DE69927600T2

DE69927600T2 - Biotechnisch konstruiertes gewebe und verfahren zu dessen produktion und benutzung

Info

Publication number: DE69927600T2
Application number: DE69927600T
Authority: DE
Inventors: P. Michael MURPHY; Vincent Ronfard
Original assignee: Organogenesis Inc
Current assignee: Organogenesis Inc
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2019-11-20
Also published as: AU2010201787B2; PT1612265E; CA2351396A1; CA2351396C; US7824913B2; ES2402739T3; JP2002530069A; WO2000029553A1; US20080108134A1; DK1131410T3; EP1612265A2; CN102051343A; HK1040740A1; DE69927600D1; AU769637B2; EP1131410A1; AU2004201787A1; BR9915476A; ES2249928T3; EP2295540A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Das Gebiet der Erfindung ist das Gebiet der Gewebezüchtung. Die vorliegende Erfindung betrifft ein In-Vitro-Verfahren zum Induzieren von Zellen, um eine extrazelluläre Matrix herzustellen. Diese lebende extrazelluläre Matrix, welche gewebeähnliche Eigenschaften aufweist, kann zum Testen oder für klinische Zwecke verwendet werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Gebiet der Gewebezüchtung verbindet Biozüchtungsverfahren mit den Prinzipien der Biowissenschaften, um die strukturellen und funktionalen Beziehungen in normalen und pathologischen Säugetiergeweben zu verstehen. Das Ziel der Gewebezüchtung ist die Entwicklung und letztendlich die Anwendung biologischer Substitute, um Gewebefunktionen wieder herzustellen, zu erhalten oder zu verbessern. Somit ist es mittels Gewebezüchtung möglich, ein biotechnisch-gezüchtetes Gewebe in einem Labor zu entwerfen und herzustellen. Biotechnisch-gezüchtete Gewebe können Zellen, welche für gewöhnlich mit nativen Säugetier- oder Humangewebe und synthetischen oder exogenen Matrixgerüsten assoziiert sind, enthalten. Das neue biotechnisch-gezüchtete Gewebe muss funktionell sein, wenn es auf einen Wirt transplantiert wird, und muss innerhalb des Körpers des Wirts dauerhaft aufgenommen oder durch Zellen des empfangenden Wirtpatienten progressiv bio-remodelliert werden. Die Herstellung eines Gewebeäquivalenten ohne ein Trägerelement oder Gerüst führt zu wissenschaftlichen Herausforderungen in Bezug auf die Schaffung des neuen biotechnisch-gezüchteten Gewebes.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft, so wie in den Ansprüchen definiert ist, biotechnisch-gezüchtete Gewebekonstrukte von kultivierten Zellen und endogen hergestellte extrazelluläre Matrixkomponenten, ohne die Notwendigkeit von exogenen Matrixkomponenten oder Netzwerkträgern oder Gerüstelementen. Die Erfindung kann somit vorteilhafterweise zur Gänze aus humanen Zellen und Humanmatrixkomponenten hergestellt werden, welche durch diese Zellen erzeugt werden, zum Beispiel wenn das biotechnisch-gezüchtete Gewebekonstrukt zum Gebrauch in Menschen entwickelt wird.
Die Erfindung betrifft, so wie in den Ansprüchen definiert ist, auch Verfahren zur Herstellung von Gewebekonstrukten durch Stimulation von Fibroblastzellen in Kultur, um extrazelluläre Matrixkomponenten herzustellen, ohne die Zugabe von exogenen Matrixkomponenten, Netzwerkträgern oder Gerüstelementen.
Ferner kann das Gewebekonstrukt, wie es in den Ansprüchen definiert ist, durch serielles Einimpfen von unterschiedlichen Zelltypen hergestellt werden, um ein kultiviertes Gewebekonstrukt zu erzeugen, das die Zellzusammensetzung und die Gewebestrukturen von nativen Geweben nachahmt.
Darüber hinaus wird, wie in den Ansprüchen definiert ist, das Gewebekonstrukt durch kultivierte Zellen hergestellt und selbst zusammengefügt, ohne die Notwendigkeit für einen Stützträger oder die Zugabe von exogenen extrazellulären Matrixkomponenten.
Die Festigkeitseigenschaften des Gewebekonstruktes machen es handhabbar, so dass es leicht und abziehbar von der Kulturvorrichtung, in der es ausgebildet wird, entfernt werden und direkt transplantiert werden kann, ohne die Notwendigkeit einer Stütze oder eines Trägers in klinischen oder Testanwendungen.
Die Gewebekonstrukte der Erfindung sind für klinische Zwecke, wie Transplantation auf einen Patienten mit Gewebe- oder Organdefekt, wie zum Beispiel Hautgeschwür oder Wunde, oder für In-Vitro-Gewebetests oder Tiertransplantation, wie etwa für Sicherheitstests oder Validierung von pharmazeutischen, kosmetischen und chemischen Produkten, nützlich.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Diagramm, welches den Anstieg der Collagenkonzentration, die durch den Hydroxyprolin-Test bestimmt wird, im Vergleich zur Zellzahl in dem Hautkonstrukt, das aus einer humanen neonatalen Vorhautzelle gewonnen wird, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, zeigt.
2 ist eine Mikroaufnahme (Objektiv 20x) eines fixierten, paraffineingebetteten, Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Abschnitts eines Zellmatrixkonstruktes, das aus kultivierten humanen dermalen Fibroblasten in einem chemisch definierten Medium nach 21 Tagen gebildet wurde. Die poröse Membran erscheint als ein dünnes durchsichtiges Band unterhalb des Konstruktes.
3 zeigt Transmissionselektronenmikroskopbilder von zwei Vergrößerungen eines Zellmatrixkonstruktes, das aus kultivierten humanen dermalen Fibroblasten in chemisch definiertem Medium nach 21 Tagen ausgebildet wurde. 3A ist eine 7600x Vergrößerung, welche eine endogene Matrix zeigt, welche die Anordnung von Collagenfasern zwischen den Fibroblasten einschließt. 3B ist eine 19000X Vergrößerung von vollständig ausgebildeten endogenen Collagenfasern, welche eine fibrille Anordnung und Packung zeigen.
4 ist eine Mikroaufnahme (Objektiv 20x) eines fixierten paraffineingebetteten, Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Abschnitts eines kultivierten Hautkonstruktes, das in einem chemisch definierten Medium in Abwesenheit von exogenen Matrixkomponenten ausgebildet wurde, welche ein Zell-Matrix-Konstrukt aufweisen, das aus kultivierten humanen dermalen Fibroblasten in einem chemisch definierten Medium mit einer mehrschichtigen, differenzierten Epidermis ausgebildet wurde, die aus kultivierten humanen Keratinocyten in einem chemisch definierten Medium gebildet wurden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bis dato sind gegenwärtige biotechnisch-gezüchtete lebende Gewebekonstrukte nicht vollständig zellassembliert und müssen sich entweder auf die Zugabe oder die Aufnahme von exogenen Matrixkomponenten oder synthetischen Elementen für die Struktur oder Unterstützung, oder beides, verlassen.
Die biotechnisch-gezüchteten Gewebekonstrukte, die hierin beschrieben und in den Ansprüchen definiert werden, weisen viele der nativen Merkmale des Gewebes auf, aus denen ihre Zellen abgeleitet sind. Die so hergestellten Gewebekonstrukte können für die Transplantation auf einen Patienten oder für In-Vitro-Tests verwendet werden.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein kultiviertes Hautkonstrukt mit mindestens zwei Schichten bereitgestellt, das Folgendes aufweist:

(a) eine erste Schicht kultivierter dermaler Fibroblastzellen, die unter Bedingungen zur Herstellung einer Schicht extrazellulärer Matrix kultiviert wurden, die durch die kultivierten Fibroblastzellen synthetisch hergestellt und zusammengefügt wird, wobei die kultivierten Fibroblastzellen in der synthetisch hergestellten extrazellulären Matrixschicht enthalten sind, wobei die extrazelluläre Matrix Folgendes aufweist: (i) Collagen vom Typ I und Typ III, welches einen Packungsaufbau von Fibrillen und Fibrillbündeln mit einem viertelversetzten 67 nm Bandenmuster aufweist; (ii) Decorin; (iii) Fibronectin; (iv) Tenascin und (v) Glycosaminoglycane; wobei die extrazelluläre Matrix durch die kultivierten dermalen Fibroblastzellen in Abwesenheit von exogenen Matrixkomponenten oder synthetischen Elementen während den Kultivierungsbedingungen erzeugt wird; und
(b) eine zweite Schicht von Keratinocytenzellen, die auf der ersten Schicht angeordnet sind, um eine epidermale Zellschicht zu bilden, wobei die epidermale Zellschicht mehrlagig, geschichtet, differenziert ist und eine basale Schicht, eine suprabasale Schicht, eine granulare Schicht und ein Stratum Corneum aufweist; und wobei das zweischichtige kultivierte Hautkonstrukt eine Basalmembran an der Verbindungsstelle zwischen erster und zweiter Schicht aufweist.

Geeigneter Weise können in solchen Konstrukten der Erfindung die kultivierten Fibroblastzellen genetisch verändert werden, um extrazelluläre Matrixkomponenten zu erzeugen. Die kultivierten Fibroblastzellen können genetisch verändert werden, um einen Wachstumsfaktor, ein Hormon, Peptid oder Protein zu erzeugen.
Die kultivierten Hautkonstrukte der Erfindung weisen eine strukturelle Schicht von mindestens einem Typ von/an extrazellulären matrixerzeugenden dermalen Fibroblastzellen und endogen erzeugten extrazellulären Matrixkomponenten auf, die einfacher als „Matrix" bezeichnet werden, wobei die Matrix durch das Kultivieren der Zellen vollständig zellsynthetisiert und zusammengefügt ist. Diese Schicht wird hierin als ein „Zell-Matrix-Konstrukt" oder eine „Zell-Matrix-Schicht" bezeichnet, weil die Zellen sich selbst innerhalb und durch ihre Matrix absondern und enthalten. Die kultivierten Gewebekonstrukte erfordern keine, und enthalten daher keine, exogenen Matrixkomponenten, das heißt Matrixkomponenten, die nicht durch die kultivierten Zellen erzeugt, sondern durch andere Mittel eingeführt werden. Das Zell-Matrix-Konstrukt, das durch humane dermale Fibroblasten erzeugt wird, weist eine prädominante Konzentration an Collagen ähnlich zu nativer Haut auf. Wie durch Elektronenmikroskopie nachgewiesen wurde, ist die Matrix von ihrer Natur her faserartig und enthält Collagen, welches das viertelversetzte 67 nm Bandenmuster aufweist, sowie einen Packungsaufbau von Fibrillen und Fibrillbündeln, der nativem Collagen ähnlich ist. Eine verzögerte Reduktions-SDS-PAGE hat die Gegenwart von sowohl Typ-I- als auch Typ-III-Collagen in diesen Konstrukten erfasst, die prädominanten Collagen-Typen, die sich in nativer humaner Haut befinden. Unter Verwendung von Standard Immunohistochemie (IHC)-Techniken färbt sich das dermale Zell-Matrix-Konstrukt positiv für Decorin, ein Dermatansulfatproteoglycan, von dem bekannt ist, dass es mit Collagen-Fibrillen in Verbindung steht und von dem angenommen wird, dass es den Fibrill-Durchmesser in vivo reguliert. Decorin kann auch in dem Konstrukt mittels TEM visualisiert werden. Das erzeugte Gewebe färbt sich auch für Tenascin positiv, einem extrazellulären Matrixglycoprotein, das zum Beispiel in Mesenchym oder in zu reparierendem Geweben zu finden ist. Ganz ähnlich wie Gewebe, das in vivo repariert wird, wurde gezeigt, dass das Gewebe, das in Kultur erzeugt wurde, sein Verhältnis von Typ-I-Collagen zu Typ-III-Collagen erhöht, während die Matrix gebildet wird. Obwohl diese Theorie keine Einschränkung darstellen soll, wird angenommen, dass die Zellen den offenen Raum zwischen sich schnell mit einer losen Matrix auffüllen, die analog zu Granulationsgewebe ist, das vorrangig aus Typ-III-Collagen und Fibronectin besteht, und danach diese lose Matrix mit einer dichteren Matrix remodellieren, die vorrangig aus Typ-I-Collagen besteht. Es wurde gezeigt, dass die erzeugte Zell-Matrix Glycosaminoglycane (GAG), wie zum Beispiel Hyaluronsäure (HA), Fibronectin, Proteoglycane, abgesehen von Decorin, wie Biglycan und Versican, enthält; und ein Profil an sulfatierten Glycosaminoglycanen wie Di-Hyaluronsäure, Di-Chondrotin-0-sulfat, Di-Chondroitin-4-sulfat, Di-Chondroitin-6-sulfat, Di-Chondroitin-4,6-sulfat; Di-Chondroitin-4-sulfat-UA-2S; und Di-Chondroitin-6-sulfat-UA-2S. Diese strukturellen und biochemischen Merkmale zeigen sich selbst, während sich das Konstrukt in Kultur entwickelt und sind unverwechselbar offensichtlich, wenn sich das Konstrukt seiner endgültigen Form nähert. Die Anwesenheit dieser Komponenten in einem vollständig ausgebildeten kultivierten dermalen Zell-Matrix-Konstrukt zeigt, dass das Konstrukt strukturelle und biochemische Merkmale aufweist, welche sich jenen von normaler Dermis nähern.
Das kultivierte Hautkonstrukt der Erfindung ist eine Zell-Matrix-Schicht mit einer zweiten darauf angeordneten Schicht von Zellen. Die zweite Schicht von Zellen wird auf der Zell-Matrix-Schicht kultiviert, um ein biotechnisch-gezüchtetes zweischichtiges Gewebekonstrukt zu bilden.
Die zweite Schicht weist kultivierte Keratinocyten auf, die gemeinsam mit der ersten Zell-Matrix-Schicht, einem Zell-Matrix-Konstrukt, das aus dermalen Fibroblasten und endogener Matrix gebildet ist, um eine dermale Schicht zu bilden, ein lebendes Hautkonstrukt aufweisen. In ihrer vollständigen Ausbildung ist die epidermale Schicht eine mehrschichtige, mehrlagige und gut differenzierte Schicht von Keratinocyten, die eine basale Schicht, eine suprabasale Schicht, eine granulare Schicht und ein Stratum Corneum aufweisen. Das Hautkonstrukt weist eine gut entwickelte Basalmembran auf, welche an der dermalepidermalen Verbindungsstelle angeordnet ist, wie durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) gezeigt wurde. Die Basalmembran erscheint um die Hemidesmosome am stärksten, gekennzeichnet durch Verankerungsfibrillen, die aus Typ-VII-Collagen bestehen, wie durch TEM visualisiert wurde. Es kann beobachtet werden, dass die Verankerungsfibrillen aus der Basalmembran austreten und die Collagen-Fibrillen in der dermalen Schicht einfangen. Diese Verankerungsfibrillen sowie andere Basalmembrankomponenten werden durch Keratinocyten abgesondert. Es ist auch bekannt, dass Keratinocyten zwar in der Lage sind, selbst Basalmembrankomponenten abzusondern, aber eine erkennbare Basalmembran in Abwesenheit von Fibroblasten wird sich nicht ausbilden. Immunohistochemisches Anfärben des Hautkonstruktes der vorliegenden Erfindung hat auch gezeigt, dass Laminin, ein Basalmembranprotein, vorhanden ist.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um ein zweischichtiges kultiviertes Hautkonstrukt zu erzeugen, welches eine dermale Schicht und eine epidermale Schicht, die darauf in Abwesenheit eines strukturellen Stützgerüsts oder exogener Matrixkomponenten angeordnet ist, aufweist, wobei das Verfahren folgende Schritte enthält:

(a) Einimpfen von Fibroblastzellen auf poröser Membran in einem Kulturgefäß in einem ersten chemisch definierten Zellkulturmedium mit einer Dichte zwischen ungefähr 1 × 10⁵ Zellen/cm² bis ungefähr 6,6 × 10⁵ Zellen/cm²;
(b) Kultivieren der Fibroblastzellen von Schritt (a) in dem ersten chemisch definierten Zellkulturmedium auf eine Konfluenz zwischen ungefähr 80 % bis ungefähr 100 %;
(c) Stimulieren der Fibroblastzellen von Schritt (a), um extrazelluläre Matrixkomponenten durch Kultivieren der Zellen in einem zweiten chemisch definierten Kulturmedium synthetisch herzustellen, abzusondern und zu organisieren;
(d) fortgeführtes Kultivieren der Fibroblastzellen bis die Zellen eine Schicht aus synthetisch hergestellter extrazellulärer Matrix mit einer Dicke von mindestens ungefähr 30 Mikron bilden, wobei die kultivierten Fibroblastzellen innerhalb der synthetisch hergestellten extrazellulären Matrixschicht enthalten sind, wobei die extrazelluläre Matrix Folgendes aufweist: (i) Collagen vom Typ I und III, das einen Packungsaufbau von Fibrillen und Fibrillbündeln mit einem viertelversetzten 67 nm Bandenmuster aufweist; (ii) Decorin; (iii) Tenascin und (iv) Glycosaminoglycane; wobei die extrazelluläre Matrix durch die kultivierten dermalen Fibroblastzellen in Abwesenheit von exogenen Matrixkomponenten oder synthetischen Elementen während der Kultivierungsbedingungen erzeugt wird;
(e) Einimpfen von Keratinocytenzellen auf die Oberfläche der synthetisch hergestellten extrazellulären Matrix von Schritt (d) und
(f) Kultivieren der Keratinocytenzellen unter Kultivierungsbedingungen, um eine epidermale Schicht zu bilden, wobei die epidermale Zellschicht eine mehrlagige, geschichtete, differenzierte Schicht von Keratinocyten ist, welche eine basale Schicht, eine suprabasale Schicht, eine granulare Schicht und ein Stratum Corneum aufweisen; und wobei das zweischichtige kultivierte Hautkonstrukt eine Basalmembran an der Verbindungsstelle zwischen der ersten und der zweiten Schicht aufweist.

