KR20090083927A - 펩타이드를 위 점막에 전달하기 위한 방법 및 장치 - Google Patents

펩타이드를 위 점막에 전달하기 위한 방법 및 장치 Download PDF

Info

Publication number
KR20090083927A
KR20090083927A KR1020097011998A KR20097011998A KR20090083927A KR 20090083927 A KR20090083927 A KR 20090083927A KR 1020097011998 A KR1020097011998 A KR 1020097011998A KR 20097011998 A KR20097011998 A KR 20097011998A KR 20090083927 A KR20090083927 A KR 20090083927A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
helicobacter
gene
disease
dna
nucleic acid
Prior art date
Application number
KR1020097011998A
Other languages
English (en)
Inventor
배리 제이. 마샬
Original Assignee
배리 제이. 마샬
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US11/558,570 external-priority patent/US8029777B2/en
Priority claimed from AU2007901331A external-priority patent/AU2007901331A0/en
Application filed by 배리 제이. 마샬 filed Critical 배리 제이. 마샬
Publication of KR20090083927A publication Critical patent/KR20090083927A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01005—Urease (3.5.1.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/42—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a HA(hemagglutinin)-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 펩타이드를 점막에 생체내 전달하는, 비-헬리코박터성 관련 질환을 치료하기 위한 펩타이드 전달 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 i) 펩타이드를 코딩하는 유전자를 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 유레아제 효소를 코딩하는 유전자에 삽입하여, 인-프래임 유전자가 발현되었을 때 유레아제 효소 기능이 손상되지 않도록 인-프래임 유전자를 생산하는 단계; 및 ii) 점막에서 집락을 형성하도록 동물에 감염시키는 단계를 포함하는 동물의 점막에 펩타이드를 전달하는 방법에 관한 것이다.

Description

펩타이드를 위 점막에 전달하기 위한 방법 및 장치{METHODS AND DEVICES FOR THE DELIVERY OF PEPTIDES INTO THE GASTRIC MUCOSA}
본 발명은 일반적으로 헬리코박터계 벡터, 플라스미드 벡터 및 셔틀 벡터 시스템 분야에 관한 것으로, 비-헬리코박터 펩타이드를 포함하는 신규한 헬리코박터 구조체를 제공한다. 또한, 본 발명은 펩타이드를 생체내 점막으로 전달하는 비-헬리코박터 연관성 질환을 치료하기 위한 펩타이드 전달에 관한 것이다.
헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)는 거의 인간 위 점막에서만 발견되는 그람 음성의 나선 형태의 박테리아이다. 인간의 위 산도는 본질적으로 헬리코박터 종 이외의 모든 박테리아의 집락 형성에 효과적인 장벽이다.
헬리코박터 필로리는 만성 감염의 원인 물질로 칭해지고 있다. 특히, 헬리코박터는 소화성 궤양, 위 선암종 및 원발성 위 림프종에서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다.
헬리코박터 필로리는 점막 염증 및 면역 반응 발생에도 불구하고, 인간 위장 점막내에서 수십년간 집락을 형성하여 살아갈 수 있는 독특한 능력을 가지고 있다. 이러한 특징은 헬리코박터 필로리가 점막을 통해 펩타이드를 전달하는 흥미로운 후보체가 되게 한다. 그러나, 이러한 독특한 이용은 부분적으로는 다양한 질환과의 관련성으로 인해 점막 전달 시스템에서의 사용이 확인되지 않았다. 이에, 이들 중요한 유기체를 이용하여 숙주에 대한 병리학적 위험성이 감소된, 펩타이드 전달 시스템의 필요성이 계속적으로 존재하고 있다.
또한, 점막 구획으로의 접근을 방지하는 숙주의 천연 장벽 기능으로 인한, 기존의 접근 방법에 의해 전달된 항원의 면역원성 불량이, 점막 전달 시스템의 개발에 장애가 되고 있다. 그래서, 유용하며 유익한 면역성 반응을 도출하는데 충분한 점막 표면에 펩타이드와 같은 약학적으로 활성인 분자의 개선된 전달 메카니즘에 대한 필요성이 의학 분야에서 계속적으로 존재하고 있다. 이러한 요구로 약학적으로 활성인 물질에 대한 효과적인 생체내 절단 시스템과 효과적인 면역화 방법, 즉 일반적인 체액성 및 점막성 면역 반응을 도출하는데 충분한 점막 표면에 항원 노출 방법이 제공되게 될 것이다.
개요
본 발명은 헬리코박터의 사용과 질병의 치료와 관련있는 전술한 과제 등을 해결하기 위한 것이다. 본 발명은 다수의 이행 및 적용들로 예시되며, 일부는 하기에서 요약된다.
일부 측면에서, 본 발명은 프로모터 영역을 포함하는 헬리코박터 서열과 비-헬리코박터성 대상 분자를 코딩하는 비-헬리코박터 서열을 포함하는, 헬리코박터 기반의 구조체를 제조 및 이용하기 위한, 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 예에서, 상기 구조체는 벡터 또는 플라스미드 벡터로 기술되며, 프로모터 서열은 대상 분자를 코딩하는 비-헬리코박터 서열의 발현을 조절할 수 있다.
