KR20140072883A - 시험관내 연구 용도를 위한 조작된 조직, 이의 어레이 및 이의 제조방법 - Google Patents

시험관내 연구 용도를 위한 조작된 조직, 이의 어레이 및 이의 제조방법 Download PDF

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쉬라그 카티왈라
스콧 도프만
벤자민 셰퍼드
샤론 프레스넬
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오가노보, 인크.
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Abstract

본원에는 시험관내 과학적 및 의학적 연구를 위한 살아있는 3차원 조직 구조물, 이의 어레이, 및 상기 조직 및 어레이를 제조하는 방법이 개시되어 있다.

Description

시험관내 연구 용도를 위한 조작된 조직, 이의 어레이 및 이의 제조방법 {ENGINEERED TISSUES FOR IN VITRO RESEARCH USES, ARRAYS THEREOF, AND METHODS OF MAKING THE SAME}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2011년 9월 12일자로 출원된 미국 특허출원번호 제61/533,757호, 2011년 9월 12일자로 출원된 미국 특허출원번호 제61/533,753호 및 2011년 9월 12일자로 출원된 미국 특허출원번호 제61/533,761호의 이익을 청구하고, 이들 모두는 전체가 본원에서 참조로서 도입된다.
신규한 약제학적 화합물의 연구 및 개발 비용은 대략 18억 달러이다[참조: Paul, et al. (2010). How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nature Reviews Drug Discovery 9(3):203-14]. 약물 개발은 약물을 발견 및/또는 설계하는 공정이다. 약물 발견의 공정은 일반적으로 후보물질의 확인, 합성, 특성화, 스크리닝 및 치료학적 효과에 대한 분석 단계를 적어도 포함한다. 기술 발전 및 생물학적 시스템의 이해에도 불구하고, 약물 발견은 낮은 속도의 신규 치료학적 발견과 더불어 여전히 시간이 걸리고 비용이 들고 비효율적인 공정이다.
지속불가능한 R&D 비용을 발생시키지 않고서, 혁신적으로 비용-절약적인 신규 의약의 수 및 품질을 실질적으로 향상시키는 물질, 도구 및 기술이 요구되고 있다. 따라서, 본 발명자들은, 조직 및 기관 공학, 시험관내 분석, 약물 발견 및 기타 분야에서 유용성을 갖는, 조작된 포유동물 조직 및 혈관벽 구역, 이의 어레이 및 이들의 제조방법을 본원에서 기재한다.
한 가지 측면에서, 본원에는, 적어도 하나의 부착 세포형을 포함하는 살아있는 3차원 조직 구조물로서, 상기 적어도 하나의 부착 세포형은 응집 및 융합되어 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하고, 상기 조직 구조물은, 혈관 튜브가 아닌 다층 구조를 갖고 시험관내에서 사용하기 위한 것이며, 단, 상기 조직 구조물 중의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있는, 살아있는 3차원 조직 구조물이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 조직 구조물은 바이오인쇄시 또는 사용시에 어떠한 사전-형성된 골격을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조직 구조물은 복수의 세포형을 포함하는 적어도 하나의 층을 포함하고, 상기 세포형은 서로에 대해 공간적으로 배열되어 평면 기하 형상을 형성한다. 일부 실시양태에서, 조직 구조물은 복수의 층을 포함하고, 적어도 하나의 층은 적어도 하나의 다른 층과는 조성적 또는 구조적으로 상이하여 층 기하 형상을 형성한다. 일부 실시양태에서, 조직 구조물은 비-부착 세포형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직 구조물은 생체적합성 표면에 고정되어 있다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 다공성 막이다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 생체적합성 하이드로겔, 단백질, 화학물질, 펩티드, 항체 또는 성장 인자 중의 하나 이상으로 피복되어 있다. 여전히 추가의 실시양태에서, 조직 구조물은 하나 이상의 측면에, 유체 유동에 의해 유발된, 전단력을 받는다. 일부 실시양태에서, 조직 구조물은 바이오인쇄시에 이의 최소 직경이 적어도 약 25㎛이다. 일부 실시양태에서, 조직 구조물은 바이오인쇄시에 이의 최대 직경이 약 3cm 이하이다. 일부 실시양태에서, 조직 구조물은 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 조직 구조물은 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 부착 세포는 분화 세포이다. 일부 실시양태에서, 부착 세포는 비-분화 세포이다. 일부 실시양태에서, 부착 세포는 간장, 위장관, 췌장, 신장, 폐, 기관, 혈관, 골격근, 심장, 피부, 평활근, 결합 조직, 각막, 비뇨생식기, 유방, 생식기, 내피, 상피, 섬유아세포, 신경, 슈완, 지방, 골, 골수, 연골, 주피세포, 중피, 내분비, 간질, 림프, 혈액, 내배엽, 외배엽 및 중배엽으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 조직 구조물은 혈관벽 구역이다.
또 다른 측면에서, 본원에는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이로서, 각각의 조직 구조물은 적어도 하나의 부착 세포형을 포함하고, 상기 적어도 하나의 부착 세포형은 응집 및 융합되어 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하고, 상기 각각의 조직 구조물은 다층 구조를 갖고 시험관내에서 사용하기 위한 것이며, 단, 상기 각각의 조직 구조물 중의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이가 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 조직 구조물은 바이오인쇄시 또는 사용시에 어떠한 사전-형성된 골격을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 부착 세포는 간장 세포, 위장관 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 폐 세포, 기관 세포, 혈관 세포, 골격근 세포, 심장 세포, 피부 세포, 평활근 세포, 결합 조직 세포, 각막 세포, 비뇨생식기 세포, 유방 세포, 생식기 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유아세포, 신경 세포, 슈완 세포, 지방 세포, 골 세포, 골수 세포, 연골 세포, 주피세포, 중피 세포, 내분비 조직으로부터 유래하는 세포, 간질 세포, 림프 세포, 혈액 세포, 내배엽-유래 세포, 외배엽-유래 세포, 중배엽-유래 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 어레이 내의 각각의 조직 구조물은 실질적으로 유사하다. 다른 실시양태에서, 상기 어레이 내의 하나 이상의 조직 구조물은 독특하다. 일부 실시양태에서, 상기 어레이 내의 하나 이상의 개개 조직은 혈관 또는 림프관, 근육, 자궁, 신경, 점막, 중피, 대망, 각막, 피부, 간장, 신장, 심장, 기관, 폐, 골, 골수, 지방, 결합, 방광, 유방, 췌장, 비장, 뇌, 식도, 위, 창자, 결장, 직장, 난소암, 전립선암, 내분비 조직, 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인간 조직을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 각각의 조직 구조물은 생체적합성 다중-웰 용기의 웰에 존재한다. 추가의 실시양태에서, 웰은 생체적합성 하이드로겔, 단백질, 화학물질, 펩티드, 항체 또는 성장 인자 중의 하나 이상으로 피복되어 있다. 추가의 실시양태에서, 각각의 조직 구조물은 용기의 웰 내의 다공성 생체적합성 막 위에 배치되어 있다. 추가의 실시양태에서, 용기는 자동화 또는 반자동화 약물 스크리닝 공정과 호환성이 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 조직 구조물은 생체적합성 표면에 고정되어 있다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 다공성 막이다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 생체적합성 하이드로겔, 단백질, 화학물질, 펩티드, 항체 또는 성장 인자 중의 하나 이상으로 피복되어 있다. 추가의 실시양태에서, 각각의 조직 구조물은 하나 이상의 측면에, 유체 유동에 의해 유발된 전단력을 받는다. 일부 실시양태에서, 상기 어레이 내의 각각의 조직 구조물은 배양시에 독립적으로 유지된다. 다른 실시양태에서, 상기 어레이 내의 2개 이상의 개개 조직 구조물은 가용성 인자를 교환한다. 일부 실시양태에서, 상기 어레이는 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 어레이는 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 어레이 내의 적어도 하나의 조직은 혈관벽 구역이다.
또 다른 측면에서, 본원에는, 하나 이상의 층을 포함하는 살아있는 3차원 조직 구조물로서, 상기 각각의 층은 하나 이상의 세포형을 포함하고, 상기 하나 이상의 층은 응집되어 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하고, 상기 조직 구조물은 서로에 대해 공간적으로 배열되어 평면 기하 형상을 형성하는 복수의 세포형을 포함하는 적어도 하나의 층, 및 적어도 하나의 층이 적어도 하나의 다른 층과는 조성적 또는 구조적으로 상이하여 층 기하 형상을 형성하는 복수의 층 중의 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는, 살아있는 3차원 조직 구조물이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 조직 구조물의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있다. 추가의 실시양태에서, 조직 구조물은 바이오인쇄시 또는 사용시에 어떠한 사전-형성된 골격을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조직 구조물은 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 조직 구조물은 약물 시험에 사용하기 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본원에는, 적어도 하나의 부착 세포형을 포함하는 바이오-잉크를 소정 형태 내로 또는 위로 바이오인쇄하는 단계 및 바이오-잉크를 살아있는 3차원 조직 구조물 내로 융합하는 단계를 포함하고, 단, 상기 조직 구조물이 혈관 튜브가 아닌 시험관내 사용을 위한 것인, 살아있는 3차원 조직 구조물을 구축하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조직 구조물은 바이오인쇄시 또는 사용시에 어떠한 사전-형성된 골격을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 당해 형태는 바이오인쇄되어 있다. 추가의 실시양태에서, 당해 형태는 바이오-잉크로 실질적으로 동시에 바이오인쇄되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 당해 형태를 용해시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에는, 포유동물 세포를 포함하는 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계; 상기 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 지지체 위에 배치하여, 서로에 대해 공간적으로 배열되어 평면 기하 형상을 형성하는 복수의 세포형을 포함하는 적어도 하나의 층, 및 적어도 하나의 다른 층과는 조성적 또는 구조적으로 상이하여 층 기하 형상을 형성하는 복수의 층 중의 적어도 하나를 형성하는 단계; 상기 하나 이상의 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하는 단계를 포함하는, 살아있는 3차원 조직 구조물을 구축하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조직 구조물의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 조직 구조물은 바이오인쇄시 또는 사용시에 어떠한 사전-형성된 골격을 포함하지 않는다.
추가의 측면에서, 본원에는, 포유동물 세포를 포함하는 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계; 조직 어레이에 적합한 형태로 공간적으로 배열되어 있는 상기 응집된 다세포 응집체를 생체적합성 지지체 위에 배치하는 단계 및 상기 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이를 형성하는 단계를 포함하는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이를 구축하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 조직 구조물의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있다. 추가의 실시양태에서, 각각의 조직 구조물은 바이오인쇄시 또는 사용시에 어떠한 사전-형성된 골격을 실질적으로 포함하지 않는다.
본 발명의 신규한 특징들은 특히 첨부된 특허청구의 범위에 기재되어 있다. 본 발명의 특징들 및 이점들에 대한 보다 양호한 이해는, 본원 발명의 원리가 이용되는 예시적 실시양태들을 기술하는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조함으로써 얻어질 수 있다:
도 1은 원통형 형식으로 다형 SMC:EC 바이오-잉크로 구축된 바이오인쇄된 혈관벽 구역의 비제한적 예를 나타낸다. 다양한 염색 조건이 세포형의 분포 및 위치를 나타내기 위해 제시되어 있다.
도 2a는 85:15의 비율로 HASMC:HAEC의 다형 바이오-잉크 원통으로 구축된 바이오인쇄된 혈관벽 구역의 비제한적 예를 나타내는 거시적 이미지이다.
도 2b는 85:15의 비율로 HASMC:HAEC로 이루어진 바이오-잉크로 구축된 바이오인쇄된 혈관벽 구역의 비제한적 예를 나타낸다.
도 3은, 층 구조를 형성하는, EC 농축물로 이루어진 제2 층의 바이오인쇄에 의해 수반된 SMC-단독 바이오-잉크 원통으로 구축된 바이오인쇄된 혈관벽 구역의 비제한적 예를 나타낸다. 다양한 염색 조건이 세포형의 분포 및 위치를 나타내기 위해 제시되어 있다.
도 4a는, 인간 피부 섬유아세포(HDFa)의 제1 층의 상부에 바이오인쇄된 HASMC로 구축되고, 이어서 HAEC로 층상화되어 3층의 층 구조를 형성하는 바이오인쇄된 혈관벽 구역의 비제한적 예를 나타낸다.
도 4b는, 상부에 노보겔(NovoGelTM) 격자(예: 메쉬)의 제3 층의 부재하에, 공-프린트된 노보겔 봉입 윈도우 내에 바이오인쇄되고 HAEC로 층상화된 HASMC 바이오-잉크의 비제한적 예를 나타내는 거시적 이미지이다.
도 5는 바이오인쇄된 세포 시트 및 일시적 또는 제거가능한 바이오인쇄된 한정 격자 구조의 비제한적 예이고, 또한 이를 제조하는 예시적 단계가 제시되어 있다.
도 6은 조작된 간 조직, 이 경우에 수용성 압출 화합물(예: PF-127)에 캡슐화된 다중 간 세포형으로 구성된 바이오-잉크를 사용한 연속 침착 메카니즘을 사용하여 바이오인쇄된 다층 간 조직의 비제한적 예를 나타내는 거시적 이미지이다. (A) 바이오-잉크 및 네가티브 공간을 패턴화함으로써 형성된 평면 기하 형상을 강조하는 단일 기능 유닛의 개략도를 나타내고; (B)는 격자 바이오인쇄된 기능 유닛이고; (C) 및 (D)는 매질의 적용 및 압출 화합물의 용해 후의 구조물을 나타내고; 시간 경과에 따르는 평면 기하 형상의 체류에 주의한다.
도 7은, 격자 구조물에서 예시적 "스포크(spoke)"를 나타내는, 도 6의 H&E 염색된 격자 구조물의 현미경사진이다.
도 8은 층 기하 형상을 갖는 바이오인쇄된 신생조직의 비제한적 개략도(A), 거시적 사진(B), 및 일련의 현미경사진(C-E)이다.
도 9는 바이오인쇄된 조직에서 세포 패턴화 및 층상화를 나타내는 일련의 현미경사진(A-D)이다.
도 10은, 제조 단계(A-D)를 나타내는, 층 기하 형상을 갖는 바이오인쇄된 인간 폐 조직 구조물의 비제한적 개략도이다.
도 11은 바이오인쇄된 인간 폐 조직의 특성화를 나타내는 일련의 현미경사진(A-H)이다.
도 12는 바이오인쇄 직후(A) 및 배지에서 24시간 배양 후(B)에 바이오인쇄된 혈관벽 구역을 나타내는 한쌍의 거시적 사진이다.
도 13은 정적 및 유동 조건하에 다중-웰 세포 배양물 삽입체 위에 바이오인쇄된 층 구조를 갖는 다층 혈액 혈관벽 구역의 분석을 나타내는 일련의 현미경사진(A-F)이다.
도 14는 다중-웰 플레이트(A) 또는 다중-웰 세포 배양 삽입체(B) 내에서 바이오인쇄된 조직을 나타내는 한쌍의 비제한적 거시적 사진이다.
도 15는 TGF-β1을 사용한 바이오인쇄된 다층 혈액 혈관벽 구역의 자극을 나타내는 한쌍의 비제한적 현미경사진이다.
도 16은 TGF-β1을 사용한 간 성상 세포를 함유하는 바이오인쇄된 간 조직의 자극을 나타내는 일련의 현미경사진(A-H)이다.
도 17은 각각의 삼각형으로 세포 페이스의 바이오인쇄(A) 및 이어서 PF-127 경계의 용해를 사용한 PF-127의 패턴화된 6층 6각형의 연속 침착 바이오인쇄에 의해 형성된 공-성형된 기능성 간 조직 미세구조를 나타내는 한쌍의 거시적 사진이다.
도 18은 본원에 기재된 구축 방법과 호환성이 있고 천연 조직 구조 및 생물학의 구조적 또는 공간적 요소를 재현하는, 이의 조합(F)을 포함하는, 평면(A-C) 및 층(D-E) 기하 형상의 일련의 비제한적 예이다.
본 발명은 재생 의료 및 조직 및/또는 기관 조작 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 조작된 포유동물 조직의 어레이, 조작된 혈관벽 구역, 이의 어레이 및 제조방법에 관한 것이다.
본원에는, 특정한 실시양태에서, 적어도 하나의 부착 세포형을 포함하는 살아있는 3차원 조직 구조물로서, 상기 적어도 하나의 부착 세포형은 응집 및 융합되어 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하고, 상기 조직 구조물은, 혈관 튜브가 아닌 다층 구조를 갖고 시험관내에서 사용하기 위한 것이며, 단, 상기 조직 구조물 중의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있는, 살아있는 3차원 조직 구조물이 개시되어 있다.
또한, 본원에는, 특정한 실시양태에서, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이로서, 각각의 조직 구조물은 적어도 하나의 부착 세포형을 포함하고, 상기 적어도 하나의 부착 세포형은 응집 및 융합되어 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하고, 상기 각각의 조직 구조물은 다층 구조를 갖고 시험관내에서 사용하기 위한 것이며, 단, 상기 각각의 조직 구조물 중의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이가 개시되어 있다.
또한, 본원에는, 특정한 실시양태에서, 하나 이상의 층을 포함하는 살아있는 3차원 조직 구조물로서, 상기 각각의 층은 하나 이상의 세포형을 포함하고, 상기 하나 이상의 층은 응집되어 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하고, 상기 조직 구조물은 서로에 대해 공간적으로 배열되어 평면 기하 형상을 형성하는 복수의 세포형을 포함하는 적어도 하나의 층, 및 적어도 하나의 층이 적어도 하나의 다른 층과는 조성적 또는 구조적으로 상이하여 층 기하 형상을 형성하는 복수의 층 중의 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는, 살아있는 3차원 조직 구조물이 개시되어 있다.
또한, 본원에는, 특정한 실시양태에서, 적어도 하나의 부착 세포형을 포함하는 바이오-잉크를 소정 형태 내로 또는 위로 바이오인쇄하는 단계 및 바이오-잉크를 살아있는 3차원 조직 구조물 내로 융합하는 단계를 포함하고, 단, 상기 조직 구조물이 혈관 튜브가 아닌 시험관내 사용을 위한 것인, 살아있는 3차원 조직 구조물을 구축하는 방법이 개시되어 있다.
또한, 본원에는, 특정한 실시양태에서, 포유동물 세포를 포함하는 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계; 상기 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 지지체 위에 배치하여, 서로에 대해 공간적으로 배열되어 평면 기하 형상을 형성하는 복수의 세포형을 포함하는 적어도 하나의 층, 및 적어도 하나의 다른 층과는 조성적 또는 구조적으로 상이하여 층 기하 형상을 형성하는 복수의 층 중의 적어도 하나를 형성하는 단계; 상기 하나 이상의 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하는 단계를 포함하는, 살아있는 3차원 조직 구조물을 구축하는 방법이 개시되어 있다.
또한, 본원에는, 특정한 실시양태에서, 포유동물 세포를 포함하는 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계; 조직 어레이에 적합한 형태로 공간적으로 배열되어 있는 상기 응집된 다세포 응집체를 생체적합성 지지체 위에 배치하는 단계 및 상기 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이를 형성하는 단계를 포함하는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이를 구축하는 방법이 개시되어 있다.
특정한 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 과학 기술 용어들은 모두 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태, "하나(a, an)" 및 "상기(the)"는 문맥이 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "핵산"이라는 언급은 본원에 기재된 유형의 하나 이상의 핵산 및/또는 조성물을 포함하고, 이는 본 개시내용 등을 읽을 때에 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 본원에서의 "또는"이라는 임의의 언급은 달리 언급되지 않은 한 "및/또는"을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "어레이(array)"는 샘플에 대해 수행되는 복수의 시험, 복수의 샘플에 대해 수행되는 하나 이상의 시험 또는 이들 둘 다를 가능하게 하도록 공간적으로 배열된 복수 요소의 연관을 포함하는 과학적 도구를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "분석(assay)"은 유기 또는 생물학적 샘플(예: 세포 응집체, 조직, 기관, 생물 등)에서 물질(예: 화학물질, 분자, 생화학물질, 단백질, 호르몬 또는 약물 등)의 존재 또는 활성을 시험 또는 측정하는 절차를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "생체적합성"은 세포에 대한 손상 또는 독성의 제한된 위험을 갖는 것을 의미한다. 명세서 및 특허청구의 범위에 제시된 바와 같이, "생체적합성 다중-벽 용기" 및 "생체적합성 막"은 포유동물 세포의 손상 또는 독성의 제한된 위험을 갖지만, 당해 정의는 이들 생체적합성 요소가 포유동물의 생체내에서 이식할 수 있다는 것을 의미하도록 확장되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "바이오인쇄(bioprinting)"은 자동화 또는 반자동화, 컴퓨터 보조, 3차원 프로토타이핑 장치(예를 들면, 바이오프린터)와 호환성이 있는 방법을 통해 세포(예를 들면, 세포 용액, 세포 함유 겔, 세포 현탁액, 세포 농축물, 다세포 응집체, 다세포체 등)의 정확한 3차원 침착을 이용하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "혈관"은, 내강을 라이닝하는 평활근 세포-함유 벽 및 내피 세포를 갖고 100㎛ 초과의 내부 직경을 가지며, 비-혈관 조직을 포함하는 3차원 조직 구조물의 성분으로 존재하지 않는 단일 단순 또는 분지된 관상 구조를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "응집하다", "응집된" 및 "응집"은 세포, 세포 응집체, 다세포 응집체, 다세포체 및/또는 이의 층을 결합하는 세포-세포 부착 특성을 지칭한다. 상기 용어는 "융합하다", "융합된" 및 "융합"과 상호교대로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "층상"은, 2개 이상의 층이 조합되어 z-평면에서 조직의 전체 두께를 증가시키는, 다층 바이오인쇄된 조직을 의미한다. 일부 실시양태에서, 각각의 평면 층은 구조 및/또는 조성에 있어서 실질적으로 유사하다. 다른 실시양태에서, 각각의 평면 층은 구조 및/또는 조성에 있어서 실질적으로 상이하다[참조: 도 18A-F].
본원에 사용된 바와 같이, "다층"은, 각각의 조직 층이 두께에 있어서 하나 이상의 세포층인, 조직의 2개 이상의 층으로 이루어져 있는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 조직 층은 한번에 하나씩 침착된다. 다른 실시양태에서, 다층은 동시에 침착된다. 임의로, 각각의 층은 다중 세포형으로 구성된다. 추가로, 각각의 층 내의 다중 세포형은 x-y 평면(즉, 수평면)에서 공간-정의된 구조로 서로에 대해 임의로 배열되어 있다. 추가로, 일부 경우에, z-평면(즉, 수직 평면)에서 층의 부가는 공간-정의된 구조가 z-평면에서 연속되도록 서로에 대해 층 내의 세포의 조절된 공간 배치를 유발한다.
본원에 사용된 바와 같이, "평면"은 다중 바이오-잉크 조성물 및/또는 공극 공간이 조직 층의 x-y 평면 내에서 서로에 대해 정의된 패턴으로 공간적으로 배열되어 있는 다세포 바이오인쇄된 조직의 층을 의미한다[참조: 도 18A-F].
본원에 사용된 바와 같이, "골격(scaffold)"는 폴리머 골격 및 다공성 하이드로겔 등의 합성 골격, 사전-형성된 세포외 매트릭스 층, 사멸 세포 층 및 탈세포화 조직 등의 비-합성 골격, 및 조작된 조직 및/또는 기관의 물리적 구조로 통합되고 상기 조직 및/또는 기관의 손상/파괴 없이 조직 및/또는 기관으로부터 제거될 수 없는 임의의 다른 형태의 사전-형성된 골격을 지칭한다. 추가의 실시양태에서, 탈세포화 조직 골격은 임의의 방식으로 배양된 세포에 의해 형성된 탈세포화 천연 조직 또는 탈세포화 세포 물질; 예를 들면, 사멸이 가능하거나 탈세포화되어, 살아있는 동안에 이들이 생성한 ECM을 잔류시키는 세포 층을 포함한다. 따라서, 용어 "무골격(scaffoldless)"는 당해 골격이, 조작된 조직의 불활성 성분으로 제거되거나 잔류되는, 사용시에 조작된 조직의 완전한 구역이 아닌 것을 암시하는 것을 의도한다. "무골격"는 "골격-비함유" 및 "사전-형성된 골격을 비함유하는"과 상호교대로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "대상체"는 인간, 비-인간 동물, 임의의 포유동물 또는 임의의 척추동물인 임의의 개체를 의미한다. 당해 용어는 "환자", "수용체" 및 "공여자"와 상호교대로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "조직"은 세포의 응집체를 의미한다. 조직의 예는, 이로써 한정되지 않지만, 결합 조직(예: 소성 결합 조직, 조밀 결합 조직, 탄성 조직, 세망 결합 조직 및 지방 조직), 근육 조직(예: 골격근, 평활근 및 심근), 비뇨생식기 조직, 위장 조직, 폐 조직, 골 조직, 신경 조직 및 상피 조직(예: 단순 상피 및 중층 상피), 내배엽 유래 조직, 중배엽 유래 조직 및 외배엽 유래 조직을 포함한다.
조직 조작
조직 조작(tissue engineering)은 기관 또는 조직의 증강, 보수 또는 치환을 통해 조직 기능을 회복시키거나, 유지시키거나, 개선하는 생물학적 대체물의 개발에 대한 생명 과학 및 조작의 원칙을 적용하고 조합하는 범학문적 분야이다. 전통적인 조직 조작에 대한 기본적인 접근법은 생체적합성 및 결국 생분해성 환경(예를 들면, 골격)에 살아있는 세포를 접종하고, 이어서 이 구조물을 바이오반응기 내에서 배양하여 초기 세포 모집단을 추가로 확장하고 성숙시켜 이식시 표적 조직을 생성하는 것이다. 생물학적 세포외 매트릭스(ECM)를 모방하는 적절한 골격에 의해, 일부 경우에, 발생 조직은 실험실내 및 생체내 성숙 후 목적하는 기관의 형성 및 기능 둘 다를 채택할 수 있다. 그러나, 천연 조직 유사 구조를 갖는 충분히 높은 세포 밀도를 성취하는 것은 골격을 통한 세포의 공간 배치 및 분포를 조절하는 제한된 능력으로 인해 도전받는다. 이러한 제한은 종종 불량한 기계적 특성 및/또는 불충분한 기능을 갖는 조직 또는 기관을 발생시킬 수 있다. 골격의 생분해, 잔류 폴리머의 포획 및 제조 공정의 산업적 규모 확장과 관련하여 추가의 도전이 존재한다. 무골격 접근법이 시도되었다. 현재의 무골격 접근법은 일부 제한이 있다:
ㆍ 복잡한 평면 및/또는 층 기하 형상, 예를 들면, 다층 구조(여기서, 하나 이상의 층은 다른 층과는 조성적 및 구조적으로 상이하거나, 하나 이상의 층은 서로에 대해 공간적으로 정의된 위치에서 다중 세포형을 포함함)는 종종 천연 조직 유사 결과를 재현가능하게 달성하기 위해 특정한 구조 내에 세포형의 한정적 고해상도 배치를 필요로 한다.
ㆍ 스케일 및 기하 형상은 영양소 공급을 위한 기능적 혈관 네트워크에 대한 확산 및/또는 요건에 의해 제한된다.
ㆍ 조직의 생존력은, 일부 경우에, 확산을 제한하고 영양소에 대한 세포의 접근을 제한하는 구속 재료에 의해 손상된다.
본원에는, 특정한 실시양태에서, 조작된 포유동물 조직, 조작된 혈관벽 구역, 이의 어레이 및 제조방법이 개시되어 있다. 본원에 개시되어 있는 조직 조작 방법은 하기 이점을 갖는다:
ㆍ 이들은 세포 함유 조직 및/또는 기관을 생성할 수 있다.
ㆍ 이들은 천연 조직 유사 세포내 상호작용을 재생성함으로써 천연 조직의 발달, 항상성 및/또는 병리발생에서 발견되는 환경 조건을 모방한다.
ㆍ 이들은 복잡한 기하학 및 기하 형상의 광범위한 어레이(예를 들면, 다층 구조, 구역, 시트, 관, 주머니 등)를 갖는 살아있는 3차원 조직 및 화합물 조직을 임의로 달성한다.
ㆍ 이들은 자동화 또는 반자동화 제조 수단과 호환성이 있고 확장가능하다.
바이오인쇄는 시험관내 분석에 유용한 것을 포함하여 미세규모 조직 유사체를 생성하는 개선된 방법을 가능하게 한다(하기 참조).
바이오인쇄
특정한 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직 및 이의 어레이 중의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있다. 추가의 실시양태에서, 바이오인쇄된 구조물은, 3차원 전달 디바이스(예를 들면, 바이오프린터)에 의해 생체적합성 표면(예를 들면, 하이드로겔 및/또는 다공성 막으로 구성됨)에 세포 용액, 세포 현탁액, 세포 함유 겔 또는 페이스트, 세포 농축물, 다세포체(예를 들면, 원통형, 회전타원형, 리본형 등) 및 임의로 제한 재료를 포함하는 세포의 3차원, 자동화, 컴퓨터 보조 침착에 기반한 신속한 프로토타이핑 기술을 이용하는 방법으로 제조된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 일부 실시양태에서, 조직 및/또는 기관을 언급하기 위해 사용되는 용어 "조작된"은 컴퓨터 스크립트에 따라 컴퓨터 보조 디바이스(예를 들면, 바이오프린터)에 의해 3차원 구조를 형성하도록 세포, 세포 용액, 세포 현탁액, 세포 함유 겔 또는 페이스트, 세포 농축물, 다세포 응집체 및 이들의 층이 배치되는 것을 의미한다. 추가의 실시양태에서, 컴퓨터 스크립트는, 예를 들면, 하나 이상의 컴퓨터 프로그램, 컴퓨터 어플리케이션 또는 컴퓨터 모듈이다. 다른 추가의 실시양태에서, 3차원 조직 구조는, 일부 경우에, 초기 형태발생에서 자가 조립 현상과 유사한 세포 또는 다세포체의 인쇄후 융합을 통해 형성한다.
