KR102284592B1

KR102284592B1 - 생체 적합성 고분자를 이용한 배열된 구조체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 배열된 구조체

Info

Publication number: KR102284592B1
Application number: KR1020200011492A
Authority: KR
Inventors: 김근형; 이지운; 채수정
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2020-01-31
Filing date: 2020-01-31
Publication date: 2021-08-02

Abstract

본 발명은 생체 적합성 고분자를 이용한 배열된 구조체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 배열된 구조체 등에 관한 것으로, 상기 본 발명의 제조방법은 양쪽성 물질의 녹는점이 52 내지 55^oC이며, 150^oC 부근에서 인화점을 띄고 있음에 따라, 해당 온도 범위 이내에 가공할 수 있는 합성 고분자와의 혼합을 통해 배열된 형태의 안전한 구조체 제작이 가능하고, 세포의 증식 및 분화를 촉진시킴에 따라 배열된 조직이나 장기 재생과 관련된 다양한 분야에 적용될 것으로 기대된다.

Description

생체 적합성 고분자를 이용한 배열된 구조체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 배열된 구조체{Method for producing arranged structure using biocompatible polymer and arranged structure produced using same}

본 발명은 생체 적합성 고분자를 이용한 배열된 구조체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 배열된 구조체 등에 관한 것이다.

조직공학은 생명과학과 공학의 원리를 활용하여 조직의 기능을 재생, 유지, 혹은 향상시키는 생물학적 제품을 개발하려는 여러 학문이 제휴한 분야이다. 대표적인 방법으로는 재생을 원하는 조직으로부터 세포를 분리하여 배양하고 이를 적절한 생체재료에 접종하여 증폭 배양함으로써 인공적으로 조직을 형성하는 시술이다.

이러한 시술에는 세포를 필요한 부위에 전달하기 쉽고, 조직이 성장하는데 3차원 구조로 기계적인 보조역할을 할 수 있으며 기능을 할 수 있는 새로운 조직으로 만들어 나가는 적당한 세포지지체가 필요하다. 이러한 지지체는 세포가 증식하고 특유의 기질을 만들 수 있는 적절한 미세구조를 갖고 있어야 하며, 3차원으로 상호 연결된 많은 기공을 가지고 있어 세포가 이 기공을 통해 안으로 자랄 수 있어야 하고, 세포 성장에 필요한 영양분을 공급할 수 있어야 한다. 또한 독성이 없으며 지지체로서의 기능 종료 후에는 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 생분해성 재료여야 한다.

인공 조직의 성능 향상을 위해 최근의 인공 조직은 성장인자와 세포를 원하는 위치에 보유할 수 있고 세포를 균일하게 분포시킬 수 있으며, 성장인자를 효과적으로 운반할 수 있다는 점으로 인해 세포 프린팅 기술(cell printing techniques)이 다양한 조직 재생 분야에 널리 응용되고 있다. 성공적인 조직 재생을 위해서 세포가 탑재되는 담체는 높은 다공성과 공극 크기 조절 가능성, 산소와 영양성분 공급, 및 혈관 신생을 위해 공극 간 100% 상호연결성을 갖추어야 한다.

한편, 배열된 구조를 갖는 조직의 재생을 위해서는 반드시 세포들을 배열된 형태로 배양하고 분화시켜야 한다. 따라서 많은 연구팀들이 세포를 배열된 형태로 배양하기 위해 여러 가지 방법으로 배열된 섬유 구조를 갖는 세포지지체를 제작하기 위해 노력해 왔다. 그러나 전기방사 공정이나 리소그래피 공정 같은 배열된 섬유 구조를 제작하는데 빈번하게 사용되는 공정들은 대체로 적층이 불가능하여 때문에 세포담체로써 사용되는데 한계점을 가지므로 이에 대한 많은 연구가 필요한 실정이다.

또한, 기존의 PCL 혹은 PLGA 등 용융방식의 3D 프린팅 (melt-printing)을 통해 구조체를 제작하는 방식의 경우, 노즐에서 토출될 때 표면이 매끈한 형태의 구조만 제작이 가능하였다. 최근에는 PVA를 고온의 수분에 용해시킨뒤 해당 용액을 PCL과 물리적으로 혼합한 뒤 토출하는 방식으로 배열된 형태의 PCL 구조를 제작하는 기술이 개발되었으나, 현재까지는 적층방식의 3D 프린팅 (additive manufacutring)을 통해 PCL의 배열된 구조체를 제작하는 기술은 고온의 수분에 용해시켜 토출하는 방식이 전부였다.

