KR101213279B1 - 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 동결 보존용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포 동결 보존용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 ROCK(Rho-associated kinase 억제제) 억제제를 포함하는, 인간 배아줄기세포로부터 분화유도된 심근세포의 동결 보존용 조성물, 인간 배아줄기세포로부터 유도된 심근세포에 상기 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 분화 유도된 심근세포를 동결 보존시키는 방법에 관한 것이다.

Description

인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 동결 보존용 조성물{Composition for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes}

본 발명은 인간 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 동결 보존용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 ROCK(Rho-associated kinase) 억제제를 포함하는 인간 배아줄기세포로부터 분화유도된 심근세포의 동결 보존용 조성물, 및 인간 배아줄기세포로부터 분화유도된 심근세포에 상기 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 심근세포를 동결 보존시키는 방법에 관한 것이다.

최근 서구식 식습관의 영향, 운동 부족, 고령화 사회로의 진입에 따른 노년층의 증가 등으로 인해 심근 경색증을 포함한 심혈관계 질환에 의한 사망자의 수가 급격히 증가하는 추세이다. 궁극적인 치료 방법으로 약물 요법 및 심장이식이 주로 사용되고 있으나, 비용 및 공여자의 한계로 인해 새로운 대체 치료법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

상기와 같은 대체 치료법으로서 각광을 받고 있는 것이 줄기세포의 이용이다. 줄기세포는 재생의학, 약리학 및 기초과학 연구 분야로 광범위하게 적용이 가능하다는 잠재력을 보유하고 있으며, 세포이식 및 조직공학과 같은 임상에의 적용을 위한 세포 공급원으로서의 역할이 기대되고 있다. 특히, 인간 배아줄기세포 유래의 심근세포는 심혈관계 질환 환자들에게 새로운 세포를 제공할 수 있는 적절한 세포 공급원으로서 관심을 받고 있다.

한편 인간 배아줄기세포 유래의 심근세포를 심혈관계 질환에 관한 연구 및 임상, 나아가 치료의 목적으로 이용하려면 상기 심근세포를 효과적이고 안전하게 동결보존할 필요가 있다. 또한 안전한 동결 방법은 줄기세포 또는 줄기세포에서 분화된 심근세포의 저장과 운송이 요구되는 세포 은행 설립에 필수적이다. 그러나 다수의 연구들이 줄기세포 또는 줄기세포에서 분화된 심근세포가 장기 배양될 때 세포의 특성 및 유전학적 정상 핵형에 대한 변화가 있다고 보고하고 있다. 하지만, 현재까지 인간 배아줄기세포-유래의 심근세포는 최적화된 동결 보존 방법의 부재로 인해 연구 및 치료 목적으로서의 적용 가능성이 낮게 평가되고 있는 실정이다.

