ES2345767T3 - Queratinocitos utilizables como substancia biologicamente activa para el tratamiento de heridas. - Google Patents
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Abstract
Queratinocitos, caracterizados porque, no están inmortalizados, y se pueden duplicar por lo menos 150 veces mediante un procedimiento de cultivo celular in vitro, y porque se trata de células del cultivo KC-BI-1 (DSM ACC 2514), ó de queratinocitos derivados de los mismos, en donde los citados queratinocitos no pueden duplicarse a. en ausencia de suero fetal de ternera, y/o b. en ausencia de células Feeder y/o c. en ausencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y en donde la actividad telomerasa de los citados queratinocitos en comparación con la línea celular HaCaT es menor, por lo menos en un factor 2, y en donde las células y cultivos de los queratinocitos derivados se generan y/o pueden ser generados mediante subpasajes y/o subclonados del cultivo original KC-BI-1 (DSM ACC 2514).
Description
Queratinocitos utilizables como substancia
biológicamente activa para el tratamiento de heridas.
La invención se refiere a nuevos queratinocitos
cultivables in vitro, así como su ventajoso empleo para la
obtención de un producto, el cual puede ser empleado para el
tratamiento de heridas agudas y crónicas. La invención ha tenido
lugar en el terreno de la medicina, especialmente en el terreno de
la curación de heridas, mediante Tissue Engineering
(ingeniería de tejidos).
Los queratinocitos alogénicos se emplean con
éxito desde hace mucho tiempo para el tratamiento de heridas, en
particular de úlceras y/o quemaduras (Maier, 1993; Schönfeld et
al., 1993). Las heridas, que se muestran resistentes frente a
las terapias convencionales durante un largo período de tiempo, se
pueden curar con éxito mediante el empleo de los queratinocitos
alogénicos, (Phillips and Gilchrest, 1993; Beele et al.,
1991; Leigh et al., 1991; Lindgren et al., 1998). Al
principio, la atención se dirigió al empleo de los queratinocitos
alogénicos especialmente en la substitución de la piel, es decir en
la regeneración de la epidermis transplantada. Sin embargo, se
observó pronto, que el éxito de la terapia radicaba primariamente
sobre la estimulación de la reepitelización endógena, y no sobre un
"crecimiento" del transplante celular alogénico de la herida.
Numerosas investigaciones dieron por resultado últimamente que los
queratinocitos transplantados permanecen solamente un determinado
tiempo en la herida y entonces no son visiblemente eliminados
clínicamente del cuerpo (Kawai et al., 1993). La
estimulación de la curación endógena de las heridas tiene lugar
primordialmente mediante una espaciosa y óptima liberación en el
tiempo de una multitud de diferentes factores de crecimiento,
citocinas, matriz extracelular (ECM), moléculas más pequeñas, y
proteasas, mediante los queratinocitos alogénicos (Lang et
al., 1996; Marcusson et al., 1992). La complejidad y
multiplicidad de los factores liberados justifica la ventaja
terapéutica frente a las terapias individuales convencionales, por
ejemplo con factores de crecimiento aislados. Junto al efecto
principal de la reepitalización aparecen mediante el tratamiento con
queratinocitos, también cambios detectables macroscópica y
microscópicamente en el tejido de granulación (Lang et al.,
1996). Otro efecto beneficioso para los pacientes y a menudo
descrito de los queratinocitos se refiere a la marcada analgesia
después del transplante (Schönfeld et al., 1993).
Para la curación de heridas es ventajoso el
empleo de queratinocitos activos en el proceso de partición,
indiferenciados, puesto que parece que dichos queratinocitos
activos en el proceso de partición disponen de un complejo perfil
de secreción de apoyo para la curación de heridas. Con excepción de
las células madres, los queratinocitos indiferenciados pierden
in vivo su potencial de proliferación en el curso de la
natural diferenciación ya después de pocas particiones celulares,
un proceso que en cambio en el cultivo in vitro de los
queratinocitos siempre hasta ahora había sido observado (Barrandon
and Green, 1987). Por consiguiente, los queratinocitos activos en
la partición, particularmente apropiados hasta ahora para la
curación de heridas, sólo se podían cultivar finalmente in
vitro, lo cual hacía que su empleo en medicina fuera difícil y
costoso.
Los queratinocitos alogénicos se emplean
terapéuticamente, bien directamente en forma de las llamadas
"láminas de queratinocitos" que consisten en una agrupación de
células enzimáticamente disueltas compuestas de varias capas, o
juntamente con soportes biocompatibles con el nombre de "compresas
biológicamente activas para la curación de heridas". Finalmente,
tienen la ventaja de que dichas células no deben ser tratadas
enzimáticamente antes de su empleo disolviéndolas del fondo de la
cápsula de cultivo. Además el empleo de membranas biocompatibles
como soporte para el cultivo de queratinocitos (EP 0 462 462, US
5.658.331; US 5.693.332; EP 0 518 920), hace posible un temprano
acabado de la compresa biológicamente activa para curación de
heridas, puesto que las células no deben formar ninguna asociación
cerrada de células. Ya pueden emplearse los soportes crecidos
subconfluentemente para el tratamiento de heridas. Junto a una
temprana disponibilidad, el empleo de asociaciones celulares
subconfluyentes tiene adicionalmente la ventaja, de que con
respecto a los queratinocitos cultivados hay pocos fuertemente
diferenciados y de esta forma son ventajosos para el tratamiento de
heridas.