Fibroblastzellen erzeugen im Allgemeinen eine Anzahl an extrazellulären Matrixproteinen, vorrangig Collagen. Es gibt verschiedene Typen von Collagenen, die durch Fibroblasten erzeugt werden, jedoch ist Typ I Collagen jenes, das am häufigsten in vivo auftritt. Humane Fibroblastzellstämme können aus einer Reihe von Quellen gewonnen werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, neonatale männliche Vorhaut, Dermis, Sehne, Lunge, Nabelschnur, Knorpel, Urethra, korneales Stroma, Mundschleimhaut und Darm. Die humanen Zellen können, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Fibroblasten enthalten, können aber Folgendes einschließen: weiche Muskelzellen, Chondrocyten und andere Bindegewebezellen mesenchymalen Ursprungs. Es wird bevorzugt, ist jedoch nicht erforderlich, dass der Ursprung der matrixerzeugenden Zelle, die in der Herstellung eines Gewebekonstruktes verwendet wird, aus einem Gewebetyp gewonnen wird, den diese nach der Anwendung der Kultivierungsverfahren der Erfindung nachahmen oder dem sie ähneln soll. Zum Beispiel ist in dem Fall, in dem ein Hautkonstrukt erzeugt wird, die matrixerzeugende Zelle ein Fibroblast, vorzugsweise dermalen Ursprungs. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können Fibroblasten, die durch Mikrodissektion von der dermalen Papilla von Haarfollikeln isoliert werden, verwendet werden, um die Matrix alleine oder in Verbindung mit anderen Fibroblasten zu erzeugen. In der Ausführungsform, in der ein korneales Konstrukt erzeugt wird, wird die matrixerzeugende Zelle aus kornealem Stroma gewonnen. Die Zellspender können nach Entwicklung und Alter unterschiedlich sein. Zellen können aus Spendergeweben von Embryos, Neugeborenen oder älteren Individuen, einschließlich Erwachsenen, gewonnen werden. Embryonische Vorläuferzellen, wie mesenchymale Stammzellen, können in der Erfindung verwendet und zum Differenzieren gebracht werden, um sich in das gewünschte Gewebe zu entwickeln.
Obwohl humane Zellen zur Verwendung in der Erfindung bevorzugt werden, sind die Zellen, die in dem Verfahren der Erfindung zu verwenden sind, nicht auf Zellen aus humanen Quellen beschränkt. Zellen von anderen Säugtierspezien, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Pferde-, Hund-, Schwein-, Rind- und Schafquellen, oder Nagetierspezien, wie Mäuse oder Ratten, können verwendet werden. Zusätzlich können in der vorliegenden Erfindung auch Zellen verwendet werden, die spontan, chemisch oder viral transfiziert sind oder rekombinante Zellen oder genetisch manipuliere Zellen. Bei jenen Ausführungsformen, welche mehr als einen Zelltyp beinhalten, können chimäre Mischungen von normalen Zellen aus zwei oder mehr Quellen, Mischungen aus normalen und genetisch veränderten oder transfizierten Zellen oder Mischungen von Zellen aus zwei oder mehr Spezien oder Gewebequellen verwendet werden.
Rekombinante oder genetisch manipulierte Zellen können in der Herstellung des Zell-Matrix-Konstruktes verwendet werden, um ein Gewebekonstrukt zu erzeugen, das als Arzneimittel abgebendes Transplantat für einen Patienten dient, der erhöhte Spiegel an natürlichen Zellprodukten oder Behandlung mit einem Therapeutikum benötigt. Die Zellen können für den Patienten über das Transplantat rekombinante Zellprodukte, Wachstumsfaktoren, Hormone, Peptide oder Proteine für eine fortlaufende Zeitspanne oder nach Bedarf erzeugen und abgeben, wenn dies aufgrund der beim Patienten vorliegenden Zustände biologisch, chemisch oder thermisch signalisiert wird. In Abhängigkeit von der Verwendungsindikation des kultivierten Gewebekonstruktes ist entweder lang- oder kurzfristige Produktexpression wünschenswert. Langfristige Expression ist wünschenswert, wenn das kultivierte Gewebekonstrukt implantiert wird, um therapeutische Produkte an Patienten über einen längeren Zeitraum abzugeben. Umgekehrt ist die kurzfristige Expression in jenen Fällen wünschenswert, in denen das kultivierte Gewebekonstrukt einem Patienten transplantiert wird, der eine Wunde hat, wo die Zellen des kultivierten Gewebekonstruktes normale oder beinahe normale Heilung fördern oder die Vernarbung der Wundstelle verringern sollen. Sobald die Wunde verheilt ist, werden die Genprodukte aus dem kultivierten Gewebekonstrukt nicht mehr benötigt oder sind unter Umständen nicht mehr an der Stelle erwünscht. Zellen können auch genetisch manipuliert werden, um Proteine oder unterschiedliche Typen von extrazellulären Matrixkomponenten zu exprimieren, die entweder „normal", aber auf hohem Niveau exprimiert, oder in irgendeiner Weise verändert sind, um eine Transplantatvorrichtung zu ergeben, welche eine extrazelluläre Matrix und lebende Zellen enthält, die therapeutisch für eine verbesserte Wundheilung, erleichterte oder gelenkte Neovaskularisierung oder für eine minimierte Narben- oder Keloidbildung vorteilhaft ist. Diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und werden in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), das hiermit als Referenz aufgenommen wird, beschrieben. Alle der oben erwähnten Typen von Zellen sind in der Definition einer „matrixerzeugenden Zelle", so wie in der Erfindung verwendet, enthalten.
Die vorherrschende wichtigste extrazelluäre Matrixkomponente, die durch Fibroblasten erzeugt wird, ist fibrilläres Collagen, insbesondere Collagen vom Typ I. Fibrilläres Collagen ist eine Schlüsselkomponente in der Zell-Matrix-Struktur, wobei die vorliegende Erfindung jedoch nicht auf Matrizen beschränkt ist, die nur aus diesem Protein oder Proteintyp bestehen. Zum Beispiel können andere Collagene, sowohl fibrilläres als auch nicht-fibrilläres Collagen aus der Collagenfamilie wie den Collagentypen II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, durch Verwendung des geeigneten Zelltyps erzeugt werden. Ähnlicherweise umfassen andere Matrixproteine, die unter Verwendung des vorliegenden Verfahrens erzeugt und abgeschieden werden können, ohne darauf beschränkt zu sein, Elastin, Proteoglycane wie Decorin oder Biglycan; oder Glycoproteine wie Tenascin, Vitronectin, Fibronectin, Laminin, Thrombospondin I und Glycosaminoglycan (GAG), wie Hyaluronsäure (HA).
Die matrixerzeugende Zelle wird in einem Gefäß kultiviert, das für Tierzellen- oder Gewebekultur geeignet ist, beispielsweise in einer Kulturschale, einer Flasche oder einer Rollerflasche, welche die Bildung einer dreidimensionalen gewebeähnlichen Struktur ermöglichen. Geeignete Zellwachstumsoberflächen, auf denen die Zellen gezüchtet werden können, können jegliches biologisch kompatibles Material sein, an dem die Zellen haften und ein Verankerungsmittel für das zu bildende Zell-Matrix-Konstrukt bereitstellen können. Materialien wie Glas, rostfreier Stahl, Polymere einschließlich Polycarbonat, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyvinyliden, Polydimethylsiloxan, Fluorpolymere und fluoriertes Ethylenpropylen, sowie Siliconsubstrate, einschließlich Quarzglas, Polysilizium oder Siliziumkristalle können als Zellwachstumsoberflächen verwendet werden. Das Zellwachstumsoberflächenmaterial kann chemisch behandelt oder verändert, elektrostatisch aufgeladen oder mit Biologika wie Poly-1-lysin oder Peptiden beschichtet werden. Ein Beispiel eines beschichtenden Peptids ist das RGD-Peptid.
Obwohl das Gewebekonstrukt der Erfindung auf einer soliden Zellwachstumsoberfläche gezüchtet werden kann, wird eine Zellwachstumsoberfläche mit Poren, welche sowohl mit der Ober- als auch mit der Grundfläche der Membran in Verbindung stehen, um einen bilateralen Kontakt des Mediums zum entwickelnden Gewebekonstrukt zu ermöglichen oder um einen Kontakt nur von unterhalb der Kultur bereitzustellen, bevorzugt. Der bilaterale Kontakt ermöglicht dem Medium, sowohl die Ober- als auch die Grundfläche des entwickelnden Konstruktes zu berühren, um für die in dem Medium enthaltenen Nährstoffe eine maximale Oberflächenexposition zu gewährleisten. Das Medium kann auch nur den Boden des sich bildenden kultivierten Gewebekonstruktes berühren, so dass die Oberfläche Luft ausgesetzt sein kann, wie bei der Entwicklung eines kultivierten Hautkonstruktes. Das bevorzugte Kulturgefäß ist jenes, das eine Trägereinlage verwendet, ein kulturbehandeltes durchlässiges Element wie eine poröse Membran, die im Kulturgefäß, welches das Medium enthält, suspendiert wird. Typischerweise ist die Membran an einem Ende eines röhrenförmigen Elementes oder Rahmens befestigt, der innerhalb einer Basis eingefügt ist und mit dieser eine Schnittstelle bildet, wie eine Petri- oder Kulturschale, die mit einem Deckel verschlossen werden kann. Kulturgefäße, welche eine Trägereinlage mit einer porösen Membran enthalten, sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden für die Umsetzung der Erfindung bevorzugt und sind in einer Reihe von US-Patentschriften betreffend das Fachgebiet beschrieben, von denen einige kommerziell erhältlich sind, zum Beispiel: 5,766,937, 5,466,602, 5,366,893, 5,358,871, 5,215,920, 5,026,649, 4,871,674, 4,608,342, deren Offenbarungen hiermit in dieses Dokument aufgenommen werden. Wenn diese Typen von Kulturgefäßen verwendet werden, wird das Gewebekonstrukt auf einer Fläche der Membran, vorzugsweise der obersten, nach oben gerichteten Fläche erzeugt, und die Kultur wird durch Zellmedien sowohl auf der Ober- als auch der Grundfläche berührt. Die Poren in der Wachstumsoberfläche ermöglichen den Durchgang von Kulturmedium, um die Unterseite der Kultur durch die Membran mit Nährstoffen zu versorgen, wodurch den Zellen ermöglicht wird, bilateral oder nur von der Unterseite versorgt zu werden. Eine bevorzugte Porengröße ist jene, die klein genug ist, um kein Wachstum von Zellen durch die Membran zu ermöglichen, jedoch groß genug ist, um einen freien Durchgang von Nährstoffen, die im Kulturmedium enthalten sind, zur Unterseite des Zell-Matrix-Konstruktes zu ermöglichen, beispielsweise durch kapillare Wirkung. Bevorzugte Porengrößen liegen bei ungefähr weniger als 3 Mikron, aber reichen von zwischen ungefähr 0,1 Mikron bis ungefähr 3 Mikron, bevorzugter zwischen ungefähr 0,2 Mikron bis ungefähr 1 Mikron, und am bevorzugtesten werden Poren mit Größen von ungefähr 0,4 Mikron bis ungefähr 0,6 Mikron verwendet. Im Falle von humanen dermalen Fibroblasten ist das am meisten bevorzugte Material Polycarbonat mit einer Porengröße zwischen ungefähr 0,4 bis ungefähr 0,6 Mikron. Die maximale Porengröße hängt nicht nur von der Größe der Zelle, sondern auch von der Fähigkeit der Zelle ab, ihre Form zu ändern und durch die Membran zu wandern. Es ist wichtig, dass das gewebeähnliche Konstrukt an der Oberfläche haftet, aber das Substrat nicht aufnimmt oder umhüllt, so dass es davon unter Anwendung minimaler Kraft z.B. durch Abziehen entfernbar ist. Die Größe und Form des ausgebildeten Gewebekonstruktes wird durch die Größe der Gefäßoberfläche oder Membran bestimmt, auf der es gezüchtet wird. Substrate können rund oder winkelig oder mit abgerundeten Eckwinkeln oder unregelmäßig geformt sein. Substrate können auch flach oder als Form fassoniert sein, um ein geformtes Konstrukt zu erzeugen, das mit einer Wunde in Kontakt kommt oder die physische Struktur von nativem Gewebe imitiert. Um größere Oberflächen des Wachstumssubstrats bewältigen zu können, werden proportional mehr Zellen auf die Oberfläche geimpft, und ein größeres Volumen an Medium wird benötigt, um die Zellen ausreichend zu befeuchten und zu ernähren. Wenn das Gewebekonstrukt letztendlich ausgebildet ist, gleich ob es sich um ein einschichtiges Zell-Matrix-Konstrukt oder um ein zweischichtiges Konstrukt handelt, wird es durch Abziehen von dem Membransubstrat entfernt, bevor es auf einen Patienten transplantiert wird.
Die kultivierten Gewebekonstrukte der Erfindung sind nicht auf synthetische oder bioresorbierbare Elemente, wie ein Netzelement, bei der Bildung der Gewebekonstrukte angewiesen. Das Netzelement ist als ein Web-, Strick- oder Filzmaterial aufgebaut. In Systemen, in denen ein Netzelement verwendet wird, werden die Zellen auf dem Netzelement kultiviert und wachsen auf beiden Seiten und innerhalb der Lücken des Netzes, um das Netz zu umhüllen und es innerhalb des kultivierten Gewebekonstruktes aufzunehmen. Das endgültige Konstrukt, das durch Verfahren gebildet wird, welche ein solches Netz enthalten, ist als physische Unterstützung und als Volumen darauf angewiesen. Beispiele für Kulturgewebekonstrukte, die auf synthetische Netzelemente angewiesen sind, werden in den US-Patentschriften 5,580,781, 5,443,950, 5,266,480, 5,032,508, 4,963,489 an Naughton, et al. gefunden.
Das System für die Erzeugung der Zell-Matrix-Schicht kann entweder statisch sein oder ein Perfusionsmittel für das Kulturmedium verwenden. In dem statischen System ist das Kulturmedium ruhig und relativ bewegungslos im Vergleich zum Perfusionssystem, wo das Medium in Bewegung ist. Die Perfusion des Mediums wirkt sich auf die Lebensfähigkeit der Zellen aus und verstärkt die Entwicklung der Matrixschicht. Perfusionsmittel schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, Folgendes ein: Verwenden eines magnetischen Rührstabs oder motorisierten Impellers in der Petrischale, die (unter) unterhalb oder benachbart zum Substratträger angeordnet ist, welcher die Kulturmembran enthält, um das Medium zu rühren; Pumpen des Mediums innerhalb oder durch die Petrischale oder Kammer; sanftes Agitieren der Petrischale auf einer Schüttel- oder Rotierplattform; oder Rollen, falls die Herstellung in einer Rollerflasche erfolgt. Andere Perfusionsmittel können von einem Fachmann zur Verwendung bei dem Verfahren der Erfindung bestimmt werden.
Kulturmedienformulierungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden auf der Basis der Zelltypen, die kultiviert werden sollen und der Gewebestruktur, die hergestellt werden soll, ausgewählt. Das Kulturmedium, das verwendet wird, und die spezifischen Kultivierungsbedingungen, die erforderlich sind, um Zellwachstum, Matrixsynthese und die Lebensfähigkeit zu fördern, hängen von dem Typ der gezüchteten Zelle ab.
Bei der Herstellung von biotechnisch-gezüchteten zweischichtigen Hautkonstrukten der vorliegenden Erfindung variiert die Medienzusammensetzung mit jeder Herstellungsstufe, da unterschiedliche Ergänzungen für unterschiedliche Zwecke erforderlich sind. Die Zell-Matrix-Schicht wird unter definierten Bedingungen ausgebildet, das heißt in chemisch definierten Medien kultiviert. Das Gewebekonstrukt weist eine Zell-Matrix-Schicht auf, die mit einer zweiten Schicht von Zellen versehen ist, die darauf angeordnet und kultiviert werden, wobei beide Zelltypen in einem definierten Kulturmediumsystem kultiviert werden. Alternativ dazu weist das Gewebekonstrukt eine Zell-Matrix-Schicht auf, die unter definierten Medienbedingungen hergestellt wird, und eine zweite Schicht, die darauf unter undefinierten Medienbedingungen ausgebildet ist. Im gegenteiligen Fall weist das Gewebekonstrukt eine Zell-Matrix-Schicht auf, die unter undefinierten Medienbedingungen hergestellt wird, und die zweite Schicht, die darauf unter definierten Medienbedingungen ausgebildet ist.
Die Verwendung von chemisch definierten Kulturmedien wird bevorzugt, das heißt Medien, die frei von undefinierten Tierorgan- oder Gewebeextrakten sind, zum Beispiel Serum, Hypophysenextrakt, hypothalamischem Extrakt, Plazentaextrakt oder embryonischem Extrakt oder Proteinen und Faktoren, die von Nährzellen abgesondert werden. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das Medium frei von undefinierten Komponenten und definierten biologischen Komponenten, die aus nicht-humanen Quellen abgeleitet sind. Obwohl die Zugabe von undefinierten Komponenten nicht bevorzugt wird, können sie in Übereinstimmung mit den offenbarten Verfahren an jedem Punkt in der Kultur verwendet werden, um ein Gewebekonstrukt erfolgreich herzustellen. Wenn die Erfindung unter Verwendung von durchsuchten humanen Zellen ausgeführt wird, welche unter Verwendung von chemisch definierten Komponenten kultiviert wurden, die aus keinen nicht-humanen Tierquellen abgeleitet sind, ist das resultierende Gewebekonstrukt ein definiertes Humangewebekonstrukt. Synthetische funktionelle Äquivalente können ebenfalls hinzugefügt werden, um chemisch definierte Medien, innerhalb des Anwendungsbereichs der Definition von chemisch definiert, zur Verwendung in dem bevorzugtesten Herstellungsverfahren zu ergänzen. Im Allgemeinen wird ein Fachmann der Zellkultur in der Lage sein, geeignete, natürliche humane, humane rekombinante oder synthetische Äquivalente für allgemein bekannte Tierkomponenten zu bestimmen, um das Kulturmedium der Erfindung ohne unangemessene Untersuchung oder Experimente zu ergänzen. Die Vorteile der Verwendung eines solchen Konstrukts in der Klinik bestehen darin, dass die Sorge um adventive Tier- oder Kreuzspezienviruskontaminierung und -infektion verringert wird. In dem Testszenario bestehen die Vorteile eines chemisch definierten Konstruktes darin, dass beim Testen keine Möglichkeit besteht, dass die Ergebnisse aufgrund der Gegenwart von undefinierten Komponenten verwechselt werden.
Das Kulturmedium besteht aus einer Nährstoffbasis, die für gewöhnlich mit anderen Komponenten weiter ergänzt wird. Der Fachmann kann geeignete Nährstoffbasen auf dem Fachgebiet von Tierzellkulturen mit angemessenen Erwartungen im Hinblick auf eine erfolgreiche Herstellung eines Gewebekonstruktes der Erfindung bestimmen. Viele im Handel erhältlichen Nährstoffquellen sind bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung nützlich. Dazu zählen im Handel erhältliche Nährstoffquellen, welche anorganische Salze, eine Energiequelle, Aminosäuren und B-Vitamine bereitstellen, wie Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM); Minimal Essential Medium (MEM); M199; RPMI 1640; Iscove's Modified Dulbecco's Medium (EDMEM). Minimal Essential Medium (MEM) und M199 erfordern eine zusätzliche Ergänzung mit Phospholipid-Vorläufern und nicht-essentiellen Aminosäuren. Im Handel erhältliche vitaminreiche Mischungen, welche zusätzliche Aminosäuren, Nukleinsäuren, Enzym-Cofaktoren, Phospholipid-Vorläufer und anorganische Salze bereitstellen, schließen Ham's F-12, Ham's F-10, NCTC 109 und NCTC 135 ein. Wenngleich in unterschiedlichen Konzentrationen, stellen alle Basis-Medien eine grundlegende Nährstoffquelle für Zellen in Form von Glucose, Aminosäuren, Vitaminen und anorganischen Ionen dar, gemeinsam mit anderen Basis-Medienkomponenten. Das bevorzugteste grundlegende Medium der Erfindung weist eine Nährstoffbasis von entweder kalziumfreiem oder wenig Kalzium enthaltendem Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) oder alternativ DMEM und Ham's F-12 zwischen einem 3-zu-1 bzw. bis zu einem 1-zu-3-Verhältnis auf.
