KR102306236B1 - 유도만능줄기세포 유래 세포치료제의 치료 효율 및 성능 향상을 위한 중간엽 줄기세포 기반 패치 적용 기술 - Google Patents

유도만능줄기세포 유래 세포치료제의 치료 효율 및 성능 향상을 위한 중간엽 줄기세포 기반 패치 적용 기술 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다능성 줄기세포 유래 심근세포의 치료 효율 및 성능 향상을 위한 중간엽 줄기세포 패치 적용 기술에 관한 것으로, 본 발명의 심근 재생용 심장 패치는 경색된 심장에서 혈관신생, 항염증 및 항섬유화와 관련된 다수의 인자들에 대해 현저한 측분비 효과를 유도할 수 있어, 척박한 미세환경 개선에 매우 효과적이지만, 심장 기능을 개선하기에는 불충분하였으나, 인간 다능성 줄기세포 유래 심근세포와 함께 병용 처리할 경우, 심근 재생용 패치가 심근세포의 잔존 및 성숙을 향상시키고 괴사된 경색 부위 심장에서 숙주 심근과의 통합을 유도함으로써 혈관 재생 증가 및 섬유증 감소뿐만 아니라 심근세포의 기능향상을 통해 포괄적인 심장 손상을 치료할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 심근세포 제조 방법은 순도 문제 없이 심근세포의 획득이 가능하며, 세포의 초기 생존율이 향상되고, 조기 성숙이 달성되는 효과가 있다

Description

유도만능줄기세포 유래 세포치료제의 치료 효율 및 성능 향상을 위한 중간엽 줄기세포 기반 패치 적용 기술{Mesenchymal stem cell-loaded patch techniques for improving therapeutic efficiency and performance of induced pluripotent stem cell-derived cell therapeutic composition}
본 발명은 다능성 줄기세포 유래 세포치료제의 치료 효율 및 성능 향상을 위한 중간엽 줄기세포 기반 패치 적용 기술에 관한 것이다.
심근 경색증 (Myocardial infarction, MI)은 심근 세포(cardiomyocytes, CM)의 괴사와 섬유화 조직 형성으로 인해 영구적인 손실을 초래하는 치명적인 질환으로 심부전으로 인한 심장 기능에 돌이킬 수 없는 손상을 초래한다. 현재 심장의 재생은 현재의 의료 옵션으로는 불가능한 것으로 간주되지만 축적된 증거 동물 모델 및 임상 시험에서 줄기세포가 심근 경색 치료에 새로운 기회를 제공할 수 있음이 연구되고 있다.
그 중에서도 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)는 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유 아세포 성장 인자 2(FGF2) 및 간세포 성장 인자 (HGF)와 같은 혈관 형성에 유익한 성장인자를 발현하여 세포 기반 치료법으로 유망한 후보 물질로 오랫동안 고려되어왔다. HGF(hepatocyte growth factor)은 혈관 신생, 혈관신생 및 세포 생존을 촉진하는 것으로 알려져있다. 또한, hMSC는 섬유 아세포의 증식을 억제하여 섬유증을 약화시키는 MMP(matrix metalloproteinases) 2, 9 및 14를 비롯한 강력한 섬유화 조절 인자를 분비하는 것으로 알려져있다.
인간 배아 줄기세포(hESCs)와 인간 유도 만능줄기세포(hiPSC)를 모두 포함하는 인간만능줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC-CMs)에서 유래된 심근세포는 인간의 심장을 구성하는 심근세포와 유사하여, 심근경색증 동물모델에서 시행한 전임상 열구 결과에 따르면 이식한 hPSC-CMs은 숙주의 심근과 정렬, 결합 및 동기화하여 심장기능을 성공적으로 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
심장은 심근과 혈관으로 구성된 기관이기 때문에 심근경색증 후에는 심근과 혈관 구조가 모두 심하게 손상되어 있다. 따라서 심근경색증의 성공적인 치료전략은 완전한 심장기능 회복을 달성하기 위해 심근과 혈관을 동시에 재생시키는데 초점을 맞추어야 한다.
1. Ahuja, P., Sdek, P. & MacLellan, W. R. Cardiac myocyte cell cycle control in development, disease, and regeneration. Physiol. Rev. 87, 521?544 (2007). Laflamme, M. A. & Murry, C. E. Heart regeneration. Nature 473, 326?335 (2011).
본 발명의 목적은 심근 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 심근 재생용 패치를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 표면 코팅제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 심근경색 치료용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 심근 재생용 패치의 제조방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 심실성 심근세포 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 중간엽 줄기세포 및 심장 유래 탈세포화된 세포 외 기질을 포함하는 심근 재생용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 심근 재생용 패치를 제공한다.
또한, 본 발명은 피험체로의 디바이스의 이식과 관련하여 사용되는 표면 코팅제를 제공한다.
또한, 본 발명은 심근 재생용 패치 및 심근세포를 포함하는 심근경색 치료용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 심근 재생용 패치의 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 심실성 심근세포 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 심근 재생용 패치는 심근경색증이 발생한 심장에서 혈관신생, 항염증 및 항섬유화와 관련된 다수의 인자들에 대해 현저한 측분비 효과를 유도할 수 있어, 혈관 재생에 매우 효과적이지만, 심장 기능을 개선하기에는 불충분하였으나, 인간 유도만능줄기세포 유래 심근세포와 함께 병용 처리할 경우, 심근 재생용 패치가 혈관 재생 및 심장 섬유증의 감소뿐만 아니라, 경색부위에 이식된 심근세포의 잔존 및 성숙을 향상시키고 숙주 심근과의 통합을 유도함으로써 심장 기능의 향상을 통해 포괄적인 심장 손상을 치료할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 심근세포 제조 방법은 고순도의 심실성 심근세포의 획득이 가능하며, 세포의 초기 생존율이 향상되고, 조기 성숙이 달성되는 효과가 있다.
도 1은 여러 조직 유래 중간엽 줄기세포의 특성을 비교한 도이다.
도 2는 hMSC-PAs를 제작 (A-C) 후 심근경색이 유도된 심장 외막으로의 hMSC-PAs의 이식 (D) 과정과, 이식 후 혈관형성, 섬유증 및 염증 관련 인자들의 qRT-PCR 결과 (E-G)를 나타낸 도이다.
도 3은 hMSC-PAs를 제작 모식도 및 이로부터 방출되는 VEGF를 ELISA로 측정한 데이터를 나타낸 도이다.
도 4는 hMSC-PAs의 혈관 재생 효과를 확인한 도이다.
도 5는 인간 유도만능줄기세포로부터 심근세포를 제작하는 과정 (A), 제작된 hiPSC-CMs의 형태 (B) 및 마커를 통한 심근세포 분화를 확인 (C-D)한 도이다.
