DE19917532A1 - Trägergebundene kultivierte Stamm-bzw. Vorläuferzellen von Keratinozyten - Google Patents

Trägergebundene kultivierte Stamm-bzw. Vorläuferzellen von Keratinozyten

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Abstract

Die Erfindung betrifft auf Träger gebundene Stamm- bzw. Vorläuferzellen der Oberhaut, die z. B. aus der äußeren Haarwurzelscheide gewonnen und in der Zellkultur vermehrt wurden. Die Anwendungsmöglichkeiten liegen auf dem medizinischen und kosmetischen Sektor. Die trägergebundenen Zellen können als Ersatz für eine plastische Deckung auf Wunden aufgebracht oder nach Entfernen z. B. alters- oder UV-geschädigter Oberhaut zur Reepithelisierung verwendet werden. Die Zellen werden auf den Träger fixiert, indem sie darauf kultiviert werden oder indem der Träger nach erfolgter Kultivierung auf die Zellen fixiert wird.

Description

Die Erfindung betrifft auf einen Träger gebundene Stamm- bzw. Vorläuferzellen von Keratinozyten, insbesondere ORS-Zellen (outer root sheath = äußere Haarwurzelscheide), welche aus den tieferen Anteilen ausgezupfter Anagenhaare z. B. aus dem okzipitalen Haarkranz isoliert wurden.
ORS-Zellen sind im Verlaufe des Lebens nicht kontinuierlich durch Ultraviolett- Exposition geschädigt worden, wie das insbesondere in chronisch lichtexponierten Hautarealen wie Gesicht oder gegebenenfalls dem Glatzenbereich bei den üblicherweise nach oberflächlichen Hautdefekten die Epidermis regenerierenden Keratinozyten aus den ortsständigen Hautanhangsgebilden der Fall ist.
Die Anwendungsmöglichkeiten dieser trägergebundenen Zellen zur Regeneration der Epidermis liegen im medizinischen oder kosmetischen Bereich (ORS-Zelltechnologie vgl. US-Patentantrag 2688-0102P, 1997). Die klinische Anwendung erfolgt nach Operationen, Verletzungen oder bei anderen akuten oder chronischen Hautdefekten bzw. aus sonstigen medizinischen (Vorstadien der malignen Entartung wie aktinische Keratosen) oder kosmetischen Gründen, z. B. bei Altersschäden der Haut, indem - gegebenenfalls nach Entfernen der geschädigten Epidermis etwa mittels Laser oder Dermabrasio - die trägergebundenen Zellen auf die Wundflächen aufgebracht werden und anstelle der ortsständigen Keratinozyten die Reepithelialisation vornehmen (sog. skin resurfacing), oder die trägergebundenen Zeilen als Ersatz für eine plastische Deckung auf die Wunde gebracht werden.
Die Fixierung an den Träger erfolgt z. B. durch Kultivierung auf biokompatiblen Folien z. B. aus PTFE oder Hyaluronsäureverbindungen oder durch Aufkleben eines biokompatiblen Materials, wie Fibrin, an die kultivierten Zellen. Zweck der Bindung bzw. Kultivation an dem Träger ist es, die Handhabung der kultivierten Zellen zu vereinfachen. So dient der Träger als stabilisierendes Element beim Transfer vom Kulturgefäß auf die Wunde und in der Phase des Anwachsens auf dem Wundgrund, die Zellen können dabei auf die zu behandelnde Körperstelle aufgetragen werden, ohne sie enzymatisch vom Untergrund, auf dem sie gewachsen sind, ablösen zu müssen.
Die klinische Anwendung erfolgt z. B. nach Operationen, Verletzungen oder bei anderen akuten oder chronischen Hautdefekten, oder insbesondere nach Entfernung altersgeschädigter Epidermis aus kosmetischen (Altershaut, sog. skin resurfacing) oder medizinischen (Vorstadien der malignen Entartung wie aktinische Keratosen) Gründen. Eine gegebenenfalls erforderliche Entfernung der geschädigten Epidermis erfolgt dabei zum Beispiel durch Laserapplikation oder durch Dermabrasio.