종래의 연구에서는, 주로 DMSO를 처리하는 유리화 동결 또는 대량 동결보존법을 이용하여 인간 배아줄기세포를 동결 보존하였다. 그러나, 이와 같은 방법은 해동된 세포의 생존률이 매우 낮다는 한계가 있었다. 인간 배아줄기세포-유래의 심근세포의 동결보존 후의 낮은 생존률의 극복은 분화유도된 심근세포를 임상학적 적용, 또는 치료의 목적으로 이용하기 위해 최우선적으로 해결해야할 과제이다. 이에, 동결보존 후의 생존율을 높이기 위한 동결보존 방법 많은 연구자들에 의해 연구되고 있으며, 성공적인 인간 배아줄기세포의 냉동보존에 대한 연구결과가 발표되는 실정이나, 인간 배아줄기세포 유래의 심근세포의 장기 보존을 위한 동결보존에 대한 연구는 거의 보고된 바가 없다. 유일하게 보고된 문헌은 단지 세포 클러스터의 심장 박동 활성이 복구되지 않은 해동 후 세포의 기본적인 특성에 대해 나타내고 있을 뿐이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 인간 배아줄기세포 유래의 심근세포를 성공적으로 동결보존하는 방법 및 해동 후의 생존을 위한 최적 조건을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, ROCK 억제제를 포함하는 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 동결 보존용 조성물을 개발하였고, 상기 조성물을 처리하여 분화 유도된 심근세포를 동결 보존 후 해동한 결과, 해동된 심근세포가 심근세포 고유의 특성인 수축능력을 회복하고 특성을 유지함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 ROCK 억제제를 포함하는, 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 동결 보존용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포에 상기의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 분화 유도된 심근세포를 동결 보존시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 ROCK 억제제를 포함하는, 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 동결 보존용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "인간 배아줄기세포"란 내배엽, 중배엽, 및 외배엽 유래의 세포로 분화할 수 있는 전분화능(Pluripotency)을 가지는 세포, 또는 인간의 몸을 구성하는 근육, 뼈, 뇌, 피부, 심장 등의 서로 다른 조직 또는 기능에 있어 밀접하게 관련된 세포로 분화할 수 있는 다분화능(Multipotency)을 가지는 세포를 의미한다. 인간 줄기세포의 예로 수정란이 처음으로 분열할 때 형성되는 만능 줄기세포, 인간의 배아를 이용해 만들 수 있는 배아줄기세포, 및 성숙한 조직과 기관 속에 존재하는 성체줄기세포가 있으나, 상기 예에 의해 인간 줄기세포의 종류가 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 본 발명에서의 인간 줄기세포는 인간 배아줄기세포, 인간 배아줄기세포 유래 배아체, 또는 인간 유도만능줄기세포이며, 더욱 바람직하게는 인간 배아줄기세포이다.

본 발명에서 용어, "인간 배아줄기세포"란 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴를 추출하여 체외에서 배양한 것으로 인체의 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 가지는 세포를 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(Embryoid body)와 같은 유사 줄기세포들을 포함한다.

본 발명에서 용어, "인간 유도만능줄기세포"란 인간의 체세포에 역분화 유전자를 삽입하여 배아줄기세포와 유사한 분화능을 가진 미분화 상태의 줄기세포를 확립하는 방식으로 만들어진 것으로, 분화능력이 배아줄기세포와 비슷한 수준인 줄기세포를 의미한다. 또한 상기의 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포는 공지의 방법에 의해 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있다.

본 발명에서 용어, "분화"란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 각각의 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변하는 것을 의미한다. 구체적으로 본 발명에서는, 인간 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화를 의미한다.

본 발명에서 용어, "심근세포"는 장래에 기능적인 심근세포가 될 수 있는 능력을 가진 심근 전구 세포, 또는 태아형 심근세포, 성체 심근세포, 박동 전의 심근세포, 박동 후의 심근세포와 같은 모든 분화 단계의 세포를 제한 없이 포함하며, 이하에 기재된 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 방법에 의하여 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 마커나 기준으로 확인할 수 있는 세포를 의미한다. 바람직하게 본 발명에서는 박동 전의 심근세포를 의미한다. 심근세포 특이적인 각종 마커의 발현은, 공지의 생화학적 또는 면역화학적 방법으로 검출할 수 있으며, 이러한 방법은 제한 없이 사용할 수 있다. 이러한 방법에서, 심근 전구 세포 또는 심근세포에 결합하는 마커 특이적인 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다. 개개의 특이적 마커를 표적으로 하는 항체는 시판용이나 공지의 방법에 의해 제조된 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근세포에 특이적인 마커의 예로는 미오신 중쇄/경쇄(MHC/MLC), α-엑티닌(α-actinin), 트로포닌 I(cTn I), ANP, GATA4, Nkx2.5 및 MEF-2c 등을 들 수 있다. 또는, 심근 전구 세포 또는 심근세포 특이적 마커의 발현은, 특정한 방법에 한정되지 않으나, 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이나 혼성화 분석인, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 해석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물학적 방법으로 확인할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근세포에 특이적인 마커(예, 미오신 중쇄/경쇄, α-엑티닌, 트로포닌 I, ANP, GATA4, Nkx2.5 및 MEF-2c) 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은행 (GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 다능성 세포의 심근세포로의 분화를 확인하기 위해, 생리학적 기준을 추가적으로 사용할 수 있다. 즉, 다능성 세포 유래의 세포가 자립적 박동성을 가지거나, 각종 이온 채널을 발현하고 있고 전기 생리적 자극에 반응할 수 있는 것 등도 유용한 지표로 활용할 수 있다.