도 6은 본 발명의 hiPSC-CMs의 심실성 심근세포 특성을 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 방법에 의해 획득한 심근세포의 초기 생존율 및 성숙 정도를 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 방법에 의해 획득한 심근세포의 심근 특이적 구조 유전자의 발현을 확인한 도이다.
도 9는 hiPSC-CMs 주사 및 hMSC-PAs 이식의 병용 요법의 효과를 확인한 도이다.
도 10은 이식한 hMSC-PAs의 hiPSC-CMs에 대한 효과 및 이에 대한 기전을 확인한 도이다.
도 11은 hMSCs의 EC 세포 이동 및 증식 촉진 효과를 확인한 도이다.
도 12는 허혈성 손상시 hMSC-조건부 배양액(conditioned medium)의 hiPSC-CMs에 대한 직접적인 세포 보호 효과를 확인한 도이다.
도 13은 hMSC 배양물로부터 수득한 조건부 배양액(conditioned medium)의 특성을 확인한 도이다.
도 14는 본 발명의 의 병용 투여에 의한 효과를 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
일 측면에서, 본 발명은 중간엽 줄기세포 및 심장 유래 세포 외 기질을 포함하는 심근 재생용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 세포 외 기질은 탈세포화된 것일 수 있으며, 세포외기질은 물리적 방법으로 탈세포화 및 분쇄되어 입자상으로 준비될 수 있다. 나아가, 상기 세포외기질은 당 업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 얻을 수 있다.
일 구현예에서, 비타민 B2를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 중간엽 줄기세포는 1x105개/ml 내지 1x107개/ml, 심장 유래 세포외기질(hdECM)은 1 내지 5% (w/v) (20mg/ml) 및 비타민 B2는 0.002 내지 0.2% (w/v)일 수 있으며, 중간엽 줄기세포는 1 x 106개/ml, 심장 유래 세포외기질(hdECM)은 2% (w/v) (또는 20mg/ml) 및 비타민 B2는 0.02% (w/v)일 수 있다.
일 구현예에서, 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
일 구현예에서, 중간엽 줄기세포 배양액(MSC-CM)을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 중간엽 줄기세포 배양액은 허혈성 손상으로부터 심근 보호 효과를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물에는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학적 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 심근 재생용 조성물을 포함하는, 피험체로의 디바이스의 이식과 관련하여 사용되는 표면 코팅제에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 코팅제는 바이오 잉크 조성물일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 디바이스는 심박조율기, 스텐트, 스텐트 그래프트, 혈관 보철, 심장 판막, 션트, 약물 전달 포트, 카테터 또는 패치일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 심근 재생용 조성물을 포함하는 심근 재생용 패치에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 심근 재생용 패치는 심장 손상부위에서의 혈관신생 촉진, 항-염증 및 항-섬유화 효과를 가질 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 심근 재생용 패치 및 심근세포를 포함하는 심근경색 치료용 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 심근세포는 다능성 줄기세포 유래일 수 있으며, 심실성 심근세포(ventricular cardiomyocyte)일 수 있다.
일 구현예에서, 다능성 줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포일 수 있으며, 인간 유래일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 심근 재생용 패치는 이식하고 심근세포는 주사될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 심장 유래 탈세포화된 세포 외 기질을 제조하는 단계; 고분자 지지체를 제조하는 단계; 및 본 발명의 심근 재생용 조성물을 상기 고분자 지지체에 증착하는 단계를 포함하는, 심근 재생용 패치의 제조방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 다능성 줄기세포 유래 심실성 심근세포 제조방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 다능성 줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포일 수 있으며, 인간 유래일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은 다능성 줄기세포주에 ROCK(rho-associated protein kinase) 신호전달 경로를 억제제를 처리하는 단계; 심근세포 분화 배지에서 배양하는 단계; 및 레티노산 신호전달을 차단하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, ROCK 신호전달 경로 억제제는 Y-27632일 수 있다.
일 구현예에서, 심근세포 분화 배지는 GSK 억제제 또는 Wnt 억제제를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 인간 유도만능줄기세포주를 심근세포로 분화하기 위해, GSK 억제제가 포함된 심근세포 분화 배지에서 배양한 뒤 Wnt 억제제를 포함하는 분화 배지에서 순차적으로 배양하였다.
일 구현예에서, GSK 억제제는 CHIR99021일 수 있으며, Wnt 억제제는 C59일 수 있다.
일 구현예에서, 레티노산 신호전달은 Pan-RAR(Pan-retinoic acid receptor) 역작용제(inverse agonist)를 처리하여 차단할 수 있다.
일 구현예에서, 심근세포의 분화 후 L-젖산을 함유하는 심근세포 분화 배지에서 배양함으로써 심근세포를 대사적으로 선택 정제할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 레티노산 신호전달을 차단하는 단계 이후에 심실성 심근세포의 순도 향상 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 심실성 심근세포의 순도 단계는 분화한 심실성 심근세포를 대사호르몬, 덱사메타손(Dexamethasone) 및 L-젖산을 함유한 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 이로 인해 심실성 심근세포의 생존율이 향상되고 조기 성숙이 달성될 수 있다.
일 구현예에서, 다능성 줄기세포주에 ROCK 신호전달 경로를 억제제를 처리하는 단계는 분화 시작으로부터 0 내지 1일차이며, 심근세포 분화 배지에서 배양하는 단계는 분화 시작으로부터 4 내지 5일차이고, 레티노산 신호전달을 차단하는 단계는 분화 시작으로부터 5 내지 8일차일 수 있다.
일 구현예에서, 심실성 심근세포의 순도 향상 단계는 분화 시작 후 10일차부터 16일차까지 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 심실성 심근세포를 심실 특이적 마커를 이용하여 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 중간엽줄기세포-적재 패치(hMSC-PA) 제작
1-1. 최적 hMSCs 선별
인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 서울 성모병원 임상 시험 심사위원회 승인 (승인번호 KIRB-00344-009 및 KIRB-00362-006)받아 건강한 20세 내지 55세의 기증자의 장골에서 수득하였다. 수득한 골수 혼합물을 4℃에서 793g로 7분 동안 원심분리하여 골수 펠릿을 분리하였으며, 상등액을 제거하고 적혈구를 제거한 뒤 멸균수를 10배 첨가하여 현탁시켰다. RBC-제거된 시료를 원심분리함으로써 얻은 세포 펠릿을 MSC 성장 배지 (10% FBS가 첨가된 DMEM-LG, PAA)에 현탁시켰다. 그 후 100 mm의 조직배양접시(TTC)에 분주하고 37℃의 CO2 인큐베이터 (5% CO2)에서 배양되었다. 배양 배지는 주 2회 교체되었으며, 세포 밀도가 70~90%에 도달했을 때 세포들을 떼어 5 ~ 8 × 103 cells/cm2의 밀도로 재분주하였다. 세포는 GMP-준수 시설에서 2 내지 4 계대로 확장되었으며, 4차 계대 후 다분화능 및 세포 표면 항원 (CD90/CD73, >95% 양성; CD34/CD45, >95% 음성)을 시험하였다. 측분비 인자(paracrine factor)의 분비 측면에서 가장 우수한 hMSC를 선별하기 위해 인간 비갑개(turbinate), 인간 지방 조직에서도 hMSCs를 분리하여 VEGF 분비 농도를 VEGF ELISA 분석으로 비교하였다. 또한, hMSC의 특이적 마커인 CD71, CD105, CD90 및 CD44의 발현을 유세포분석으로 확인하였다.