대한민국 출원공개공보 10-2017-0012099호

본 발명자들은 조직 재생을 위한 구조체에 대한 연구를 거듭한 결과 배열된 구조를 갖는 조직의 재생을 위해서는 반드시 세포들이 배열된 형태로 배양되고 분화시켜야 함을 인지하여 배열된 구조체 제작을 위한 제조방법을 발명하고, 상기 제조방법을 통한 배열된 구조체 경우 기존의 표면이 매끈한 형태의 구조체에 비해 빠른 세포성장 및 세포분화 효과가 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 (a) 녹는점이 52 내지 56^oC이며, 140 내지 160^oC의 인화점을 갖는 양쪽성 물질; 및 52 내지 160^oC에서 가공가능한 생분해성 고분자를 포함하는 바이오잉크를 준비하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 바이오잉크를 노즐로 단일 가닥(strut)을 토출하는 단계; 및

(c) 상기 (b)단계의 단일 가닥의 양쪽성 물질을 세척하는 단계를 포함하는, 비등방성(anisotropic)으로 배열된 구조체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 비등방성(anisotropic)으로 배열된 구조체를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 녹는점이 52 내지 56^oC이며, 140 내지 160^oC의 인화점을 갖는 양쪽성 물질; 및 52 내지 160^oC에서 가공가능한 생분해성 고분자를 포함하는 바이오잉크를 준비하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 단일 가닥의 양쪽성 물질을 세척하는 단계를 포함하는, 비등방성(anisotropic)으로 배열된 구조체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 비등방성(anisotropic)으로 배열된 구조체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 (a) 단계의 양쪽성 물질은 플루로닉계 공중합체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 (a) 단계에서 양쪽성 물질은 Pluronic F-127(PF-127)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (a) 단계의 생분해성 고분자는 콜라겐, 젤라틴, 히아루론산(hyaluronic acid) 및 그의 유도체, 키틴, 키토산, 알지네이트(alginate), 피브로넥틴 (fibronetin), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PGA(polyglycolic acid), PLA(poly(lactic acid)) 및 유사 공중합체들, 폴리 ε-카프로락톤(poly ε-caprolactone, PCL), 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리오르쏘에스터(polyorthoesters), 폴리우레탄(polyurethane)의 합성재료로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (a) 단계의 바이오잉크는 양쪽성 물질 및 생분해성 고분자가 3.5 내지 4.5 : 5.5 내지 6.5의 질량비(w/w %)로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계는 50 내지 160 ℃의 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계의 노즐은 300 내지 500 μm 직경일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 배열된 구조체는 세포 증식 또는 분화 효과가 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 배열된 구조체는 단일 가닥(strut)의 번들(bundle) 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 배열된 구조체는 근원세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 심근원세포 (cardiomyoblast), 평활근세포 (smooth muscle cell), 신경세포 (neural cell), 및 혈관세포 (vascular cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포를 증식 또는 분화시키는 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제조방법은 양쪽성 물질의 녹는점이 52 내지 55^oC이며, 150^oC 부근에서 인화점을 띄고 있음에 따라, 해당 온도 범위 이내에 가공할 수 있는 합성 고분자와의 혼합을 통해 배열된 형태의 안전한 구조체 제작이 가능하다.

또한, 근육세포를 활용한 세포실험 결과 본 발명의 방법에 따라 제작된 구조체가 기존의 구조체에 비해 세포의 증식 및 분화가 촉진됨을 확인하였다.