Los queratinocitos pueden crioconservarse sin
ningún efecto desventajoso para la curación de heridas directamente,
o juntamente con materiales de soporte biocompatibles, a
temperaturas entre -30 y -196ºC, de preferencia entre -70 y -90ºC
(De Luca et al., 1992; Teepe et al., 1993). Esto
mejora de nuevo su utilidad terapéutica, puesto que permite tener
en existencia una cierta provisión de compresas biológicamente
activas para curación de heridas.
Los queratinocitos conocidos en el estado actual
de la técnica así como sus compresas biológicamente activas
obtenidas para curación de heridas, están disponibles actualmente
con ciertas desventajas, cuya superación es un objetivo de la
presente invención.
Una manifiesta desventaja de los queratinocitos
de origen primario conocidos hasta el momento, consiste en que
dichas células, mediante el procedimiento de cultivo de células
in vitro, solamente pueden duplicarse pocas generaciones de
células sin perder su alta actividad de división y con ello su
preferida idoneidad para la obtención de compresas biológicamente
activas para curación de heridas. Según el estado actual de la
técnica al experto le es solamente posible multiplicar el número de
células mediante cultivo in vitro, alrededor de
aproximadamente 10^{3} a 10^{4} (Tanczos et al.,
1999).
Otra desventaja condicionada por lo expuesto,
consiste en que el cultivo in vitro de los citados
queratinocitos hace necesario una frecuente y costosa nueva
separación; lo cual tiene de nuevo como consecuencia que el material
de células obtenido y multiplicado no sea uniforme y con ello las
compresas de curación de heridas obtenidas presentan con una alta
probabilidad, diferencias de calidad o por lo menos pueden
presentarlas.
Otra desventaja consiste en que con el nuevo
aislamiento de los queratinocitos a partir de diferentes donantes
existe un alto riesgo de infección para los receptores de la
compresa de curación de heridas. Hay que pensar aquí, por ejemplo,
en un HIV ó un elevado riesgo de hepatitis.
\vskip1.000000\baselineskip
El objeto de la invención son los
queratinocitos, caracterizados porque, no están
inmortalizados y se pueden duplicar mediante el procedimiento de
cultivo celular in vitro por lo menos 150 veces, y porque se
trata de células del cultivo
KC-BI-1 (DSM ACC 2514), o se trata
de queratinocitos derivados de los mismos, en donde los
queratinocitos citados, no pueden duplicarse
- a.
- en ausencia de suero fetal de ternera y/o
- b.
- en ausencia de células Feeder y/o
- c.
- en ausencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF),
y en donde la actividad de los citados
queratinocitos en comparación con la línea celular HaCaT es menor
aproximadamente en un factor 2,
y en donde las células derivadas de
queratinocitos y los cultivos se generan y/o pueden ser generados
mediante subpasajes y/o subclonados del cultivo original
KC-BI-1 (DSM ACC 2514). A
consecuencia de esto resulta una multiplicación celular alrededor
de aproximadamente 10^{44} veces. Los correspondientes
queratinocitos conservan con ello sus ventajosas propiedades para
el tratamiento de heridas.
En los queratinocitos según la invención, se
trata de queratinocitos primarios cultivables in vitro
aislados de un donante, en donde el aislamiento y el cultivo
inicial puede ser efectuado por un experto por ejemplo por el
correspondiente procedimiento descrito por Rheinwald y Green
1975.
La invención se refiere a queratinocitos,
aislados de la parte epidérmica de un prepucio. Se depositaron
queratinocitos de origen humano, del cultivo
KC-BI-1, el día 27 de junio de 2001
en la DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Braunschweig, Alemania con el número de registro DSM ACC2514
para fines del procedimiento de patente según el Tratado de
Budapest. Dentro de la definición se incluyen también aquellos
queratinocitos que se derivan del cultivo
KC-BI-1 (DSM ACC2514). Objeto de la
invención son por lo tanto también todas las células y cultivos,
que se generan y/o puede ser generados mediante subpasaje y/o
subclonación del cultivo original
KC-BI-1.
El cultivo según la invención de los
queratinocitos está constituido por ejemplo para los queratinocitos
KC-BI-1 (ejemplo 1). Es ventajoso
para el cultivo, el empleo del medio complejo citado en el ejemplo
1, así como el empleo de células Feeder (en inglés,
células feeder; en alemán Ammenzellen: células enfermeras),
de preferencia el empleo de fibroblastos de ratones 3T3 irradiados
letalmente. La proporción de suero fetal de ternera debe ser entre
2 y 10%. La obtención de las células Feeder es ya conocida
por el experto, y puede efectuarse por ejemplo según el
procedimiento indicado en el ejemplo 2. Particularmente ventajoso es
el subcultivo de los queratinocitos según la invención con una
confluencia máxima del 80%. Los queratinocitos se pueden cultivar
de 35 a 38ºC, de preferencia 37ºC, con una humedad atmosférica de
> 90%, de preferencia el 95% y una saturación de CO_{2} del 5
al 9%.
Con el procedimiento representado en el ejemplo
1, el tiempo de duplicación de los queratinocitos está entre 1 y 2
días (figura 1). Las células se pueden cultivar mediante numerosos
pasajes con una tasa de duplicación casi constante (figura 2). La
presente invención no está limitada solamente a los queratinocitos
KC-BI-1, sino que para un experto
es también posible ejecutar la invención bajo las correspondientes
condiciones, con todos los queratinocitos según la reivindicación
1.
La expresión "no inmortalizados" significa
en referencia a la presente invención, que los queratinocitos
primarios aislados así como los queratinocitos puestos a cultivar
no se transforman espontáneamente ni han sido transformados por
conocidos procedimientos de biología molecular, químicos o físicos
mediante el estado actual de la investigación. Finalmente,
significa que las células no han sido tratadas ni con el empleo de
por ejemplo factores o secuencias virales, ni con substancias
químicamente mutágenas ni por ejemplo por irradiación o una
combinación de diferentes procedimientos.