그 결과, 인간 골수로부터 유래된 hMSC에서 다른 유형의 hMSC에서보다 VEGF가 현저히 많이 방출되는 것을 확인할 수 있었다 (도 1A). 또한, 골수 유래 hMSCs는 균일한 방추체 형태를 나타냈으며, hMSCs의 특이적 마커인 CD73, CD105, CD90 및 CD44의 풍부한 발현을 나타냈다 (도 1B 및 C).
1-2. 심장-유래 세포 외 기질을 이용한 hMSC 패치(hMSC-PAs) 제작
심장 유래 탈세포화된 세포 외 기질(heart-derived decellularized extracellular matrix, hdECM)을 제조하기 위해, 6개월 된 돼지의 심장에서 좌심실을 해부하고 작을 조각으로 자른 뒤, 1% 소듐 도데실 설페이트 (affimetrix, CA) 용액에 48시간 동안 침지하고 PBS로 희석한 1% triton X-100 용액을 1시간 동안 처리하였다. 이어서 탈세포화된 조직을 3일 동안 PBS에 침지시키고 동결전조한 뒤, 액체 질소에서 분쇄하여 펩신 분말 33 mg이 첨가된 최종 농도 3.3 w/v% (330 mg of hdECM powder)의 0.5 M 아세트산 용액 10 mL에서 소화시켰다. 소화된 hdECM 용액을 40 μm 포어 사이즈의 메쉬에서 여과하고 1ml로 분주한 뒤, -20℃에서 보관하였다. hMSC-PAs를 제조하기 전에, hdECM의 젤화를 방지하기 위해 아이스 버킷에서 보관하면서, 10 N NaOH를 첨가하여 hdECM 용액을 7.4의 중성 pH로 조정하였다. 그 후, hMSC-PAs를 제조하기 위해, 3D 프린터를 이용하여 지지 프레임워크로서 0.5mm 높이 및 8mm의 직경을 가진 디스크 형태의 PCL(polycaprolactone)을 제작하였다 (도 2B). hMSCs (1 x 106/ml), hdECM (20mg/ml) 및 0.02% (w/v)의 비타민 B2를 혼합하여 바이오잉크를 만들고 이를 PCL 프레임워크에 3D 프린팅으로 적용하여 hMSCs-PAs를 제작하였다 (도 2C). 이 후, hMSCs-PAs를 UVA 광에 60초 동안 노출시켜 비타민 B2 유도된 후-가교 공정 (광도: 30 mW/cm2)을 개시하고 추가적인 열 가교를 위해 37℃에서 24시간 동안 유지시켰다. 모든 공정 후에, hMSC-PAs의 최종 두께 및 직경은 각각 평균 3 mm 및 8 mm로 나타났다.
실시예 2. hMSC-PAs 확인
2-1. 측분비 인지(paracrine factor) 확인
hMSC-PA 내의 hMSCs의 생존능을 확인하기 위해, 상기 실시예에서 제조한 hMSC-PAs를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 뒤 live/dead 염색을 수행한 결과, hMSC-PAs 내의 hMSCs가 대다수 생존하고 있었으며, 세포의 1/10만이 사멸한 것을 확인함으로써, hMSC-PAs가 hMSCs의 생존을 유지할 수 있음을 확인하였다 (데이터 미도시). 그 후, hMSCs가 내장된 hMSC-PA가 측분비 인자를 효과적으로 방출할 수 있는지 확인하기 위해, hMSC-PAs를 in vitro로 배양하고, 상등액을 수집하여 VEGF ELISA 분석을 수행한 결과, 시간이 지남에 따라 hMSC-PAs가 VEGF를 방출하였으며, hMSC-PAs로부터 방출된 VEGF의 농도가 기간 의존적으로 증가하여 hMSC-PAs가 충분한 양의 사이토카인을 방출할 수 있음을 확인하였다 (도 3B).
2-2. hMSC-PAs 효과 확인
hMSC-PAs의 이식이 미치는 영향을 확인하기 위해, 랫의 심근 경색(myocardial infarction, MI)이 유도된 심장에 hMSC-PAs를 이식한 뒤 (도 2D) 7일 후 심장 조직을 수득하여, 정량적 실시간 RT-PCR로 혈관신생, 항-섬유화 및 항-염증 인자들의 발현을 확인하였다. 구체적으로, Fischer 344 랫 (180-200g, 수컷, Orientbio, Korea)을 2% 이소플루란으로 마취하고 18-게이지 정맥 카테터로 기관을 통해 삽관하였다. 그 후 랫을 의료용 산소로 기계적으로 환기시키고 37℃ 히팅 패드에 위치한 뒤 가슴을 면도하고 좌측 개흉술(left thoracotomy)을 수행하였다. LAD(left anterior descending) 동맥에 위치한 멸균된 폴리에틸렌 글리콜 튜빙 (22G)으로 봉합사(suture)를 1분 동안 묶은 후 7-0 프로렌(Prolene) 봉합사를 이용하여 매듭을 영구적으로 묶었다. 좌심실 기능 기준을 수립하기 위해, EF 및 RWMA(regional wall motion abnormalities)을 수술 7일 후 조사하였다 (포함 기준: 심장 초음파 측정에 의한 EF < 45%). 동일한 날에 랫을 이소플루란으로 다시 마취시키고, 삽관 및 기계식 환기하였다. 랫의 가슴을 다시 개흉한 뒤 경색된 심장에서 심막(pericardium)을 부분적으로 제거하여 심근경색 랫 모델을 제작하였다. 그 후 hMSC-PA를 세 개의 봉합사를 이용하여 심외막에 직접적으로 이식한 뒤, 흉부를 무균 폐쇄하고 항생제 및 0.9% 정상 식염수를 제공하였다. 모든 랫에 면역억제제 (azathioprine, 2mg/kg; cyclosporine A, 5 mg/kg; methylprednisolone, 5mg/kg)를 매일 투여하였다. 그 후, 랫을 희생시키고 심장으로부터 조직을 수득하여 세포로 분리한 뒤, 0.5mL의 TRIzol 시약(Life Technologies)을 세포에 처리하여 총 RNA를 추출하였으며, 1㎍의 RNA를 cDNA로 합성하였다. SYBR®Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) 및 ABI Real-time PCR StepOne Plus (Applied Biosystems)를 이용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcription- polymerase chain reaction)을 3회 수행하였다. 각 처리 군에 대한 각 유전자의 발현 수준의 변화를 하우스키핑 유전자, 18S rRNA 또는 GAPDH의 전사 수준에 정규화한 CT 값을 이용하여 계산하였다.