헬리코박터 구조:
일 측면에서, 본 발명은 헬리코박터 구조체, 구체적으로 헬리코박터 필로리 핵산 구조체를 포함하는 조성물을 제공한다. 펩타이드를 위벽(위 점막)에 전달하기 위해, 헬리코박터 필로리의 유레아제 유전자 내 및 유전자 사이에 DNA 서열을 삽입하여, 박테리아에서 코딩된 펩타이드를 발현시킬 수 있다.
일부 예에서, 헬리코박터 구조체의 헬리코박터 뉴클레오타이드 서열은 제1 헬리코박터 서열 Y1, 제2 헬리코박터 서열 Y2 및 비-헬리코박터성 대상 분자를 코딩하는 비-헬리코박터 서열 X를 포함한다. 이러한 구조체의 도식의 일 예는 식 1로 표현된다:
식 1:
Figure 112009035098288-PCT00001
비-헬리코박터성 대상 뉴클레오타이드 서열인 "X"는 대상 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 예들에서, 비-헬리코박터성 서열 X는 헬리코박터 필로리 종들과 이종이다. 이러한 대상 분자는, 동물에 도입되는 구조체를 포함하고 있는 재조합 헬리코박터로부터 발현된 산물로서, 전달받은 동물에게 유익하고 및/또는 치료적 효과를 제공할 수 있다.
일부 예들에서, 구조체는 천연 UreA 또는 UreB 유전자 서열의 첫번째 부분으로서 정의되는 제1 헬리코박터 서열 Y1, 천연 UreA 또는 UreB 유전자 서열의 두번째 부분으로서 정의되는 제2 헬리코박터 서열 Y2, 및 비-헬리코박터성 대상 뉴클레오타이드 서열 "X"를 포함한다.
일부 예들에서, 헬리코박터 구조체는 도 12에 나타낸 구조체를 포함한다.
다른 예로, 헬리코박터 구조체는 약독화된(attenuated) 헬리코박터 필로리 구조체로서 추가적으로 정의된다.
헬리코박터 필로리 핵산 구조체는, 일부 예들에서, 프로모터 서열, 분비 서열 및/또는 리포터 유전자 서열을 더 포함할 수 있다. 특정한 예에서, 헬리코박터 구조체로 형질전환된 재조합 세포가 제공된다. 일부 예들에서, 이들 재조합 세포는 재조합 E. coli 세포 또는 헬리코박터 필로리 세포이다.
일부 측면들에서, 헬리코박터 구조체를 포함하는 헬리코박터 기반의 벡터 및 벡터 플라스미드 구조체는 단백질, 펩타이드 또는 그외 모든 분자로 정의되는 약학적으로 활성인 대상 분자를 포함한다. 일부 예들에서, 분리된 핵산 분자는 cDNA, 게놈 DNA, RNA 또는 이들의 하이브리드 분자로서 더욱 설명될 수 있다. 구체적인 예로, 핵산은 cDNA이다.
예로, 대상 단백질 및/또는 펩타이드는 그렐린, 아밀린, 인슐린, 모틸린, β-글루코시다제, 화학 샤페론 또는 고셔병, 세포 소모증, 인간 면역결핍질환(AIDS), 식욕 억제의 치료 및/또는 관리에 유용한 그외 물질, 당뇨병 치료에 유용한 조제물 등을 포함할 수 있다.
재조합 세포:
다른 측면에서, 재조합 세포를 포함하는 조성물은 전술한 헬리코박터 구조체를 포함하는 플라스미드 벡터 및/또는 벡터로 형질전환된 세포를 포함한다. 일부 예들에서, 재조합 세포는 비-헬리코박터의 약학적으로 활성인 대상 분자를 코딩하는 서열을 포함한다. 다른 예에서, 비-헬리코박터의 약학적으로 활성인 대상 분자를 코딩하는 핵산 서열은 분비 신호 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 예들에서, 재조합 세포는 재조합 세포의 표면에 비-헬리코박터성 대상 분자에 해당하는 발현된 산물을 분비시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 대상 분자의 발현된 산물은 장 점막과 같은 동물의 점막 표면에 또는 이를 통과하여 전달될 수 있다. 일부 예들에서, 재조합 세포는 헬리코박터 균주 26695 또는 B128과 같은 재조합 헬리코박터 필로리 세포이다.
약학 조제물 :
본 발명은 예컨대 위에, 경구 또는 코내 전달과 같이, 환자에게 전달하기 위해 제형화된 다양한 약학적으로 허용가능한 조제물을 제공한다. 특정 예에서, 조성물은 점막 표면에 전달하는데 적합하다. 특정 예에서, 조성물은 점막 표면이나 라이닝(lining)에 전달하는데 적합하다. 일부 예들에서, 점막 표면은 위 점막 표면이다.
조성물의 다양한 전달 형태는 구체적인 헬리코박터, 헬리코박터 구조체 및 그외 본원에 기술된 전달 비히클의 구체적인 타입과 비율에 따라, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition, Mack Publishing Company에 기술된 바와 같이 당업자에게 공지된 제형화 기법으로, 본 발명의 실시에 이용하기 위해 용이하게 제조되며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다.
전달 시스템은 동물, 특히 인간, 말, 소, 양 및 설치류 등의 영장류, 조류 및 어류에 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 또한, 조제물은 아동 및 성인 모두에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 임신한 상태이거나 수유기 동물에 비경구로 사용하거나 투여할 수 있는 것으로 생각된다. 조제물 및 방법은 동물 수컷 및 암컷 둘다에 적합한 것으로 추가적으로 기술될 수 있다.
