KR102311639B1 - 심근조직 재생용 3차원 구조체의 제조방법 - Google Patents

심근조직 재생용 3차원 구조체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탈세포화된 세포외 기질 및 심장전구세포를 포함하는 제1 바이오프린팅용 조성물의 프린팅을 통한 적층 공정을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하거나; 혹은 상기 제1 바이오프린팅용 조성물과 탈세포화된 세포외 기질, 중간엽 줄기세포, 및 혈관내피성장인자를 포함하는 제2 바이오프린팅용 조성물을 교대로 사용하는 프린팅을 통한 적층 공정을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성한 다음, 이를 열적 겔화하는 것을 포함하는 심근조직 재생용 3차원 구조체의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 제조방법은 심장전구세포를 구조체 내에 균등하게 위치시킬 뿐만 아니라, 구조체 내에 혈관세포로 이루어진 혈관 네트워크를 구현함으로써, 세포의 생존능을 장기간 유지시킬 수 있어 심근내부로의 세포전달 효율을 현저하게 향상시킬 수 있다.

Description

심근조직 재생용 3차원 구조체의 제조방법{Process for preparing three-dimensional construct for the regeneration of cardiac muscle tissues}
본 발명은 심근조직 재생용 3차원 구조체의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 탈세포화된 세포외 기질 및 심장전구세포를 포함하는 제1 바이오프린팅용 조성물의 프린팅을 통한 적층 공정을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하거나; 혹은 상기 제1 바이오프린팅용 조성물과 탈세포화된 세포외 기질, 중간엽 줄기세포, 및 혈관내피성장인자를 포함하는 제2 바이오프린팅용 조성물을 교대로 사용하는 프린팅을 통한 적층 공정을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성한 다음, 이를 열적 겔화하는 것을 포함하는 심근조직 재생용 3차원 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
3차원 프린팅은 복잡한 형상을 가진 조직(tissue)이나 장기(organ)의 의료 데이터로부터 얻은 임의 형상 정보를 G-code로 변환한 후 적층 공정(layer-by-layer process)을 통하여 복잡한 골격 구조를 구축하는 것을 말한다. 이러한 3차원 프링팅은 또한 '3차원 바이오프린팅(three-dimensional bioprinting, 3D bioprinting)'으로도 지칭된다. 예를 들어, '다축 조직 장기 프린팅 시스템'은 대표적인 3차원 프린팅 기술 중 하나로서, 재료를 공압으로 분사하는 공압식 시린지 2개와 스텝 모터(step motor)를 이용하여 나노리터 단위로 정밀하게 분사하는 피스톤식 시린지 2개로 이루어져 있으며, 다양한 재료를 동시에 이용할 수 있다. 통상, PLA(Polylactic Acid), PGA(Poly-glycolic Acid), PLGA(Poly-lactic-co-glycolid Acid), PCL(Polycaprolactone), 혹은 이들의 혼합물과 같은 열가소성 생체적합성 고분자를 공압식 시린지에 장착하여 구조체를 제작한다. 또한, 콜라겐, 히알루론산, 젤라틴, 알기네이트, 키토산 또는 피브린(fibrin) 등으로 이루어진 하이드로겔을 피스톤식 시린지를 이용하여 3차원 구조체를 제작한다.
바이오프린팅은 세포-함유 매체의 분배를 필요로 하기 때문에, 바이오프린팅의 중요한 측면은 프린팅 공정이 세포적합성(cytocompatible)이어야 한다는 것이다. 이러한 제한은, 수성 또는 수성 겔 환경에서 수행하여야 할 필요성 때문에, 재료의 선택을 감소시킨다. 따라서, 젤라틴, 젤라틴/키토산, 젤라틴/알기네이트, 젤라틴/피프로넥틴, 루트롤 F127(Lutrol F127)/알기네이트, 및 알기네이트 등의 재료를 사용한 하이드로겔이 간에서 골에 이르기까지 다양한 조직을 제조하기 위한 바이오프린팅에 사용되고 있다. 바이오프린팅에 사용되는 상기 하이드로겔 또는 하이드로겔과 세포의 혼합물 등은 '바이오잉크(bioink)'로도 지칭된다.