수동 배치를 포함하는 3차원 구조를 생성하기 위해 생체적합성 표면에 세포, 다세포 응집체 및/또는 이들의 층을 배열하는데 다수의 방법이 이용 가능하지만, 바이오프린터와 같은 자동화된 컴퓨터 보조 기계에 의한 위치결정이 유리하다. 이러한 기술에 의한 세포 또는 다세포체 전달의 이점은 다양한 조성을 갖는 세포, 다세포 응집체 및/또는 이들의 층의 계획된 또는 소정의 배향 또는 패턴을 나타내는 구조물을 제조하기 위한 세포 또는 다세포체의 신속하고, 정확하고, 재현가능한 배치를 포함한다. 이점은 또한 세포 손상의 최소화와 동시에 높은 세포 밀도의 보장을 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이오인쇄 방법은 연속식 및/또는 실질적으로 연속식이다. 연속식 바이오인쇄 방법의 비제한적 예는 바이오잉크의 저장소에 연결된 분배 팁(예를 들면, 시린지, 바늘, 모세관 등)을 통해 바이오프린터로부터 바이오잉크(세포, 부형제 또는 압출 화합물과 조합된 세포, 또는 세포의 응집체)를 분배하는 것이다. 추가의 비제한적 실시양태에서, 연속식 바이오인쇄 방법은 기능적 유닛의 반복 패턴으로 바이오잉크를 분배하는 것이다. 다양한 실시양태에서, 반복 기능적 유닛은, 예를 들면, 원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 다각형 및 불규칙형 기하 형상을 포함하는 임의의 적합한 기하 형상을 갖고, 이에 의해 독특한 바이오잉크의 공간적 패턴화를 통해 달성된 평면 기하 형상 및/또는 공극 공간을 갖는 하나 이상의 조직 층을 생성한다. 추가의 실시양태에서, 바이오인쇄된 기능적 유닛의 반복 패턴은 층을 포함하고, 복수의 층은 층 형성을 갖는 조작된 조직 또는 기관을 형성하기 위해 인접하게 바이오인쇄된다(예를 들면, 적층된다). 다양한 실시양태에서, 조작된 조직 또는 기관을 형성하기 위해 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 그 이상의 층이 인접하게 바이오인쇄된다(예를 들면, 적층된다). 추가의 실시양태에서, 층 기하 형상을 갖는 조직의 하나 이상의 층이 또한 평면 기하 형상을 갖는다.
일부 실시양태에서, 바이오인쇄된 기능적 유닛은 격자 패턴으로 반복된다. "격자 패턴"은 중첩되지 않고 갭이 없는 평면을 충전하는 기하 형상(figure)의 평면이다. 도 6A는 도 6B 내지 D 및 7에 도시된 격자 패턴을 생성하기 위해 임의로 반복되는 기능적 유닛의 예를 나타낸다. 연속식 및/또는 격자 바이오인쇄의 이점은, 비제한적 예로서, 바이오인쇄된 조직의 생성 증가를 포함한다. 다른 비제한적인 예시적 이점은 바이오프린터를 바이오잉크의 이전 침착된 요소와 배열할 필요성을 제거하는 것이다. 일부 실시양태에서, 연속식 바이오인쇄는, 임의로 시린지 메카니즘을 사용하여, 바이오잉크의 거대 저장소로부터 보다 큰 조직의 인쇄를 촉진한다. 연속식 바이오인쇄는 또한 인쇄후 이의 기하 형상을 유지할 수 있는 압출 화합물, 하이드로겔, 폴리머, 바이오잉크 또는 임의의 인쇄가능한 재료를 사용하여 공간-한정된 경계를 공동-인쇄하는 편리한 방법이고, 여기서 생성되는 경계는 하나 이상의 바이오잉크의 바이오인쇄를 통해 임의로 충전되어, 공간적으로 한정된 평면 기하 형상을 갖는 모자이크식 조직을 생성하며, 예를 들면, 도 17에 설명된 실시양태를 참조한다.
일부 실시양태에서, 연속식 바이오인쇄 방법은 독립적으로 또는 서로에 대해 프린트 높이, 펌프 속도, 로봇 속도 또는 이들의 조합과 같은 파라미터를 최적화하고/하거나 균형 맞추는 것을 포함한다. 한 가지 예에서, 침착을 위한 바이오프린터 헤드 속도는 3㎜/s이고, 제1 층의 경우에 분배 높이는 0.5㎜이고, 후속 층의 경우에 분배 높이는 0.4㎜ 증가한다. 일부 실시양태에서, 분배 높이는 바이오프린터 분배 팁의 직경과 대략 동일하다. 제한 없이, 적합한 및/또는 최적 분배 거리는 재료 편평화 또는 분배 바늘에 대한 부착을 발생시키지 않는다. 다양한 실시양태에서, 바이오프린터 분배 팁은 약 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000㎛ 또는 그 이상의 내경(이들 범위 내의 증분 포함)을 갖는다. 다양한 실시양태에서, 바이오프린터의 바이오잉크 저장소는 약 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 입방 센티미터 이상의 용적(이들 범위 내의 증분 포함)을 갖는다. 펌프 속도는, 일부 경우에, 시스템에서의 잔류 압력 상승이 낮을 때 적합하고/하거나 최적이다. 양호한 펌프 속도는, 일부 경우에, 분배 바늘과 저장소의 단면적 사이의 비에 의존할 수 있고, 보다 큰 비는 보다 낮은 펌프 속도를 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 적합한 및/또는 최적 프린트 속도는 재료의 기계적 완전성에 영향을 미치지 않고서 균일한 라인의 침착을 가능하게 한다.
본원에 개시되어 있는 본 발명은 비즈니스 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시되어 있는 기술 및 방법의 속도 및 확장성은 시험관내 분석 등의 연구 및 개발용 세포-기반 도구의 생성에서 이식 또는 사용하기 위해 조작된 조직 및/또는 기관의 제조를 위한 산업 및/또는 상업 시설을 설계하고, 구축하고, 조작하기 위해 이용된다. 추가의 실시양태에서, 조작된 조직 및/또는 기관 및 이의 어레이는, 예를 들면, 세포 어레이(예: 마이크로어레이 또는 칩), 조직 어레이(예: 마이크로어레이 또는 칩) 및 생물학적 분석 및 고출력 약물 스크리닝을 위한 키트로서 제조되고, 저장되고, 배포되고, 시판되고, 선전되고, 판매된다. 다른 실시양태에서, 조작된 조직 및/또는 기관 및 이의 어레이는 서비스로서 생물학적 분석 및/또는 약물 스크리닝을 수행하기 위해 생산 및 사용된다.
조작된 조직
본원에는, 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 부착 세포형을 포함하는 살아있는 3차원 조직 구조물이 개시되어 있고, 여기서 적어도 하나의 부착 세포형은 응집 및 융합되어 다층 구조를 갖는 조직 구조물을 형성한다. 추가의 실시양태에서, 조직 구조물의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있다. 일부 실시양태에서, 조직은 혈관벽 구역이다(참조: 실시예 16 및 도 12 및 13). 따라서, 본원에는, 일부 실시양태에서, 평활근 세포; 및 임의로 섬유아세포 및/또는 내피 세포를 포함하는 조작된 혈관벽 구역이고, 여기서 세포는 서로 응집되고, 혈관벽 구역은 바이오인쇄되고 비-관형이다. 다른 실시양태에서, 조직은 기도 유사체이다(참조: 실시예 15 및 도 10 및 11). 일부 실시양태에서, 기도 유사체는 폐 섬유아세포 및 임의로 평활근 세포 및/또는 내피 세포를 포함하고, 여기서 상기 조직의 적어도 하나의 표면은 소기도 상피 세포로 적층된다. 다른 실시양태에서, 조직은 간 유사체이다(참조: 실시예 13 및 19 및 도 6A 내지 6D, 7 및 17A-17B). 추가의 실시양태에서, 간 조직 유사체는 간세포 또는 간세포-유사 세포 및 임의로 담관 상피 세포 및 임의로, 이로써 한정되지 않지만, 성상 세포, 내피 세포, 쿠퍼(kupffer) 세포, 면역 세포 또는 근섬유아세포를 포함하는 비-실질 세포를 포함한다.
또한, 본원에는, 특정 실시양태에서, 응집된 포유동물 세포를 포함하고 포유동물 세포의 하나 이상의 층을 추가로 포함하는 조작된 조직이 개시되어 있고, 여기서 조직의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 조직 층은 평면 기하 형상을 특징으로 하고, 여기서 복수 세포형 또는 바이오-잉크 종류 및/또는 공극 공간은 x-y 평면 내의 공간 규정된 위치에 존재한다. 일부 실시양태에서, 조직은 다층이고, 여기서 적어도 하나의 층은 구조적 또는 조성적으로 다른 층과는 구별되어, 조직에 특징적 층 기하 형상을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 상기 층은 z-평면에서 유사한 두께이다. 추가의 실시양태에서, 상기 층은 z-평면에서 가변 두께의 것이다. 추가의 실시양태에서, 임의의 단일 층은 두께가 하나의 세포 층이다. 일부 실시양태에서, 조직은 혈관벽 구역이다. 따라서, 본원에는, 특정 실시양태에서, 응집된 평활근 세포, 및 하나 이상의 표면 위에 상피 세포의 층, 하나 이상의 표면 위에 섬유아세포의 층 또는 이들 둘 다를 포함하는 조작된 혈관벽 구역이 개시되어 있고, 여기서 상기 혈관벽 구역의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되고, 상기 혈관벽 구역은 비-관형이다. 다른 실시양태에서, 조직은 기도 유사체이다. 일부 실시양태에서, 기도 유사체는 폐 섬유아세포 및 임의로 평활근 세포 및/또는 내피 세포를 포함하고, 조직의 적어도 하나의 표면은 소기도 상피 세포로 적층되어 있다. 다른 실시양태에서, 조직은 간 유사체이다. 추가의 실시양태에서, 간 조직 유사체는, 간 세포 또는 간세포-유사 세포 및 임의로 담관 상피 세포 및 임의로, 이로써 한정되지 않지만, 성상 세포, 내피 세포, 쿠퍼 세포, 면역 세포 또는 근섬유아세포를 포함하는 비-실질 세포형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 본원에 기재된 방법으로 바이오인쇄된다. 추가의 실시양태에서, 조작된 조직의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄된다. 추가의 실시양태에서, 바이오인쇄된 성분은 응집된 평활근 세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 추가의 바이오인쇄된 층은 섬유아세포 및/또는 내피 세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 조직은 제조시 또는 사용시에 본원에서 추가로 기재된 바와 같은 어떠한 사전-형성된 골격을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 바이오인쇄를 포함하는 조직 조작 기술에 의해 제조되는 결과로서, 본 발명의 조직은 생물체의 일부로서 생체내에서 발달된 조직으로부터 추가로 구별된다. 일부 실시양태에서, 조작된 조직의 1개의 층은 섬유아세포, 평활근 세포, 근섬유아세포, 주피 세포 및 내피 세포 등의 각종 세포형을 포함하는 간질 조직으로 이루어진다. 추가의 실시양태에서, 간질 조직은 하나 이상의 표면 위에서, 일반적 또는 조직-특이적 내피 또는 상피 세포를 포함하는 제2 조직 유형으로 적층된다. 추가의 실시양태에서, 제2 조직 층은 연속적이고, 하부 간질 조직 층으로 분자의 통과를 위한 배리어로서 기능한다.
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 임의 유형의 포유동물 세포를 포함한다. 다양한 추가 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조직은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 세포형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직은 단지 평활근 세포만을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직은 평활근 세포 및 내피 세포를 포함한다. 실시예 3은 인간 대동맥 평활근 세포 및 인간 대동맥 내피 세포로 이루어진 다형 원통형 바이오-잉크의 제조를 입증하고, 실시예 4는 혈관벽 구역을 형성하기 위한 이러한 원통의 바이오인쇄 및 융합을 입증한다(참조: 도 1, 2a 및 2b). 실시예 7은 인간 지방흡입물의 간질 혈관 분획으로부터 배양한 평활근 세포 및 내피 세포로 이루어진 다형 원통형 바이오-잉크의 제조를 입증하고, 실시예 8은 혈관벽 구역을 형성하기 위해 이러한 원통의 바이오인쇄 및 융합을 입증한다. 다른 실시양태에서, 조직은 평활근 세포 및 섬유아세포를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조직은 평활근 세포, 내피 세포 및 섬유아세포를 포함한다. 실시예 5는 인간 대동맥 평활근 세포, 인간 피부 섬유아세포 및 인간 대동맥 내피 세포로 이루어진 다형 원통형 바이오-잉크의 제조를 입증하고, 실시예 6은 혈관벽 구역을 형성하기 위해 이러한 원통의 바이오인쇄 및 융합을 입증한다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직의 세포는 서로 "응집" 또는 "부착"되어 있다. 추가의 실시양태에서, 응집 또는 부착은 세포, 다세포 응집체, 다세포체 및/또는 이의 층들에 결합하는 특성을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 하나 이상의 표면 위에 하나 이상의 세포 층을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 세포 층은 응집된 평활근 세포의 하나 이상의 표면 상에 존재한다. 추가의 다양한 실시양태에서, 응집된 평활근 세포의 하나 이상의 표면 위에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 세포 층이 존재한다. 추가의 다양한 실시양태에서, 응집된 평활근 세포의 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 표면 위에는 적어도 하나의 세포 층이 존재하여, 조작된 조직에 평면 기하 형상을 생성한다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 층은 평면 기하 형상을 갖는 것을 특징으로 한다. 추가의 실시양태에서, 조작된 조직의 다층은 평면 기하 형상을 갖고, 여기서 평면 기하 형상은 층 사이에서 가변적이거나 동일하다. 추가의 실시양태에서, 개개 층에서 평면 기하 형상(x-y 평면)은 제조 동안 z-평면으로 배열되어, 추가의 기하 형상이 복합 조직에서 z-기하 형상에 생성된다(참조: 도 18D-F에 제시된 실시양태).
일부 실시양태에서, 조직 층은 단층의 세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 단층은 융합성이다. 다른 실시양태에서, 단층은 융합성이 아니다. 일부 실시양태에서, 세포 층은 하나 이상의 세포 시트를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 세포 시트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100㎛ 또는 그 이상의 세포 두께(이들 범위 내의 증분 포함)이다. 다른 다양한 실시양태에서, 세포 시트는 약 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500㎛ 또는 그 이상의 두께(이들 범위 내의 증분 포함)이다. 일부 실시양태에서, 조직 층은 세포의 융합된 응집체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 융합 전에, 세포의 응집체는, 비제한적 예로서, 소정 기하 형상 및/또는 구조를 갖고, 실질적으로 구형, 가늘고 긴 기하 형상, 실질적으로 원통형 및 리본-유사 기하 형상이다. 다양한 실시양태에서, 융합된 세포 응집체는 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500㎛ 또는 그 이상의 두께(이들 범위 내의 증분 포함)의 층을 형성한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 층은 임의 유형의 포유동물 세포를 포함한다. 다양한 추가 실시양태에서, 각각의 층은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 세포형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 하나 이상의 표면 위에 내피 세포의 하나 이상의 층을 포함한다. 실시예 9는, 원통형 평활근 세포 바이오-잉크를 포함하는 혈관 배지 조직의 층을 바이오인쇄한 다음, 혈액 혈관벽의 배지 및 내막을 반복하는 평면 기하 형상을 형성하기 위해 SMC 구조물 상에 세포 농축물을 직접 바이오인쇄함으로써 달성되는, 내피 세포의 제2 층을 상부 표면에 적용함으로써 혈관벽 구역의 구성을 입증한다. 실시예 10은 인간 대동맥 평활근 세포를 포함하는 원통형 바이오-잉크를 바이오인쇄한 다음, SMC 구조물 상에 내피 세포의 특이적으로 배치된 액적의 침착에 의해 달성되는, 내피 세포의 층을 상부 표면에 적용함으로써 혈관벽 세포의 구성을 입증한다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 하나 이상의 표면 위에 하나 이상의 섬유아세포 층을 포함한다.
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 하나 이상의 표면 위에 하나 이상의 내피 세포 층을 포함하고 하나 이상의 표면 위에 하나 이상의 섬유아세포 층을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 내피 세포 층은 하나 이상의 섬유아세포 층과 동일한 표면 위에 존재한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 내피 세포 층은 하나 이상의 섬유아세포 층을 갖는 표면과는 상이한 표면 위에 존재한다. 추가의 실시양태에서, 다층 구조 내의 하나 이상의 층은 평면 기하 형상을 갖는 것을 추가로 특징으로 한다.
실시예 11은 인간 대동맥 평활근 세포를 포함하는 원통형 바이오-잉크를 섬유아세포의 제1 층 위에 직접 바이오인쇄한 다음, 내피 세포를 포함하는 제3 층을 상부 표면에 적용하고, 이에 의해 각각의 층 내에 3층의 층 기하 형상을 생성함으로써 혈관벽 구역의 구성을 입증하고, 여기서 각각의 층은 조성이 상이하고 가변 두께 및 구조를 갖는다(참조: 도 12). 내피 세포의 층은 구조물 상에 내피 세포 현탁액의 특이적으로 배치된 액적의 침착에 의해 적용된다. 실시예 11의 공정은 응집된 평활근 세포, 평활근 세포의 1개 표면 위에 섬유아세포 세포 및 평활근 세포의 반대 표면 위에 섬유아세포 층을 포함하는 3층 조직을 생성한다. 각 층 내의 세포는 서로 응집되어 있고, 층 사이의 계면에 배치된 세포는 또한 응집되어 있으며, 이에 의해 세포 상호작용에 의해 개개 층을 함께 결합시킨다(참조: 도 4a 및 4b).
혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은, 다양한 실시양태에서, 임의의 적합한 크기이다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 바이오인쇄된 조직의 크기는 시간 경과에 따라 변화한다. 추가의 실시양태에서, 바이오인쇄된 조직은, 예를 들면, 세포 이동, 세포사, 세포간 상호작용, 수축 또는 기타 형태의 축소에 기인하여 바이오인쇄 후에 축소 또는 수축한다. 다른 실시양태에서, 바이오인쇄된 조직은, 예를 들면, 세포 이동, 세포 성장 및 증식, 세포외 매트릭스 또는 천연 조직의 기타 세포-생성된 성분의 생성, 세포/조직 성숙 또는 기타 형태의 확장에 기인하여 바이오인쇄 후에 성장 또는 팽창한다.
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직의 물리적 치수는, 구조물의 내부로 확산시키는, 산소를 포함하는 영양소의 능력에 의해 제한된다. 다양한 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 바이오인쇄시에 이의 최소 치수가 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000㎛이다. 다양한 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 바이오인쇄시에 이들의 최소 치수가 적어도 약 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.25, 2.5, 2.75, 3.0, 3.25, 3.5, 3.75, 4.0, 4.25, 4.5, 4.75 또는 5.0mm이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 바이오인쇄시에 이들의 최소 치수가 약 25㎛ 내지 약 500㎛이다. 또 다른 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 제조시에 최대 직경이 3cm 미만이다.
혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은, 다양한 실시양태에서, 임의의 적합한 기하 형상이다. 일부 실시양태에서, 기하 형상은 특정의 천연 조직 또는 기관을 모방하도록 선택된다. 추가의 실시양태에서, 기하 형상은 특정의 병상, 상태 또는 질환 상태를 모방하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 실질적으로 평면인 기하 형상을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 평면 조직은, 비제한적 예로서, 사각형, 직사각형, 다각형, 원형, 타원형 또는 불규칙형을 포함하는 임의의 적합한 평면 기하 형상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 평면 기하 형상은 특정 세포 또는 바이오-잉크 성분 및/또는 공극 공간을 서로에 대해 x-y 평면에 배치함으로써 조작된 조직에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 실질적으로 시트 또는 디스크 기하 형상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 혈관벽 구역은 비-관형 기하 형상을 갖고, 이는, 혈관의 튜브가 아닌, 혈관벽 구역, 패치 또는 시트이다.
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 밀폐 용기에 대해 조직의 공간적 위치를 고정시키기에 적합한 수단에 의해 밀폐 용기에 고정된다. 추가의 실시양태에서, 조작된 조직은 표면에 고정된다. 추가의 실시양태에서, 조직은 생체적합성 표면에 고정된다. 추가의 실시양태에서, 복수의 조직은 표면에 대한 고정에 의해 결합되고, 공간적으로 배열되어 본원에 기재된 바와 같은 어레이를 형성한다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 하나 이상의 측면에, 유체 유동에 의해 유발된 전단력이 제공된다. 전단력의 적용은 조직의 성숙 및 발달을 촉진시키고/시키거나 이동, 분화, 증식, 세포외 매트릭스의 침착, 또는 조직 내의 세포 내부 또는 외부로 단백질 또는 분자의 수송을 촉진시키도록 작용한다.
조직 기하 형상
천연 조직은 조직의 세포 및 세포외(즉, 공극 공간, 세포외 매트릭스, 단백질성 물질 등) 성분에 의해 유도된 공간적 및 조성적 패턴의 존재를 특징으로 한다. 3차원을 달성하기 위해 합성 스캐폴딩을 전개하는 조직 조작 전략에 대한 고유의 과제는 천연 조직의 기하학적 및 생물학적 속성 둘 다를 재현할 수 없다는 것이다. 현재까지, 천연 조직을 모방하는 밀도로 세포의 도입을 가능하게 하면서 골격 구조 내에 천연 조직-유사 층 또는 평면 기하 형상을 생성하려는 시도는 기술적 제한에 의해 방해되어 왔다. 바이오인쇄는, 도 18A-F에 설명된 예에 따라, 세포로 구성된 바이오-잉크의 공간적 정의된 침착을 통해 고유의 과제(평면/층 기하 형상 및 세포 밀도)를 극복한다. 일부 실시양태에서, 평면 기하 형상은 복수의 바이오-잉크 배합물로부터 생성되고, 이에 의해 2개 이상의 조직 성분(즉, 간질, 상피, 혈관, 골, 연골, 실질, 피질, 수질, 유두상, 소엽 등)은 실시예 18A-C에 기재된 예에 따라 x, y 및/또는 z 평면에서 서로에 대해 소정 위치로 각각의 조직 성분/세포 모집단/바이오-잉크 배합물을 배치하는 방식으로 제조된다. 일부 실시양태에서, 평면 기하 형상은 바이오인쇄에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 평면 기하 형상은 선 조직, 암 조직, 조직 계면(예를 들면, 골:연골), 혈관 조직, 피라미드 조직, 띠상 조직 또는 분엽 조직의 적어도 하나의 공간 요소를 재현한다. 일부 실시양태에서, 평면 기하 형상은 공극 공간을 도입한다. 추가 실시양태에서, 평면 기하 형상 내의 공극 공간은 체액, 예를 들면, 혈액, 림프액, 담즙, 뇨, 분비물 등의 체액의 적어도 하나의 요소를 모방하는 유체를 수용한다. 추가의 실시양태에서, 공극 공간은 비-부착 세포형 또는 체액-유래된 성분(예: 혈액 세포, 골수 세포, 림프 세포, 면역 세포, 암 세포, 혈소판, 단백질 등)을 임의로 함유한다. 추가의 실시양태에서, 체액-유래 성분은 제조 전, 제조 중 또는 제조 후에 평면 기하 형상의 세포 포함 성분 내로 도입되는 비-공극 공간의 성분으로 임의로 존재한다. 추가의 실시양태에서, 비-부착 세포 성분 또는 체액-유래 성분은 세포간 상호작용 또는 분비된 인자에 대한 반응 결과로서 평면 기하 형상 내의 세포-포함 공간 내로 공극 공간으로부터 모집된다.
일부 실시양태에서, 유체 유동 또는 관류는 임의로 기하 형상 내에서 공극 공간을 통해 개시된다. 일부 실시양태에서, 평면 기하 형상은 도 18B에서 강조된 바와 같이 조직-조직 또는 조직-액체 계면의 형성을 가능하게 한다. 추가의 실시양태에서, 조직은 당해 기하 형상에 의해 생성된 계면(들)에서 세포의 실시간 관찰을 가능하게 하기 위해 광학적으로 투명한 용기 내로 제조된다.
일부 실시양태에서, 조직은 다층을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 층은 구조물 내에서 다른 층과는 구조적 또는 조성적으로 구별되고, 이에 의해 z-평면에서 층 구조를 생성한다. 층 구조의 예는 도 18D-F에 제시된 예에 의해 도시된 바와 같이 주요 간질 조직에 대한 내피 또는 상피 장벽을 갖는 장벽 조직을 포함한다. 일부 실시양태에서, 층 조직은 관강 또는 관상 구조(예를 들면, 장, 혈관, 림프관, 뇨세관, 요관, 방광, 기관, 식도, 기도, 난관, 요도, 소관구조체)의 벽의 일부를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 층 조직은 조직(예를 들면, 점막 조직, 피부 조직, 신 조직, 심장 조직 등)의 영역 또는 층을 나타낸다(참조: 도 8 내지 11). 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 조직 층은 혈관 또는 미소혈관 성분을 도입한다. 추가의 실시양태에서, 혈관 또는 미소혈관 성분의 도입은 조작된 조직의 하나 이상의 성분 내에 미소혈관 또는 유사혈관 네트워크의 형성을 유도한다. 일부 실시양태에서, 층 형성을 갖는 조직의 하나 이상의 성분은 바이오인쇄된다. 일부 실시양태에서, 층 기하 형상을 갖는 하나 이상의 조직은 서로 인접하여 제조되고, 이에 의해 도 18E에 도시된 바와 같이 점막피부 접합부 등의 조직 계면을 생성한다.
일부 실시양태에서, 층 기하 형상을 갖는 다층 조작된 조직의 하나 이상의 층은 또한 도 18F에 기재된 비제한적 예에 따라 평면 기하 형상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동일한 평면 기하 형상은 각 층에서 연속되고, x, y 및 z 평면에서 연속 구조를 갖는 3차원 조직을 생성한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 층상 층의 조성 또는 평면 기하 형상은 변화되어, 생성되는 3차원 조직은 도 18F에 설명된 신장 세관의 비제한적 예에 따라 x, y 및 z 평면 둘 다에서 복합 구조를 갖는다.
세포
본원에서, 일부 실시양태에서, 포유동물 세포의 하나 이상의 형태를 포함하는 조작된 조직이 개시되어 있다. 또한, 본원에는, 일부 실시양태에서, 평활근 세포 및 임의로 섬유아세포 및/또는 내피 세포를 포함하는 조작된 혈관벽 구역이 개시되어 있다. 다른 실시양태에서, 조직은 기도 유사체이다. 일부 실시양태에서, 기도 유사체는 폐 섬유아세포 및 임의로 평활근 세포 및/또는 내피 세포를 포함하고, 여기서 조직의 적어도 하나의 표면은 소기도 상피 세포로 적층된다. 다른 실시양태에서, 조직은 간 유사체이다. 추가의 실시양태에서, 간 조직 유사체는 간장 세포 또는 간장 세포-유사 세포 및 임의로 담관 상피 세포 및 임의로, 이로써 한정되지 않지만, 성상 세포, 내피 세포, 쿠퍼 세포, 면역 세포 또는 근섬유아세포를 포함하는 비-실질 세포형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 임의의 포유동물 세포는 조작된 조직 및 이의 어레이에 포함시키는 데에 적합하다. 추가의 실시양태에서, 조작된 조직의 적어도 하나의 성분은 부착 세포형이다. 추가의 실시양태에서, 포유동물 세포는, 비제한적 예로서, 수축 또는 근육 세포(예: 골격근 세포, 심근 세포, 평활근 세포 및 근아세포), 결합 조직 세포(예: 골 세포, 연골 세포, 섬유아세포, 및 골 형성 세포, 연골 세포 또는 림프 조직 내로 분화하는 세포), 골수 세포, 내피 세포, 피부 세포, 상피 세포, 유방 세포, 혈관 세포, 혈액 세포, 림프 세포, 신경 세포, 슈완 세포, 위장 세포, 간 세포, 췌장 세포, 폐 세포, 기관 세포, 각막 세포, 요생식 세포, 신장 세포, 생식 세포, 실질 세포, 주피 세포, 중피 세포, 간질 세포, 미분화 세포(예: 배세포, 간세포 및 이의 전구 세포), 내배엽 유래 세포, 중배엽 유래 세포, 외배엽 유래 세포, 암 유래 세포 및 이들의 조합이다.
한 가지 실시양태에서, 세포는 평활근 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 평활근 세포 및 섬유아세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 평활근 세포 및 내피 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포이다. 하나 이상의 세포형을 포함하는 실시양태에서, 세포형은 다수의 적합한 비로 존재하며, 이의 예는 본원에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 성인의 분화된 세포이다. 추가의 실시양태에서, "분화된 세포"는, 예를 들면, 분리시에 평활근 세포, 섬유아세포 또는 내피 세포와 일치하는 조직-특이적 표현형을 갖는 세포이고, 여기서 조직-특이적 표현형(또는 잠재적으로 표현형을 나타내는)은 분리시로부터 사용시까지 유지된다. 다른 실시양태에서, 세포는 성인 미분화 세포이다. 추가의 실시양태에서, "미분화 세포"는, 예를 들면, 평활근 세포, 섬유아세포 또는 내피 세포의 결정적 조직-특이적 형질을 갖지 않거나 소실한 세포이다. 일부 실시양태에서, 미분화 세포는 간세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, "간세포"는 효력 및 자기 재생을 나타내는 세포이다. 간세포는, 이로써 한정되지 않지만, 전능성 세포, 복능성 세포, 다능성 세포, 올리고능성 세포, 단능성 세포 및 전구 세포를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 간세포는 배성 간세포, 성체 간세포, 반수 간세포 및 유도된 다능성 간세포이다. 다른 실시양태에서, 당해 세포는 성체 분화된 세포 및 성체 미분화 세포의 혼합물이다.