백신:
일부 예들에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 용액 중의 백신으로서 추가적으로 정의된다. 백신의 일부로서, 헥터 구조체를 포함하는 조성물은 발현된 산물, 즉 대상 분자 "X"가 동물의 점막 표면과 또는 점막 표면에 접촉할 수 있는 방식으로, 동물에 도입된다. 예로, 동물의 점막 표면은 위 점막, 코 점막 등을 포함할 수 있다.
일부 예들에서, 헬리코박터 기반의 백신은 본원에 기술된 플라스미드 벡터와 같은 헬리코박터 기반의 구조체로 형질전환된 세포를 포함한다. 예로, 헬리코박터 기반의 플라스미드 벡터로 형질전환된 세포는 E. coli 세포 또는 헬리코박터 필로리 세포를 포함할 수 있다. 일부 예들에서, 백신은 약독화된 생백신으로 더 명시될 수 있다. 특정 예에서, 조성물은 보강제를 포함할 것이다. 일부 예에서, 백신은 점전막 표면에 비-헬리코박터성 대상 분자의 전달을 제공할 수 있다.
백신 접종( vaccination )/면역화:
다른 측면에서, 동물에 백신 접종하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 상기 방법은 본원에 기술된 헬리코박터 기반의 벡터 및/또는 플라스미드 벡터로 형질전환된 세포를 포함하는 백신을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 상기 방법은 동물에서 생리적 및/또는 병리적 특정 상태 또는 질환을 소거 또는 저해하는데 충분하거나 또는 약학적으로 활성인 대상 분자에 특이적인 면역 반응을 도출하는데 충분한, 유효량의 약학적으로 활성인 대상 분자의 전달을 제공한다.
예로, 본 발명의 백신 조제물로 동물에 제공될 수 있는 비-헬리코박터성 대상 분자는 비-포유류성 단백질, 펩타이드, 효소, 호르몬 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 대상 분자는 약학적으로 활성인 인간 대상 분자인 약학적으로 활성인 대상 분자로서 추가적으로 명시된다. 일부 예들에서, 약학적으로 활성인 대상 분자는 인간 병원체 분자/항원, 인간 단백질 항원, 예컨대 아밀린이나 이의 유사체나 유도체, 그렐린이나 이의 유사체나 유도체이다.
특정 예에서, 본 발명의 백신은 인간 병원체, 에볼라 바이러스, HIV 바이러스, 마르부르크 바이러스, 인플루엔자 바이러스 등에 대한 질병 내성 강화 및/또는 면역성을 제공한다. 에볼라 당단백질 및 마르부르크 당단백질을 포함하는, 약독화된 재조합 소수포성 구내염 바이러스 벡터를 근간으로 한 복제 컴피턴트 백신은 Jones et al . (2005)43에 기술되어 있다. 그래서, 본원에 기술된 헬리코박터 기반의 벡터 시스템과 플라스미드 벡터 시스템의 구조체를 포함하는 백신 조제물은 인간 병원체와 조합되는 이들 당단백질 및 그외 당단백질과 함께, 본 발명에 따라 제공될 수 있다.
다른 측면에서, 동물을 면역화하는 방법을 제공한다. 일부 예들에서, 상기 방법은 본원에 기술된 헬리코박터 백신을 포함하는 조성물을 동물에 제공하는 단계 및 동물에서 허용가능한 면역 반응을 도출하는데 충분한 유효량의 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 예들에서, 허용가능한 면역 반응은 조성물의 1회분 이상의 유효 투여량을 포함하는 치료 요법의 투여시에 나타난다. 이러한 방법은 동물 면역화(veterinary immunization)와 인간 면역화에 사용할 수 있다.
아래 핵산 및 아미노산 서열은 본 발명의 명세서 전체에 언급되어 있다:
서열번호 1 - 플라스미드 pHP1의 뉴클레오타이드 서열(뉴클레오타이드 2796개) (+) 가닥.
서열번호 2 - 플라스미드 pHP1의 뉴클레오타이드 서열(뉴클레오타이드 2796 개) (-) 가닥.
서열번호 3 - 플라스미드 pHP3의 뉴클레오타이드 서열(뉴클레오타이드 3444 개).
서열번호 4 - C형 간염 바이러스 항원(HCV) 뉴클레오타이드 서열(뉴클레오타이드 580 개).
서열번호 5 - C형 간염 바이러스(HCV) 코어 항원 유래의 면역성 코딩 서열 뉴클레오타이드 서열 135 bp(아미노산 45 개)
서열번호 6 - 헬리코박터 필로리의 HopE 유전자(nt504, 아미노산 위치 168)의 표면 노출 루프의 뉴클레오타이드 서열(뉴클레오타이드 1108 개)
서열번호 7 - 상류 프라이머(뉴클레오타이드 29 개).
서열번호 8 - 하류 프라이머(뉴클레오타이드 28 개).
서열번호 9 - 올리고뉴클레오타이드 프라이머(뉴클레오타이드 15 개).