일반적으로, 세포는 전체 배양 기간 동안 원래의 놓여진 위치에 특이적으로 계속 위치해 있으며, 이는 세포가 주위의 알기네이트 겔 매트릭스를 유지하거나 분해할 수 없기 때문이다(Fedorovich, N. E. et al. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007). 따라서, 세포-프린트 구조체의 바이오프린팅에 관한 몇가지 성공 보고가 있을 지라도, 최소한의 세포-재료 상호작용(cell-material interactions) 및 열등한(inferior) 조직 형성은 가장 중요한 문제이다. 실제로, 이들 재료는 천연의 세포외 기질(extracellular matrices, ECMs)의 복잡성을 나타낼 수 없으며, 이에 따라 생체 조직의 전형적인 세포-세포 연결(cell-cell connections) 및 3차원(three-dimensional, 3D) 세포 구성을 갖는 미세환경을 재현하기에 충분하지 않다. 따라서 상기 하이드로겔 중의 세포는 생체 내에서 살아있는 조직의 고유한 형태 및 기능을 나타낼 수 없다. 따라서, 세포의 모 조직(parent tissue)과 유사한 천연의 미세환경을 세포에 제공된다면 이상적일 것이다. 탈세포화된 세포외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM)은 이렇게 하기 위한 최선의 선택이며, 이는 어떠한 천연의 혹은 인공 재료도 천연의 세포외 기질의 특성 모두를 재현할 수 없기 때문이다. 더욱이, 각 조직의 ECM은 조성(composition) 및 국소해부학(topology) 관점에서 독특하며, 상기 조성 및 해부학 특성은 상주하는 세포(resident cells)와 미세환경 사이의 역동적이고 상호적인 상호작용을 통해 생성된다. 조직 및 장기로부터 분리된 세포와 ECM의 최근 연구는 선택된 세포 기능 및 표현형(phenotype)을 보존하기 위하여 조직 특이성(tissue specificity)의 필요성을 강조하고 있다(Sellaro, T. L. et al. Tissue Eng. Part A 16, 1075-1082 (2010); Petersen, T. H. et al. Science 329, 538-541 (2010); Uygun, B. E. et al. Nat. Med. 16, 814-821 (2010); Ott, H. C. et al. Nat. Med. 16, 927-933 (2010); Flynn, L. E. Biomaterials 31, 4715-4724 (2010)). 수확된 dECM 재료는 전형적으로 피부, 소장 점막하조직(small intestinal submucosa)을 포함한 다양한 조직으로부터 2차원(two-dimensional, 2D) 스캐폴드로서 가공되며, 초기 단계에서 침투성 또는 시딩된 세포는 지지성 혈관 네트워크(supporting vascular network)가 생길 때까지 생존을 위해 산소 및 영양소의 확산에 의존한다. 그러나, 프린팅된 조직 유사체 구조는 영양소의 흐름을 허용하도록 개방된 다공성 3D 구조를 고안하는 제조방법을 필요로 한다. 본 발명자들은 3D 구조 조직의 성장에 적합한 최적화된 미세환경을 제공할 수 있는 dECM 바이오잉크를 사용한 세포-담지(cell-laden) 구조의 프린팅을 위한 3차원 프린팅 방법을 개발한 바 있으며, 상기 세포-담지 구조는 고유의 세포 형태 및 기능을 재현할 수 있다(Falguni Pati, et al., Nat Commun. 5, 3935 (2014)).
한편, 허혈성 심장질환은 전세계적으로 매우 높은 유병률을 보이고 있으며, 단일질환 전체 사망원인 중 1위를 차지하고 있다. 한국 역시 사회·경제적인 발전과 서구화된 생활습관으로 인하여 허혈성 심장질환 환자들이 급증하고 있다. 더욱이 중증의 말기 심부전 환자의 경우, 심장이식술이나 기계적 좌심실 보조장치 이외에는 완치법이 없는 실정이다. 하지만 공여장기의 부족, 장기확보의 어려움, 높은 사망률 및 고가의 치료비용 등의 문제점을 가지고 있다. 줄기세포의 다분화능력(multipotency)을 이용한 치료법은 손상된 조직재생을 근본적으로 치료할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 최근에는 성체줄기세포를 혈관내피세포 및 기타 간질세포와 배합하거나, 다양한 하이드로젤과 혼합하여 주입함으로써 심근세포로의 분화를 촉진하고 세포가 병변으로부터 이탈하는 현상을 방지하여 심장 질환 치료의 효율을 높이는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 또한, 줄기세포 및 줄기세포와 다양한 성체세포를 이용하여 세포 시트(cell sheets)를 제작함으로써 줄기세포의 생체 환경을 모사하고 세포간의 상호작용을 극대화 하는 연구도 활발히 진행 중이다.