Queratinocitos que "no están
inmortalizados" significa también que los citados queratinocitos
en comparación a líneas de células tumorales
(Härle-Bachor y Boukamp, 1993) o en comparación con
líneas celulares inmortalizadas, no presentan de preferencia en la
línea celular HeLA ninguna actividad telomerasa o presentan una
actividad esencialmente menor (ver figura 3). Esto sirve en
particular también, para la comparación con la línea celular de
queratinocitos inmortalizados HaCat.
La expresión "no inmortalizados" significa
además, que los queratinocitos citados no pueden ser duplicados en
ausencia de suero fetal de ternera y/o tampoco en ausencia de
células Feeder y/o tampoco en ausencia del factor de crecimiento
epidérmico (en inglés: epidermal growth factor, EGF), lo cual
si es posible por ejemplo en los queratinocitos inmortalizados
(Schoop et al., 1999).
La expresión "no inmortalizados" significa
también que los queratinocitos citados no cambian su fenotipo
característico con una duplicación celular creciente (ver figura
4).
Además la expresión "no inmortalizados"
significa también que los citados queratinocitos después del
transplante sobre los ratones inmunodeprimidos, de preferencia
ratones BALB/c, muestran un perfil normal de diferenciación.
"Potencial normal de diferenciación" significa aquí la
posibilidad de que los queratinocitos se desarrollen en
queratinocitos diferenciados terminalmente y formen capas
epidérmicas suprabasales así como un estrato córneo correspondiente
a queratinocitos autológicos.
Objeto de la invención son también aquellos
queratinocitos, que no están inmortalizados y que se pueden duplicar
por lo menos 200 veces mediante un procedimiento de cultivo de
células in vitro. La invención se refiere además a
queratinocitos que no están inmortalizados y que por lo menos pueden
duplicarse 250 veces mediante procedimientos de cultivo celular
in vitro. La invención se refiere además a aquellos
queratinocitos que no están inmortalizados y que por lo menos
pueden duplicarse 300 veces mediante un procedimiento de cultivo
celular in vitro.
La presente invención hace posible la ventajosa
multiplicación de los citados queratinocitos a partir de un solo
donante. A partir de un solo donante se pueden obtener por ejemplo
después de 150 duplicaciones celulares, 10^{44} células, después
de 250 duplicaciones celulares, se pueden obtener 10^{77} células,
y después de 300 duplicaciones celulares, se pueden obtener
10^{90} células. Por este motivo la invención hace posible en
primer lugar la preparación de grandes cantidades de material
celular estandarizado para la obtención de compresas biológicamente
activas para curación de heridas con una calidad constante y
controlable. Una cantidad correspondiente de material celular
estandarizado se puede por ejemplo multiplicar a partir de un banco
de células crioconservado, la cual es obtenida de nuevo a partir de
queratinocitos, los cuales tienen las propiedades de la
invención.
Con el empleo del material celular estandarizado
como material de partida para la obtención de compresas
biológicamente activas para curación de heridas, se disminuye
también el riesgo de infección para los posibles receptores, puesto
que el aislamiento de los queratinocitos queda limitado a un único
donante.
Con ello, la presente invención supera la
desventaja esencial actual, consistente en la posibilidad de hacer
pasajes de los queratinocitos conocidos hasta ahora, pero solamente
de una forma limitada.
Objeto de la invención es además un producto, el
cual consiste en un soporte, el cual está recubierto con los
queratinocitos según la invención. "Recubierto" en el sentido
de la invención, significa que el soporte está cubierto sobre su
superficie parcial o completamente con los queratinocitos según la
invención. Un soporte parcialmente cubierto es particularmente
apropiado puesto que se requiere un tiempo corto de cultivo hasta
que el soporte puede ser empleado para el tratamiento de
heridas.
Un soporte apropiado en el sentido de la
invención se caracteriza porque se trata de un material de
soporte biocompatible, el cual puede emplearse para la obtención de
un medicamento. Pueden emplearse por ejemplo, materiales de soporte
biocompatibles hidrófobos, como por ejemplo están descritos en la
patente WO 91/13638. Pueden emplearse también materiales de soporte
con propiedades preponderantemente hidrófilas.
Una versión preferida de la presente invención
consiste en el empleo de materiales de soporte que consisten en un
polímero del ácido hialurónico esterificado. En una versión
particularmente preferida se trata de un polímero del ácido
hialurónico esterificado, que consiste en una lámina de polímero
perforada con una geometría definida. La lámina de polímero tiene
por ejemplo un grueso de 10 a 500 \mum y está perforada con unos
orificios de un tamaño entre 10 y 1000 \mum, en donde los
orificios tienen un tamaño definido y constante y forman una serie
ordenada, en donde están separados entre sí por una distancia
constante de 50 a 1000 \mum. Una de esas láminas está descrita en
la patente EP 0 462 426. Los materiales de soporte perforados son
particularmente muy apropiados, puesto que no necesitan una
aplicación dirigida de la compresa biológicamente activa para
heridas, sobre la herida. En el ejemplo 3 se describe la obtención
como ejemplo de una matriz soporte perforada cubierta de
queratinocitos según la invención, de ácido hialurónico esterificado
con una geometría definida. La matriz de soporte es un producto
distribuido en Alemania con el nombre registrado de "Laserskin"
de la firma Fidia Advanced Biopolymers Ltd., Abano Terme,
Italia.
Italia.