Hintergrund der Erfindung/State of the art
Problem: Zusätzlich zur chronobiologischen Hautalterung tritt in chronisch lichtexponierten Hautarealen wie zum Beispiel Gesicht, Handrücken oder gegebenenfalls einer Glatze eine durch kumulative Ultraviolett-Exposition induzierte Alterung der Haut auf, welche sich im Bereich der Epidermis mit fleckförmigen Pigmentverschiebungen, Atrophie bis hin zu beginnender maligner Entartung im Sinne von aktinischen Keratosen äußert, und welche durch degenerative Veränderungen des dermalen Bindegewebes zu feiner bis gröberer Hautfaltenbildung führt.
Ein in der Kosmetik in den letzten Jahren etablierter Therapieansatz ist das sogenannte skin resurfacing, bei welchem durch chemisches Peeling oder mittels Lasertechnologie bzw. Dermabrasio oberflächlich die Epidermis entfernt wird. Die entstehenden Wundflächen werden durch Migration und Proliferation von Keratinozyten aus den ortsständigen Hautanhangsgebilden wieder reepithelialisiert. Diese Keratinozyten haben jedoch durch ihre Lokalisation in den chronisch lichtexponierten Hautarealen ebenfalls eine - wenn auch geringere als die oberflächlichen interfollikulären Keratinozyten - lebenslange Ultraviolett-Exposition erfahren. Anders stellt sich in der Regel die Situation für in der Tiefe der Haaranlagen des Kapillitiums lokalisierte Zellen der äußeren epithelialen Haarwurzelscheide, z. B. aus Anagenhaaren des okzipitalen Haarkranzes, dar, da das ultraviolette Licht nicht in größerem Ausmaß durch die Haare penetriert. Diese Zellen haben somit nur die chronobiologische Alterung durchgemacht. Ein Hinweis für die Relevanz dieser Gegebenheiten mag die Tatsache sein, dass sich diese ORS-Zellen (outer root sheath = äußere Haarwurzelscheide) aus dem Kapillitium selbst von sehr betagten Patienten gut in vitro vermehren lassen, während dies für interfollikuläre Keratinozyten, das heißt Keratinozyten aus der oberflächlichen Epidermis, bekanntermaßen nicht der Fall ist.
Die therapeutische Anwendung aus interfollikulären Keratinozyten gezüchteter mehrschichtiger epidermaler Strukturen ist in den letzten Jahren oft durchgeführt worden. Problem dabei ist, daß die Zellen enzymatisch behandelt werden müssen, damit sie sich vom Untergrund, auf dem sie gezüchtet worden sind, ablösen, um sie klinisch einsetzen zu können. Dieser Prozeß ist umständlich und zeitraubend und es besteht die Gefahr, daß für das Anwachsen wichtige Oberflächenstrukturen der Zellen zerstört werden und so die Anwachsrate beeinträchtigt wird.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, nach Entfernen der altersgeschädigten Keratinozyten die Regeneration der Epidermis durch die vitalere, weniger Ultraviolett­ geschädigte autologe Keratinozyten-Stamm- bzw. Vorläuferzell-Population aus der äußern Haarwurzelscheide von Haaren des Patienten stattfinden zu lassen, um längerfristig eine bessere Hautqualität zu erreichen.
Mit der beschriebenen Technologie lassen sich natürlich auch weitere Hautdefekte, z. B. nach Operationen oder Verletzungen, oder auch chronische Wunden, behandeln. Ziel ist ferner die Vermeidung der enzymatischen Ablösung der kultivierten Zellen vom Untergrund im Vorfeld der therapeutischen Anwendung.
Eigene Arbeiten im Vorfeld der Erfindung Zellkultivierung
Die Isolierung und Anzüchtung in der Primärkultur sowie die Subkultivierung von Zellen der äußeren epithelialen Haarwurzelscheide aus ausgezupften Anagenhaaren wurde in den letzten Jahren von Limat et al. weiterentwickelt und auch der Einsatz solcher Zellen als autologer, d. h. patienteneigener Hautersatz dokumentiert (Limat, A. et al., "Successful treatment of chronic leg ulcers with epidermal equivalents generated from cultured autologous outer root sheath cells", J. Invest. Dermatol. 107: 128-135, 1996).