도 1은 생분해성을 가진 생체적합재료인 PCL과 PF-127의 혼합 및 이의 토출을 통한 배열성을 지닌 PCL 섬유다발 구조체 제작에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 (a-b) PCL과 PF-127 구조체의 표면 (PF-127 제거 전/후) 및 단면 형상, (c) 표면 형상의 배열성 측정 데이터, 및 (d) 배열성 측정 데이터의 반값 전폭 (FWHM) 측정 데이터를 나타낸 것이다.
도 3은 (a) PCL과 PF-127를 혼합한 뒤, PF-127을 제거한뒤 촬영한 주사전자현미경(SEM) 이미지, (b) PCL, PF-127 혼합 용액의 노즐 내에서의 횡단면 및 종단면 SEM 이미지, 및 (c) 각 구역에 따른 기공 크기 분포 데이터를 나타낸 것이다.
도 4는 PCL과 PLGA 구조체의 (a) 표면과 (b) 단면 주사전자현미경 이미지, (c) 방향성 측정 데이터, 및 이를 기반으로 한 (d) orientation factor 데이터(FWHM)를 나타낸 것이다,
도 5는 (a) 근육에 대한 모식도 및 근육 형태를 모사하기 위한 합성고분자 기반 (b) 표면이 매끄러운 PCL 번들 (PCL-B) 및 (c) 마이크로 PCL strut으로 이루어진 번들 (FPCL-B)의 optical images, 표면 이미지 및 단면 주사전자현미경 이미지, (d) 15개의 strut으로 이루어진 bundle의 방향성 분석과 하나의 strut 내부의 방향성 분석, (e) protein adsorption, (f) stress-strain curve, (g) tensile modulus, 및 (h) FT-IR 분석 데이터를 나타낸 것이다.
도 6은 제작된 구조체에서의 근육세포의 활성도를 평가한 것으로, (a) 세포 증식데이터, (b) 4일차 세포 배양 후 세포핵 (DAPI) 및 F-actin (Phalloidin) 데이터, (c) 방향성 분석, 21일차 세포 배양 후 (d) strut bundle의 단면의 세포핵 분포 평가, (e) 세포핵 및 myosin heavy chain (MHC) 염색, (f) alpha-actinin 염색 결과, 14일차 세포배양 후 (g) 세포핵 종횡비 데이터, (h) MHC 면적, (i) MHC의 fusion index 및 maturation ratio 데이터, (j) alpha-actinin 발현 면적, 및 (k) 7, 21일차의 RT-PCR 분석 데이터를 나타낸 것이다.
도 7은 인체의 인대 및 건 구조에 대한 모식도와 이를 모사하기 위한 PCL/PF-127 혼합 용액의 바이오프린팅 기술 접목 및 이에 대한 tenocyte 배양 및 형광염색 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 제작된 구조체의 형태를 보여주기 위한 모식도 및 이의 데이터를 나타낸 것으로, (a)는 프린팅 이후 수중의 상태에 담지해 두었을 때, 섬유 가닥이 풀려나오는 것을 보여주는 데이터이며, (b)~(d)는 단면, 45^o 기울여진 상태, 그리고 표면의 주사전자현미경 이미지를 보여준 데이터로, 제작된 구조체는 단면의 이미지에서는 기공을 가지고, 표면은 배열성을 띈 구조를 보이며, 제작된 구조체의 섬유는 다양한 폭을 가지고 있음을 나타내는 데이터이고, (e)는 배열성 패턴의 간격(μm)을 나타낸 데이터이다.

본 발명자들은 조직 재생을 위한 구조체에 대한 연구를 거듭한 결과 배열된 구조를 갖는 조직의 효과적인 재생을 위해서는 세포들이 배열된 형태로 배양되고 분화시켜야 함을 인지하여, 적층 형태의 용융 방식 3D 프린팅을 통해 단일가닥을 토출하였음에도, 최종적으로 제작되는 형태는 배열된 형태의 여러 가닥의 다발형태의 구조체를 제작가능한 본 발명의 제조방법을 발명하고, 상기 제조방법을 통한 배열된 구조의 구조체 경우 일반적으로 제작되는 구조체에 비해 빠른 세포성장 및 세포분화 효과가 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 제조방법에 따라 양쪽성 물질인 PF-127; 및 생분해성 고분자인 PCL 또는 PLGA를 용융 혼합한 뒤 프린팅함으로써 배열된 섬유구조를 갖는 구조체의 제조가 가능함을 확인하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 양쪽성 물질인 PF-127을 세척 제거한 경우, 하나의 가닥(strut)이 내부 기공을 가지고 배열성을 가진 중심 가닥과 주변부에 미세한 가닥들로 이루어짐을 확인하였다(실시예 3, 8 및 도 8 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 근원세포가 포함된 배열된 구조체 배양 및 세포실험을 수행한 결과 본 발명의 방법에 따라 제작된 구조체에서 세포 증식 및 분화 모두 뛰어남을 확인하였다(실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 건 세포를 포함한 배열된 구조체 배양 및 세포실험을 수행한 결과에서도, 마찬가지로 건세포 특정 유전자인 tenomodulin이 잘 발현되며, 건 세포 또한 배열성을 가짐을 확인하였다(실시예 7 참조).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 (a) 녹는점이 52 내지 56^oC이며, 140 내지 160^oC의 인화점을 갖는 양쪽성 물질; 및 52 내지 160^oC에서 가공가능한 생분해성 고분자를 포함하는 바이오잉크를 준비하는 단계;

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 배열된 구조체를 제공한다.