일부 실시양태에서, 평활근 세포는 인간 평활근 세포이다. 일부 실시양태에서, 적합한 평활근 세포는, 비제한적 예로서, 혈액, 혈관, 림프관, 소화관의 조직, 뇨생식관의 조직, 지방 조직, 기도의 조직, 생식기계의 조직, 골수 및 제대 조직을 포함하는 조직으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 내피 세포는 인간 내피 세포이다. 일부 실시양태에서, 적합한 내피 세포는, 비제한적 예로서, 혈액, 혈관, 림프관, 소화관의 조직, 뇨생식관의 조직, 지방 조직, 기도의 조직, 생식기계의 조직, 골수 및 제대 조직을 포함하는 조직으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 섬유아세포는 인간 섬유아세포이다. 일부 실시양태에서, 적합한 섬유아세포는 비-혈관 섬유아세포이다. 다른 실시양태에서, 적합한 섬유아세포는 혈관 외막으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 세포의 일부 또는 전부는 포유동물 지방흡입물로부터 유래한다. 추가의 실시양태에서, 세포의 일부 또는 전부는 포유동물 지방흡입물의 간질 혈관 분획으로부터 배양된다(실시예 1 참조).
다양한 실시양태에서, 세포형 및/또는 세포 공급원은 특정의 연구 목표 또는 목적에 기초하여 선택, 구성, 처리 또는 변형된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 특이적 세포형은 특정 질환 또는 상태의 조사를 촉진하기 위해 선택, 구성, 처리 또는 변형된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 특이적 세포형은 특정 대상체의 질환 또는 상태의 조사를 촉진하기 위해 선택, 구성, 처리 또는 변형된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 특이적 세포형은 2개 이상의 특이적 인간 공여체로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 특이적 세포형은 특정 척추동물 대상체로부터 유래한다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 특이적 세포형은 특정한 포유동물 대상체로부터 유래한다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 특이적 세포형은 특정 인간 대상체로부터 유래한다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 특이적 세포형은 질환 또는 조직 기능과 관련된 특이적 표현형을 갖는 특정 대상체로부터 유래한다. 추가의 실시양태에서, 대상체-특이적 세포는 생검 또는 조직 샘플링에 의해 목적하는 표적 조직으로부터 단리된다. 추가의 실시양태에서, 대상체-특이적 세포는 단리 직후에 조직을 제조하기 위해 사용된다. 다른 실시양태에서, 대상체-특이적 세포는 3차원 조직의 제조에 사용하기 전에 시험관내에서 조작되고, 여기서 상기 조작은 하나 이상의 확장, 분화, 지시된 분화, 증식, 단백질 또는 핵산에의 노출, 유전자 벡터의 도입, 유전자 또는 비유전자 세포-추천 잔기의 도입, 탈분화(즉, 유도된 다능성 간세포 또는 등가물의 생성), 저온 보존을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체-특이적 세포는 표적 조직 이외의 조직으로부터 단리된다. 추가의 실시양태에서, 대상체-특이적 세포는 표적 조직 내에서 목적하는 세포형으로의 분화를 필요로 한다. 추가의 실시양태에서, 분화를 필요로 하는 대상체-특이적 세포는 3차원 구조로의 제조 전, 제조 중 또는 제조 후에 분화된다.
세포 배양 방법
본 발명의 조작된 조직에 사용된 세포형은 당해 기술분야에 공지된 임의의 방식으로 적합하게 배양된다. 세포 및 조직 배양 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Freshney, R., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, Wiley (1987)]에 기재되어 있고, 이의 내용은 정보를 위해 본원에서 참조로서 도입된다. 본 발명과 관련하여 적합하게 사용된 일반적 포유동물 세포 배양 기술, 세포주 및 세포 배양 시스템은 또한 문헌[참조: Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G., (eds.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998)]에 기재되어 있고, 이의 내용은 정보를 위해 본원에서 참조로서 도입된다.
배양시에 포유동물 세포를 위한 적절한 증식 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있다(실시예 1 참조). 세포 배양 배지는 일반적으로 필수 영양소 및 임의로, 배양되는 세포형(들)에 따라 임의로 선택되는, 추가 요소, 예를 들면, 성장 인자, 염, 무기물, 비타민, 혈소판-농후 혈장 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 성분은 세포 증식, 분화, 특정 단백질의 분비 등을 증강시키기 위해 선택된다. 일반적으로, 표준 증식 배지는 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)를 포함하거나, 1-20% 태아 소 혈청(FBS), 송아지 혈청 또는 사람 혈청, 100U/ml 페니실린 및 0.1mg/mL 스트렙토마이신이 보충된, 110mg/L 피루베이트 및 글루타민을 갖는 저 글루코즈는 당해 기술분야에 공지된 다양한 기타 표준 배지이기 때문에 적절하다. 바람직하게는, 세포는 세포 기원 동물의 체온에서 또는 체온 근처에서 1-21% O2 및 바람직하게는 3-5% CO2의 분위기에서 멸균 조건하에 배양된다. 예를 들면, 인간 세포는 바람직하게는 대략 37℃에서 배양된다.
세포는 목적하는 세포주와 함께 당해 세포의 분화를 유도하기 위해 세포 분화제와 함께 임의로 배양된다. 예를 들면, 세포는 임의로 성장 인자, 사이토킨 등과 함께 배양된다. 일부 실시양태에서, 용어 "성장 인자"는, 세포에 의해 생산되고 기타 인접 또는 원위 세포 자체 및/또는 이의 다양성에 영향을 미치는, 사이토킨을 포함하여, 단백질, 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드의 복합체를 지칭한다. 전형적으로, 성장 인자는, 발생학적으로 또는 복수의 생리학적 또는 환경적 자극에 반응하여, 특정 세포형의 증식 및/또는 분화에 영향을 미친다. 일부(전부는 아니지만) 성장 인자는 호르몬이다. 예시적 성장 인자는 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 신경 성장 인자(NGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF)(염기성 FGF(bFGF) 포함), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF)(PDGF-AA 및 PDGF-AB 포함), 간세포 성장 인자(HGF), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장인자 베타(TGF-β)(TGFβ1 및 TGFβ3 포함), 상피 성장 인자(EGF), 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 인터루킨-6(IL-6), IL-8 등이다. 성장 인자는 그 중에서도 문헌[참조: Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Darnell et al., eds., 1986; Principles of Tissue Engineering, 2d ed., Lanza et al., eds., Academic Press, 2000]에 언급되어 있다. 당해 기술분야의 당업자는 본원에 기재된 조절된 배지 중의 임의의 및 모든 배양물-유래된 성장 인자가 본 발명의 범위 내에 있다는 것을 이해할 것이다.
바이오-잉크 및 다세포 응집체
본원에는, 특정한 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 살아있는 3차원 조직, 이의 어레이, 및 바이오인쇄된 세포를 포함하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 바이오인쇄로부터 바이오-잉크를 침착 또는 압출시킴으로써 바이오인쇄된다. 일부 실시양태에서, "바이오-잉크"는 복수의 세포를 포함하는 액체, 반고체 또는 고체 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 액체 또는 반고체 세포 용액, 세포 현탁액 또는 세포 농축물을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 세포 용액, 현탁액 또는 농축물은 액체 또는 반고체(예: 점성) 담체 및 복수의 세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 담체는 본원에 기재된 것들과 같은 적합한 세포 영양 배지이다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 바이오인쇄 전에 다세포 응집체로 임의로 응집하는 복수의 세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 바이오-잉크는 복수의 세포를 포함하고, 바이오인쇄되어 특정의 평면 및/또는 층 기하 형상을 생성하고, 여기서 바이오-잉크 내의 개개 세포의 응집은 바이오인쇄 전, 동안 및/또는 후에 수행된다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 1) 복수의 세포를 고정된 용적으로 수집함으로써 생성되고, 여기서 세포 성분(들)은 적어도 약 30% 및 최대 100%의 총 용적을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 반고체 또는 고체 다세포 응집체 또는 다세포체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 바이오-잉크는 1) 복수의 세포 또는 세포 응집체 및 생체적합성 액체 또는 겔을 소정 비로 혼합하여 바이오-잉크를 제공하고, 2) 바이오-잉크를 압축시켜 목적하는 세포 밀도 및 점도를 갖는 바이오-잉크를 생산함으로써 생성된다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크의 압축은 농축, 접선 유동 여과("TFF") 또는 이들의 조합에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크의 압축은 압출가능한 조성물을 제공하여, 다세포 응집체 또는 다세포체의 형성을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, "압출가능한"은 노즐 또는 오리피스(예: 하나 이상의 구멍 또는 튜브)를 통해 밀어넣음으로써 성형할 수 있는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크의 압축은 적합한 밀도로 세포의 증식을 제공한다. 바이오-잉크에 요구되는 세포 밀도는 사용되는 세포 및 생성되는 조직 또는 기관에 따라 달라질 것이다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크의 세포는 응집 및/또는 부착된다. 일부 실시양태에서, "응집하다", "응집된" 및 "응집"은 세포, 다세포 응집체, 다세포체 및/또는 이의 층에 결합하는 세포-세포 부착 특성을 지칭한다. 추가의 실시양태에서, 당해 용어는 "융합하다", "융합된" 및 "융합"과 상호교대로 사용된다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 지지체 재료, 세포 배양 배지(또는 이의 보충제), 세포외 매트릭스(또는 이의 성분), 세포 부착제, 세포 사멸 억제제, 항-아폽토시스 제제, 항산화제, 압출 화합물 및 이의 조합을 추가로 포함한다.
다양한 실시양태에서, 세포는 임의의 적합한 세포이다. 추가의 다양한 실시양태에서, 세포는 척추동물 세포, 포유동물 세포, 인간 세포 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 세포형은 생성된 구조물 또는 조직의 형태에 좌우된다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 하나의 세포형(또한 "동종" 또는 "단형" 바이오-잉크로서 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 하나 이상의 세포형(또한 "이종" 또는 "다형" 바이오-잉크로서 지칭됨)을 포함한다.
세포 배양 배지
일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 세포 배양 배지를 포함한다. 세포 배양 배지는 임의의 적합한 배지이다. 다양한 실시양태에서, 적합한 세포 배양 배지는, 비제한적 예로서, 둘베코 인산염 완충된 염수, 이를(Earle) 평형 염, 한크(Hank) 평형 염, 티로드(Tyrode) 염, 알세버(Alsever) 용액, 게이(Gey) 평형 염 용액, 변형된 크렙-한셀레이트(Kreb-Henseleit) 완충제, 크렙-링거(Kreb-Ringer) 중탄산염 완충제, 퍽(Puck) 염수, 둘베코 변형된 이글 배지, 둘베코 변형된 이글 배지/영양소 F12 Ham, 영양 혼합물 F-10 Ham(Ham's F-10), 배지 199, 최소 필수 배지 이글, RPMI-1640 배지, 아메스(Ames) 배지, BGJb 배지(Fitton-Jackson Modification), 클린(Click) 배지, CMRL-1066 배지, 피셔(Fischer) 배지, 글라스코브(Glascow) 최소 필수 배지(GMEM), 이스코브(Iscove) 변형된 둘베코 배지(IMDM), L-15 배지(Leibovitz), 맥코이(McCoy) 5A 변형된 배지, NCTC 배지, 스윔(Swim) S-77 배지, 웨이마우스(Waymouth) 배지, 윌리암(William) 배지 E 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 변형되거나 보충된다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 알부민, 셀레늄, 트랜스페린, 페투인, 당, 아미노산, 비타민, 성장 인자, 사이토킨, 호르몬, 항체, 지질, 지질 담체, 사이클로덱스트린, 혈소판-농후 혈장 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
세포외 매트릭스
일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 세포외 매트릭스의 하나 이상의 성분 또는 이의 유도체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, "세포외 매트릭스"는, 이들이 조직을 함께 유지하기 위해 지지체로서 작용하는 경우, 세포에 의해 생산되고 세포 외부로 세포외 공간으로 수송되어 세포 신호전달을 용이하게 하는 단백질을 포함한다. 세포외 매트릭스 성분의 예는, 이로써 한정되지 않지만, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 히알루로네이트, 엘라스틴 및 프로테오글리칸을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 다세포 응집체는 다양한 ECM 단백질(예: 젤라틴, 피브리노겐, 피브린, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴 및/또는 프로테오글리칸)을 함유한다. ECM 성분 또는 ECM 성분의 유도체는 다세포 응집체의 형성에 사용된 세포 페이스트에 임의로 첨가된다. 세포 페이스트에 첨가된 ECM 성분 또는 ECM 성분의 유도체는 인간 또는 동물 공급원으로부터 임의로 정제되거나, 당해 기술분야에 공지된 재조합 방법에 의해 생산된다. 또는, ECM 성분 또는 ECM 성분의 유도체는 신장 세포체 중의 세포에 의해 자연적으로 분비되거나, 신장 세포체의 제조에 사용된 세포는 하나 이상의 ECM 성분 또는 ECM 성분의 유도체 및/또는 하나 이상의 세포 부착 분자 또는 세포-기질 부착 분자(예: 셀렉틴, 인테그린, 면역글로불린 및 애드헤린)의 발현 수준을 변화시키기 위해 당해 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 임의로 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, ECM 성분 또는 ECM 성분의 유도체는 다세포 응집체에서 세포의 응집을 촉진시킨다. 예를 들면, 젤라틴 및/또는 피브리노겐은 세포 페이스트에 적합하게 첨가되고, 이는 다세포 응집체를 형성하기 위해 사용된다. 피브리노겐은 트롬빈의 첨가에 의해 피브린으로 전환된다.
일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 세포 부착을 촉진하는 제제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 세포 사멸(예: 괴사, 아폽토시스 또는 자가식작용)을 억제하는 제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 항-아폽토시스 제제를 추가로 포함한다. 세포 사멸을 억제하는 제제는, 이로써 한정되지 않지만, 소분자, 항체, 펩티드, 펩티바디 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 사멸을 억제하는 제제는 항-TNF 제제, 인터루킨의 활성을 억제하는 제제, 인터페론의 활성을 억제하는 제제, GCSF(과립구 콜로니-자극 인자)의 활성을 억제하는 제제, 마크로파지 염증 단백질의 활성을 억제하는 제제, TGF-B(형질전환 성장 인자 B)의 활성을 억제하는 제제(도 15 및 16 참조), MMP(매트릭스 메탈로프로테이나제)의 활성을 억제하는 제제, 카스파제의 활성을 억제하는 제제, MAPK/JNK 신호전달 캐스케이드를 억제하는 제제, Src 키나제의 활성을 억제하는 제제, JAK(야누스 키나제)의 활성을 억제하는 제제 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 항산화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 산소-담체 또는 기타 세포-특이적 영양소를 포함한다.
압출 화합물
일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 압출 화합물(즉, 바이오-잉크의 압출 특성을 개질시키는 화합물)을 추가로 포함한다. 압출 화합물의 예는, 이로써 한정되지 않지만, 겔, 하이드로겔, 펩티드 하이드로겔, 아미노산계 겔, 계면활성제 폴리올(예: Pluronic F-127 또는 PF-127), 열-반응성 폴리머, 히알루로네이트, 알기네이트, 세포외 매트릭스 성분(및 이의 유도체), 콜라겐, 기타 생체적합성 천연 또는 합성 폴리머, 나노섬유 및 자가-조립 나노섬유를 포함한다. 일부 실시양태에서, 압출 화합물은 물리적, 화학적 또는 효소적 수단에 의해 바이오인쇄 후에 제거된다.
겔(종종 젤리로서 지칭됨)은 다양한 방식으로 정의된다. 예를 들면, 미국 약국방(the United States Pharmacopoeia)은 작은 무기 입자 또는 액체에 의해 상호 침투된 거대 유기 분자로 구성된 현탁액으로 이루어진 반고체 시스템으로 겔을 정의한다. 겔은 단상 또는 이상 시스템을 포함한다. 단상 겔은 외관적 경계가 분산된 거대분자와 액체 사이에 존재하지 않도록 하는 방식으로 액체를 통해 균일하게 분포된 유기 거대분자로 이루어진다. 일부 단상 겔은 합성 거대분자(예: 카보머) 또는 천연 검(예: 트라가칸트)로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 단상 겔은 일반적으로 수성이지만, 알콜 및 오일을 사용하여 제조될 수 있다. 이상 겔은 작은 별개 입자의 네트워크로 구성된다.
겔은, 일부 경우에, 소수성 또는 친수성인 것으로 분류된다. 특정한 실시양태에서, 소수성 겔의 기재는 콜로이드성 실리카 또는 알루미나 또는 아연 비누로 겔화된 폴리올레핀 또는 지방 오일을 갖는 액체 파라핀으로 구성된다. 대조적으로, 친수성 겔의 기재는 통상 적합한 겔화제(예: 트라가칸트, 전분, 셀룰로즈 유도체, 카복시비닐폴리머 및 마그네슘-알루미늄 실리케이트)로 겔화된 물, 글리세롤 또는 프로필렌 글리콜로 구성된다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물 또는 디바이스의 유동학은 유사 플라스틱, 플라스틱, 틱소트로픽 또는 팽창제이다.
적합한 하이드로겔은 콜라겐, 히알루로네이트, 피브린, 알기네이트, 아가로즈, 키토산 및 이들의 조합으로부터 유래된 것들을 포함한다. 다른 실시양태에서, 적합한 하이드로겔은 합성 폴리머를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 적합한 하이드로겔은 폴리(아크릴산) 및 이의 유도체, 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 이의 공중합체, 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠 및 이들의 조합으로부터 유래된 것들을 포함한다. 다양한 특정 실시양태에서, 밀폐 재료는 하이드로겔, 노보겔TM, 아가로즈, 알기네이트, 젤라틴, 마트리겔TM, 히알루로난, 폴록사머, 펩티드 하이드로겔, 폴리(이소프로필 n-폴리아크릴아미드), 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEG-DA), 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리디메틸실록산, 폴리아크릴아미드, 폴리(락트산), 규소, 실크 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔계 압출 화합물은 열가역적 겔(또한 열-반응성 겔 또는 써모겔로서 공지됨)이다. 일부 실시양태에서, 적합한 열가역적 하이드로겔은 실온에서 액체가 아니다. 특정 실시양태에서, 적합한 하이드로겔의 겔화 온도(Tgel)는 약 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃(이들 범위 내의 증분 포함)이다. 특정 실시양태에서, 적합한 하이드로겔의 Tgel은 약 10℃ 내지 약 40℃이다. 추가의 실시양태에서, 적합한 하이드로겔의 Tgel은 약 20℃ 내지 약 30℃이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바이오-잉크(하이드로겔, 하나 이상의 세포형 및 기타 첨가제 등을 포함함)는 실온에서 액체가 아니다. 일부 실시양태에서, 적합한 열가역적 하이드로겔은 포유동물 체온에서 액체가 아니다. 특정 실시양태에서, 적합한 하이드로겔의 겔화 온도(Tgel)는 약 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 41℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃(이들 범위 내의 증분 포함)이다. 특정 실시양태에서, 적합한 하이드로겔의 Tgel은 약 22℃ 내지 약 52℃이다. 추가의 실시양태에서, 적합한 하이드로겔의 Tgel은 약 32℃ 내지 약 42℃이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바이오-잉크(예를 들면, 하이드로겔, 하나 이상의 세포형 및 기타 첨가제 등을 포함함)는 포유동물 체온에서 액체가 아니다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바이오-잉크의 겔화 온도(Tgel)는 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃(이들 범위 내의 증분 포함)이다. 특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 바이오-잉크의 Tgel은 약 10℃ 내지 약 15℃이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바이오-잉크의 Tgel은 약 15℃ 내지 약 20℃이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바이오-잉크의 Tgel은 약 20℃ 내지 약 25℃이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바이오-잉크의 Tgel은 약 25℃ 내지 약 30℃이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바이오-잉크의 Tgel은 약 30℃ 내지 약 35℃이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바이오-잉크의 Tgel은 약 35℃ 내지 약 40℃이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바이오-잉크의 Tgel은 약 40℃ 내지 약 45℃이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바이오-잉크의 Tgel은 약 45℃ 내지 약 50℃이다.
폴리옥시프로필렌 및 폴리옥시에틸렌으로 구성된 폴리머는, 수용액 내로 도입되는 경우, 열가역적 겔을 형성한다. 이들 폴리머는 바이오프린터 장치에서 유지가능한 온도에서 액체 상태로부터 겔 상태로 변화하는 능력을 갖는다. 액체 상태 대 겔 상태 상 전이는 폴리머 농도 및 용액 중의 성분에 의존한다.
폴록사머 407(플루로닉 F-127 또는 PF-127)은 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체로 구성된 비이온성 계면활성제이다. 기타 폴록사머는 188(F-68 등급), 237(F-87 등급), 338(F-108 등급)이다. 폴록사머의 수용액은 산, 알칼리 및 금속 이온의 존재하에 안정하다. PF-127은 평균 몰 질량이 13,000인 화학식 E106 P70 E106의 상업적으로 이용가능한 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 트리블록 공중합체이다. 폴리머는 임의로 폴리머의 겔화 특성을 증강시킬 수 있는 적합한 방법으로 추가로 정제된다. 이는 대략 70% 에틸렌 옥사이드를 함유하고, 이는 이의 친수성을 고려한다. 이는 일련의 폴록사머 ABA 블록 공중합체 중의 하나이다. PF-127은 우수한 가용화능, 저독성을 갖고, 따라서 적합한 압출 화합물로 고려된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제시된 하이드로겔 및 바이오-잉크의 점도는 기재된 임의의 수단에 의해 측정된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, LVDV-II + CP 콘 플레이트 점도계 및 콘 스핀들 CPE-40은 하이드로겔 및 바이오-잉크의 점도를 계산하기 위해 사용된다. 다른 실시양태에서, 브룩필드(스핀들 및 컵) 점도계는 하이드로겔 및 바이오-잉크의 점도를 계산하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 지칭되는 점도 범위는 실온에서 측정된다. 다른 실시양태에서, 본원에서 지칭되는 점도 범위는 체온(예를 들면, 건강한 인간의 평균 체온에서)에서 측정된다.
추가의 실시양태에서, 하이드로겔 및/또는 바이오-잉크는 약 500 내지 1,000,000 센티포이즈, 약 750 내지 1,000,000 센티포이즈; 약 1000 내지 1,000,000 센티포이즈; 약 1000 내지 400,000 센티포이즈; 약 2000 내지 100,000 센티포이즈; 약 3000 내지 50,000 센티포이즈; 약 4000 내지 25,000 센티포이즈; 약 5000 내지 20,000 센티포이즈; 또는 약 6000 내지 15,000 센티포이즈의 점도를 갖는 것을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 연속 바이오인쇄에 적합한 세포 및 압출 화합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이오-잉크는 약 1500 mPa·s의 점도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 플루로닉 F-127 및 세포 재료의 혼합물은 연속 바이오인쇄에 적합하다. 이러한 바이오-잉크는 48시간에 걸쳐 냉각(4℃) 인산염 완충된 염수(PBS)에서 연속 혼합에 의해 플루로닉 F-127 분말을 30%(w/v)로 용해시킴으로써 적합하게 제조된다. 플루로닉 F-127은 또한 물에 적합하게 용해된다. 일부 실시양태에서, 세포는 표준 멸균 세포 배양 기술을 사용하여 배양 및 확장시킨다. 추가의 실시양태에서, 세포는, 예를 들면, 200g으로 펠릿화하고, 30% 플루로닉 F-127에서 재현탁시키고, 일부 실시양태에서, 약 10 내지 약 25℃의 겔화 온도에서 고형화하도록 허용되는 경우, 바이오프린터에 고정된 저장소에 흡인시킨다. 바이오인쇄 전 바이오-잉크의 겔화는 임의적이다. 플루로닉 F-127을 포함하는 바이오-잉크를 포함하는 바이오-잉크는 임의로 액체로서 분배된다.
다양한 실시양태에서, 플루로닉 F-127의 농도는 적합한 점도 및/또는 세포독성 특성을 갖는 임의의 값이다. 일부 실시양태에서, 플루로닉 F-127의 적합한 농도는, 바이오인쇄되는 경우, 이의 기하 형상을 유지하면서 중량을 지지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 플루로닉 F-127의 농도는 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50%이다. 일부 실시양태에서, 플루로닉 F-127의 농도는 약 30% 내지 약 40% 또는 약 30% 내지 약 35%이다.
일부 실시양태에서, 바이오-잉크(예를 들면, 압출 화합물 등)의 비-세포 성분은 사용 전에 제거된다. 추가의 실시양태에서, 비-세포 성분은, 예를 들면, 하이드로겔, 펩티드 하이드로겔, 아미노산계 겔, 계면활성제 폴리올, 열-반응성 폴리머, 히알루로네이트, 알기네이트, 콜라겐 또는 기타 생체적합성 천연 또는 합성 폴리머이다. 추가의 실시양태에서, 비-세포 성분은 물리적, 화학적 또는 효소적 수단에 의해 제거된다. 일부 실시양태에서, 비-세포 성분의 비율은 사용시에 세포 성분과 관련하여 유지된다.
일부 실시양태에서, 세포는 세포 상호작용을 증가시키기 위해 사전-처리된다. 예를 들면, 세포는 바이오-잉크를 성형하기 전에 세포-세포 상호작용을 증강시키기 위해 원심분리 후에 원심분리 튜브 내부에서 적합하게 배양된다.
예시적 세포 비
일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 다세포체를 포함하고, 이는 평활근 세포 및 내피 세포를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 평활근 세포 대 내피 세포의 비는 임의의 적합한 비이다. 추가의 실시양태에서, 평활근 세포 대 내피 세포의 비는 약 90:10 내지 약 60:40이다. 특정 실시양태에서, 다세포체는 평활근 세포 및 내피 세포를 포함하고, 평활근 세포 대 내피 세포의 비는 약 85:15이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 다세포체는 평활근 세포 및 내피 세포를 포함하고, 평활근 세포 대 내피 세포의 비는 약 70:30이다.
일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 다세포체를 포함하고, 이는 평활근 세포 및 섬유아세포를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 평활근 세포 대 섬유아세포의 비는 임의의 적합한 비이다. 추가의 실시양태에서, 평활근 세포 대 섬유아세포의 비는 약 90:10 내지 약 60:40이다.
일부 실시양태에서, 바이오-잉크는 다세포체를 포함하고, 이는 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포의 비는 임의의 적합한 비이다. 추가의 실시양태에서, 평활근 세포 대 섬유아세포 및 내피 세포의 비는 약 70:25:5이다.
세포의 자가 분류
일부 실시양태에서, 구조물 또는 조직의 형성에 사용된 다세포 응집체는 조작된 세포(예: 내피 세포, 평활근 세포, 섬유아세포 등)에 포함되는 모든 세포형을 포함하고, 이러한 예에서 각각의 세포형은 적절한 위치로 이동(예를 들면, 성숙 동안)하여 혈관벽 구역 등의 조작된 조직을 형성한다. 다른 실시양태에서, 구조물의 형성에 사용된 다세포 응집체는 조작된 조직에 포함되는 모든 세포형보다 적제 포함한다. 일부 실시양태에서, 각 형태의 세포는 다세포 응집체, 또는 조직의 영역 또는 층 내에 균일하게 분포된다. 다른 실시양태에서, 각 형태의 세포는 다세포 응집체의 특정 영역 또는 조직의 층 또는 영역에 국지화된다.
예를 들면, 평활근 세포 및 내피 세포를 적합한 비(예: 85:15, 70:30 등)로 포함하는 조작된 혈관벽 구역(혈관 조직 시트)의 경우에, 인접하는 바이오인쇄된 응집된 다형 원통형 바이오-잉크 단위는 융합한다. 성숙 동안, 내피 세포는 구조물의 주위에 어느 정도 국지화하고 콜라겐이 형성된다(도 1, 3 및 4a). 추가의 예로서, 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포를 적합한 비(예를 들면, 70:25:5 등)로 포함하는 바이오인쇄된 혈관벽 구역의 경우에, 바이오인쇄된 다형 원통형 바이오-잉는 융합하고, 내피 세포는 구조물의 주위에 어느 정도 국지화한다. 일부 실시양태에서, 구조물에 세포형의 국지화는 생체내 또는 생체외 포유동물 조직의 층상 구조를 모방한다. 추가의 실시양태에서, 예를 들면, 조작된 혈관벽 구역에서, 구조물에서 세포형의 국지화는 추정의 내막, 중막 및 외막을 형성한다.
일부 실시양태에서, 세포의 분류 또는 자가-분류는 하나 이상의 세포 층을 적용함으로써 가속, 증강 또는 증대된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 평활근 세포 및 내피 세포를 포함하는 다세포 응집체로 바이오인쇄된 구조물은 구조물의 하나 이상의 표면 상에 내피 세포의 층의 적용이 추가로 제공된다. 추가의 실시양태에서, 그 결과는 구조물의 주위에 내피 세포의 국지화에 의해 생산된 계층화의 증강이다.
사전-형성된 골격
일부 실시양태에서, 본원에는, 임의의 사전-형성된 골격을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 조작된, 이식가능한 조직 및 기관이 개시되어 있다. 추가의 실시양태에서, "골격"는 폴리머 골격 및 다공성 하이드로겔 등의 합성 골격, 사전-형성된 세포외 매트릭스 층, 사멸 세포 층 및 탈세포화 조직 등의 비-합성 골격, 및 조작된 조직 및/또는 기관의 물리적 구조조에 불가결하고 조직 및/또는 기관으로부터 제거되지 않는 임의의 기타 형태의 사전-형성된 골격을 지칭한다. 추가의 실시양태에서, 탈세포화 조직 골격은 형성된 탈세포화된 천연 조직 또는, 임의의 방식으로 배양된 세포에 의해 탈세포화된 세포 재료, 예를 들면, 사멸하거나 탈세포화하여 살아있는 동안에 이들이 생산한 ECM을 잔류시키는 세포 층를 포함한다.