Daten aus der Literatur weisen darauf hin, daß die ORS-Zellen Vorläuferzellen mit hoher proliferativer Kapazität für Keratinozyten enthalten. Aus diesem Grund stellen sie die bestgeeigneten Zellen zur Epidermisregeneration dar.
Die Isolierung von ORS-Zellen stellt keinen invasiven Eingriff dar und es entstehen, im Gegensatz zur autologen Hauttransplantation, keine neuen Wunden. Aus diesem Grunde ist eine wiederholte Entnahme ohne weiteres möglich.
Haare werden z. B. aus der lateralen und occipitalen Region der Patienten-Kopfhaut gezupft, die Haarfollikel samt ORS-Zellen präpariert und anschließend auf eine mikroporöse Membran explantiert. Die Membran trägt auf der Unterseite einen Zelirasen aus teilungsinaktivierten Fibroblasten menschlicher Herkunft. Nach ca. zwei Wochen haben sich die auswachsenden ORS-Zellen so weit vermehrt, daß sie entweder eingefroren oder direkt für die Herstellung von Keratinozyten-Transplantaten eingesetzt werden können.
Alternativ können die ORS-Zellen durch enzymatische Behandlung der Haarfollikel, z. B. mittels Trypsin-lnkubation, dissoziiert und zusammen mit Hilfe der o. g. teilungs­ inaktivierten Feeder-Fibroblasten menschlicher Herkunft in der Primärkultur propagiert werden.
Durch das Einfrieren der kultivierten ORS-Zellen ist man in der Lage, je nach Bedarf zu jedem gewünschten Zeitpunkt Keratinozyten-Transplantate herzustellen und somit einen flexiblen Algorithmus für die Epidermis-Regeneration zu wählen.
Des weiteren wurde die Anwendung von homologem bzw. autologem Serum als Zusatz zum Kulturmedium anstelle des in der Keratinozytenkultivierung bisher üblichen foetalen Kälberserums - auch unter Weglassen von weiteren nicht definierten biologischen Zusätzen wie Rinderhypophysenextrakt - im Hinblick auf den therapeutischen Einsatz der kultivierten ORS-Zellen eingeführt. Die Etablierung der ORS-Zelltechnologie zur Behandlung von Hautwunden unter Verzicht auf art- bzw. spender- bzw. empfängerfremde Zellen, derartige Medien oder derartige Medienzusätze ist Gegenstand des US-Patentantrages 2688-0102P, 1997.
Dazu verwendeten wir z. B. modifiziertes MCDB153-Medium unter Zugabe von autologem, d. h. empfängereigenem Serum, oder homologem, d. h. empfängerfremdem humanem Serum zu. Sowohl in der Primärkultur, der Auswanderungs- und Vermehrungsphase der ORS-Zellen aus den Haarfollikeln, als auch in der Sekundärkultur, der Rekonstitutions- und Stratifizierungsphase, zeigte sich dieser Ansatz gegenüber demjenigen mit FCS zumindest ebenbürtig. In der Kultur waren die Zellen äußerst homogen.
Durch die innovativen Kulturbedingungen entwickeln sich Epidermis-Äquivalente mit hoher Ähnlichkeit bezüglich Aufbau und Differenzierung zur normalen Epidermis. Die bislang verzeichneten guten Therapieerfolge dieser Methode bei chronischen Wunden beruhen größtenteils auf dieser hohen Qualität der Transplantate.
Die zur Transplantation eingesetzten ORS-Zellen sind autolog und damit vor einer Abstoßung durch das Immunsystem bewahrt. Die zur Durchführung dieser Methode notwendigen Zusätze sind entweder definiert, getesteter humaner oder tierischer Herkunft oder autolog. Die menschlichen Fibroblasten, die in dieser Methode eingesetzt werden, sind nicht autolog, stammen jedoch von gesunden, getesteten Donoren und werden in regelmäßigen Abständen auf ihre Qualität und biologische Unbedenklichkeit, insbesondere betreffend Infektübertragung, getestet. Während des gesamten Verfahrens bleiben die Fibroblasten von den ORS-Zellen räumlich getrennt. Statt des herkömmlich eingesetzten fötalen Kälberserums wird autologes Patientenserum eingesetzt, die Wachstumsfaktoren bzw. Medienzusätze sind rekombinante humane Erzeugnisse. Damit ist das System als unbedenklich zu betrachten, insbesondere in bezug auf übertragbare Erreger.