본 발명자들은 심근조직의 미세환경(microenvironment)이 구현된 3차원 구조체의 제조방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 특정 세포, 즉 심장전구세포(cardiac progenitor cellsls) 및/또는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)와 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 포함하는 바이오프린팅용 조성물(들)[즉, 바이오 잉크(들)]를 사용하여 3차원 프린팅을 수행하였을 때, 심근조직의 미세환경을 효과적으로 구현할 수 있다는 것을 발견하였다. 특히, 이러한 3차원 프린팅 방법은 심장전구세포를 구조체 내에 균등하게 위치시킬 뿐만 아니라, 구조체 내에 혈관세포로 이루어진 혈관 네트워크를 구현함으로써, 세포의 생존능을 장기간 유지시킬 수 있어 심근내부로의 세포전달 효율을 현저하게 향상시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 심장전구세포(cardiac progenitor cells) 및/또는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)와 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 포함하는 바이오프린팅용 조성물(들)을 사용하여 3차원 프린팅을 수행하는 것을 포함하는, 심근조직 재생용 3차원 구조체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) (i) 탈세포화된 세포외 기질 및 심장전구세포를 포함하는 제1 바이오프린팅용 조성물의 프린팅을 통한 적층 공정을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하거나 혹은 (ii) 탈세포화된 세포외 기질 및 심장전구세포를 포함하는 제1 바이오프린팅용 조성물과; 탈세포화된 세포외 기질, 중간엽 줄기세포, 및 혈관내피성장인자를 포함하는 제2 바이오프린팅용 조성물을 교대로 사용하는 프린팅을 통한 적층 공정을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하는 단계, 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 3차원 구조체 형상을 15 ℃ 이상의 온도에서 열적 겔화하여 3차원 구조체를 얻는 단계를 포함하는 심근조직 재생용 3차원 구조체의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물 중의 상기 탈세포화된 세포외 기질은 체외로 배출된 심장 조직을 탈세포화함으로써 얻어질 수 있다. 제1 바이오프린팅용 조성물 중의 상기 탈세포화된 세포외 기질은, 제1 바이오프린팅용 조성물 총 중량에 대하여, 1∼4 중량%의 함량으로 존재할 수 있으며; 제2 바이오프린팅용 조성물 중의 상기 탈세포화된 세포외 기질은, 제2 바이오프린팅용 조성물 총 중량에 대하여, 1∼4 중량%의 함량으로 존재할 수 있다. 상기 심장전구세포는 제1 바이오프린팅용 조성물 중 105 ∼ 108 cells/ml의 범위로 존재할 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포 및 상기 혈관내피성장인자는 제2 바이오프린팅용 조성물 중 각각 105 ∼ 108 cells/ml 및 50∼1000 ng/ml의 범위로로 존재할 수 있다.
제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은 독립적으로 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소; 및 pH 조절제를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은 독립적으로, 각각의 조성물 총 중량에 대하여, 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 0.03∼30 중량%; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소 0.1∼0.4 중량%; 및 pH 조절제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은 독립적으로 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cells), 혈관내피세포(endothelial cells), 심근세포(cardiomyocytes), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈소판유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1), 형질전환성장인자-베타 (transforming growth factor beta, TGF-β), 에리스로포에틴(erythropoietin, EPO), 줄기세포인자(stem cell factor, SCF), 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 콜로니자극인자(colony stimulating facor, CSF), 혈관성장보충물(endothelial cell growth supplement, ECGS), 바탕질단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP), 및 바탕질단백분해저해효소(tissue inhibitor matrix metalloproteinase, TIMP)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 세포 또는 성장인자를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은 독립적으로, 15℃에서 측정될 때 전단율(shear rate) 1 s-1 에서의 점도가 1∼30 Pa·S의 범위일 수 있다.
제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은 가교제로서 리보플라빈을 추가로 포함하고, 단계(a)의 각각의 적층 공정이 상기 프린팅 및 UVA 하에서의 가교화를 통하여 수행될 수 있다. 상기 리보플라빈은, 제1 바이오프린팅용 조성물 또는 제2 바이오프린팅용 조성물 총 중량에 대하여, 0.001∼0.1 중량%의 함량으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은 독립적으로, 각각의 조성물 총 중량에 대하여, 리보플라빈 0.001∼0.1 중량%; 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 0.03∼30 중량%; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소 0.1∼0.4 중량%; 및 pH 조절제를 추가로 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 각각의 적층 공정에서의 가교화는 1∼10 분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 단계(b)에서 얻어지는 3차원 구조체는 50 ∼ 1000 ㎛의 두께를 가질 수 있다.
특정 세포, 즉 심장전구세포(cardiac progenitor cells) 및/또는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)와 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 포함하는 바이오프린팅용 조성물(들)를 사용하여 3차원 프린팅을 수행하였을 때, 심근조직의 미세환경을 효과적으로 구현할 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 본 발명의 제조방법은 심장전구세포를 구조체 내에 균등하게 위치시킬 뿐만 아니라, 구조체 내에 혈관세포로 이루어진 혈관 네트워크를 구현함으로써, 세포의 생존능을 장기간 유지시킬 수 있어 심근내부로의 세포전달 효율을 현저하게 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법은 허혈성 심장질환을 포함한 다양한 심장질환의 치료를 위한 3차원 구조체의 제조에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 심장 조직으로부터 얻어진 탈세포화된 세포외 기질(hdECM)(b)의 광학 현미경 사진 및 조직염색 사진(a)이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 3차원 구조체의 모식도(a) 및 PCL 프레임웍을 사용하여, 본 발명에 따라 제조된 3차원 구조체의 형상(b)을 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 3차원 구조체를 랫드 심근경색 모델에 이식한 후, 구조체 이식 전 및 이식 8주 후에 촬영한 심장초음파(echocardiography) m-mode 사진(a) 과 심기능을 수치화하여 나타낸 사진(b)이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 3차원 구조체를 이식한 후, 8주 후에 희생하여 조직학적 분석을 수행한 결과이다. 도 4a는 매슨 트리크롬 염색(masson's trichrome staining)을 수행하여 심근 조직의 섬유화 정도 및 심근 벽 두께의 변화를 관찰한 것이고, 도 4b는 면역형광염색(immunofluorescence staining)을 통한 심근경색 부의 기능성 심근의 재생 정도 및 혈관 재생 정도를 나타낸다.