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직 및 이의 어레이는, 예를 들면, 조직, 조직의 임의의 층의 형성 또는 조직 기하 형상의 형성을 위해 임의의 사전-형성된 골격을 이용하지 않는다. 비제한적 예로서, 본 발명의 조작된 조직은 임의의 사전-형성된 합성 골격, 예를 들면, 폴리머 골격, 사전-형성된 세포외 매트릭스 층, 또는 임의의 기타 유형의 사전-형성된 골격을 제조시에 또는 사용시에 이용하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 조직은 임의의 사전-형성된 골격을 실질적으로 포함하지 않는다. 추가의 실시양태에서, 조직의 세포 성분은 검출 가능하지만 미량 또는 소량의 골격, 예를 들면, 전체 조성물의 2.0% 미만, 1.0% 미만 또는 0.5% 미만의 골격을 함유한다. 추가의 실시양태에서, 미량 또는 소량의 골격은 조직 또는 이의 어레이의 장기간 거동에 영향을 미치거나 이의 주요 생물학적 기능을 방해하기에는 불충분하다. 추가의 실시양태에서, 골격 성분은 물리적, 화학적 또는 효소적 방법에 의해 인쇄 후에 제거되어, 골격 성분을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 조작된 조직을 수득한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 사전-형성된 골격을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 조작된 조직은 스캐폴딩 재료가 먼저 형성되는 특정한 기타 조직 조작 방법으로 개발된 것들과는 전혀 대조적이고, 이어서 세포는 골격 및 후속적으로, 예를 들면, 골격의 기하 형상을 충전 및 취하기 위해 증식한다. 한 가지 측면에서, 본원에 기재된 바이오인쇄 방법은 사전-형성된 골격을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 생존가능한 및 유용한 조직의 생산을 가능하게 한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 세포는, 일부 실시양태에서, 밀폐 재료를 사용하여 목적하는 3차원 기하 형상으로 유지된다. 밀폐 재료는 당해 밀폐 재료가 일시적 및/또는 세포 및/또는 조직으로부터 제거가능하다는 점에서 적어도 골격와는 상이하다.
어레이
일부 실시양태에서, 본원에는 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직의 어레이가 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, "어레이"는 복수의 시험이 샘플 상에서 수행되고 하나 이상의 시험이 복수의 샘플 상에서 수행되거나 이들 둘 다를 가능하게 하도록 공간적으로 배열된 복수 요소의 결합을 포함하는 과학적 도구이다. 일부 실시양태에서, 어레이는, 중간 또는 고수율 스크리닝과 관련된 것들을 포함하여, 스크리닝 방법 및 디바이스에 적용되거나 이들과 호환성이 있다. 추가의 실시양태에서, 어레이는 복수의 시험을 동시에 수행되도록 한다. 추가의 실시양태에서, 어레이는 복수의 샘플을 동시에 시험되도록 한다. 일부 실시양태에서, 어레이는 세포 마이크로어레이이다. 추가의 실시양태에서, 세포 마이크로어레이는 고체 지지체의 표면 위에 살아있는 세포의 다중 질문을 가능하게 하는 실험 도구이다. 다른 실시양태에서, 어레이는 조직 마이크로어레이이다. 추가의 실시양태에서, 조직 마이크로어레이는 어레이에서 조립된 복수의 분리 조직 또는 조직 샘플을 포함하여, 다수의 생화학적, 대사적, 분자 또는 조직학적 분석의 실행을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 각각 생체적합성 다중-웰 용기의 웰에 존재한다(참조: 도 14). 추가의 실시양태에서, 각각의 조직은 웰 내에 배치된다. 다른 실시양태에서, 각각의 조직은 웰 내로 바이오인쇄된다. 추가의 실시양태에서, 웰은 피복된다. 다양한 추가 실시양태에서, 웰은 하나 이상의 생체적합성 하이드로겔, 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 화학물질, 하나 이상의 펩티드, 하나 이상의 항체 및 하나 이상의 성장 인자(이들의 조합 포함)로 피복된다. 일부 실시양태에서, 웰은 노보겔TM으로 피복된다. 다른 실시양태에서, 웰은 아가로즈로 피복된다. 일부 실시양태에서, 각각의 조직은 생체적합성 다중-웰 용기의 웰에서 다공성 생체적합성 막 위에 존재한다. 일부 실시양태에서, 다중-웰 용기의 각 웰은 2개 이상의 조직을 함유한다.
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 하나 이상의 측면에서 생체적합성 표면에 고정된다. 다수의 방법은 생체적합성 표면에 조직을 고정하는데 적합하다. 다양한 실시양태에서, 조직은, 예를 들면, 하나 이상의 전체 측면을 따라, 하나 이상의 측면의 엣지에서만, 또는 하나 이상의 측면의 중심에서만 생체적합성 표면에 적합하게 고정된다. 다양한 추가 실시양태에서, 조직은 표면 내로 일체화되거나 표면과 결합된 홀더 또는 담체를 사용하여 생체적합성 표면에 적합하게 고정된다. 다양한 추가 실시양태에서, 조직은 표면과 일체화되거나 표면과 결합된 하나 이상의 핀치-플램프 또는 플라스틱 누브를 사용하여 생체적합성 표면에 적합하게 고정된다. 일부 실시양태에서, 조직은 다공성 막에 대한 세포-부착에 의해 생체적합성 표면에 적합하게 고정된다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 하나 이상의 측면 위에서 생체적합성 표면에 대한 고정에 의해 어레이 배열로 유지된다. 추가의 실시양태에서, 조직은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 측면 위에서 생체적합성 표면에 고정된다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 표면은 조직 또는 당해 조직과 접촉하는 기관에 대한 손상 또는 독성의 현저한 위험을 갖지 않는 임의의 표면이다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 종래의 조직 배양 방법에 적합한 임의의 표면이다. 적합한 생체적합성 표면은, 비제한적 예로서, 처리된 플라스틱, 막, 다공성 막, 피복된 막, 피복된 플라스틱, 금속, 피복된 금속, 유리, 처리된 유리 및 피복된 유리를 포함하고, 여기서 적합한 피복물은 하이드로겔, ECM 성분, 화학물질, 단백질 등을 포함하고, 피복물 또는 처리는 생체적합성 표면에 대한 세포 및 조직 부착을 자극하거나 방지하는 수단을 제공한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 측면에서 생체적합성 조직에 대한 조작된 세포의 고정은 유체 유동에 의해 유발된 전단력으로 조직을 처리하는 것을 용이하게 한다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직은 유체 유동에 의해 유발된 전단력을 받는다. 다양한 실시양태에서, 조작된 조직은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 측면에서 전단력을 받는다(참조: 도 13).
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직의 어레이는 2개 이상의 요소의 결합을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 어레이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 또는 500개 요소(이들 범위 내의 증분 포함)의 결합을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 각각의 효소는 하나 이상의 세포, 다세포 응집체, 조직, 기관 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직의 어레이는 소정의 패턴으로 공간적으로 배열된 복수의 요소를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 패턴은 요소의 임의의 적합한 공간적 배열이다. 다양한 실시양태에서, 정렬 패턴은, 비제한적 예로서, 2차원 그리드, 3차원 그리드, 하나 이상의 직선, 원호 또는 원, 일련의 행렬 등을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 패턴은 고수율 생물학적 분석 또는 스크리닝 방법 또는 디바이스와의 호환성을 위해 선택된다.
다양한 실시양태에서, 어레이 내의 하나 이상의 조직을 제조하기 위해 사용된 세포형 및/또는 세포 공급원은 특정한 연구 목표 또는 목적에 기반하여 선택된다. 추가의 다양한 실시양태에서, 어레이 내의 특정한 조직은 특정한 연구 목표 또는 목적에 기반하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 특정한 조작된 조직은 특정 질환 또는 상태의 조사를 용이하게 하기 위해 어레이에 포함된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 특정 조작된 조직은 특정 대상체의 질환 또는 상태의 조사를 용이하게 하기 위해 어레이에 포함된다. 추가의 실시양태에서, 어레이 내의 하나 이상의 특정 조작된 조직은 2개 이상의 상이한 인간 공여체로부터 유래한 하나 이상의 세포형으로 생성된다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직은 세포형, 세포 공급원, 세포 층, 세포 비, 구성 방법, 크기, 기하 형상 등과 관련하여 실질적으로 유사하다. 다른 실시양태에서, 어레이 내의 하나 이상의 조직은 세포형, 세포 공급원, 세포 층, 세포 비, 구성 방법, 크기, 기하 형상 등과 관련하여 독특하다. 다양한 실시양태에서, 어레이 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300개 또는 그 이상의 조직(이들 범위 내의 증분 포함)은 독특하다. 다른 다양한 실시양태에서, 어레이 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 조직(이들 범위 내의 증분 포함)은 독특하다.
일부 실시양태에서, 어레이 내의 하나 이상의 조직은 인체 내의 하나 이상의 특정 조직을 나타낸다. 추가의 실시양태에서, 어레이 내의 하나 이상의 개개 조직은 인간 조직을 나타내고, 비제한적 예로서, 혈관 또는 림프관, 근육, 자궁, 신경, 점막, 중피, 대망, 각막, 피부, 간장, 신장, 심장, 기관, 폐, 골, 골수, 지방, 결합 조직, 방광, 유방, 췌장, 비장, 뇌, 식도, 위, 창자, 결장, 직장, 난소, 전립선, 종양, 내배엽, 외배엽 및 중배엽을 포함한다. 한 가지 실시양태에서, 어레이 내의 조직은 대상체에서 주요 조직 유형 모두를 나타내도록 선택된다.
일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직은 배양시에 독립적으로 유지된다. 추가의 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직의 배양 조건은 이들이 다른 조직으로 단리되고 배지 또는 당해 배지에 가용성인 인자를 교환할 수 없도록 하는 것이다. 다른 실시양태에서, 어레이 내의 2개 이상의 개개 조직은 가용성 인자를 교환한다. 추가의 실시양태에서, 어레이 내의 2개 이상의 개개 조직의 배양 조건은 이들이 배지 및 다른 조직을 갖는 배지에서 가용성인 인자를 교환하도록 하는 것이다. 다양한 실시양태에서, 어레이 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300개 또는 그 이상의 조직(이들 범위 내의 증분 포함)은 배지 및/또는 가용성 인자를 교환한다. 다른 다양한 실시양태에서, 어레이 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 조직(이들 범위 내의 증분 포함)은 배지 및/또는 가용성 인자를 교환한다.
시험관내 분석
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직 및 어레이는 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, "분석"은 유기 또는 생물학적 샘플(예를 들면, 세포 응집체, 조직, 기관, 생물 등)에서 물질(예를 들면, 화학물질, 분자, 생화학적, 약물 등)의 존재 또는 활성을 시험 또는 측정하는 공정이다. 추가의 실시양태에서, 분석은 정성적 분석 및 정량적 분석을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 정량적 분석은 샘플 중의 물질의 양을 측정한다.
다양한 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직 및 어레이는, 비제한적 예로서, 화상-기반 분석, 분비된 단백질의 측정, 마커의 발현 및 단백질의 생산에 사용하기 위한 것이다. 다양한 추가 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직 및 어레이는 분자 결합(방사성리간드 결합 포함), 분자 흡수, 활성(예를 들면, 효소적 활성 및 수용체 활성 등), 유전자 발현, 단백질 발현, 수용체 작동작용, 수용체 길항작용, 세포 신호전달, 아폽토시스, 화학요법 감수성, 형질감염, 세포 이동, 주화성, 세포 생존력, 세포 증식, 안전성, 유효성, 대사성, 독성 및 남용 경향 중의 하나 이상을 검출 또는 측정하는 분석에서 사용하기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직 및 어레이는 면역분석에서 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 면역분석은 경쟁 면역분석 또는 비경쟁 면역분석이다. 경쟁 면역분석에서, 예를 들면, 샘플 중의 항원은 표지된 항원과 경쟁하여 항체와 결합하고, 이어서 항체 부위에 결합된 표지된 항원의 양을 측정한다. 비경쟁 면역분석(또한 "샌드위치 분석"으로 지칭됨)에서, 예를 들면, 샘플 중의 항원은 항체 부위와 결합하고, 후속적으로 표지된 항체는 항원에 결합하고, 이어서 당해 부위 위의 표지된 항체를 측정한다.
일부 실시양태에서, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직 및 어레이는 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA)에서 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, ELISA는 샘플 중의 항체 또는 항원의 존재를 검출하기 위해 사용된 생화학적 기술이다. ELISA에서, 예를 들면, 특정 항원에 대해 특이성을 갖는 적어도 하나의 항체가 사용된다. 추가의 예로서, 미공지 양의 항원을 갖는 샘플은 비특이적(표면에 대한 흡착을 통해) 또는 특이적("샌드위치" ELISA에서, 동일한 항원에 특이적인 또 다른 항체에 의한 포획을 통해)으로 고체 지지체(예를 들면, 폴리스티렌 미세적정 플레이트) 상에 고정된다. 추가의 예로서, 항원을 고정시킨 후, 검출 항체를 첨가하여, 항원과의 복합체를 형성한다. 검출 항체는, 예를 들면, 효소에 공유 결합되거나, 생물접합을 통해 효소에 결합되는 2차 항체에 의해 자체로 검출된다.
예를 들면, 일부 실시양태에서, 세포의 어레이, 마이크로어레이 또는 칩, 다세포 응집체 또는 조직은 약물 스크리닝 또는 약물 발견을 위해 사용된다. 추가의 실시양태에서, 조직의 어레이, 마이크로어레이 또는 칩은 약물 스크리닝 또는 약물 발견을 위한 키트의 일부로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 각각의 혈관벽 구역은 생체적합성 다중-웰 용기의 벽에 존재하고, 여기서 용기는 하나 이상의 자동화 약물 스크리닝 공정 및/또는 디바이스와 호환성이 있다. 추가의 실시양태에서, 자동화 약물 스크리닝 공정 및/또는 디바이스는 컴퓨터 또는 로봇-보조되는 임의의 적합한 공정 또는 디바이스를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 약물 스크리닝 분석 또는 약물 발견 분석을 위한 어레이는 임의의 치료학적 분야에서 잠재적으로 유용한 약물을 연구 또는 개발하기 위해 사용된다. 추가의 실시양태에서, 적합한 치료학적 분야는, 비제한적 예로서, 감염성 질환, 혈액학, 종양학, 소아과, 심장, 중추신경계 질환, 신경학, 위장병, 비뇨기과, 불임증, 안과, 신장, 정형외과, 통증 제어, 정신과, 호흡기, 백신, 창상 치유, 생리학, 약리학, 피부과, 유전자 치료, 독물학 및 면역학을 포함한다.
방법
본원에는, 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 부착 세포형을 소정 형태로 포함하는 바이오-잉크를 바이오인쇄하는 단계 및 바이오-잉크를 살아있는 3차원 조직 구조물에 융합시키는 단계를 포함하는 살아있는 3차원 조직 구조물을 구축하는 방법이 개시되어 있다. 추가의 실시양태에서, 조직 구조물은 시험관내 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 조직 구조물은 혈관 튜브가 아니다.
또한, 본원에는, 일부 실시양태에서, 평활근 세포를 포함하는 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계, 상기 응집된 다세포 응집체를 지지체 위에 배치하는 단계 및 상기 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 혈관벽 구역 등의 조직을 형성하는 단계를 포함하는, 혈관벽 구역을 포함하는 조직을 구축하는 방법이 개시되어 있고, 여기서, 상기 배양은 약 2시간 내지 약 10일의 기간을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 바이오인쇄를 이용한다. 추가의 실시양태에서, 상기 방법은, 임의의 사전-형성된 골격을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직을 생산한다.
또한, 본원에는, 일부 실시양태에서, 포유동물 세포를 포함하는 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계, 상기 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 지지체 위에 배치하는 단계, 상기 하나 이상의 응집된 다세포 응집체에, 하나 이상의 외부 표면 상에 제1 형태의 포유동물 세포의 층, 하나 이상의 외부 표면 상에 제2 형태의 포유동물 세포의 층 중의 하나 이상을 적용하는 단계, 및 상기 하나 이상의 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 조직을 형성하는 단계를 포함하는, 혈관벽 구역을 포함하는 살아있는 3차원 조직을 구축하는 방법이 개시되어 있고, 여기서 상기 배양은 약 2시간 내지 약 10일의 기간을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 바이오인쇄를 이용한다. 추가의 실시양태에서, 상기 방법은, 임의의 사전-형성된 골격을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는, 혈관벽 구역을 포함하는 조작된 조직을 생산한다.
또한, 본원에는, 일부 실시양태에서, 포유동물 세포를 포함하는 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계, 상기 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 지지체 위에 배치하여, 서로에 대해 공간적으로 배열되어 평면 기하 형상을 생성하는 복수의 세포형을 포함하는 적어도 하나의 층, 및 적어도 하나의 층이 적어도 하나의 다른 층과는 조성적 또는 구조적으로 상이하여 평면 기하 형상을 생성하는 복수의 층 중의 적어도 하나를 형성하는 단계, 및 상기 하나 이상의 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하는 단계를 포함하는, 살아있는 3차원 조직 구조물을 구축하는 방법이 개시되어 있다.
응집된 다세포 응집체의 제조
일부 실시양태에서, 상기 방법은 포유동물 세포의 하나 이상의 형태를 포함하는 응집된 다세포 응집체를 제조하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 평활근 세포를 포함하는 응집된 다세포 응집체를 제조하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 내피 세포를 추가로 포함하는 응집된 다세포 응집체를 제조하는 것을 수반한다(참조: 실시예 3, 4 및 7). 일부 실시양태에서, 상기 방법은 섬유아세포를 추가로 포함하는 응집된 다세포 응집체를 제조하는 것을 수반한다(참조: 실시예 5 및 6).
본원에 기재된 특징을 갖는 다세포 응집체를 제조하는 다양한 방법이 있다. 일부 실시양태에서, 다세포 응집체는 복수의 살아있는 세포를 함유하거나 목적하는 밀도 및 점도를 갖는 세포 페이스트로부터 제조된다. 추가의 실시양태에서, 세포 페이스트는 목적하는 기하 형상으로 성형되고, 다세포체는 성숙(예를 들면, 배양)을 통해 형성된다. 일부 실시양태에서, 다세포 응집체는 실질적으로 원통형이다. 일부 실시양태에서, 다세포 응집체는 실질적으로 리본-기하 형상이다. 일부 실시양태에서, 다세포 응집체는 실질적으로 구형이다. 다른 실시양태에서, 조작된 조직은 광범위한 기하 형상으로 다세포 응집체로부터 구축된다. 특정 실시양태에서, 신장 다세포체는 복수의 살아있는 세포를 포함하는 세포 페이스트를 신장 기하 형상(예를 들면, 원통형, 리본 등)으로 성형함으로써 생산된다. 추가의 실시양태에서, 세포 페이스트는 세포를 서로 부착 및/또는 응집하게 하여 신장 다세포체를 형성하도록 조절된 환경에 배양된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 다세포체는 복수의 살아있는 세포를 포함하는 세포 페이스트를, 상기 세포 페이스트를 3차원 기하 형상으로 유지하는 디바이스에서 성형함으로써 제조된다. 추가의 실시양태에서, 세포 페이스트는, 평편한 표면 위에 자체를 지지하기에 충분한 응집력을 갖는 바디를 생산하기에 충분한 시간 동안 3차원 기하 형상을 유지하는 조절된 환경에서 배양된다.
다양한 실시양태에서, 세포 페이스트는 1) 세포 또는 세포 응집체(하나 이상의 세포형) 및 생체적합성 겔 또는 액체, 예를 들면, 세포 배양 배지(예를 들면, 소정 비)를 수집하여 세포 현탁액을 제공하고, 2) 세포 현탁액을 압축하여 목적하는 세포 밀도 및 점도를 갖는 세포 페이스트를 생산함으로써 제공된다. 다양한 실시양태에서, 압축은 다수의 방법, 예를 들면, 목적하는 세포 농도(밀도), 점도, 및 세포 페이스트에 요구되는 일관성을 달성하기 위해 세포 배양물로부터 생성된 특정 세포 현탁액을 농축시킴으로써 달성된다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물로부터 비교적 묽은 세포 현탁액을 소정 시간 동안 원심분리하여, 금형에서의 성형을 가능하게 하는 펠릿 중의 세포 농도를 달성한다. 접선 유동 여과("TFF")는 세포를 농축 또는 압축하는 또 다른 적합한 방법이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 세포 현탁액과 조합되어 요구된 압출 특성을 제공한다. 적합한 화합물은, 비제한적 예로서, 계면활성제 폴리올, 콜라겐, 하이드로겔, 펩티드 하이드로겔, 아미노산계 겔, 마트리겔TM, 나노섬유, 자가-조립 나노섬유, 젤라틴, 피브리노겐 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 페이스트는 복수의 살아있는 세포를 조직 배양 배지와 혼합하고, 살아있는 세포를 압축(예를 들면, 원심분리에 의해)함으로써 생산된다. 하나 이상의 ECM 성분(또는 ECM 성분의 유도체)은 ECM 성분(들)(또는 ECM 성분(들)의 유도체(들))를 함유하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 완충제에 세포 펠릿을 재현탁시킴으로써 임의로 포함되고, 생성되는 세포 현탁액은 다시 원심분리하여 세포 페이스트를 형성한다.
일부 실시양태에서, 추가 처리를 위해 요구되는 세포 페이스트의 세포 밀도는 세포형에 따라 달라진다. 추가의 실시양태에서, 세포 사이의 상호작용은 세포 페이스트의 특성을 결정하고, 상이한 세포형은 세포 밀도와 세포-세포 상호작용 사이의 상이한 관계를 가질 것이다. 추가의 실시양태에서, 세포는 전처리되어, 세포 페이스트를 성형하기 전에 세포 상호작용을 증가시킨다. 예를 들면, 일부 경우에, 세포는 원심분리 후에 원심분리 튜브 내에서 배양되어, 세포 페이스트를 성형하기 전에 세포-세포 상호작용을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 세포 페이스트는 바이오인쇄과 동시에 성형되고, 여기서 바이오-잉크를 형성하기 위해 서로에 대한 개개 세포의 응집은 바이오인쇄 동안 또는 후에 발생한다.
다양한 실시양태에서, 다수의 방법을 사용하여 세포 페이스트를 성형한다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 세포 페이스트는 수동 성형되거나 가압(예를 들면, 농축/압축 후)되어 목적하는 기하 형상을 달성한다. 세포 페이스트는, 세포 페이스트를 성형하여 당해 장치의 내부 표면에 적합하도록 장치, 예를 들면, 마이크로피펫(예를 들면, 모세관 피펫)에 침지된다. 마이크로피펫(예를 들면, 모세관 피펫)의 단면 기하 형상은 달리는 원형, 정방형, 장방형, 삼각형, 또는 기타 비원형 단면 기하 형상이다. 일부 실시양태에서, 세포 페이스트는 이를 소정 금형, 예를 들면, 플라스틱 금형, 금속 금형 또는 겔 금형에 침착시킴으로써 성형된다. 일부 실시양태에서, 원심분리 주조 또는 연속 주조를 사용하여 세포 페이스트를 성형한다. 일부 실시양태에서, 바이오-잉크의 성형은 바이오인쇄과 동시에 또는 바이오인쇄 후에 발생한다. 추가의 실시양태에서, 바이오-잉크의 성형은 공-인쇄 금형의 결과로서 발생하고, 여기서 금형은 바이오인쇄에 의해 임의로 침착되고, 상기 금형은 겔, 하이드로겔, 합성 폴리머, 카보하이드레이트, 단백질 또는 포유동물 세포 중의 하나 이상을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 공-인쇄된 금형의 하나 이상의 성분은 바이오인쇄 후에 제거되고, 여기서 제거 방법은 물리적 수단, 수성 매질을 사용한 가용화, 화학적 처리, 효소적 처리, 온도 조절 중의 하나로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 규정된 기하 형상의 다세포 응집체는 또한 본원에 기재된, 혈관벽 구역을 포함하는 조직을 구성하는데 적합하다. 구형 다세포 응집체는 임의로, 이로써 한정되지 않지만, 세포 자가-조립, 금형의 사용 및 현적 방법을 포함하는 다양한 방법으로 생성된다. 추가의 실시양태에서, 실질적으로 구형 다세포 응집체를 생산하는 방법은 1) 목적하는 세포 밀도 및 점도를 갖는 복수의 소정 세포 또는 세포 응집체를 함유하는 세포 페이스트를 제공하는 단계, 2) 세포 페이스트를 원통 기하 형상으로 조작하는 단계, 3) 원통을 동등한 단편으로 절단하는 단계, 4) 임의로 상기 단편을 회전 진탕기 상에서 밤새 회전시키는 단계, 5) 실질적으로 구형 다세포 응집체를 성숙을 통해 형성하는 단계를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 세포 응집체는 음향 집속 방법을 통해 생성된다.
일부 실시양태에서, 구역 부착된 및/또는 응집된 세포 페이스트는 바이오인쇄를 위해 사용되고, 여기서 응집 및 바이오-잉크 형성은 주로 인쇄 후에 발생한다. 다른 실시양태에서, 세포 페이스트는 바이오인쇄 전에 제1 단계에서 성형된다. 추가의 실시양태에서, 세포 페이스트는 제1 성형 디바이스(예: 모세관 피펫)으로부터 제2 성형 디바이스(예: 금형)으로 전송되어, 이들을 추가의 제조 기간 동안 제2 성형 디바이스에 유지시키면서 영양소 및/또는 산소가 세포에 공급되도록 한다. 세포에 영양소 및 산소가 공급되도록 하는 적합한 성형 디바이스의 한 가지 예는 복수의 다세포 응집체(예를 들면, 실질적으로 동일한 다세포 응집체)를 생산하는 금형이다. 추가의 예로서, 이러한 금형은 기판으로 세포의 이동 및 내방성장에 내성이 있고 기판에 대한 세포의 부착에 내성이 있는 재료로 제조된 생체적합성 기판을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 기판은 적합하게는 테플론R(PTFE), 스테인레스 강, 노보겔TM, 아가로즈, 폴리에틸렌 글리콜, 유리, 금속, 플라스틱 또는 겔 재료(예: 아가로즈 또는 하이드로겔) 및 유사한 재료로 제조된다. 일부 실시양태에서, 금형은 또한 적합하게는 세포 페이스트에 조직 배양 배지를 공급하도록 배치된다(예를 들면, 금형의 상부에 조직 배양 배지를 분배함으로써).
따라서, 제2 성형 디바이스가 사용되는 실시양태에서, 구역적으로 부착된 및/또는 응집된 세포 페이스트는 제1 성형 디바이스(예를 들면, 모세관 피펫)으로부터 제2 성형 디바이스(예를 들면, 금형)으로 전송된다. 추가의 실시양태에서, 구역적으로 부착된 및/또는 응집된 세포 페이스트는 제1 성형 디바이스(예를 들면, 모세관 피펫)에 의해 금형의 그루브로 전송된다. 추가의 실시양태에서, 금형이 조절 환경에서 내부에 유지된 세포 페이스트와 함께 배양되어 세포 페이스트 중의 세포가 서로 부착 및/또는 응집되도록 함으로써 다세포 응집체를 형성하는 성숙 기간 후에, 세포의 응집은 충분히 강력하여, 생성되는 다세포 응집체가 도구(예를 들면, 모세관 피펫)로 채집되도록 할 것이다. 추가의 실시양태에서, 모세관 피펫은 적합하게는 다세포 응집체를 3차원 구조물로 자동 배치하도록 작동가능한 바이오프린터 또는 유사한 장치의 인쇄 헤드의 일부이다.
일부 실시양태에서, 다세포 응집체의 단면 기하 형상 및 크기는 다세포 응집체의 제조에 사용된 제1 성형 디바이스 및 임의로 제2 성형 디바이스의 단면 기하 형상 및 크기에 실질적으로 상응하고, 당해 기술분야의 당업자는 적합한 단면 기하 형상, 단면적, 직경 및, 상기 언급된 단면 기하 형상, 단면적, 직경 및 길이를 갖는 다세포 응집체를 생성하는데 적합한 길이를 갖는 적합한 성형 디바이스를 선택할 수 있다.
지지체 상으로 응집된 다세포 응집체의 배치
다수의 방법은 목적하는 3차원 구조를 생산하기 위해 지지체 상에 다세포 응집체를 배치하는데 적합하다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 다세포 응집체는 서로 수동으로 배치하고, 피펫, 노즐 또는 바늘로부터 압출에 의해 적소에 침착하거나, 바이오프린터 등의 자동화된, 컴퓨터 보조된 디바이스에 의해 배치한다.
본원에 기재된 바와 같이, 다양한 실시양태에서, 다세포 응집체는 다수의 적합한 기하 형상 및 크기를 가질 것이다. 일부 실시양태에서, 다세포 응집체는, 비제한적 예로서, 원형, 타원형, 정방형, 삼각형, 다각형 및 불규칙형을 포함하는 임의의 일부 적합한 단면 기하 형상으로 신장한다. 추가의 실시양태에서, 다세포 응집체는 원통형 형태로 신장한다. 일부 실시양태에서, 신장 다세포 응집체는 유사한 길이 및/또는 직경을 갖는다. 다른 실시양태에서, 신장 다세포 응집체는 상이한 길이 및/또는 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 다세포 응집체는 실질적으로 구형이다. 일부 실시양태에서, 조작된 조직(예를 들면, 혈관벽 구역 등)은 크기가 실질적으로 유사한 실질적으로 구형 다세포 응집체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조작된 조직(예를 들면, 혈관벽 구역 등)은 크기가 상이한 실질적으로 구형 다세포 응집체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상이한 기하 형상 및 크기의 조작된 조직(예를 들면, 혈관벽 구역 등)은 다양한 기하 형상 및 크기의 다세포 응집체를 배열함으로써 형성된다.