서열번호 10 - 헬리코박터 필로리 삽입 구조체의 뉴클레오타이드 서열, HopE 유전자 + 대상 뉴클레오타이드 서열, "X". (580 bp HopE - "X" bp - 502 bp HopE). 대상 뉴클레오타이드 서열, "X"는 생물학적으로 유용한 대상 분자 등의 대상 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 생물학적으로 유용한 대상 분자는 위 점막과 같은 점막 표면을 통해 또는 점막 표면에 발현된 산물로서 전달하는 것과 같이 동물에 유익한 효과나 치료 효과를 제공할 수 있는, 효소, 단백질, 펩타이드 또는 그외 분자를 포함할 수 있다. 일부 예들에서, "X"는 60개의 뉴클레오타이드 염기 내지 150개의 뉴클레오타이드 염기, 또는 69개의 뉴클레오타이드 염기 내지 138개의 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 핵산 서열이다.
서열번호 11 - HopE 및 p60의 융합 단백질에 대한 뉴클레오타이드 서열, HopE 서열에서 504번 핵산(아미노산 168번에 해당됨)에 p60 핵산 서열(아미노산 23개) 삽입.
서열번호 12 - HopE 및 HCCA의 융합 단백질에 대한 뉴클레오타이드 서열, HopE 서열에서 504번 핵산(아미노산 168번에 해당됨)에 HCCA 핵산 서열(아미노산 46개) 삽입.
서열번호 13 - p60에 대한 핵산 서열(69개의 뉴클레오타이드 염기).
서열번호 14 - HCCA에 대한 핵산 서열(138개의 뉴클레오타이드 염기).
발명의 상세한 설명
본 발명은 헬리코박터 또는 헬리코박터 기반의 벡터 전달 시스템을 포함하는 다양한 여러가지 타입의 박테리아 백신 구조체에 적용가능한 것으로 생각한다. 본 발명을 설명하기 전에 여러가지 용어에 대한 정의를 내리는 것이 좋다. 본 발명이 반드시 그러한 적용으로 한정될 필요는 없으며, 본 발명의 다양한 측면은 내용에 사용되는 다양한 예에 대한 검토를 통해 이해될 수 있다.
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명이 구체적으로 예시된 방법들로 한정되지 않으며, 물론 변경될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정 예를 설명하기 위한 목적일 뿐 한정되는 것으로 의도되지 않으며, 단지 첨부된 청구항으로만 한정되는 것으로 이해된다.
상기 또는 하기에 본원에 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 그러나, 본원에 언급된 공개문헌들은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있으며 공개문헌에 기재되어 있는 프로토콜, 시약 및 벡터를 설명 및 기술하기 위한 목적으로 인용된다. 본원은, 이전 발명이 상기한 내용을 선행하는 것으로 용인하는 것으로 해석되어서는 안된다.
또한, 언급되어 있지 않은 한, 본 발명의 실시에는 당업계의 능력내에서 기존의 면역 및 분자 생물 기법 및 약학을 사용한다. 이러한 기법들은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 문헌들에 잘 설명되어 있다. 예로, Coligan et al ., ( Current Protocols in Protein Science (1999) Volume I and II (John Wiley & Sons Inc.); Sambrook et al ., ( Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2nd & 3rd Editions. Cold Spring Harbor Laboratory press (1989) (2001); 및 Bailey, S F. and Ollis, D.F., Biochemical Engineering , Fundamentals . McGraw-Hill Book Company, NY, 1986을 참조한다. 본 명세서와 첨부된 청구항에서, 단수형 "하나(a)", "하나(an)" 및 "그것(the)"은 문맥상 명확하게 나타난 경우를 제외하고는, 복수의 언급도 포함한다. 따라서, 예컨대, "핵산"은 그러한 핵산의 복수를 포함하며, "분리된 펩타이드"는 하나 이상의 펩타이드이다.
언급되어 있지 않은 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 또는 동급의 모든 물질 및 방법들을 이용하여 본 발명을 실시할 수 있으며, 바람직한 물질 및 방법은 이하 설명한다.
동물 체내 특정 타겟 부위에 치료 조성물 및 핵산의 전달은 약물 개발 산업에서 당면한 진행중인 과제이다. 본 발명자는 생물학적 활성 물질을 코딩하는 벡터를 수송할 수 있는 헬리코박터 기반의 박테리아 전달 시스템을 개발하였으며, 상기한 물질은 박테리아 표면 상에 발현되거나 또는 박테리아로부터 분비된다. 일 예에서, 박테리아는 헬리코박터 종인 헬리코박터 필로리이다. 일부 예에서, 헬리코박터 필로리 균주는 당업계에 공지되어 있는 모든 균주일 수 있다. 일부 예에서, 헬리코박터 필로리 균주는 게놈 균주 26695와 같은 비-병원성 균주이다. 사용할 수 있는 다른 균주는 헬리코박터 필로리 균주 B128, 특히 변이체 7.13이다.
다른 예에서, 헬리코박터 필로리코박테리아 이외의 박테리아가 이용되며, 박테리아는 위 점막이나 위장관, 뇨관, 기관 상피 또는 그외 점막 표면 등의 그외 영역에서 장기간 집락 증식하는 능력 등의, 헬리코박터 또는 헬리코박터 필로리 특성들을 가지도록, 유전자 변이된 것이며, 숙주에 대한 유의한 독성은 없다.
일 예에서, 헬리코박터 필로리는 조작되어, 병리 특성들 중 일부가 제거 및/또는 약독화된 것이다. 예컨대, 헬리코박터 필로리가 저병원성이도록 소포형성 세포독소(vacuolating cytotoxin) 및 cag 병원성 섬 유전자를 제거할 수 있다. 약독성 돌연변이는, 비-특이적인 돌연변이형성을 화학적으로 이용하거나, N-메틸-N-니트로-N-니트로소쿠아니딘을 이용하거나, 또는 재조합 DNA 기법을 이용하여, 헬리코박터에 도입할 수 있다.