본 발명은 (a) (i) 탈세포화된 세포외 기질 및 심장전구세포를 포함하는 제1 바이오프린팅용 조성물의 프린팅을 통한 적층 공정을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하거나 혹은 (ii) 탈세포화된 세포외 기질 및 심장전구세포를 포함하는 제1 바이오프린팅용 조성물과; 탈세포화된 세포외 기질, 중간엽 줄기세포, 및 혈관내피성장인자를 포함하는 제2 바이오프린팅용 조성물을 교대로 사용하는 프린팅을 통한 적층 공정을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하는 단계, 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 3차원 구조체 형상을 15 ℃ 이상의 온도에서 열적 겔화하여 3차원 구조체를 얻는 단계를 포함하는 심근조직 재생용 3차원 구조체의 제조방법을 제공한다.
상기 탈세포화된 세포외 기질(decellularized extracellular matrix)은 인간, 돼지, 소, 토끼, 개, 염소, 양, 닭, 말 등의 포유동물로부터 배출된 조직을 탈세포화함으로써 얻어질 수 있다. 상기 조직은 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 돼지로부터 얻어진 조직, 더욱 바람직하게는 돼지로부터 얻어진 심장 조직을 포함한다. 즉, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물 중의 상기 탈세포화된 세포외 기질은 예를 들어 돼지로부터 얻어진 심장 조직을 탈세포화함으로써 얻어지는 것이 바람직하다. 상기 탈세포화는 공지의 방법, 예를 들어 Ott, H. C. et al. Nat. Med. 14, 213-221 (2008), Yang, Z. et al. Tissue Eng. Part C Methods 16, 865-876 (2010) 등에 개시된 방법을 사용하여 혹은 약간 변형하여 수행될 있다. 바람직하게는, 본 발명자들이 보고한 탈세포화 방법, 즉 Falguni Pati, et al., Nat Commun. 5, 3935 (2014)에 개시된 탈세포화 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 얻어진 탈세포화된 세포외 기질은 통상 동결건조된 분말형태로 보관된다. 상기 탈세포화된 세포외 기질의 사용량은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 조성물 총 중량에 대하여 1∼4 중량%, 바람직하게는 2∼3 중량%의 함량으로 사용될 수 있다.
본 발명에 의해, 특정 세포, 즉 심장전구세포(cardiac progenitor cells) 및/또는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)와 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 포함하는 바이오프린팅용 조성물(들)를 사용하여 3차원 프린팅을 수행하였을 때, 심근조직의 미세환경을 효과적으로 구현할 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 본 발명의 제조방법은 심장전구세포를 구조체 내에 균등하게 위치시킬 뿐만 아니라, 구조체 내에 혈관세포로 이루어진 혈관 네트워크를 구현함으로써, 세포의 생존능을 장기간 유지시킬 수 있어 심근내부로의 세포전달 효율을 현저하게 향상시킬 수 있다. 상기 심장전구세포 및 혈관내피세포는 사람을 포함한 동물로부터 유래된 세포로서 상업적으로 구입가능하며, 공지의 방법에 의해 배양, 증식시킬 수 있다. 상기 심장전구세포는 제1 바이오프린팅용 조성물 중 105 ∼ 108 cells/ml, 바람직하게는 106 ∼ 5 X 107 cells/ml의 범위로 존재할 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 제2 바이오프린팅용 조성물 중 105 ∼ 108 cells/ml, 바람직하게는 106 ∼ 5 X 107 cells/ml 의 범위로로 존재할 수 있다. 또한, 상기 혈관내피성장인자는 제2 바이오프린팅용 조성물 중 50∼1000 ng/ml, 바람직하게는 100∼200 ng/ml의 범위로로 존재할 수 있다.
제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은, 효율적인 3차원 프린팅을 위하여, pH 6.5 내지 7.5의 범위를 갖는 점탄성의 균일한 용액의 형태를 가지는 것이 바람직하다. 따라서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은 수성 매질 중에 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제(matrix metalloproteinase)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소; 및 pH를 6.5 내지 7.5의 범위로 조절하기 위한 pH 조절제(예를 들어, 수산화나트륨)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 산은 탈세포화된 세포외 기질을 용해시키는 기능을 수행하며, 바람직하게는 아세트산, 염산 등이 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.01∼10 M의 아세트산 수용액(예를 들어, 약 0.5M의 아세트산 수용액) 또는 0.01∼10 M의 염산 수용액의 형태로 사용될 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 탈세포화된 세포외 기질의 텔로펩타이드(telopeptide)의 소화(digestion) 기능을 수행하며, 바람직하게는 펩신, 매트릭스 메탈로프로티나아제 등이 사용될 수 있다. 상기 단백질 분해효소의 사용량은 탈세포화된 세포외 기질의 함량에 따라 상이하나, 예를 들어 탈세포화된 세포외 기질 100 mg에 대하여 5∼30 mg, 바람직하게는 10∼25 mg의 비율로 사용될 수 있다. pH 조절제는 탈세포화된 세포외 기질의 용해를 위해 사용된 산을 중화시키는 기능을 하며, 예를 들어 수산화나트륨을 사용하여 pH 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 약 pH 7로 조절하는데 충분한 양으로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물이 독립적으로, 각각의 조성물 총 중량에 대하여, 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 0.03∼30 중량%; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소 0.1∼0.4 중량%; 및 pH 조절제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은 독립적으로 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cells), 혈관내피세포(endothelial cells), 심근세포(cardiomyocytes), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈소판유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1), 형질전환성장인자-베타 (transforming growth factor beta, TGF-β), 에리스로포에틴(erythropoietin, EPO), 줄기세포인자(stem cell factor, SCF), 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 콜로니자극인자(colony stimulating facor, CSF), 혈관성장보충물(endothelial cell growth supplement, ECGS), 바탕질단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP), 및 바탕질단백분해저해효소(tissue inhibitor matrix metalloproteinase, TIMP)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 세포 또는 성장인자를 추가로 포함할 수 있다.