일부 실시양태에서, 응집된 다세포 응집체는 지지체 상에 배치된다. 다양한 실시양태에서, 지지체는 임의의 적합한 생체적합성 표면이다. 추가의 실시양태에서, 적합한 생체적합성 표면은, 비제한적 예로서, 폴리머 재료, 다공성 막, 플라스틱, 유리, 금속, 하이드로겔 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지지체는, 비제한적 예로서, 하이드로겔, 단백질, 화학물질, 펩티드, 항체, 성장 인자 또는 이들의 조합을 포함하는 생체적합성 물질로 피복된다. 한 가지 실시양태에서, 지지체는 노보겔TM으로 피복된다. 또 다른 실시양태에서, 지지체는 아가로즈로 피복된다. 한 가지 실시양태에서, 응집된 다세포 응집체는 생체적합성 다중-웰 용기의 웰에 배치된다.
응집된 다세포 응집체의 배치가 완료되면, 일부 실시양태에서, 조직 배양 배지를 구조물의 상부에 부어 넣는다. 추가의 실시양태에서, 조직 배양 배지는 다세포체 중의 세포를 지지하기 위해 다세포체 사이의 공간에 도입한다.
제1 세포형의 층 및/또는 제2 세포형의 층을 적용한다.
다수의 방법은 응집된 포유동물 세포 구조물의 하나 이상의 외부 표면 위에 하나 이상의 세포 층을 적용하는데 적합하다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 세포 층의 적용은 세포의 현탁액, 시트, 단층 또는 융합된 응집체로 상기 응집된 다세포 응집체의 하나 이상의 표면을 피복하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 응집된 포유동물 세포 구조물의 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 표면이 피복된다.
일부 실시양태에서, 세포 층의 적용은 융합된 다세포 응집체의 추가의 층을 바이오인쇄하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포 층의 적용은 세포의 용액, 현탁액 또는 액체 농축물을 바이오인쇄, 분무 또는 잉크-젯팅하는 것을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 적합한 세포 현탁액은 약 1×104 내지 약 1×105 세포/㎕를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 적합한 세포 현탁액은 약 1×105 내지 약 1.5×105 세포/㎕를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 세포 층의 적용은 공간적으로 분포된 액적으로 응집된 포유동물 세포 구조물의 하나 이상의 표면에 세포 현탁액을 직접 분배하는 것을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 세포 층의 적용은 분무로서 응집된 포유동물 세포 구조물의 하나 이상의 표면에 세포 현탁액을 직접 분배하는 것을 포함한다. 세포 층은, 다양한 실시양태에서, 구성 공정에서 임의의 적합한 시간에 적용된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포 층은 바이오인쇄 직후(예를 들면, 10분 이내)에 응집된 포유동물 세포 구조물의 하나 이상의 외부 표면에 적용된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 층은 바이오인쇄 후(예를 들면, 10분 후)에 적용된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 층은 구조물의 성숙 동안 적용된다.
임의의 세포형은 바이오-잉크로서 바이오인쇄함으로써 층으로 적용하기에 적합하다. 더욱이, 임의의 세포영은 현탁액, 용액 또는 농축물의 액적으로서 침착에 의해, 또는 현탁액, 용액 또는 농축물로서 분무에 의해 층으로 적용하는데 적합하다. 일부 실시양태에서, 섬유아세포는 응집된 포유동물 세포 구조물의 하나 이상의 외부 표면 위에 하나 이상의 세포 층으로 적용된다. 다른 실시양태에서, 내피 세포는 응집된 포유동물 세포 구조물의 하나 이상의 외부 표면에 하나 이상의 세포 층으로 적용된다. 추가의 실시양태에서, 내피 세포의 층은 응집된 포유동물 세포 구조물의 하나 이상의 외부 표면에 적용되고, 섬유아세포의 층은 구조물의 하나 이상의 상이한 표면에 적용된다.
실시예 9는 응집된 평활근 세포 응집체로 바이오인쇄된 혈관벽 구조물을 입증하고, 이는 내피 세포 농축물(예를 들면, 1-1.5×105 세포/㎕)로 추가로 피복된다. 실시예 9의 기술은 SMC 및 EC의 피복으로 구성된 혈관벽 구조물을 생성했다(예를 들면, 추정의 중막 및 내막)(참조: 도 3 및 4B).
실시예 10은 응집된 인간 대동맥 평활근 세포 응집체로 바이오인쇄된 혈관벽 구조물을 입증한다. 추가로, 현탁액 중의 인간 대동맥 내막 세포는 2.5㎕ 액적으로서 평활근 원통형 바이오-잉크의 상부에 바이오인쇄로부터 분배된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포 층을 지지체 위에서 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 실시양태에서, 세포 층의 적용은, 일부 경우에, 응집된 평활근 세포 구조물의 하나 이상의 표면을 세포의 확립된 배양물과 접촉하여 직접 배치하는 것을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 구조물은 세포의 배양된 층 또는 세포의 단층 위에 직접 바이오인쇄된다. 생체적합성 지지체 상의 임의 형태의 배양된 세포 층이 적합하다. 일부 실시양태에서, 상기 다세포 응집체는 재피 세포의 층 위에 바이오인쇄된다. 다른 실시양태에서, 상기 다세포 응집체는 섬유아세포의 층 위에 바이오인쇄된다. 추가의 실시양태에서, 상기 세포의 층은 바이오인쇄된 구조물의 다세포 응집체와 부착하고/하거나 응집시킨다. 일부 실시양태에서, 다층 구조물의 각각의 층은 바이오인쇄된다. 추가의 실시양태에서, 개개 층은 가변 형태의 바이오-잉크를 포함하고, 이로써 한정되지 않지만, 응집된 세포 응집체, 세포 페이스트, 압출 화합물(들) 또는 기타 첨가제와 조합된 세포 페이스트, 세포 단층 또는 세포 시트를 포함한다.
실시예 11은 실시예 10의 동일한 구조물의 구성을 입증한다. 그러나, 당해 구조물은 인간 피부 섬유아세포의 컨플루언트 단층이 사전 배양된 지지체 상에 바이오인쇄된다. 실시예 11의 기술은 SMC 및 EC와 Fb의 피막으로 구성된 혈관벽 구조물을 생성했다(예를 들면, 추정의 중막, 내막 및 외막)(참조: 4a 및 4b).
다세포 응집체의 배양
일부 실시양태에서, 다세포 응집체가 배양된다. 추가의 실시양태에서, 배양은 혈관벽 구역 등의 조직을 형성하기 위해 다세포 응집체가 부착 및/또는 응집하는 것을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 상기 다세포 응집체는 세포 배양 환경(예를 들면, 페트리 접시, 세포 배양 플라스크, 바이오반응기 등)에서 조직을 형성하기 위해 응집한다. 추가의 실시양태에서, 상기 다세포 응집체는 응집하여, 다세포 응집체에 포함된 세포형의 성장을 촉진하는데 적합한 조건하에서 환경 내의 조직을 형성한다. 한 가지 실시양태에서, 상기 다세포 응집체는 부착 및/또는 응집을 촉진하는 인자 및/또는 이온을 함유하는 세포 배양 배지의 존재하에 약 5% CO2를 함유하는 가습 분위기 중에서 역 37℃로 배양된다. 다른 실시양태에서, 상기 다세포 응집체는 0.1% 내지 21% O2를 함유하는 환경에서 유지된다.
배양은, 다양한 실시양태에서, 임의의 적합한 기간을 갖는다. 추가의 다양한 실시양태에서, 배양은 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180분 또는 그 이상(이들 범위 내의 증분 포함)의 기간을 갖는다. 추가의 다양한 실시양태에서, 배양은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 36, 48시간 또는 그 이상(이들 범위 내의 증분 포함)의 기간을 갖는다. 추가의 다양한 실시양태에서, 배양은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 또는 그 이상(이들 범위 내의 증분 포함)의 기간을 갖는다. 일부 인자는 조직을 형성하기 위해 다세포 응집체의 응집에 필요한 시간에 영향을 미치고, 비제한적 예로서, 세포형, 세포형 비, 배양 조건 및 성장 인자 등의 첨가제의 존재를 포함한다.
조작된 조기의 생존력을 증가시키는 추가 단계
일부 실시양태에서, 상기 방법은 조작된 조직의 생존력을 증가시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 이들 단계는 밀폐 재료의 일시적 또는 반영구적 격자를 통한 조직 및 영양소 배지 사이의 직접 접촉을 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직은 다공성 또는 갭 재료로 제한된다. 영양소에 대한 조작된 조직의 적어도 일부의 직접 접근은 조작된 조직의 생존력을 증가시킨다.
추가의 실시양태에서, 조작된 조직의 생존력을 증가시키는 추가의 및 임의의 단계는 1) 응집된 다세포 응집체를 배치하기 전에 밀폐 재료의 기저 층을 임의로 분배하고, 2) 밀폐 재료의 주위를 임의로 분배하고, 3) 정의된 기하 형상 내의 조직 세포를 바이오인쇄하고, 4) 격자, 메쉬 또는 그리드 등의 밀폐 재료에 갭을 도입하는 패턴으로 신생 조직을 중첩하는 밀폐 재료의 신장 바디(원통형, 리본 등)을 분배하는 것을 포함한다(참조: 실시예 12 및 도 5).
다수의 밀폐 재료는 본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합하다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔은, 비-부착성, 생체적합성, 압출가능성, 생물인쇄성, 비세포성, 적절한 강도, 및 수성 조건에서 비용해성을 포함하는 하나 이상의 유리한 특성을 갖는 예시적 밀폐 재료이다. 일부 실시양태에서, 적합한 하이드로겔은 천연 폴리머이다. 한 가지 실시양태에서, 밀폐 재료는 노보겔TM으로 구성된다. 추가의 실시양태에서, 적합한 하이드로겔은 계면활성제 폴리올, 예를 들면, 플루로닉 F-127, 콜라겐, 히알루로네이트, 피브린, 알기네이트, 아가로즈, 키토산 및 이들의 유도체 또는 조합으로부터 유래된 것들을 포함한다. 다른 실시양태에서, 적합한 하이드로겔은 합성 폴리머이다. 추가의 실시양태에서, 적합한 하이드로겔은 폴리(아크릴산) 및 이의 유도체, 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 이의 공중합체, 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠 및 이들의 조합으로부터 유래된 것들을 포함한다. 다양한 특정 실시양태에서, 밀폐 재료는 하이드로겔, 노보겔TM, 아가로즈, 알기네이트, 젤라틴, 마트리겔TM, 히알루로난, 폴록사머, 펩티드 하이드로겔, 폴리(이소프로필 n-폴리아크릴아미드), 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEG-DA), 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리디메틸실록산, 폴리아크릴아미드, 폴리(락트산), 규소, 실크 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 패턴을 중첩하는 갭은 조직의 표면 주위에 균일하게 또는 실질적으로 균일하게 분포된다. 다른 실시양태에서, 갭은 불균일하게 분포되고, 이에 의해 조직 세포는 영양소에 불균일하게 노출된다. 불균일 실시양태에서, 영양소에 대한 차동 접근은 조직의 하나 이상의 특성에 영향을 주기 위해 임의로 이용된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 바이오인쇄된 조직의 하나의 표면 위의 세포가 바이오인쇄된 조직의 또 다른 표면 위에 세포보다 더 빠르게 증식하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 영양소에 대한 조직의 다양한 구역의 노출은 목적하는 종점을 향해 조직의 개발에 영향을 주도록 다양한 시간에 변화된다.
일부 실시양태에서, 상기 밀폐 재료는, 이로써 한정되지 않지만, 바이오인쇄 직후(예를 들면, 10분 이내), 바이오인쇄 후(예를 들면, 10분 후), 세포가 서로 실질적으로 응집하기 전, 세포가 서로 실질적으로 응집한 후, 세포가 세포외 매트릭스를 생산하기 전, 세포가 세포외 매트릭스를 생산한 후, 사용 직전 등을 포함하는 임의의 적합한 시간에서 제거된다. 다양한 실시양태에서, 밀폐 재료는 임의의 적합한 방법으로 제거된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 밀폐 재료는 제거되거나, 세포 외부로 인출되거나, 소화되거나, 용해된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 측면에서 조작된 조직(예를 들면, 혈관벽 구역 등)에 유체 유동에 의해 유발된 전단력을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
특별한 예시적 실시양태
특정 실시양태에서, 살아있는 3차원 조직이 본원에 기재되고, 상기 조직 중의 적어도 하나의 성분이 바이오인쇄되고, 상기 조직이 혈관 튜브는 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 실질적으로 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 바이오인쇄시에 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 사용시에 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 임의의 실시양태에서, 상기 조직의 적어도 하나의 성분은 층상 또는 평면 기하 형상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 하나 이상의 측면 위의 생체적합성 표면에 고정시킨다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 다공성 막이다. 추가의 실시양태에서, 상기 조직은 하나 이상의 측면 위에서 유체 유동에 의해 유발되는 전단력을 적용한다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 25㎛이다. 추가의 실시양태에서, 상기 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 100㎛이다. 추가의 실시양태에서, 상기 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 250㎛이다. 추가의 실시양태에서, 상기 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 500㎛이다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 바이오인쇄시 이의 최대 치수가 3.0cm 미만이다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 평활근 세포 및 내피 세포를 포함하고, 여기서 평활근 세포 대 내피 세포의 비는 약 90:10 내지 약 60:40이다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 평활근 세포 및 내피 세포를 포함하고, 여기서 평활근 세포 대 내피 세포의 비는 약 85:15이다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 평활근 세포 및 내피 세포를 포함하고, 여기서 평활근 세포 대 내피 세포의 비는 약 70:30이다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 평활근 세포 및 섬유아세포를 포함하고, 여기서 평활근 세포 대 섬유아세포의 비는 약 90:10 내지 약 60:40이다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포를 포함하고, 여기서 평활근 세포 대 섬유아세포 및 내피 세포의 비는 약 70:25:5이다. 일부 실시양태에서, 상기 조직은 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 조직은 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 조직은 심혈관 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포는 성인 분화 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포는 성인 비분화 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 평활근 세포는 인간 평활근 세포이다. 추가의 실시양태에서, 평활근 세포는 혈액, 혈관, 림프관, 소화관 조직, 뇨생식관 조직, 지방 조직, 기도 조직, 생식계 조직, 중배엽 유래 조직, 골수 및 제대 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 상기 내피 세포는 인간 내피 세포이다. 추가의 실시양태에서, 내피 세포는 혈액, 혈관, 림프관, 소화관 조직, 뇨생식관 조직, 지방 조직, 기도 조직, 생식계 조직, 중배엽 유래 조직, 골수 및 제대 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포이다. 기타 실시양태에서, 상기 섬유아세포는 혈관 외막으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 상기한 세포형 중의 하나 이상은 특별한 척추동물 피험체로부터 유래된다. 추가의 실시양태에서, 세포는 심혈관계에 영향을 미치는 질환 또는 상태를 갖는 척추동물 대상체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 특별한 질환 상태를 모방하기 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 특별한 질환 상태를 모방하기 위해 배열된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 특별한 질환 상태를 모방하는 방식으로 처리되거나 조절된다.
특정 실시양태에서, 살아있는 3차원 조직의 어레이가 본원에서 기재되고, 여기서 각각의 상기 조직은 하나 이상의 형태의 포유동물 세포를 포함하고, 상기 세포는 서로 응집되고, 각각의 상기 조직의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되고, 각각의 상기 조직은 배양물에 유지된다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직은 사용시에 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 간장 세포, 위장 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 폐 세포, 기관 세포, 혈관 세포, 골격근 세포, 심장 세포, 피부 세포, 평활근 세포, 결합 조직 세포, 각막 세포, 뇨생식 세포, 생식 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유아세포, 신경 세포, 슈완(Schwann) 세포, 지방 세포, 골 세포, 골수 세포, 연골 세포, 혈관 주위 세포, 간엽 세포, 중피 세포, 간질 세포, 간세포, 전구 세포, 림프 세포, 혈액 세포, 종양 유래 세포 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직은 실질적으로 유사하다. 기타 실시양태에서, 어레이 내의 하나 이상의 조직은 독특하다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 개별 조직은 인체에서 하나 이상의 특정 조직을 나타낸다. 추가의 실시양태에서, 어레이 내의 하나 이상의 개별 조직은 혈관 또는 림프관, 근육, 자궁, 신경, 점막, 중피, 대망, 각막, 피부, 간장, 신장, 심장, 기관, 폐, 골, 골수, 지방, 결합, 방광, 유방, 췌장, 비장, 뇌, 식도, 위, 창자, 결장, 직장, 난소, 및 전립선으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인간 조직을 나타내고, 여기서, 조직 각각은 임의로 특정 질환 상태(예: 섬유증, 암, 염증 등)의 조성적 또는 구조적 특징을 도입한다. 일부 실시양태에서, 각 조직은 생체적합성 다중-웰 용기의 웰에 존재한다. 추가의 실시양태에서, 웰은 다음 중의 하나로 피복된다: 생체적합성 하이드로겔, 단백질, 화학물질, 펩티드, 항체 또는 성장 인자. 추가의 실시양태에서, 웰은 아가로즈로 피복된다. 일부 실시양태에서, 각 조직은 상기한 용기의 상기 웰 내의 다공성 생체적합성 막 위에 배치했다. 일부 실시양태에서, 용기는 자동화된 약물 스크리닝과 호환성이 있다. 일부 실시양태에서, 각 조직은 하나 이상의 측면 위의 생체적합성 표면에 고정시킨다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 다공성 막이다. 추가의 실시양태에서, 각 조직은 하나 이상의 측면에서 유체 유동에 의해 유발되는 전단력에 적용한다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 조직은 둘 이상의 상이한 인간 공여체로부터 유도된 하나 이상의 세포형으로 생성된다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직은 배양액에 독립적으로 유지시킨다. 기타 실시양태에서, 어레이 내의 둘 이상의 개별 조직은 가용성 인자를 교환한다. 일부 실시양태에서, 어레이는 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 어레이는 약물 시험에 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원에는, 포유동물 세포를 포함하는 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계; 상기 응집된 다세포 응집체를 생체적합성 지지체 위에 배치하고, 여기서 상기 응집체가 조직 어레이에 적합한 형태로 공간적으로 배열되는 단계; 상기 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 3차원 조직의 어레이를 형성하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 배양이 약 2시간 내지 약 10일의 기간을 갖는, 살아있는 3차원 포유동물 조직의 어레이를 구축하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있다. 추가의 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직은 실질적으로 사용시에 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 각종 실시양태에서, 어레이는 2 내지 500개의 상이한 조직을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 조직은 소정의 패턴으로 공간적으로 배열된다. 추가의 실시양태에서, 조직은 행과 열의 격자상으로 배열된다. 일부 실시양태에서, 응집된 다세포 응집체는 하나의 세포형을 포함한다. 기타 실시양태에서, 응집된 다세포 응집체는 하나 이상의 세포형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 응집된 다세포 응집체는 실질적으로 구형이고/이거나 실질적으로 원통형이다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 지지체는 폴리머 재료, 다공성 막, 플라스틱, 유리, 금속 또는 하이드로겔로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 25㎛이다. 추가의 실시양태에서, 각 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 150㎛이다. 추가의 실시양태에서, 각 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 250㎛이다. 추가의 실시양태에서, 각 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 500㎛이다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직은 배양물에 유지시킨다. 일부 실시양태에서, 당해 방법은 각각의 상기 조직을 하나 이상의 측면 위에서 유체 유동에 의해 유발된 전단력에 적용하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에는, 평활근 세포, 및 임의로 섬유아세포 및 내피 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포형을 포함하는 살아있는 3차원 혈관벽 구역이 개시되어 있고, 여기서 상기 세포는 서로 응집되고, 상기 혈관벽 구역의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있고, 상기한 혈관벽 구역이 비관형이다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 실질적으로 평면이다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 하나 이상의 측면 위에서 생체적합성 표면에 고정시킨다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 다공성 막이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 하나 이상의 측면 위에서 유체 유동에 의해 유발된 전단력에 적용된다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 25㎛이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 150㎛이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 250㎛이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 500㎛이다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 평활근 세포 및 내피 세포를 포함하고, 여기서 평활근 세포 대 내피 세포의 비는 약 90:10 내지 약 60:40이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 평활근 세포 및 내피 세포를 포함하고, 여기서 평활근 세포 대 내피 세포의 비는 약 85:15이다. 기타 실시양태에서, 혈관벽 구역은 평활근 세포 및 내피 세포를 포함하고, 여기서 평활근 세포 대 내피 세포의 비는 약 70:30이다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 평활근 세포 및 섬유아세포를 포함하고, 여기서 평활근 세포 대 섬유아세포의 비는 약 90:10 내지 약 60:40이다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포를 포함하고, 여기서 평활근 세포 대 섬유아세포 및 내피 세포의 비는 약 70:25:5이다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 심혈관 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포는 성인 분화 세포이다. 기타 실시양태에서, 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포는 성인 비분화 세포이다. 일부 실시양태에서, 평활근 세포는 인간 평활근 세포이다. 추가의 실시양태에서, 평활근 세포는 혈액, 혈관, 림프관, 소화관 조직, 뇨생식관 조직, 지방 조직, 기도 조직, 생식계 조직, 골수 및 제대 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 내피 세포는 인간 내피 세포이다. 추가의 실시양태에서, 내피 세포는 혈액, 혈관, 림프관, 소화관 조직, 뇨생식관 조직, 지방 조직, 기도 조직, 생식계 조직, 골수 및 제대 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포이다. 일부 실시양태에서, 섬유아세포는 혈관 외막으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포는 특별한 척추동물 대상체로부터 유래된다. 추가의 실시양태에서, 상기한 세포형 중의 하나 이상은 심혈관계에 영향을 미치는 질환 또는 상태를 갖는 척추동물 대상체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포는 특별한 질환 상태를 모방하기 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포는 특별한 질환 상태를 모방하기 위해 배열된다. 일부 실시양태에서, 세포는 특별한 질환 상태를 모방하는 방식으로 처리되거나 조절된다.
특정 실시양태에서, 본원에는 살아있는 3차원 혈관벽 구역의 어레이가 개시되어 있고, 여기서 각각의 상기한 혈관벽 구역은 평활근 세포, 및 임의로 섬유아세포 및 내피 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포형을 포함하고, 상기 세포는 서로 응집되고, 각각의 상기한 혈관벽 구역은 조작된다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각각의 혈관벽 구역의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있다. 추가의 실시양태에서, 어레이 내의 각각의 혈관벽 구역은 사용시에 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 각각의 혈관벽 구역은 생체적합성 다중-웰 용기의 웰 내에 존재한다. 추가의 실시양태에서, 웰은 다음 중의 하나로 피복된다: 생체적합성 하이드로겔, 단백질, 화학물질, 펩티드, 항체 또는 성장 인자. 추가의 실시양태에서, 웰은 노보겔TM으로 피복된다. 기타 실시양태에서, 웰은 아가로즈로 피복된다. 일부 실시양태에서, 각 혈관벽 구역은 상기한 용기의 상기 웰 내의 다공성 생체적합성 막 위에 배치했다. 추가의 실시양태에서, 용기는 자동화된 약물 스크리닝과 호환성이 있다. 일부 실시양태에서, 각 혈관벽 구역은 하나 이상의 측면 위의 생체적합성 표면에 고정시킨다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 다공성 막이다. 추가의 실시양태에서, 각 혈관벽 구역은 하나 이상의 측면에서 유체 유동에 의해 유발되는 전단력에 적용한다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 혈관벽 구역은 실질적으로 유사하다. 기타 실시양태에서, 어레이 내의 하나 이상의 혈관벽 구역은 독특하다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 혈관벽 구역은 인체에서 하나 이상의 상이한 혈관 조직을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 혈관벽 구역은 둘 이상의 상이한 인간 공여체로부터 유도된 하나 이상의 세포형으로 생성된다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 혈관벽 구역은 배양액에 독립적으로 유지시킨다. 기타 실시양태에서, 어레이 내의 둘 이상의 개별 혈관벽 구역은 가용성 인자를 교환한다. 일부 실시양태에서, 어레이는 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 어레이는 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 어레이는 심혈관 약물 시험에 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원에는, 평활근 세포를 포함하는 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계; 상기 응집된 다세포 응집체를 지지체 위에 배치하는 단계; 상기 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 혈관벽 구역을 형성하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 배양이 약 2시간 내지 약 10일의 기간을 갖는, 살아있는 3차원 혈관벽 구역을 구축하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 시험관내 분석에 사용되고, 사용시에 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 응집된 다세포 응집체는 내피 세포를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 응집된 다세포 응집체는 섬유아세포를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 응집된 다세포 응집체는 실질적으로 구형 또는 실질적으로 원통형이다. 일부 실시양태에서, 응집된 다세포 응집체는 생체적합성 표면 위에 배치된다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 지지체는 폴리머 재료, 다공성 막, 플라스틱, 유리, 금속 또는 하이드로겔로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 50㎛이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 150㎛이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 266㎛이다. 기타 실시양태에서, 혈관벽 구역은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 500㎛이다. 일부 실시양태에서, 당해 방법은 상기 혈관벽 구역을 하나 이상의 측면 위에서 유체 유동에 의해 유발된 전단력에 적용하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에는, 서로 응집되어 있는 평활근 세포, 및 하나 이상의 표면 위에 내피 세포의 층과 하나 이상의 표면 위에 섬유아세포의 층 중의 하나 이상을 포함하는 살아있는 3차원 조직이 개시되어 있고, 여기서 상기 조직의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있고, 상기한 조직은 튜브가 아니다. 일부 실시양태에서, 조직은 실질적으로 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조직은 바이오인쇄시 실질적으로 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조직은 사용시 실질적으로 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조직은 실질적으로 평면이다. 일부 실시양태에서, 내피 세포의 층은 단층, 하나 이상의 시트 또는 내피 세포의 융합된 응집체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직은 상기한 조직의 하나 이상의 표면 위에 내피 세포의 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 섬유아세포의 층은 단층, 하나 이상의 시트, 또는 섬유아세포의 융합된 응집체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직은 상기 조직의 하나 이상의 표면 위에 섬유아세포의 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조직은 내피 세포의 층과 섬유아세포의 층을 포함하고, 여기서 상기한 내피 세포의 층은 상기한 조직의 하나 이상의 외부 표면 위에 존재하고, 상기한 섬유아세포의 층은 상기한 조직의 하나 이상의 상이한 표면 위에 존재한다. 일부 실시양태에서, 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 50㎛이다. 추가의 실시양태에서, 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 150㎛이다. 추가의 실시양태에서, 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 250㎛이다. 추가의 실시양태에서, 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 500㎛이다. 일부 실시양태에서, 조직은 하나 이상의 측면 위의 생체적합성 표면에 고정시킨다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 다공성 막이다. 추가의 실시양태에서, 조직을 하나 이상의 측면 위에서 유체 유동에 의해 유발된 전단력에 적용한다. 일부 실시양태에서, 조직은 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 조직은 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 조직은 심혈관 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포는 성인 분화 세포이다. 일부 실시양태에서, 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포는 성인 비분화 세포이다. 일부 실시양태에서, 평활근 세포는 인간 평활근 세포이다. 추가의 실시양태에서, 평활근 세포는 혈액, 혈관 조직, 혈관, 림프관, 소화관 조직, 뇨생식관 조직, 지방 조직, 기도 조직, 생식계 조직, 골수, 근조직, 결합 조직, 중배엽 유래 조직 및 제대 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 내피 세포는 인간 내피 세포이다. 추가의 실시양태에서, 내피 세포는 혈관 조직, 혈액, 혈관, 림프관, 소화관 조직, 뇨생식관 조직, 지방 조직, 기도 조직, 생식계 조직, 중배엽 유래 조직, 골수 및 제대 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포이다. 기타 실시양태에서, 섬유아세포는 혈관 외막으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포는 특별한 척추동물 대상체로부터 유래된다. 추가의 실시양태에서, 세포는 심혈관계에 영향을 미치는 질환 또는 상태를 갖는 척추동물 대상체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포는 특별한 질환 상태를 모방하기 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포는 특별한 질환 상태를 모방하기 위해 배열된다. 일부 실시양태에서, 세포는 특별한 질환 상태를 모방하는 방식으로 처리되거나 조절된다.