본 발명의 동결 보존용 조성물을 이용하여 동결한 심근세포는 심장 관련 질환을 치료하기 위한 심근 재생제 또는 세포 대체요법용 세포 조성물로 이용할 수 있다. 심장 관련 질환은 선척적 또는 후천적으로 심장에 이상이 생기거나 변성이 생겨 발생한 질환이면 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대성 심근증, 확장형 심근증, 심근염, 만성 심부전 등이 있다. 심근 재생제 또는 세포 대체요법용 세포 조성물은 본 발명에 의해 제조된 심근세포를 높은 순도로 포함하는 것이면, 세포를 배지 등의 수성 담체에 부유시킨 것, 세포를 생체 분해성 기질 등의 지지체에 내포시킨 것, 또는 단층 또는 다층의 심근세포 시트 (Shimizu 등, Circ. Res. 90: e40, 2002)로 가공한 것 등, 다양한 형태로 사용할 수 있다. 상기 치료제는 개흉한 뒤 주사기를 이용하여 직접 심장에 주입하는 방법, 심장의 일부를 외과적으로 절개하여 이식하는 방법, 또는 카테터를 이용한 경혈관적 방법에 의해 이식하는 방법 등으로 장해 부위에 수송할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 따라서, 심근세포의 쇠퇴 및 소실로 인한 상기의 심장 관련 질환에 있어서, 본 발명의 동결 보존 방법으로 처리한 심근세포를 질환성 심장 조직에 보충적으로 이식함으로써, 심장 기능 개선의 촉진을 기대할 수 있다.

본 발명의 동결보존용 조성물을 사용하기 위한 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포를 제조하는 방법으로는, 크게 직접 분화 유도법과 배아체 경유법을 사용할 수 있고, 일반적으로 사용되는 공지의 부유 응집 배양법, 현적 (hanging drop) 배양법 및 영양세포(feeder)를 이용한 공배양법 (co-culture method)과 혼용하여 사용할 수 있으나, 인간 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화유도 방법이 상기 방법들에 의해 제한되지는 않는다. 바람직하게는 BMP2를 이용한 직접 분화법을 사용하여 분화유도된 심근세포의 생존율을 높게 동결보존하는 데 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "동결 보존"이란 냉동을 통해 장기간에 걸쳐 세포주를 안정하게 유지시키는 행위를 의미한다. 세포는 보통 배양에서 일만 개에 한 개의 비율로 돌연변이적으로 변이가 일어나고 있다. 다시 말해서 장기간에 걸쳐 세포의 계대를 계속하면, 본래의 세포집단과는 전혀 다른 세포집단으로 변하고, 최악의 경우에는 세포가 가지고 있던 어떤 종류의 기능이 장기간의 계대에 의해 소실되는 경우도 있다. 따라서 이와 같이 동결을 통해 세포주를 보관하여 세포의 소실을 막는 것을 가능하게 하는 행위를 동결 보존이라 한다. 본 발명에서의 동결보존 방법은 유리화 동결 또는 대량 동결보존이 포함될 수 있으나, 동결보존의 방법이 상기 예에 의해 제한되지는 않는다. 바람직하게 본 발명에서의 동결 보존은, 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 대량 동결 보존을 의미한다. 본 발명의 동결보존용 조성물을 이용하여 인간 배아줄기세포로부터 분화유도된 심근세포를 동결보존시키면 장기간 동안 심근세포의 특성을 유지하며 유전자형 또는 핵형의 변화 없이 보존이 가능하여 해동 후 증식이 가능하다.

