifugacion se puede realizar durante un periodo de tiempo de 4 a 10 min por ejemplo igual a 5 minutos.
De acuerdo con la invencion, la etapa a’" de sedimentacion se puede realizar con cualquier dispositivo conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar de una centrifugadora giratoria comercializada por las companias Eppendorf o Jouan.
En la presente por « matriz que comprende colageno » se hace referencia a cualquier matriz que comprende colageno conocida por el experto en la materia susceptible de siembra con celulas. Por ejemplo, se puede tratar de una matriz de colageno que corresponde a un gel de colageno de tipo I no estirado, preferentemente que no impone una organizacion preferente de los fibroblastos tal como se describe en Bell et al., 1979 [6]. Por ejemplo, se puede tratar de una matriz con una densidad / concentracion de colageno, preferentemente colageno de tipo I, con una superficie de 25 a 500 cm2. Por ejemplo, se puede tratar de una matriz que comprende colageno disponible en el mercado, por ejemplo, se puede tratar de una matriz que comprende colageno comercialidad por la compania Integra.
De manera ventajosa, la matriz que comprende colageno puede ser una matriz de regeneracion dermica. La matriz de regeneracion dermica se puede elegir en particular entre las matrices comercializadas con las denominaciones Integra (marca registrada) y Matriderm (marca registrada) por las companias Integra Life Science Corporation y MedSkin Solutions Dr. Suwelack AG respectivamente. De manera ventajosa, y a diferencia de las otras matrices que comprenden colageno, las matrices de regeneracion dermica tales como las mencionadas anteriormente ya estan modeladas, lo que favorece a la reconstruccion del equivalente de piel.
En un modo de realizacion, la matriz que comprende colageno puede ser una matriz que comprende colageno reticulado y al menos un glucosaminoglucano, por ejemplo 6-sulfato de condroitina. Por ejemplo, se puede tratar de la matrice Integra (marca registrada) comercializada por la compania Integralife Sciences y/o de la matriz obtenida de acuerdo con el metodo que se describe en el documento de Boyce ST et al., 1988 [7].
En otro modo de realizacion, la matriz que comprende colageno puede ser una matriz que comprende fibras de colageno de estructura nativa y de elastina. Por fibras de colageno de estructura nativa se hace referencia en particular a fibras no reticuladas quimicamente. Por ejemplo, se puede tratar de la matriz Matriderm comercializada por la compania MedSkin Solutions Dr. Suwelack AG y/o de la matriz obtenida de acuerdo con el metodo que se describe en el documento de Hafemann et al., Burns 1999 [8].
En la presente, el espesor de la matriz que comprende colageno puede ser de 1,0 a 3,0 mm (extremos incluidos) antes de la siembra con los fibroblastos. En un modo de realizacion en particular, el espesor de la matriz que comprende colageno puede ser estrictamente superior a 1,0 mm antes de la siembra con los fibroblastos.
En la presente, la siembra de la etapa b se puede realizar mediante cualquier metodo conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar de una aplicacion, por ejemplo por aspersion de un medio de cultivo que
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comprende los fibroblastos sobre la matriz, mediante deposito por trasplante de las celulas sobre la matriz, mediante deposicion de un medio de cultivo que comprende las celulas en suspension, mediante impresion 3D por ejemplo tal como se describe en Wonhye Lee et al., « Multi-layered culture of human skin fibroblasts and keratinocytes through three-dimensional freeform fabrication." Biomaterials, 2009, Mar; 30 (8): 1587-95 [7].
En la presente, cuando la etapa a comprende la etapa a", el metodo de la invencion puede comprender, antes de la etapa b de siembra, una etapa b1 de resuspension de las celulas centrifugadas en el medio M1.
En la presente, la siembra de la etapa b de una matriz que comprende colageno se puede realizar a una densidad de 20 000 a 50 000 fibroblastos/cm2, preferentemente de 30 000 fibroblastos/cm2 de superficie de la matriz que comprende colageno. En un modo de realizacion en particular, la densidad de fibroblastos puede ser estrictamente inferior a 50 000 fibroblastos / cm2 de matriz que comprende colageno.
En la presente el medio M2 de cultivo de fibroblastos puede ser cualquier medio conocido por el experto en la materia adaptado para el cultivo de fibroblastos que comprende ademas de acido ascorbico o ascorbato. Por ejemplo, se puede tratar de un medio disponible en el mercado, por ejemplo un medio: medio esencial minimo de Eagle Modificado con Dulbecco (DMEM) que comprende en particular una mezcla de aminoacidos, vitaminas, sales inorganicas de azucares, por ejemplo glucosa, que comprende ademas de acido ascorbico o ascorbato.
En la presente, el medio M1 puede comprender ademas complementos, en particular suero de ternero fetal (SVF).
En la presente, el medio M2 puede comprender de un 5 a un 15 % en peso, de 7,5 a 12,5 % en peso, 10 % en peso de suero de ternero fetal (SVF) con respecto al peso total del medio.
En la presente, el medio M2 puede comprender al menos un compuesto antifungico y/o antibiotico. Por ejemplo, se puede tratar de cualquier compuesto antifungico y/o antibiotico conocido por el experto en la materia y/o disponible en el mercado. Por ejemplo, se puede tratar de al menos un compuesto antifungico elegido entre el grupo que comprende Anfotericina B, ketoconazol y una mezcla de los mismos. Por ejemplo, se puede tratar de al menos un compuesto antibiotico elegido entre el grupo que comprende penicilina, estreptomicina, ciprofloxacina y una mezcla de los mismos.
En la presente, el medio M2 puede comprender de un 0,1 a un 10 % en peso, de un 5 a un 5 % en peso, 1 % en peso de antifungico con respecto al peso total del medio.
En la presente, el medio M2 puede comprender de un 0,1 a un 10 % en peso, de un 5 a un 5 % en peso, igual a un 1 % en peso de antibioticos con respecto al peso total del medio.
En la presente, el medio M2 comprende acido ascorbico o ascorbato o un derivado de los mismos. Por ejemplo, el medio M2 puede comprender acido ascorbico o ascorbato a una concentracion de 20 a 60 mg.ml-1, por ejemplo de 30 a 55 mg.ml-1, igual a 50 mg.ml-1.
De manera ventajosa, el acido ascorbico permite en particular favorecer la remodelacion de la matriz que comprende colageno estimulando la sintesis de colageno por los fibroblastos.
En la presente el medio M2 y/o el conjunto de sus componentes puede(n) ser de calidad clinica.
En la presente, la etapa c. de cultivo de fibroblastos se puede realizar a una temperatura comprendida de 30 a 40 °C, de 35 a 39 °C, igual a 37 °C.
En la presente, la duracion del cultivo de la etapa c. de fibroblastos puede ser de 5 a 12 dias, de 7 a 10 dias.
En la presente, el cultivo de la etapa c. de fibroblastos se puede realizar en una atmosfera controlada que comprende al menos un 5 % de CO2.
En la presente, la etapa c. de cultivo de fibroblastos sembrados en la matriz que comprende colageno puede comprender:
- una primera etapa c’ de cultivo de 18 a 28 horas en presencia de un medio M21 de cultivo de fibroblastos que no comprende ni acido ascorbico ni ascorbato, y
- una segunda etapa c’’ de cultivo, de al menos 2 dias en presencia de un medio M22 de cultivo de fibroblastos que comprende acido ascorbico o un ascorbato o un derivado de los mismos.
En este modo de realizacion, el medio M21 de cultivo de fibroblastos corresponde al medio M2 tal como se ha definido anteriormente que no comprende ni acido ascorbico ni ascorbato ni derivado de los mismos. En la presente el medio M21 y/o el conjunto de sus componentes puede(n) ser de calidad clinica.
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En este modo de realizacion, el medio M22 de cultivo de fibroblastos corresponde al medio M2 tal como se definido anteriormente que comprende acido ascorbico o un ascorbato o un derivado de los mismos. En la presente el medio M22 y/o el conjunto de sus componentes puede(n) ser de calidad clinica.
En la presente, la etapa c’ de cultivo se puede realizar a una temperatura comprendida de 30 a 45 °C, de 35 a 39 °C, igual a 37 °C.