Unter geeigneten Kulturbedingungen, insbesondere unter Einsatz geeigneter Kulturmedien, ist die Kultivierung der ORS-Zellen auch ohne Feeder-Zellen mit oder ohne Serum prinzipiell möglich. Die Kulturschalen können z. B. mit humanem Fibronektin bzw. humanem Kollagen beschichtet werden. Als definiertes Medium kann modifiziertes MCDB153 (Boyce, S. T., Ham, L. G., "Cultivation, Frozen Storage and Clonal Growth of Normal Human Epidermal Keratinocytes in Serum Free Media", J. Tissue Cult. Meth. 9: 83-93, 1985) eingesetzt werden.
Die Subkultivierung in vitro von ORS-Zellen submers auf biokompatiblen, eventuell auch biodegradierbaren bzw. resorbierbaren Folien, z. B. aus PTFE oder Hyaluronsäureester, wurde im Hinblick auf Verwendung solcher Materialien als Träger für die ORS-Zelltransplantation in vitro ausgetestet, wobei sich im Vergleich zum Wachstum auf üblichen Kultursubstraten eine zumindest ebenbürtige Proliferation der ORS-Zellen ergab (eigene, unveröffentlichte Daten).
Die Innovation
Mittels der von Limat et al. etablierten oben beschriebenen Primärkultur-Techniken wurden ORS-Zellen von 10 Personen isoliert und in Primärkultur propagiert.
Beispiel 1
Subkulturen der Zellen von 4 dieser Patienten, die sich einem skin resurfacing unterziehen lassen wollten, wurden in der Regel auf 5 × 5 cm großen biokompatiblen Folien aus PTFE oder Hyaluronsäureester submers angesetzt. Prinzipiell ist die Verwendung jeder anderen biokompatiblen Folie möglich.
Wir verwendeten 5 × 103 Zellen/cm2. Je nach proliferativem Potential sind Aussaatdichten 102 bis 106 prinzipiell einzusetzen. Als Medium verwendeten wir modifiziertes MCDB-153 mit 5% autologem Serum. Prinzipiell sind aber auch andere geeignete Kulturmedien mit oder ohne Serumzusatz einsetzbar.
Die Folien wurden nach einigen Tagen bei in der Regel noch praekonfluentem Stadium der ORS-Kulturen auf die gereinigten Wundflächen derart aufgelegt, dass die ORS- Zellen in direkten Kontakt mit dem freigelegten dermalen Bindegewebe zu liegen kamen, und mit einem Verband abgedeckt. Bei allen Patienten erfolgte eine kosmetisch befriedigende Reepithelialisation innerhalb weniger Tage.
Beispiel 2
6 Patienten litten an chronischen Wunden (4 venöse, 1 arterielle, 1 diabetische Genese). Ausgehend von autologen ORS-Zellen wurden innerhalb von zwei Wochen unter voll definierten Kulturbedingungen mit 10% autologem Serum für jeden Patienten 12 hochdifferenzierte epidermale Äquivalente (Limat, A. et al., "Successful treatment of chronic leg ulcers with epidermal equivalents generated from cultured autologous outer root sheath cells", J. Invest. Dermatol. 107: 128-135, 1996) von je 1 cm Durchmesser angezüchtet. Für einen solchen Einsatz geeignete differenzierte Keratinozytenkulturen lassen sich prinzipiell auch unter anderen Kulturbedingungen, insbesondere auch mit geeigneten serumfreien Medien, anzüchten.