특정 실시양태에서, 본원에는 살아있는 3차원 조직의 어레이가 개시되어 있고, 여기서 각각의 상기 조직은 서로 응집되어 있는 포유동물 세포, 및 하나 이상의 표면 위에 포유동물 세포의 제1 형태의 층과 하나 이상의 표면 위에 포유동물 세포의 제2 형태의 층 중의 하나 이상을 포함하고, 여기서 각각의 상기 조직의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있고, 각각의 상기한 조직은 배양물에 유지시킨다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직은 사용시에 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 혈관 조직, 혈액, 혈관, 림프관, 소화관 조직, 뇨생식관 조직, 지방 조직, 기도 조직, 생식계 조직, 골수, 근조직, 간엽 조직, 결합 조직, 중배엽 유래 조직 및 제대 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 유래된 평활근 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 혈관 조직, 혈액, 혈관, 림프관, 소화관 조직, 뇨생식관 조직, 지방 조직, 기도 조직, 생식계 조직, 중배엽 유래 조직, 골수 및 제대 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 유래된 내비 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 비혈관 섬유아세포를 포함한다. 기타 실시양태에서, 포유동물 세포는 혈관 섬유아세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 혈관 섬유아세포는 혈관 외막으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직은 실질적으로 유사하다. 기타 실시양태에서, 어레이 내의 하나 이상의 조직은 독특하다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 개별 조직은 인체에서 하나 이상의 특정 조직을 나타낸다. 추가의 실시양태에서, 어레이 내의 하나 이상의 개별 조직은 혈액 또는 림프관, 근육, 자궁, 신경, 점막, 중피, 대망, 각막, 피부, 간장, 신장, 심장, 기관, 폐, 골, 골수, 지방, 결합, 방광, 유방, 췌장, 비장, 뇌, 식도, 위, 창자, 결장, 직장, 난소 및 전립선으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인간 조직을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 각 조직은 생체적합성 다중-웰 용기의 웰에 존재한다. 추가의 실시양태에서, 웰은 다음 중의 하나로 피복된다: 생체적합성 하이드로겔, 단백질, 화학물질, 펩티드, 항체 또는 성장 인자. 일부 실시양태에서, 웰은 노보겔TM으로 피복된다. 추가의 실시양태에서, 웰은 아가로즈로 피복된다. 일부 실시양태에서, 각 조직은 용기의 웰 내의 다공성 생체적합성 막 위에 배치했다. 일부 실시양태에서, 용기는 자동화된 약물 스크리닝과 호환성이 있다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직은 하나 이상의 측면 위의 생체적합성 표면에 고정시킨다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 다공성 막이다. 추가의 실시양태에서, 각 조직은 하나 이상의 측면에서 유체 유동에 의해 유발되는 전단력에 적용한다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 조직은 둘 이상의 상이한 인간 공여체로부터 유도된 하나 이상의 세포형으로 생성된다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 조직은 배양액에 독립적으로 유지시킨다. 기타 실시양태에서, 어레이 내의 둘 이상의 개별 조직은 가용성 인자를 교환한다. 일부 실시양태에서, 어레이는 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 어레이는 약물 시험에 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원에는, 포유동물 세포를 포함하는 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계; 상기 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 지지체 위에 배치하는 단계; 상기 하나 이상의 응집된 다세포 응집체에 하나 이사으이 외부 표면 위에 포유동물 세포의 제1 형태의 층과 하나 이상의 외부 표면 위의 포유동물 세포의 제2 형태의 층 중의 하나 이상을 적용하는 단계; 및 상기 하나 이상의 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 조직을 형성하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 배양이 약 2시간 내지 약 10일의 기간을 갖는, 살아있는 3차원 조직을 구축하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조직의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있다. 일부 실시양태에서, 조직은 제조시에 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 추가의 실시양태에서, 조직은 제조시에 실질적으로 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 기타 실시양태에서, 조직은 사용시에 실질적으로 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 50㎛이다. 추가의 실시양태에서, 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 150㎛이다. 추가의 실시양태에서, 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 250㎛이다. 기타 실시양태에서, 조직은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 500㎛이다. 추가의 실시양태에서, 조직은 최소 치수가 약 50㎛ 내지 약 600㎛의 길이, 너비 또는 높이 또는 두께를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 조직은 1mm를 초과하는 길이, 너비, 높이 또는 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 세포형의 응집된 다세포 응집체는 간질 세포, 결합 조직 유래 세포, 중배엽 기원 세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 응집된 다세포 응집체는 추가로 제2 세포형을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 제2 세포형(들)은 상피 조직, 내피 조직 또는 간엽 조직 또는 외배엽 조직으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포의 층의 적용은 응집된 다세포 응집체의 적어도 하나의 표면을 현탁액, 단층, 하나 이상의 시트, 다중 층 또는 세포의 융합된 응집체로 피복시킴을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 현탁액은 약 1 × 104 내지 약 1 × 106세포/㎕를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 현탁액은 약 1 × 105 내지 약 1.5 × 105세포/㎕를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포 층의 적용은 세포의 현탁액을 상기 응집된 다세포 응집체의 한 표면 위에 직접 공간적으로 분포된 소적으로서 분배함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포 층의 적용은 세포의 현탁액을 상기 응집된 다세포 응집체의 한 표면 위에 직접 스프레이로서 분배함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포 층의 적용은 상기 응집된 다세포 응집체의 하나 이상의 표면을 세포의 확립된 층과 직접 접촉시켜 배치함을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 세포의 확립된 층은 단층, 다중 층, 하나 이상의 시트 또는 세포의 융합된 응집체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 형태의 층을 상기 응집된 다세포 응집체의 하나 이상의 표면에 적용하고, 세포의 제2 형태의 층을 상기 응집된 다세포 응집체의 하나 이상의 상이한 표면에 적용한다. 일부 실시양태에서, 배양은 약 2시간 내지 약 10일 기간을 갖는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표면 위의 세포의 제1 형태의 층 및 하나 이상의 표면 위의 세포의 제2 형태의 층 중의 하나 이상을 적용하는 단계는 하나 이상의 응집된 다세포 응집체가 배치될 때 수행된다. 기타 실시양태에서, 하나 이상의 외부 표면 위의 세포의 제1 형태의 층 및 하나 이상의 외부 표면 위의 세포의 제2 형태의 층 중의 하나 이상을 적용하는 단계는 상기 배양 동안 수행된다. 일부 실시양태에서, 당해 방법은 조직을 하나 이상의 측면 위에서 유체 유동에 의해 유발되는 전단력에 적용하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에는, 서로 응집된 평활근 세포, 및 하나 이상의 표면 위의 내피 세포의 층 및 하나 이상의 표면 위의 섬유아세포의 층 중의 하나 이상을 포함하는 살아있는 3차원 혈관벽 구역이 개시되어 있고, 여기서 상기 혈관벽 구역의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있고, 상기 혈관벽 구역은 비관형이다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 제조시 실질적으로 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 기타 실시양태에서, 혈관벽 구역은 사용시에 실질적으로 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 실질적으로 평면이다. 일부 실시양태에서, 내피 세포의 층은 단층, 하나 이상의 층, 하나 이상의 시트 또는 내피 세포의 융합된 응집체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 하나 이상의 표면 위에 내피 세포의 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 섬유아세포의 층은 단층, 하나 이상의 층, 하나 이상의 시트 또는 섬유아세포의 융합된 응집체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 상기 혈관벽 구역의 하나 이상의 표면 위에 섬유아세포의 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 내피 세포의 층 및 상기 섬유아세포의 층을 포함하고, 여기서 상기 내피 세포의 층은 상기 혈관벽 구역의 하나 이상의 외부 표면에 존재하고, 상기 섬유아세포의 층은 상기 혈관벽 세그먼크의 하나 이상의 상이한 표면에 존재한다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 50㎛이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 150㎛이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 250㎛이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 바이오인쇄시 이의 최소 치수가 적어도 약 500㎛이다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 하나 이상의 측면 위의 생체적합성 표면에 고정시킨다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 다공성 막이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 하나 이상의 측면에서 유체 유동에 의해 유발된 전단력에 적용한다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 구역은 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 혈관벽 구역은 심혈관 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포는 성인 분화 세포이다. 기타 실시양태에서, 평활근 세포, 섬유아세포 및 내피 세포는 성인 비분화 세포이다. 일부 실시양태에서, 평활근 세포는 인간 평활근 세포이다. 추가의 실시양태에서, 평활근 세포는 혈관조직, 혈액, 혈관, 림프관, 소화관 조직, 뇨생식관 조직, 지방 조직, 기도 조직, 생식계 조직, 골수, 근조직, 결합 조직 및 제대 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 내피 세포는 인간 내피 세포이다. 추가의 실시양태에서, 내피 세포는 혈관 조직, 혈액, 혈관, 림프관, 소화관 조직, 뇨생식관 조직, 지방 조직, 기도 조직, 생식계 조직, 골수 및 제대 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 섬유아세포는 비혈관 섬유아세포이다. 기타 실시양태에서, 섬유아세포는 혈관 섬유아세포이다. 추가의 실시양태에서, 섬유아세포는 혈관 외막으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포 성분은 특별한 척추동물 대상체로부터 유래된다. 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 세포 성분은 심혈관계에 영향을 미치는 질환 또는 상태를 갖는 척추동물 대상체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포 성분은 특별한 질환 상태를 모방하기 위해 선택되고/되거나 배열된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 세포 성분은 특별한 질환 상태를 모방하는 방식으로 처리되고/되거나 조절된다.
특정 실시양태에서, 본원에는 살아있는 3차원 혈관벽 구역의 어레이가 개시되어 있고, 여기서 각각의 상기 혈관벽 구역은 서로 응집되어 있는 평활근 세포, 및 하나 이상의 표면 위의 내피 세포의 층 및 하나 이상의 표면 위의 섬유아세포의 층 중의 하나 이상을 포함하고, 각각의 상기 혈관벽 구역은 조작되고, 각각의 상기 혈관벽 구역은 배양물에 유지시킨다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 혈관벽 구역의 적어도 한 성분은 바이오인쇄되어 있다. 추가의 실시양태에서, 어레이 내의 각 혈관벽 구역은 제조시에 실질적으로 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 기타 실시양태에서, 어레이 내의 각 혈관벽 구역은 사용시에 실질적으로 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 각 혈관벽 구역은 생체적합성 다중-웰 용기의 웰에 존재한다. 추가의 실시양태에서, 웰은 다음 중의 하나로 피복된다: 생체적합성 하이드로겔, 단백질, 화학물질, 펩티드, 항체 또는 성장 인자. 일부 실시양태에서, 웰은 노보겔TM으로 피복된다. 기타 실시양태에서, 웰은 아가로즈로 피복된다. 일부 실시양태에서, 각 혈관벽 구역은 상기 용기의 상기 웰 내의 다공성 생체적합성 막 위에 배치했다. 일부 실시양태에서, 용기는 자동화된 약물 스크리닝과 호환성이 있다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 혈관벽 구역은 하나 이상의 측면 위의 생체적합성 표면에 고정시킨다. 추가의 실시양태에서, 생체적합성 표면은 다공성 막이다. 추가의 실시양태에서, 각 혈관벽 구역은 하나 이상의 측면에서 유체 유동에 의해 유발되는 전단력에 적용한다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 혈관벽 구역은 실질적으로 유사하다. 기타 실시양태에서, 어레이 내의 하나 이상의 혈관벽 구역은 독특하다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 혈관벽 구역은 인체에서 하나 이상의 상이한 혈관 조직을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 혈관벽 구역은 두 개 이상의 상이한 인간 공여체로부터 유도된 하나 이상의 세포형으로 생성된다. 일부 실시양태에서, 어레이 내의 각 혈관벽 구역은 배양액에 독립적으로 유지시킨다. 기타 실시양태에서, 어레이 내의 둘 이상의 개별 혈관벽 구역은 가용성 인자를 교환한다. 일부 실시양태에서, 어레이는 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 어레이는 약물 시험에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 어레이는 심혈관 약물 시험에 사용하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 본원에는, 섬유아세포 층을 생체적합성 지지체 위에서 배양하는 단계; 평활근 세포를 포함하고 실질적으로 구형 또는 실질적으로 원통형인 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계; 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 상기 지지체 위에 배치하는 단계; 상기 하나 이상의 응집된 다세포 응집체에 하나 이상의 표면 위의 내피 세포의 층을 적용하는 단계; 및 상기 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 조직을 형성하는 단계를 포함하는, 살아있는 3차원 혈관벽 구역을 구축하는 방법이 개시되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에는 3차원 세포계 요소 및 일시적 또는 제거가능한 밀폐를 포함하는 조작된 조직 배양 시스템이 개시되어 있고, 여기서 밀폐 재료는 세포와 영양 배지 사이의 직접 접촉을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 조작된 3차원 세포계 요소가 바이오인쇄되어 있다. 추가의 실시양태에서, 조작된 3차원 세포계 요소는 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 밀폐 재료는 이하 특징 중의 적어도 하나를 갖는다: 세포에 실질적으로 부착되지 않고; 생체적합성이고; 압출가능하고; 비-세포성이고; 세포용 지지체에 충분한 강도를 제공하고; 수성 조건하에 가용성이 아니다. 추가의 실시양태에서, 밀폐 재료는 플라스틱이 아니고, 유리가 아니고, 세라믹이 아니다. 일부 실시양태에서, 밀폐 재료는 하이드로겔이다. 추가의 실시양태에서, 밀폐 재료는 노보겔TM이다. 추가의 실시양태에서, 밀폐 재료는 아가로즈, 폴리에틸렌 글리콜 다아크릴레이트(PEG-DA), 히알루로난, 젤라틴, 폴록사머, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 펩티드 하이드로겔, 마트리겔(Matrigel™), 폴리디메틸실록산, 실리콘, 실크, 폴리아크릴아미드, 폴리 락트산, 계면활성제 폴리올 및 알기네이트 중의 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 및/또는 밀폐 재료 중의 적어도 하나는 바이오프린터로부터 압출되었다. 추가의 실시양태에서, 밀폐 재료에 갭이 존재하고, 영양 배지는 갭을 통해 세포를 접촉시킬 수 있다. 추가의 실시양태에서, 갭의 너비는 약 100㎛ 내지 약 30mm였다. 일부 실시양태에서, 갭은 구조물 주위에 불균질하게 분포되어 조직의 세포가 영양소에 불균일하게 노출되었다. 일부 실시양태에서, 조직의 표면적의 약 10% 이상을 영양 배지와 접촉시키기에 적합한 갭에 노출시켰다. 일부 실시양태에서, 밀폐 재료는 세포 위에 적어도 하나의 연장된 요소로서 중첩시켰다. 추가의 실시양태에서, 밀폐 재료의 연장된 요소는 약 100㎛ 내지 약 1mm의 단면 두께를 가졌다. 일부 실시양태에서, 밀폐 재료의 연장된 요소 사이에 갭이 존재했다. 일부 실시양태에서, 갭은, 밀폐 재료를 바이오프린터로부터 압출시킬 때 연장된 요소 사이의 왼쪽이었다. 기타 실시양태에서, 적어도 일부의 밀폐 재료를 시스템으로부터 제거하여 갭을 제공했다. 일부 실시양태에서, 밀폐 재료의 연장된 요소는 실질적으로 평행했고, 갭은 연장시켰다. 일부 실시양태에서, 밀폐 재료의 연장된 요소는 격자로 배열했다. 일부 실시양태에서, 밀폐 재료의 연장된 요소는 지지 표면에 구조물을 고정시킨다. 일부 실시양태에서, 시스템은 배송에 적합하다. 일부 실시양태에서, 바이오인쇄된 세포는 평활근 세포, 내피 세포, 섬유아세포 및 상피 세포 중의 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 영양 배지는 산소(02), 탄소원, 질소원, 성장 인자, 염, 무기물, 비타민, 혈청, 항생물질, 화학물질, 단백질, 핵산, 약제학적 화합물 및 항체 중의 적어도 하나로 이루어졌다.
특정 실시양태에서, 본원에는 하이드로겔로 적소에 유지된 3차원 세포 포함 요소를 포함하는 조작된 살아있는 조직이 개시되어 있고, 여기서 하이드로겔은 상기 세포 포함 요소 위에 원통 또는 원통 사이에 갭을 갖는 리본 또는 세포가 영양소에 접근하는 리본으로서 분배되었고, 하이드로겔은 조직으로부터 제거가능하다.
특정 실시양태에서, 본원에는 일시적 또는 반영구적 격자를 통해 조직과 영양 배지 사이에 직접 접촉을 제공함을 포함하는 조작된 조직의 생존력을 증가시키는 방법이 개시되어 있고, 여기서 조직은 임의의 사전-형성된 골격을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 일시적 또는 반영구적 격자를 통해 조직과 영양 배지 사이에 직접 접촉을 제공하는 단계는 상기 조직을 다공성 또는 갭화 재료에서 압박하는 것을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 세공 또는 갭이 너비는 약 100㎛ 내지 약 30mm였다. 추가의 실시양태에서, 다공성 또는 갭화 재료는 하이드로겔이었다. 추가의 실시양태에서, 다공성 또는 갭화 재료는 아가로즈였다. 일부 실시양태에서, 조작된 조직의 생존력은 생체외에서 증가된다. 일부 실시양태에서, 조작된 조직을 포함하는 세포의 적어도 일부의 생존력이 연장된다. 추가의 실시양태에서, 세포의 생존력을 1일 이상 연장한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 영양소는 탄소원, 질소원, 성장 인자, 염, 무기물, 비타민, 혈청, 항생물질, 단백질, 핵산, 약제학적 화합물, 항생물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 영양소는 산소(02)이다. 추가의 실시양태에서, 다공성 또는 갭화 하이드로겔 밀폐는 하나 이상의 표면 위의 영양소에 시차 노출로 바이오인쇄된 세포를 제공하도록 설계된다.
특정 실시양태에서, 본원에는 생체적합성 기질 위에 3차원 세포 포함 요소를 확립시키는 단계 및 3차원 세포 포함 요소를 중첩시키는 밀폐 재료를 분배시키는 단계를 포함하는 조직 배양 시스템을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 여기서 중첩된 밀폐 재료는 세포 중 적어도 일부가 성장 배지와 접착하도록 한다.
특정 실시양태에서, 본원에는 밀폐 재료의 주위를 표면에 분배하고, 주변부 내의 세포를 분배하는 단계 및 세포를 중첩시키는 밀폐 재료를 분배하는 단계를 포함하는 조직 배양 시스템을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 여기서 중첩된 밀폐 재료는 세포 중 적어도 일부가 성장 배지와 접촉하도록 한다. 일부 실시양태에서, 밀폐 재료를 분배시키는 것은 바이오인쇄으로 달성된다. 일부 실시양태에서, 당해 방법은 시스템을 적합한 배지에서 배양시켜 바이오인쇄된 세포 구조물을 성숙시키는 것을 포함하거나 추가로 포함한다.
실시예
하기 특정 실시예는 단순히 예시로서, 그리고 어떻든 임의의 방식으로 본 명세서의 나머지를 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1 - 세포 배양
평활근 세포
1차 인간 대동맥 평활근 세포(HASMC; 기브코/인비트로겐 코포레이션, 캘리포니아주 칼스배드(GIBCO/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA))를 37℃ 및 5% CO2에서 10% 태아 소 혈청(FBS), 100U/㎖ 페니실린, 0.1㎎/㎖ 스트렙토마이신, 0.25㎍/㎖ 암포테리신 B, 0.01M HEPES(모두 인비트로겐 코포레이션(캘리포니아주 칼스배드)사로부터 구입), 50㎎/ℓ의 프롤린, 50㎎/ℓ의 글리신, 20㎎/ℓ의 알라닌, 50㎎/ℓ의 아스코르브산 및 3㎍/L의 CuSO4(모두 시그마(Sigma; St. Louis, MO)사로부터 구입)가 보충된 저 글루코즈 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; 인비트로겐 코포레이션, 캘리포니아주 칼스배드) 내에서 유지시키고 팽창시켰다. 계대 4 및 8 사이의 HASMC의 컨플루언트 배양물을 모든 연구에서 사용하였다.
내피 세포
1차 인간 대동맥 내피 세포(HAEC; 기브코/인비트로겐 코포레이션, 캘리포니아주 칼스배드)를 10% FBS, 1㎍/㎖ 하이드로코르티손, 10ng/㎖의 인간 표피 성장 인자, 3ng/㎖의 염기성 섬유아세포 성장 인자, 10㎍/㎖의 헤파린, 100U/㎖ 페니실린, 0.1㎎/㎖ 스트렙토마이신 및 0.25㎍/㎖의 암포테리신 B(모두 인비트로겐 코포레이션(캘리포니아주 칼스배드)사로부터 구입)가 보충된 배지 199 내에서 유지시키고 팽창시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 (돼지 혈청(Sigma, St. Louis, MO)으로부터의) 젤라틴 피복 조직 배양물 처리 플라스크에서 성장시켰다. 계대 4 및 8 사이의 HAEC의 컨플루언트 배양물을 모든 연구에서 사용하였다.
섬유아세포
1차 인간 피부 섬유아세포(HDF; 기브코/인비트로겐 코포레이션, 캘리포니아주 칼스배드)를 37℃ 및 5% CO2에서 2% FBS, 1㎍/㎖ 하이드로코르티손, 10ng/㎖의 인간 표피 성장 인자, 3ng/㎖의 염기성 섬유아세포 성장 인자, 10㎍/㎖의 헤파린, 100U/㎖ 페니실린 및 0.1㎎/㎖ 스트렙토마이신(모두 인비트로겐 코포레이션(캘리포니아주 칼스배드)사로부터 구입)이 보충된 배지 106(인비트로겐 코포레이션, 캘리포니아주 칼스배드) 내에서 유지시키고 팽창시켰다. 계대 4 및 8 사이의 HDF의 컨플루언트 배양물을 모든 연구에서 사용하였다.
인간 지방흡입물 SVF 로부터 SMC 형 세포
SMC형 세포는 지방흡입물의 콜라게나제 소화 후에 분리된 세포의 부착성 분획으로부터 생성시켰다. 이러한 소화는 간질 혈관 분획(SVF)으로서 공지된 세포 모집단을 생성한다. SVF의 세포를 표준 조직 배양 플라스틱 및 적합한 배양 조건으로 추가로 선택된 부착 세포에 플레이팅한다. 지방 조직의 지방흡입물의 SVF로부터 SMC형 세포는 37℃ 및 5% CO2에서 10% 태아 소 혈청(FBS), 100U/㎖ 페니실린, 0.1㎎/㎖ 스트렙토마이신, 0.25㎍/㎖ 암포테리신 B, 0.01M HEPES(모두 인비트로겐 코포레이션(캘리포니아주 칼스배드)사로부터 구입), 50㎎/ℓ의 프롤린, 50㎎/ℓ의 글리신, 20㎎/ℓ의 알라닌, 50㎎/ℓ의 아스코르브산 및 3㎍/L의 CuSO4(모두 시그마(Sigma; St. Louis, MO)사로부터 구입)가 보충된 고 글루코즈 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; 인비트로겐 코포레이션, 캘리포니아주 칼스배드) 내에서 유지시키고 팽창시켰다. 계대 3 및 8 사이의 SVF-SMC의 컨플루언트 배양물을 모든 연구에서 사용하였다.
인간 지방흡입물 SVF 로부터 EC
간질 혈관 분획(SVF)으로부터의 내피 세포를 일반적으로 진실한 내피 세포(EC)의 1차 분리물을 성장시키기 위해 사용되는 성장 배지 중에서 유지시키고 팽창시켰다. 구체적으로, SVF-EC는 10% FBS, 1㎍/㎖ 하이드로코르티손, 10ng/㎖의 인간 표피 성장 인자, 3ng/㎖의 염기성 섬유아세포 성장 인자, 10㎍/㎖의 헤파린, 100U/㎖ 페니실린 및 0.1㎎/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 M199 내에서 유지시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 조직 배양물 처리된 플라스크 상에서 성장시켰다. 계대 3 및 8 사이의 SVF-EC의 컨플루언트 배양물을 모든 연구에서 사용했다.
폐 유래 세포
정상 인간 폐 섬유아세포를 라이프라인 테크놀로지스(LifeLine technologies) 또는 론자(Lonza)사로부터 획득하고, 각 벤더로부터의 배지를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 증식시켰다. 소 기도 상피 세포를 론자사로부터 구입하여 제조업자의 지침에 따라 벤더 제공된 배양 배지에서 성장시켰다. 폐 기도 및 폐 혈관 평활근 세포를 라이프라인 테크놀로지스사로부터 수득하여 제조업자의 지침에 따라 벤더 제공된 배지에서 배양시켰다.
실시예 2- 노보겔(NoboGelTM) 용액 및 금형
2% 및 4%(w/v) 노보겔 TM 용액의 제조
1g 또는 2g(각각 2% 또는 4%에 대해)의 노보겔TM(Organovo, San Diego, CA) 을 50mL의 둘베코 인산염 완충된 식염수(DPBS; 인비트로겐 코로페이션, 캘리포니아주 칼스배드)에 용해시켰다. 간단히, 노보겔™이 완전히 용해될 때까지 DPBS 및 노보겔™을 핫 플레이트에서 일정하게 교반하면서 85℃로 가열시켰다. 125℃에서 25분 동안 증기 멸균화에 의해 노보겔™ 용액을 살균시켰다. 온도가 66.5℃ 초과로 유지되는 한 노보겔™ 용액은 액체 상태로 잔류한다. 이 온도 미만에서는, 상 전이가 일어나고, 노보겔™ 용액의 점도가 증가하고, 노보겔™이 고체 겔을 형성한다.
노보겔 ™ 금형의 제조
10㎝ 페트리 접시에 맞는 테플론(Teflon®) 금형을 사용하여 원통형 바이오-잉크의 배양을 위해 노보겔™ 금형을 제작하였다. 간단히, 테플론® 금형을 70% 에탄올 용액을 사용하여 사전 살균시켰고, 금형을 UV 광에 45분 동안 적용하였다. 살균된 금형을 10㎝ 페트리 접시(VWR International LLC, West Chester, PA)의 상부에 위치시키고 안전하게 부착하였다. 이 어셈블리(테플론® 금형 + 페트리 접시)를 수직으로 유지시키고, 45㎖의 예열된 무균 2% 노보겔™ 용액을 테플론® 금형과 페트리 접시 사이의 공간에 부었다. 이어서, 어셈블리를 실온에서 1시간 동안 수평으로 위치시켜 노보겔™의 완전한 겔화를 허용하였다. 겔화 후, 테플론® 인쇄를 제거하고, 노보겔™ 금형을 DPBS를 사용하여 2회 세척하였다. 이어서, 17.5㎖의 HASMC 배양 배지를 다형 원통형 바이오-잉크를 배양하기 위한 노보겔™ 금형에 첨가하였다.
실시예 3 - HASMC-HAEC 다형 원통형 바이오-잉크의 제작
다형 원통형 바이오-잉크를 제조하기 위해, HASMC 및 HAEC를 개별적으로 수집한 다음, 소정 비로 혼합하였다. 간단히, 배양 배지를 컨플루언트 배양 플라스크로부터 제거하고, 세포를 DPBS(1㎖/5㎠의 성장 구역)로 세척하였다. 10분 동안 트립신(1㎖/15㎠의 성장 구역; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)의 존재하의 배양에 의해 배양 플라스크의 표면으로부터 세포를 박리시켰다. 0.15% 트립신을 사용하여 HASMC를 박리시키고, 0.1% 트립신을 사용하여 HAEC를 박리시켰다. 배양 후, 적절한 배양 배지를 플라스크(트립신 용적과 관련하여 2× 용적)에 첨가하였다. 세포 현탁액을 6분 동안 200g에서 원심분리한 후 상청액 용액을 완전히 제거하였다. 세포 펠릿을 각각의 배양 배지 중에 재현탁시키고, 혈구계산기를 사용하여 계수하였다. HASMC 및 HAEC의 적절한 용적을 배합하여 (전체 세포 모집단의 %로서) 15% HAEC 및 나머지 85% HASMC를 함유하는 다형 세포 현탁액을 수득하였다. 다형 세포 현탁액을 5분 동안 200g에서 원심분리한 후, 상청액 용액을 완전히 제거하였다. 다형 세포 펠릿을 6㎖ HASMC 배양 배지 중에 재현탁시키고, 20㎖ 유리 바이알(VWR International LLC, West Chester, PA)에 옮긴 후, 오비탈 진탕기에서 60분 동안 37℃ 및 5% CO2에서 150rpm으로 배양했다. 이는 세포가 서로 응집되게 하고, 세포-세포 부착을 개시하도록 한다. 배양 후, 세포 현탁액을 15㎖ 원심분리 튜브에 옮기고, 200g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액 배지의 제거 후, 세포 펠릿을 400㎕의 HASMC 배양 배지 중에 재현탁시키고, 수회 상하로 피펫팅하여 모든 세포 클러스터가 파괴되도록 하였다. 세포 현탁액을 15㎖ 원심분리 튜브 내에 위치한 0.5㎖ 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브(VWR International LLC, West Chester, PA)에 옮긴 후, 4분 동안 2000g에서 원심분리하여 매우 치밀하고 압축된 세포 펠릿을 형성하였다. 상청액 배지를 흡인시키고, 세포를 흡인에 의해 모세관 튜브(OD 1.5㎜, ID 0.5㎜, L 75㎜; Drummond Scientific Co., Broomall, PA)으로 옮겨 길이 50㎜의 원통형 바이오-잉크를 수득하였다. 모세관 내부의 세포 페이스트를 HASMC 배지 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 20분 동안 배양하였다. 이어서, 모세관이 제공된 플런저를 사용하여 원통형 바이오-잉크를 (HASMC 배지가 피복된) 노보겔™ 금형(예: 실시예 2 참조)의 홈에서 모세관 튜브로부터 압출시켰다. 원통형 바이오-잉크를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양했다.
실시예 4 - HASMC 및 HAEC 다형 원통형 바이오-잉크를 포함하는 바이오인쇄 혈관벽 구역
혈관벽 모의 구역을 노보겔TM 피복된 웰 내부에서 노보겔TM 기저 플레이트(100mm 페트리 접시 크기) 상에서 또는 다중-웰 플레이트(예: 6-웰 플레이트) 중의 코닝R 트렌스웰R 삽입물 상에서 직접 NovoGen MMX 바이오프린터TM(Organovo, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 바이오인쇄했다. 이 공정은 다음 세 단계를 포함한다:
HASMC-HAEC 다형 바이오-잉크의 제조
인간 대동맥 평활근(HASMC) 및 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)의 배양물을 트립신화하고, 계수하고, 적합한 양으로 혼합하여 HASMC:HAEC를 85:15 또는 70:30 비로 포함하는 바이오-잉크를 수득했다. 다형 세포 현탁액을 회전 진탕기 상에서 60분 동안 진탕시키고, 수집하고 원심분리시켰다. 세포를 266 또는 500㎛(ID) 유리 마이크로모세관에서 인출한 다음, 배지 피복된 노보겔TM 플레이트에서 압출시키고, 최소 6시간 동안 배양했다.