En la presente, la duracion del cultivo de la etapa c’ puede ser de 19 a 27 horas, por ejemplo de 24 horas.
En la presente, la etapa c’’ de cultivo se puede realizar a una temperatura comprendida de 30 a 40 °C, de 35 a 39 °C, igual a 37 °C.
En la presente, la duracion del cultivo de la etapa c’’ puede comprender entre 5 a 12 dias, igual a 7 dias.
Los inventores tambien han demostrado de manera ventajosa que la matriz y los fibroblastos cultivados obtenidos en la etapa c. forman una estructura que corresponde a un sustituto de dermis.
De manera ventajosa, los inventores tambien han demostrado que la etapa c’ de cultivo corresponde a una etapa de adhesion y de colonizacion de la matriz por los fibroblastos y la etapa c" permite de manera ventajosa una remodelacion de la matriz que comprende los fibroblastos con el fin de formar un sustituto de dermis. En particular sucesion de las etapas c’ y c" con la utilizacion respectivamente de los medios M21 y M22 permitira formar de manera ventajosa un sustituto de dermis en el que los fibroblastos no proliferan pero colonizan la matriz que comprende colageno a la vez que permiten de manera ventajosa la produccion de colageno por los propios fibroblastos permitiendo de este modo una remodelacion de la dermis.
En otros terminos, el producto obtenido al final de la etapa c. se puede utilizar de manera ventajosa como sustituto de dermis. En particular, este producto comprende todas las caracteristicas fisicoquimicas de la dermis a partir de la que se pueden obtener los fibroblastos.
De acuerdo con la invencion, la etapa d. de cultivo de melanocitos se puede realizar en cualquier recipiente de cultivo adaptado conocido por el experto en la materia. Se puede tratar de una placa de Petri, un matraz de cultivo con una capacidad de 25 a 75 cm2, de 25, 75 o 175 cm2.
En la presente el medio M3 de cultivo de melanocitos puede ser cualquier medio conocido por el experto en la materia adaptado para el cultivo de melanocitos. Por ejemplo, se puede tratar de un medio disponible en el mercado, por ejemplo un medio disponible en el mercado comercializados por la compania Promocell con la referencia « Medio de Melanocitos M2 », « MBM » comercializados por la compania Promocell, en un medio MCDB 153 comercializado por la compania Sigma-Aldrich que comprende en particular una mezcla de aminoacidos, vitaminas, sales inorganicas de azucares, por ejemplo glucosa, tal como se representa en la tabla 3 que sigue a continuacion:
Tabla 3: composicion del medio MCDB 153
Composicion
Concentracion en g.l-1
Metavanadato de Amonio
0,000000585
Cloruro de Calcio Anhidro
0,00333
Sulfato Cuprico 5 H2O
0,00000275
Sulfato Ferroso 7 H2O
0,00139
Cloruro de Magnesio
0,05713
Sulfato de Manganeso
0,000000151
Acido Molibdico 4 H2O (amonio)
0,00000124
Cloruro de Niquel-6 H2O
0,00000012
Cloruro de Potasio
0,11183
Acetato de Sodio (anhidro)
0,30153
Cloruro de Sodio
7,599
Metasilicato de Sodio 9 H2O
0,000142
Composicion
Concentracion en g.l-1
Fosfato de Sodio dibasico (anhidro)
0,284088
Selenito de Sodio
0,0000038
Cloruro Estannoso-2 H2O
0,000000113
Sulfato de Cinc-7 H2O
0,000144
L-Alanina
0,00891
L-Arginina-HCl
0,2107
L-Asparagina -^O
0,015
Acido L-Aspartico
0,00399
L-Cisteina-HCl- H2O
0,04204
Acido L-Glutamico
0,01471
L-Glutamina
0,8772
Glicina
0,00751
L-Histidina-HCl- H2O
0,01677
L-Isoleucina
0,001968
L-Leucina
0,0656
L-Lisina-HCl
0,01827
L-Metionina
0,00448
L-Fenilalanina
0,00496
L-Prolina
0,03453
L-Serina
0,06306
L-Treonina
0,01191
L-Triptofano
0,00306
L-Tirosina-2Na
0,00341
L-Valina
0,03513
D-Biotina
0,0000146
Cloruro de Colina
0,01396
Acido folico
0,00079
mio-Inositol
0,01802
Niacinamida
0,00003663
Acido D-Pantotenico (hemicalcico)
0,000238
Piridoxina-HCl
0,00006171
Riboflavina
0,0000376
Tiamina-HCl
0,000337
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Composicion
Concentracion en g.l-1
Vitamina B-12
0,000407
Adenina-HCl
0,03088
D-Glucosa
1,081
HEPES
6,6
Rojo Fenol-Na
0,001242
Putrescina-2HCl
0,000161
Acido Piruvico -Na
0,055
Acido Tioctico
0,000206
Timidina
0,000727
Tambien se puede tratar de un medio disponible en el mercado modificado, por ejemplo el medio MCDB153 que comprende ademas aminoacidos complementarios, por ejemplo de tirosina, metionina o una mezcla de los mismos, sales inorganicas adicionales, por ejemplo bicarbonato de sodio (NaHCO3).
En la presente, el medio M3 puede comprender ademas al menos un complemento elegido entre extracto de pituitaria de bovino (BPE), insulina, penicilina estreptomicina (PS), hidrocortisona, suero de caballo, suero de ternero, factor de crecimiento basico de fibroblastos (bFGF), factor de estimulacion de Granulocitos y Macrofagos (« Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrofagos » (GM-CSF)), SCF o una mezcla cualquiera de los mismos.
En la presente, el medio M3 puede comprender de un 0,1 a un 10 %, en peso, de un 5 a un 5 % en peso, 1 % en peso de penicilina estreptomicina (PS) con respecto al peso total del medio.
En la presente, el medio M3 puede comprender una concentracion de 1,25 a 1,60 pM, de 1,40 a 1,55 pM, de 1,45 pM de hidrocortisona.
En la presente, el medio M3 puede comprender una concentracion de 100 a 160 pg.ml-1, de 110 a 150 pg.ml-1, igual a 140 pg.ml-1 extracto de pituitaria de bovino (BPE).
En la presente, el medio M3 puede comprender una concentracion de 15 a 25 pg.ml-1, igual a 20 pg.ml-1 de insulina.
En la presente, el medio M3 puede comprender una concentracion de 0,01 a 0,2 pg.ml-1, de 0,01 a 0,1 pg.ml-1, igual a 0,01 pg.ml-1 de GM-CSF.
En la presente, el medio M3 puede comprender una concentracion de 0,004 a 0,2 pg.ml-1, de 0,01 a 0,15 pg.ml-1, igual a 0,05 pg.ml-1 de SCF.
En la presente, el medio M3 puede comprender una concentracion de 0,1 a 10 ng.ml-1, de 0 ,5 a 5 ng.ml-1, de 0,8 a 2 ng.ml-1, igual a 1 ng.ml-1 de bFGF.
En la presente, el medio M3 puede comprender de un 1 a un 5 % en peso, de un 2 a un 4 % en peso, 3 % en peso de suero de caballo o de ternero con respecto al peso total del medio.
En la presente el medio M3 y/o el conjunto de sus componentes puede(n) ser de calidad clinica.
En la presente, la etapa d. de cultivo de melanocitos se puede realizar a una temperatura ambiente, por ejemplo, a una temperatura de 30 a 40 °C, por ejemplo igual a 37 °C.
En la presente, la duracion del cultivo de la etapa d. puede comprender entre 15 a 28 dias.
En la presente, el cultivo de la etapa d. de melanocitos se puede realizar en una atmosfera controlada que comprende al menos un 5 % de CO2.
De acuerdo con la invencion, los melanocitos obtenidos por cultivo de acuerdo con la etapa d. pueden formar una capa de celulas de confluencia en el recipiente de cultivo. Por ejemplo, los melanocitos pueden formar una capa de
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celulas de un 50 a un 100 % de confluencia.