당업자는 본 발명의 방법을 이용하여 생리 활성 물질을 전달할 수 있음을 숙지할 것이다. 적합한 물질의 예로는, 국소 또는 전신적으로 작용할 수 있는 물질, 예컨대 국소 또는 신체 전체 대사에 작용하는 엔도크린 활성을 발휘할 수 있는 물질 및/또는 면역/조혈 시스템에 속하는 세포의 활성을 조절할 수 있는 물질, 및/또는 신체에서 다양한 정상 또는 종양성 세포의 생존성, 생장 및 분화에 작용할 수 있거나 상처 및 감염에 대해 급성 염증 반응의 면역 조절 또는 유도에 작용할 수 있는 물질, 타겟 세포 수용체에 작용하는 케모카인에 의해 매개되는 세포 및 조직의 감염의 내성을 강화 또는 유도할 수 있거나 또는 상피 세포의 증식이나 상처 치유 촉매를 강화 또는 유도할 수 있는 물질, 및/또는 신체에서 세포에 의한 물질의 발현 또는 생성을 조정하는 물질을 포함한다.
그러한 생물 활성 물질의 구체적인 예로는, 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 칼시토닌, 황체형성 호르몬, 부갑상선 호르몬 소마토스타틴, 갑상선 자극 호르몬, 혈관성 장 폴리펩타이드, 역평행의 4 α 나선 번들 구조를 취하는 구조 그룹 1 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, CM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-감마, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL 또는 IFN α/β, 대개 세포 표면에 조합되어 있으며 특정 바이러스 막 단백질에서 나타나는 β-젤리 롤 구조를 취하는 대칭성 동형삼량체 및 서브유닛을 형성하는, 구조 그룹 2 사이토카인, 예컨대 사이토카인의 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리, 예컨대 TNF α, TNF β, CD40, CD27 또는 FAS 리간드, 사이토카인의 IL-1 패밀리, 섬유모세포 성장 인자 패밀리, 혈소판 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 β 및 신경 성장 인자, 세포외 영역에서 하나 이상의 EGF 도메인을 각각 포함하는 큰 트랜스멤브레인 전구체 분자로서 생산되는 단쇄 α/β 분자를 포함하는 구조 그룹 3 사이토카인, 예컨대 사이토카인의 상피 성장 인자 패밀리, 보존된 시스테인 잔기 주변에 그룹화된 아미노산 서열이 있는 것이 특징적인 케모카인(C--C 또는 C--X--C 케모카인 서브그룹) 또는 인슐린 관련 사이토카인, 여러가지 도메인, 예컨대 EGF, 면역글로불린 유사 및 크링글 도메인으로 구성된 헤레굴린(heregulin) 또는 뉴레굴린(neuregulin) 등의 모자이크 구조를 보이는 구조 그룹 4 사이토카인을 포함한다.
또는, 생물 활성 물질은 상기에서 정의된 생물 활성 물질에 대한 수용체 또는 작용제일 수 있다.
일부 예들에서, 헬리코박터 필로리 기반의 벡터 및/또는 벡터 플라스미드 구조체를 이용하여, 형질전환된 세포 조제물이 투여되는 숙주의 점막에서 비-헬리코박터의 약학적으로 활성인 대상 분자의 발현 및 분비를 허용하는, 형질전환 세포(예, E. coli 세포 또는 헬리코박터 세포)를 만든다. 형질전환된 세포(또는 벡터)내에 포함된 분리된 핵산 분자는, 약학적으로 활성인 대상 분자를 코딩하는 핵산이 헬리코박터 필로리 조절 서열의 조절 하에 있는, 하나 이상의 핵산 구조체를 포함할 수 있다.
적합한 벡터 및 셔틀 벡터 서열은, 적절하게 프로모터 서열, 종결자 단편, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 그외 서열 등의 적합한 조절 서열을 포함하도록 선택 또는 구축될 수 있다. 벡터는 적절하게는 플라스미드, 바이러스, 예컨대 파지 또는 파지미드일 수 있다. 더욱 상세하게는, 예컨대 전술한 Sambrook et al .을 참조한다. 예컨대 핵산 구조체, 돌연변이 유발, 서열분석, 세포에 DNA 도입 및 유전자 발현 및 단백질 분석에서의 핵산 조작에 대해서는 Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al . eds., John Wiley & Sons, 1992에 상세하게 기술된 바와 같이 많은 기법들과 프로토콜들이 알려져 있다. 전술한 Sambrook et al 및 Ausubel et al .은 원용에 의해 본 명세서에 명백하게 포함된다.
일부 예들에서, 약학적으로 활성인 대사 물질의 코딩 서열(들)은 오페론, 즉 다중-시스트론 발현을 위한 핵산 구조체에 포함된다. 오페론에서, 프로모터에서의 전사를 통해 각각에 상류에 리보좀 결합부가 적합하게 위치되어 있는 2개 이상의 코딩 서열을 포함하는 mRNA가 만들어진다. 따라서, 2 이상의 물질(약학적으로 활성인 대상 분자)을 하나의 mRNA로부터 번역시킬 수 있다. 오페론의 사용으로 약학적으로 활성인 대상 분자의 발현을 동조(coordination)되게 할 수 있다.