La idoneidad particularmente preferida de este
material de soporte para la obtención de una compresa biológicamente
activa para heridas, en combinación con queratinocitos, ya ha sido
mostrada en un modelo animal (Lam et al., 1999) y en hombres
(Harris et al., 1999). Junto a una mejor migración y
diferenciación de las células epiteliales la matriz a base del
éster del ácido hialurónico tiene un efecto positivo sobre la
angiogénesis y la producción de colágeno. Las compresas para
heridas empleadas actualmente con éster de ácido hialurónico como
matriz están recubiertas con queratinocitos autológicos y/o
equivalentes cutáneos en forma de complejos de queratinocitos y
fibroblastos. Para ellos son válidas las desventajas descritas más
arriba del estado actual de la técnica. Esta desventaja puede
solventarse en particular mediante el empleo de los ventajosos
queratinocitos alogénicos según la invención.
Otra versión preferida de la invención se
refiere a un producto que consiste en los queratinocitos según la
invención juntamente con polímeros absorbibles a base de
poliésteres, policarbonatos, polianhídridos, poliortoésteres,
polidepsipéptidos, polieterésteres, poliaminoácidos o
polifosfazenos, en particular,
poli(L-láctido),
poli(D,L-láctido),
poli(L-láctido-co-D,L-láctido),
poli(glicólido), poli
(L-láctido-co-glicólido),
poli(L-láctido-co-trimetilen-carbonato)
o poli(dioxanona). Los citados polímeros están tanto
perforados como también sin perforar.
La presente invención se refiere igualmente a un
procedimiento para la crioconservación de los queratinocitos según
la invención a una temperatura de -20ºC a -196ºC, de preferencia a
una temperatura por debajo de los -180ºC. Los queratinocitos
citados se pueden congelar según un procedimiento estandarizado y
familiar para el experto. Como crioprotector se puede emplear entre
otros el DMSO. Además es posible también el empleo de otros
crioprotectores, como por ejemplo la glicerina, el
hidroxietilalmidón o una combinación de los dos así como una
combinación de éstos con el DMSO. Los correspondientes
procedimientos están descritos en las patentes WO 96/24018, US
5.891.617 ó también en la patente US 5.298.417.
Objeto de la presente invención es también la
crioconservación de los soportes recubiertos con queratinocitos
según la invención, caracterizado porque, los queratinocitos
son crioconservados con el correspondiente soporte a una
temperatura de -20ºC hasta -196ºC, de preferencia a -60ºC hasta
-80ºC. La crioconservación tiene la ventaja de que pueden
almacenarse grandes cantidades de producto obtenido y con ello
pueden ser investigados aleatoriamente antes de su empleo médico
para determinar su calidad individual. El almacenamiento hace
posible finalmente también que las compresas para heridas citadas,
estén disponibles a corto plazo para fines médicos.
Como crioprotector para el producto según la
invención es apropiado por ejemplo el hidroxietilalmidón en una
concentración de 7-13% (p/p). También es posible el
empleo o del DMSO ó de glicerina así como una combinación de
distintos crioprotectores, en particular del hidroxietilalmidón,
DMSO y/o glicerina. Además es posible también el empleo de la
trehalosa como crioprotector.
Después de un rápido descenso de la temperatura
de 37ºC hasta de -5 a -10ºC, de preferencia de -6 a -8ºC en el
intervalo de 2-5 minutos, se equilibra el producto
según la invención, del soporte y los queratinocitos a una
correspondiente temperatura durante 15-30 minutos,
de preferencia durante 23-26 minutos. A
continuación, se enfría el producto con una tasa de enfriamiento
< 1ºC/minuto, de preferencia de 0,2 hasta 0,6ºC/minuto, con
particular preferencia de 0,4ºC/minuto a una temperatura de por
ejemplo -60 a -80ºC.
El ejemplo 4 describe por ejemplo la
crioconservación de una matriz soporte de éster de ácido hialurónico
recubierta con KC-BI-1. También es
posible emplear otro procedimiento para la crioconservación, por
ejemplo los procedimientos descritos en las patentes WO 95/707611,
WO 96/24018, EP 0 296 475, en donde la enumeración no debe
entenderse como concluyente, sino que solamente remite a que el
procedimiento para la crioconservación de productos que constan de
soportes biocompatibles y queratinocitos, pertenece al actual estado
de la técnica.
La presente invención se refiere también al
empleo en medicina de los queratinocitos según la invención aquí
descritos y/o del producto descrito de los citados queratinocitos y
un soporte, en particular sobre el empleo para el tratamiento de
heridas. Una versión de la invención representa el empleo de los
queratinocitos según la invención y/o del producto de los citados
queratinocitos y un soporte para el tratamiento de quemaduras y/o
úlceras. En las quemaduras tratables se trata de preferencia de
quemaduras de segundo grado, en las úlceras se trata de preferencia
de úlceras crónicas de la pierna difíciles de curar, del tipo
Ulcus cruris, de preferencia Ulcus cruris venosum o
también de úlceras diabéticas, adicionalmente también se trata de
úlceras por decúbito.
El empleo en medicina comprende un empleo
combinado y/o completado de los citados queratinocitos y/o del
producto según la invención a base de queratinocitos y un soporte
con clásicas terapias ya conocidas por el experto con un efecto
positivo para la curación de heridas. A este respecto se cita un
empleo combinado y/o de complemento de uno o varios otros productos
con un efecto positivo para la curación de heridas. Por ejemplo,
debe mencionarse aquí el tratamiento complementario y/o combinado
del Ulcus cruris venosum con compresas de hidrocoloide y/o
el empleo adicional de substancias antimicrobianas, por ejemplo la
adición de antibióticos.