Das Basismedium wird durch Komponenten, wie Aminosäuren, Wachstumsfaktoren und Hormone, ergänzt. Definierte Kulturmedien für die Kultur von Zellen der Erfindung werden in der US-Patentschrift Nr. 5,712,163 an Parenteau und in der Internationalen PC'T-Publikation Nr. WO 95/31473 beschrieben, deren Offenbarungen hierin als Referenz aufgenommen werden. Andere Medien sind auf dem Fachgebiet bekannt, beispielsweise jene, die in Ham and McKeehan, Methods in Enzymology, 58:44-93 (1979), offenbart werden, oder für andere geeignete chemisch definierte Medien, in Bottenstein et al., Methods in Enzymology, 58:94-109 (1979). In der bevorzugten Ausführungsform wird das Basismedium durch folgende Komponenten ergänzt, die dem Fachmann im Bereich Tierzellkultur bekannt sind: Insulin, Transferrin, Triiodothyronin (T3) und entweder Ethanolamin oder o-Phosphorylethanolamin, oder beide, wobei Konzentrationen und Substitutionen für die Ergänzungen durch den Fachmann bestimmt werden können.
Insulin ist ein Polypeptidhormon, das die Aufnahme von Glucose und Aminosäuren fördert, um langfristigen Nutzen über mehrere Durchgänge bereitzustellen. Die Ergänzung von Insulin oder insulinähnlichem Wachstumsfaktor (IGF) ist für langzeitige Kulturen notwendig, da es letztendlich zu einer Erschöpfung der Fähigkeit der Zelle, Glucose und Aminosäuren aufzunehmen, sowie zu einer möglichen Verschlechterung des Zellphänotyps kommen wird. Insulin kann entweder von einem Tier, beispielsweise einem Rind, von humanen Quellen oder durch rekombinante Mittel als humanes rekombinantes Insulin gewonnen werden. Daher würde ein humanes Insulin als eine chemisch definierte Komponente gelten, die nicht aus einer nicht-humanen biologischen Quelle gewonnen wurde. Die Insulinergänzung ist für serielle Kultivierung ratsam und wird den Medien in einem großen Konzentrationsbereich bereitgestellt. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich liegt zwischen ungefähr 0,1 μg/ml bis ungefähr 500 μg/ml, bevorzugter bei ungefähr 5 μg/ml bis ungefähr 400 μg/ml und am bevorzugtesten bei ungefähr 375 μg/ml. Geeignete Konzentrationen für die Ergänzung mit insulinähnlichem Wachstumsfaktor, wie zum Beispiel IGF-1 oder IGF-2, können leicht von einem Fachmann für die zur Kultivierung ausgewählten Zelltypen bestimmt werden.
Transferrin befindet sich in dem Medium zur Eisentransportregulierung. Eisen ist ein wesentliches Spurenelement, das im Serum gefunden wird. Da Eisen für Zellen in seiner freien Form toxisch sein kann, wird es im Serum, an Transferrin gebunden, an Zellen in einer Konzentration, die vorzugsweise zwischen ungefähr 0,05 bis ungefähr 50 μg/ml, bevorzugter bei ungefähr 5 μg/ml liegt, geliefert.
Triiodothyronin (T3) ist ein Basisbestandteil und die aktive Form des Schilddrüsenhormons, das in dem Medium enthalten ist, um die Raten des Zellstoffwechsels aufrechtzuerhalten. Triiodothyronin wird dem Medium in einem Konzentrationsbereich zwischen ungefähr 0 bis ungefähr 400 pM beigegeben, bevorzugter in einer Konzentration zwischen ungefähr 2 bis ungefähr 200 pM und am bevorzugtesten in einer Konzentration von ungefähr 20 pM.
Entweder Ethanolamin, oder o-Phosphorylethanolamin, die Phospholipide sind, oder beide, werden hinzugefügt, wobei ihre Funktion ein wichtiger Vorläufer in dem Inositolpfad und Fettsäurenstoffwechsel ist. Die Ergänzung mit Lipiden, die normalerweise im Serum gefunden werden, ist in einem serumfreien Medium notwendig. Ethanolamin und o-Phosphorylethanolamin werden den Medien in einem Konzentrationsbereich zwischen ungefähr 10^–6 bis ungefähr 10^–2 M, bevorzugter mit ungefähr 1 × 10^–4 M hinzugefügt.
Durch die gesamte Kulturdauer hindurch wird das Basismedium zusätzlich durch andere Komponenten ergänzt, um die Synthese oder Differenzierung herbeizuführen oder um das Zellwachstum zu verbessern, beispielsweise Hydrocortison, Selen und L-Glutamin.
Es wurde nachgewiesen, dass Hydrocortison in einer Keratinocytenkultur den Keratinocytenphänotypen fördert und somit differenzierte Eigenschaften verstärkt, beispielsweise Involucrin- und Keratinocytentransglutaminasegehalt (Rubin et al., J. Cell Physiol., 138:208-214 (1968)). Daher ist Hydrocortison ein wünschenswerter Zusatzstoff in Fällen, wo diese Eigenschaften nützlich sind, beispielsweise bei der Bildung von Keratinocytenblatttransplantaten oder Hautkonstrukten. Hydrocortison kann in einem Konzentrationsbereich bereitgestellt werden, der von ungefähr 0,01 μg/ml bis ungefähr 4,0 μg/ml reicht, am bevorzugtesten in einer Konzentration zwischen ungefähr 0,4 μg/ml bis 16 μg/ml.
Selen wird einem serumfreien Medium hinzugefügt, um die Spurenelemente von Selen zu ergänzen, die normalerweise vom Serum bereitgestellt werden. Selen kann in einer Konzentration im Bereich von ungefähr 10^–9 M bis ungefähr 10^–7 M, am bevorzugtesten in einer Konzentration von ungefähr 5,3 × 10^–8 M, bereitgestellt werden.
Die Aminosäure L-Glutamin ist in einigen Nährstoffbasen enthalten und kann in Fällen hinzugefügt werden, in denen keine oder unzureichende Mengen vorhanden sind. L-Glutamin kann auch in stabiler Form bereitgestellt werden, wie in jener, die unter der Markenbezeichnung G1utaMAX-1^TM (Gibco BRL, Grand Island, NY) verkauft wird. GlutaMAX-1^TM ist die stabile Dipeptidform von L-Alanyl-L-Glutamin und kann austauschbar mit L-Glutamin verwendet werden und wird in äquimolaren Konzentrationen als Substitut für L-Glutamin bereitgestellt. Das Dipeptid bietet für L-Glutamin Stabilität hinsichtlich eines Abbaus während der Lagerungszeit und während der Inkubation, welcher zu Unsicherheit bei der effektiven Konzentration von L-Glutamin im Medium führen kann. Typischerweise wird das Basismedium mit vorzugsweise zwischen ungefähr 1 mM bis ungefähr 6 mM ergänzt, bevorzugter zwischen ungefähr 2mM bis ungefähr 5mM und am bevorzugtesten mit 4 mM L-Glutamin oder GlutaMAX-1^TM.
Wachstumsfaktoren wie der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) können ebenfalls dem Medium hinzugefügt werden, um bei der Schaffung der Kulturen durch Maßstabsvergrößerung der Zellenkultivierung und Beimpfung zu helfen. EGF kann in nativer Form oder in rekombinanter Form verwendet werden. Humane native oder rekombinante Formen von EGF werden für die Verwendung im Medium bevorzugt, wenn ein Hautäquivalent hergestellt wird, das keine nicht-humanen biologischen Komponenten enthält. EGF ist eine optionale Komponente und kann in einer Konzentration zwischen ungefähr 1 bis 15 ng/mL bereitgestellt werden, bevorzugter in einer Konzentration zwischen ungefähr 5 bis 10 ng/mL.
Das oben beschriebene Medium wird typischerweise so wie unten angeführt hergestellt. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die Komponenten der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer herkömmlichen Methodologie hergestellt und zusammengefügt werden können, die mit ihren physischen Eigenschaften kompatibel ist. Auf dem Fachgebiet ist wohl bekannt, bestimmte Komponenten mit einem geeigneten Analog oder einem funktionell gleichwertigen Wirkstoff zu ersetzen, und zwar aus Gründen der Verfügbarkeit oder Wirtschaftlichkeit, wobei ein ähnliches Ergebnis erzielt wird. Natürlich vorkommende Wachstumsfaktoren können durch rekombinante oder synthetische Wachstumsfaktoren ersetzt werden, die ähnliche Eigenschaften und Ergebnisse aufweisen, wenn sie bei der Ausführung der Erfindung verwendet werden.
Medien gemäß der vorliegenden Erfindung sind steril. Sterile Komponenten werden steril gekauft oder durch herkömmliche Verfahren, wie Filtration, nach der Zubereitung steril gemacht. Geeignete aseptische Verfahren wurden während der gesamten folgenden Beispiele verwendet. DMEM und F-12 werden zuerst vermischt, und die einzelnen Komponenten werden danach hinzugefügt, um das Medium zu vervollständigen. Stamm-Lösungen aller Komponenten können bei –20 °C gelagert werden, mit Ausnahme der Nährstoffquelle, die bei 4 °C gelagert werden kann. Alle Stamm-Lösungen werden mit 500X Endkonzentrationen, so wie oben angeführt, hergestellt. Eine Stamm-Lösung aus Insulin, Transferrin und Triiodothyronin (alle von Sigma) wird wie folgt hergestellt: Triiodothyronin wird anfangs in absolutem Ethanol in 1N Salzsäure (HCl) in einem Verhältnis von 2:1 aufgelöst. Insulin wird in verdünnter HCl (ungefähr 0,1 N) aufgelöst, und Transferrin wird in Wasser aufgelöst. Die drei werden danach gemischt und in Wasser auf eine 500X Konzentration verdünnt. Ethanolamin und o-Phosphorylethanolamin werden in Wasser auf eine 500X Konzentration aufgelöst und danach sterilfiltriert. Progesteron wird in absolutem Ethanol aufgelöst und mit Wasser verdünnt. Hydrocortison wird in absolutem Ethanol aufgelöst und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt. Selen wird in Wasser auf eine 500X Konzentration aufgelöst und sterilfiltriert. EGF wird steril gekauft und in PBS aufgelöst. Adenin ist schwierig aufzulösen, kann aber durch eine Reihe von Verfahren aufgelöst werden, die Fachleuten bekannt sind. Serumalbumin kann bestimmten Komponenten hinzugefügt werden, um sie in Lösung zu stabilisieren und wird gegenwärtig entweder aus humanen oder tierischen Quellen gewonnen. Zum Beispiel kann Humanserum-Albumin (HSA) oder Rinderserum-Albumin (BSA) für eine verlängerte Lagerung hinzugefügt werden, um die Aktivität von Progesteron und EGF-Stammlösungen aufrechtzuerhalten. Das Medium kann entweder sofort nach der Zubereitung verwendet oder bei 4 °C gelagert werden. Wenn es gelagert wird, sollte EGF nicht vor dem Zeitpunkt der Verwendung hinzugefügt werden.
Um die Zell-Matrix-Schicht durch die Kultur von matrixerzeugenden Zellen zu bilden, wird das Medium mit zusätzlichen Wirkstoffen ergänzt, welche die Matrixsynthese und das Abscheiden durch die Zellen fördern. Diese zusätzlichen Wirkstoffe sind zellkompatibel, auf einen hohen Reinheitsgrad definiert und frei von Verunreinigungen. Das Medium, das zur Herstellung der Zell-Matrix-Schicht verwendet wird, wird als „Matrixherstellungsmedium" bezeichnet.
Um das Matrixherstellungsmedium zu erzeugen, wird das Basismedium mit einem Ascorbatderivat wie Natriumascorbat, Ascorbinsäure oder einem seiner chemisch stabileren Derviate wie L-Ascorbinsäurephosphatmagnesiumsalz n-Hydrat ergänzt. Ascorbat wird hinzugefügt, um die Hydroxylierung von Prolin und die Absonderung von Procollagen zu fördern, einem löslichen Vorläufer zu abgeschiedenen Collagenmolekülen. Ascorbat hat sich auch als wichtiger Cofaktor für posttranslationale Verarbeitung anderer Enzyme erwiesen, sowie als ein Aufwärtsregulator von Typ-I- und Typ-III-Collagen-Synthese.
Obwohl diese Theorie keine Einschränkung darstellen soll, bewahrt das Ergänzen des Mediums mit Aminosäuren, die an der Proteinsynthese beteiligt sind, die zelluläre Energie, indem die Zellen nicht gezwungen werden, selbst Aminosäuren zu erzeugen. Die Zugabe von Prolin und Glycin wird bevorzugt, da sie, so wie die hydroxylierte Form von Prolin, Hydroxyprolin, grundlegende Aminosäuren sind, welche die Struktur des Collagens ausmachen.
Obwohl nicht erforderlich, wird das Matrixherstellungsmedium wahlweise mit einem neutralen Polymer ergänzt. Die Zell-Matrix-Konstrukte der Erfindung können ohne ein neutrales Polymer erzeugt werden, dennoch kann, ohne dass diese Theorie eine Einschränkung darstellen soll, ihre Gegenwart in dem Matrixherstellungsmedium die Collagenverarbeitung und -abscheidung zwischen Proben konsistenter gestalten. Ein bevorzugtes neutrales Polymer ist Polyethylenglykol (PEG), das nachweislich die In-Vitro-Verarbeitung des löslichen Vorläufer-Procollagens, das durch die kultivierten Zellen hergestellt wird, zu matrixabgeschiedenem Collagen fördert. Gewebekulturgradiges PEG innerhalb des Bereichs zwischen ungefähr 1000 bis ungefähr 4000 MW (Molekulargewicht), bevorzugter zwischen ungefähr 3400 bis ungefähr 3700 MW wird in den Medien der Erfindung bevorzugt. Bevorzugte PEG-Konzentrationen, die in der Erfindung verwendet werden, können Konzentrationen von ungefähr 5 % w/v oder weniger sein, vorzugsweise von ungefähr 0,01 % w/v bis ungefähr 0,5 % w/v, bevorzugter von zwischen ungefähr 0,025 % w/v bis ungefähr 0,2 % w/v, am bevorzugtesten ungefähr 0,05 % w/v.
Andere kulturgradige neutrale Polymere wie Dextran, vorzugsweise Dextran T-40, oder Polyvinylpyrrolidon (PVP), vorzugsweise im Bereich von 30.000 – 40.000 MW können ebenfalls in Konzentrationen von ungefähr 5 % w/v oder weniger verwendet werden, vorzugsweise zwischen ungefähr 0,01 % w/v bis ungefähr 0,5 % w/v, bevorzugter zwischen ungefähr 0,025 % w/v bis ungefähr 0,2% w/v, am bevorzugtesten ungefähr 0,05 % w/v. Andere zellkulturgradige und zellkompatible Wirkstoffe, welche die Collagenverarbeitung und – abscheidung fördern, können durch Fachleute auf dem Gebiet der Säuger-Zellkultur bestimmt werden.
Wenn die zellerzeugenden Zellen konfluent sind und das Kulturmedium mit Komponenten ergänzt wird, die bei der Matrixsynthese, Absonderung oder Organisation helfen, gilt, dass die Zellen stimuliert werden, um ein Gewebekonstrukt auszubilden, das aus Zellen und einer Matrix besteht, die durch diese Zellen synthetisiert wurde.
Daher enthält eine Formulierung eines bevorzugten Matrixherstellungsmediums: eine Basismischung 3:1 von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Formulierung mit hohem Glucosegehalt, ohne L-Glutamin) und Hams F-12 Medium, ergänzt entweder durch 4 mM L-Glutamin oder Äquivalent, 5 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor, 0,4 μg/ml Hydrocortison, 1 × 10^–4 M Ethanolamin, 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin, 5 μg/ml Insulin, 5 μg/ml Transferrin, 20 pM Triiodothyronin, 6,78 ng/ml Selen, 50 ng/ml L-Ascorbinsäure, 0,2 μg/ml L-Prolin und 0,1 μg/ml Glycin. Zu dem Herstellungsmedium können andere pharmakologische Wirkstoffe zu der Kultur hinzugefügt werden, um die Natur, die Menge oder den Typ der abgesonderten extrazellulären Matrix zu ändern. Diese Wirkstoffe können Polypeptidwachstumsfaktoren, Transkriptionsfaktoren oder anorganische Salze einschließen, um eine Aufwärtsregulierung der Collagentranskription durchzuführen. Beispiele für Polypeptidwachstumsfaktoren sind der transformierende Wachstumsfaktor-Beta 1 (TGF-β1) und der Gewebeplasminogenaktivator (TPA), von denen beide bekannt sind, dass sie eine Aufwärtsregulierung der Collagensynthese durchführen. Raghow et al., Journal of Clinical Investigation, 79:1285-1288 (1987); Paredes et al., Journal of Investigative Dermatology, 100:549 (1993). Ein Beispiel eines anorganischen Salzes, das die Collagenproduktion stimuliert, ist Cerium. Shivakumar et al., Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 24:775-780 (1992).
Die Kulturen werden in einem Inkubator gehalten, um geeignete Umweltbedingungen in Form von kontrollierter Temperatur, Feuchtigkeit und Gasmischung für die Kultur von Zellen zu gewährleisten. Bevorzugte Bedingungen liegen zwischen ungefähr 34 °C bis ungefähr 38 °C, bevorzugter bei 37 ± 1 °C, mit einer Atmosphäre zwischen ungefähr 5 – 10 ± 1 % CO₂ und einer relativen Feuchtigkeit (Rh) von zwischen ungefähr 80 – 90 %.
Das Zell-Matrix-Konstrukt ist ein dermales Konstrukt, das aus dermalen Fibroblasten und ihrer abgesonderten Matrix besteht. Vorzugsweise werden humane dermale Fibroblasten verwendet, die als Primärzellen von der Dermis gewonnen werden, oder bevorzugter aus seriell durchwanderten oder subkultivierten etablierten Zell-Vorräten oder Zell-Banken, die im Hinblick auf virale und bakterielle Kontaminierung überprüft und auf Reinheit getestet wurden. Die Zellen werden unter geeigneten Bedingungen in einem Wachstumsmedium kultiviert, um sie dazu zu bringen, auf eine geeignete Anzahl für das Einimpfen der Zellen in das Kultursubstrat zu proliferieren, auf dem ein Zell-Matrix-Konstrukt gebildet werden soll. Alternativ dazu können Zellen aus gefrorenen Zell-Vorräten direkt in das Kultursubstrat beimpft werden.