제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은 전단율이 증가할수록 점도가 낮아지는 점탄성 물질인 것이 바람직하며, 예를 들어 약 15℃에서 측정될 때 전단율(shear rate) 1 s-1 에서의 점도가 1∼30 Pa·S의 범위인 것이 바람직하다. 상기 점도는 수성 매질(예를 들어, 물, 증류수, PBS, 생리식염수 등)의 양을 적절히 조절함으로써 조절될 수 있다.
상기 제1 바이오프린팅용 조성물의 프린팅[즉, 단계(i)]; 및 제1 바이오프린팅용 조성물과 제2 바이오프린팅용 조성물을 교대로 사용하는 프린팅[즉, 단계(ii)]은 공지의 3차원 프린팅 방법(예를 들어, '다축 조직 장기 프린팅 시스템'을 사용한 프린팅 방법)을 사용하여, Falguni Pati, et al., Nat Commun. 5, 3935 (2014) 등에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 다축 조직 장기 프린팅 시스템의 2개의 시린지를 이용하여 상기 프린팅을 수행할 수 있다. 즉, 폴리카프로락톤 프레임웍(polycaprolactone (PCL) framework)을 시린지에 로딩하고, 약 80℃로 가열하여 중합체를 용융시킨다. 상기한 프리-겔 형태의 3차원 프린팅용 조성물을 다른 시린지에 로딩하고, 온도를 약 15℃ 이하, 바람직하게는 약 4∼10℃로 유지시킨다. PCL 프레임웍의 제작(fabrication)을 위해 400-650 kPa 범위로 공기압(pneumatic pressure)을 가한다. 상기 프리-겔 형태의 조성물을 플런저-계 저용량 분사 시스템(plunger-based low-dosage dispensing system)을 사용하여 분사한다. 또한, 상기 제1 바이오프린팅용 조성물의 프린팅[즉, 단계(i)]; 및 제1 바이오프린팅용 조성물과 제2 바이오프린팅용 조성물을 교대로 사용하는 프린팅[즉, 단계(ii)]은 폴리카프로락톤 프레임웍의 사용 없이 상기 프리-겔 형태의 조성물만을 플런저-계 저용량 분사 시스템(plunger-based low-dosage dispensing system)을 사용하여 분사함으로써 수행될 수도 있다.
놀랍게도, 높은 안전성을 갖는 리보플라빈을 가교제로서 사용하여 3차원 프린팅 및 UVA 하에서의 가교화를 통한 적층 공정을 수행하여 3차원 구조체 형상을 제작한 다음, 얻어진 3차원 구조체 형상을 열적 겔화함으로써 높은 기계적 강도를 균일하게 갖는 3차원 구조체를 제조할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 즉, 리보플라빈 사용을 포함하는 가교-열적 겔화 방법(crosslinking-thermal gelation)에 의해 높은 기계적 강도를 균일하게 갖는 3차원 구조체를 제조할 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 리보플라빈을 사용하는 상기 가교-열적 겔화 방법에 의해 높은 기계적 강도를 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 같은 독성 가교제의 사용을 필요로 하고 또한 3차원 구조체 내부에는 불균일한 가교를 야기하는 프린트-후 가교(post-print crosslinking)의 문제점을 회피할 수 있다.
바람직한 구현에에서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은 가교제로서 리보플라빈을 추가로 포함하고, 단계(a)의 각각의 적층 공정이 상기 프린팅 및 UVA 하에서의 가교화를 통하여 수행될 수 있다. 상기 리보플라빈은, 제1 바이오프린팅용 조성물 또는 제2 바이오프린팅용 조성물 총 중량에 대하여, 0.001∼0.1 중량%, 바람직하게는 0.01∼0.1 중량%의 함량으로 존재할 수 있다. 상기 UVA 하에서의 가교화는 315∼400 nm 파장, 바람직하게는 약 360 nm 파장의 UVA를 1∼10 분 동안, 바람직하게는 약 3 분 동안 조사함으로써 수행될 수 있다. 상기 프린팅 및 UVA 하에서의 가교화를 반복적으로 수행함으로써, 즉 적층 공정(layer-by-layer process))을 수행함으로써, 3차원 구조체 형상이 형성된다.