그 결과, MI(myocardial infarction) 유도된 심장에서 hMSC-PAs는 VEGFa(vascular endothelial growth factor A), PLGF(placental growth factor), Ang1(Angiopoietin 1), Ang2(Angiopoietin 2) 및 CD31(cluster of differentiation 31)와 같은 여러 혈관신생-관련 유전자들의 발현을 현저히 상향 조절하였다 (도 2E). 또한, IFNG(Interferon gamma), IL-1b(Interleukin 1 beta) 및 TNFα(tumor necrosis factor alpha)와 같은 전-염증 관련 유전자는 유의적으로 발현이 변화하지 않은 반면, TGFβ(Transforming growth factor beta 1) 및 IL10(Interleukin 10)과 같은 항-염증 관련 유전자들의 발현 수준은 hMSC-PAs 이식된 심장에서 현저히 증가하였다 (도 2F). 또한, hMSC-PAs는 COL1(collagen type 1) 및 COL3(collagen type 3)를 포함하는 항-섬유화와 관련된 유전자들의 발현을 현저히 하향 조절하였으며, TIMP2(tissue inhibitors of metalloproteinase 2)의 발현을 증가시켰다 (도 2G). 이를 통해, hMSC-PAs가 MI 유도된 심장에서 혈관신생, 염증 및 섬유화와 관련된 다수의 인자들에 대해 현저한 측분비 효과를 유도할 수 있음을 알 수 있다.
2-3. hMSC-PAs의 혈관신생 및 심장 기능에 대한 효과 확인
여러 혈관신생 관련 유전자의 증가를 감안하여, hMSC-PAs가 MI 유도된 심장에서 혈관 재생을 개선할 수 있는지 확인하기 위해, 녹색 형광으로 표지된 IB4(isolectin B4)을 심장 조직에 관류시킨 뒤 8주 후 조직에서 혈관을 시각화하였다. 구체적으로, GFP-접합된 이소렉틴 B4(Griffonia simplicifolia)로 상온에서 15분 동안 관류한 뒤, 심상을 4% 파라포름알데하이드로 하룻밤 동안 고정하고 OCT 화합물 (Thermo Scientific)로 임베딩하였다. 그 후 HM525 NX Cryostat (Thermo Scientific)를 이용하여 심장을 10μm 절편을 제작하고 이를 -80℃에 보관하였다. 모세관의 수는 형광 현미경을 이용하여 임의의 5 곳에서 계수하고 제곱 밀리미터의 조직 당 모세관의 수로 표시되었다. 또한, 심장 기능 및 심장 리모델링에서의 hMSC-PAs의 효과를 확인하기 위해, 랫을 이소플루란으로 마취하고 15MHz L15-7io linear transducer (Affniti 50G, Philips)를 이용하여 처리 2, 4 및 8주 후 심장 초음파를 수행하였다. LV 수축기 함수의 지수인 EF(Ejection fraction) 및 FS(fractional shortening)은 하기의 수학식 1 및 2를 통해 각각 계산되었다.
Figure 112020022192800-pat00001
Figure 112020022192800-pat00002
그 결과, qRT-PCR 결과와 동일하게, hMSC-PAs가 이식된 심장의 심근 경색 지역에서 대조군에 비해 모세관의 수가 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다 (hMSC-PAs: 17.93 ± 0.07/mm2 및 대조군: 11.15 ± 1.11/mm2, n=3~5; *p < 0.05). 따라서, hMSC-PAs가 MI 유도된 심장에서 혈관 재생에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다 (도 4A). 반면, 심장 초음파 결과에서는 hMSC-PAs가 MI 유도된 심장에서 기능적 개선은 유도하지 못한 것으로 나타났다. EF (hMSC-PAs: 33.93% ± 1.66%/대조군: 32.21% ± 0.67%, n=7~10; p < 0.05) 및 FS (hMSC-PAs: 14.07% ± 0.81%/대조군: 11.56% ± 0.94%, n=7~10; p < 0.05) 모두 대조군에 비해 유의적으로 변화하지 않았다 (도 4B). 이를 통해, hMSC-PAs의 이식이 혈관 재생에 매우 효과적이지만, 심장 기능을 개선하기에는 불충분함을 알 수 있었다.
실시예 3. 인간 유도만능줄기세포 유래 심근세포 제작 및 확인
3-1. 인간 유도만능줄기세포 유래 심근세포 제작 및 확인
심장 기능을 더욱 향상시키기 위해서 추가의 세포 공급원이 필요하다고 판단하여, MI 유도된 심장을 치료하기 위한 추가 세포 유형으로서 인간 유도만능줄기세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMs)를 제작하였다. 구체적으로, mTeSR1 (STEMCELL Technologies) 또는 Essential 8 (Gibco) 배지를 사용하여 Matrigel (Corning) 또는 Vitronectin (Gibco)에서 유지된 hiPSC 세포주 (BJ1 또는 CMC11)를 37℃에서 0.5mM EDTA (Thermo Fisher scientific) 또는 Accutase (Thermo Fisher scientific)를 이용하여 5분 동안 단일 세포로 분리하였다. 그 후, 심근세포로 분화시키기 위해, hiPSC-BJ1 세포주의 경우, hPSC 적격 Matrigel (Corning)이 코팅된 세포 배양 접시에 140,000cells/cm2로 분주하고 첫 계대 24시간 동안 5μM Y-27632 (Tocris)를 첨가하였으며, 배지를 매일 교체하고 세포 밀도가 90%가 될 때까지 hiPSCs를 3 내지 4일 동안 mTeSR1에서 배양하였다. 또한, hiPSC-CMC11 세포주의 경우, hPSC 적격 Matrigel (Corning)이 코팅된 세포 배양 접시에 10,000cells/cm2로 분주하고 첫 계대 24시간 동안 10μM Y-27632 (Tocris)를 첨가하였으며, 배지를 매일 교체하고 세포 밀도가 90%가 될 때까지 hiPSC를 4일동안 Essential 8에서 배양하였다. 그 뒤, 0 일차에 GSK 억제제인 CHIR99021 (Tocris) 6~8μM 가 포함된 CDM (Cardiomyocyte Differentiation Medium) (RPMI1640 (Thermo Fisher scientific) / HSA (Sigma-aldrich) / Ascrobic acid (Sigma-aldrich))를 세포에 각각 처리하고, 48시간 후, 2μM C59 (Wnt 억제제/Stemgent Inc)가 첨가된 CDM으로 배지를 교체하여 48시간 더 배양하였다. 4 일차부터 CDM로 배지를 교체한 뒤 2일 주기로 교체해 주었다. 자발적으로 수축하는 세포는 약 6일 내지 10일에 나타나기 시작했으며, 10일부터 15일까지 배지를 L-젖산을 함유하는 CDM으로 바꿔 심근 세포(hiPSC-CMs)를 대사적으로 선택하고 정제하였다. 그 후, TNNT2 및 ACTN2와 같은 CM 특이적 마커를 나타내는 분화된 hiPSC-CMs를 면역 염색을 통해 확인하였다. 구체적으로, 선별한 hiPSC-CMs를 젤라틴이 코팅된 글라스 디쉬에 분주하고 5일 동안 배양한 뒤, 4℃에서 4 % PFA로 20분 동안 고정하고 0.1% BSA이 포함된 0.03% Triton X-100으로 10분 동안 상온에서 투과한 뒤 10% 정상 고트 혈청 (NGS, ThermoFisher scientific)이 포함된 0.03% Triton X -100으로 30분 동안 상온에서 블로킹하였다. 이 후, 세포들을 0.03% Triton X-100에 포함된 1:700 TNNT2 (Abcam) 및 1:200 ACTN4 (Sigma-aldrich)로 하룻밤 동안 4 ℃에서 반응시키고 0.03% Triton X-100로 10분씩 3회 세척하였으며, 2차 항체로 1:1000 Alexa Fluor 488 고트 항-래빗 IgG 및 Alexa Fluor 555 고트 항-마우스 IgG (ThermoFisher scientific)를 상온에서 1시간 동안 교반기 상에서 반응시켰다. DAPI (Thermo Fisher)로 핵을 염색하기 전에 세포들을 4회 세척하였다. 모든 이미지는 형광 현미경 Nikon TE2000-U (Nikon, Japan)로 분석하였다. 또한, 상기 마커들의 발현을 정량하기 위해 유세포 분석을 수행하였다.