Sobald eine ausreichende Anzahl an Zellen erreicht wurde, werden die Zellen geerntet und auf eine geeignete Kulturoberfläche geimpft und unter geeigneten Wachstumsbedingungen kultiviert, um eine konfluente Schicht an Zellen zu bilden. In der bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen auf eine poröse Membran beimpft, die untergetaucht ist, um einen Mediumkontakt von unterhalb der Kultur durch die Poren und direkt darüber zu ermöglichen. Vorzugsweise werden die Zellen entweder in der Basis oder dem Wachstumsmedium suspendiert und auf die Zellkulturoberfläche mit einer Dichte zwischen ungefähr 1 × 10⁵ Zellen/cm² bis ungefähr 6,6 × 10⁵ Zellen/cm² beimpft, bevorzugter zwischen ungefähr 3 × 10⁵ Zellen/cm² bis ungefähr 6,6 × 10⁵ Zellen/cm² und am bevorzugtesten ungefähr 6,6 × 10⁵ Zellen/cm² (Zellen pro Quadratzentimeterfläche der Oberfläche). Die Kulturen werden in einem Wachstumsmedium kultiviert, um die Kultur zu etablieren und werden auf zwischen ungefähr 80 % bis 100 % Konfluenz kultiviert, wobei sie zu diesem Zeitpunkt chemisch induziert werden, indem das Medium in ein Matrixherstellungsmedium geändert wird, um die Synthese und Absonderung der extrazellulären Matrix aufwärts zu regulieren. In einem alternativen Verfahren werden Zellen direkt in das Herstellungsmedium beimpft, damit es nicht mehr notwendig ist, von dem Basismedium zum Herstellungsmedium zu wechseln, wobei dies jedoch ein Verfahren ist, das höhere Impfungsdichten erfordert.
Während der Kultur organisieren Fibroblasten die abgesonderten Matrixmoleküle, um eine dreidimensionale gewebeähnliche Struktur zu bilden, weisen aber keine bedeutenden Kontraktionskräfte auf, die dazu führen würden, dass sich das Zell-Matrix-Konstrukt zusammenzieht und sich selbst von dem Kultursubstrat ablöst. Alle zwei bis drei Tage wird das Medium durch ein frisches Matrixherstellungsmedium ausgetauscht, und im Laufe der Zeit nimmt die abgesonderte Matrix an Stärke und Organisation zu. Die Zeit, die für die Herstellung eines Zell-Matrix-Konstruktes erforderlich ist, hängt von der Fähigkeit der anfänglichen Impfungsdichte, dem Zelltyp, dem Alter der Zelllinie und der Fähigkeit der Zelllinie ab, die Matrix künstlich herzustellen und abzusondern. Nach vollständiger Ausbildung weisen die Konstrukte der Erfindung eine Dicke der Masse aufgrund der von den Zellen hergestellten und organisierten faserartigen Matrix auf. Sie sind keine gewöhnlichen konfluenten oder übermäßig konfluenten Zellkulturen, wo Zellen lose aneinander haften können. Die faserartige Qualität verleiht den Konstrukten kohäsive gewebeähnliche Eigenschaften, im Gegensatz zu gewöhnlichen Kulturen, weil sie physischer Beschädigung, wie einem Zerreißen oder einer Rissbildung, bei routinemäßiger Handhabung in einer klinischen Umgebung widerstehen. Bei der Herstellung eines kultivierten dermalen Konstruktes werden die Zellen eine organisierte Matrix um sich herum auf der Zellkulturoberfläche bilden, vorzugsweise mit einer Dicke von mindestens ungefähr 30 Mikron oder dicker, bevorzugter mit einer Dicke von ungefähr 60 bis ungefähr 120 Mikron über die Fläche der Membran. Es wurden jedoch Dicken von über 120 Mikron erzielt, und diese sind zur Verwendung bei Testanwendungen oder klinischen Anwendungen geeignet, wo eine solche größere Dicke erforderlich ist.
Eine Epithelzellschicht von Keratinocyten wird auf eine Fläche, vorzugsweise die Oberfläche, mit nach oben gerichteter Fläche des Zell-Matrix-Konstruktes aufgetragen. Auf das Zell-Matrix-Konstrukt können Epithelzellen aufgeimpft und darauf kultiviert werden, um ein mehrschichtiges Gewebekonstrukt zu bilden. Keratinocyten, die aus Haut gewonnen werden, werden auf dem Zellkonstrukt gezüchtet, um ein Hautkonstrukt der Erfindung zu bilden.
Verfahren zur Bereitstellung von epidermalen Zellen an ein dermales Substrat und Verfahren für deren Kultur, welche die Induktion von Differenzierung und Kornifikation einschließen, um eine differenzierte Keratinocytenschicht zu bilden, sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden in der US-Patentschrift Nr. 5,712,163 an Parentau et al. und in der US-Patentschrift Nr. 5,536,656 an Kemp et al, beschrieben, deren Inhalte hiermit als Referenz aufgenommen werden. Typischerweise werden zur Durchführung der Epidermalisierung des Zell-Matrix-Konstruktes Keratinocyten auf das Zell-Matrix-Konstrukt beimpft und darauf kultiviert, bis die Schicht ungefähr ein bis drei Zellschichten dick ist. Die Keratinocyten werden daraufhin induziert, um zu differenzieren, um eine mehrschichtige Epidermis zu bilden, und werden dann induziert, um zu kornifizieren, um ein Stratum Corneum zu bilden.
In dem Verfahren zur Bildung einer differenzierten epidermalen Schicht werden subkultivierte Keratinocyten aus dem Zell-Vorrat genommen und ihre Zellzahl ausgeweitet. Wenn eine erforderliche Anzahl an Zellen erreicht wurde, werden die Zellen aus dem Kultursubstrat freigesetzt, suspendiert, gezählt, verdünnt und danach auf die Oberfläche des Zell-Matrix-Konstruktes mit einer Dichte zwischen ungefähr 4,5 × 10³ Zellen/cm² bis ungefähr 5,0 × 10⁵ Zellen/cm² beimpft, bevorzugter mit einer Dichte zwischen ungefähr 1,0 × 10⁴ Zellen/cm² bis ungefähr 1,0 × 10⁵ Zellen/cm² und am bevorzugtesten mit einer Dichte von ungefähr 4,5 × 10⁴ Zellen/cm². Die Konstrukte werden dann für zwischen ungefähr 60 bis ungefähr 90 Minuten bei 37 ± 1 °C, 10 % CO₂ inkubiert, um den Keratinocyten zu ermöglichen, sich anzuheften. Nach dem Inkubieren werden die Konstrukte in einem Epidermalisierungsmedium untergetaucht. Nach einer ausreichenden Zeitspanne in Kultur proliferieren die Keratinocyten und breiten sich aus, um eine konfluente Monoschicht über das Zell-Matrix-Konstrukt hinweg zu bilden. Sobald konfluent, wird die Zellmediumformulierung in ein Differenzierungsmedium geändert, um die Zelldifferenzierung herbeizuführen. Wenn ein mehrschichtiges Epithel gebildet wurde, wird danach ein Kornifikationsmedium verwendet, und die Kultur wird an die Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle gebracht. Zur Differenzierung und Kornifikation von Keratinozyten werden die Zellen einer trockenen Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle oder einer Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle mit geringer Feuchtigkeit ausgesetzt. Eine trockene Schnittstelle oder eine Schnittstelle mit geringer Feuchtigkeit kann so charakterisiert werden, dass sie versucht, die geringen Feuchtigkeitswerte der Haut zu duplizieren. Im Laufe der Zeit werden die Keratinozyten die meisten oder alle der Keratine und andere Merkmale, die in nativer Haut bei Aussetzen gegenüber diesen Bedingungen gefunden werden, exprimieren.
Wahlweise können gemischte Zellpopulationen von zwei oder mehr Zelltypen gemeinsam während der Bildung eines Hautkonstruktes der Erfindung kultiviert werden, vorausgesetzt, dass mindestens eine der Zelltypen, die verwendet werden, in der Lage ist, eine extrazelluläre Matrix zu synthetisieren. Der zweite Zelltyp kann ein Typ sein, der benötigt wird, um andere Gewebefunktionen zu erfüllen oder bestimmte strukturelle Merkmale des Gewebekonstruktes zu entwickeln. In der Herstellung eines Hautkonstruktes der Erfindung, können dermale Papilla-Zellen oder Epithelzellen von Anhangsgebilden mit den matrixherstellenden Zellen kultiviert werden, um die Bildung von Epithelanhangsgebilden oder deren Komponenten zu ermöglichen. Epidermale Anhangsgebilde wie Schweiß- oder Talgdrüsenstrukturen oder Komponenten oder Haarfollikelstrukturen oder Komponenten können sich ausbilden, wenn sie gemeinsam mit den matrixherstellenden Zellen kultiviert werden. Epithelzellen können aus den Drüsen- und Haar-Anhangsgebilden gewonnen werden, die sich in der tiefen Dermis befinden, beispielsweise durch Mikrodissektion, und schließen ekkrine Zellen, Myoepithelzellen, drüsensekretorische Zellen, Haarfollikelstammzellen ein. Andere Zelltypen, die normalerweise in der Haut gefunden werden, welche Haut bilden, können auch hinzugefügt werden, beispielsweise Melanocyten, Langerhans-Zellen und Merkel-Zellen. In ähnlicher Weise können vaskuläre Endothelzellen co-kultiviert werden, um rudimentäre Komponenten für neue Gefäßsystembildung zu erzeugen. Adipocyten können ebenfalls mit den matrixherstellenden Zellen kultiviert werden, um ein Konstrukt zu bilden, das für rekonstruktive Chirurgie verwendet wird. Als alternative Form der Bereitstellung dieses zweiten Zelltyps können die Zellen lokal als ein Punkt oder als eine Anordnung einer beliebigen Anzahl von Punkten von Zellen auf oder innerhalb einer sich bildenden oder vollständig gebildeten Zell-Gewebe-Matrix für die lokalisierte Entwicklung dieser Strukturen beimpft werden. Um die Zellen innerhalb des Zell-Matrix-Konstruktes einzuimpfen, können die Zellen zwischen der Oberfläche und der Grundfläche innerhalb der Zell-Matrix injiziert werden, damit die Zellen wachsen, spezielle Strukturen ausbilden und ihre spezielle Funktion ausüben.
Um ein dreischichtiges Gewebekonstrukt zu erzeugen, wird eine erste Impfung von Zellen, welche einen matrixerzeugenden Zelltyp oder einen nicht-matrixerzeugenden Zelltyp enthält, auf das Kultursubstrat für eine Zeitdauer beimpft, die ausreicht, um ein Zell-Matrix-Konstrukt oder eine Zellschicht zu erzeugen. Sobald das erste Zell-Matrix-Konstrukt oder die erste Zellschicht ausgebildet ist, wird eine zweite Impfung von Zellen, welche einen matrixerzeugenden Zelltyp enthält, auf die Oberfläche des ersten Zell-Matrixkonstruktes oder die erste Zellschicht aufgeimpft und für eine Zeit unter Bedingungen kultiviert, die ausreicht, um ein zweites Zell-Matrix-Konstrukt auf dem ersten Konstrukt zu bilden. Auf dem zweiten Zell-Matrix-Konstrukt wird eine dritte Impfung eines dritten Zelltyps aufgeimpft und unter geeigneten Bedingungen kultiviert, um die dritte Schicht zu erzeugen. Als Beispiel für die Erzeugen eines dreischichtigen kornealen Konstruktes kann die Zelle des ersten Zelltyps aus endothelialem Ursprung bestehen, wie zum Beispiel korneale Endothelzellen. Der zweite Zelltyp kann Zellen mit Bindegewebe-Ursprung enthalten, beispielsweise korneale Keratocyten; und der dritte Zelltyp kann Zellen mit Epithelursprung enthalten, beispielsweise korneale Epithelzellen. Als weiteres Beispiel für ein dreischichtiges Konstrukt der Haut kann die Zelle der ersten Impfung vaskulären Ursprungs sein, um Komponenten für eine Vaskularisierung bereitzustellen, die Zellen der zweiten Impfung können dermale Fibroblasten aufweisen, um ein Zell-Matrix-Konstrukt zu bilden, um als dermales Konstrukt zu dienen, und die Zellen der dritten Impfung können epidermale Keratinocyten sein, um eine epidermale Schicht zu bilden.
Gewebekonstrukte der Erfindung könne bei kryogenen Temperaturen gelagert werden, wenn Vitrifikations- oder Kryopreservationsverfahren angewendet werden. Verfahren zur Vitrifikation von Gewebekonstrukten werden in der US-Patentschrift Nr. 5,518,878 beschrieben und Verfahren zur Kryopreservation in der US-Patentschrift Nr. 5,689,961 und 5,891,617 und in der Internationalen PCT Anmeldung WO 96/24018, deren Offenbarungen hiermit als Referenz aufgenommen werden.
Die Hautkonstrukte der vorliegenden Erfindung können in Gewebetestsystemen für In-Vitro-Toxikologietests verwendet werden. Die Testsysteme, welche Hautkonstrukte für Testzwecke aufnehmen, werden in der US-Patentschrift Nr. 4,835,102 beschrieben, deren Offenbarung hiermit als Referenz aufgenommen wird. Weil das zellenerzeugte Hautkonstrukt eine ähnliche Struktur, und noch wichtiger eine ähnliche Organisation wie die Haut aufweist, kann es ein wertvolles Testsystem als Alternative oder Ersatz für lebendige humane oder tierische Testverfahren für die Absorption, Toxizität und in vielen Fällen für die Wirksamkeit von Produkten sein. Es wurde gezeigt, dass die Herstellung der Matrix mehrere der Verfahren imitiert, die bei der Herstellung der Matrix und der Reparatur der Matrix in vivo vorkommen. Aufgrund dieser Tatsache kann das beschriebene System ein wertvolles Werkzeug in der Analyse von Wundreparatur und Gewebeerzeugung sein und ferner für das Testen und die Analyse von chemischen und/oder physikalischen Stimulansen der Wundreparatur.
Die Hautkonstrukte der vorliegenden Erfindung sind für die Transplantation oder Implantierung in einen Säugetierwirt geeignet, um die Haut nach einer Verletzung oder Krankheit wiederherzustellen oder zu reparieren. Indikationen für die Transplantation eines Hautkonstruktes schließen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, plastische oder rekonstruktive Chirurgie, Hautwunden, Verbrennungen, Psoriasis, venöse und diabetische Geschwüre und Basalzellenkarzinoma ein. Hautkonstrukte der vorliegenden Erfindung sind für das Schützen des verletzten Gewebes nützlich und dienen danach als ein Gerüst für den Einwuchs des Wirtsgewebes. Es wird angenommen, dass der Grad an Organisation des Gewebes, das in der Erfindung erzeugt wird, auch dazu dienen würde, die Aktionen der Wundreparatur zu erleichtern und möglicherweise zu beschleunigen.
Die Zell-Matrix-Konstrukte der Erfindung weisen kohäsive Eigenschaften auf. „Kohäsiv", so wie hierin verwendet, bedeutet, in der Lage zu sein, die physische unitäre Integrität und gewebeähnliche Handhabungseigenschaften beizubehalten. Die physischen Eigenschaften, welche primär den Konstrukten der Erfindung kohäsive Eigenschaften verleihen, sind Dicke der Masse und eine faserartige Matrixstruktur. Die faserartige extrazelluläre Matrix wird aus zellsynthetisierten Collagen- und anderen Matrixkomponenten ausgebildet, vorrangig fibrillärem Collagen, das in Fibrillen und Fibrillbündeln angeordnet ist, und den Konstrukten ihre Masse gibt. Die Zell-Matrix-Konstrukte der Erfindung sind handhabbar, das heißt, sie können manuell von ihrem Kultursubstrat abgelöst werden, ohne eine Trägerstütze oder spezielle Werkzeuge, und auf den Patienten oder eine Testvorrichtung aufgetragen werden. Sie können einer Beschädigung durch Zerreißen oder Dehnen, die sich aus gewöhnlicher Handhabung in der Klinik ergeben, ohne Beeinträchtigung ihrer Struktur oder Funktion widerstehen. Wenn sie auf einen Patienten aufgetragen werden, können sie durch Nähte oder Klammern in Position gehalten werden.
Um das Hautkonstrukt der vorliegenden Erfindung auf einen Patienten zu transplantieren, wird der Transplantationsbereich gemäß standardmäßiger Vorgangsweise vorbereitet. Für Verbrennungsindikationen müssen die verbrannten Wundstellen, die zu transplantieren sind, für die Transplantation vorbereitet werden, so dass die verbrannte Hautfläche vollständig herausgeschnitten wird. Herausgeschnittene Betten werden vor der Transplantation sauber und klinisch uninfiziert erscheinen. Für tiefe Wunden mit partieller Dicke, die auf eine chirurgische Exzision zurückzuführen sind, wird der präoperative Bereich rasiert, falls erforderlich mit einem antimikrobiellen, antiseptischen Hautreiniger gereinigt und mit normaler Kochsalzlösung gespült. Eine Lokalanästhesie besteht für gewöhnlich aus einer intradermalen Verabreichung von Lidocain oder Epinephrin oder beiden. Sobald die Anästhesie abgeschlossen ist, wird ein Dermatom verwendet, um die Haut bis auf eine geeignete Tiefe zu entfernen, wobei eine tiefe Wunde mit partieller Dicke geschaffen wird. Hämostase kann durch Kompression mit Epinephrin, das Lidocain enthält, erzielt werden, und durch ein Elektrobrenneisen. Das Hautkonstrukt wird dann auf das Wundbett aufgetragen und, falls erforderlich, durch Nähen oder Heften in Position gehalten, danach gepolstert und mit geeigneten Verbänden bandagiert.
Das Hautkonstrukt der vorliegenden Erfindung kann vor dem Transplantieren auf einen Patienten auch vernetzt werden. Die Netzbildung verbessert die Anpassung des Hautkonstruktes auf das Wundbett und stellt ein Mittel zum Ablassen von Wundexsudat von unterhalb des Transplantats bereit. Der Begriff „Netzbildung" wird als ein mechanisches Verfahren definiert, durch welches ein Gewebe mit Schlitzen perforiert wird, um eine netzartige Anordnung zu bilden. Netzbildung wird vorzugsweise durch die Verwendung eines herkömmlichen Gerätes zur Hautnetzbildung (ZIMMER^®; BIOPLASTY^®) ausgeführt. Es könnte ein Gewebe aber auch manuell mit einem Skalpell oder einer Nadel durchstochen oder perforiert werden. Vernetzte Haut kann durch Dehnen der Haut ausgeweitet werden, so dass die Schlitze geöffnet und dann auf das Wundbett aufgelegt werden. Ausgeweitetes vermaschtes Gewebe stellt einen Wundbereich mit maximaler Abdeckung bereit. Alternativ dazu kann vermaschte Haut ohne Ausweitung aufgelegt werden, einfach als eine Schicht mit einer Anordnung von nicht ausgeweiteten Schlitzen. Das Konstrukt vermaschter Haut kann alleine oder gemeinsam mit der eigenen Haut des Patienten, die aus einem anderen Körperbereich stammt, aufgetragen werden. Gewebekonstrukte können auch Perforationen oder Fensterungen und Poren aufweisen, die durch andere Mittel bereitgestellt werden. Fensterungen können manuell unter Verwendung eines Lasers, einer Stanze, eines Skalpells, einer Nadel oder einer Stecknadel durchgeführt werden.