Die epidermalen Äquivalente wurden für die Transplantation folgendermaßen vorbereitet: Die beiden Komponenten eines Fibrinklebers (Tissucol® Duo S. Fa. lmmuno, Wien), Thrombin und Fibrinogen, wurden jeweils in einer gegenüber den Angaben des Herstellers 8fach erhöhten Verdünnung gelöst, gemischt und in einer dünnen Lage auf die Epidermisäquivalente aufgetragen. Auf je 4 Epidermisäquivalente wurden Folien aus PTFE, auf je weitere 4 Folien aus Hyaluronsäureester geklebt. Bei den jeweils restlichen 4 epidermalen Äquivalenten jeder Gruppe ließ man den aufgebrachten Fibrinkleber sich ohne zusätzliche Folie als Film verfestigen. Die so stabilisierten epidermalen Äquivalente wurden ohne enzymatische Behandlung von den Membranen, auf denen sie kultiviert worden waren, mittels feinen Pinzetten abgezogen. Es ist jedoch prinzipiell auch eine enzymatische Ablösung, z. B. mit Dispase-, Trypsin- oder Thermolysin-Inkubation, möglich.
Prinzipiell ist die Verwendung jedes biokompatiblen Klebers, jeder biokompatiblen gelartigen Substanz bzw. jeder weiteren biokompatiblen Folie möglich.
Pro Patient wurden 12 epidermale Äquivalente auf die gereinigten Wunden aufgebracht und mit geeigneten Verbänden abgedeckt. Von diesen insgesamt 72 Stück wuchsen 65 an. Die restlichen 7 hatten sich abgelöst, wobei weder ein Zusammenhang zur Art der Beschichtung noch zur der Wunde zugrunde liegenden Erkrankung festgestellt werden konnte. Die Wunden heilten unter regelmäßigem Verbandwechsel innerhalb von 8 Wochen vollständig ab.
Neu und Bestandteil dieses Patentes ist
Die Verwendung trägergebundener, autologer, nicht-chronisch-lichtexponierter ORS- Zellen aus Anagenhaarfollikeln z. B. des okzipitalen Kapillitiums
  • a) beim Ersatz chronisch Ultraviolett-geschädigter Keratinozyten
    • a) zur kosmetischen epidermalen Erneuerung bei chronischen Lichtschäden der Haut,
    • b) zur epidermalen Regeneration nach größerflächiger Abtragung der Epidermis bei Vorstadien der malignen Entartung
  • b) zur epidermalen Regeneration nach Operationen, Verletzungen oder anderen Hautdefekten, z. B. bei chronischen Wunden.

Claims (17)

1. Trägergebundene kultivierte Stamm- bzw. Vorläuferzellen von Keratinozyten.
2. Trägergebundene kultivierte Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen ORS-Zellen sind.
3. Trägergebundene kultivierte Zellen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Quelle der ORS-Zellen gezupfte Haarfollikel sind.
4. Trägergebundene kultivierte Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen als praekonfluenter Monolayer vorliegen.
5. Trägergebundene kultivierte Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in ein bis mehreren Lagen vorliegen.
6. Trägergebundene kultivierte Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen zu epidermalen Äquivalenten kultiviert sind.
7. Trägergebundene kultivierte Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine biokompatible synthetische Matrix ist.
8. Trägergebundene kultivierte Zellen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger PTFE, Polyacrylat, Polyester, Polyurethan oder sonstige Polymere enthält.
9. Trägergebundene kultivierte Zellen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger biodegradierbar ist.
10. Trägergebundene kultivierte Zellen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger resorbierbar ist.
11. Trägergebundene kultivierte Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger Hyaluronsäure-, Saccharid- oder Laktatderivate, Kollagen, Fibrin, Fibronectin, weitere Komponenten der extrazellulären Matrix oder andere biodegradable Polymere enthält.
12. Trägergebundene kultivierte Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen auf dem Träger kultiviert worden sind.
13. Trägergebundene kultivierte Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger auf die Zellen aufgeklebt ist.
14. Trägergebundene kultivierte Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in flüssigem Zustand aufgebracht wird und nach dem Aufbringen fest wird.
15. Verwendung der trägergebundenen kultivierten Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14 als Arzneimittel.
16. Verwendung der trägergebundenen kultivierten Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14 als Medizinprodukt.
17. Verwendung der trägergebundenen kultivierten Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14 als Kosmetikum.
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