De acuerdo con la invencion, durante el cultivo de acuerdo con la etapa d., corresponda a una capa de celulas de confluencia o no, el metodo puede comprender ademas:
- una etapa d’ de eliminacion del medio de cultivo, aclarado de las celulas con una solucion, eliminacion de la solucion de aclarado,
- etapa d" de separacion de las celulas por tripsinizacion, y
- una etapa d’" de sedimentacion.
En la presente, en la etapa d’, la eliminacion del medio de cultivo se puede realizar con cualquier metodo conocido por el experto en la materia adaptado. Por ejemplo, se puede tratar de una aspiracion del medio, un cambio del contenido con el fin de eliminar el medio de cultivo.
En la presente, en la etapa d’, el aclarado de las celulas se puede realizar mediante cualquier metodo conocido por el experto en la materia, por ejemplo, por aspersion, inmersion de las celulas en una solucion de aclarado.
En la presente, por solucion de aclarado de melanocitos se hace referencia a cualquier solucion de aclarado de melanocitos conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar una solucion tampon HBSS, por ejemplo de la solucion que se ha descrito en la tabla 2 mencionada anteriormente, de tampon fosfato salino (PBS) a pH comprendido de 7,2 a 7,4. Tambien se puede tratar de una solucion tampon disponible en el mercado por ejemplo un tampon fosfato salino (PBS), una solucion equilibrada de Hank comercializada respectivamente por la compania Gibco, Sigma Aldrich, Lonza.
En la presente, en la etapa d’, la eliminacion de la solucion de aclarado se puede realizar con cualquier metodo conocido por el experto en la materia adaptado. Por ejemplo, se puede tratar de una aspiracion de la solucion de aclarado, un cambio del contenido con el fin de eliminar la solucion de aclarado.
De acuerdo con la invencion, la etapa d" de tripsinizacion se puede realizar por inmersion de las celulas en una solucion tampon (ST) que comprende tripsina, seguido por la adicion de Suero de Ternero Fetal (SVF) con el fin de detener la reaccion enzimatica.
De acuerdo con la invencion, la solucion tampon (ST) puede ser una solucion tampon tal como se ha definido anteriormente.
De acuerdo con la invencion la cantidad de tripsina anadida en la solucion tampon (ST) puede ser de un 0,01 a un 0,05 % en peso con respecto al peso total.
De acuerdo con la invencion la duracion de la incubacion de tripsina antes de anadir SVF en la solucion tampon puede ser de 2 a 5 min.
En la presente la cantidad de SVF anadido en la solucion (ST) puede comprender de un 5 a un 20 % en volumen con respecto al volumen total.
De acuerdo con la invencion, la etapa d’" de sedimentacion se puede realizar por sedimentacion, por centrifugacion mediante cualquier metodo conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar de una centrifugacion a una velocidad de 800 a 1200 vueltas por minuto.
De acuerdo con la invencion, la etapa d’" de centrifugacion se puede realizar durante un periodo de tiempo de 5 a 10 min.
En la presente, la etapa d’" de centrifugacion se puede realizar con cualquier dispositivo conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar de una centrifugadora giratoria comercializada por las companias Eppendorf o Jouan.
En la presente, la etapa d"’ de centrifugacion permite sedimentar las celulas con el fin de separarlas del medio. El experto en la materia, de acuerdo con sus conocimientos generales, sabra adaptar/modificar la etapa d"’ de centrifugacion mediante cualquier tecnica conocida que permita sedimentar celulas en un medio.
De acuerdo con la invencion, la etapa e. de cultivo de queratinocitos se puede realizar en cualquier recipiente de cultivo adaptado conocido por el experto en la materia. Se puede tratar de una placa de Petri, un matraz de cultivo con una capacidad de 25 a 75 cm2, de 25, 75 o 125 cm2.
En la presente el medio M4 de cultivo de queratinocitos puede ser cualquier medio conocido por el experto en la materia adaptado para el cultivo de melanocitos. Por ejemplo, se puede tratar de un medio disponible en el mercado, por ejemplo un medio KSFM comercializado por la compania Life-technology, KGM comercializado por la compania
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Lonza, provitro en un medio MCDB 153 comercializado por la compania Sigma-Aldrich que comprende en particular una mezcla de aminoacidos, vitaminas, sales inorganicas de azucares, por ejemplo glucosa. Tambien se puede tratar de un medio disponible en el mercado modificado, por ejemplo el medio MCDB153 que comprende una concentracion de cloruro de sodio de 0,100 a 0,110 M/l, por ejemplo de 0,104 M/l, una concentracion de Hepes de 2 a 3 x 10-2 M/l, por ejemplo de 2,29 x 10-2 M/l, una concentracion de bicarbonato de sodio de 1,10 x 10-2 M/l a 1,25 x 10-2 M/l, por ejemplo de 1,19 x 10-2 M/l, y que comprende una concentracion de a arginina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano, tirosina, valina y colina duplicara con respecto a las concentraciones del medio MCDB153 no modificado.
En la presente, el medio M4 puede comprender ademas complementos elegidos entre factores de crecimiento, por ejemplo factor de crecimiento epitelial (EGF), extracto de pituitaria de bovino (BPE), insulina, penicilina- estreptomicina (PS), hidrocorticosona o una mezcla cualquiera de los mismos. De manera ventajosa, el medio M4 puede comprender complementos de calidad clinica. Por ejemplo, se puede tratar de complementos elegidos entre factores de crecimiento, por ejemplo factor de crecimiento epitelial (EGF), insulina, penicilina-estreptomicina (PS), hidrocorticosona o una mezcla cualquiera de los mismos.
En la presente, el medio M4 puede comprender por ejemplo de un 0,5 a un 5 % en peso, de un 0,75 a un 3 % en peso, 1 % en peso de penicilina-estreptomicina (PS) con respecto al peso total del medio.
En la presente, el medio M4 puede comprender una concentracion de 1,25 a 1,60 pM, de 1,40 a 1,55 pM, de 1,45 pM de hidrocortisona.
En la presente, el medio M4 puede comprender una concentracion de 50 a 90 pg.ml-1, de 60 a 80 pg.ml-1, de 70 pg.ml-1 de extracto de pituitaria de bovino (BPE).
En la presente, el medio M4 puede comprender una concentracion de 3 a 8 pg.ml-1, por ejemplo igual a 5 pg.ml-1 de insulina.
En la presente, el medio M4 puede comprender una concentracion de 5 a 15 ng.ml-1, de 6,5 a 13 ng.ml-1, igual a 10 ng.ml-1 de factor de crecimiento epitelial (EGF).
En la presente el medio M4 y/o el conjunto de sus componentes puede(n) ser de calidad clinica.
En la presente, la etapa e. de cultivo de queratinocitos se puede realizar a una temperatura de 25 a 39 °C, por ejemplo igual a 37 °C.
En la presente, la duracion del cultivo de la etapa e. puede comprender de 15 a 28 dias.
En la presente, el cultivo de la etapa e. de queratinocitos se puede realizar en una atmosfera controlada que comprende al menos un 5 % de CO2.
De acuerdo con la invencion, les queratinocitos obtenidos por cultivo de acuerdo con la etapa e. pueden formar una monocapa de celulas en el recipiente de cultivo. Por ejemplo, se puede tratar de una monocapa de celulas cercana a la confluencia, por ejemplo de un 50 a un 80 % de confluencia en el recipiente de cultivo.
De acuerdo con la invencion, cuando el cultivo de acuerdo con la etapa e. corresponde a una monocapa de celulas cercanas a la confluencia, preferentemente de un 50 a un 80 % de confluencia, el metodo puede comprender ademas:
- una etapa e’ de eliminacion del medio de cultivo, aclarado de las celulas con una solucion, eliminacion de la solucion de aclarado,
- una etapa e" de separacion de las celulas por tripsinizacion, y
- una etapa e’" de centrifugacion.
En la presente, en la etapa e’, la eliminacion del medio de cultivo se puede realizar con cualquier metodo conocido por el experto en la materia adaptado. Por ejemplo, se puede tratar de una aspiracion del medio, un cambio del contenido con el fin de eliminar el medio de cultivo.