일 구현예에서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은 독립적으로, 각각의 조성물 총 중량에 대하여, 리보플라빈 0.001∼0.1 중량%; 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 0.03∼30 중량%; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소 0.1∼0.4 중량%; 및 pH 조절제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 구현예에 따른 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은, 예를 들어, 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 용액에, 탈세포화된 세포외 기질을 첨가하는 단계; 얻어진 혼합물에 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소를 가한 후, 교반하여 용액을 얻는 단계; 및 얻어진 용액에 리보플라빈 및 pH 조절제를 첨가한 후, 심장전구세포(제1 바이오프린팅 조성물의 경우) 또는 중간엽 줄기세포와 혈관내피성장인자(제2 바이오프린팅 조성물의 경우)를 첨가하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 교반은 탈세포화된 세포외 기질의 완전한 용해를 달성할 때까지 수행될 수 있으며, 통상 24∼48 시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 리보플라빈 및 pH 조절제를 첨가하는 공정은 겔화를 방지하기 위하여 약 15℃ 이하, 바람직하게는 약 4∼10℃의 저온에서 수행되는 것이 바람직하다. 얻어지는 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물은 pH-조절된 프리-겔(pH-adjusted pre-gel) 형태로서, 약 4℃에서 냉장 보관하는 것이 바람직하다.
단계(b)는 단계(a)에서 얻어진 3차원 구조체 형상을 15 ℃ 이상에서 열적 겔화(thermal gelation)함으로써 수행된다. 상기 열적 겔화는 바람직하게는 20∼40 ℃, 더욱 바람직하게는 약 37℃로 유지되는 인큐베이터(humid incubator) 중에서 5∼60 분 동안, 바람직하게는 20∼30 분 동안 유지시킴으로써 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 사용된 탈세포화된 세포외 기질은 돼지의 심장 조직을 사용하여 Falguni Pati, et al., Nat Commun. 5, 3935 (2014)에 개시된 방법에 따라 얻어진 것을 사용하였으며, 이하 'hdECM' 이라 칭한다. 상기 hdECM은 최종적으로 동결건조하여 사용전까지 냉동보관하였다. 상기 hdECM의 광학 현미경 사진 및 조직염색 사진은 도 1과 같다.
실시예 1: 탈세포화된 세포외 기질 및 심장전구세포를 포함하는 제1 바이오프린팅용 조성물의 제조
액제 질소를 동결건조된 hdECM에 붓고 모르타르 및 막자로 분쇄하였다. 0.5M 아세트산 수용액(10 ml)에 hdECM 분말(330 mg)을 첨가한 후, 펩신(33 mg)(P7125, Sigma-Aldrich)을 가한 다음 상온에서 48시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액의 온도를 10℃ 이하로 유지하면서, 리보플라빈(2 mg)을 가하고 10℃ 이하로 냉각시킨 10M NaOH 용액을 적가하여 pH를 약 pH 7로 조절하였다. 얻어진 프리-겔(pre-gel) 형태의 용액은 약 4℃에서 냉장 보관하였으며, 프린팅 공정 수행 직전에 상기 프리-겔 형태의 용액에 심장전구세포(인간 심근조직 유래 심장전구세포, 부산대학교 의학전문대학원, 생리학 교실)(5 X 106 cells/ml)를 첨가하여 제1 바이오프린팅용 조성물을 제조하였다.
실시예 2: 탈세포화된 세포외 기질, 심장전구세포, 및 혈관내피세포를 포함하는 제2 바이오프린팅용 조성물의 제조
액제 질소를 동결건조된 hdECM에 붓고 모르타르 및 막자로 분쇄하였다. 0.5M 아세트산 수용액(10 ml)에 hdECM 분말(330 mg)을 첨가한 후, 펩신(33 mg)(P7125, Sigma-Aldrich)을 가한 다음 상온에서 48시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액의 온도를 10℃ 이하로 유지하면서, 리보플라빈(2 mg)을 가하고 10℃ 이하로 냉각시킨 10M NaOH 용액을 적가하여 pH를 약 pH 7로 조절하였다. 얻어진 프리-겔(pre-gel) 형태의 용액은 약 4℃에서 냉장 보관하였으며, 프린팅 공정 수행 직전에 상기 프리-겔 형태의 용액에 중간엽 줄기세포(하비갑개(inferior turbinate) 유래 중간엽 줄기세포, 가톨릭대학교 이비인후과학 교실)(5 X 106 cells/ml)와 혈관내피성장인자(제품번호: 293-VE-10, R&D systems사)(100 ng/ml)를 각각 첨가하여 제2 바이오프린팅용 조성물을 제조하였다.