약학적으로 활성인 대상 분자에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조체 또는 벡터는 헬리코박터 필로리에서의 발현을 위한 프로모터의 통제 하에 있는 것이 바람직하다.
일 예에서, 본 발명에 따라 사용되는 프로모터는 헬리코박터 필로리에서 구성적으로(constitutively) 발현된다. 구성적 프로모터의 사용은 발현을 발생시키기 위한 유발자나 그외 조절 신호를 보충하지 할 필요가 없게 한다. 바람직하게는, 프로모터는, 헬리코박터 필로리 숙주 세포가 살아있는 상태로 유지하는, 즉 생장은 저해될 수 있더라도 일부 대상 활성을 보유하고 있는 수준에서 발현을 지시한다. 유익하게는, 이러한 발현은 낮은 수준일 수 있다. 예를 들어, 발현 산물이 세포내에 축적되는 경우, 발현 수준은 발현 산물을 세포성 단백질의 약 10% 이하로, 바람직하기로는 약 5% 이하 예컨대 약 1-3%로 축적시킬 수 있다.
일부 예들에서, 대상 분자를 코딩하는 핵산 서열에 해당되는, mRNA 서열과 같은 메신저 핵산 서열을 동물에 전달하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 예로, 동물에서 상기 메신저 핵산 서열의 발현시 동물에 펩타이드, 단백질 또는 호르몬을 제공하기 위해, 치료 펩타이드, 단백질, 호르몬 또는 프로-호르몬에 해당되는 이러한 메신저 핵산 서열(mRNA)을 제조할 수 있다. 예로, 상기 호르몬은 인슐린일 수 있으며, 상기 프로-호르몬은 프로-인슐린일 수 있다. 따라서, 본 발명은 당뇨병 치료와 같은 인간 질환을 치료하기 위한 유전자 요법으로서 적용할 수 있는 것으로 생각된다.
프로모터는 사용하는 헬리코박터 필로리 균주에 동종이며, 즉 본래 헬리코박터 필로리 균주에서 발견되는 프로모터일 수 있다. 일부 예에서, 프로모터는 아라비노스 저해성 프로모터이다. 그외 프로모터로는 FlaB sigma 54 프로모터(Josenhans et at ., 1998, FEMS Microbiol Lett , 161(2): 263-73), T7 프로모터 및 살모넬라의 nir B 프로모터(Chatfield et al ., 1992, Biotechnology , 10(8): 888-92)가 있다.
다른 예에서, 프로모터는 유도성이다. 임상 등급의 벡터와 함께 사용할 수 있는 유도성 프로모터로는, 쿨렌 등의 미국 특허 6,242,194에 기술된 유도성 프로모터, E. coli 플라스미드(예, pBluescript™, Stratagene)에 사용되는 락토스 저해성 프로모터 또는 락토바실러스에서의 내인성 락토스 프로모터, 및 Aristarkhov et at ., (1999) J. Bacteriology , 178(14), 4327-4332에 기재된 바와 같이, 알코올 디하이드로게나제(adhE)에 대하 프로모터와 같은 혐기성 생장 동안에 유도되는 프로모터를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
일 예에서, 본 발명의 구조체는 또한 독성 유전자를 포함한다. 이러한 독성 유전자는 바람직하기로는 유도성 프로모터의 통제하에 있어, 치료 완료시, 헬리코박터는 독성 유전자의 발현을 유도함으로써 쉽게 제거할 수 있다. 독성 유전자의 비제한적인 예는, 유도성 프로모터의 통제 하에 있는 박테리아 오토라이신(autolysin)이다. 오토라이신 유전자는 위장관에서 바로 위에 기술한 하나 이상의 유도성 프로모터를 사용함으로써 위장관에서 적정 시기 및 위치에서 촉발될 수 있다.
일부 예에서, 조작된 헬리코박터 벡터 및 플라스미드 벡터 구조체는 산소에 민감하다. 이러한 산소 민감성은 본 발명의 임상 등급 벡터의 보급을 제한하는 다른 방법이다. 인간의 장내 환경은 산소가 매우 적어, 혐기성 및 미호기성(microaerophilic)인 헬리코박터를 포함한 미생물의 생장에 적합하다. 따라서, 헬리코박터를 제거하는 효과적인 방법은, 장의 폐기물이 산소가 풍부한 외부 환경으로 배출될때 인체에서 나가므로, 산소 민감성을 부여하는 유전자를 형질전환된 미생물에 조작하는 방법이다.
본 발명의 핵산 구조체 또는 구조체들은 또한 분비 신호 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 예들에서, 약학적으로 활성인 대상 분자를 코딩하는 핵산(예,비-헬리코박터성 폴리펩타이드)은 분비 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열을 분자(폴리펩타이드)를 코딩하는 핵산 서열과 적절하게 커플링함으로써 세포 막에 분자 분비를 제공할 수 있다. 폴리펩타이드의 분비를 위한 핵산을 보유하는 헬리코박터의 능력은 헬리코박터의 생활성을 유지시키는 배양 조건에서 시험관내 평가할 수 있다.