본 발명에서 용어 "ROCK(Rho-associated kinase)"란, 저분자 GTP-결합단백질인 Rho의 하류에서 작용하는 세린/트레오닌 키나아제인 ROCK를 억제할 수 있는 물질을 의미하여, ROCK 억제제의 예로는, 이에 제한되지는 않으나, Y-27632, HA-1077, Y-39983, 및 Wf-536가 포함될 수 있다. 바람직하게는 Y-27632를 사용할 수 있다.

바람직하게 본 발명의 조성물 내의 ROCK 억제제는 1μM 내지 20μM의 농도일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10μM 농도일 수 있다.

구체적인 일 구현예에 따르면, 분화된 세포에 ROCK 억제제를 처리하고, 세포를 분리하여, 대량 동결보존법을 이용하여 냉동보존한 결과, 해동된 심근세포의 생존율이 높음을 확인하였다. 대량 동결보존된 세포들의 경우, 박동은 해동 후 5일째부터 ROCK 억제제를 처리한 세포들에서 확인할 수 있었으며, 그 비율은 10% 였다.

또한, 생존한 세포의 수는 분화 12일째와 분화 16일째의 세포에서 모두 ROCK 억제제를 처리한 세포군에서 가장 높음을 확인하였다. 생존율은 ROCK 억제제를 처리한 세포군에서 대조군과 비교하여 약 4배가 높았으며, NT 4(Neurotrophin 4)를 처리한 세포군에서는 2배가 높았다. 이는 ROCK 억제제를 사용하는 것이 NT 4(Neurotrophin 4)를 사용하는 것보다 생존 및 기능의 회복 능력이 더 우수함을 시사하는 것으로 본 발명의 동결용 조성물인 ROCK 억제제의 효과가 좋음을 시사하는 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포에 ROCK 억제제를 포함하는 동결 보존용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 분화 유도된 심근세포를 동결 보존시키는 방법에 관한 것이다.

심근세포 및 배아줄기세포는 상기에서 설명한 바와 같다.

바람직하게 본 발명의 ROCK 억제제를 포함하는, 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 동결 보존용 조성물은 0.25 시간 내지 5 시간 동안 처리할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1시간 동안 처리할 수 있다.

구체적인 일 구현예에 따르면, ROCK 억제제를 처리하고, 해동 후 재부착된 세포들을 현미경으로 관찰한 결과, 그 수가 생장하는 것을 확인하였다. 또한, 해동된 세포들의 증식을 확인하기 위하여, 해동 후 5일째에 BrdU와 α-엑티닌의 면역세포염색을 수행한 결과, BrdU와 α-엑티닌을 발현하는 세포들을 확인하였다. 이러한 결과들은 해동 후의 심근세포가 심근세포의 특성을 유지하면서 증식할 수 있는 능력이 있음을 시사한다.

바람직한 일 실시태양으로 상기 동결보존시키는 방법은 DMSO 및 FBS를 추가로 포함하는 조성물에서 동결시키는 대량 동결보존 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대량 동결보존 단계는 분화된 세포에 ROCK 억제제인 Y-27632를 처리한 다음, Y-27632가 포함된 동결보존 용기에 DMSO 및 FBS를 처리한 후, -70℃에서 12시간 이상 보관 후, 액체 질소에서 장기간 보존하는 단계로 이루어진다. 그 후 37℃ 항온수조에서 서서히 해동한 다음, 원심분리를 통해 동결보존액을 제거한 후, Y-27632가 포함된 배양액에 부유하여 배양 접시에 부착시킨다. 해동 이틀 후부터는 Y-27632를 포함하지 않는 배양액에서 배양하여 활성을 회복시킬 수 있다.

바람직한 일 실시태양으로 상기 동결보존시키는 방법에 있어서, 분화유도된 심근세포에 ROCK 억제제를 처리하는 시기는 심근 박동 전의 세포일 수 있으며, 본 발명의 조성물을 사용하여 안정하게 동결보존을 할 수 있으며 해동 후 심근세포의 특성을 회복할 수 있는 단계의 세포에 제한없이 사용할 수 있으나 바람직하게는 심근 박동 전의 세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간 배아줄기세포로부터 분화유도 시작 후 12일째인 심근세포 일 수 있다.