Objeto de la invención es igualmente el empleo
de los queratinocitos según la invención, y/o del producto de un
soporte biocompatible y los citados queratinocitos para la obtención
de un producto médico para el tratamiento de heridas, en particular
para el tratamiento de quemaduras y/o úlceras, como por ejemplo,
para el tratamiento de quemaduras de segundo grado, de Ulcus
cruris (venosum), de úlceras diabéticas, o de úlcera por
decúbito.
Objeto de la invención es además también un
procedimiento para el tratamiento de las citadas heridas, en donde
el procedimiento se caracteriza porque se aplican los queratinocitos
según la invención y/o el producto según la invención a base de
queratinocitos y un soporte, sobre la herida a tratar. Los citados
queratinocitos y el citado producto, pueden emplearse o bien recién
obtenidos, o bien después de la crioconservación. Un correspondiente
procedimiento para el tratamiento de heridas está descrito en el
ejemplo 5.
Figura 1: Duplicación de las células de los
queratinocitos KC-BI-1 en función
del tiempo de cultivo. Está representado el número de
duplicaciones de células (CPD = Cumulative Population Doublings)
(duplicaciones acumulativas de la población) de los queratinocitos
KC-BI-1 durante un tiempo de cultivo
de 94 días (days). Dentro de los 94 días observados, se duplican
las células aproximadamente 75 veces. Esto corresponde a un tiempo
de duplicación medio de 1,25 días por duplicación de células, ó 12,5
cada 10 días.
Figura 2: Duplicación de los queratinocitos
KC-BI-1 durante un período de tiempo
de 10 meses. Se representa la duplicación de las células de los
queratinocitos KC-BI-1 durante 10
meses, indicada como duplicaciones de la población (PD) en función
de los pasajes celulares (Passage) 1-67.
Figura 3: Determinación de la actividad
telomerasa relativa. Se representa la actividad telomerasa
relativa para los queratinocitos
KC-BI-1 después del pasaje 1, 12,
18, 40 y 57, en comparación con la actividad de la línea celular
HeLa. La figura muestra para los queratinocitos
KC-BI-1 casi ninguna actividad
telomerasa o solamente una pequeña actividad telomerasa en
comparación con la línea celular inmortalizada HeLa.
Figura 4: Morfología de los queratinocitos
KC-BI-1 después de los pasajes 5 y
60. Los queratinocitos KC-BI-1
no muestran en la representación microscópica óptica ninguna
diferencia morfológica entre el pasaje de células 5 (tiempo de
cultivo 25 días) y el pasaje de células 60 (tiempo de cultivo 300
días).
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Ejemplo
1
Queratinocitos
KC-BI-1; fibroblastos de ratón 3T3
irradiados (células enfermeras, en inglés:
feeder-cells, ver obtención en el ejemplo 2); medio
de cultivo de las células K/-1 (composición ver más adelante); EDTA
(0,02%); tripsina/EDTA (0,05%/0,01%); frascos para el cultivo de
las células: 25 cm^{2}, 80 cm^{2}, 175 cm^{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Descongelar rápidamente las células y añadir a
5-10 ml de medio K/1 previamente calentado. Se
transfiere una correspondiente cantidad de células Feeder en un
frasco de cultivo de células apropiado y se completa con medio
K/1:
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\vskip1.000000\baselineskip
Las células Feeder puede emplearse enseguida o
al cabo de 24 horas.
\newpage
Descongelar rápidamente las células y añadir a
5-10 ml de medio K/1 previamente calentado. Se añade
una correspondiente cantidad de células a las frascos de cultivo de
células preparados con células Feeder y se completa con medio
recién preparado:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La incubación de las células tienen lugar al
35-39º, de preferencia a 37ºC. La humedad
atmosférica es > 90%, de preferencia 95%, y la concentración de
CO_{2} es del 5-9%. Los queratinocitos se
subcultivan con una confluencia máxima del 80%.
Para ello, se descarta el sobrenadante del
cultivo de las células. Las células Feeder se disuelven lavando dos
veces con 0,02% de EDTA (2-10 ml) y una incubación
durante 5-10 minutos a 37ºC mediante subsiguientes
golpecitos (o agitando) en el frasco de cultivo celular. A
continuación se disuelven cuidadosamente los queratinocitos después
de un tratamiento con tripsina/EDTA (0,05%/0,01%,
1-6 ml) durante 5-10 minutos a
37ºC, mediante pequeños golpecitos. En caso necesario, se disuelve
cuidadosamente el resto de células con un rascador de células. La
solución de tripsina/EDTA se neutraliza mediante la adición de medio
K/1 y las células se aíslan pipeteando cuidadosamente. La siembra
de las células tiene lugar con el número de células dado en 2.2. El
medio de cultivo de las células K/1 se intercambia el día 3 y a
continuación cada dos días.
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Todos los componentes así como las soluciones
madre se añaden uno detrás de otro en el orden correspondiente a la
serie citada en la tabla 1. La mezcla se completa hasta 1 litro con
WFI (en inglés: water for injection (agua para inyección)).
A continuación se ajusta el pH con NaOH ó HCl de 7,0 a 7,2. La
osmolaridad debe estar entre 320-400 mOsm/kg. A
continuación, se filtra el medio K/1 para dejarlo estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
Disolver 13,6 mg de triiodotironina en 1 ml de
NaOH 0,1M y añadir 99 ml de PBS. Diluir la solución 1:100 en PBS
para preparar la solución para ser usada. Por cada litro de medio se
necesita 1 ml de esta solución.
\vskip1.000000\baselineskip
Disolver 1 mg de EGF en 100 ml de WFI. Por cada
litro de medio se necesita 1 ml de esta solución.