Das Hautkonstrukt der vorliegenden Erfindung kann auf andere Wunden als chirurgische Wunden oder Verbrennungsflächen angewendet werden. Andere Wunden, beispielsweise venöse Geschwüre, diabetische Geschwüre, Dekubitusgeschwüre, können durch die Verwendung des offenbarten Hautkonstruktes einen Heilungsnutzen erfahren. Andere angeborene Hautkrankheiten, wie Epidermolysis bullosa, können ebenfalls Nutzen ziehen.
Die folgenden Beispiele werden zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung angeführt und sind keinesfalls als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung auszulegen.
BEISPIELE
Beispiel I: Bildung einer collagenen Matrix durch humane Vorhautfibroblasten von Neugeborenen
Humane neonatale Vorhautfibroblasten (erhalten von Organogenesis, Inc. Canton, MA) wurden mit 5 × 10⁵ Zellen/162 cm² gewebekulturbehandelter Flaschen (Costar Corp., Cambridge, MA, Kat Nr. 3150) beimpft, und in Wachstumsmedium gezüchtet. Das Wachstumsmedium bestand aus: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Formulierung mit hohem Glukosegehalt, ohne L-Glutamin, BioWhittaker, Walkersville, MD), ergänzt durch 10 % Neugeborenen-Kalbserum (NBCS) (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) und 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD). Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 ± 1 °C mit einer Atmosphäre von 10 ± 1 % CO₂ gehalten. Das Medium wurde durch frisch zubereitetes Medium alle zwei bis drei Tage ersetzt. Nach 8 Tagen in der Kultur, waren die Zellen zu Konfluenz gewachsen, das heißt, dass die Zellen eine gepackte Monoschicht entlang des Bodens der Gewebekulturflasche gebildet hatten und das Medium aus der Kulturflasche abgesaugt wurde. Um die Monoschicht zu spülen, wurde sterilfiltrierte phosphatgepufferte Kochsalzlösung zum Boden jeder Kulturflasche hinzugefügt und danach aus den Flaschen abgesaugt. Die Zellen wurden aus der Flasche freigesetzt, indem 5 mL Trypsinversen-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD) zu jeder Flasche hinzugefügt wurden und danach ein sanfter Schüttelvorgang ausgeführt wurde, um eine vollständige Abdeckung der Monoschicht zu gewährleisten. Die Kulturen wurden in den Inkubator zurückgeführt. Sobald die Zellen freigesetzt worden waren, wurden 5 ml SBTI (Sojabohnentrypsin-Inhibitor) zu jeder Flasche hinzugefügt und mit der Suspension vermischt, um die Aktion von Trypsinversen zu stoppen. Die Zellsuspension wurde aus der Flasche entfernt und gleichmäßig auf sterile, konische Zentrifugenröhrchen aufgeteilt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei ungefähr 800 – 1000 × g über einen Zeitraum von 5 Minuten gesammelt.
Die Zellen wurden unter Verwendung von frischem Medium auf eine Konzentration von 3,0 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und auf gewebekulturbehandelte Einlagen (TRANSWELL^®, Corning Costar) mit 0,4 Mikron Porengröße, 24 mm Durchmesser, in einer flachen Schale mit sechs Vertiefungen mit einer Dichte von 3,0 × 10⁶ Zellen/Einlage (6,6 × 10⁵ Zellen/cm²) beimpft. Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 ± 1 °C mit einer Atmosphäre von 10 ± 1 % CO₂ gehalten, und über einen Zeitraum von 21 Tagen wurde alle 2 bis 3 Tage frisches Herstellungsmedium zugeführt. Das Herstellungsmedium umfasste: eine 3:1 Basismischung von DMEM und Hams F-12 Medium (Quality Biologics Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAX-1^TM (Gibco BRL, Grand Island, NY) und Zusatzstoffe bis zu einer resultierenden Konzentration von 5 ng/ml humanem rekombinantem epdiermalem Wachstumsfaktor (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 2 % Neugeborenen-Kalbserum (Hyclone, Logan, Utah), 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma St. Louis, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY ACS-Grad), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO) und 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), 50 ng/ml L-Ascorbinsäure (WAKO Chemicals USA, Inc. Nr. 013-12061), 0,2 μg/ml L-Prolin (Sigma, St. Louis, MO), 0,1 μg/ml Glycin (Sigma, St. Louis, MO) und 0,05 % Polyethylenglykol (PEG) 3400-3700 MW (Zellkulturgrad) (Sigma, St. Louis, MO).
Proben für eine histologische Analyse wurden an den Tagen 7, 14 und 21 entnommen und in Formalin fixiert, danach in Paraffin eingebettet. Die formalinfixierten Proben wurden in Paraffin eingebettet, und 5 Mikrometerabschnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gefärbt. Unter Verwendung von mit H&E gefärbten Objektträgern wurden Dickemessungen auf zehn zufällig ausgewählten mikroskopischen Feldern durchgeführt, unter Verwendung eines 10X Augenstücks, geladen mit einem 10 mm/100 Mikrometer-Retikel.
Die Ergebnisse für zwei unterschiedliche Zellstämme von humanen dermalen Fibroblasten sind zusammenfassend in Tabelle 1 angeführt, welche die Dicke des sich entwickelnden Zell-Matrix-Konstruktes zeigt.
Proben wurden an den Tagen 7, 14 und 21 auch einer Collagenkonzentrationsanalyse unterzogen. Der Collagengehalt wurde geschätzt und zwar unter Anwendung eines auf dem Fachgebiet bekannten kolorimetrischen Tests im Hinblick auf den Hydroxyprolingehalt (Woessner, 1961). Zu diesen Zeitpunkten wurde auch die Zellzahl bestimmt.
Tabelle 2 ist eine Zusammenfassung der Collagenkonzentration und Tabelle 3 eine Zusammenfassung der Zelldaten aus den Zell-Matrix-Konstrukten, die aus zwei unterschiedlichen Zellstämmen (B156 und B119) unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens hergestellt wurden.
Proben der von humanen Zellen gewonnen dermalen Matrix der Tage 7, 14 und 21 wurden durch verzögerte Reduktions-SDS-PAGE analysiert, um die Collagenzusammensetzung zu bestimmen, wobei Typ I und Typ III Collagen-Alphabänder in den Proben entdeckt wurden.
Die biochemischen Eigenschaften der dermalen Matrix wurden unter Anwendung immunohistochemischer Verfahren bestimmt. Es wurde eine Fibronectin-Identifizierung auf paraffinfixierten Abschnitten unter Verwendung des Zymed-Histostain-Strepavidinbiotinsystems (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA) durchgeführt. Die Tenascin-Gegenwart wurde durch primäres Anti-Tenascin-Antikörperfärben (Dako, Carpitheria, CA) bestimmt, gefolgt von Anti-Maus-Meenettichperoxidase markiertem Antikörper (Calbiochem) als sekundärem Antikörper. Die Proben wurden durch Anwendung von Diaminobenzyn (Sigma St. Louis, MO) visualisiert und mit Kernechtrot (Nuclear Fast Red) gegengefärbt.
Glycosaminoglycan (GAG)-Quantifizierung wurde bei den Proben des Tages 21 unter Verwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens (Farndale, 1986) durchgeführt. Der Test zeigte das Vorliegen von 0,44 Gramm GAG pro cm² in einer Probe von aus menschlicher Zelle gewonnener dermaler Matrix, entnommen 21 Tage nach dem Beimpfen.
Beispiel 2: Hautkonstrukt mit voller Dicke
Unter Verwendung eines dermalen Konstruktes, das mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens ausgebildet wurde, wurden normale humane epidermale Keratinocyten der Vorhaut eines Neugeborenen (erhalten von Organogenesis, Inc. Canton, MA) auf das Zell-Matrix-Konstrukt plattiert, um die epidermale Schicht des Hautkonstruktes zu bilden.
Das Medium wurde aseptisch von der Kultureinlage und seiner Umgebung entfernt. Normale humane epidermale Keratinocyten-Kultivierung wurde für 4 Durchgänge aus gefrorenem Subkulturzell-Vorrat zu Konfluenz im Maßstab vergrößert. Danach wurden die Zellen aus den Kulturschalen mit Hilfe von Trypsinversen freigesetzt, gepoolt und zentrifugiert, um ein Zellpellet zu bilden, in Epidermalisierungsmedium resuspendiert, gezählt und auf die Membran mit einer Dichte von 4,5 × 10⁴ Zellen/cm² beimpft. Die Konstrukte wurden danach 90 Minuten lang bei 37 ± 1 °C, 10 % CO₂, inkubiert, um den Keratinocyten zu ermöglichen, sich anzuheften. Nach dem Inkubieren wurden die Konstrukte in Epidermalisierungsmedium untergetaucht. Das Epidermalisierungsmedium besteht aus einem 3:1-Basisgemisch aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Formulierung mit hohem Glukosegehalt, ohne L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD) und Hams F-12 Medium (Quality Biologics Gaithersburg, MD), ergänzt mit 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma St. Loius, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO), 6,78 ng/ml Selen (Aldrich), 24,4 μg/ml Adenin (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD), 0,3 % cheliertes Neugeborenen-Kalbsserum (Hyclone, Logan, Utah), 0,628 ng/ml Progesteron (Amersham Arlington Heights, IL), 50 μg/ml L-Ascorbatnatriumsalz (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 10 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (Life Technologies Inc., MD) und 50 μg/ml Gentamycinsulfat (Amersham, Arlington Heights, IL). Die Konstrukte wurden in dem Epidermalisierungsmedium über einen Zeitraum von 2 Tagen bei 37 ± 1 °C, 10 % CO₂, kultiviert.
Nach zwei Tagen wurde das Konstrukt im Medium untergetaucht, das aus Folgendem bestand: 3:1 Gemisch aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Formulierung mit hohem Glukosegehalt, ohne L-Glutamin, BioWhittaker, Walkersville, MD), Hams F-12 Medium (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), ergänzt durch 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO), 1 × 10^–4 Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 × 10^–4 o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO) und 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 24,4 μg/ml Adenin (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD), 0,3 % cheliertes Neugeborenen-Kalbserum (BioWhittaker, Walkersville, MD), 0,628 ng/ml Progesteron (Amersham, Arlington Heights, IL), 50 μg/ml Natriumascorbat, 265 μg/ml Kalziumchlorid (Mallinckrodt, Chesterfield, MO) und 50 μg/ml Gentamycinsulfat (Amersham, Arlington Heights, IL). Das Konstrukt wurde wieder bei 37 ± 1 °C, 10 % CO₂, über einen Zeitraum von 2 Tagen inkubiert.
Nach den zwei Tagen wurde der Träger, welcher das Konstrukt enthält, aseptisch zu neuen Kultivierungs-Schalen mit einer ausreichenden Menge an Kornifikationsmedium transferiert, 9 mL, um einen Fluidpegel bis knapp an die Oberfläche der Trägermembran zu erzielen, um eine trockene Schnittstelle zu erhalten, um eine Schichtung der Epithelschicht zu ermöglichen. Die Konstrukte wurden bei 37 ± 1 °C, 10 % CO₂, und geringer Feuchtigkeit, im Medium inkubiert, wobei über einen Zeitraum von 7 Tagen das Medium alle 2 bis 3 Tage gewechselt wurde. Das Medium besteht aus: einem 1:1-Gemisch aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Formulierung mit hohem Glukosegehalt, ohne L-Glutamin, BioWhittaker, Walkersville, MD), Hams F-12 Medium (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), ergänzt durch 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO), 6,78 ng/ml Selen (Aldrich), 24,4 μg/ml Adenin (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD), 2 % Neugeborenen-Kalbserum (BioWhittaker, Walkersville, MD), 50 μg/ml Natriumascorbat und 50 μg/ml Gentamycinsulfat (Amersham, Arlington Heights, IL). Nach 7 Tagen wurde das Konstrukt weitere 10 Tage mit einem Erhaltungsmedium versorgt, wobei dieses alle 2 bis 3 Tage gewechselt wurde. Dieses Erhaltungsmedium bestand aus: einem 1:1-Gemisch von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Formulierung mit hohem Glukosegehalt, ohne L-Glutamin, BioWhittaker, Walkersville, MD), Hams F-12 Medium (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 × 10^–4 M O-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO), und 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 24,4 μg/ml Adenin (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD), 1 % Neugeborenen-Kalbserum (BioWhittaker, Walkersville, MD) und 50 μg/ml Gentamycinsulfat (Amersham, Arlington Heights, IL).
Die endgültigen Proben wurden einer Hämotoxylin- und Eosin-Verarbeitung unterzogen, wie in Beispiel 1 beschrieben, um die grobe Erscheinung unter Lichtmikroskopie zu bestimmen. Das resultierende Konstrukt bestand aus einer unteren (dermalen) Schicht, bestehend aus Fibroblasten, umgeben von einer Matrix, welche die Merkmale aufwies, die in Beispiel 1 beschrieben werden, und wurde vollständig mit einer mehrlagigen, geschichteten und gut differenzierten Schicht von Keratinocyten überzogen, welche eine basale Schicht, eine suprabasale Schicht, eine granulare Schicht und ein Stratum Corneum aufweisen, das jenem einer Haut in situ ähnlich ist. Das Hautkonstrukt weist eine gut entwickelte Basalmembran an der dermal-epidermalen Verbindungsstelle auf, wie durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) gezeigt. Die Basalmembran erscheint um die Hemidesmosome am dicksten, gekennzeichnet durch Verankerungsfibrillen, die aus Typ-VII-Collagen bestehen, wie durch TEM visualisiert. Wie erwartet, können diese Verankerungsfibrillen einfach aus der Basalmembran austreten und die Collagenfibrillen einschließen. Das Vorhandensein von Laminin, einem Basalmembranglycoprotein, wurde nachgewiesen, und zwar unter Verwendung der zuvor beschriebenen Avidin-Biotin-immunoenzymatischen Technik (Guesdon, 1979).
Beispiel 3: In-Vitro-Bildung einer collagenen Matrix durch humane neonatale Vorhautfibroblasten in chemisch definiertem Medium
Humane neonatale Vorhautfibroblasten wurden unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens ausgeweitet. Danach wurden die Zellen auf eine Konzentration von 3 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und auf gewebekulturbehandelte Membraneinlagen mit einer Porengröße von 0,4 Mikron und einem Durchmesser von 24 mm in einer Schale mit sechs Vertiefungen bei einer Dichte von 3,0 × 10⁶ Zellen/TW (6,6 × 10⁵ Zellen/cm²) beimpft. Diese Zellen wurden danach wie in Beispiel 1 aufrechterhalten, wobei Neugeborenem-Kalbserum durch das gesamte Medium hindurch weggelassen wurde. Das Medium enthielt insbesondere: ein 3:1-Basisgemisch aus DMEM, Hams F-12 Medium (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) und Zusatzstoffen: 5 ng/ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY Kat. Nr. 02400 ACS-Grad), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO) und 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 50 ng/ml L-Ascorbinsäure (WAKO Chemicals USA, Inc.), 0,2 μg/ml L-Prolin (Sigma, St. Louis, MO), 0,1 μg/ml Glycin (Sigma, St. Louis, MO) und 0,05 % Polyethylenglykol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO). An den Tagen 7, 14 und 21 wurden die Proben mit Hilfe der beschriebenen Verfahren auf die Collagenkonzentration und die Zellzahl hin überprüft. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 (Zellzahl) und 5 (Collagen) zusammengefasst. Die Proben wurden auch formalinfixiert und für Hämatoxylin- und Eosin-Färbung für eine Lichtmikroskopanalyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, verarbeitet. Die histologische Evaluierung zeigte, dass die Konstrukte, die in definiertem Medium gezüchtet wurden, jenen ähnlich waren, die in Gegenwart von 2 % Neugeborenen-Kalbserum gezüchtet wurden. Die Proben färbten sich auch positiv für Fibronectin, unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens.
Abgesehen von endogen erzeugtem fibrillärem Collagen, waren auch Decorin und Glycosaminoglycan in dem Zell-Matrix-Konstrukt vorhanden.
Beispiel 4: Hautkonstrukt voller Dicke, das mit Hilfe von chemisch definiertem Medium gebildet wurde
Unter Verwendung eines dermalen Konstruktes des 25. Tages, das durch humane dermale Fibroblasten unter chemisch definierten Bedingungen ausgebildet wurde, die jenen des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens ähnlich sind, wurden normale humane neonatale Vorhautepidermalkeratinocyten auf die Oberfläche des Zell-Matrix-Konstruktes beimpft, um die epidermale Schicht des Hautkonstruktes zu bilden.
Das Medium wurde aseptisch von der Kultureinlage und seiner Umgebung entfernt. Normale humane epidermale Keratinocyten-Kultivierung wurden für 4 Durchgänge aus gefrorenem Subkulturzell-Vorrat auf Konfluenz im Maßstab vergrößert. Danach wurden die Zellen aus den Kulturschalen mit Hilfe von Trypsinversen freigesetzt, gepoolt und zentrifugiert, um ein Zellpellet zu bilden, in Epidermalisierungsmedium resuspendiert, gezählt und auf die Membran mit einer Dichte von 4,5 × 10⁴ Zellen/cm² geimpft. Die Konstrukte wurden danach 90 Minuten lang bei 37 ± 1 °C, 10 % CO, inkubiert, um den Keratinocyten zu ermöglichen, sich anzuheften. Nach dem Inkubieren wurden die Konstrukte in Epidermalisierungsmedium untergetaucht. Das Epidermalisierungsmedium besteht aus einem 3:1-Basisgemisch aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (ohne Glukose und ohne Kalzium, BioWhittaker, Walkersville, MD) und Hams F-12 Medium (Quality Biologics Gaithersburg, MD), ergänzt mit 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma St. Loius, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO), 6,78 ng/ml Selen (Aldrich), 24,4 μg/ml Adenin (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD), 50 mg/ml L-Ascorbamatriumsalz (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 16 μM Linolsäure (Sigma, St. Louis, MO), 1 μM Tocopherolacetat (Sigma, St. Louis, MO) und 50 μg/ml Gentamicinsulfat (Amersham, Arlington Heights, IL). Die Konstrukte wurden in dem Epidermalisierungsmedium 2 Tage lang bei 37 ± 1 °C, 10 ± 1 % CO₂, kultiviert.