바람직한 일 실시태양으로 상기 동결보존시키는 방법은, 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 동결 보존용 조성물을 처리하는 단계; ROCK 억제제, DMSO 및 FBS를 포함하는 조성물에서 동결시키는 대량 동결보존 단계; 및 해동 후 해동된 세포에 ROCK 억제제를 포함하는 조성물을 처리하는 단계에 의해서 수행될 수 있다.

바람직한 구체적인 일 구현예에 따르면, 본 발명의 ROCK 억제제를 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도 후 12일째(심근박동 전) 및 16일째(심근박동 후)의 세포에 1시간 반응시킨 후 대량 동결보존 방법 또는 유리화 동결방법으로 동결시킨 후 해동한 결과, ROCK 억제제를 포함하는 동결보존용 조성물을 심근박동 전의 심근세포에 처리한 군에서 생존율이 높으며 세포의 파괴가 적고, 아넥신 V(Annexin V) 염색 결과 뚜렷한 세포사멸 억제효과를 나타내며 증식효과도 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명에 따른 ROCK 억제제를 포함하는, 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 동결 보존용 조성물, 및 상기 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 동결보존 방법을 이용하면 심근세포의 생존 능력을 유지하여 장기간 보존하는 것이 가능하므로, 심장 관련 질환의 치료를 위한 세포 치료제 등의 개발에 기여할 수 있다. 아울러 본 발명에 의해 동결 보존된 심근세포는 적절한 시기에 해동하여, 신약 개발 과정에서 요구되는 줄기세포를 이용한 생물학적 약효 검증 시스템, 특히 심근세포 분화 유도 물질 및 심장 기능 강화 물질을 개발하기 위한 약효 검증 시스템과 신약제품화에 활용될 수 있다.

도 1은 인간 배아줄기세포로부터 분화된 심근세포를 동결보존하는 연구 흐름도이다.
도 2는 인간 배아줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 연구 흐름도이다.
도 3은 주사전자현미경을 이용한 인간 배아줄기세포 유래 심근세포의 동결보존 전과 후의 미세구조 분석 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 인간 배아줄기세포 배양

세 개의 인간 배아줄기세포주, SNUhES3, SNUhES16 및 SNUhES12를 미토마이신 (Mitomycin C, Sigma)이 처리된 STO 지지세포 (ATCC) 위에서 Oh 등(Methods for expansion of human embryonic stem cells, Stem Cells, 2005 May; 23(5): 605-9)의 방법에 따라 배양하였다. DMEM/F12 (Invitrogen)를 기본 배양액으로 하여 20% 넉아웃 시럼 리플레이스먼트 (knockout serum replacement, KO-SR, Invitrogen), 1% 비필수 아미노산 (nonessential amino acids, Invitrogen), 0.1 mM 베타-머캡토에탄올 (β-mercaptoethanol, Sigma), 4 ng/㎖ 염기성 FGF (fibroblast growth factor, bFGF, Invitrogen), 50 U/㎖ 페니실린 (Invitrogen) 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Invitrogen) 등을 첨가하여 인간 배아줄기세포 배양액으로 사용하였다.

실시예 2: 직접 분화법을 이용한 심근세포의 형성

상기 실시예 1에서 얻은 미분화 상태의 인간 배아줄기세포에 0.025% 트립신-EDTA (Invitrogen)를 37℃에서 3분간 처리하였다. 이후, 지지세포를 제거하고 PBS (Invitrogen)로 세정하였다. 세정 후 RPMI 1640 (Invitrogen) 배양액에 B27 (Invitrogen)을 첨가한 배양액을 첨가하고 100 ng/㎖의 악티빈 A (Activin A, R&D Systems)를 24시간 동안 처리한 후에 악티빈 A를 제거한 다음, 10 ng/㎖의 BMP2 (R&D Systems)를 4일간 처리하였다. 분화 기간 동안, 5일째부터는 성장인자들을 첨가하지 않고, 이틀 간격으로 배양액을 교체하였다.