패치/3차원 세포 시트의 바이오인쇄
다중-웰 플레이트의 웰 내부의 노보겔TM 상에서 또는 노보겔TM 기저 플레이트(100mm 페트리 접시 크기) 상에서 인쇄의 경우, 노보겔TM 원통의 제1 층을 바이오인쇄했다. 이어서, 이의 상부에서, 박스를 내부 공간이 8mm 길이 × 1.25mm 너비가 되도록 노보겔TM 막대를 사용하여 바이오인쇄했다. 성숙된 원통형 바이오-잉크를 박스 내부를 인쇄하기 위한 바이오프린터에 부하시켰다. 최종적으로, 노보겔TM 원통의 제3 층을 세포의 전체 길이를 피복하거나 위에 격자/메시형 구조를 생성시키는 제2 상부 위에 인쇄했다. 플레이트의 웰 내부의 트렌스웰R 삽입체 상에서 인쇄의 경우, 처음에 기재된 노보겔TM 막대의 제1 층을 제거했다. 이어서, 바이오인쇄된 구조물을 적합한 세포 배양 배지로 피복하고, 바이오-잉크의 인접하는 구역이 융합하여 세포의 3차원 패치를 형성하는 동안 배양했다.
바이오인쇄된 구조물의 성숙
HASMC-HAEC 바이오-잉크를 포함하는 바이오인쇄된 구조물을 1 내지 7일 동안 배양하여 구조물을 성숙하게 하고 HAEC를 구조물 주변에서 분류하여 혈관벽의 단편을 모방하기에 충분한 시간 동안 제공하도록 했다. 일부 실험에서, 3차원 세포 패치를 전단력(즉, 박동성 유동)에 적용하여 HAEC 분류 공정을 도왔다.
실시예 5 - HASMC-HDF-HAEC 다형 원통형 바이오-잉크의 제작
다형 원통형 바이오-잉크를 제조하기 위해, HASMC, HDF 및 HAEC를 개별적으로 수집한 다음, 소정 비(예: HASMC:HDF:HAEC의 비 70:25:5)로 혼합하였다. 간단히, 배양 배지를 컨플루언트 배양 플라스크로부터 제거하고, 세포를 DPBS(1㎖/10㎠의 성장 구역)로 세척하였다. 10분 동안 트립신(1㎖/15㎠의 성장 구역; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)의 존재하의 배양에 의해 배양 플라스크의 표면으로부터 세포를 박리시켰다. 0.15% 트립신을 사용하여 HASMC 및 HDF를 박리시키고, 0.1% 트립신을 사용하여 HAEC를 박리시켰다. 배양 후, 적절한 배양 배지를 플라스크(트립신 용적과 관련하여 2× 용적)에 첨가하였다. 세포 현탁액을 6분 동안 200g에서 원심분리한 후 상청액 용액을 완전히 제거하였다. 세포 펠릿을 각각의 배양 배지 중에 재현탁시키고, 혈구계산기를 사용하여 계수하였다. HASMC, HDF 및 HAEC의 적절한 용적을 배합하여 다형 세포 현탁액을 수득하였다. 다형 세포 현탁액을 5분 동안 200g에서 원심분리한 후, 상청액 용액을 흡인시켰다. 다형 세포 펠릿을 6㎖ HASMC 배양 배지 중에 재현탁시키고, 20㎖ 유리 바이알(VWR International LLC, West Chester, PA)에 옮긴 후, 오비탈 진탕기에서 60분 동안 37℃ 및 5% CO2에서 150rpm으로 배양했다. 이는 세포가 서로 응집되게 하고, 세포-세포 부착을 개시하도록 한다. 배양 후, 세포 현탁액을 15㎖ 원심분리 튜브에 옮기고, 200g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액 배지의 제거 후, 세포 펠릿을 400㎕의 HASMC 배양 배지 중에 재현탁시키고, 수회 상하로 피펫팅하여 모든 세포 클러스터가 파괴되도록 하였다. 세포 현탁액을 15㎖ 원심분리 튜브 내에 위치한 0.5㎖ 마이크로퓨즈 튜브(VWR International LLC, West Chester, PA)에 옮긴 후, 4분 동안 2000g에서 원심분리하여 매우 치밀하고 압축된 세포 펠릿을 형성하였다. 상청액 배지를 흡인시키고, 세포를 흡인에 의해 모세관 튜브(OD 1.25㎜, ID 0.266㎜, L 75㎜; Drummond Scientific Co., Broomall, PA)으로 옮겨 길이 50㎜의 원통형 바이오-잉크 응집체를 수득하였다. 모세관 내부의 세포 페이스트를 HASMC 배지 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 20분 동안 배양하였다. 이어서, 원통형 바이오-잉크를 모세관이 제공된 플런저를 사용하여 (HASMC 배지가 피복된) 노보겔™ 금형(예: 실시예 2 참조)의 홈에서 모세관 튜브로부터 압출시켰다. 원통형 바이오-잉크를 37℃ 및 5% CO2에서 6 내지 24시간 동안 배양했다.
실시예 6 - 다형 HASMC, HAEC 및 HDFa 바이오-잉크를 포함하는 바이오인쇄 혈관벽 구역
혈관벽 모의 구역을 노보겔TM 피복된 웰 내부에서 노보겔TM 기저 플레이트(100mm 페트리 접시 크기) 상에서 또는 다중-웰 플레이트(예: 6-웰 플레이트) 중의 코닝R 트렌스웰R 삽입물 상에서 직접 NovoGen MMX 바이오프린터TM(Organovo, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 바이오인쇄했다. 이 공정은 다음 세 단계를 포함한다:
다형 HASMC-HDFa-HAEC 바이오-잉크의 제조
HASMC, HAEC 및 HDFa의 배양물을 트립신화하고, 계수하고, 적합한 양으로 혼합하여 HASMC:HDFa:HAEC를 70:15:15 비로 포함하는 바이오-잉크를 수득했다. 다형 세포 현탁액을 회전 진탕기 상에서 60분 동안 진탕시키고, 수집하고 원심분리시켰다. 세포를 266 또는 500㎛(ID) 유리 마이크로모세관에서 인출한 다음, 배지 피복된 노보겔TM 플레이트에서 압출시키고, 최소 6시간 동안 배양했다.
패치/3차원 세포 시트의 바이오인쇄
다중-웰 플레이트의 웰 내부의 노보겔TM 상에서 또는 노보겔TM 기저 플레이트(100mm 페트리 접시 크기) 상에서 인쇄의 경우, 노보겔TM 원통의 제1 층을 바이오인쇄했다. 이어서, 이의 상부에서, 박스를 내부 공간이 8mm 길이 × 1.25mm 너비가 되도록 노보겔TM 막대를 사용하여 바이오인쇄했다. 성숙된 원통형 바이오-잉크 응집체를 박스 내부를 인쇄하기 위해 바이오프린터에 부하시켰다. 최종적으로, 노보겔TM 원통의 제3 층을 세포의 전체 길이를 덮거나 위에 격자/메시형 구조를 생성시키는 제2 상부 위에 인쇄했다. 플레이트의 웰 내부의 트렌스웰R 삽입체 상에서 인쇄의 경우, 처음에 기재된 노보겔TM 막대의 제1 층을 제거했다. 이어서, 바이오인쇄된 구조물을 적합한 세포 배양 배지로 피복하고, 바이오-잉크의 인접하는 구역이 융합하여 세포의 3차원 패치를 형성하는 동안 배양했다.
바이오인쇄된 구조물의 성숙
HASMC-HDFa-HAEC 바이오-잉크를 포함하는 바이오인쇄된 구조물을 1 내지 7일 동안 배양하여 구조물을 성숙하게 하고 HAEC를 구조물 주변에서 분류하여 혈관벽의 단편을 모방하기에 충분한 시간 동안 제공하도록 했다. 일부 실험에서, 3차원 세포 패치에 전단력(즉, 박동성 유동)을 적용하여 HAEC 분류 공정을 도왔다.
실시예 7 - SVF-SMC-SVF-EC 다형 원통형 바이오-잉크의 제작
다형 원통형 바이오-잉크를 제조하기 위해, SVF-SMC 및 SVF-EC를 개별적으로 수집한 다음, 소정 비로 혼합하였다. 간단히, 배양 배지를 컨플루언트 배양 플라스크로부터 제거하고, 세포를 DPBS(1㎖/5㎠의 성장 구역)로 세척하였다. 5 내지 10분 동안 TrypLE(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)의 존재하의 배양에 의해 배양 플라스크의 표면으로부터 세포를 박리시켰다. 배양 후, 적절한 배양 배지를 플라스크에 첨가하여 효소 활성을 퀀칭시켰다. 세포 현탁액을 6분 동안 200g에서 원심분리한 후 상청액 용액을 완전히 제거하였다. 세포 펠릿을 각각의 배양 배지 중에 재현탁시키고, 혈구계산기를 사용하여 계수하였다. SVF-SMC 및 SVF-EC의 적절한 용적을 배합하여 (전체 세포 모집단의 %로서) 15% SVF-EC 및 나머지 85% SVF-SMC를 함유하는 다형 세포 현탁액을 수득하였다. 다형 세포 현탁액을 5분 동안 200g에서 원심분리한 후, 상청액 용액을 완전히 제거하였다. 다형 세포 펠릿을 6㎖ SVF-SMC 배양 배지 중에 재현탁시키고, 20㎖ 유리 바이알(VWR International LLC, West Chester, PA)에 옮긴 후, 오비탈 진탕기에서 60분 동안 37℃ 및 5% CO2에서 150rpm으로 배양했다. 이는 세포가 서로 응집되게 하고, 세포-세포 부착을 개시하도록 한다. 배양 후, 세포 현탁액을 15㎖ 원심분리 튜브에 옮기고, 200g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액 배지의 제거 후, 세포 펠릿을 400㎕의 SVF-SMC 배양 배지 중에 재현탁시키고, 수회 상하로 피펫팅하여 모든 세포 클러스터가 파괴되도록 하였다. 세포 현탁액을 15㎖ 원심분리 튜브 내에 위치한 0.5㎖ 마이크로퓨즈 튜브(VWR International LLC, West Chester, PA)에 옮긴 후, 4분 동안 2000g에서 원심분리하여 매우 치밀하고 압축된 세포 펠릿을 형성하였다. 상청액 배지를 흡인시키고, 세포를 흡인에 의해 모세관 튜브(OD 1.25㎜, ID 0.266㎜, L 75㎜; Drummond Scientific Co., Broomall, PA)으로 옮겨 길이 50㎜의 원통형 바이오-잉크 응집체를 수득하였다. 모세관 내부의 세포 페이스트를 SVF-SMC 배지 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 20분 동안 배양하였다. 이어서, 모세관이 제공된 플런저를 사용하여 원통형 바이오-잉크를 (SVF-SMC 배지가 피복된) 노보겔™ 금형(예: 실시예 2 참조)의 홈에서 모세관 튜브로부터 압출시켰다. 원통형 바이오-잉크를 37℃ 및 5% CO2에서 6 내지 12시간 동안 배양했다.
실시예 8 - 혈관 SMC 및 EC의 혼합물을 포함하는 바이오인쇄 혈관벽 구역
혈관벽 구조물은 이미 1.5mL의 2%(w/v) 노보겔TM으로 피복된 6-웰 배양 플레이트의 웰 중에서 NovoGen MMX 바이오프린터TM(Organovo, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 바이오인쇄했다. 원통형 바이오-잉크는 인간 혈관 평활근 세포(SMC) 및 인간 내피 세포(EC)의 SMC:EC 비 85:15 또는 70:30의 혼합물로 제조했다. 바이오-잉크는 500㎛ 또는 266㎛ 내경(ID)을 갖는 유리 마이크로모세관 튜브 속에서 세포 펠릿(SMC:EC)을 흡인시켜 생성시켰다. 이어서, 바이오-잉크 원통을 적절한 배양 배지로 피복된 노보겔TM 금형 속에서 압출시켰다. 바이오인쇄 전에, 바이오-잉크를 6 내지 18시간 동안 정치시켰다. SMC 및 EC의 혼합물을 함유하는 다형 바이오-잉크를 사용했다. 이러한 실험에서, 바이오-잉크 내의 EC를 바이오-잉크 응집체 주변에서 분류하여 EC로 피복되고, SMC 농후 구조물 벽을 함유하는 구조물을 생성했다. 이 공정은 SMC로 구성된 벽 및 EC의 피복물(예: 추정된 중막 및 내막)을 함유하는 혈관벽 구조물의 개발을 유도한다. 구조물은 바이오인쇄 프로토콜을 사용하여 배양 웰의 중심에서 바이오인쇄하였고, 배양 웰은 적합한 배양 배지로 충전시키고, 구조물을 성숙 및 평가용 배양기로 반환시켰다. 바이오인쇄 후, 구조물을 적합한 양의 배양 배지(예: 6-웰 플레이트 중의 1개의 웰에 대해 4mL)로 피복시켰다. 요약하면, 이 실시예는 혈관벽 구역 또는 모방체를 표준 크기 다중-웰 조직 배양 플레이트 내에서 바이오인쇄하기 위한 혈관 SMC 및 EC의 사용을 기재한다. 생성되는 혈관벽 구역 또는 모방체는 EC의 외부 층 또는 층들 및 대구역 또는 단독으로 SMC로 구성된 내벽을 특징으로 한다.
실시예 9 - EC의 피복물과 함께 인간 혈관 SMC를 포함하는 바이오인쇄 혈관벽 구역
혈관벽 구조물은 이미 1.5mL의 2%(w/v) 노보겔TM으로 피복된 6-웰 배양 플레이트의 웰 중에서 NovoGen MMX 바이오프린터TM(Organovo, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 바이오인쇄했다. 원통형 바이오-잉크는 인간 혈관 평활근 세포(SMC)로 제조했다. 바이오-잉크를 500㎛ 또는 266㎛ 내경(ID)을 갖는 유리 마이크로모세관 튜브 속에서 세포 펠릿(SMC)을 흡인시켜 생성시켰다. 이어서, 원통형 바이오-잉크 응집체를 적절한 배양 배지로 피복된 노보겔TM 금형 속에서 압출시켰다. 바이오인쇄 전에, 바이오-잉크를 6 내지 18시간 동안 정치시켰다. EC 농축물(1 내지 1.5 × 105 세포/㎕)을 이미 바이오인쇄된 SMC 구조의 상부에서 직접 바이오인쇄하여 구조물의 제2 층을 형성했다. 이 공정은 SMC로 구성된 벽 및 EC의 피복물(예: 추정된 중막 및 내막)을 함유하는 혈관벽 구조물의 개발을 유도한다. 구조물은 바이오인쇄 프로토콜을 사용하여 배양 웰의 중심에서 바이오인쇄하였다. 바이오인쇄 후, 구조물을 적합한 양의 배양 배지(예: 6-웰 플레이트 중의 1개의 웰에 대해 4mL)로 피복시키고, 성숙 및 평가용 배양기로 반환시켰다. 요약하면, 이 실시예는 혈관벽 구역 또는 모방체를 표준 크기 다중-웰 조직 배양 플레이트 내에서 바이오인쇄하기 위한 혈관 SMC 및 EC의 사용을 기재한다. 생성되는 혈관벽 구역 또는 모방체는 EC의 외부 층 및 대구역 또는 단독으로 SMC로 구성된 내벽을 특징으로 한다.
실시예 10 - 노보겔TM 밀폐를 사용하는 HAEC로 적층된 HASMC를 포함하는 바이오인쇄 혈관벽 구역
혈관벽 모의 구역은 노보겔TM 피복된 웰 내부에서 또는 다중-웰 플레이트(예: 6-웰 플레이트) 중의 코닝R 트렌스웰R 삽입체 상에서 직접 NovoGen MMX 바이오프린터TM(Organovo, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 바이오인쇄했다. 이 공정은 다음 세 단계를 포함한다:
HASMC 바이오-잉크의 제조
인간 대동맥 평활근 세포(HASMC)의 배양물을 트립신화한 다음, 회전 진탕기 상에서 60분 동안 진탕시켰다. 진탕 후, 세포를 수집하고, 원심분리시키고, 266 또는 500㎛(ID) 유리 마이크로모세관에서 흡인시켰다. 최종적으로, 세포를 배지 피복된 노보겔TM 플레이트에서 압출시키고, 최소 6시간 동안 배양했다.
HAEC 적층된 HASMC 패치의 바이오인쇄
패치(예: 구역)의 바이오인쇄 전에, 인간 대동맥 내피 세포(HAEC) 배양물을 트립신화하고, 계수한 다음, 1×106 세포/10μL의 배지의 작동 농도에서 HAEC 배지에 재현탁시켰다. HAEC 현탁액은 바이오인쇄된 패치를 적층시키기 위해 사용될 바이오프린터에 위치시켰다. 다중-웰 플레이트의 웰 내부의 노보겔TM 상에서 인쇄의 경우, 노보겔TM 원통의 제1 층을 바이오인쇄했다. 이어서, 이의 상부에서, 박스를 내부 공간이 8mm 길이 × 1.25mm 너비가 되도록 노보겔TM 막대를 사용하여 바이오인쇄했다. 성숙된 원통형 HASMC 바이오-잉크를 박스 내부를 인쇄하기 위해 바이오프린터에 부하시켰다. 이어서, 현탁액 중의 HAEC를 바이오프린터에 의해 깨끗한 마이크로모세관 속에서 인출하고, 인쇄된 패치의 4개 코너 근처에서 인쇄된 HASMC 층의 상부에 4배 분배시켰다. 각 액적은 용적이 2.5㎕였다. 구조물은 제3 층을 인쇄 진행시키기 전에 15 내지 30분 동안 배양했다. 최종적으로, 노보겔TM 원통의 제3 층을 위에 격자/메시형 구조를 생성시키는 제2 상부 위에 인쇄했다. 플레이트의 웰 내부의 트렌스웰R 삽입체 상에서 인쇄의 경우, 처음에 기재된 노보겔TM 막대의 제1 층을 제거했다. 이어서, 바이오인쇄된 구조물을 적합한 세포 배양 배지로 피복하고, 배양했다.
바이오인쇄된 구조물의 성숙
바이오인쇄된 구조물을 1 내지 7일 동안 배양하여 구조물을 성숙하게 하고 HAEC를 HASMC 패치의 상부에 얇은 단층을 균일하게 형성하기에 충분한 시간 동안 제공하도록 했다. 일부 실험에서, 3차원 세포 패치에 전단력(즉, 박동성 유동)을 적용했다.
실시예 11 - 노보겔TM 밀폐를 사용하는 HDFa 단층 위에 HAEC로 적층된 HASMC를 포함하는 바이오인쇄 혈관벽 구역
혈관벽 모의 구역은 다중-웰 플레이트(예: 6-웰 플레이트) 중의 코닝R 트랜스웰R 삽입물 상에서 직접 NovoGen MMX 바이오프린터TM(Organovo, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 바이오인쇄했다. 이 공정은 다음 네 단계를 포함한다:
트랜스웰 R 막 상에서 HDFa의 배양
인간 성인 피부 섬유아세포(HDFa)를 20,000 세포/cm2의 밀도로 트랜스웰R 막 상에 접종시키고, 최소 6일 동안 배양했다. 이는 세포가 부착하고, 성장하고, 트랜스웰R 막 상에서 컨플루언트 층이 되도록 했다.
HASMC 바이오-잉크의 제조
인간 대동맥 평활근 세포(HASMC)의 배양물을 트립신화한 다음, 회전 진탕기 상에서 60분 동안 진탕시켰다. 진탕 후, 세포를 수집하고, 원심분리시키고, 266 또는 500㎛(ID) 유리 마이크로모세관에서 흡인시켰다. 이어서, 세포를 배지 피복된 노보겔TM 플레이트에서 압출시키고, 최소 6시간 동안 배양했다.
HAEC 적층된 HASMC 패치의 바이오인쇄
패치(예: 구역)의 바이오인쇄 전에, 인간 대동맥 내피 세포(HAEC) 배양물을 트립신화하고, 계수한 다음, 1×106 세포/10μL의 배지의 작동 농도에서 HAEC 배지에 재현탁시켰다. HAEC 현탁액은 바이오인쇄된 패치를 적층시키기 위해 사용될 바이오프린터에 위치시켰다. 트랜스웰R 막 상에서 성장된 HDFa를 갖는 다중-웰 플레이트 중의 배양 배지를 완전히 흡인시키고, 플레이트를 바이오프린터로 옮겼다. 박스를 공간이 8mm 길이 × 1.25mm 너비가 되도록 규정된 막 위의 HDFa의 상부에서 직접 노보겔TM 막대를 사용하여 바이오인쇄했다. 성숙된 HASMC 바이오-잉크 원통을 박스 내부를 인쇄하기 위해 바이오프린터에 부하시켰다. 이어서, 현탁액 중의 HAEC를 바이오프린터에 의해 깨끗한 마이크로모세관 튜브 속에서 인출하고, 인쇄된 패치의 4개 코너 근처에서 인쇄된 HASMC 층의 상부에 4배 분배시켰다. 각 액적은 용적이 2.5㎕였다. 구조물을 상부 노보겔TM 막대 층을 인쇄 진행시키기 전에 15 내지 30분 동안 배양했다. 최종적으로, 노보겔TM 원통의 상부 층을 인쇄하여 격자/메시형 구조를 생성시켰다. 이어서, 바이오인쇄된 구조물을 적합한 세포 배양 배지로 피복하고, 배양했다.
바이오인쇄된 구조물의 성숙
바이오인쇄된 구조물을 1 내지 7일 동안 배양하여 구조물을 성숙하게 하고 HAEC를 HASMC 패치의 상부에 얇은 단층을 균일하게 형성하기에 충분한 시간 동안 제공하도록 했다.
실시예 12 - 배지와 직접 접촉을 허용하면서 구조물을 공간적으로 제한하는데 사용되는 하이드로겔 격자
원통형 하이드로겔 요소는 3차원 세포 시트의 상면 일부를 교차하여 NovoGen MMX 바이오프린터TM(Organovo, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 바이오인쇄했다. 격자는 시트에 공간적 밀폐를 제공하고, 시트와 주위 배지 사이의 직접 접촉을 허용한다. 첫째, 하이드로겔 기저 층을 바이오인쇄했다. 둘째, 하이드로겔 윈도우를 바이오인쇄하여 8mm 길이 × 1.25mm 너비의 공간을 한정했다. 셋째, 세포 바이오-잉크를 하이드로겔 윈도우 내부에서 바이오인쇄하여 3차원 세포 시트를 형성했다. 그리고, 넷째, 하이드로겔 격자 구조를 바이오인쇄했다. 각종 실험에서, 하이드로겔 요소의 크기는 직경이 약 100㎛ 내지 1mm이고, 요소들 사이의 공간은 약 100㎛ 내지 10mm였다.
일부 실험에서, 하이드로겔 요소를 한 방향에 따라 인쇄하여 세포 시트의 상부에 긴 개방 채널을 생성했다. 기타 실험에서, 하이드로겔 요소를 다중 방향으로 인쇄하여 시트의 상부에 개방 영역의 격자형 패턴을 생성했다. 하이드로겔은 노보겔TM으로 구성되었다. 격자 구조는 임의로 구조를 통과하여 인쇄 표면 위에 연장하여 인쇄 표면에 구조를 고정하기 위한 추가 재료의 적용을 가능하게 했다. 생성되는 격자를 사용하여 구조물을 공간적으로 한정하지만, 세포 구조물의 일부가 주위 영양 배지와 직접 접촉하도록 한다.
실시예 13 - 연속적인 침착 및 격자 모양의 기능적 유닛 구조를 사용하여 바이오인쇄된 간 조직
조작된 간 조직은 연속적인 침착 메카니즘을 사용하여 NovoGen MMX 바이오프린터TM(Organovo, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 바이오인쇄했다. 간 조직의 3차원 구조는 반복 기능 유닛, 이 경우에, 육각형에 기초했다. 바이오-잉크는 압출 화합물(계면활성제 폴리올 - PF-127)에 캡슐화된 간장 세포 및 내피 세포로 구성했다.
30% PF-127의 제조
30% PF-127 용액(w/w)은 PBS를 사용하여 제조했다. PF-127 분말을 4℃에서 유지된 자기 교반 플레이트를 사용하여 냉각된 PBS와 혼합했다. 완전한 용해가 약 48시간에 발생했다.
세포 제조 및 바이오인쇄
82% 성상 세포(SC) 및 18% 인간 대동맥 내피 세포(HAEC) 및 인간 성인 피부 섬유아세포(HDFa)로 구성된 세포 현탁액을 15mL 튜브에서 분리하여 3개의 세포 농도: 50 × 106 세포/ml, 100 × 106 세포/ml, 및 200 × 106 세포/mL의 후속 원심분리를 달성했다. 각 세포 펠릿을 30% PF-127에 재현탁시키고, 바이오프린터를 사용하여 3cc 저장소에서 흡인시켰다. 510㎛ 분배 팁을 사용하여, 캡슐화된 세포를 단일 육각형(참조: 도 6A) 또는 육각형 모자이크화 배치(참조: 도 6B)에서 PDMS 기저 플레이트 상에서 바이오인쇄했다. 각 구조물에 약 200μL의 배지를 제공하고, 실온에서 20분 동안 배양하여 구조물의 완전성을 평가했다.
다층 바이오인쇄
육각형 모자이크화 실험을 위해, (4)개 이하의 연속 층을 바이오인쇄하여 보다 많은 세포 물질이 존재하는 더 큰 구조를 생성한다. 제작 후, 각 구조물에 초기에 약 200μL의 완전 배지를 제공하여 구조물 완전성을 평가했다. 구조물을 실온에서 20분 동안 배양한 다음, 20mL의 완전 배지 중에 침지시켰다.
결과
(PF127을 용해시키는) 10% 태아 소 혈청을 함유하는 성장 배지 중에서 18시간 배양 후, 바이오인쇄된 기하 형상 내에 함유된 세포를 원래 디자인의 기하 형상 패턴화를 유지시킨 조직의 완전한 인접 시트를 생성하기에 충분히 서로 응집시켰다(참조: 도 6D). 10% 중성 완충된 포르말린에서 고정시킨 후, 모자이크화된 구조물의 단일 구역의 H&E 염색을 도 7에 도시한다. 세포는 생존가능하고 완전하며 이들의 원래 인쇄된 기하 형상으로 한정되는 것으로 밝혀졌다.
실시예 14 - 강제 적층
세포 집단(동종 또는 이종)은 바이오인쇄를 위해 원통형 바이오-잉크로서 또는 플루로닉 F-127(Lutrol, BASF) 중의 세포 현탁액으로서 제조했다. 간단히, 바이오-잉크의 제조를 위해, 세포는 재조합 인간 트립신(75㎍/mL, Roche) 또는 0.05% 트립신(Invitrogen)을 사용하여 표준 조직 배양 플라스틱으로부터 유리시켰다. 효소 유리 후, 세포를 세척하고, 수집하고, 계수하고, 목적하는 비(즉, 50:50 간 성상 세포(hSC):내피 세포(EC))로 배합하고, 원심분리로 펠릿화했다. 이어서, 상청액을 세포 펠릿으로부터 제거하고, 세포 혼합물을 목적하는 직경, 통상적으로 내경 500㎛ 또는 250㎛의 유리 마이크로모세관에서 흡인시켰다. 이어서, 이 원통형 세포 제조물을 금형으로부터 압출시키고, 바이오-잉크 성숙을 위한 채널을 갖는 비세포 부착성 하이드로겔 재료로부터 생성했다. 이어서, 생성된 바이오-잉크 원통을 실험적으로 측정된 시간 동안, 통상적으로 2 내지 24시간 동안 완전 세포 배양 배지에서 배양했다.
간단히, 하이드로겔 세포 현탁액 제조를 위해, 세포를 본원에 기재된 효소 매개된 프로토콜 중 하나를 사용하여 표준 세포 배양 용기로부터 유리시켰다. 이어서, 유리된 세포는 배지를 함유하는 혈청으로 세척하고, 수집시키고, 계수하고, 원심분리하여 조밀한 세포 펠릿을 형성했다. 상청액을 생성되는 세포 펠릿으로부터 제거한 다음, 세포를 차가운 PF-127(4℃)에 50 내지 200 × 106 세포/mL(10 내지 300 × 106 세포/mL)의 농도로 재현탁시켰다. 이어서, 이 세포 현탁액을 NovoGen MMX 바이오프린터TM(Organovo, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 시린지로 흡인시켰다.
이어서, 강제된 세포 패턴화, 적층 또는 배향을 갖는 조직 구조물의 제작은 바이오프린터를 사용하여 달성했다. 3차원 조직 구조물의 바이오인쇄는 원통형 바이오-잉크, 수용성 겔 중의 세포 현탁액 또는 이의 조합으로 수행했다. 규정된 세포 패턴화 또는 적층을 달성하기 위해, 관련 세포 집단의 조합을 바이오-잉크 또는 세포 현탁액 제조에 포함시킨 다음, 세포 용액을 지지하는 겔 재료의 용해가 침착된 바이오-잉크 주위에 한정된 세포 적층을 유도하는 방식으로 바이오인쇄했다(참조: 도 8). 세포 패턴화, 조직 또는 적층은 또한 한정된 별도의 세포 집단(예: hSC 및 EC)의 사용 및 도입을 통해 달성하고, 이는 바이오인쇄된 조직 내에 세포 및 세포 구조의 예견가능하고 반복가능한 조직을 유도했다(참조: 도 9).
일부 실험에서, 바이오인쇄된 신생조직 내의 최종 세포 조직이 성숙 또는 배양 기간 후 관찰되었다. 구조물을 표준 실험실 배양기(37℃, 5% CO2가 보충된 가습 챔버)에 유지시키고 경시적으로 평가했다.
결과
세포 패턴화, 적층 또는 배열은 바이오인쇄를 사용하여 달성했다. 이종(즉, 다형) 세포 모집단을 함유하는 바이오-잉크로 바이오인쇄하거나 바이오-잉크(동종 또는 이종 세포 모집단)를 고밀도 세포-겔 또는 세포 현탁액과 배합하여, 상이한 세포 조직을 관찰했다. 가습 챔버(배양기)에서 이러한 신생조직 구조물의 성숙은 이러한 바이오인쇄된 신생조직에서 상이한 세포 배열, 조직 및/또는 분리의 추가 확립을 유도한다.