En la presente, en la etapa e’, el aclarado de las celulas se puede realizar mediante cualquier metodo conocido por el experto en la materia, por ejemplo, mediante inmersion, aspersion, incubacion de las celulas en una solucion de aclarado de queratinocitos.
En la presente, par solucion de aclarado de queratinocitos se hace referencia a cualquier solucion de aclarado de queratinocitos conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar una solucion tampon PBS, HBSS, por ejemplo tal como se ha descrito en la tabla 2 mencionada anteriormente, a pH comprendido de 7,2 a 7,4. Tambien se puede tratar de una solucion tampon disponible en el mercado, por ejemplo un tampon fosfato salino
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(PBS), una solucion equilibrada de Hank comercializada respectivamente por la compania Gibco, Sigma Aldrich, Lonza.
En la presente, en la etapa e’, la eliminacion de la solucion de aclarado de queratinocitos se puede realizar con cualquier metodo conocido por el experto en la materia adaptado. Por ejemplo, se puede tratar de una aspiracion de la solucion de aclarado de queratinocitos, de un cambio del contenido con el fin de eliminar la solucion de aclarado de queratinocitos.
De acuerdo con la invencion, la etapa e" de tripsinizacion se puede realizar por inmersion de las celulas en una solucion (S) que comprende tripsina, seguido de la adicion de Suero de Ternero Fetal (SVF) con el fin de detener la reaccion enzimatica.
De acuerdo con la invencion la cantidad de tripsina anadida en la solucion (S) puede comprender de un 0,01 a un 0,05 % en peso con respecto al peso total de la solucion.
De acuerdo con la invencion la duracion de la incubacion de tripsina antes de anadir SVF en el medio puede comprender de 5 a 10 min.
En la presente la cantidad de SVF anadido en la solucion (S) puede comprender de un 5 a un 20 % en peso con respecto al peso total de la solucion.
De acuerdo con la invencion, la etapa e’" de centrifugacion se puede realizar mediante cualquier metodo conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar de una centrifugacion a una velocidad de 800 a 1200 vueltas por minuto.
De acuerdo con la invencion, la etapa e"’ de centrifugacion se puede realizar durante un periodo de tiempo de 5 a 10 min.
En la presente, la etapa e"’ de centrifugacion se puede realizar con cualquier dispositivo conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar de una centrifugadora giratoria comercializada por las companias Eppendorf o Jouan.
En la presente la etapa f. de mezcla de melanocitos obtenidos en la etapa d. con queratinocitos obtenidos en la etapa e. se puede realizar con cualquier medio adecuado adaptado conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar de una mezcla de celulas con agitacion en un medio de cultivo.
En la presente, la mezcla de melanocitos y de queratinocitos de la etapa f se puede realizar con una proporcion de melanocitos / queratinocitos en numero de 1/20 a 1/15, igual a 1/19.
De manera ventajosa, los inventores han demostrado de manera sorprendente que cuando la mezcla de melanocitos y de queratinocitos se realiza con una proporcion melanocitos / queratinocitos de 1/20 a 1/15, preferentemente igual a 1/19, el sustituto de piel obtenido presenta caracteristicas estructurales/biologicas identicas a las de una piel in vivo.
En un modo de realizacion preferente, la mezcla de melanocitos y de queratinocitos de la etapa f se realiza con una proporcion melanocitos / queratinocitos en numero de 1/20 a 1/15, igual a 1/19, y la matriz que comprende colageno es una matriz de regeneracion dermica tal como se ha definido anteriormente.
En la presente, la siembra del sustituto de dermis de la etapa g se puede realizar mediante cualquier metodo conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar de una aplicacion, por ejemplo por aspersion del medio de cultivo que comprende una mezcla de melanocitos y de queratinocitos obtenidos en la etapa f., mediante deposito por trasplante de las celulas sobre el sustituto de dermis, por vertido gota a gota del medio de cultivo que comprende una mezcla de melanocitos y de queratinocitos obtenidos en la etapa f, por impresion 3D por ejemplo tal como se describe en Wonhye Lee et al., « Multi-layered culture of human skin fibroblasts and keratinocytes through three-dimensional freeform fabrication." Biomaterials, 2009, Mar; 30 (8): 1587-95 [9].
En la presente, la siembra del sustituto de dermis de la etapa g se realiza con una proporcion
(queratinocitos + melanocitos)/fibroblastos de 9 a 19. De hecho, los inventores han demostrado de manera
sorprendente que cuando la siembra de la etapa g se realiza con una proporcion
(queratinocitos + melanocitos)/fibroblastos de 9 a 19, el sustituto de piel obtenido presenta caracteristicas
estructurales/biologicas identicas a las de una piel normal.
En un modo de realizacion preferente, la siembra del sustituto de dermis de la etapa g se realiza con una proporcion (queratinocitos + melanocitos)/fibroblastos de 9 a 19 y la matriz que comprende colageno es una matriz de regeneracion dermica tal como se ha definido anteriormente.
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En la presente por medio M5 de cultivo de piel se entiende cualquier medio conocido por el experto en la materia adaptado al cultivo de piel que comprende ademas acido hialuronico o un hialuronato. Por ejemplo, se puede tratar de un medio disponible en el mercado, por ejemplo un medio Green modificado, es decir, que comprende 2/3 de medio « medio esencial minimo de Eagle modificado con Dulbecco/Vogt » (DMEM); 1/3 de medio « Fl2 de Ham » y que comprende una mezcla de un 10 % de Suero de Ternero Fetal (SVF) comercializado por la compania Gibco que comprende en particular una mezcla de aminoacidos, vitaminas, sales inorganicas, de azucares, por ejemplo glucosa. Tambien se puede tratar de de un medio Green modificado, es decir, un medio Green exento de toxina de colera, de triodotironina, o de una mezcla del medio « Medio de Dulbecco Modificado con Iscove » (IMDM) y del medio MCDB153 que comprende un 10 % de SVF; o de una mezcla de IMDM / « queratinocitos de dermalife » que comprende un dermalife de SVF comercializado respectivamente por la compania Gibco, Lifescience, Promocell y Sigma Aldrich.
En la presente, el medio M5 tambien puede comprender ademas de complementos elegidos entre el acido hialuronico o un hialuronato, acido ascorbico o un ascorbato o una mezcla de los mismos.
En la presente, el medio M5 puede comprender por ejemplo de 40 a 60 mg.l-1, de 45 a 55 mg.l-1, 50 mg.l-1 de hialuronato o acido hialuronico.
En la presente, el medio M5 puede comprender por ejemplo de 40 a 60 mg.l-1, de 45 a 55 mg.l-1, 50 mg.l-1 de acido ascorbico o ascorbato.
En la presente, la etapa h. de cultivo de piel se puede realizar a una temperatura comprendida de 25 a 40 °C, por ejemplo igual a 37 °C.
En la presente, la duracion del cultivo de piel de la etapa h. puede comprender entre 6 y 21 dias, por ejemplo de 8 a 15 dias.
En la presente, el cultivo de piel de la etapa h. de piel se puede realizar en una atmosfera controlada que comprende al menos un 5 % de CO2.
De acuerdo con la invencion, el cultivo de piel de la etapa h. de piel se puede realizar a una temperatura comprendida de 25 a 40 °C, por ejemplo igual a 37 °C y en una atmosfera controlada que comprende al menos un 5 % de CO2.
En la presente el medio M5 y/o cada uno de sus componentes puede(n) ser de calidad clinica.
En la presente la etapa h. puede comprender:
- una primera etapa h.’ de cultivo de al menos 6 horas, preferentemente de 6 a 24 horas, en presencia de un medio M51 de cultivo y de un medio Green modificado, es decir, un medio Green exento de toxina de colera, de triodotironina, o de una mezcla del medio « Medio de Dulbecco Modificado con Iscove » (IMDM) y del medio MCDB153 que comprende un 10 % de SVF; o de una mezcla de IMDM / « queratinocitos de dermalife » que comprende un 10 % de SVF comercializado respectivamente por la compania Gibco, Lifescience, Promocell y Sigma Aldrich.
En la presente, el medio M5 tambien puede comprender ademas complementos elegidos entre el acido hialuronico o un hialuronato, acido ascorbico o un ascorbato como una mezcla de los mismos.