Nach zwei Tagen wurde das Medium durch frisches Medium, gemäß oben angeführter Zusammensetzung, ausgetauscht und wieder in den Inkubator eingeführt, bei 37 ± 1 °C, 10 ± 1 % CO₂, über einen Zeitraum von zwei Tagen. Nach den zwei Tagen wurde der Träger, der das Konstrukt: enthält, aseptisch in neue Kultivierungs-Schalen mit ausreichendem Medium transferiert, um einen Flüssigkeitsspiegel bis knapp zur Oberfläche der Trägermembran zu erreichen, um das sich entwickelnde Konstrukt an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle zu halten. Die Luft, welche die Oberfläche der sich ausbildenden epidermalen Schicht berührt, ermöglicht die Schichtung der Epithelschicht. Die Konstrukte wurden bei 37 ± 1 °C, 10 % CO2, und geringer Feuchtigkeit im Medium inkubiert, wobei das Medium über einen Zeitraum von 7 Tagen alle 2 bis 3 Tage gewechselt wurde. Dieses Medium enthielt: ein 1:1 Gemisch aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (ohne Glukose und ohne Kalizium, BioWhittaker, Walkersville, MD), Hams F-12 Medium (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), ergänzt durch 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO), 5 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY), 5 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO), 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 24,4 μg/ml Adenin (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD), 2,65 μg/ml Kalziumchlorid (Mallinckrodt, Chesterfield, MO), 16 μM Linolsäure (Sigma, St. Louis, MO), 1 μM Tocopherolacetat (Sigma, St. Louis, MO), 1,25 mM Serin (Sigma, St. Louis, MO), 0,64 mM Cholinchlorid (Sigma, St. Louis, MO) und 50 μg/ml Gentamicinsulfat (Amersham, Arlington Heights, IL). Die Kulturen wurden über einen Zeitraum von 14 Tagen alle 2 bis 3 Tage gefüttert.
Proben wurden in dreifacher Ausführung an den Tagen 10, 12 und 14, nachdem das Konstrukt ein die Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle angehoben worden war, für die Hämatoxylin- und Eosin-Verarbeitung, gemäß Beschreibung in Beispiel 1, vorgelegt, um die grobe Erscheinung unter Lichtmikroskopie zu bestimmen. Das resultierende Konstrukt bestand aus einer unteren (dermalen) Schicht, bestehend aus Fibroblasten, umgeben von einer Matrix, die Merkmale aufwies, wie jene, die in Beispiel 3 beschrieben werden, und wurde mit einer Schicht von geschichteten und differenzierten Keratinocyten überzogen.
Beispiel 5: In-Vitro-Bildung einer collagenen Matrix durch humanes Achillessehnenfibroblasten
Zell-Matrix-Konstrukte wurden unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens ausgebildet, wobei die humanen neonatalen Vorhautfibroblasten durch humane Achillessehnenfibroblasten (HATF) ersetzt wurden. Nach 21 Tagen im Herstellungsmedium wurden die Proben auch einer H&E-Färbung und Dickebestimmung mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens unterzogen. Das resultierende Konstrukt wurde als ein Zell-Matrixgewebe-ähnliches Konstrukt mit einer Dicke von 75,00 ± 27,58 Mikron (n=2) visualisiert. Endogen erzeugtes fibrilläres Collagen, Decorin und Glycosaminoglycan waren ebenfalls im Konstrukt vorhanden.
Beispiel 6: In-Vitro-Bildung einer collagenen Matrix durch transfizierte humane neonatale Vorhautfibroblasten
Transfizierte humane dermale Fibroblasten wurden mit Hilfe folgenden Verfahrens erzeugt. Eine Phiole mit jCRIP-43 Plättchen-abgeleiteten-Wachstumsfaktor (PDGF) viralen Herstellern (Morgan, J. et al.) wurde aufgetaut und die Zellen wurden mit 2 × 10⁶ Zellen/162 cm² Flasche (Corning Costar, Cambridge, MA) beimpft. Diese Flaschen wurden mit einem Wachstumsmedium versorgt und in einem Inkubator bei 37 ± 1 °C mit einer Atmosphäre von 10 ± 1 % CO₂ gehalten. Das Wachstumsmedium bestand aus: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Formulierung mit hohem Glukosegehalt, ohne L-Glutamin, BioWhittaker, Walkersville, MD), ergänzt durch 10 % Neugeborenen-Kalbserum (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) und 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD). Am selben Tag wurde auch eine Phiole humaner neonataler Vorhautfibroblasten (HDFB 156) aufgetaut und bei 1,5 ± 10⁶ Zellen/162 cm² Flasche (Corning Costar, Cambridge, MA) ausplattiert. Nach drei Tagen wurden die jCRIP PDGF-43-virale Erzeuger mit frischem Wachstumsmedium versorgt. Die HDFB 156 wurden mit dem oben genannten Wachstumsmedium versorgt, plus 8 μg/ml Polybren (Sigma, St. Louis, MO). Am nächsten Tag wurden die HDFB 156-Zellen wie folgt infiziert. Das verbrauchte Medium aus den jCRIP PDGF-43-viralen Erzeugern wurde gesammelt und durch einen 0,45-Mikron-Filter filtriert. 8 μg/ml Polybren wurden diesem filtrierten verbrauchten Medium hinzugefügt. Das verbrauchte Medium wurde danach auf die HDF platziert. An den nächsten zwei Tagen wurden die HDF mit frischem Wachstumsmedium versorgt. Am Tag darauf wurden die HDF von p5 zu p6 übergeleitet und mit einer Dichte von 2,5 × 10⁶ Zellen/162 cm² Flasche (Corning Costar, Cambridge, MA) beimpft. Die Zellen wurde wie folgt übergeleitet – das Medium wurde abgesaugt. Die Flaschen wurden danach mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung gespült, um etwaiges restliches Neugeborenen-Kalbserum zu entfernen. Danach wurden die Zellen aus der Flasche freigesetzt, indem 5 mL Trypsinversen zu jeder Flasche hinzugefügt wurden und ein sanftes Schütteln durchgeführt wurde, um eine vollständige Abdeckung der Monoschicht zu gewährleisten. Danach wurden die Kulturen zum Inkubator zurückgebracht. Sobald die Zellen freigesetzt worden waren, wurden 5 mL SBTI (Sojabohnentrypsin-Inhibitor) jeder Flasche hinzugefügt und mit der Supsension gemischt, um die Wirkung von Trypsinversen zu stoppen. Die Zell/Trypsin/SBTI-Suspension wurde aus den Flaschen entfernt und gleichmäßig auf sterile, konische Zentrifugierröhren aufgeteilt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei ungefähr 800 – 1000 × g über einen Zeitraum von 5 Minuten gesammelt. Die Zellen wurden im Wachstumsmedium resuspendiert, um ein Einimpfen in der oben genannten Dichte durchzuführen. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit frischem Wachstumsmedium versorgt. Am darauffolgenden Tag wurden die Zellen wie oben geerntet und auf eine Dichte von 1,5 × 10⁶ Zellen/ml in Wachstumsmedium verdünnt, das 10 % Neugeborenen-Kalbserum (NBCS) mit 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) enthielt (Sigma, St. Louis, MO). Danach wurden die Zellen 1 ml/Kryophiole bei ungefähr –80 °C gefroren.
Die Erzeugung der collagenen Matrix für dieses Beispiel erfolgt mit Hilfe desselben Verfahrens wie in Beispiel 1 und 3, wobei die humanen neonatalen Vorhautfibroblasten mit humanen neonatalen Vorhautfibroblasten ersetzt werden, die transformiert wurden, um hohe Werte von Plättchen-abgeleitetem-Wachstumsfaktor (PDGF), wie oben beschrieben, zu erhalten. Es wurden Proben genommen, um eine H&E-Färbung durchzuführen, wie oben beschrieben, und zwar am Tag 18 nach dem Einimpfen. Die Proben wurden auch mit Hilfe der Avidin-Biotin-Verfahren im Hinblick auf die Gegenwart von Fibronectin, angeführt in Beispiel 10, gefärbt. Am Tag 18 nach dem Einimpfen wurden Proben für H&E-Färbung genommen, wie in Beispiel 1 beschrieben, und diese wiesen eine ähnliche grobe Erscheinung der Zell-Matrix auf wie jene, die in Beispiel 1 beschrieben wird, mit einer gemessenen Dicke von 123,6 Mikron (N=1). Der PDGF-Ausstoß der transfizierten Zellen in dem Zell-Matrix-Konstrukt lag bei 100ng/mL, gemessen mittels ELISA, über die gesamte Dauer der Kultur (18 Tagen), während ein Kontroll-Ausstoß von PDGF nicht erfassbar war.
Beispiel 7: Verwendung des dermalen Konstruktes als ein Transplantationsmaterial
Es wurden Zell-Matrix-Konstrukte gemäß den in Beispiel 1 genannten Verfahren mit Hilfe von humanen dermalen Fibroblasten hergestellt, die von neonataler Vorhaut gewonnen wurden, und wurden auf Vollexzisionswunden transplantiert, die auf nackten athymischen Mäusen geschaffen wurden. Die Mäuse erhielten die Transplantation gemäß den Verfahren, die von Parenteau, et al. (1996), beschrieben werden, deren Offenbarung hiermit hierin aufgenommen wird. Die Transplantationen wurden an den Tagen 14, 28 und 56 auf Anzeichen von Haftung auf dem Wundbett, Anzeichen von Wundkontraktion, Bereiche von Transplantatverlust und Vorliegen von Vaskularisierung (Farbe) überprüft. Die Transplantationsbereiche wurden fotografiert, während sie auf den Mäusen intakt waren. Zu jedem Zeitpunkt wurde eine Anzahl von Mäusen geopfert, und die Transplantationsflächen und ihre Umgebungen wurden entlang mit einem Umgebungsrand von Mäusehaut auf mindestens den Panniculus carnosus exzidiert. Die Verbindungsstellen zwischen Transplantat und der Mäusehaut wurden bei jeder Probe aufbewahrt. Die explantierten Gewebeproben wurden danach in phosphatgepuffertem 10% Formalin fixiert, und es erfolgte eine Fixation in Methanol. Die formalinfixierten Proben wurden einer H&E-Färbung gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unterzogen. Die Transplantate waren in der Lage, sich mit der Mäusehaut zu integrieren, wobei minimale Kontraktion festgestellt wurde. Innerhalb von 14 Tagen nach der Transplantation war die Mäuseepidermis vollständig über das Transplantat migriert. Mit Hilfe der H&E-gefärbten Proben waren Gefäße innerhalb des Transplantats nach 14 Tagen und das gesamte Experiment hindurch sichtbar. Durch grobe Beobachtung und mit Hilfe von H&E-gefärbten Proben wurde über die gesamte Dauer des Experiments hindurch bestimmt, dass das Transplantat weiter bestand und gesund aussehend blieb, lebende Zellen, keine großen Matrixanomalien usw., enthielt
Beispiel 8: Verwendung von Hautkonstrukt voller Dicke als Hauttransplantat
Zweischichtige Hautkonstrukte wurden gemäß Beispiel 2 hergestellt, und zwar mit Hilfe von humanen dermalen Fibroblasten, die aus neonataler Vorhaut in der dermalen Schicht gewonnen wurde, und humanen Keratinocyten, die aus einer anderen neonatalen Vorhaut in der epidermalen Schicht gewonnen wurde. Die Hautkonstrukte konnten manuell von der Membran abgezogen, ohne Trägerstütze gehandhabt und auf die Transplantationsstelle platziert werden. Die zweischichtigen Hautkonstrukte wurden auf Wunden mit voller Exzision transplantiert, wobei diese auf athymischen nackten Mäusen gemäß den Verfahren geschaffen wurden, die von Parenteau, et al. (1996) beschrieben werden, deren Offenbarung hiermit hierin aufgenommen wird. Die Proben wurden an den Tagen 7, 14, 28, 56 und 184 nach der Transplantation entnommen. Die Transplantationsbereiche wurden fotografiert, solange sie auf den Mäusen intakt waren. Eine Anzahl von Mäusen wurde zu jedem der Zeitpunkte geopfert, und die Transplantationsbereiche und deren Umgebungen wurden entlang mit einem umgebenden Rand der Mäusehaut auf mindestens den Panniculus Carnosus exzidiert. Die Verbindungsstellen zwischen dem Transplantat und der Mäusehaut wurden bei jeder Probe aufbewahrt. Die explantierten Gewebeproben wurden danach in phosphatgepuffertem 10 % Formalin fixiert und es erfolgte eine Fixierung in Methanol. Die formalinfixierten Proben wurden gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren für H&E-Färbung verarbeitet.
Die Transplantate integrierten sich in das Wirtsgewebe innerhalb von 7 Tagen, nachgewiesen durch grobe Beobachtung und histologische Erscheinung. Durch H&E-Färbung wurden Gefäße visualisiert, welche in das Transplantat von dem Wirtsgewebe innerhalb von 7 Tagen nach der Transplantation wachsen. Die Transplantate blieben gesund und hielten das ganze Experiment hindurch aus, wobei minimale Kontraktion festgestellt wurde. Die Verwendung von anti-humanem Involucrin, welches die Persistenz von humanen epidermalen Zellen färbt, wurde für die gesamte Transplantationsperiode gezeigt.
Beispiel 9: In-Vitro-Bildung einer Matrix durch humane korneale Keratocyten
Humane korneale Keratocytenzellen (erhalten von Organogenesis, Inc. Canton, MA) wurden bei der Herstellung eines stromalen Kornea-Konstruktes verwendet. Konfluente Kulturen von humanen Keratocyten wurden aus ihren Kultursubstraten mit Hilfe von Trypsinversen freigesetzt. Nach der Freisetzung, wurde ein Sojabohnentrypsin-Inhibitor verwendet, um das Trypsinversen zu neutralisieren, die Zellsuspension wurde zentrifugiert, die Überstandsflüssigkeit entsorgt und die Zellen wurden dann in Basismedium auf eine Konzentration von 3 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden auf gewebekulturbehandelte Transwells, 0,4 Mikron Porengröße, 24 mm Durchmesser, in einer Schale mit sechs Vertiefungen mit einer Dichte von 3,0 × 10⁶ Zellen/TW (6,6 × 10⁵ Zellen/cm²) beimpft. Diese Kulturen wurden über Nacht in einem Impfungsmedium behalten. Das Impfungsmedium bestand aus: einer Basismischung 3:1 von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) und Hams F-12 Medium (Quality Biologics Gaithersburg, MD Kat.), 4 mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) und Zusatzstoffen: 5 ng/ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma St. Louis, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, ST. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO) und 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company Milwaukee, WI). Danach wurden die Kulturen mit frischem Herstellungsmedium gefüttert. Das Herstellungsmedium bestand aus: einem 3:1-Basisgemisch aus DMEM, Hams F-12 Medium (Quality Biologics Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) und Zusatzstoffen: 5 ng/ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 2 % Neugeborenen-Kalbserum (Hyclone, Logan, Utah), 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY ACS-Grad), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO) und 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), 50 ng/ml L-Ascorbinsäure (WAKO Pure Chemical Company), 0,2 μg/ml L-Prolin (Sigma, St. Louis, MO), 0,1 μg/ml Glycin (Sigma, St. Louis, MO) und 0,05 % Polyethylenglykol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO, Zellkulturgrad).
Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 ± 1 °C mit einer Atmosphäre von 10 % ± 1 % CO₂ und über einen Zeitraum von 20 Tagen (insgesamt 21 Tage in Kultur) alle 2 bis 3 Tage mit frischem Herstellungsmedium versorgt. Nach 21 Tagen in Kultur, hatten die Keratocyten eine Matrixschicht von ungefähr 40 Mikron Dicke abgeschieden, wie durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren beschrieben. Endogen hergestelltes fibrilläres Collagen, Decorin und Glycosaminoglycan waren auch in dem Zell-Matrix-Konstrukt vorhanden.
Beispiel 10: In-Vitro-Bildung einer collagenen Matrix durch humane neonatale
Vorhautfibroblasten, eingeimpft in Herstellungsmedium Humane neonatale Vorhautfibroblasten (erhalten von Organogenesis, Inc. Canton, MA) wurden bei 1 × 10⁵ Zellen/0,4 Mikron Porengröße, 24 mm Durchmesser, gewebekulturbehandelten Trägern in einer Schale mit sechs Vertiefungen (TRANSWELL^®, Costar Corp. Cambridge, MA) beimpft und in Wachstumsmedium gezüchtet. Das Wachstumsmedium bestand aus: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Formulierung mit hohem Glukosegehalt, ohne L-Glutamin, BioWhittaker, Walkersville, MD), ergänzt durch 10 % Neugeborenen-Kalbserum (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) und 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD). Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 ± 1 °C mit einer Atmosphäre von 10 ± 1 % CO₂ gehalten. Das Medium wurde alle zwei bis drei Tage ausgetauscht. Nach 9 Tagen in Kultur wurde das Medium aus der Kulturschale abgesaugt und mit Herstellungsmedium ersetzt. Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 ± 1 °C mit einer Atmosphäre von 10 ± 1 % CO₂ gehalten und über einen Zeitraum von 21 Tagen alle 2 bis 3 Tage mit frischem Herstellungsmedium versorgt. Das Herstellungsmedium bestand aus einem 3:1-Basisgemisch von DMEM, Hams F-12 Medium (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) und Zusatzstoffen: 5 ng/ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 2 % Neugeborenen-Kalbserum (Hyclone, Logan, Utah), 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY, ACS-Grad), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO) und 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), 50 ng/ml L-Ascorbinsäure (WAKO Pure Chemical Company), 0,2 μg/ml L-Prolin (Sigma, St. Louis, MO), 0,1 μg/ml Glycin (Sigma, St. Louis, MO) und 0,05 % Polyethylenglykol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO, Zellkulturgrad).
Am Tag 21 wurden Proben genommen und in Formalin fixiert, danach in Paraffin eingebettet. Die formalinfixierten Proben wurden in Paraffin eingebettet, und 5 Mikrometerabschnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) gemäß auf dem Fachgebiet routinemäßig verwendeten Verfahren gefärbt. Mit Hilfe von H&E-gefärbten Objektträgern wurden Messungen bei zehn zufällig ausgewählten mikroskopischen Feldern mit 10 X Augenstück (Olympus America Inc., Melville, NY), geladen mit einem 10 mm/100 Mikrometer-Retikel (Olympus America Inc., Melville, NY), durchgeführt. Die Konstrukte, die mit Hilfe dieses Verfahrens erzeugt wurden, sind von ihrer Struktur und biochemischen Zusammensetzung jenen ähnlich, die in Beispiel 1 erzeugt wurden, und weisen eine gemessene Dicke von 82,00 ± 7,64 Mikron auf.