예를 들어, HepG2 세포를 포함하는 바이오인쇄된 바이오-잉크의 상부에서 EC:hSC-적재된 PF-127의 바이오인쇄는 상이한 세포 집단 및 신중한 조직 형태를 갖는 구조물의 상이한 층의 확립을 유도한다. hSC 및 EC를 함유하는 바이오잉크 구조물의 경우, 완전 배지에서 3일 이상 동안 성숙된 바이오인쇄된 구조물은 주변에 상이한 EC 층 및 구조물 코어 내에 조직된 마이크로용기 네트워크를 함유하는 것으로 밝혀졌다. EC의 고농축 용액이 바이오인쇄된 혈관 평활근 세포의 동종(즉, 단일 형태) 모집단을 포함하는 바이오-잉크로 제작된 바이오인쇄된 구조물은 구조물 주위에 상이한 EC 층을 함유하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 15 - 적층된 비-혈관 구조물(기도 유사체)
원통형 바이오-잉크를 정상 인간 폐 섬유아세포(NHLF), 소 기도 상피 세포(SAEC) 및 인간 대동맥 내피 세포(EC)로 제조했다. 세포는 표준 실험실 조건하에 증식시키고, 세포를 세포와 동일한 벤더로부터 구입된 배지 또는 이들 특별한 세포형을 위한 표준 세포 배양 실행에 도움이 되는 주요 문헌에서 통상적으로 발견된 성분을 포함하는 배지에서 배양했다. 간단히, 세포를 양이온 비함유 인산염 완충된 식염수(PBS)로 세척하여 표준 조직 배양 플라스틱으로부터 유리시킨 다음, 0.1 내지 0.05% 트립신(Invitrogen)에 노출시켰다. 이어서, 유리된 세포를 혈청 함유 배지로 세척하고, 수집하고, 계수하고, 적합한 비로 배합하고, 원심분리로 펠릿화했다. 통상적으로, NHLF 및 EC를 90:10 내지 50:50 NHLF:EC의 비로 혼합했다. 이어서, 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 유리 마이크로모세관으로 흡인시킨 다음, 이를 약 15 내지 20분 동안 완전 배지에 침지시켰다. 이 원통형 바이오-잉크 구조물을 선형 채널을 함유하는 비세포 부착성 하이드로겔 금형에서 압출시키고 2 내지 18시간 동안 유지시켰다.
이어서, SAEC는 고농축 세포 현탁액으로 제조했다. 간단히, SAEC를 본원에서 기재된 바와 같이 유리시키고, 수집하고, 열거하고, 원심분리로 펠릿화했다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 소용적의 완전 배지에 재현탁시켜 고농축 세포 펠릿 1 × 105 세포/μL를 수득했다. 이어서, 이 세포 현탁액을 사용시까지 4℃에서 저장했다.
이어서, 인간 폐 구조물을 다중-웰 플레이트의 웰에서 또는 세포 배양 웰 삽입체(트랜스웰, BD)의 막 위에 바이오인쇄했다. 다세포 NHLF 또는 NHLF:EC 바이오-잉크를 사용하여 소 기도 벽을 나타내는 조직의 층을 바이오인쇄했다. 인간 기도 조직 구역을 초기 치수 1.25mm × 8mm × 0.25mm(W × L × H)로 제작했다. NHLF 또는 NHLF:EC 바이오-잉크에 의한 벽 층의 바이오인쇄 후, SAEC의 농축 세포 현탁액을 벽의 상부 표면 위에 바이오인쇄하여 추정 기도 간질의 상부에 기도 상피를 포함하는 제2 층을 생성했다(참조: 도 10).
이어서, 인간 기도 조직 구역을 혈청 함유 완전 세포 배양 배지에 침지시키고, 성숙용 5% CO2가 보충된 표준 가습 챔버에 위치시켰다. 이어서, 바이오인쇄된 인간 기도 구역을 정적 조건에서 배양하거나 사이토킨(들) 또는 생체역학적 신호(예: 유동, 전단 응력 등)의 첨가를 통해 자극했다. 이어서, 바이오인쇄된 인간 폐 조직 구조물을 7일 이하 동안 배양하고, 세포 조직, 세포외 매트릭스 생산, 세포 생존력 및 구조물 완전성에 대해 평가했다(참조: 도 11).
결과
EC-선상 마이크로용기 프로파일의 조직된 네트웨크를 함유하는 NHLF 벽을 포함하는 적층된 세포 구조물 및 소기도 상피 세포를 포함하는 정점 표면을 갖는 바이오인쇄된 인간 폐 조직 구조물을 성공적으로 제작하고 배양물에 유지시켰다. 바이오인쇄된 구조물은 NHLF 또는 NHLF:EC 바이오-잉크 원통을 사용하는 다층 접근법 및 SAEC의 바이오인쇄된 층을 사용하여 생성했다. 폐의 질병 과정에서 중요하다고 간주되는 사이토킨에 의한 자극시, 조직 비후화 및 NHLF 활성화를 포함하는 형태학상 변화가 관찰되었다.
실시예 16 - 적층된 혈관벽 구조물
원통형 바이오-잉크를 혈관 평활근 세포(SMC)로, 일부 실험에서는 피부 섬유아세포(Fb)로 제조했다. 간단히, 세포를 양이온 비함유 인산염 완충된 식염수(PBS)로 세척하여 표준 조직 배양 플라스틱으로부터 유리시킨 다음, 0.05% 트립신(Invitrogen)에 노출시켰다. 이어서, 유리된 세포를 혈청 함유 배지로 세척하고, 수집하고, 계수하고, Fb가 포함된 실험을 위해, 적합한 비로 배합하고, 원심분리로 펠릿화했다. 이어서, 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 유리 마이크로모세관으로 흡인시킨 다음, 이를 약 15 내지 20분 동안 완전 배지에 침지시켰다. 이어서, 이 원통형 바이오-잉크 구조물을 선형 채널을 함유하는 비세포 부착성 하이드로겔 금형에서 압출시키고, 2 내지 18시간 동안 유지시켰다.
이어서, 내피 세포(EC)를 고농축 세포 현탁액으로 제조했다. 간단히, EC를 상기한 바와 같이 유리시키고, 수집하고, 열거하고, 원심분리로 펠릿화했다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 소용적의 완전 배지에 재현탁시켜 고농축 세포 펠릿 1 × 105 세포/μL를 수득했다. 이어서, 이 세포 현탁액을 사용시까지 4℃에서 저장했다.
이어서, 혈관벽 구조물을 다중-웰 플레이트의 웰에서 또는 세포 배양 웰 삽입체의 막(트랜스웰, BD) 상에서 바이오인쇄했다. 원통형 SMC 또는 SMC:Fb 바이오-잉크를 사용하여 혈관벽 구역의 중막을 바이오인쇄했다. 혈관벽 구역을 초기 치수 1.25mm × 8mm × 0.25mm(W × L × H)로 제작했다. 조직의 제1 층을 형성하기 위한 SMC 또는 SMC:Fb 바이오-잉크에 의한 추정 중막의 바이오인쇄 후, EC의 농축 세포 현탁액을 제1 층의 상부 표면 위에 바이오인쇄하여 추정 중막으로서 작용하는 혈관 내피의 제2 층을 생성했다(참조: 도 12).
이어서, 바이오인쇄된 혈관벽 구역을 혈청 함유 완전 세포 배양 배지에 침지시키고, 성숙용 5% CO2가 보충된 표준 가습 챔버에 위치시켰다. 이어서, 바이오인쇄된 혈관벽 구역을 정적 조건에서 배양하거나 사이토킨(들) 또는 생체역학적 신호(예: 유동, 전단 응력 등)의 첨가를 통해 자극했다. 혈관벽 구역을 7일 이하 동안 배양하고, 세포 조직, 세포외 매트릭스 생산, 세포 생존력 및 구조물 완전성에 대해 평가했다(참조: 도 13).
결과
SMC 농후 배지 및 EC-선상 내막을 포함하는 적층된 세포 구조체를 갖는 바이오인쇄된 혈관벽 구역을 성공적으로 제작하고 배양물에 유지시켰다. 바이오인쇄된 구조물은 SMC 또는 SMC:Fb 바이오-잉크 원통을 사용하는 다층 접근법 및 EC의 바이오인쇄된 층을 사용하여 생성했다.
실시예 17 - 다중-웰 플레이트
세포 모집단(동종 또는 이종)을 임의로, 압출 화합물을 함유하는, 원통형 바이오-잉크 응집체, 세포 응집체의 현탁액 또는 세포 현탁액/페이스트를 포함하는 각종 바이오-잉크 포맷을 사용하여 바이오인쇄를 위해 제조했다. 간단히, 원통형 바이오-잉크를 제조하기 위해, 세포를 재조합 인간 트립신(75㎍/mL, Roche) 또는 0.05% 트립신(Invitrogen)을 사용하여 표준 조직 배양 플라스틱으로부터 유리시켰다. 효소 유리 후, 세포를 세척하고, 수집하고, 계수하고, 목적하는 비(즉, 50:50 간장 성상 세포(hSC):내피 세포(EC))로 배합하고, 원심분리로 펠릿화했다. 이어서, 상청액을 세포 펠릿으로부터 제거하고, 세포 혼합물을 목적하는 직경, 통상적으로 500㎛ 또는 250㎛ 내경의 유리 마이크로모세관으로 흡인시켰다. 이어서, 이 원통형 세포 제제를 금형에서 압출시키고, 바이오-잉크 성숙용 채널을 갖는 비세포 부착성 하이드로겔 물질로부터 생성했다. 이어서, 생성되는 바이오-잉크 원통을 실험적으로 측정된 양의 시간, 통상적으로 2 내지 24시간 동안 완전 세포 배양 배지에서 배양했다.
세포 응집체의 세포 현탁액 또는 세포 페이스트의 제조를 위해, 본원에 기재된 세포 증식 및 유리 프로토콜을 수행했다. 세포 펠릿 생성시, 상청액을 펠릿으로부터 제거하고, 펠릿을 사용자 지정 침착 주사기로 옮겼다. 이어서, 이 주사기를 다중-웰 플레이트에서 세포 응집체 용액 또는 페이스트의 직접 바이오인쇄를 위한 바이오프린터 침착 헤드에 장착시켰다.
이어서, 복제 조직 구조물을 다중-웰 조직 배양 플레이트의 웰(예: 6-웰 또는 24-웰) 내에서 또는 다중-웰 세포 배양 삽입체(즉, 트랜스웰, BD) 내에서 바이오인쇄한 다음, 적합한 다중-웰 플레이트에 위치시켰다. 바이오인쇄 후, 3차원 구조물을 일정 기간 동안 통상적으로 3 내지 14일 동안 관련 배지로 성숙시키고/조절했다. 성숙 후, 구조물을 채취하고, 고정시키고, 통상의 조직학 및 면역조직화학을 위해 처리했다.
결과
바이오인쇄된 조직을 다중-웰 배양 플레이트 또는 다중-웰 플레이트에 삽입된 다중-웰 배양 삽입체 내에서 성공적으로 제작했다. 이 접근법은 임의로 배양되고 동일하거나 독특한 배양 조건을 생성하도록 처리된 복제 바이오인쇄된 조직의 생성을 허용한다. 이 접근법은 바이오인쇄 처리 수율 및 샘플 생성의 상당한 증가를 유도한다(참조: 도 14).
실시예 18 - 바이오인쇄된 신생조직의 자극
관련 이종(즉, 다형) 세포 모집단을 포함하는 원통형 바이오-잉크를 제조했다. 세포의 생리학적으로 관련된 모집단(예: 정상 인간 폐 섬유아세포(NHLF) 및 소 기도 상피 세포(SAEC) 또는 혈관 평활근 세포(SMC) 및 혈관 내피 세포(EC))을 특정 비로 배합하여 적절한 바이오-잉크를 생성했다. 추가의 실험에서, 간장 성상 세포(hSC)를 EC와 배합하여 간 조직을 생성했다. 추가의 실험에서, 간장 성상 세포(hSC)를 EC와 배합하여 간 조직을 생성했다. 세포를 표준 실험실 조건하에 유지시키고 증식시키고, 세포를 세포와 동일한 벤더로부터 구입한 배지 또는 이러한 특정 세포형의 표준 세포 배양 실행에 도움이 되는 주요 문헌에서 통상적으로 발견된 성분을 포함하는 배지에서 배양했다. 바이오-잉크 제조를 위한 세포 처리는 다음과 같다: 간단히, 세포를 양이온 비함유 인산염 식염수(PBS)로 세척하여 표준 조직 배양 플라스틱으로부터 유리시킨 다음, 0.1 내지 0.05% 트립신(Invitrogen)에 노출시켰다. 이어서, 유리된 세포를 혈청 함유 배지로 세척하고, 수집하고, 계수하고, 자극 검정 또는 수행되는 실험을 위해 적합한 비로 배합하고, 원심분리로 펠릿화했다. 이어서, 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 유리 마이크로모세관으로 흡인시킨 다음, 약 15 내지 20분 동안 완전 배지에 침지시켰다. 이어서, 이 원통형 바이오-잉크 구조물을 선형 채널을 함유하는 비세포 부착성 하이드로겔 금형에서 압출시키고, 2 내지 18시간 동안 유지시켰다.
상부 표면에 제한된 동종(즉, 단일 형태) 세포 층을 필요로 하는 조직 구조물을 위해, 관련 세포형을 함유하는 2차 세포 모집단을 사용했다. 통상적으로, (각각 혈관벽 및 인간 폐 조직 모델을 위한) 혈관 내피 세포 또는 소 기도 상피 세포를 고농축 세포 현탁액으로 제조했다. 간단히, 세포를 상기한 바와 같이 유리시키고, 수집하고, 계산하고 원심분리로 펠릿화했다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 소용적의 완전 배지에 재현탁시켜 고농축된 세포 펠릿 1 × 105 세포/μL를 수득했다. 이어서, 이 세포 현탁액을 사용시까지 4℃에서 저장했다.
이어서, 바이오인쇄된 조직 구조물을 다중-웰 플레이트의 웰에서 또는 세포 배양 웰 삽입체(트랜스웰, BD)의 막 위에서 제작했다. 다중 조직형을 생성했다. 다세포 NHLF 또는 NHLF:EC 바이오-잉크를 사용하여 소 기도 벽을 재현시키기 위한 두꺼운 간질 조직을 바이오인쇄하고, 이어서, 동족 상피 장벽 층을 제공하기 위해 SAEC로 적층시켰다. 혈관 SMC 또는 SMC:섬유아세포 바이오-잉크를 사용하여 혈관 벽을 재현하기 위한 두꺼운 간질 조직을 바이오인쇄하고, 이어서 동족 내피 장벽을 제공하기 위해 EC로 적층시켰다. hSC 바이오-잉크를 산재된 내피 네트워크 또는 내피 층이 함유된 패치에서 EC와 함께 바이오인쇄했다. 조직 구역을 초기 치수 1.25mm × 8mm × 0.25mm(W × L × H)로 제작했다. 폐 구조물 또는 혈관벽 구역의 바이오인쇄 후, 농축된 세포 현탁액을 이미 분배된 바이오-잉크 층의 상부에서 바이오인쇄하여 제1 층의 표면 위에 세포의 추가로 한정된 층을 생성했다.
이어서, 바이오인쇄된 신생조직을 혈청 함유 완전 세포 배양 배지에 침지시키고, 성숙용 5% CO2가 보충된 표준 가습 챔버에 위치시켰다. 이어서, 바이오인쇄된 신생조직을 배양하고, 소정 시간 동안 관련 사이토킨(들)으로 자극하고, 포르말린 고정시키고, 채취하고, 표준 조직학 및 면역조직화학을 위해 처리했다. 바이오인쇄된 조직을, 예를 들면, 이로써 한정되지 않지만, 조직 형태, 세포 조직, 세포외 매트릭스 생산, 세포 증식, 세포 생존력 및 구조물 완전성과 같은 특성에 대해 평가했다.
사이토킨 자극은 사이토킨을 배양 배지에 직접 첨가하고, 바이오인쇄된 조직을 적절한 자극에 직접 및 연장 세포 접근을 제공하기 위한 첨가된 단백질로 배양하여 수행했다. 용량-반응 실험을 실험 사이토킨의 ED50에 따라 통상적으로 0.1 내지 100ng/mL 범위의 용량으로 수행했다. 사이토킨 자극이 48시간 이상 수행된 실험을 위해, 배지를 변경하고, 새로운 사이토킨을 48시간 마다 첨가했다.
결과
세포의 생리학적으로 관련된 모집단을 함유하는 바이오인쇄된 신생조직을 2차원 시험관내 시스템으로 세포 반응을 도출하는 것으로 이미 입증된 사이토킨으로 성공적으로 자극시켰다. 바이오인쇄된 3차원 조직 구조물에서 관찰된 반응은 용량 의존적이고, 바이오인쇄된 구조물 내의 세포에 독특한 것으로 관찰되었다(참조: 예를 들면, 도 11, 15 및 16).
실시예 19 - 연속 침착으로 공성형된 기능 간 조직 미세구조의 바이오인쇄
30% PF-127의 제조
30% PF-127 용액(w/w)은 PBS를 사용하여 제조했다. PF-127 분말을 4℃에서 유지된 자기 교반 플레이트를 사용하여 냉각된 PBS와 혼합했다. 완전 용해는 약 48시간에 발생한다.
세포 제조 및 금형 및 충전물의 공동-인쇄
3mL의 PF-127 용액은 바이오프린터 및 510㎛ 분배 팁을 사용하여 3cc 저장소에서 흡인시키고, 30% PF-127 용액을 6 웰 트랜스웰 상에서 단일 육각형 형태로 바이오인쇄하고, 순차적으로 6회 적층시켰다.
7.8 × 107 간장 세포(HepG2)로 구성된 세포 현탁액을 1000g에서 6분 동안 원심분리시켜 세포 페이스트를 생성했다. 5μL의 세포 페이스트를 510㎛ 침을 통해 압출시켜 각 삼각형 금형을 충전시켰다(참조: 17A). 육각형 금형을 실온에서 15분 동안 배양했다. 3mL의 배지(10% FBS 및 1× 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B로 보충된 DMEM)를 상기 지지된 트랜스웰을 갖는 웰에 첨가한 후, 37℃ 및 5% CO2에서 배양했다. 45분 이내에, PF-127 금형을 배지에 용해시켜 세포 및 공극 공간의 평면 기하 형상을 형성하기 위해 성형된 간장 바이오-잉크를 순수하게 남긴다(참조: 도 17B). 배지로부터 잔류성 PF-127을 제거하기 위해, 트랜스웰을 3mL의 배지를 함유하는 새로운 웰로 옮기고, 2시간 동안 배양했다. 이를 6시간 동안 총 배지 교환 9ml에 대해 추가로 2회 반복했다.
6시간 후, 트랜스웰을 배지가 없는 새로운 웰로 옮기고, 90% 인간 대동맥 내피 세포 및 10% 간장 성상 세포의 비로 2×106 세포의 세포 현탁액을 분배하여 PF-127 금형의 용해로 생성된 공극을 충전시켰다. 간장 구조물을 실온에서 15분 동안 배양시켰다. 15분 배양 후, 4mL 배지는 85% 배지(간장 및 성상 세포를 지지하기 위해 10% FBS 및 1× 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B로 보충된 DMEM 및 인간 대동맥 내피 세포를 지지하기 위해 2% LSGS, 10% FBS, HEPES 및 1× 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B로 보충된 15% M199)를 함유한다. 구조물은 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 배양하여, 개재 내피 세포 포함 조직을 갖는 간장 실질의 소편(삼각형) 배열을 포함하는 평면 기하 형상을 갖는 연속 구조물을 형성했다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되었으나, 이러한 실시양태가 단지 예로써 제공된다는 것은 당해 기술분야의 숙련가에게 자명하다. 다수의 변형, 변화 및 치환이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고도 당해 분야의 숙련가에게서 이루어질 것이다. 본원에 기재된 실시양태에 대한 각종 대안이 본 발명을 실시하는데 적합하게 사용된다는 것이 이해되어야 한다.

Claims (52)

  1. 적어도 하나의 부착 세포형을 포함하는 살아있는 3차원 조직 구조물로서,
    상기 적어도 하나의 부착 세포형은 응집(cohered) 및 융합되어 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하고,
    상기 조직 구조물은 혈관 튜브가 아닌 다층 구조를 갖고, 상기 조직 구조물은 시험관내에서 사용하기 위한 것이며,
    단, 상기 조직 구조물 중의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있는, 살아있는 3차원 조직 구조물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조직 구조물이 바이오인쇄시 또는 사용시에 실질적으로 임의의 사전-형성된 골격을 가지지 않는, 조직 구조물.
  3. 제1항에 있어서, 조직 구조물이 복수의 세포형을 포함하는 적어도 하나의 층을 포함하고, 상기 세포형이 서로에 대해 공간적으로 배열되어 평면 기하 형상을 형성하는, 조직 구조물.
  4. 제1항에 있어서, 조직 구조물이 복수의 층을 포함하고, 적어도 하나의 층이 적어도 하나의 다른 층과는 조성적 또는 구조적으로 상이하여 층 기하 형상을 형성하는, 조직 구조물.
  5. 제1항에 있어서, 비-부착 세포형을 추가로 포함하는, 조직 구조물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조직 구조물이 생체적합성 표면에 고정되어 있는, 조직 구조물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 생체적합성 표면이 다공성 막인, 조직 구조물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 생체적합성 표면이 생체적합성 하이드로겔, 단백질, 화학물질, 펩티드, 항체 또는 성장 인자 중의 하나 이상으로 피복되어 있는, 조직 구조물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 조직 구조물은 하나 이상의 측면에, 유체 유동에 의해 유발된 전단력을 받는 것인, 조직 구조물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조직 구조물이 바이오인쇄시에 이의 최소 직경에서 적어도 약 25㎛인, 조직 구조물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조직 구조물이 바이오인쇄시에 이의 최대 직경에서 약 3cm 이하인, 조직 구조물.
  12. 제1항에 있어서, 시험관내 분석에 사용하기 위한, 조직 구조물.
  13. 제12항에 있어서, 약물 시험에 사용하기 위한, 조직 구조물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 부착 세포가 분화 세포인, 조직 구조물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 부착 세포가 비-분화 세포인, 조직 구조물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 부착 세포가 간장, 위장관, 췌장, 신장, 폐, 기관, 혈관, 골격근, 심장, 피부, 평활근, 결합 조직, 각막, 비뇨생식기, 유방, 생식기, 내피, 상피, 섬유아세포, 신경, 슈완(Schwann), 지방, 골, 골수, 연골, 주피세포, 중피, 내분비, 간질, 림프, 혈액, 내배엽, 외배엽 및 중배엽으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 유래하는, 조직 구조물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 조직 구조물이 혈관벽 구역인, 조직 구조물.
  18. 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이로서,
    각각의 조직 구조물은 적어도 하나의 부착 세포형을 포함하고,
    적어도 하나의 부착 세포형은 응집 및 융합되어 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하고,
    각각의 조직 구조물은 다층 구조를 갖고, 각각의 조직 구조물은 시험관내에서 사용하기 위한 것이며,
    단, 상기 각각의 조직 구조물 중의 적어도 하나의 성분은 바이오인쇄되어 있는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  19. 제18항에 있어서, 각각의 조직 구조물이 바이오인쇄시 또는 사용시에 임의의 사전-형성된 골격을 포함하지 않는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  20. 제18항에 있어서, 상기 부착 세포는 간장 세포, 위장관 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 폐 세포, 기관 세포, 혈관 세포, 골격근 세포, 심장 세포, 피부 세포, 평활근 세포, 결합 조직 세포, 각막 세포, 비뇨생식기 세포, 유방 세포, 생식기 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유아세포, 신경 세포, 슈완 세포, 지방 세포, 골 세포, 골수 세포, 연골 세포, 주피세포, 중피 세포, 내분비 조직으로부터 유래하는 세포, 간질 세포, 림프 세포, 혈액 세포, 내배엽-유래 세포, 외배엽-유래 세포, 중배엽-유래 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  21. 제18항에 있어서, 어레이 내의 각각의 조직 구조물이 실질적으로 유사한, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  22. 제18항에 있어서, 상기 어레이 내의 하나 이상의 조직 구조물이 독특한 것인, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  23. 제18항에 있어서, 상기 어레이 내의 하나 이상의 개개 조직이 혈관 또는 림프관, 근육, 자궁, 신경, 점막, 중피, 대망, 각막, 피부, 간장, 신장, 심장, 기관, 폐, 골, 골수, 지방, 결합, 방광, 유방, 췌장, 비장, 뇌, 식도, 위, 창자, 결장, 직장, 난소, 전립선, 내분비 조직, 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인간 조직을 나타내는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  24. 제18항에 있어서, 각각의 조직 구조물이 생체적합성 다중-웰 용기의 웰에 존재하는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  25. 제24항에 있어서, 상기 웰이 생체적합성 하이드로겔, 단백질, 화학물질, 펩티드, 항체 또는 성장 인자 중의 하나 이상으로 피복되어 있는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  26. 제24항에 있어서, 각각의 조직 구조물이 용기의 웰 내의 다공성 생체적합성 막 위에 배치되어 있는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  27. 제24항에 있어서, 상기 용기가 자동화 또는 반자동화 약물 스크리닝 공정과 호환성이 있는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  28. 제18항에 있어서, 각각의 조직 구조물이 생체적합성 표면에 고정되어 있는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  29. 제28항에 있어서, 상기 생체적합성 표면이 다공성 막인, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  30. 제28항에 있어서, 상기 생체적합성 표면이 생체적합성 하이드로겔, 단백질, 화학물질, 펩티드, 항체 또는 성장 인자 중의 하나 이상으로 피복되어 있는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  31. 제28항에 있어서, 각각의 조직 구조물은 하나 이상의 측면에, 유체 유동에 의해 유발된 전단력을 받는 것인, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  32. 제18항에 있어서, 상기 어레이 내의 각각의 조직 구조물이 배양시에 독립적으로 유지되는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  33. 제18항에 있어서, 상기 어레이 내의 2개 이상의 개개 조직 구조물이 가용성 인자를 교환하는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  34. 제18항에 있어서, 시험관내 분석에 사용하기 위한, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  35. 제34항에 있어서, 약물 시험에 사용하기 위한, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이.
  36. 제18항에 있어서, 상기 어레이 내의 적어도 하나의 조직이 혈관벽 구역인, 살아있는 3차원 조직 주조물의 어레이.
  37. 하나 이상의 층을 포함하는 살아있는 3차원 조직 구조물로서,
    상기 각각의 층은 하나 이상의 세포형을 포함하고,
    상기 하나 이상의 층은 응집되어 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하고,
    상기 조직 구조물은
    a. 서로에 대해 공간적으로 배열되어 평면 기하 형상을 형성하는 복수의 세포형을 포함하는 적어도 하나의 층; 및
    b. 적어도 하나의 층이 적어도 하나의 다른 층과는 조성적 또는 구조적으로 상이하여 층 기하 형상을 형성하는 복수의 층
    중의 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는, 살아있는 3차원 조직 구조물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 조직 구조물의 적어도 하나의 성분이 바이오인쇄되어 있는, 살아있는 3차원 조직 구조물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 조직 구조물이 바이오인쇄시 또는 사용시에 임의의 사전-형성된 골격을 실질적으로 포함하지 않는, 살아있는 3차원 조직 구조물.
  40. 제37항에 있어서, 시험관내 분석에 사용하기 위한, 살아있는 3차원 조직 구조물.
  41. 제40항에 있어서, 약물 시험에 사용하기 위한, 살아있는 3차원 조직 구조물.
  42. a. 적어도 하나의 부착 세포형을 포함하는 바이오-잉크를 형태 내로 또는 위로 바이오인쇄하는 단계; 및
    b. 상기 바이오-잉크를 살아있는 3차원 조직 구조물 내로 융합하는 단계를 포함하고,
    단, 상기 조직 구조물이 혈관 튜브가 아닌 시험관내 사용을 위한 것인,
    살아있는 3차원 조직 구조물을 구축하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 조직 구조물이 바이오인쇄시 또는 사용시에 임의의 사전-형성된 골격을 포함하지 않는, 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 형태가 바이오인쇄되는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 형태가 바이오-잉크로 실질적으로 동시에 바이오인쇄되는, 방법.
  46. 제42항에 있어서, 당해 형태를 용해시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  47. a. 포유동물 세포를 포함하는 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계;
    b. 상기 하나 이상의 응집된 다세포 응집체를 지지체 위에 배치하여,
    i. 서로에 대해 공간적으로 배열되어 평면 기하 형상을 형성하는 복수의 세포형을 포함하는 적어도 하나의 층; 및
    ii. 적어도 하나의 다른 층과는 조성적 또는 구조적으로 상이하여 층 기하 형상을 형성하는 복수의 층 중의 적어도 하나를 형성하는 단계;
    c. 상기 하나 이상의 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 살아있는 3차원 조직 구조물을 형성하는 단계를 포함하는, 살아있는 3차원 조직 구조물을 구축하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 조직 구조물의 적어도 하나의 성분이 바이오인쇄되는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 조직 구조물이 바이오인쇄시 또는 사용시에 임의의 사전-형성된 골격을 포함하지 않는, 방법.
  50. a. 포유동물 세포를 포함하는 응집된 다세포 응집체를 제조하는 단계;
    b. 조직 어레이에 적합한 형태로 공간적으로 배열되어 상기 응집체는 상기 응집된 다세포 응집체를 생체적합성 지지체 위에 배치하는 단계; 및
    c. 상기 다세포 응집체를 배양하여, 이들을 응집시키고 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이를 형성하는 단계를 포함하는, 살아있는 3차원 조직 구조물의 어레이를 구축하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 각각의 조직 구조물의 적어도 하나의 성분이 바이오인쇄되는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 각각의 조직 구조물이 바이오인쇄시 또는 사용시에 임의의 사전-형성된 골격을 실질적으로 포함하지 않는, 방법.

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