En la presente, el medio M5 puede comprender por ejemplo de 40 a 60 mg.l-1, de 45 a 55 mg.l-1, 50 mg.l-1 de hialuronato o acido hialuronico.
En la presente, el medio M5 puede comprender por ejemplo de 40 a 60 mg.l-1, de 45 a 55 mg.l-1, 50 mg.l-1 de acido ascorbico o ascorbato.
En la presente, la etapa h. de cultivo de piel se puede realizar a una temperatura comprendida de 25 a 40 °C, por ejemplo igual a 37 °C.
En la presente, la duracion del cultivo de piel de la etapa h. puede comprender entre 6 y 21 dias, por ejemplo de 8 a 15 dias.
En la presente, el cultivo de piel de la etapa h. de piel se puede realizar en una atmosfera controlada que comprende al menos un 5 % de CO2.
De acuerdo con la invencion, el cultivo de piel de la etapa h. de piel se puede realizar a una temperatura comprendida de 25 a 40 °C, por ejemplo igual a 37 °C y en una atmosfera controlada que comprende al menos un 5 % de CO2.
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En la presente el medio M5 y/o cada uno de sus componentes puede(n) ser de calidad clinica.
En la presente la etapa h. puede comprender:
- una primera etapa h.’ de cultivo de al menos 6 horas, preferentemente de 6 a 24 horas, en presencia de un medio M51 de cultivo que no comprende ni acido hialuronico, ni hialuronato, ni acido ascorbico ni ascorbato,
- una segunda etapa h." de cultivo de 0 a 7 dias, preferentemente de al menos 2 dias, en presencia de un medio M52 de cultivo que comprende acido hialuronico o un hialuronato y
- una tercera etapa h.’" de cultivo de al menos 2 dias en un medio M53 que comprende acido hialuronico o un hialuronato y acido ascorbico o un ascorbato.
El medio M51 de cultivo de sustituto de piel corresponde al medio M5 tal como se ha definido anteriormente no comprende ni acido ascorbico ni ascorbato o derivado de los mismos.
En la presente el medio M51 y/o cada uno de sus componentes puede(n) ser de calidad clinica.
El medio M52 de cultivo de sustituto de piel corresponde al medio M5 tal como se ha definido anteriormente que comprende acido hialuronico o un hialuronato a la vez que esta exento de acido ascorbico, ascorbato y un derivado de los mismos.
En la presente el medio M52 puede ser y/o cada uno de sus componentes puede(n) ser de calidad clinica.
El medio M53 de cultivo de sustituto de piel corresponde al medio M5 tal como se ha definido anteriormente que comprende acido hialuronico o un hialuronato y acido ascorbico o ascorbato.
En la presente el medio M53 puede ser un medio de calidad clinica.
En la presente invencion, la etapa h’ de cultivo se puede realizar mediante deposicion en un medio de cultivo M51 del sustituto de dermis sembrado obtenido en la etapa g.
En la presente, la etapa h’ de cultivo se puede realizar a una temperatura comprendida de 25 a 40 °C, por ejemplo igual a 37 °C.
En la presente, la duracion de la etapa h’ de cultivo puede ser de 6 a 24 horas, por ejemplo de 8 a 24 horas, de 12 a 18 horas.
En la presente, la etapa h’ de cultivo de piel se puede realizar en una atmosfera controlada que comprende al menos un 5 % de CO2.
De manera ventajosa, los inventores han demostrado que la etapa h’ permite favorecer la adhesion de los melanocitos y queratinocitos sobre el sustituto de dermis.
En la presente invencion, la etapa h" de cultivo se puede realizar mediante deposicion en un medio de cultivo M52 del sustituto de dermis sembrado obtenido en la etapa h’ o inmersion o submersion del sustituto de dermis sembrado obtenido en la etapa h’ en un medio de cultivo M52.
En la presente, la etapa h" de cultivo se puede realizar a una temperatura comprendida de 25 a 40 °C, por ejemplo igual a 37 °C.
En la presente, la duracion de la etapa h" de cultivo puede comprender de 0 a 7 dias, preferentemente de 2 a 7 dias.
En la presente, la etapa h" de cultivo de piel se puede realizar en una atmosfera controlada que comprende al menos un 5. % de CO2.
En la presente invencion, la etapa h’" de cultivo se puede realizar mediante deposicion en un medio de cultivo M52 del sustituto de dermis sembrado obtenido en la etapa h", inmersion del sustituto de dermis sembrado obtenido en la etapa h" en un medio de cultivo M52, o inmersion del sustituto de dermis sembrado obtenido en la etapa h", siendo dicho sustituto sumergido en dicho medio hasta la superficie de contacto de aire-liquido, o siento dicho medio sumergido en la superficie del medio.
En la presente por « en la superficie del medio » se hace referencia a la inmersion del sustituto en el medio de para recubrir el sustituto en la totalidad de su altura sin inmersion de su parte superior.
En la presente, la etapa h"’ de cultivo se puede realizar a una temperatura comprendida de 25 a 40 °C, por ejemplo igual a 37 °C.
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En la presente, la duracion de la etapa h"’ de cultivo puede comprender de 2 a 7 dias preferentemente 7 dias.
En la presente, la etapa h"’ de cultivo de piel se puede realizar en una atmosfera controlada que comprende al menos un 5 % de CO2
De manera ventajosa, los inventores han demostrado que la inmersion del sustituto de dermis sembrado obtenido en la etapa h" en un medio de cultivo M53 que comprende acido hialuronico o un hialuronato y acido ascorbico o un ascorbato permite favorecer la formacion de la union dermo-epidermica y asegura de ese modo una mejor polarizacion de las celulas del sustituto de dermis sembrado.
De manera ventajosa, los inventores tambien han demostrado que la inmersion hasta la superficie de contacto del aire-liquido o en la superficie del medio del sustituto de dermis sembrado obtenido en la etapa h" en un medio de cultivo M53 que comprende acido hialuronico o un hialuronato o un derivado de los mismos y acido ascorbico o un ascorbato o un derivado de los mismos permite una diferenciacion de la epidermis que favorece de ese modo la formacion de una capa cornea sobre el sustituto o equivalente.
De manera ventajosa, los inventores han demostrado que el metodo permite de manera ventajosa tener un sustituto de piel o equivalente de piel que comprende el conjunto de las capas componentes de las mismas. Ademas, el sustituto de piel obtenido de acuerdo con el metodo de la invencion presenta caracteristicas similares a las de la piel nativa a diferencia de los sustitutos de piel conocidos en el estado de la tecnica.
De manera ventajosa, los inventores tambien han demostrado que el metodo permite obtener un sustituto de dermis y/o un sustituto de piel de un tamano muy superior a los conocidos en el estado de la tecnica. En particular, el metodo permite de manera ventajosa obtener un sustituto de dermis y/o un sustituto de piel con una superficie de 1 a 25 cm2, por ejemplo de 5 a 25 cm2.
Los inventores tambien han demostrado de manera ventajosa que el metodo permite obtener un sustituto o equivalente de dermis y/o un equivalente o sustituto de piel con una capacidad de amplificacion minima de 6.
Ademas, los inventores tambien han demostrado de manera ventajosa que el metodo de acuerdo con la invencion permite obtener un sustituto de dermis y/o de piel manipulable con propiedades viscoelasticas que permiten de manera ventajosa evitar un desgarro/alteracion fisicos opcionales de dicho sustituto durante su manipulacion.
Ademas, la duracion de la preparacion del sustituto de dermis y/o de piel de acuerdo con el metodo de la invencion por lo general es inferior a 30 dias, y por lo tanto es compatible con las exigencias para el cuidado de las quemaduras en particular.
La presente invencion tambien tiene como objeto un sustituto de piel susceptible de ser obtenido mediante la realizacion del metodo tal como se ha definido anteriormente.
De manera ventajosa, los inventores han demostrado que el sustituto de piel comprende melanocitos a nivel de la capa basal formando una unidad epidermica de melanizacion.
De manera ventajosa, el sustituto de piel susceptible de ser obtenido con el metodo de la invencion, mediante la presencia de melanocitos presenta de manera ventajosa una pigmentacion constitutiva.