적합한 분비 신호 서열은 에셰리키아, 클렙시엘라 및 살모넬라와 같은 그람 음성 유기체에서 활성을 가지는 임의의 것을 포함한다. 분비 신호 서열은 일부 스타필로코커스 균주에서 분비된 스타필로키나제 효소의 분비 리더를 포함할 수 있으며, 이는 그람 양성 및 그람 음성 숙주에서 기능하는 것으로 알려져 있다("Gene Expression Using Bacillus ", Rapoport (1990) Curr Opin Biotech 1:21-27).
그외 사용할 수 있는 분비 신호 서열로는, 예컨대 β-락타마제 유전자(Talmadge et al ., 1980, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:3369-3373) 또는 장침투성(enteroinvasive) E. coli 헤몰라이신(hemolysin) A(hlyA)(Su et al ., 1992, Microbial Pathogen, 13:465-476)가 있다. 분비 신호 서열의 예는, Pugsley, 1988, Protein secretion across the outer membrane of gram-negative bacteria. In: Protein Transfer and organelle Biogenesis, R. C. Dand and P. W. Robbins (eds), Academic Press, Inc., San Diego, pp 607-652에 나열되어 있다.
선별 마커는 혼성 집단에서 형질전환되지 않은 미생물로부터 형질전환된 미생물을 구별하는 일반적인 수단을 연구자 및 기술자들에게 제공한다. 형질전환된 유기체를 동정하는 방법은 대상 유전자를 포함하는 플라스미드에 선별 마커 핵산 서열을 병합하는 것이다. 선별 마커 서열은 일반적으로 대상 유전자의 하위에 삽입하며, 동일한 프로모터로부터 조졸된다. 그 결과, 대상 유전자가 성공적으로 형질전환된 세포는 또한 선별 마커 핵산 서열로 형질전환될 수 있을 것이다. 항생제 내성을 선별 마커로 사용하였을때, 형질전환된 세포만 항생제가 함유된 배지에서 생존 및/또는 증식할 것이다.
따라서, 항생제 내성은 형질전환체 개발시 편리하게 많이 사용되고 있는 표현형이다. 그러나, 항생제 내성 유전자를 선별 마커로서 가지는 벡터는 다른 유기체에게 항생제 내성 표현형을 부여할 수 있는 수평적인 유전자 전이가 가능하다. 이러한 위험은 헬리코박터를 치료 벡터의 일부로서 사용할 때 특히 심각하다.
동물에 대한 유전자 전달 시스템으로서 헬리코박터를 사용하기 위하여, 본 발명은, 일부 예에서, 항생제 선별 마커를 이용하지 않는 임상 등급의 벡터 시스템을 사용한다. 본 발명의 전달 시스템에 의해 제시되는 항생제 내성 유전자 이용의 다른 방법 중 하나는, "하우스-키핑" 유전자에 염색체 결손 또는 치사성 돌연변이가 있는 임상 등급의 벡터를 포함한다. 이후, 기능적으로 유사한 하우스-키핑 유전자를 약학적으로 활성인 대상 분자를 코딩하는 플라스미드에 삽입한다. 그 결과, 하우스-키핑 유전자는 형질전환체의 신속한 분리 및 동정이 가능한 선별 마커가 된다.
"하우스-키핑" 유전자의 예로는, 다수의 대사 조절자 및/또는 효소를 코딩하는 유전자가 있으며, 그 예로는 키나제, 프로테아제, 신테타제, 디하이드로게나제 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 제공되는 항생제 내성 유전자에 대한 다른 방안은 약학적으로 활성인 대상 분자를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드에 리포터 유전자가 병합되어 있는 임상 등급의 벡터이다. 본 발명에 따라 사용되는 리포터 유전자의 비제한적인 예로는 푸른 형광 단백질(green fluorescent Protein (GFP)), β-갈락토시다제 및 아밀라제가 있다.
일 예에서, 약학적으로 활성인 대상 분자는 사이토카인 활성을 가진다. 사이토카인은 The Cytokine Facts Rook , Callard and Gearing (1994), Academic Press에 논의되어 있다. 사이토카인 활성을 가지는 바람직한 폴리펩타이드 등의 바람직한 분자는 인터루킨-2(IL-2) 및 인터루킨-6(IL-6)을 포함하는 인터루킨류이다.
일부 예에서, 헬리코박터 벡터 또는 플라스미드 벡터 시스템은 형질전환된 세포를 제공하기 위하여, 헬리코박터 또는 그외 적합한 숙주 세포로 도입되는 전술한 핵산 구조체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 개시된 핵산을 비-병원성 헬리코박터에 도입하는 단계를 포함하는 방법을 추가적으로 제공한다. 헬리코박터와 같은 숙주 세포의 배양물의 형질전환에는 모든 이용가능한 기술을 적용할 수 있다. 헬리코박터 필로리 세포의 경우, 적합한 기법으로는 칼슘 클로라이드 형질전환, 전기충격 및 박테리오파지를 이용한 형질감염이 있을 수 있다.