\vskip1.000000\baselineskip
Insulina rh (solamente soluble a pH <
4,0)
Se añaden 5 g de insulina-rh a
0,9 litros de WFI y se ajusta el pH con HCl 6M hasta 2,5. Una vez se
ha disuelto la insulina-rh, ajustar el pH con NaOH
1M a 8,0. La mezcla se completa con WFI hasta 1 litro. Por cada
litro de medio se necesita 1 ml de esta solución.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo de las células puede también
efectuarse a partir del material de biopsia recién preparado, por
ejemplo a partir del componente epidérmico de un prepucio. El
aislamiento primario de los queratinocitos indiferenciados,
proliferantes, puede efectuarse según el procedimiento descrito por
Rheinwald y Green 1975.
Como células Feeder pueden emplearse las células
descritas en el ejemplo 2. Además, es concebible también el empleo
de otros fibroblastos letales, de preferencia el empleo de otros
fibroblastos murinos, con particular preferencia, descendientes de
la línea celular 3T3.
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Ejemplo
2
Fibroblastos 3T3 de ratón (por ejemplo ATCC CCL
92,3T3-Swiss albino, fibroblastos inhibidos al
contacto) que pueden obtenerse en la American Type Culture
Collection (Colección de cultivos tipo americanos) (ATCC), 10801
University Boulevar, Manassas, VA, USA, DMEM+ 10% de suero fetal de
ternera (FCS); PBS; 0,2% de solución de tripsina; 0,04% de solución
de EDTA; frascos de cultivo de células (frascos T): 25 cm^{2}, 80
cm^{2}, 175 cm^{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se descongelan rápidamente las células y se
añaden a 5-10 ml de medio previamente calentado. El
medio conteniendo DMSO se separa después de la centrifugación. Se
suspenden las células en 5-10 ml del medio. Después
de la determinación del número de células, se siembran las células
con una densidad de 10^{3} a 10^{4} células/cm^{2} en frascos
de cultivo celular adecuados. La incubación tiene lugar a
35-39ºC, de preferencia a 37ºC. La humedad
atmosférica es > 90%, con preferencia 95%, y la concentración de
CO_{2} es del 5-9%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determina diariamente el crecimiento de las
células. La densidad de las células no debe sobrepasar una
confluencia máxima del 70-80%. El subcultivo tiene
lugar según la experiencia cada 2 a 4 días. Para ello se descarta
el medio y las células se lavan con una cantidad apropiada de una
mezcla 1-2 de EDTA y tripsina (0,5-5
ml). A continuación, se disuelven de nuevo las células disueltas en
3,5-20 ml del medio. Las células se siembran de
nuevo con una densidad de 10^{3} a 10^{4} células/cm^{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
La irradiación de las células Feeder tiene lugar
con una dosis de aproximadamente 60 Gy (6000 rads en una fuente de
Cs^{137}).
Tanto las células irradiadas como las células no
irradiadas se pueden crioconservar según protocolos estándar en
nitrógeno líquido, y almacenar durante largo tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
A continuación se describe como ejemplo la
obtención de la compresa biológicamente activa para curación de
heridas según la invención. La compresa para curación de heridas
aquí descrita se compone de queratinocitos
KC-BI-1 según la invención y
Laserskin, una matriz de soporte bioabsorbible a base de éster de
ácido hialurónico.
La invención no está limitada por ello a la
combinación aquí descrita. Por el contrario pueden emplearse todos
los queratinocitos para el recubrimiento, que dispongan de las
características innovadoras según las reivindicaciones
1-8.
Además es concebible también el empleo de otras
matrices de soporte apropiadas, con la condición de que se trate de
un material de soporte biocompatible que pueda ser empleado para la
obtención de un medicamento. Pueden emplearse por ejemplo,
materiales de soporte biocompatibles hidrófobos, como por ejemplo se
describen en la patente WO 91/13638. Además, pueden emplearse
también materiales de soporte con propiedades preponderantemente
hidrófilas.
Otra versión preferida de la invención está en
el empleo de los queratinocitos según la invención juntamente con
polímeros absorbibles, compuestos de poliéster, policarbonatos,
polianhídridos, poliortoésteres, polidepsipéptidos,
polieterésteres, ácidos poliamínicos o polifosfazenos, en
particular, de poli(L-láctido),
poli(D,L-láctido),
poli(L-láctido-co-D,L-láctido),
poli(glicólido),
poli(L-láctido-co-glicólido),
poli(L-láctido-co-trimetilen-carbonato)
ó poli (dioxanona) así como el empleo de láminas perforadas, a base
de los citados polímeros.
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Medio K/1 (ver ejemplo 1); PBS, 0,04% de EDTA
(se diluye con PBS hasta 0,02%); tripsina/EDTA (0,05%/0,01%);
cápsulas Roux estériles (T 25 cm^{2}, T 80 cm^{2}, T 175
cm^{2}), Laserskin (de la firma Fidia dvanced Biopolymers sr1,
Abano Terme, Italia) en cápsulas Petri de 144x 21 (superficie 145
cm^{2}); células Feeder 3T3; queratinocitos según la invención
como en el ejemplo KC-BI-1.