Beispiel 11: In-Vitro-Bildung einer collagenen Matrix durch Schweinedermalfibroblasten
Schweine-Dermalfibroblasten (erhalten von Organogenesis, Inc., Canton, MA) wurden mit 5 ± 10⁵ Zellen/162 cm² gewebekulturbehandelter Flasche (Costar Corp., Cambridge, MA, Kat.Nr. 3150) beimpft und in Wachstumsmedium, wie unten beschrieben, gezüchtet. Das Wachstumsmedium bestand aus: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Formulierung mit hohem Glukosegehalt, ohne L-Glutamin, BioWhittaker, Walkersville, MD), ergänzt durch 10 % fötales Kalbserum (HyClone Laboratories, Inc. Logan, Utah) und 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD). Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 ± 1 °C mit einer Atmosphäre von 10 % ± 1 % CO₂ gehalten. Das Medium wurde alle zwei bis drei Tage ausgetauscht. Nach der Konfluenz, das heißt, nachdem die Zellen eine gepackte Schicht auf dem Boden der Gewebekulturflasche gebildet hatten, wurde das Medium aus der Kulturschale abgesaugt. Um die Monoschicht zu spülen, wurde sterilfiltrierte phosphatgepufferte Kochsalzung zur Monoschicht hinzugefügt und danach aus der Schale abgesaugt. Die Zellen wurden aus der Flasche durch Zugabe von 5 ml Trypsinversenglutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD) zu jeder Flasche freigesetzt, und es wurde ein sanftes Schütteln durchgeführt, um eine vollständige Abdeckung der Monoschicht zu erreichen. Die Kulturen wurden zum Inkubator zurückgeführt. Sobald die Zellen freigesetzt worden waren, wurden 5 mL SBTI (Sojabohnentrypsin-Inhibitor) jeder Flasche hinzugefügt und mit der Zell-Suspension gemischt, um die Wirkung von Trypsinversen zu stoppen. Die Suspension wurde aus den Flaschen entfernt und gleichmäßig auf sterile, konische Zentrifugationsröhren aufgeteilt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei ungefähr 800 – 1000 × g über einen Zeitraum von 5 Minuten gesammelt. Die Zellen wurden resuspendiert und auf eine Konzentration von 3 × 10⁶ Zellen/ml verdünnt und auf gewebekulturbehandelte Transwells, 0,4 Mikron Porengröße, 24 mm Durchmesser, in einer Schale mit sechs Vertiefungen bei einer Dichte von 3,0 × 10⁶ Zellen/TW (6,6 ± 10⁵ Zellen/cm²) beimpft. Die Zellen wurden über Nacht in einem Impfungsmedium gehalten. Das Impfungsmedium bestand aus: einem 3:1 Basisgemisch aus DMEM, Hams F-12 Medium (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) und Zusatzstoffen: 5 ng/ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma St. Louis, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY ACS-Grad), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO) und 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), 50 ng/ml L-Ascorbinsäure (WAKO Pure Chemical Company), 0,2 μg/ml L-Prolin (Sigma, St. Louis, MO) und 0,1 μg/ml Glycin (Sigma, St. Louis, MO). Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 ± 1 °C mit einer Atmosphäre von 10 ± 1 % CO₂ gehalten und über einen Zeitraum von 7 Tagen alle 2 bis 3 Tage mit frischem Herstellungsmedium versorgt. Das Herstellungsmedium bestand aus: einem 3:1 Basisgemisch aus DMEM, Hams F-12 Medium (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAX-1^TM (Gibco BRL, Grand Island, NY) und Zusatzstoffen: 5 ng/ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 2 % Neugeborenen-Kalbserum (Hyclone, Logan, Utah), 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma St. Louis, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY, ACS-Grad), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO) und 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), 50 ng/ml L-Ascorbinsäure (WAKO Pure Chemical Company), 0,2 μg/ml L-Prolin (Sigma, St. Louis, MO), 0,1 μg/ml Glycin (Sigma, St. Louis, MO) und 0,05 % Polyethylenglykol (PEG)-Zellkulturgrad (Sigma, St. Louis, MO). Nach 7 Tagen wurde das Medium durch ein Herstellungsmedium ohne Neugeborenen-Kalbserum ersetzt. Dieses Medium wurde frisch den Zellen zugeführt, alle zwei bis drei Tage, über einen Zeitraum von weiteren 20 Tagen, insgesamt über 28 Tage in Kultur.
Am Tag 21 wurden Proben entnommen und in Formalin fixiert, danach in Paraffin eingebettet. Die formalinfixierten Proben wurden in Paraffin eingebettet und es wurden 5 Mikrometerabschnitte mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) gemäß für gewöhnlich auf dem Fachgebiet verwendeten Verfahren gefärbt. Mit Hilfe von H&E-gefärbten Objektträgern wurden Messungen an zehn zufällig ausgewählten mikroskopischen Feldern mit einem 10X Augenstück (Olympus America Inc., Melville, NY) durchgeführt, geladen mit einem 10 mm/100 Mikrometer-Retikel (Olympus America Inc., Melville, NY). Die Probe wies eine Struktur auf, die aus Zellen und einer Matrix mit einer gemessenen Dicke von 71,20 ± 9,57 Mikron bestand. Abgesehen von endogen erzeugtem fibrillärem Collagen, waren in dem Zell-Matrix-Konstrukt auch Decorin und Glycosaminoglycan vorhanden.
Beispiel 12: In-Vitro-Bildung eines zweischichtigen Hautkonstruktes, das Zellen dermaler Papilla enthält
Eine Zell-Matrix wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1 mit Hilfe von humanen neonatalen Vorhautfibroblasten als ein erster matrixerzeugender Zelltyp hergestellt. Die Zell-Matrix wurde lokal mit Punkten dermaler Papillazellen als zweite Zellpopulation beimpft, welche wiederum mit Keratinocyten als dritte Zellpopulation beimpft wurde, um eine kontinuierliche epidermale Schicht über die Zell-Matrix und die dermalen Papillazellen zu bilden.
Zuerst wurde ein Zell-Matrix-Konstrukt mit Hilfe von humanen dermalen Fibroblasten (HDF), gewonnen aus neonataler Vorhaut, gebildet. Die HDF-Kultivierung wurde im Maßstab vergrößert, indem sie beimpft wurden mit 5 × 10⁵ Zellen/162 cm² gewebekulturbehandelten Flaschen (Costar Corp., Cambridge, MA) in Wachstumsmedium, bestehend aus: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Formulierung mit hohem Glukosegehalt, ohne L-Glutamin, BioWhittaker, Walkersville, MD), ergänzt mit 10 % Neugeborenem-Kalbserum (NBCS) (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) und 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD). Sobald sie konfluent waren, wurden die HDF aus der Platte unter Verwendung von Trypsinversen freigesetzt und mit frischem Medium auf eine Konzentration von 3,0 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und auf gewebekulturbehandelte Einlagen (TRANSWELL^®, Corning Costar), 0,4 Mikron Porengröße, 24 mm Durchmesser, in einer Schale mit sechs Vertiefungen mit einer Dichte von 3,0 × 10⁶ Zellen/Einlage (6,6 × 10⁵ Zellen/cm²) beimpft. Die HDF-Kulturen wurden in einem Inkubator bei 37 + 1 °C bei einer Atmosphäre von 10 × 1 % CO₂ gehalten, und mit frischem Herstellungsmedium alle 2 bis 3 Tage versorgt, über einen Zeitraum von 23 Tagen gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren.
Nach dem sich das Zell-Matrix-Konstrukt gebildet hatte, wurde es mit Punkten von dermalen Papillae-Zellen als zweite Zellpopulation beimpft. Die dermalen Papillazellen sind eine diskrete Population von speziellen Fibroblasten, umgeben von dem Haarkolben von Haarfollikeln, um eine unterstützende Rolle beim Haarwachstum zu spielen. Dermale Papillae kann durch Mikrodissektieren der Haarfollikel und Kultivieren in vitro mit Hilfe des Verfahrens isoliert werden, das zuvor von Messenger, A. G. beschrieben wurde, The Culture of Dermal Papilla Cells from Human Hair Follicles, Br. J. Dermatol. 110:685-9 (1984), wobei dieses Verfahren hiermit hierin aufgenommen wird. Wenn eine Kultur von dermalen Papillazellen Konfluenz erreicht, bildet sie Aggregate, die auf Kulturflaschen wieder ausplattiert werden können, um neue Aggregate auszubilden. Dermale Papillae wurden aus einer Hautbiopsie isoliert, die von einem 4 Wochen alten Schwein erhalten worden war. Zellen aus der dermalen Papilla (PDP) wurden seriell in DMEM kultiviert, das 20 % NBCS bis Durchgang 8 enthält. Nach drei Wochen in Kultur, haben die PDP-Zellen die dermalen papillaähnlichen Strukturen neu gebildet, oder Aggregate, welche jeweils einen Durchmesser von ungefähr zwischen 90 bis 210 Mikron aufwiesen. Die Aggregate wurden dann aus der Kulturplatte durch vigoröses Pipettieren des Mediums gegen sie entfernt und dann auf die humane collagene Matrix mit einer Dichte von 200 Aggregaten pro cm² beimpft. Die Aggregate wurden weitere 15 Tage in DMEM 20 % NBCS untergetaucht kultiviert, wobei verbrauchtes Medium alle zwei bis drei Tage durch frisches Medium ersetzt wurde.
Die Zell-Matrix-Kulturen, welche dermale Papillazellen darauf enthielten, wurden mit Keratinocyten beimpft und kultiviert, um eine kontinuierliche epidermale Schicht über der Zell-Matrix und der dermalen Papillae zu bilden. Zwei verschiedene Konstrukte wurden hergestellt: Das erste mit humanen Keratinocyten, das zweite mit Schweine-Keratinocyten. Die normalen epidermalen Keratinocyten wurden von der humanen neonatalen Vorhaut (HEP) oder von Schweine-Keratinocyten (PEP) isoliert, unter Verwendung von Explantat-Auswuchs, um primäre Kulturen herzustellen. Diese Zellen wurden dann kultiviert und bis Durchgang 3 für den Schweinestamm oder bis Durchgang 4 für den humanen Stamm ausgeweitet. Nach ungefähr 5 bis 6 Tagen in Kultur wurden die Zellen dann aus den Kulturschalen mit Hilfe von Trypsinversen freigesetzt, gepoolt, zentrifugiert, um ein Zellpellet zu bilden, in Epidermalisierungsmedium resuspendiert, gezählt und auf die Membran in einer Dichte von 4,5 × 10⁴ Zellen/cm² für HEP-Zellen oder 1,6 × 10⁵ Zellen/cm² für PEP-Zellen beimpft. Die epidermalisierten Kulturen wurden 12 Tage lang so wie zuvor in Beispiel 2 beschrieben kultiviert.
Die endgültigen Proben wurden zur Hämatoxylin- und Eosin-Verarbeitung für
Lichtmikroskopie vorgelegt. Die resultierenden Hautkonstrukte wiesen eine grundlegende morphologische Organisation auf, die der Haut ähnlich ist: eine dermale Schicht, die aus Fibroblasten besteht, umgeben von endogen hergestellter Matrix, einschließlich endogen hergestellten fibrillären Collagens, Decorins und Glycosaminoglycans, lokalisierte Bereiche von dermalen Papillazellen und eine kontinuierliche, geschichtete Schicht von Keratinocyten durch das Zell-Matrix-Konstrukt und die dermale Papillae hindurch. In beiden Gewebekonstrukten, überzogen mit entweder humanen oder Schweinekeratinocyten, behielt die dermale Papilla eine gepackte Struktur, welche kleine wellenartige Unebenheiten des darüber gelegten Epithels induzierte. Differenzierte Epithelzellen sind oft nahe den dermalen Papillazellen vorhanden.
Beispiel 13: Hyaluronsäuremessung durch Sandwich-ELISA
Hyaluronsäure (HA) wurde in Zell-Matrix-Konstrukten gemessen, die durch dermale Fibroblasten in serumhaltigem Medium und chemisch definiertem Medium gemäß den Verfahren von Beispiel 1 bzw. Beispiel 3 gebildet werden.
Die Zell-Matrix-Konstrukte wurden auf kreisförmigen Trägern mit einem Durchmesser von 75 mm gebildet, die eine poröse Membran enthalten (TRANSWELL^®, Corning Costar). Extrakte aus den Zell-Matrix-Konstrukten wurden durch Zugabe von 10 mL Ammoniumacetatpuffer und 0,5 mg/mL Proteinase K in ein Teströhrchen zubereitet, welches ein Zell-Matrix-Konstrukt enthielt. Die Mischung wurde über Nacht bei 60 °C inkubiert. Nach Abschluß des Aufschlusses wurde die Mischung zentrifugiert und der Überstandsextrakt zu einer getrennten Röhre für die Durchführung des Hyaluronsäuretests transferiert. Eine Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit 50 μL von 20 μg/mL HA bindendem Protein in 0,1 M NaHCO₃-Lösung beschichtet und über Nacht bei 4 °C gelagert. Die Platte wurde danach drei Mal mit 0,85 % NaCl gewaschen, die 0,05 % Tween 20 enthält. Jeder Vertiefung wurden dann 250 μL Blockierlösung (Natriumphosphatpuffer, 10 mmol, pH = 7,4, der 3 % BSA und 0,9 % NaCL, PBS + 3 % BSA) enthält, hinzugefügt, und die Platte wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dann drei Mal mit 0,85 % NaCl, die 0,05 % Tween 20 enthält, gewaschen. Der Platte wurden im Anschluss daran 50 μL Standard HA-Lösungen und Extrakte aus beiden experimentellen Bedingungen hinzugefügt, einschließlich verschiedener Verdünnungen dieser Bedingungen. Die Platte wurde bei Raumtemperatur (ungefähr 20 °C) zwei Stunden lang inkubiert. Danach wurde die Platte drei Mal mit 0,85 % NaCl, die 0,05 % Tween 20 enthält, gewaschen, und jeder Vertiefung wurden 50 μL biotinylierte HA (1:2000 Verdünnung) hinzugefügt, und dann zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde im Anschluss daran drei Mal mit 0,85 % NaCl, die 0,05 % Tween 20 enthält, gewaschen, und dann wurden zu jeder Vertiefung 50 μL HRP-Avidin D (1:3000 Verdünnung) hinzugefügt. Danach wurde die Platte 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Platte drei Mal mit 0,85 % NaCl, die 0,05 % Tween 20 enthält, gewaschen, und jeder Vertiefung wurden 100 μL Orthophenylendiaminsubstratlösung zugegeben. Die Platte wurde zehn Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μL 1M HCl gestoppt. Schließlich wurde mit Hilfe eines Plattenlesers die Absorption bei 492 nm abgelesen und aufgezeichnet.
Die Absorptionsmessungen wurden gemittelt und in Mengenmaße konvertiert. Die kreisförmigen Zell-Matrix-Konstrukte (75 mm Durchmesser), die in einem serumhaltigen Medium ausgebildet wurden, wurden so bestimmt, dass sie jeweils ungefähr 200 μg Hyaluronsäure enthielten, während jene, die in chemisch definiertem Medium ausgebildet wurden, jeweils ungefähr 1,5 mg Hyaluronsäure enthielten.
Beispiel 14: Physikalisches Testen und mechanische Eigenschaften des erzeugten Zell-Matrix-Konstruktes
Die mechanischen Eigenschaften der Gewebekonstrukte von Beispiel 1 (Zell-Matrix-Konstrukt), Beispiel 2 (Zell-Matrix-Konstrukt mit einer Keratinocytenschicht darauf) und Beispiel 3 (Zell-Matrix-Konstrukt, das in definiertem Medium ausgebildet ist), wurden durch Membraninflationstests quantifiziert. Diese Tests sind klinisch verwendeten Tests ähnlich (z. B. Dermaflex^®, Cyberderm Inc., Media, PA und Cutameter^®, Courage Khazaka, Köln, Deutschland), wobei jedoch höhere Drucke daran beteiligt sind, einschließlich solcher, die in der Lage sind, die Membran zum Bersten zu bringen. Das Proben-Zell-Matrix-Konstrukt wurde flach auf einen Polycarbonatblock gelegt, der über einer zylinderförmigen Vertiefung, Durchmesser 10 mm, gefüllt mit normotone Kochsalzlösung zentriert war. Eine Metallplatte mit einer kreisförmigen Öffnung, welche dem Durchmesser der zylinderförmigen Vertiefung entspricht, wurde über die Probe gelegt und an den Block geklemmt. Die Proben wurden danach aufgeblasen, indem zusätzliche Kochsalzlösung mittels einer Spritzenpumpe in die Vertiefung eingeführt wurde. Der resultierende Druck wurde mit einem Druckwandler gemessen. Das Unter-Druck-Setzen wurde bis zum Geräteversagen, der Berststärke, ausgeführt, die im Durchschnitt bei 439,02 mm Hg für das Zell-Matrix-Konstrukt lag, das durch das Verfahren von Beispiel 1 erzeugt worden war; 998,52 mm Hg für die Proben des Zell-Matrix-Konstruktes mit einer Keratinocytenschicht, erzeugt durch das Verfahren von Beispiel 2, und 1542,26 mm Hg für die Proben des Zell-Matrix-Konstruktes, das in definiertem Medium ausgebildet wurde, erzeugt gemäß dem Verfahren von Beispiel 3.
Um den Wärmeschmelzpunkt der dermalen Matrix zu bestimmen wurden Proben (Zell-Matrix-Konstrukt), die am Tag 21 entnommen worden waren, mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens zubereitet. Die Probendenaturierungstemperatur wurde durch Analyse mit einem Mettler Toledo (Highston, NJ) Differentialscanningcalorimeter (DSC-Produkt Nr. DSC12E) bestimmt. Für unsere Zwecke wurde die Schmelztemperatur durch Erwärmen der Probe von 45 und 80 °C mit einer Rate von 1 °C/Minute bestimmt. Die durchschnittliche Denaturierungstemperatur für die Proben liegt bei 60,8 ± 1,2 °C (n=3).
Die Nahtretention und Zugfestigkeit der epidermalisierten Matrix, die mit Hilfe der Verfahren aus Beispiel 1 (Zell-Matrix-Konstrukt) und Beispiel 3 (Zell-Matrix-Konstrukt, gebildet in definiertem Medium), erzeugt wurde, wurden gemessen, um die Nähbarkeit des Konstruktes in bestimmten klinischen Situationen zu messen. Die Nahtretentionsfestigkeit der 21 Tage alten humanen dermalen Matrix wurde mit Hilfe eines Verfahrens bestimmt, das in American National Standards Publication for Vascular Graft Prosthesis (Instruments, 1986) beschrieben wird, unter Verwendung eines Mini-Bionex 858 Testsystems (MTS Systems Corporation, Minneapolis, Minn.).
Für die Proben aus Beispiel 1 (Zell-Matrix-Konstrukt) wurde die Zugfestigkeit mit 365 N/m bestimmt; für Proben, die gemäß Beispiel 2 hergestellt wurden (Zell-Matrix-Konstrukt mit einer Keratinocytenschicht), lag die Zugfestigkeit bei 2720 N/m.
Die Nahtretentionsfestigkeit für Proben, die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurden, lag bei 0,14 N; für jene, die gemäß Beispiel 2 hergestellt wurden, bei 0,22 N.
Die Konstrukte, die gemäß Beispiel 1, 2 und 3 hergestellt wurden, wurden sowohl mit einem 24 mm großen als auch einem 75 mm großen Durchmesser ausgeführt. Die Konstrukte, die durch die Kultiviertechniken aller 3 Methoden hergestellt werden, sind kohäsive gewebeähnliche Strukturen, die leicht von der Membran mit minimaler Kraftaufwendung abgezogen werden können, sie sind somit „abziehbar" und können physisch und zur Verwendung und zum Testen gehandhabt werden, ohne dass es zu einer Beschädigung kommt.
Beispiel 15: In-Vitro-Bildung einer collagenen Matrix durch humane neonatale Vorhautfibroblasten in chemisch definiertem Medium
Humane neonatale Vorhautfibroblasten wurden ausgeweitet, unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens. Danach wurden die Zellen auf eine Konzentration von 3 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und auf gewebekulturbehandelte Membraneinlagen, 0,4 Mikron Porengröße, 24 mm Durchmesser, in einer Schale mit sechs Vertiefungen mit einer Dichte von 3,0 × 10⁶ Zellen/TW (6,6 × 10⁵ Zellen/cm²) beimpft. Die Zellen in diesem Beispiel wurden durchgehend in chemisch definiertem Medium kultiviert.