상기와 같은 분화 과정의 전체적인 개요는 도 2에 나타낸 바와 같다.

실시예 3: 인간 배아줄기세포 유래 심근세포의 동결보존 및 해동

상기 실시예 2에서 분화된 심근세포를 분화 후 12일째와 16일째에 각각 10 μM Y-27632 (Calbiochem), 50 μg/ml 뉴로트로핀 3(Neurotrophin 3) (PeproTech), 또는 50 μg/ml 뉴로트로핀 4 (PeproTech)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 아큐타제 (Chemicon)를 37℃에서 10분간 처리하여 작은 세포 덩어리로 분리시켰다.

대량 동결보존 (Mass cryopreservation)을 위해서, 분리된 심근세포들을 500 μl의 배양액에 부유시켜, 20%의 DMSO (Sigma)와 60%의 FBS (HyClone)로 구성된 용액이 500 μl 들어있는 동결보존 용기로 옮겨주었으며, 위에서 언급한 Y-27632, 뉴로트로핀 3 또는 4들을 첨가하였다. 동결보존 용기들을 동결 저장장치(freezing container)로 옮긴 후, -70℃에서 12시간 이상 보관하였다. 보관 후, 동결보존용기들을 액체질소에 담가서 장기보존하였다. 수일 후, 동결보존된 인간 배아줄기세포 유래 심근세포는 37℃ 항온수조에서 해동하였다. 동결보존액에 2 ml의 배양액을 천천히 첨가한 후, 심근세포 덩어리를 부드럽게 세정하였다. 원심분리를 이용하여, 동결보존액을 제거하고, 각각의 Y-27632, 뉴로트로핀 3, 또는 4를 포함하는 배양액에 부유하여 배양접시에 부착시켰다. 해동 이틀 후부터는 상기 Y-27632, 뉴로트로핀 3, 또는 4를 포함하지 않은 배양액을 첨가하여 주었다.

유리화 동결 (Vitrification)을 위해서 두 종류의 용액을 사용하였다. 유리화동결 용액 I과 유리화동결 용액 II로서, 용액 I은 배양액에 10% 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) (EG; Sigma)과 10% DMSO가 첨가된 용액이고, 용액 II는 배양액에 20% 에틸렌 글리콜, 20% DMSO 및 0.5 M 수크로스(sucrose) (Sigma)가 첨가된 용액이다. 해동을 위해서도, 두 종류의 용액을 사용하였다. 해동 용액 I과 해동 용액 II로서, 용액 I은 배양액에 0.2 M 수크로스 (Sigma)가 첨가된 용액이고, 용액 II은 배양액에 0.1 M 수크로스가 첨가된 용액이다. 분리된 심근세포들을 세포 거름망 (cell strainer; BD Biosciences)에 올린 후 유리화 동결 용액 I에 37℃에서 1분간 담궜고, 다시 용액 II에 37℃에서 30초간 담갔다. 그 후, 세포 거름망을 액체 질소에 보관하였다. 수일 후에, 세포 거름망을 회수하여, 해동 용액 I에 1분간 담근 후, 해동 용액 II로 옮겨, 5분간 담갔다. 해동된 세포들을 배양액에 각각 Y-27632, 뉴로트로핀 3, 또는 4를 첨가한 배양접시로 옮겼다. 해동 이틀 후부터는 Y-27632, 뉴로트로핀 3, 또는 4를 포함하지 않은 배양액을 첨가하여 주었다.

생존 및 기능의 회복을 이틀 간격으로 현미경을 이용하여 확인한 결과, 해동된 심근세포의 생존율은 대량 동결보존법을 이용하여 냉동된 세포에서 유리화 동결 방법으로 해동된 세포보다 뚜렷하게 높았다. 유리화 동결되었던 세포들의 경우, 대부분의 해동된 세포들은 배양접시에 부착되지 않았고, 형태학적 모양이나 박동 등을 회복하지 못하였다. 대량 동결보존된 세포들의 경우, 박동은 해동 후 5일째부터 ROCK 억제제를 처리한 세포들에서 확인할 수 있었으며, 그 비율은 10% 였다.