실시예 3: 3차원 구조체의 제조
실시예 1에서 얻어진 제1 바이오프린팅용 조성물을 사용하여 Falguni Pati, et al., Nat Commun. 5, 3935 (2014)에 개시된 방법에 따라 3차원 구조체를 제작하였다. 구체적으로, PCL 프레임웍(polycaprolactone (PCL) framework)을 다축 조직 장기 프린팅 시스템(Jin-Hyung Shim et al., J. Micromech. Microeng. 22 085014 (2012))의 시린지(제1 시린지)에 로딩하고, 약 80℃로 가열하여 중합체를 용융시켰다. 실시예 1에서 얻어진 프리-겔 형태의 3차원 프린팅용 조성물을 다른 시린지(제2 시린지)에 로딩하고, 온도를 약 10℃ 이하로 유지시켰다. 제1 시린지에 약 600 kPa의 공기압을 가하여 약 100 μm 이하의 선폭을 가지고, 약 300 μm 의 공극을 지닌 120 μm 두께의 얇은 PCL 프레임웍을 제작하고, PCL 프레임웍 위에 제2 시린지의 내용물을 분사한 후, 약 360 nm의 UVA를 3분 동안 조사하여 가교화하였다. 이후, 제2 시린지의 내용물 분사 및 상기 가교화를 통한 적층 공정(layer-by-layer process)을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하였다. 얻어진 3차원 구조체 형상을 약 37℃의 인큐베이터(humid incubator)에 넣고 30분 동안 유지시켜 열적 겔화시켜 3차원 구조체('CPC printed'라 칭함)를 제조하였다. 얻어진 3차원 구조체는 약 300∼400 μm 두께를 가진다.
실시예 4: 3차원 구조체의 제조
실시예 1 및 2에서 얻어진 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물을 사용하여 3차원 구조체를 제작하였다. 구체적으로, PCL 프레임웍(polycaprolactone (PCL) framework)을 다축 조직 장기 프린팅 시스템(Jin-Hyung Shim et al., J. Micromech. Microeng. 22 085014 (2012))의 시린지(제1 시린지)에 로딩하고, 약 80℃로 가열하여 중합체를 용융시켰다. 실시예 1에서 얻어진 프리-겔 형태의 제 1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물을 다른 시린지(제2, 3 시린지)에 로딩하고, 온도를 약 10℃ 이하로 유지시켰다. 제1 시린지에 약 600 kPa의 공기압을 가하여 약 100 μm 이하의 선폭을 가지고, 약 300 μm 의 공극을 지닌 120 μm 두께의 얇은 PCL 프레임웍을 제작하고, PCL 프레임웍 위에 제2 시린지의 내용물을 분사한 후, 약 360 nm의 UVA를 3분 동안 조사하여 가교화하였다. 이후, 제2, 3 시린지의 내용물 분사 및 상기 가교화를 통한 적층 공정(layer-by-layer process)을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하였다. 얻어진 3차원 구조체 형상을 약 37℃의 인큐베이터(humid incubator)에 넣고 30분 동안 유지시켜 열적 겔화시켜 3차원 구조체('CPC/MSC printed'라 칭함)를 제조하였다.. 얻어진 3차원 구조체는 약 300∼400 μm 두께를 가지며, 그 형상은 도 2와 같다.
시험예 1
실시예 1에서 얻어진 프리-겔 형태의 용액을 약 360 nm의 UVA를 3분 동안 조사하여 가교화한 후, 약 37℃의 인큐베이터(humid incubator)에 넣고 30분 동안 유지시켜 열적 겔화시켜 하이드로겔을 형성시켰다(하이드록겔 A). 또한,
리보플라빈을 사용하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 프리-겔 형태의 용액을 약 37℃의 인큐베이터(humid incubator)에 넣고 30분 동안 유지시켜 열적 겔화시켜 하이드로겔을 형성시켰다(하이드록겔 B). 얻어진 각각의 하이드로겔에 대하여, 빈도(frequency) 1 rad/s에서의 복소 모듈러스(complex modulus)를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같다.
모듈러스 (n=3, 1 rad/s)
하이드로겔 A 10.58 ± 3.4 kPa
하이드로겔 B 0.33 ± 0.13 kPa
상기 표 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 얻어진 하이드로겔은 1 rad/s에서의 모듈러스가 10.58 kPa로서, 가교화에 의해 약 30배 이상의 강도 향상을 나타냄을 알 수 있다.
시험예 2
4∼5 주령의 랫트(무게: 300±30g)의 흉부를 절개하고, 좌전하행동맥(Left Anterior Descending artery, LAD)의 영구결찰(permanent ligation)을 시행하여 심근경색을 유발하였다. 7일 후에, 실시예 3에서 제조한 3차원 구조체(CPC printed) 및 실시예 4에서 제조한 3차원 구조체(CPC/MSC printed)를 각각 8 mm 직경의 크기로 잘라, 심근경색 부위에 이식한 후 봉합하였다 (각각 n=7). 이식 후 4주 및 8주차에 심장초음파를 촬영하여 좌심실 내경 (left ventricle diameter, LV diameter)을 확인하였고(도 3a), 심근의 기능을 보여주는 좌심실 박출 계수(left ventricle ejection fraction, LVEF) 및 구획 단축률 (fractional shortening, FS)을 계산하여 student T-test에 의한 실험군간의 유의성 평가를 수행하였다(도 3b). 도 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 제조한 3차원 구조체 이식 4주 및 8주 후 아무것도 처리하지 않은 실험군(대조군) 대비 좌심실 내경이 현저히 줄어들었다. 이는 구조체에 의해 심장 리모델링 (cardiac remodeling)이 저해됨을 나타낸다.