De manera ventajosa, el sustituto de piel tiene un tamano muy superior a los conocidos en el estado de la tecnica que permite en particular cuando hay heridas extendidas, la aplicacion de uno solo o de un numero inferior de sustitutos de piel con respecto a los del estado de la tecnica. La disminucion del numero de sustitutos de piel a aplicar tambien permite de manera ventajosa reducir los costes de tratamiento a la vez que se acelera esto ultimo.
La presente invencion tambien describe un sustituto de dermis susceptible de ser obtenido en la etapa c. Del metodo.
De manera ventajosa, el sustituto de dermis puede comprender colageno de tipo IV neoformado.
De manera ventajosa el sustituto de dermis comprende al menos una matriz que comprende colageno de tipo I en la
que se reparten los fibroblastos. Ademas puede contener otros componentes de la matriz extracelular, por ejemplo moleculas tales como el colageno en particular el colageno IV, las lamininas, los glucosaminoglucanos.
De manera ventajosa, el sustituto de dermis tiene un tamano muy superior a los conocidos en el estado de la tecnica
que permite en particular cuando hay heridas extendidas, la aplicacion de uno solo o de un numero inferior de sustitutos con respecto a los del estado de la tecnica. La disminucion del numero de sustitutos a aplicar tambien permite de manera ventajosa reducir los costes de tratamiento a la vez que se acelera el tratamiento de parte, por ejemplo la puesta a disposicion de un dispositivo unico que cubre el conjunto de la superficie a tratar.
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Los inventores tambien han demostrado que el sustituto de dermis y/o el sustituto de piel de acuerdo con la invencion se pueden utilizar de manera ventajosa para cubrir las perdidas de sustancia, por lo tanto el sustituto de dermis y/o el sustituto de piel de acuerdo con la invencion se pueden utilizar de manera ventajosa como injerto.
Por lo tanto, la presente invencion tambien tiene como objeto un injerto constituido por un sustituto de piel tal como se ha definido anteriormente o describe un injerto formado por un sustituto de dermis tal como se ha definido anteriormente.
En la presente, el injerto de acuerdo con la invencion se puede utilizar como medio de tratamiento de un trastorno cutaneo y/o de una perdida de sustancia cutanea. En particular, el injerto de acuerdo con la invencion se puede utilizar como medio de tratamiento de un trastorno cutaneo y/o de una perdida de sustancia cutanea elegido entre el grupo que comprende una quemadura, un defecto de cicatrizacion, relacionado con una herida traumatica o con una herida cronica, un trastorno pigmentario, hemangioma y un cancer cutaneo.
La presente solicitud describe un metodo de tratamiento de un trastorno de la piel que comprende el trasplante o el implante de un sustituto de piel o de un sustituto de dermis de acuerdo con la invencion.
En la presente, el implante del sustituto de piel se puede realizar mediante cualquier metodo conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar de la aplicacion directa del sustituto sobre la zona a tratar, por ejemplo de acuerdo con el metodo que se describe en Pena, et al, Use of Autologous Skin Equivalents With Artificial Dermal Matrix (Integra) in Donor Site Coverage in Radial Forearm Free Flaps: Preliminary Cases J Oral and Maxillofacial Surgery, 70: 10 10, 2012 [10].
En la presente, el trasplante del sustituto de piel se puede realizar mediante cualquier metodo conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, se puede tratar de un metodo que comprende una primera etapa de determinacion y de eliminacion de una zona de piel/dermis a eliminar seguida de una segunda etapa de incorporacion del sustituto en la zona que se deja libre. Tambien se puede tratar del metodo que se describe en el documento E. Dantzer, F. Braye Reconstructive surgery using an artificial dermis (Integra): results with 39 grafts. Br J Plast Surg, 54: 8 8, 2001 [11].
En el metodo de tratamiento, por trastorno de la piel se hace referencia a una quemadura, un defecto de cicatrizacion relacionado con una herida traumatica o con una herida cronica, un trastorno pigmentario, hemangioma y un cancer cutaneo.
Por lo tanto, el metodo de tratamiento puede permitir la sustitucion de una piel herida y/o danada y/o patologica con un sustituto de la piel sana.
El metodo de tratamiento puede comprender el trasplante del sustituto de piel despues de ablacion, por ejemplo de un nevus melanocitico, un nevus melanocitico gigante, un melanoma, un hemangioma, un poroma ecrino.
El metodo de tratamiento tambien puede comprender el implante y/o la aplicacion de un sustituto de piel sobre una quemadura y/o una herida profunda y/o una herida cronica, por ejemplo una herida diabetica. Estos metodos no forman parte de la invencion.
La presente invencion tambien tiene como objeto un kit para la realizacion del metodo de acuerdo con la invencion que comprende un medio M1 de cultivo de fibroblastos, una matriz que comprende colageno, un medio M2 de cultivo de los fibroblastos en la matriz que comprende colageno, un medio M3 de cultivo de melanocitos, un medio M4 de cultivo de queratinocitos y un medio M5 de cultivo de piel.
La presente invencion tambien tiene como objeto un kit para la realizacion del metodo de acuerdo con la invencion que comprende un medio M1 de cultivo de fibroblastos, una matriz que comprende colageno, un medio M21, un medio M22 de cultivo de los fibroblastos en la matriz que comprende colageno, un medio M3 de cultivo de melanocitos, un medio M4 de cultivo de queratinocitos, un medio M51 y un medio M52 de cultivo de piel.
Los medios M1, M2, M21, M22, M3, M4, M5, M51 et M52 son tal como se han definido anteriormente.
La presente invencion tambien tiene como objeto un metodo de injerto de piel que comprende las etapas de:
- toma de una muestra de piel al nivel de una zona no afectada en un individuo,
- preparacion de un sustituto de piel de acuerdo con la invencion utilizando los fibroblastos, queratinocitos y fibroblastos obtenidos de la muestra tomada, y
- el injerto del sustituto obtenido en el individuo.
Con la lectura de los ejemplos que siguen a continuacion, ilustrados con las figuras adjuntas, proporcionadas a modo ilustrativo, todavia podran aparecer otras ventajas para el experto en la materia.
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Breve descripcion de las figuras
La figura 1 representa un esquema de las etapas que permiten la obtencion de un sustituto/equivalente de piel.
La figura 2 representa fotografias en microscopia optica de piel (figura 2A), de sustitutos de piel obtenidos de acuerdo con el metodo de la invencion con variaciones de proporcion de celulas sembradas (figuras 2B y 2C).
La figura 3A es una fotografia de un sustituto de dermis obtenido a la etapa c en microscopia optica despues de la coloracion de los fibroblastos.
La figura 3B es una fotografia de un sustituto de piel obtenido de tamano pequeno, es decir 0,5 cm2.
La figura 3C es una fotografia de un sustituto de piel obtenido de tamano medio, es decir 25 cm2.
La figura 4 representa fotografias despues del injerto de una matriz que comprende colageno (columna A) o de un sustituto de dermis obtenido en la etapa c (columna B) el dia del injerto (linea 1), 14 dias despues del injerto (linea 2) o 24 dias despues del injerto (linea 3).
La figura 5 representa fotografias en microscopia optica de una toma de muestra del injerto 24 dias despues del injerto despues de la coloracion con hematoxilina-eosina.
Ejemplos
Ejemplo 1: Ejemplo de fabricacion de un sustituto de piel
En el presente ejemplo, las celulas utilizadas provenian de una biopsia de piel realizada a nivel de mamoplastias realizadas previamente en un paciente.
La toma de muestras de la biopsia fue realizada por un cirujano plastico y la biopsia se deposito en un tubo esteril que contenia suero fisiologico.