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Células Feeder irradiadas, por ejemplo
los fibroblastos 3T3 de los ratones descritos en el ejemplo 2;
queratinocitos según la invención a partir del stock madre; trozo de
tamaño 8,5 cm x 8,5 cm de Laserskin en una cápsula de Petri
(producto acabado); medio K/2.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células Feeder, obtenidas según el
ejemplo de ejecución 2, se aplican con una densidad de siembra de
aproximadamente 15.000 a 25.000 células/cm^{2} (corresponde
aproximadamente a 3 x 10^{6} células/cápsula de Petri) sobre
Laserskin. La cápsula de Petri se incuba a continuación con > 90%
de humedad atmosférica y 5-11% de CO_{2}, de
preferencia 7-9% en una estufa de incubación a 37ºC,
de 35 a 37ºC. Los queratinocitos se siembran o bien el mismo día o
a lo más tarde al día siguiente (después de 24 horas, sobre las
capas de células Feeder.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan compresas para curación de heridas
biológicamente activas con queratinocitos según la invención. El
subcultivo de los queratinocitos puede efectuarse por ejemplo como
se describe a continuación: Los cultivos subconfluentes se lavan
una vez con 0,02% de EDTA (cápsulas Roux de 80 cm^{2}: 8 ml;
cápsula Roux de 175 cm^{2}: 10 ml). A continuación se incuban las
células Feeder con 0,02% de EDTA durante 5-10
minutos a 37ºC (cápsulas de Roux de 80 cm^{2}: 8 ml; cápsulas de
Roux de 175 cm^{2}: 10 ml), y se disuelve mediante una cuidadosa
agitación.
Los queratinocitos se disuelven
correspondientemente al ejemplo de ejecución 1 con una mezcla de
tripsina/EDTA (0,05%/0,01%) (cápsulas de Roux de 80 cm^{2}:
2-3 ml; cápsulas de Roux de 175 cm^{2}:
5-6 ml), a continuación se toman en un medio de
cultivo de células (cápsulas de Roux de 80 cm^{2}:
7-8 ml; cápsulas de Roux de 175 cm^{2}:
14-15 ml) y se separan mediante un cuidadoso
pipeteado.
Sobre la lámina de Laserskin preparada con
células Feeder, se aplican los queratinocitos según la invención
con una densidad de siembra de aproximadamente 15.000 a 25.000
células/centímetro cuadrado (corresponde aproximadamente a 3 x
10^{6} células/cápsula de Petri). A continuación se incuban las
células hasta una confluencia de 30-100%, de
preferencia de 80-100% a 35-39ºC, de
preferencia a 37ºC. La humedad atmosférica es > 90%, de
preferencia 95%, y la concentración de CO_{2} es del
5-9%.
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Ejemplo
4
Después de que los queratinocitos de la matriz
soporte hayan crecido con una confluencia del
30-100%, de preferencia del
80-100%, el producto según la invención puede ser
congelado controladamente en recipientes adecuados, por ejemplo en
frascos soldables de PP. Para ello se elimina cuidadosamente el
medio de cultivo y se intercambia por 20 ml a 2-6ºC
de medio de congelación frío K/2. El producto se envasa a
continuación de forma estéril y se congela correspondientemente al
siguiente programa:
Después de una disminución rápida de la
temperatura de -5 a -10ºC, de preferencia -6 a -8ºC en el intervalo
de 2-5 minutos se equilibra el producto a la
correspondiente temperatura durante 15-30 minutos,
de preferencia durante 23-25 minutos. A
continuación se enfría el producto con una tasa de enfriamiento de
<1ºC/minuto, de preferencia de 0,2 a 0,6ºC/minuto, con
particular preferencia de 0,4ºC/minuto a una temperatura de por
ejemplo -60 a -80ºC. El almacenamiento del producto tiene lugar de
-60ºC a -80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio de crecimiento K/1 (ver ejemplo 1)
mezclado con 7-13% (p/p) de hidroxietilalmidón.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Después de que los queratinocitos hayan crecido
un 30-100%, de preferencia 180-100%
confluentes sobre el Laserskin, se lava una vez o respectivamente
varias veces el cultivo con una cantidad apropiada, de preferencia
30 ml de medio de transporte K/3. Se transportan las compresas
biológicamente activas para curación de heridas en una cantidad
apropiada, de preferencia en 20 ml de medio de transporte K/3. El
espacio en cabeza de la cápsula de Petri se gasea brevemente con
una mezcla de aire y el 5-10% de CO_{2}, se cierra
con una banda adhesiva por ejemplo de Parafilm, y se lleva
enseguida en una caja de transporte a la clínica.
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Medio de crecimiento K/1 (ver ejemplo 1) sin
suero fetal de ternera (FCS). Es concebible sin embargo
también el empleo de soluciones salinas fisiológicas sencillas por
ejemplo a base de fosfato-borato, por ejemplo, PBS,
ó también de HEPES (ácido
N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etansulfónico),
o a base de MES (ácido
[2-N-morfolinilo]etansulfónico).
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Las compresas crioconservadas para curación de
heridas pueden suministrarse a las clínicas típicamente con hielo
seco. Es concebible sin embargo también otra forma de transporte, en
tanto las compresas para curación de heridas se transporten a una
temperatura por debajo de los -60ºC.
Se descongelan rápidamente las compresas
crioconservadas para curación de heridas. A continuación se elimina
el medio de congelación y se lava la compresa una o varias veces con
medio de transporte K/3 (ver más arriba) u otra solución
fisiológica apropiada, por ejemplo, solución de Ringer).