면역염색 결과, 대부분의 분화된 hiPSC-CMs가 CM 특이적인 마커인 TNNT2 및 ACTN2를 나타냈다 (도 5). 또한, 유세포 분석을 통한 정량 결과에서도 hiPSC-CMs의 98% 이상이 TNNT2에 양성인 것으로 나타났으며, 약 84%의 hPSC-CMs가 심실 CM에 대한 마커로 잘 알려진 MYL2를 발현하는 것으로 나타나, 고도로 정제된 hiPSC-CMs의 성공적인 생성을 나타냈다 (도 5). 아울러, 상기 프로토콜로 생성된 대부분의 hiPSC-CMs는 심실 hiPSC-CMs였다.
3-2. 기존 심근세포의 비교
3-2-1. 심실성 심근세포 특성 확인
심장발생 과정에서 심실성 심근세포는 FHF(First heart-field) 전구체 형성에 의해 구성되며, 이는 대부분 심실성 심근세포를 이루는 단분화능(Uni-potent)의 특성을 가진다. 레티노산 리셉터 신호전달체계에 의해 유도되는 SHF(Second heart-field)는 FHF에 비하여 다분화능(Multi-potent)의 특성을 가지고 있으며, 이를 통하여 심방성 심근세포 뿐만 아니라 혈관내피세포 및 심외막세포 등을 형성하는 역할을 한다. 이에, 메조덤 형성 직후 전구체 유도과정에서 레티노산 시그널링의 차단을 통해 최대한 SHF로의 분화를 막고, 이를 통해 동일 시점에 더 유의적으로 심실성 심근세포의 특성을 보유하도록 세포를 분화하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1에서 생성한 hiPSC-CMs에 비해 향상된 특성을 가지는 심실성 특성강화 세포를 생산하기 위해, 48시간의 WNT 억제제 처리 후, 1μM 농도의 BMS493 (Pan-retinoic acid receptor (pan-RAR) inverse agonist) (Tocris)이 포함된 CDM 배지에서 48시간 유지한 뒤 배지를 교체하고, 24시간을 더 처리해 주었다. 그 후, 유효성을 확인하기 위해, 심근세포 제작 25일차에 심실/심근 이소형 마커 MYL2 (Myosin regulatory light chain 2, MLC2γ), 심방 이소형 마커 MYL7 (Myosin regulatory light chain 2, MLC2α), 심방보다 심실에서 높게 발현되는 이온채널 마커 KCNJ2 (Inward-rectifier potassium ion channel, Kir2.1), 심방에서 풍부하게 발현되는 이온채널 마커 KCNJ3 (Inward-rectifier potassium ion channel, Kir3.1, SAN 및 AVN), 심실 특이적 이온채널 마커 KCNA4 (Poatassium voltage-gated channel subfamily A member 4 (Kv1.4)), 심방 특이적 마커 KCNA5 (Poatassium voltage-gated channel shaker-related subfamily member 5 (Kv1.5)), 심실근 조직에서 높게 발현되는 GJA1 (Gap junction alpha-1 protein, connexin 43) 및 심실 근육보다 전도 조직 및 심방에서 풍부한 GJA5 (Gap junction alpha-5 protein, connexin 40)의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과, 동일한 시점에 일반적인 심근세포 분화방식에 비해 더 유의적으로 심실성(Ventricular) 특성을 보유하는 심근세포를 만들 수 있었으며 (도 6), 이를 통해 투여 조직 적합성/전기생리학적 안전성 확보가 가능하다.
3-2-2. 초기 생존율 및 조기 성숙 확인
종래에는 심근세포의 분화 이후 순도를 향상시키기 위해 분화 시점 10~15일 기간동안 글루코즈를 제거하고 L-젖산을 함유한 배지로 교체하여 심근세포 이외의 세포를 제거하였다. 이에, 본 발명에서는 획득 세포의 초기 생존율 향상 및 조기 성숙 달성을 위하여 상기 기간 동안 L-젖산 배지에 대사호르몬인 150 nM 농도의 트리요오드티로닌(Triiodothyronine, T3) (Sigma-aldrich) 및 1.5 μM 농도의 덱사메타손(Dexamethasone) (Sigma-aldrich)을 첨가하여 심근세포를 정제한 뒤 종래의 방법과 비교하였다. 각각의 방법으로 동일 기간 동안 정제한 심근세포를 단일 심근세포를 획득하는 17일 시점에서 심근특이적 표지자 TNNT2의 유세포분석 및 심근세포 외 세포군의 mRNA (CD31, CD34, ACTA2, WT1, POSTN 및 VIM) 발현을 분석 비교한 결과, 본 발명의 방법이 종래의 일반 정제방법과 비교하여 획득되는 심근세포의 순도에 유의적 차이가 없는 것을 확인하였으며, 정제과정 이후 단일세포를 배양하는 과정에서 높은 초기 생존율이 달성되어 48시간 내 더욱 많은 수의 박동하는 심근세포가 배양접시에 부착되어 있음을 확인하였다. 또한, 대사호르몬을 적용함으로써 정제과정 중 가해지는 극심한 대사적 스트레스 상황에서 FOXO1/NRF2의 전사를 증가시킬 수 있었고, 이에 매개되는 항산화 및 세포를 보호하는 효소 시스템의 발현이 증가함을 mRNA 발현 비교 분석을 통해 확인하였다 (도 7). 아울러, 정제 과정 후 획득한 세포의 TNNT2 및 ACTN2의 면역형광염색을 통해 대사호르몬 정제방법이 적용된 세포가 배양 초기 시점부터 더욱 뚜렷한 구조적 성숙이 이루어졌음을 확인하였고, mRNA 분석을 통해 심근세포의 구조적 성숙 인자인 TNNI3 및 MYL2과 성숙 심근세포에서 발현이 증가하는 칼슘 조절인자인 ATP2A2 및 RYR2의 발현이 유의적으로 증가함을 확인하여, 동일 시점에 더 성숙한 심근세포가 형성되었음을 확인 하였다 (도 8).