본 발명에서 사용하는 용어 “양쪽성 물질”은 플루로닉계 공중합체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용하는 용어 “플루로닉계 공중합체”는 BASF사로부터 플루로닉이라는 상품명으로 판매되는 다양한 공중합체들이 사용될 수 있으며, F127, P105 등과 같은 다양한 공중합체들을 그 예로 들 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 플루로닉 F127 (Pluronic F-127)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다. Pluronic F-127은 생체적합한 합성고분자로 친수기와 소수기를 모두 가지고 있는 양친매성 물질이며, 용매 혹은 혼합되어있는 농도 상태에 따라 다양한 형태를 띌 수 있다. Pluronic F-127의 이러한 특성은 수중 상태에서의 sol-gel transition을 가능하게 하고, 생체적합한 특성을 통해 더해져 바이오프린팅에 응용가능하다:

[화학식 1]

본 명세서에서, 플루로닉계 공중합체는 예를 들어, Pluronic F-127(PF-127)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 상기 (a) 단계의 생분해성 고분자는 생체 내에서 분해될 수 있는 고분자라면 모두 적용가능하며, 콜라겐, 젤라틴, 히아루론산(hyaluronic acid) 및 그의 유도체, 키틴, 키토산, 알지네이트(alginate), 피브로넥틴 (fibronetin), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PGA(polyglycolic acid), PLA(poly(lactic acid)) 및 유사 공중합체들, 폴리 ε-카프로락톤(poly ε-caprolactone, PCL), 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리오르쏘에스터(polyorthoesters), 폴리우레탄(polyurethane)의 합성재료로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 상기 생분해성 고분자는 바람직하게는 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)) 또는 폴리 ε-카프로락톤(poly ε-caprolactone, PCL)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서, 상기 (a) 단계의 바이오잉크는 양쪽성 물질 및 생분해성 고분자가 3.5 내지 4.5 : 5.5 내지 6.5의 질량비(w/w %)로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이는 본 발명의 실시예에서 양쪽성 물질 및 생분해성 고분자의 질량비에 따른 실험 결과, 상기 범위 외의 질량비에서는 배열된 구조체가 형성되기 어렵기 때문이다.

본 명세서에서, 상기 (b) 단계는 50 내지 160 ℃, 보다 바람직하게는 52 내지 150℃의 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 양쪽성 물질의 녹는점이 52 내지 55^oC이며, 150^oC 부근에서 인화점을 띄고 있음에 따라 해당 온도 범위 이내에서 가공할 필요가 있기 때문이다.

본 명세서에서, 상기 (b) 단계의 토출은 예를 들어, 1 내지 50 ml/h, 1 내지 40 ml/h, 1 내지 30 ml/h, 1 내지 20 ml/h, 1 내지 15 ml/h, 3 내지 12 ml/h, 3 내지 10 ml/h, 4 내지 10 ml/h, 5 내지 10 ml/h, 6 내지 10 ml/h, 7 내지 9 ml/h, 또는 약 8ml/h의 공압 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 상기 (b) 단계의 토출은 예를 들어, 0.1 내지 50 ml/h, 0.1 내지 40 ml/h, 1 내지 30 ml/h, 5 내지 30 ml/h, 5 내지 25 ml/h, 10 내지 25 ml/h, 10 내지 20 ml/h, 12 내지 20 ml/h, 12 내지 17 ml/h, 또는 약 15 ml/h의 유속으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 상기 (b) 단계의 노즐은 300 내지 500 μm 직경을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 상기 (c) 단계의 세척에 사용되는 용매는 양쪽성 물질을 제거하기 위한 용매라면 그 종류가 제한되지 않으나, 예를 들어, 1차수, 2차수, 3차수 등 증류수를 포함하는 물, 또는 에탄올일 수 있다.