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La compresa se aplica a continuación sobre la
herida. Cuando se emplea materiales de soporte no perforados es
necesario una correcta aplicación de la compresa para curar heridas
con las células en dirección a la herida. El empleo de soportes
perforados, los cuales hacen posible un crecimiento por ambos lados
del soporte con los queratinocitos (por ejemplo el Laserskin), no
precisa ninguna correcta aplicación de la compresa para curar
heridas según la invención sobre la herida a tratar. Según el éxito
de la terapia puede repetirse el tratamiento varias veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Las células
KC-BI-1 se subcultivaron según el
método según la invención descrito más arriba mediante varios
pasos. Las células de los pasos 4, 13 y 121 se sometieron a
continuación a un análisis genético, en donde se investigó el
polimorfismo en longitud de 15 diferentes sitios génicos (CSF1PO,
D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D3S1358,D5S818, D7S820, D8S1179,
FGA, Penta D, Penta E, TH01, TPOX y vWA). El análisis se efectuó
según un procedimiento ya conocido en la técnica actual. Para ello
se amplificaron los correspondientes alelos mediante el empleo de
un test para la determinación de la paternidad (PoewerPlex® 16
System) de la firma Promega (Mannheim, Alemania), de conformidad
con los datos del fabricante. Los alelos pudieron ser identificados
mediante la determinación de la longitud del fragmento (el estándar
de longitud ILS 600 es un componente del kit antes citado). Los
datos de las frecuencias de los alelos en la población pueden
extraerse de las correspondientes tablas.
El análisis muestra una coincidencia del
conjunto de los alelos con el conjunto de los sitios génicos, para
todos los pasos celulares analizados. Los datos permiten una
asignación genética de las células
KC-BI-1. A partir de las
frecuencias de los alelos, se determinó una probabilidad de
asignación > del 99,999%.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Determinación del polimorfismo en longitud del
ADN:
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Claims (18)
-
\global\parskip0.970000\baselineskip
1. Queratinocitos, caracterizados porque, no están inmortalizados, y se pueden duplicar por lo menos 150 veces mediante un procedimiento de cultivo celular in vitro, y porque se trata de células del cultivo KC-BI-1 (DSM ACC 2514), ó de queratinocitos derivados de los mismos, en donde los citados queratinocitos no pueden duplicarse- a.
- en ausencia de suero fetal de ternera, y/o
- b.
- en ausencia de células Feeder y/o
- c.
- en ausencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF)
y en donde la actividad telomerasa de los citados queratinocitos en comparación con la línea celular HaCaT es menor, por lo menos en un factor 2,y en donde las células y cultivos de los queratinocitos derivados se generan y/o pueden ser generados mediante subpasajes y/o subclonados del cultivo original KC-BI-1 (DSM ACC 2514).\vskip1.000000\baselineskip
- 2. Producto que consta de un soporte, el cual está recubierto de queratinocitos según la reivindicación 1,
- a.
- en donde el soporte está cubierto parcialmente con queratinocitos; o
- b.
- en donde el soporte está cubierto completamente con queratinocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
- 3. Producto según la reivindicación 2, caracterizado porque, el soporte se trata de un material de soporte biocompatible, el cual puede emplearse para la obtención de un medicamento.
- 4. Producto según la reivindicación 3, caracterizado porque, el material de soporte es una membrana biodegradable hidrófoba o hidrófila.
- 5. Producto según las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque, el soporte se trata de un polímero de ácido hialurónico esterificado, de preferencia una lámina de polímero perforada con una geometría definida, en donde la lámina de polímero tiene un grueso de 10 a 500 \mum y está perforada con agujeros con un tamaño entre 10 y 1000 \mum, en donde los orificios tienen un tamaño definido y constante, y forman una serie ordenada, en donde están separados entre sí a una distancia constante de 50 a 1000 \mum.
- 6. Producto según las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque, el material de soporte se trata de poliésteres, policarbonatos, polianhídridos, poliortoésteres, polidepsipéptidos, polieterésteres, ácidos poliamínicos o polifosfazenos,
- a.
- en particular se trata de poli(L-láctido), poli(D,L-láctido), poli(L-láctido-co-D,L-láctido), poli(glicólido), poli (L-láctido-co-glicólido), poli(L-láctido-co-trimetilen-carbonato) o poli(dioxanona),
- b.
- en donde los citados polímeros están perforados, o
- c.
- no están perforados.
\vskip1.000000\baselineskip
- 7. Procedimiento para la crioconservación de los queratinocitos según la reivindicación 1, o un producto según las reivindicaciones 2-6, en el cual los queratinocitos o el producto se crioconservan a una temperatura de -20ºC a -196ºC, de preferencia de -60 a -80ºC.
- 8. Queratinocitos según la reivindicación 1 ó producto de queratinocitos y soporte, según las reivindicaciones 2-6, los cuales/el cual están/está tratados/tratado según el procedimiento descrito en la reivindicación 7.
- 9. Queratinocitos según las reivindicaciones 1 y 8, ó producto según las reivindicaciones 2-6, para el empleo en medicina.
- 10. Empleo de los queratinocitos según la reivindicación 1 y 8, ó de un producto según las reivindicaciones 2-6, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de heridas.
- 11. Empleo según la reivindicación 10, en donde en el caso de las heridas se trata de preferencia de quemaduras y/o úlceras.
- 12. Empleo según la reivindicación 11, en donde en el caso de las heridas se trata de preferencia de quemaduras de segundo grado.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- 13. Empleo según la reivindicación 11, en donde en el caso de las heridas se trata de preferencia de úlceras de la pierna crónicas que curan difícilmente, del tipo Ulcus cruris, de preferencia Ulcus cruris venosum.
- 14. Empleo según la reivindicación 11, en donde en el caso de las heridas se trata de preferencia de un Ulcus asociado a la diabetes.
- 15. Empleo según la reivindicación 11, en donde en el caso de las heridas se trata de preferencia de un decubitus.
- 16. Empleo según las reivindicaciones 11-15 como complemento a, o en combinación con, el empleo de una o varias otras substancias con un efecto positivo para la curación de heridas.
- 17. Empleo según la reivindicación 16, en donde en el caso de la otra substancia se trata de compresas de hidrocoloide.
- 18. Empleo según la reivindicación 16, en donde en el caso de la otra substancia se trata de substancias antimicrobianas, como por ejemplo antibióticos.
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