실시예 4. hPSC-CMs 및 hMSC-PAs의 공동 처리에 의한 효과
hPSC-CMs 주사 및 hMSC-PAs 이식에 의한 이중 치료 방식에 의한 심근 경색 치료 효과를 확인하기 위해, 상기 실시예 2-2에서 제작한 MI 랫 모델의 심장에 hiPSC-CMs (1.0 X 106/랫)을 심근 경색의 경계 구역에서 서로 다른 두 위치에 주사하고, hMSC-PA를 세 개의 봉합사를 이용하여 심외막에 직접적으로 이식하였다. 흉부를 무균 폐쇄하고 항생제 및 0.9% 정상 식염수를 제공하였다. 모든 랫에 면역억제제 (azathioprine, 2mg/kg; cyclosporine A, 5 mg/kg; methylprednisolone, 5mg/kg)를 매일 투여하였다. 즉, i) 치료되지 않은 대조군, ii) hiPSC-CM 심근내 주사군, iii) hMSC-PAs 이식군, 또는 iv) hiPSC-CMs 주사 및 hMSC-PAs 이식을 모두 수행한 군으로 나누어 심근경색에 대한 치료 효과를 심장 초음파, 모세관 밀도 및 섬유증(fibrosis) 분석을 통해 확인하였다. 심장 초음파 및 모세관 밀도는 상기 실시예들에 기재된 바와 같이 수행하였으며, 섬유증 분석을 위해, 각 군의 냉동된 심장 절편을 56℃에서 15분 동안 Bouin's 용액에 고정시켰다. 그 후, Weigert's Iron Hematoxylin 용액을 이용하여 상온에서 5분 동안 염색한 뒤 Biebrich Scarlet-acid Fuchsin 용액으로 상온에서 2분 동안 염색하였다. 최종적으로 절편들을 Aniline Blue로 5분 동안 대비 염색하고 1% 아세트산에서 2분 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 청색으로 나타난 콜라겐 섬유와 적색으로 나타난 생존 가능한 심근을 확인하고 좌심실 벽 영역 전체에 대한 섬유증 면적의 백분율을 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 정량하였다.
심장 초음파 검사 결과, 심장 기능이 EF (hiPSC-CMs 처리군 (CM): 35.95% ± 1.85%, 병용처리군 (CM + PA): 43.15% ± 0.52% 및 대조군: 32.21% ± 0.67%, n=7-10; p < 0.05) 및 FS (hiPSC-CM 처리군 (CM): 15.02% ± 0.85%, hiPSC-CMs + hMSC-PAs 처리군 (CM + PA): 18.61% ± 0.26% 및 대조군: 11.56% ± 0.94%, n=7-10; p < 0.05)에 의해 나타난 바와 같이 hiPSC-CM 및 hMSC-PAs를 병용처리한 군에서 심장 기능이 hiPSC-CM 또는 hMSC-PAs 단독 처리군에 비해 현저히 높아진 것으로 나타났다 (도 9A). 또한, 조직학적 이미지를 확인한 결과, 모세관의 수 (mm2)가 hiPSC-CMs 및 hMSC-PAs의 병용처리군에서 단독처리군 또는 대조군에 비해 현저하게 높아진 것으로 나타났다 (hiPSC-CMs + hMSC-PAs (CM + PA): 29.87 ± 1.53 per mm2, hiPSC-CM 단독 (CM): 11.48 ± 1.80 mm2 및 대조군: 11.15 ± 1.11 mm2; *p < 0.05 또는 hiPSC-CM 단독 (CM); # p < 0.05, n=3~5) (도 9B). 아울러, hiPSC-CMs 및 hMSC-PAs의 병용 처리는 다른 실험군들에 비해 심장 섬유증을 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다 (hiPSC-CMs + hMSC-PAs (CM + PA): 17.67 ± 2.01%, 대조군: 76.05 ± 3.10%, hiPSC-CM 단독처리군 (CM): 42.52 ± 1.80% 및 hMSC-PA 단독처리군 (PA): 77.03 ± 2.52%; **p < 0.05, n=3~5) (도 9C). 이를 통해, 병용 치료가 혈관 재생 및 심장 섬유증의 감소뿐만 아니라 심장 기능의 향상을 통해 포괄적인 심장 손상을 치료할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. hMSC-PA의 기전 확인
5-1. hiPSC-CMs의 생착 및 성숙 촉진 효과
hiPSC-CMs 주사 및 hMSC-PAs 이식을 모두 수행한 병용처리군의 심장의 10um 절편을 0.5% Triton X-100를 포함하는 PBS로 투과시키고 1% BSA를 포함하는 PBS로 60분 동안 상온에서 블로킹하였다. 그 후 절편을 1% BSA 및 1% Tween 20이 포함된 PBS에 희석된 일차 항체, 항-TNNT2 항체 (Thermo; 1:100), 마우스 항-MYH6 항체 (Abcam; 1:100), 래빗 항-GJA1 항체 (Abcam; 1:50), 래빗 항-TNNI3 항체 (Abcam; 1:50) 및 마우스 항-인간 TNNI3 항체 (Invitrogen; 1:25)와 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 1% Tween 20를 포함하는 PBS로 3회 세척한 뒤, 시료들을 이차 항체, 항-마우스 IgG Alexa Fluor 488 (Invitrogen; 1:400) 또는 항-래빗 IgG Alexa Fluor 647 (Invitrogen; 1:400)와 암조건의 상온에서 60분 동안 반응시켰다. 1% Tween 20를 포함하는 PBS로 세척한 뒤, 절편들을 DAPI 용액 (VectaShield)으로 염색하고 슬라이드에 마운팅하였다. 심장 절편의 이미지는 Laser Scanning Microscope LSM 880 NLO with Airyscan processing (Zeiss)로 확인하였다. 심장 조직에서 주사된 hiPSC-CMs를 추적하기 위해 강력한 적색 형광 염료인 CM-DiI로 표지된 hiPSC-CMs를 이용하고 콘포칼 형광 현미경으로 MI 유도된 심장에서 Dil-양성 hiPSC-CMs들을 확인하였다.