A partir de la biopsia, las celulas se aislaron como sigue a continuacion:
1. Aislamiento de las celulas epiteliales
a. Aclarar la biopsia en HBSS (Solucion Salina equilibrada de Hank) esteril
b. Eliminacion del tejido adiposo por un tecnico biologo con la ayuda de un escalpelo
c. Incubacion con tripsina-EDTA calentada previamente a 37 °C entre 3 y 24 h
d. Neutralizacion con SVF irradiado (inhibidores de tripsina)
e. Eliminacion de la epidermis y raspado con el escalpelo de la capa basal en la que se encuentran las celulas altamente proliferativas (p63 positivas)
f. Filtracion, centrifugacion a 1200 vueltas por minuto y siembra del sedimento a 100 000 celulas por cm2 en medio MCDB153 modificados* que comprende los compuestos mencionados en la tabla 4 que sigue a continuacion en el que las concentraciones de L arginina, L Histidina, L isoleucina, L leucina, L metionina, L fenil alanina, L treonina, L- triptofano, L tirosina, L marina, Cloruro de Colina se duplicaron, la concentracion de NaCl disminuyo a 0,104 M/l, Hepes a 2,29 exp-2 M/l y NaHCO3 a 1,19exp-2 M/l, siendo el pH del medio ajustado a 7,4 y antibioticos (penicilina y estreptomicina al 1 %) para los queratinocitos.
Para los melanocitos, Filtracion, centrifugacion a 1200 vueltas por minuto y siembra del sedimento a 100 000 celulas por cm2 en medio MCDB153 modificados* que comprende los compuestos mencionados en la tabla 4 que sigue a continuacion que comprende ademas 5,88 g de bicarbonato de sodio/5 l, 0,272 g de tirosina/5 l y 0,157 g de L Metionina/ 5 l, siendo el pH del medio ajustado a 7,4
Tabla 4: composicion normal del medio MCDB 153
Composicion
Concentracion en g.l-1
Metavanadato de Amonio
0,000000585
Cloruro de Calcio ■ Anhidro
0,00333
Sulfato Cuprico-5H2O
0,00000275
Sulfato Ferroso-7H2O
0,00139
Cloruro de Magnesio
0,05713
Sulfato de Manganeso
0,000000151
Acido Molfbdico-4H2O (amonio)
0,00000124
Cloruro de Nfquel-6H2O
0,00000012
Cloruro de Potasio
0,11183
Composicion
Concentracion en g.l-1
Acetato de Sodio (anhidro)
0,30153
Cloruro de Sodio
7,599
Metasilicato de Sodio-9H2O
0,000142
Fosfato de Sodio Dibasico (anhidro)
0,284088
Selenito de Sodio
0,0000038
Cloruro Estannoso-2H2O
0,000000113
Sulfato de Cinc-7H2O
0,000144
L-Alanina
0,00891
L-Arginina-HCl
0,2107
L-Asparagina-H2O
0,015
Acido L-Aspartico
0,00399
L-Cisteina-HCl-H2O
0,04204
Acido L-Glutamico
0,01471
L-Glutamina
0,8772
Glicina
0,00751
L-Histidina-HCl-H2O
0,01677
L-Isoleucina
0,001968
L-Leucina
0,0656
L-Lisina-HCl
0,01827
L-Metionina
0,00448
L-Fenilalanina
0,00496
L-Prolina
0,03453
L-Serina
0,06306
L-Treonina
0,01191
L-Triptofano
0,00306
L-Tirosina-2Na
0,00341
L-Valina
0,03513
D-Biotina
0,0000146
Cloruro de Colina
0,01396
Acido folico
0,00079
mio-Inositol
0,01802
Niacinamida
0,00003663
Acido D-Pantotenico (hemicalcico)
0,000238
5
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15
20
25
30
35
40
Composicion
Concentracion en g.l-1
Piridoxina-HCl
0,00006171
Riboflavina
0,0000376
Tiamina-HCl
0,000337
Vitamina B-12
0,000407
Adenina-HCl
0,03088
D-Glucosa
1,081
HEPES
6,6
Rojo Fenol-Na
0,001242
Putrescina-2HCl
0,000161
Acido Piruvico-Na
0,055
Acido Tioctico
0,000206
Timidina
0,000727
g. Incubacion a 37 °C a un 5 % de CO2 durante una semana con cambio del medio los 3 dias.
h. Al cabo de una semana aproximadamente: tripsinizacion diferencial = tripsinizacion con tripsina al 0,025 % y EDTA 0,1 M (1-2 minutos para separar los melanocitos, 10 minutos para separar los queratinocitos). Los melanocitos se separan en primer lugar, lo que permite purificar los cultivos.
Neutralizacion con SVF irradiado, centrifugacion a 1200 vueltas por minuto y siembra del sedimento para amplificacion en el mismo medio.
i. Incubacion a 37 °C a un 5 % de CO2 durante una semana con cambio del medio los 3 dias.
2. Aislamiento de los fibroblastos
a. Aclarado de la parte dermica con HBSS,
b. Incubacion de la dermis con colagenasa al 1 % a 37 °C como maximo 3 horas de acuerdo con el tipo de dermis.
c. Neutralizacion con SVF irradiado.
d. Filtracion a traves de un tamiz celular de 40 pm, centrifugacion a 1200 vueltas por minuto con una centrifugadora GR 2022 durante unos cinco minutos y siembra del sedimento a 100 000 celulas por cm2 en DMEM que comprende SVF al 10 % irradiado y penicilina y estreptomicina al 1 % durante 24 horas.
e. Incubacion en una incubadora Jouan IG 150 a 37 °C con CO2 al 5 % durante una semana con cambio del medio los 3 dias.
3. Preparacion de un sustituto de piel
a. Tripsinizacion de los fibroblastos con tripsina al 0,025 % y EDTA 0,1 M durante 10 minutos y a continuacion neutralizacion con SVF irradiado, centrifugacion a 1200 vueltas por minuto con una centrifugadora GR 2022 durante 5 minutos, y siembra en DMEM que comprende SVF al 10 % sobre una matriz termica de origen de colageno esteril, es decir, una matriz Integra (marca registrada) aclarara previamente con una solucion salina equilibrada de Hank (« Solucion Salina equilibrada de Hank » (HBSS) 3 veces a razon de 30 000 fibroblastos por cm2 en una camara de incubacion de acero inoxidable realizada a medida.
b. Al cabo de 24 horas de cultivo a 37 °C, CO2 al 5 %, la camara de incubacion se retiro de la matriz.
c. La matriz sembrada se incubo a 37 °C, CO2 al 5 % en DMEM que comprendia un 10 % de SVF irradiado y penicilina y estreptomicina al 1 % y acido ascorbico 50 mg/ml, durante 1 semana con cambio del medio los 3 dias.
d. Tripsinizacion de los queratinocitos y de los melanocitos con tripsina al 0,025 % y EDTA 0,1 M durante 1 a 2 minutos para separar los melanocitos de las placas de cultivo de melanocitos, durante 10 minutos para separar los queratinocitos de las placas de cultivo de queratinocitos. Neutralizacion con SVF y radial y centrifugacion y siembra a 400 000 celulas por cm2 en una camara de incubacion de una mezcla que contiene 1 melanocito por 19 queratinocitos.
e. Adhesion durante 24 horas.
f. Submersion durante 7 dias en medio de Green modificado :DMEM / F12 de Ham / SVF al 10 % que comprende acido hialuronico a 50 mg/ml.
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g. Superficie de contacto durante 7 dias en medio de Green modificado DMEM / F12 de Ham que comprende SVF al 10 %, acido hialuronico a 50 mg/ml y acido ascorbico 50 mg/ml y antibioticos, es decir penicilina y estreptomicina al 1 %.
La figura 1 representa un esquema de las etapas que permiten la obtencion de un sustituto de piel.
En el presente ejemplo, dos sustitutos de piel obtenidos presentaban proporciones (queratinocitos + melanocitos)/fibroblastos de 13,3. Para la proporcion de 13,3, durante las etapas de deposito de los fibroblastos y de la mezcla de queratinocitos/melanocitos las cantidades de celulas sembradas eran respectivamente 15000 para los fibroblastos, 10 000 para los melanocitos y 190 000 para los queratinocitos.