본 명세서에서, 상기 (c) 단계의 세척은 양쪽성 물질을 제거하기 위하여, 적절한 횟수로 반복 수행할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 배열된 구조체는 비등방성(anisotropic)으로 배열된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 상기 배열된 구조체는 세포 증식 또는 분화 효과가 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포는 예를 들어, 근원세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 심근원세포 (cardiomyoblast), 평활근세포 (smooth muscle cell), 신경세포 (neural cell), 및 혈관세포 (vascular cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 상기 배열된 구조체는 단일 가닥(strut)의 번들(bundle) 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용하는 용어 “근원세포”는 분화되지 않은 상태에 있는 근육 세포를 의미하며, 근원세포의 분화가 진행되면 다른 세포와 융합하여 다핵의 가늘고 긴 근관 (myotube)을 형성하여 근섬유 (muscle fiber)를 만든다. 본 발명의 제조방법에 따른 근원세포의 분화 촉진 효과는 골격근, 심근 및 평활근 등에서 유도될 수 있으며, 상기 근원세포는 심근원세포(cardiomyoblast)일 수 있다. 또한, 상기 근원세포 이외에도, 건 세포(tenocyte), 평활근세포 (smooth muscle cell), 신경세포 (neural cell), 혈관세포 (vascular cells)를 바이오잉크 제작에 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 배열된 구조체의 제조

본 발명에서는 양쪽성 물질과 생체 적합고분자를 활용하여 배열된 구조체를 제작하고자 하였다. 재료의 녹는점을 고려하여 그 재료는 PCL(Polycaprolactone)과 PF127 (Pluronic F-127)로 택하였다. PCL과 PF127의 가루를 10:0 또는 6:4의 중량비로 교반 한 후, 섭씨 90℃로 가열되는 배럴에서 로테이터를 활용하여 1000rpm에서 10분간 재교반하였다. 그 후 배럴 아래쪽에 400μm 노즐을 체결하고 3차원 토출 공정을 실시하였다. 섭씨 90℃로 유지되는 배럴에 8 ml/h의 공압을 가하여 토출을 진행하였으며, 그 속도는 15mm/s으로 제어하였다.

양쪽성 물질을 제거하기 위하여 제작된 구조체를 섭씨 4℃에서 3차 증류수에 담궜으며, 3일동안 6시간에 한번씩 3차 증류수를 교체해 주었다. 양쪽성 물질이 제거됨으로써 해당 물질이 위치하고 있던 자리가 비게 되어 섬유 다발의 형태가 최종적으로 제작하였다.

실시예 2. PCL과 PF -127의 섬유구조의 형태 관찰

실시예 1에서 언급한 제작 공정을 이용하여 PCL과 PF127를 사용하여 구조체를 제작하였으며, 양쪽성 물질을 제거함으로써 배열성을 가진 PCL 섬유구조체를 얻을 수 있었다. 구체적인 섬유구조체의 구조를 확인하기 위하여 주사전자현미경으로 관찰하였다.

도 2의 (a)에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 방법을 통하여 기질물질인 PCL로만 제작된 구조체의 표면이 매끄럽고, 그 단면 또한 완벽하게 충진된 형태를 띄고 있음을 확인하였다.

반면, 도 2의 (b)에 나타난 바와 같이, 양쪽성 물질 PF-127과 PCL을 활용하여 제작한 구조체는 표면이 방향성을 띄고 있으며, 그 단면에서 구조체가 방향성을 띈 여러 섬유 다발로 이루어져 있음을 확인하였다.

또한, 도 2c에 나타난 바와 같이, 양쪽성 물질 PF-127과 PCL을 활용하여 제작한 구조체는 섬유 분포 정도가 낮았음을 확인하였다.

또한, 도 2d에 나타난 바와 같이, 양쪽성 물질 PF-127과 PCL을 활용하여 제작한 구조체는 방향 계수(orientation factor)의 반값 전폭이 높아, 배열성이 우수함을 확인하였다.

실시예 3. 양쪽성 물질의 제거 후 섬유구조의 형태 관찰

본 발명의 구조체의 배열성은 희생물질로 사용한 양쪽성 물질의 Poly(propylene oxide) (PEO)와 기질 물질 간의 소수성 효과/소수성 상호작용에 기인하며, PCL 기질에 의해 가두어진 PF-127이 공기압에 의해 신장되며 토출되고, 토출된 양쪽성 물질이 최종 산물에서 제거됨에 따라 방향성을 가진 섬유구조의 구조체 제작이 가능할 것으로 예상하였다.

이러한 가설을 증명하기 위해 본 발명 구조체의 토출 전후를 주사전자현미경으로 비교하였다.

그 결과, 도 3의 (a)에 나타난 바와 같이, PCL 기질 물질 상에 양쪽성 물질이 분포되어 있는 형상이 나타났다.

도 3의 (b)에서 확인할 수 있듯이, 토출 전 PCL 상에 둘러싸여 있던 PF-127 상은 공기압이 가해짐에 따라 신장되다가 최종적으로 배열성을 보임을 확인하였다.