그 결과, hMSC-PAs 이식이 심근내 주사된 hiPSC-CMs의 잔류를 현저하게 향상시키는 것으로 나타났으며, Dil-양성 hiPSC-CMs가 hiPSC-CMs 주사 및 hMSC-PAs 이식을 모두 수행한 병용처리군에서 현저히 증가였으며, 좌심실의 모든 영역에 hiPSC-CMs가 검출된 반면, hMSC-PAs 이식 없이 hiPSC-CMs만 주사한 경우 주사한 지점 근처에서 부분적으로만 검출되었다 (도 10A). 정량 결과는 병용 처리군에서 hiPSC-CMs의 영역이 hiPSC-CMs 단독 처리군에 비해 현저히 큰 것으로 나타났다 (hiPSC-CMs + hMSC-PAs (CM+PA): 102.32 ± 17.83 mm2, hiPSC-CMs 단독 처리군 (CM): 42.84 ± 6.18 mm2; *p < 0.05, n=5)
또한, TNNT2 및 MYH6/7 항체를 통해 확인한 결과, hiPSC-CMs 단독 처리군은 전형적인 미성숙 CM 표현형인 구형을 나타낸 반면, hMSC-PAs 이식과 함께 심근 내 주사한 hiPSC-CMs는 현저하게 성숙한 형태를 나타냈으며, 생착된 hiPSC-CMs는 성숙형 CM과 유사하게 막대형 구조를 유지하였다 (도 10B). 또한, 주요 간극연접(gap junction) 단백질인 Gja1에 대한 염색 결과, 병용처리군의 심장에서 상당수의 생착된 hiPSC-CMs가 숙주 CM과 간극연접을 형성한 것을 나타냈다 (도 10B). 이를 통해, hMSC-PAs가 hiPSC-CM 및 숙주 CM 사이의 간극연접 형성에 지지적인 역할을 하는 것을 알 수 있다. 아울러, 인간 특이적 TNNI2으로 면역염색함으로써 Dil-양성 hiPSC-CMs가 인간 CM임을 확인하였다 (도 10C). 이를 통해, hMSC-PAs가 세포 잔류의 현저한 향상, 기능 성숙 향상 및 MI 유도된 심장에서 숙주 심근과의 통합을 유도하는 것을 알 수 있다.
5-2. hMSC의 혈관신생 촉진 효과
hMSC-PAs의 상세한 치료 기전을 확인하기 위해, hMSC-PAs가 혈관신생을 직접적으로 촉진하는지 확인하기 위해, 배양된 hMSCs으로부터 수득한 CM(conditioned media) (hMSC-CM)을 이용하여 세포 이동 및 관형성 분석(tube formation assay)을 수행하였다. 구체적으로, hMSCs (2 × 106)를 100 mm 디쉬에 분주하고 세포밀도 80 내지 90%가 될 때까지 배양하였다. 그 후 PBS로 세포를 세척하고 배지를 FBS 없이 저 글루코스 DMEM (Lonza)으로 교체하였다. 배양 14일 중 7일 후, 상등액을 수득하여 hMSCs으로부터 수득한 CM(conditioned media) (hMSC-CM)을 얻었다. 이 후 혈관신생의 중요한 단계인 내피 세포 (endothelial cell, ECs)의 증식 및 이동에 미치는 영향을 확인하기 위해 HUVEC (3.5 × 104 cells/well)를 Culture-Insert 24 (ibidi, Martinsried, Germany)에 의해 분리된 웰에서 배양한 뒤, 무-세포 간극으로의 세포의 이동을 기록하기 위해 Culture-Insert 24를 배양 24시간 후에 제거하고 10% hMSC-CM을 포함하는 EBM-2 배지 (Lonza)에서 18시간 동안 추가로 배양하였다. 이 후 0, 6, 12 및 18시간에 무-세포 간극 영역을 디지털 카메라로 촬영하고 image J 소프트웨어 (version 6.0, NIH)로 이를 계산하였다. 세포의 이동률은 0 시간의 초기 크기에 대한 폐쇄율(%)로 표기하였다. 모든 이미지는 Lumasope 720 microscope (Etaluma)로 5분 간격으로 촬영되었다. 또한, 혈관 형성 능력을 확인하기 위해 기저막 기질 (Matrigel®BD Biosciences)을 2-웰 챔버 슬라이드에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 고화시켰다. 마트리젤이 코팅된 웰 위에 1 × 105 개의 HUVECs(human umbilical vein endothelial cells)을 분주하고 20% KnockOut serum replacement, 1% 비 필수 아미노산, 0.1mM β머캅토에탄올, FGF2 4 ng/mL, VEGFA 10 ng/ml, EGF 10 ng/ml 및 DLL4 25 ng/ml을 포함하는 DMEM/F12 배지로 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 뒤 4% PFA를 추가하여 고정한 뒤 관(tube) 구조를 현미경으로 평가하였다.
그 결과, 10%의 hMSC-CM 첨가는 HUVEC의 이동을 현저하게 증가시켰으며, 대조군에 비해 무-세포 간극이 더 빠르게 채워진 것으로 나타나 (도 11A), hMSCs로부터 분비되는 사이토카인이 ECs의 이동을 촉진하는 것을 알 수 있다. 마트리젤을 이용한 혈관 형성 능력 분석결과, 10% hMSC-CM 처리된 HUVEC이 대조군에 비해 현저히 혈관이 길고 분지가 많은 것으로 나타났다 (도 11B).
5-3. hMSC의 EC 증식 촉진 효과
ES 증식에 대한 hMSCs의 효과를 확인하기 위해, hMSCs 및 HUVECs을 공동배양하고 HUVECs의 증식을 확인하였다. 구체적으로, 2 × 105개의 hMSCs을 35 mm 플레이트의 상부 층에 분주하고 2 % FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 4시간 후, HUVEC 액적 (1 x 104 cells; 10 μl)을 각 웰의 하부 층에 위치시켰다. HUVEC 액적을 37 ℃에서 3시간 동안 부착시킨 후 배지를 첨가하였다. 그 후 HUVEC 액적의 크기를 측정하기 위해 H&E 염색을 수행하였다. 플레이트 당 HUVECs의 총 수를 정량하고 HUVECs 액적 크기 및 세포 수 모두 연속 3일 동안 정량하였다.
그 결과, hMSCs과 공배양한 경우 HUVEC을 단독 배양한 대조군에 비애 HUVEC의 증식률이 현저히 증가된 것으로 나타났다 (도 11C). 증식률의 차이는 2일차부터 나타났으며, 공동 배양 플레이트에서 HUVEC 액적 크기 및 세포수가 단일 배양에 비해 현저히 높게 나타났다. 이는 hMSCs로부터 분비된 인자가 EC의 증식 및 이동에 의해 혈관 형성 잠재력을 가지는 것을 의미한다.