생존한 세포의 수는 분화 12일째와 분화 16일째의 세포에서 모두 ROCK 억제제를 처리한 세포군에서 가장 높았다. 생존율은 ROCK 억제제를 처리한 세포군에서 대조군과 비교하여 약 4배가 높았으며, NT 4(Neurotrophin 4)를 처리한 세포군에서는 2배가 높았다. 또한, ROCK 억제제를 처리한 해동된 세포군의 박동수는 분당 58에서 108 사이였으며, 이것은 동결보존 하지 않은 심근세포보다 빠른 것이었다.

이러한 결과는 본 발명의 ROCK 억제제를 포함하는 조성물로 동결시키는 방법의 해동 후 생존율이 높다는 결과를 시사하는 결과이다.

실시예 4: 동결 및 해동 후 심근세포의 특성 유지 확인

<4-1> 주사전자현미경 분석을 통한 해동 후 심근세포의 미세구조 변화 분석

분화된 세포를 PBS로 세정한 후 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde, Sigma) 용액으로 상온에서 20분간 반응시켰다. 그 후, 세포를 0.14M 수크로스 (sucrose)가 첨가된 1% 오스뮴 테트록사이드 (osmium tetroxide, Sigma)를 첨가하여 4℃에서 10분간 반응시켰다. 에폭시 레진을 첨가한 후 중합을 위하여 빔 캡슐 (beam capsule)로 옮겨주었다. 중합된 세포들은 면도칼을 이용하여 레진으로부터 분리하였다. 울트라마이크로톰(Ultramicrotome, MT-6000, DuPont Instruments-Sorvall Biomedical Div.)을 이용하여 샘플을 잘라준 후, 주사전자현미경(JEM-1400; JEOL Ltd.)으로 관찰하였다.

아울러, 동결보존 후 인간 배아줄기세포 유래 심근세포의 미세구조적 변화를 분석하기 위해 주사전자현미경 분석을 수행한 결과, 세포 구조의 파괴가 분화 12일째와 분화 16일째의 세포군에서 모두 확인되었다. 세포 구조의 파괴는 분화 16일째의 세포군에서 많이 관찰되었다. 핵과 세포막과 같은 세포 소기관도 부분적으로 파괴되어 있었으며, 지질 방울과 확장된 소포체 등이 관찰되었다. 미토콘드리아는 모든 세포에서 많은 수가 존재하였으며, 대부분은 핵막 간 미토콘드리아(perinuclear mitochondria)였다.

이는 분화 12일째에 ROCK 억제제를 처리한 군의 세포군에서의 세포 구조의 파괴가 적음을 시사하는 것이다.

도 3은 주사전자현미경을 이용한 인간 배아줄기세포 유래 심근세포의 미세구조 분석 결과에 관한 것으로, 심근세포 미세구조적 특징인 많은 수의 미토콘드리아 및 Z band의 전구체인 Z body의 존재를 확인시켜주었다.

<4-2> Annexin V 염색을 통한 ROCK 억제제의 항 세포사멸 효과 조사

ROCK 억제제의 항 세포사멸 효과를 확인하기 위하여 Annexin V 염색을 수행하였다.

세포를 0.25% 트립신-EDTA에서 10분간 37℃에서 반응시킨 후, 단일 세포로 분리하였다. Annexin V 염색은 FITC Annexin V apoptosis detection kit I (BD Biosciences)을 이용하여 수행하였다. 간단히 과정을 설명하면, 세포들을 차가운 PBS를 이용하여 두 번 세정한 후, 1X 결합 완충액(binding buffer)을 첨가하여 부유시켰다. 이후, 5 μl의 FITC가 결합되어 있는 Annexin V와 PI (Sigma)를 첨가하여 암조건의 상온에서 15분간 반응시켰다. 세포들을 BD FACS Calibur^TM (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, Annexin V 염색 결과 동결보존 전과 후에 ROCK 억제제를 처리한 경우 분화 12일째의 심근세포에서 뚜렷하게 세포사멸을 억제하는 결과를 보여주었다. 이와는 반대로 분화 16일째의 심근세포의 동결보존에는 ROCK 억제제의 처리가 뚜렷한 효과를 나타내지 않았다. 이와 같은 결과는 동결 보존 전후의 ROCK 억제제 처리가 인간 배아줄기세포 유래 심근세포의 생존 및 기능의 회복을 증가시켰음을 나타내며, 박동 전의 심근세포를 동결보존 하는 것이 심근세포의 보존과 해동 후 기능회복에 더 적절함을 나타낸다.