Das Medium enthielt: ein 3:1 Basisgemisch aus DMEM, Hams F-12 Medium (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) und Zusatzstoffen: 5 ng/ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (Upstate Biotechnolgoy, Lake Placid, NY), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY, Kat. Nr. 02400 ACS-Grad), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO) und 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 50 ng/ml L-Ascorbinsäure (WAKO Chemicals USA, Inc.), 0,2 μg/ml L-Prolin (Sigma, St. Louis, MO), 0,1 μg/ml Glycin (Sigma, St. Louis, MO).
Dem Basismedium von oben wurden unter diesen getrennten Bedingungen andere Komponenten hinzugefügt:

1. 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO), 0,05 % Polyethylenglykol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO).
2. 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO).
3. 375 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 6 μg/ml Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO).

Die Proben wurden formalinfixiert und für Hämatoxylin- und Eosin-Färbung für die Lichtmikroskopanalyse verarbeitet. Visuelle histologische Evaluierungen zeigten, dass die Bedingung 2, ohne PEG, eine vergleichbar ähnliche Matrix wie Bedingung 1, die PEG enthielt, aufwies. Eine biochemische Analyse, welche den Collagengehalt des Konstruktes misst, zeigt beinahe dieselbe Menge an Collagen in beiden: 168,7 ± 7,98 μg/cm² für Bedingung 1 mit PEG, im Vergleich zu 170,88 ± 9,07 μg/cm² für Bedingung 2 ohne PEG. Bedingung 3 enthielt hohe Spiegel an Insulin und Hydrocortison und zeigte eine höhere Matrixexpression, einschließlich Collagen, zu einem Zeitpunkt, der früher eintrat als der bei den anderen zwei Bedingungen. Abgesehen von endogen erzeugtem fibrillärem Collagen, waren auch Decorin und Glycosaminoglycan in den Zell-Matrix-Konstrukten, unter allen Bedingungen, enthalten. Das kultivierte dermale Konstrukt, das durch das Verfahren von Bedingung 2 dieses Beispiels gebildet wurde, wird in 2 dargestellt. In 2 wird eine Mikroaufnahme eines fixierten, paraffineingebetteten, Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Abschnitts eines Zell-Matrix-Konstruktes gezeigt, das aus kultivierten humanen dermalen Fibroblasten in chemisch definiertem Medium nach 21 Tagen ausgebildet wird. Die poröse Membran erscheint als ein dünnes durchsichtiges Band unterhalb des Konstruktes, und es ist zu sehen, dass die Zellen auf der Oberfläche der Membran wachsen und die Membran nicht integrierend mit der Matrix umhüllen.
3 zeigt die Transmissionselektronenmikroskop (TEM)-Bilder von zwei Vergrößerungen des kultivierten dermalen Konstruktes, das durch das Verfahren von Bedingung 2 dieses Beispiels nach 21 Tagen gebildet wird. 3A ist eine 7600X Vergrößerung, welche die Anordnung von endogenen Collagenfasern zwischen den Fibroblasten zeigt. 3B ist eine 19000X Vergrößerung von vollständig gebildeten endogenen Collagenfasern, welche fibrille Anordnung und Packung zeigen.
In allen Bedingungen dieses Beispiels enthalten die kultivierten dermalen Konstrukte, die sich ausgebildet haben, dermale Fibroblasten und eine endogen erzeugte Matrix. Alle weisen vollständig ausgebildete Collagenfibrillen in gepackter Organisation, zwischen den Zellen angeordnet, auf. Ihre faserige Qualität, Dicke und kohäsive Integrität verleihen dem Konstrukt beträchtliche Festigkeit und ermöglichen diesem, abziehbar von der Kulturmembran entfernt und gehandhabt zu werden, wenn es auf einen Patienten transferiert wird, der mit dem Konstrukt behandelt werden soll, beispielsweise im Fall eines Transplantats oder eines Implantats.
Beispiel 16: Hautkonstrukt mit voller Dicke
Unter Verwendung eines 21 Tage alten dermalen Konstruktes, gebildet durch humane dermale Fibroblasten unter chemisch definierten Bedingungen gemäß dem Verfahren von Bedingung 2 (ohne PEG), beschrieben in Beispiel 15 oben, wurden normale humane neonatale Vorhautepidermalkeratinocyten auf die Oberfläche des Zell-Matrix-Konstruktes beimpft, um die epidermale Schicht des Hautkonstruktes zu bilden.
Das Medium wurde aseptisch aus der Kultureinlage und seiner Umgebung entfernt. Normale humane epidermale Keratinocyten-Kultivierung wurde auf 4 Durchgänge von gefrorenem Subkulturzell-Vorrat zu Konfluenz im Maßstabvergrößert. Danach wurden die Zellen aus den Kulturschalen mit Hilfe von Trypsinversen freigesetzt, gepoolt und zentrifugiert, um ein Zellpellet zu bilden, in Epidermalisierungsmedium resuspendiert, gezählt und auf die Membran mit einer Dichte von 4,5 × 10⁴ Zellen/cm² geimpft. Die Konstrukte wurden danach 90 Minuten lang bei 37 ± 1 °C, 10 % CO₂, inkubiert, um den Keratinocyten zu ermöglichen, sich anzuheften. Nach dem Inkubieren wurden die Konstrukte in Epidermalisierungsmedium untergetaucht. Das Epidermalisierungsmedium besteht aus einem 3:1-Basisgemisch aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (ohne Glukose und ohne Kalzium, BioWhittaker, Walkersville, MD) und Hams F-12 Medium (Quality Biologics Gaithersburg, MD), ergänzt mit 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma St. Louis, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO), 6,78 ng/ml Selen (Aldrich), 24,4 μg/ml Adenin (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD), 50 μg/ml L-Ascorbatnatriumsalz (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company, Milwaukee, WI), 16 μM Linolsäure (Sigma, St. Louis, MO), 1 μM Tocopherolacetat (Sigma, St. Louis, MO) und 50 μg/ml Gentamicinsulfat (Amersham, Arlington Heights, IL). Die Konstrukte wurden in dem Epidermalisierungsmedium zwei Tage lang bei 37 ± 1 °C, 10 ± 1 % CO₂, kultiviert.
Nach zwei Tagen wurde das Medium durch frisches Medium, zusammengesetzt wie oben, ersetzt und für zwei Tage zum Inkubator zurückgeführt, der auf 37 ± 1 °C, 10 ± 1 %, CO₂ eingestellt war. Nach den zwei Tagen wurde der Träger, welcher das Konstrukt enthält, aseptisch zu neuen Kultivierungsschalen mit einer ausreichenden Menge an Medium transferiert, um einen Fluidspiegel bis knapp an die Oberfläche der Trägermembran zu erzielen, um das sich entwickelnde Konstrukt an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle zu halten. Die Luft, welche die Oberfläche der sich bildenden epidermalen Schicht berührt, ermöglicht eine Schichtung der Epithelschicht. Die Konstrukte wurden bei 37 ± 1 °C, 10 % CO₂, und geringer Feuchtigkeit, im Medium inkubiert, wobei über einen Zeitraum von 7 Tagen das Medium alle 2 bis 3 Tage gewechselt wurde. Das Medium bestand aus: einem 1:1-Gemisch aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (ohne Glukose und ohne Kalzium, BioWhittaker, Walkersville, MD), Hams F-12 Medium (Quality Biologics, Gaithersburg, MD), ergänzt durch 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO), 5 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY), 5 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO), 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), 24,4 μg/ml Adenin (Sigma Aldrich Fine Chemicals Company), 4 mM L-Glutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD), 2,65 μg/ml Kalziumchlorid (Mallinckrodt, Chesterfield, MO), 16 μM Linolsäure (Sigma, St. Louis, MO), 1 μM Tocopherolacetat (Sigma, St. Louis, MO), 1,25 mM Serin (Sigma, St. Louis, MO), 0,64 mM Cholinchlorid (Sigma, St. Louis, MO) und 50 μg/ml Gentamicinsulfat (Amersham, Arlington Heights, IL). Die Kulturen wurden über einen Zeitraum von 14 Tagen alle 2 bis 3 Tage gefüttert.
Proben wurden in dreifacher Ausführung an den Tagen 10, 12 und 14, nachdem das Konstrukt an die Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle angehoben worden war, für die Hämatoxylin- und Eosin-Verarbeitung, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, vorgelegt, um die grobe Erscheinung unter Lichtmikroskopie zu bestimmen. Das resultierende Konstrukt war ein zweischichtiges Hautkonstrukt, bestehend aus einer unteren dermalen Schicht, bestehend aus dermalen Fibroblasten, umgeben von einer Matrix, die durch eine obere epidermale Schicht von geschichteten und differenzierten Keratinocyten überzogen ist. Das zweischichtige Hautkonstrukt dieses Beispiels wird in 4 dargestellt. 4 ist eine Mikroaufnahme eines fixierten, paraffineingebetteten, Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Abschnitts eines kultivierten Hautkonstruktes, ausgebildet in chemisch definiertem Medium in Abwesenheit von exogenen Matrixkomponenten, weisen ein Zell-Matrix-Konstrukt, ausgebildet aus kultivierten humanen dermalen Fibroblasten in chemisch definiertem Medium mit einer mehrlagigen, differenzierten Epidermis, ausgebildet aus kultivierten humanen Keratinocyten in chemisch definiertem Medium auf.
Beispiel 17: Bildung einer collagenen Matrix durch humane bukkale Fibroblasten
Der Zweck dieses Experimentes liegt darin, ein Zell-Matrix-Konstrukt aus bukkalen Fibroblasten herzustellen, die aus humanem Wangengewebe isoliert wurden. Die bukkalen Fibroblasten wurden in T-150 Flaschen in DMEM, das 10 % NBCS-Medium enthielt, kultiviert. Nach sieben Tagen wurden, um die Anzahl der Zellen weiter zu steigern, die Bukkalzellen geerntet und in neun T-150-Flaschen mit 4,0 × 10⁶ Zellen in DMEM befördert, das 10% NBCS-Medium enthielt, und bis zur Konfluenz kultiviert, wobei bei Erreichen der Konfluenz die Zellen geerntet wurden.
Um die Zellen zu ernten, wurde das Medium aus den Kulturflaschen abgesaugt. Um die Monoschicht zu spülen, wurde sterilfiltrierte phosphatgepufferte Kochsalzlösung dem Boden jeder Kulturflasche zugeführt und danach aus den Flaschen abgesaugt. Die Zellen wurden aus der Flasche durch Zugabe von 5 mL Trypsinversenglutamin (BioWhittaker, Walkersville, MD) zu jeder Flasche und sanftes Schütteln freigesetzt, um eine vollständige Abdeckung der Monoschicht zu gewährleisten. Die Kulturen wurden in den Inkubator zurückgeführt. Sobald die Zellen freigesetzt worden waren, wurden 5 ml SBTI (Sojabohnentrypsin-Inhibitor) zu jeder Flasche hinzugefügt und mit der Suspension vermischt, um die Aktion von Trypsinversen zu stoppen. Die Zellsuspension wurde aus den Flaschen entfernt und gleichmäßig auf sterile, konische Zentrifugalröhrchen aufgeteilt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei ungefähr 800 – 1000 × g über einen Zeitraum von 5 Minuten gesammelt.
Die Zellen wurden unter Verwendung von frischem Medium auf eine Konzentration von 3,0 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und auf gewebekulturbehandelte Einlagen (TRANSWELL^®, Corning Costar) mit 0,4 Mikron Porengröße, 24 mm Durchmesser, in einer Schale mit sechs Vertiefungen mit einer Dichte von 3,0 × 10⁶ Zellen/Einlage (6,6 × 10⁵ Zellen/cm²) beimpft. Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 ± 1 °C bei einer Atmosphäre von 10 ±1 % CO₂ gehalten und mit einem Medium versorgt, das Folgendes enthielt: eine 3:1 Basismischung aus DMEM und Hams F-12 Medium (Quality Biologics Gaithersburg, MD), 4 mM GlutaMAX (Gibco BRL, Grand Island, NY) und Zusatzstoffe: 5 ng/ml humanen rekombinanten epdiermalen Wachstumsfaktor (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 0,4 μg/ml Hydrocortison (Sigma St. Louis, MO), 1 × 10^–4 M Ethanolamin (Fluka, Ronkonkoma, NY, Kat. Nr. 02400, ACS-Grad), 1 × 10^–4 M o-Phosphorylethanolamin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 5 μg/ml Transferrin (Sigma, St. Louis, MO), 20 pM Triiodothyronin (Sigma, St. Louis, MO) und 6,78 ng/ml Selen (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), 50 ng/ml L-Ascorbinsäure (WAKO Chemicals USA, Inc.), 0,2 μg/ml L-Prolin (Sigma, St. Louis, MO), 0,1 μg/ml Glycin (Sigma, St. Louis, MO) und 0,05 % Polyethylenglykol (PEG) (Sigma, St. Louis, MO).
Einen Tag nach dem Impfen wurde das Medium durch serumfreies Herstellungsmedium ersetzt, das über einen Zeitraum von 21 Tagen alle zwei bis drei Tage ausgetauscht wurde. Am Tag 21 wurden die Proben in Formalin zu Zwecken der Histologie fixiert. Drei Proben wurden für eine Protein- und Collagenherstellungsanalyse verwendet.
Die Collagenherstellung für Konstrukte mit einem Durchmesser von 24 mm lag im Durchschnitt bei 519 μg pro Konstrukt nach 21 Tagen in Kultur. Die Gesamtproteinproduktion für Konstrukte mit einem Durchmesser von 24 mm lag im Durchschnitt bei 210 μg pro Konstrukt nach 21 Tagen in Kultur. Morphologisch zeigte das bukkale Fibroblast-Zell-Matrix-Konstrukt, ein kultiviertes Gewebekonstrukt aus oralem Bindgewebe, bukkale Fibroblasten, die von Matrix umgeben waren, während das Konstrukt physisch eine physische Masse und physische Integrität aufwies.
Obwohl die vorstehende Erfindung in einigen Details zum Zwecke der Klarheit und des besseren Verständnisses durch Darstellungen und Beispiele beschrieben wurde, wird Fachleuten klar sein, dass bestimmte Änderungen und Modifizierungen im Rahmen des Schutzumfanges der beiliegenden Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

Kultiviertes Hautkonstrukt mit mindestens zwei Schichten, das Folgendes aufweist: (a) eine erste Schicht kultivierter dermaler Fibroblastzellen, die unter Bedingungen zur Herstellung einer Schicht extrazellulärer Matrix kultiviert wurden, die durch die kultivierten Fibroblastzellen synthetisch hergestellt und zusammengefügt wird, wobei die kultivierten Fibroblastzellen in der synthetisch hergestellten extrazellulären Matrixschicht enthalten sind, wobei die extrazelluläre Matrix Folgendes aufweist: (i) Collagen vom Typ I und Typ III, welches einen Packungsaufbau von Fibrillen und Fibrillbündeln mit einem viertelversetzten 67 nm Bandenmuster aufweist; (ii) Decorin; (iii) Fibronectin; (iv) Tenascin und (v) Glycosaminoglycane; wobei die extrazelluläre Matrix durch die kultivierten dermalen Fibroblastzellen in Abwesenheit von exogenen Matrixkomponenten oder synthetischen Elementen während der Kultivierungsbedingungen erzeugt wird; und (b) eine zweite Schicht von Keratinocytenzellen, die auf der ersten Schicht angeordnet sind, um eine epidermale Zellschicht zu bilden, wobei die epidermale Zellschicht mehrschichtig, mehrlagig, differenziert ist und eine basale Schicht, eine suprabasale Schicht, eine granulare Schicht und ein Stratum Corneum aufweist; und wobei das zweischichtige kultivierte Hautkonstrukt eine Basalmembran an der Verbindungsstellt zwischen erster und zweiter Schicht aufweist.
Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die kultivierten Fibroblastzellen genetisch verändert sind, um extrazelluläre Matrixkomponenten zu erzeugen.
Konstrukt nach Anspruch 2, wobei die kultivierten Fibroblastzellen genetisch verändert sind, um einen Wachstumsfaktor, ein Hormon, Peptid oder Protein zu erzeugen.
Verfahren zur Herstellung eines zweischichtigen Hautkonstruktes, das eine dermale Schicht und eine epidermale Schicht, die darauf in Abwesenheit eines strukturellen Stützgerüsts oder exogener Matrixkomponenten angeordnet ist, aufweist, wobei das Verfahren folgende Schritte enthält: (a) Einimpfen von Fibroblastzellen auf poröser Membran in einem Kulturgefäß in einem ersten chemisch definierten Zellkulturmedium mit einer Dichte zwischen ungefähr 1 × 10⁵ Zellen/cm2 bis ungefähr 6,6 × 10⁵ Zellen/cm²; (b) Kultivieren der Fibroblastzellen von Schritt (a) in dem ersten chemisch definierten Zellkulturmedium auf eine Konfluenz zwischen ungefähr 80% bis ungefähr 100%; (c) Stimulieren der Fibroblastzellen von Schritt (a), um extrazelluläre Matrixkomponenten durch Kultivieren der Zellen in einem zweiten chemisch definierten Kulturmedium synthetisch herzustellen, abzusondern und zu organisieren; (d) fortgeführtes Kultivieren der Fibroblastzellen, bis die Zellen eine Schicht aus synthetisch hergestellter extrazellulärer Matrix mit einer Dicke von mindestens ungefähr 30 Mikron bilden, wobei die kultivierten Fibroblastzellen innerhalb der synthetisch hergestellten extrazellulären Matrixschicht enthalten sind, wobei die extrazelluläre Matrix Folgendes aufweist: (i) Collagen vom Typ I und Typ III, das einen Packungsaufbau von Fibrillen und Fibrillbündeln mit einem viertelversetzten 67 nm Bandenmuster aufweist; (ii) Decorin; (iii) Tenascin und (iv) Glycosaminoglycane; wobei die extrazelluläre Matrix durch die kultivierten dermalen Fibroblastzellen in Abwesenheit von exogenen Matrixkomponenten oder synthetischen Elementen während der Kultivierungsbedingungen erzeugt wird; (e) Einimpfen von Keratinocytenzellen auf die Oberfläche der synthetisch hergestellten extrazellulären Matrix von Schritt (d) und (f) Kultivieren der Keratinocytenzellen unter Kultivierungsbedingungen, um eine epidermale Schicht zu bilden, wobei die epidermale Zellschicht eine mehrlagige, geschichtete, differenzierte Schicht von Keratinocyten ist, welche eine basale Schicht, eine suprabasale Schicht, eine granulare Schicht und ein Stratum Corneum aufweisen;
Kultiviertes Gewebekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung bei der Transplantation oder Implantation von kultiviertem Gewebe.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Konstrukt kohäsiv ist und eine physikalische einstückige Integrität und gewebeähnliche Handhabungseigenschaft aufweist.