상기 결과들을 통해, 향상된 혈관 형성이 hMSCs로부터 분비된 혈관형성 인자들에 기인한 것임을 알 수 있다.
실시예 6. hMSC의 기전 확인
6-1. hiPSC-CMs 생존 및 이동 향상 효과
hMSC-PAs가 주사된 hiPSC-CMs의 생존 및 잔류를 향상시키는 것을 고려하여, hMSC-CMs이 hiPSC-CMs에서 직접적으로 세포 보호 효과를 나타내는지 확인하고자, 10% hMSCs CM(conditioned medium)을 H2O2 200 μM를 함유하는 hiPSC-CM 배양물에 첨가하여 in vitro 심근 허혈 상태를 관찰하였다. H2O2 노출 2시간 후, hiPSC-CMs 및 배양 배지를 수집하고 hiPSC-CMs는 Annexin V -FITC kit (Biolegend)를 이용하여 세포 사멸을 확인하고 SONY® flow cytometer (SH800, Sony Biotechnology, Inc., Tokyo Japan)로 결과를 분석하였다. 배양 배지로는 LDH cytotoxicity assay kit (Sigma)를 이용하여 LDH 분석을 수행함으로써 세포 손상을 확인하였다. 구체적으로, 배양 배지 50 μL를 수집하여 96-웰 플레이트에 옮긴 뒤 동일한 부피의 LDH 시약을 각 웰에 첨가하였다. 그 후 492 nm 및 기준 파장 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 정확한 측정을 위해 비-세포 대조군의 흡광도를 판독치에서 차감하였다. 또한, hMSCs에 의해 방출된 사이토카인에 의한 심근세포의 이동 여부를 확인하기 위해, 심근세포 이동 분석을 수행하였다. 구체적으로, hiPSC-CMs 및 hMSCs를 Culture-Insert 2 well (ibidi)에 2 x 104 cells/well로 분주하여 배양하고 36시간 후 culture inserts를 제거하였다. 그 후 2% FBS가 첨가된 RPMI 배지에서 48시간 동안 배양한 뒤 세포 이동 범위를 디지털 카메라로 0, 12, 24 및 48 시간 차에 확인하였다.
그 결과, 10%의 hMSC-CM이 PI 및 Annexin-양성 세포들의 수를 감소시켰으며 (도 12A), hMSC-CM 처리된 hiPSC-CMs으로부터 방출되는 LDH가 대조군보다 현저히 낮게 나타나 (도 12B), hMSC-CM가 허혈성 손상으로부터 심근 보호 효과를 가지는 것을 알 수 있었다. 또한, 심근세포 이동 분석 결과, hMSCs로부터 방출되는 사이토카인이 CM 이동을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.
6-2. BM-MSC CM의 사이토카인 분석
본 발명의 BM-MSC CM(conditioned medium)에 의해 분비되는 인자를 확인하기 위해, hMSC 배양물로부터 7일차 및 14일차의 상이한 시점에 hMSC-CM을 수득한 뒤 Proteome Profiler Human Arrays로 분석을 수행하였다. 그 결과, hMSC-CM에서 혈관신생 관련 사이토카인: Angiopoietin-1, Vasorin, Progranulin, IGFBP-2, IGFBP-7, VEGF, DKK-1, DKK-3, IL-6, IL-8 및 uPA; ECM 리모델링 관련 사이토카인: MMP-1, MMP-13, MMP-20, Thrombospondin-1, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, Latent TGF-beta 및 bp1; 세포 생존능 관련 사이토카인: EDA-A2, GDF-15, IL-1 sRII, MCP-1 및 MIP-2; 및 염증 관련 사이토카인: IL-28A, Lymphotactin, activin A 및 GRO들이 방출되는 것으로 확인되었다 (도 13).

Claims (17)

  1. 중간엽 줄기세포 및 심장 유래 탈세포화된 세포 외 기질(heart-derived decellularized extracellular matrix, hdECM)을 포함하는 심근 재생용 패치; 및
    심근세포;를 포함하는 심근경색 치료용 키트로서,
    상기 심근 재생용 패치는 경색 부위 심외막에 이식되는 것이고, 상기 심근세포는 주사에 의해 심근 내로 투여되는 것인, 심근경색 치료용 키트.
  2. 제 1항에 있어서, 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포인, 심근경색 치료용 키트.
  3. 제 1항에 있어서, 심근 재생용 패치는 중간엽 줄기세포 배양액(MSC-Conditioned Media)을 추가로 포함하는, 심근경색 치료용 키트.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 심근세포는 다능성 줄기세포 유래인, 심근경색 치료용 키트.
  9. 제 1항에 있어서, 심근세포는 심실성 심근세포(ventricular cardiomyocyte)인, 심근경색 치료용 키트.
  10. 제 1항에 있어서, 심근 재생용 패치는 하기의 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것인, 심근경색 치료용 키트:
    a) 심장 유래 탈세포화된 세포 외 기질을 제조하는 단계;
    b) 고분자 지지체를 제조하는 단계; 및
    c) 중간엽 줄기세포 및 심장 유래 탈세포화된 세포 외 기질을 포함하는 심근 재생용 조성물을 단계 b)의 고분자 지지체에 증착하는 단계.
  11. 제 1항에 있어서, 심근세포는 하기의 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것인, 심근경색 치료용 키트:
    a) 다능성 줄기세포주에 ROCK(rho-associated protein kinase) 신호전달 경로 억제제를 처리하는 단계;
    b) 심근세포 분화 배지에서 배양하는 단계; 및
    c) 레티노산 신호전달을 차단하는 단계.
  12. 제 11항에 있어서, 심근세포 분화 배지는 GSK 억제제가 포함된, 심근경색 치료용 키트.
  13. 제 11항에 있어서, 심근세포 분화 배지는 Wnt 억제제가 포함된, 심근경색 치료용 키트.
  14. 제 11항에 있어서, 레티노산 신호전달은 Pan-RAR(Pan-retinoic acid receptor) 역작용제(inverse agonist)를 처리하여 차단하는, 심근경색 치료용 키트.
  15. 제 11항에 있어서, 단계 c) 이후에 심실성 심근세포의 순도 향상 단계를 추가로 포함하는, 심근경색 치료용 키트.
  16. 제 15항에 있어서, 심실성 심근세포의 순도 향상 단계는 L-젖산을 함유한 배지에서 배양하는 단계인, 심근경색 치료용 키트.
  17. 제 16항에 있어서, 배지는 대사호르몬 및 덱사메타손(Dexamethasone)을 추가로 함유하는, 심근경색 치료용 키트.
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