실시예 4. PLGA과 PF -127의 섬유구조의 형태 관찰

본 발명에서는 양쪽성 물질을 적용할 수 있는 다른 기질 물질로서 PLGA (Poly Lactic-co-Glycolic Acid)를 적용하여 실험을 진행하였다. 기질물질 PLGA와 양쪽성 물질 PF-127을 10:0 또는 6:4의 중량비로 교반하고, 섭씨 140도에서 7.5mm/s의 속도로 토출하였다. 양쪽성 물질 (PF-127)을 제거하기 위하여 토출한 구조체를 섭씨 4도에서 3차 증류수에 담갔으며, 3일동안 6시간에 한번씩 3차 증류수를 교체해 주었다. 최종적으로 제작된 PLGA 구조체는 주사전자현미경을 확인하여 표면과 단면 형상을 촬영하였으며, 촬영한 이미지를 바탕으로 섬유의 분포를 분석하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 기질물질로 PLGA를 이용한 구조체의 표면 및 단면을 평가한 결과, 본 발명의 구조체의 섬유 분포 정도가 낮았을 뿐만 아니라, 배열성이 우수함을 확인하였다.

실시예 5. 방향성을 가진 섬유 다발 구조체의 및 특성 분석

본 발명에서는 자연의 근육 구조를 모사하기 위해 방향성을 가진 가닥을 활용하여 섬유다발 형태의 구조체를 제작하였다.

먼저, 도 5의 (a)에 나타난 바와 같이, 자연의 골격근은 여러 개의 근육섬유다발로 구성되어 있으며, 근육 섬유 다발은 여러 개의 근육 원섬유로 구성되어 있다.

이러한 구조를 모사하기 위하여 희생물질을 사용하여 방향성 가진 실험군의 15 가닥과 매끄러운 표면을 가진 대조군의 15 가닥을 각각 묶어 섬유 다발 형태의 구조체를 제작하였다. 방향성을 가진 구조체(FPCL-B, PCL+PF-127)의 가닥은 앞서 실시예 1의 방법과 동일하게 제작하였고, 대조군(PCL-B, PCL only)은 PCL을 섭씨 90^oC에서 녹인 뒤 체적 유량 8.0 ml/h 과 15 mm/s의 노즐 속도의 조건 하에서 토출하고, 이 후 15가닥을 다발로 묶어 제작하였다. 제작된 구조체는 생체친화성을 높이기 위하여 콜라겐으로 코팅하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 표면이 매끄러운 PCL 번들(PCL-B)과 마이크로 PCL 가닥으로 이루어진 번들(FPCL-B)의 번들의 방향성, 하나의 가닥의 방향성, 단백질 흡수율, 응력-변형률 선도(stress-strain curve), 인장 탄성율(tensile modulus)및 FT-IR을 분석하였다.

구체적으로, FPCL-B의 번들 방향성 및 가닥 방향성이 PCL-B와 비교하여 잘 배열된 것으로 나타났으며, FPCL-B의 단백질 흡수력이 PCL-B와 비교하여 우수하였다.

또한, 도 5의 (b) 및 (c)에 나타난 바와 같이, FPCL-B의 경우 희생물질인 PF-127의 제거로 인한 가닥 내의 기공으로 인해 PCL-B군보다 기계적 강도가 떨어짐을 확인하였다. 도 5의 (h)에 나타난 바와 같이, 제작된 FPCL-B 구조체에서 희생물질인 PF-127이 완전히 제거되고, 콜라겐이 잘 코팅이 되었음을 보여주고 있다.

실시예 6. 제작된 구조체에서의 근원세포( myoblast ) 활성 평가

6-1. 세포 배양

근원세포인 C2C12 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)를 10% FBS (Gemini Bio-Products, Calabasas, CA, USA)과 1% 항생제를 함유한 DMEM-high glucose (Sigma- Aldrich, USA) 배지에서 37 ℃, 5 % CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

길이 10 mm, 직경 2 mm의 제작된 번들형 구조체 (PCL-B, FPCL-B)는 70% 에탄올과 PBS를 사용하여 세척되었고, 세척한 구조체에 2 x 10⁴의 근원세포를 접종(seeding)하였다. 접종 후 세포 배양을 위해 배지를 2일에 한번씩 교체하였다. 일반 배지는 초기 3일을 배양에 사용되었고, 그 후 근원세포의 분화유도를 위해 2% horse serum과 1% 항생제를 함유하는 DMEM-high glucose 배지를 이용하였다.