Una vez obtenido el sustituto, se fijo en formol al 4 %, se introdujo en parafina y a continuacion se realizo un corte de 4 pm en, a condenacion se realizo una coloracion con hematoxilina-eosina con el fin de marcar las diferentes capas de la piel. Se realizo una observacion al microscopio optico con un aumento de 40x. Con el microscopio acoplado a una camara CCD (Nikon, software NIS elemento Br) se realizaron fotografias de las observaciones. La figura 2B representa una fotografia en microscopia optica de un sustituto de piel obtenido de acuerdo con el metodo en el que la proporcion (queratinocitos + melanocitos)/fibroblastos era de 13,3. La figura 2C representa una fotografia en microscopia optica de un sustituto de piel obtenido de acuerdo con el metodo en el que la proporcion (queratinocitos + melanocitos)/fibroblastos era de de 6,7 y la figura 2A una fotografia en microscopia optica de una biopsia de piel normal. Tal como se representa en estas fotografias, el sustituto obtenido con el metodo tiene una estructura identica que comprende una estructura identica a la de la piel in vivo.
Ejemplo 2: Injerto de un sustituto de dermis de acuerdo con la invencion en ratones
En este ejemplo, el sustituto de piel utilizado era el sustituto obtenido como se ha descrito en el ejemplo 1 con celulas obtenidas a partir de mamoplastias con la proporcion (queratinocitos + melanocitos)/fibroblastos de 13, 3. Los ratones utilizados eran ratones atimicos Swiww nu/nu que provenian de Jackson Lab.
En este ejemplo, se realizaron injertos en 10 ratones en paralelo.
Una incision en los ratones se realizo con la ayuda de un escalpelo en una zona de 5 cm2 con el fin de suprimir la dermis y la epidermis, se realizo una limpieza de la zona escarificada con suero fisiologico. Un sustituto de piel preparado previamente se aplico sobre la zona escarificada con el fin de recubrirla (figura 4A, linea 1) y a continuacion la zona insertada se cerro con la piel del raton que se suturo (figura 4B, linea 1).
Los ratones se conservaron en un animalario especializado de manera individual por jaula durante el periodo de tiempo en el que injerto prende y a continuacion a razon de 5 en jaulas de tamano adecuado.
Despues de 2 semanas, se realizo una observacion de como habia aprendido el injerto retirando la tapa de piel del raton (figura 4A, linea 2). En otras palabras, la piel suturada del raton se desuturo, se elimino y el sustituto de dermis injertado se actualizo para una observacion visual (figura 4B, linea 2).
Despues de 3 semanas, se realizo una observacion visual de como habia aprendido el injerto (figuras 4B y B, linea 3).
Tal como se demuestra en la figura 4, parece claramente que el sustituto de dermis se puede aplicar de manera ventajosa, en particular para un injerto sin induccion de efectos secundarios.
Ademas, con el fin de estudiar el estado estructural del sustituto de dermis despues de tres semanas despues de la aplicacion, se realizo una toma de muestra mediante corte del sustituto con el escalpelo. El sustituto se fijo en formol al 4 %, se incluyo en parafina y a continuacion se realizo un corte de 4 pm, a continuacion se realizo una coloracion con hematoxilina-eosina con el fin de marcar las diferentes capas de la piel. Se realizo una observacion con el microscopio optico con un aumento de 40x. Con el microscopio acoplado a una camara CCD (Nikon, software NIS elemento Br) se realizaron fotografias de las observaciones.
La figura 5 representada fotografias en microscopia optica de los sustitutos injertados. En particular, la figura 5A, muestra el sustituto colonizado por los fibroblastos murinos que son poco numerosos y que no han comenzado a remodelar el colageno. La figura 5B nuestra sustituto colonizado con los fibroblastos humanos antes del injerto. Se observa un numero importante de fibroblastos y una remodelacion de la matriz en particular en la zona superficial con manojos mas espesos de colageno. Por lo tanto, el presente ejemplo demuestra claramente que la presencia del conjunto de las celulas permite la obtencion de un sustituto facilmente integrable, que no se degrada con el tiempo y que presenta una maduracion despues del injerto, que se acelera en presencia de fibroblastos en la matriz.
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20
Listado de referencias
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Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
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    65
    REIVINDICACIONES
    1. Metodo de preparacion de un sustituto de piel que comprende las siguientes etapas:
    a. cultivo de fibroblastos en un medio M1 de cultivo de fibroblastos;
    b. siembra de una matriz que comprende colageno con fibroblastos obtenidos en la etapa a;
    c. cultivo de los fibroblastos sembrados en la matriz que comprende colageno en un medio M2 de cultivo de fibroblastos, formando la matriz y los fibroblastos cultivados un sustituto de dermis;
    d. cultivo de melanocitos en un medio M3 de cultivo de melanocitos;
    e. cultivo de queratinocitos en un medio M4 de cultivo de queratinocitos;
    f. mezcla de melanocitos obtenidos en la etapa d con queratinocitos obtenidos en la etapa e;
    g. siembra del sustituto de dermis obtenido en la etapa c con la mezcla obtenida en la etapa f;
    h. cultivo del sustituto de dermis sembrado en la etapa g en un medio M5 de cultivo de piel formando de ese modo el sustituto de piel.
    en el que el medio M2 comprende acido ascorbico o un ascorbato, el medio M5 comprende acido hialuronico o un hialuronato o un derivado de los mismos, y la siembra en la etapa g se realiza con una proporcion (queratinocitos + melanocitos)/fibroblastos de 9 a 19.
  2. 2. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el medio M5 comprende acido ascorbico o un ascorbato.
  3. 3. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la mezcla de melanocitos y de queratinocitos de la etapa f se realiza con una proporcion de melanocitos / queratinocitos de 1/20 a 1/15.
  4. 4. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la siembra en la etapa b se realiza a una densidad de 20 000 a 50 000 fibroblastos / cm2 de superficie de la matriz que comprende colageno.
  5. 5. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa c. comprende una primera etapa c’ de cultivo de 18 a 28 horas en presencia de un medio M21 de cultivo de fibroblastos que no comprende ni acido ascorbico ni ascorbato, una segunda etapa c" de cultivo de al menos 2 dias en presencia de un medio M22 de cultivo de fibroblastos que comprende acido ascorbico o un ascorbato.
  6. 6. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa h. comprende:
    - una primera etapa h.’ de cultivo de 6 a 24 horas en presencia de un medio M51 de cultivo que no comprende ni acido hialuronico, ni hialuronato, ni acido ascorbico ni ascorbato,
    - una segunda etapa h." de cultivo de al menos 2 dias en presencia de un medio M52 de cultivo que comprende acido hialuronico o un hialuronato y
    - una tercera etapa h."’ de cultivo de al menos 2 dias en un medio M53 que comprende acido hialuronico o un hialuronato y acido ascorbico o un ascorbato.
  7. 7. Sustituto de piel obtenido mediante la realizacion del metodo definido en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
  8. 8. Sustituto de piel de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que los fibroblastos son autologos de un individuo con fines de un injerto de dicho sustituto de piel sobre dicho individuo.
  9. 9. Sustituto de piel de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que los fibroblastos, los melanocitos y queratinocitos son autologos de un individuo.
  10. 10. Injerto constituido por un sustituto de piel de acuerdo con la reivindicacion 8 o 9.
  11. 11. Injerto de acuerdo con la reivindicacion 10 para una utilizacion como medio de tratamiento de un trastorno cutaneo y/o de una perdida de sustancia cutanea.
  12. 12. Injerto para una utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 11 en el que el trastorno cutaneo y/o una perdida de sustancia cutanea se elige entre el grupo que comprende una quemadura, un defecto de cicatrizacion, una herida cronica, un trastorno pigmentario, un hemangioma y un cancer cutaneo.
  13. 13. Kit para la realizacion del metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende un medio M1 de cultivo de fibroblastos, una matriz que comprende colageno, un medio M2 de cultivo de fibroblastos en la matriz que comprende colageno, un medio M3 de cultivo de melanocitos, un medio M4 de cultivo de queratinocitos y un medio M5 de cultivo de piel, en el que el medio M2 comprende acido ascorbico o un ascorbato y el medio M5 comprende acido hialuronico o un hialuronato.
  14. 14. Kit de acuerdo con la reivindicacion 13 en el que los medios M1 a M5 son independientemente medios de calidad clfnica.
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