도 4a로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 제조한 3차원 구조체 이식 8주후의 좌심실 내벽의 두께가 대조군에 비하여 두껍게 유지되었으며 심근경색 부위의 반흔 조직(scar tissue)의 형성이 적었다. 또한, 제1 바이오프린팅용 조성물로 형성시킨 3차원 구조체(CPC printed)에 비하여, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물로 형성시킨 3차원 구조체(CPC/MSC printed)를 이식하였을 때 반흔 조직 형성이 더욱 효과적으로 억제되었고, 좌심실 내벽이 두께가 얇아지지 않고 유지되었다. 또한, 본 발명에 따라 제조한 3차원 구조체를 이식한 심근경색 부위에 심근조직의 수축성을 대표하는 베타 마이오신 중쇄(β-myosin heavy chain, βMHC)와 혈관형성을 대표하는 분화클러스터 31 (CD31)의 발현양이 현저히 증가하였고, 특히 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물로 형성시킨 3차원 구조체(CPC/MSC printed)를 이식하였을 때 그 효과가 더욱 극대화되었다 (도 4b).
따라서, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 3차원 구조체는 구조체 내에 혈관 네트워크를 구현함으로써(즉, 심근조직의 미세환경을 효과적으로 구현함으로써), 세포의 생존능을 장기간 유지시킬 수 있어 심근내부로의 세포전달 효율을 현저하게 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.

Claims (15)

  1. (a) 탈세포화된 세포외 기질 및 심장전구세포를 포함하는 제1 바이오프린팅용 조성물과; 탈세포화된 세포외 기질, 중간엽 줄기세포, 및 혈관내피성장인자를 포함하는 제2 바이오프린팅용 조성물을 교대로 사용하는 프린팅을 통한 적층 공정을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하는 단계, 및
    (b) 단계(a)에서 얻어진 3차원 구조체 형상을 15 ℃ 이상의 온도에서 열적 겔화하여 3차원 구조체를 얻는 단계
    를 포함하는 심근조직 재생용 3차원 구조체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물 중의 상기 탈세포화된 세포외 기질이 체외로 배출된 심장 조직을 탈세포화함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 제1 바이오프린팅용 조성물 중의 상기 탈세포화된 세포외 기질이, 제1 바이오프린팅용 조성물 총 중량에 대하여, 1∼4 중량%의 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 제2 바이오프린팅용 조성물 중의 상기 탈세포화된 세포외 기질이, 제2 바이오프린팅용 조성물 총 중량에 대하여, 1∼4 중량%의 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 심장전구세포가 제1 바이오프린팅용 조성물 중 105 ∼ 108 cells/ml의 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포 및 상기 혈관내피성장인자가 제2 바이오프린팅용 조성물 중 각각 105 ∼ 108 cells/ml 및 50∼1000 ng/ml의 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물이 독립적으로 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소; 및 pH 조절제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물이 독립적으로, 각각의 조성물 총 중량에 대하여, 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 0.03∼30 중량%; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소 0.1∼0.4 중량%; 및 pH 조절제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물이 독립적으로 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cells), 혈관내피세포(endothelial cells), 심근세포(cardiomyocytes), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈소판유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1), 형질전환성장인자-베타 (transforming growth factor beta, TGF-β), 에리스로포에틴(erythropoietin, EPO), 줄기세포인자(stem cell factor, SCF), 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF), 콜로니자극인자(colony stimulating facor, CSF), 혈관성장보충물(endothelial cell growth supplement, ECGS), 바탕질단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP), 및 바탕질단백분해저해효소(tissue inhibitor matrix metalloproteinase, TIMP)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 세포 또는 단백질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물이 독립적으로, 15℃에서 측정될 때 전단율(shear rate) 1 s-1 에서의 점도가 1∼30 Pa·S의 범위인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제7항에 있어서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물이 가교제로서 리보플라빈을 추가로 포함하고, 단계(a)의 각각의 적층 공정이 상기 프린팅 및 UVA 하에서의 가교화를 통하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 리보플라빈이, 제1 바이오프린팅용 조성물 또는 제2 바이오프린팅용 조성물 총 중량에 대하여, 0.001∼0.1 중량%의 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 제1 바이오프린팅용 조성물 및 제2 바이오프린팅용 조성물이 독립적으로, 각각의 조성물 총 중량에 대하여, 리보플라빈 0.001∼0.1 중량%; 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 0.03∼30 중량%; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소 0.1∼0.4 중량%; 및 pH 조절제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 각각의 적층 공정에서의 가교화가 1∼10 분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)에서 얻어지는 3차원 구조체가 50 ∼ 1000 ㎛의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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