6-2. 세포 증식 테스트

각 세포 구조체는 1, 3, 7일 배양 후 Cell Counting Kit - 8(CCK-8; Dojindo Molecular Technology, Tokyo, Japan)을 이용해 세포 증식을 평가하였다. 배양을 진행한 구조체를 세척하고, 200 μl의 배양 배지와 20 μl의 CCK-8 용액을 구조체에 가하고 37^oC, 5% CO₂의 인큐베이터에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 450nm의 파장대에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 6의 (a)에 나타난 바와 같이 상기 FPCL-B에서 세포 증식률이 더 우수한 것을 확인하였다.

6-3. 형광이미지 획득 방법

각 세포가 포함된 구조체는 4일 및 21일 배양한 후 37℃에서 30 분 동안 diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:100 희석; Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 FITC-Phalloidin (1:100 희석; Invitrogen)로 염색하고, 세포핵 및 F-actin을 형광현미경(LSM 700; Ziess, Oberkochen, Germany)으로 촬영하였다.

그 결과 도 6의 (b) 및 (c)에 나타난 바와 같이 세포핵과 F-actin을 염색한 형광사진에서 FPCL-B군에서 세포가 방향성을 가지고 배열함을 확인할 수 있었다.

또한, 도 6의 (d)의 21일차 배양 후 세포핵 염색 형광사진에서 FPCL-B군의 세포가 구조체 내부로 잘 침투한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 각 구조체에서 배양한 세포의 미오신 중쇄(myosin heavy chain: MHC)와 sarcomeric alpha actinin (α-actinin) 이미지 획득을 위하여, 배양 14일 및 21일 경과 후 PBS로 세척하고, 3.7% 파라포름알데히드를 처리하여 실온에서 고정하였다. 그리고 1% BSA(Bovine Serum Albumin; Sigma-Aldrich, USA)로 1시간 동안 처리한 후, 0.2% Triton X-100에 10분 동안 담갔으며, 상기 샘플을 1:200으로 희석한 항-MHC 항체 (Invitrogen, USA) 및 항-α-actinin 항체 (Invitrogen)로 처리하여 4℃에서 12시간동안 보관하였다. 상기 샘플은 PBS 세척 후, 항 마우스 항체와 접목된 FITC-phalloidin(1:500 희석; Abcam, Cambridge, UK) 및 DAPI(1;100 희석)으로 염색하였다. 염색 후 Zeiss 공초점 현미경을 이용하여 이미지를 촬영하였다.

그 결과, 도 6의 (e)에 나타난 바와 같이, 14일차 배양 후 MHC 염색 형광사진에서 FPCL-B군은 미오신 중쇄가 배열성을 가지며 근육형성을 잘 유도하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 6의 (f)에 나타난 바와 같이, 21일차 배양 후 α-actinin 염색 형광사진에서 근수축에 관여하는 α-actinin이 FPCL-B군에서 현저히 잘 발현됨을 확인하였다.

촬영한 DAPI/MHC 이미지를 기반으로, 세포핵의 종횡비, MHC 발현 범위 (MHC surface coverage), 그리고 분화정도를 확인할 수 있는 MHC fusion index (MHC 발현된 영역내 세포핵이 5개 이상 포함된 세포핵 개수/MHC가 발현된 영역내 전체 세포핵 개수) 및 maturation rate를 분석하였다. 또한 DAPI/α-actinin 이미지를 기반으로 α-actinin이 발현된 영역을 측정하였다. 또한, gene 단위에서의 근육 분화도 측정을 하기 위하여 Myogenic 마커인 MyoD (Myogenic differentiation), MyoG (Myogenin), MHC (Myosin heavy chain), 및 TnT (troponin T)를 선별하여 RT-PCR (Real-time polymerase chain reaction)을 수행하였다.

그 결과, 도 6의 (g) 내지 (k)에 나타난 바와 같이, 형광염색 분석 및 세포의 분화도 측정 결과를 종합해 볼 때 FPCL-B에서 높은 근육 형성을 유도할 수 있음을 확인하였다.

실시예 7. 제작된 구조체에서의 건 세포( tenocyte ) 활성 평가

프린팅한 방향에 따라 배열성을 띄는 본 발명의 기술을 응용하여, 주름진 형상 (crimp structure)을 띄는 건 (tendon) 재생에의 활용도 가능성을 확인하기 위해 인체의 건 구조를 모방한 구조체를 제작하고 이에 대한 평가를 간단히 진행하였다.