<4-3> BrdU 표지를 이용한 해동된 세포들의 증식 확인

해동된 세포들의 증식을 확인하기 위하여, 해동 후 5일째에 BrdU와 α-엑티닌의 면역세포염색을 수행하였다.

해동된 세포들을 10 μM 5-브로모-2-디옥시유리딘 (BrdU; Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)를 첨가하여 24시간 동안 반응시킨 후, PBS로 세정하였다. 그 후, 4% PFA를 이용하여 고정한 후, 3% BSA를 첨가하여 반응시켰다. 일차항체, 마우스 항-BrdU (Chemicon) 및 염소 항 α-엑티닌, 를 첨가하여 면역세포염색법에 의한 표지인자 발현 조사 부분에 기술한 것과 동일하게 그 이후의 과정을 수행하였다.

4℃에서 밤새 반응시킨 후, PBST(0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)로 세번 세정하고, 이차 항체를 첨가하여, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, PBST를 사용하여 세 번 세정한 후, DAPI가 포함되어 있는 용액으로 염색하여, 공초점 형광 현미경(BioRad)을 사용하여 관찰하였다.

그 결과, BrdU와 α-엑티닌을 발현하는 세포들이 확인되었다. 이러한 결과는 해동 후의 심근세포가 심근세포의 특성을 유지하면 동결보존 및 해동 후도 증식할 수 있는 능력이 있음을 보여주는 것으로 본 발명의 ROCK 억제제를 포함하는 동결보존용 조성물을 사용하여 인간 배아줄기세포로부터 분화유도된 심근세포를 동결보존시킬 경우 심근세포의 특성 및 증식 능력이 회복될 수 있다는 것을 시사하는 것이다.

Claims (11)

1. ROCK (Rho-associated kinase)억제제를 포함하는, 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포의 동결 보존용 조성물로서,
   상기 심근세포는 심근 박동 전의 심근세포인 것인 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 인간 배아줄기세포는, 인간 배아줄기세포 유래 배아체, 또는 인간 유도만능줄기세포인 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 Y-27632, HA-1077, Y-39983 및 Wf-536으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 물질인 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 Y-27632인 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, Y-27632의 농도가 1μM 내 20μM로 포함된 조성물.
   
   
6. 인간 줄기세포로부터 분화 유도된 심근 박동 전의 심근세포에 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 분화 유도된 심근 박동 전의 심근세포를 동결 보존시키는 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 배아줄기세포, 인간 배아줄기세포 유래 배아체, 또는 인간 유도만능줄기세포인 방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 조성물을 처리하는 단계는 0.25 시간 내지 5 시간 동안 이루어지는 것인 방법.
   
9. 제6항에 있어서, ROCK 억제제, DMSO 및 FBS를 포함하는 조성물에서 동결시키는 대량 동결보존 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
   
10. ROCK (Rho-associated kinase)억제제를 심근 박동 전의 심근세포에 처리하여 심근세포를 동결보존시키는 단계를 포함하는, 심근 세포의 동결보존시 심근세포의 생존율을 증가시키는 방법.
    
11. 제6항에 있어서, i) 인간 줄기세포로부터 분화 유도된 심근 박동 전의 심근세포에 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계; ii) ROCK 억제제, DMSO 및 FBS를 포함하는 조성물에서 동결시키는 대량 동결보존 단계; 및 iii) 해동 후 해동된 세포에 ROCK 억제제를 포함하는 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 분화 유도된 심근 박동 전의 심근세포를 동결 보존시키는 방법.

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