주름진 형상은 3D 프린팅을 진행할 시, 프린팅 경로를 조절하여 제작하였다. 이렇게 제작된 주름진 단일 가닥을 합쳐 번들 형태로 제작하였다.

또한, 제작된 구조체에 건세포 (tenocyte)를 접종하고 7일 배양을 진행한 뒤, 건세포 특화 발현 단백질인 tenomodulin (TNMD)의 형광염색을 진행하고 공초점 현미경을 활용하여 이미지를 촬영하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 제작된 주름진 구조체에서도 프린팅 된 방향에 따라 배열성을 띄는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 제작된 구조체의 방향성에 따라 건세포가 배열되는 것을 확인하였으며, 이를 기반으로 건 재생에의 응용가능성을 확인하였다.

실시예 8. 개발된 발명을 통해 제작된 가닥의 대표도

실시예 1의 방법을 통해 제조된 구조체의 형상을 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 또한 미세구조 파악을 위해 액체질소에 순간적으로 가닥을 동결시킨 뒤 절단하였으며, 단면, 45^o 기울여진 형상, 그리고 표면 주사전자현미경을 촬영하였다. 표면 주사전자현미경 이미지를 기반으로 단방향 패턴의 간격을 Fiji software를 활용하여 surface profile을 측정하였고, 이 데이터를 기반으로 peak-to-peak 간격을 spacing of uniaxial pattern (단방향 배열성의 간격)으로 정의한 뒤 이에 대한 데이터를 특정, 그래프화 하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 제작된 가닥에서 희생물질 (PF-127)을 제거하고, 수중에 담갔을 때 한 가닥 내에 수많은 미세 가닥으로 구성될 수 있음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

(a) 녹는점이 52 내지 56^oC이며, 140 내지 160^oC의 인화점을 갖는 양쪽성 물질; 및 52 내지 160^oC에서 가공가능한 생분해성 고분자를 포함하는 바이오잉크를 준비하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 바이오잉크를 단일 노즐로 단일 가닥(strut)을 토출하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계의 단일 가닥의 양쪽성 물질을 세척하는 단계를 포함하는, 비등방성(anisotropic)으로 배열된 구조체의 제조방법으로,
상기 (a) 단계에서 양쪽성 물질은 Pluronic F-127(PF-127)이며,
상기 (a) 단계의 바이오잉크는 양쪽성 물질 및 생분해성 고분자가 3.5 내지 4.5 : 5.5 내지 6.5의 질량비(w/w %)로 포함되며,
상기 구조체는 내부에 기공을 가지는 것을 특징으로 하는, 비등방성으로 배열된 구조체의 제조방법.
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제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 생분해성 고분자는 콜라겐, 젤라틴, 히아루론산(hyaluronic acid) 및 그의 유도체, 키틴, 키토산, 알지네이트(alginate), 피브로넥틴 (fibronetin), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PGA(polyglycolic acid), PLA(poly(lactic acid)) 및 유사 공중합체들, 폴리 ε-카프로락톤(poly ε-caprolactone, PCL), 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리오르쏘에스터(polyorthoesters), 폴리우레탄(polyurethane)의 합성재료로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 비등방성으로 배열된 구조체의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 바이오잉크는 근원세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 심근원세포 (cardiomyoblast), 평활근세포 (smooth muscle cell), 신경세포 (neural cell), 및 혈관세포 (vascular cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 비등방성으로 배열된 구조체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계는 50 내지 160 ℃의 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 비등방성으로 배열된 구조체의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 배열된 구조체는 상기 세포를 배열시키는 것을 특징으로 하는, 비등방성으로 배열된 구조체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 배열된 구조체는 세포 증식 또는 분화 효과가 있는 것을 특징으로 하는, 비등방성으로 배열된 구조체의 제조방법.
제1항의 방법으로 제조된, 비등방성(anisotropic)으로 배열된 구조체로서,
상기 배열된 구조체는 단일 가닥(strut)의 번들(bundle) 형태이며,
상기 구조체는 내부에 기공을 가지는 것을 특징으로 하는, 비등방성으로 배열된 구조체.
제10항에 있어서,
상기 배열된 구조체는 세포를 배열시키는 것을 특징으로 하는, 비등방성으로 배열된 구조체.
제10항에 있어서,
상기 배열된 구조체는 근원세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 심근원세포 (cardiomyoblast), 평활근세포 (smooth muscle cell), 신경세포 (neural cell), 및 혈관세포 (vascular cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포를 증식 또는 분화시키는 용도인 것을 특징으로 하는, 비등방성으로 배열된 구조체.