플라스미드 벡터를 헬리코박터 세포로 도입한 다음, 예컨대 유전자 발현에 적합한 조건하에서 헬리코박터 필로리를 배양함으로써 핵산으로부터의 발현을 유발 또는 허용할 수 있다. 약학적으로 활성인 대상 분자 발현 조건하에서 헬리코박터를 배양함으로써, 헬리코박터가 코딩 핵산을 포함하며 코딩된 물질을 생산할 수 있음을 검증할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 치료 또는 예방학적 투여량의 생리 활성 물질을 생체내에서 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 비-병원성 헬리코박터 필로리 조성물 및 백신을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 방법 및 비-침투성 또는 비-병원성 헬리코박터의 사용은, 당업자가 예컨대 개체의 면역 반응을 조작할 수 있는 광범위한 치료 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 일측면은 본원에 개시된 바와 같이 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직의 생존, 증식, 분화, 작용자 기능 또는 감염 감수성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 본원에 개시된 바와 같이, 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포 또는 점막 표면 또는 인접하거나 떨어져 있는 조직에서 집락을 이루는 감염에 대한 면역 반응을 부스팅(boosting)하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은, 본원에 개시된 바와 같이 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 병원성 감염 물질에 대한 (항체 대 세포 매개성) 면역 반응 타입을 조정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 개시된 바와 같이 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증 또는 종양 세포의 정상 조직으로의 침윤을 조정하는 방법을 제공한다.
일부 측면은, 본원에 개시된 바와 같이 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 증식율, 침투율 또는 생존율을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은, 본원에 개시된 바와 같이 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양세포에 세포자살을 유도하는 방법을 제공한다.
다른 측면은, 본원에 개시된 바와 같이 약학적으로 활성인 대상 분자를 발현하는 비침투성 또는 비-병원성 박테리아을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응을 하향 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 약학적으로 활성인 대상 분자를 발현하는 비침투성 또는 비-병원성 헬리코박터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 알레르기성 자가면역 또는 그외 면역 조절 부전 질환 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 영장류, 말, 소, 돼지, 양, 설치류, 조류 또는 어류일 수 있다. 일 예에서, 상기 개체는 인간이다. 투여는 통상적으로 코 또는 경구일 수 있다.
치료에 있어서, 즉 약학적으로 활성인 대상 분자가 개체에 이로운 효과를 제공하는 생물 활성 물질인 경우, 물질의 양 및/또는 치료 요법은 바람직하기로는 "치료학적 유효량"으로 제공될 것이며, 이는 개체에서 이로운 효과를 나타내는데 충분한 함량이다. 이러한 이로운 효과는 한가지 이상의 증상의 심각도 또는 발생율을 적어도 일정 이상으로 완화 또는 감소일 수 있다. 예방에서, 양은 나중에 병원체 접종한 개체에서 예컨대 면역 반응 증강에 의해 유해한 효과를 감소시키는데 충분할 수 있다. 투여되는 실제량과 투여 속도 및 시간은 투여 목적, 예컨대 접종(challenge)의 성질 및 심각도 측면에서 얻고자하는 생리학적 효과에 의존적일 것이며, 일반적인 최적화의 과제이다. 예방적 백신 접종을 포함하여 치료 처방, 예컨대 투여량 결정은 일반적인 실무자 및 그외 의사의 책무에 속한다.
헬리코박터를 포함하는 조성물은 본 발명에 따라 단독으로 또는 그외 치료제와 병용하여, 동시에 또는 순차 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 개시된 바와 같이 헬리코박터를 포함하는 약리학적 조성물을 제공한다. 이러한 약리학적 조성물은 일 예로 바람직하기로는 점막에 적용하기 매우 적합하다.
본 발명에 따른 및 본 발명에 따라 이용하기 위한 약리학적 조성물은, 헬리코박터 뿐만 아니라, 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업계에 공지된 그외 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 무독성이어야 하며, 약학적으로 활성인 대상 분자의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 그외 물질의 성질은 투여 경로에 의존적일 수 있다. 경구 투여에 있어서는, 적합한 pH, 등장성(isotonicity) 및 안정성을 가지며, 피로겐(pyrogen)이 없는 비경구 허용가능한 수용액을 사용할 수 있다. 본 기술분야의 당업자들은 적합한 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충액, 항산화제 및/또는 그외 첨가제를 필요에 따라 포함할 수 있다. 논의한 바와 같이, 본 발명에 따라 투여하기 위한 헬리코박터를 포함하는 약리학적 조성물은 하나 이상의 영양 물질, 예컨대 글루코스와 같은 에너지원, 아미노산 등을 포함할 수 있다.
다른 측면으로, 본 발명은 개체에게 투여하기에 적합한 적정 담체 매질을 이용하여, 기재된 바와 같이 헬리코박터를 제형화하는 단계를 포함하는, 약학적 제형의 제조 방법을 제공한다. 일 예로, 상기 약제는 개체의 점막에 적용하기에 적합하다.
다른 예로, 본 발명은 약리학적인 이용을 위한, 예컨대 예방("백신접종")을 포함하여 수술 또는 치료로 인간 또는 동물 신체를 치료하는 방법에 이용하기 위하여, 이종의 약학적으로 활성인 대상 분자를 발현하는 비-병원성 헬리코박터를 제공한다.
일 예로, 상기 방법은 암과 같은 질환을 치료, 예방 또는 완화시키기 위해 사용할 수 있다. 또한, 상기 방법 및 전달 시스템을 사용하여, 면역/조혈계 질환 또는 증상, 생식계 질환 또는 증상, 근골격계 질환 또는 증상, 심혈관계 질환 또는 증상, 혼합성 태아로 나타나는 질환 또는 증상, 배설기계 질환 또는 증상, 신경/감각기계 질환 또는 증상, 내분비계 질환 또는 증상, 호흡기계 질환 또는 증상, 소화기계 질환 또는 증상, 및 결합/상피 조직 관련 질환 또는 증상이나, 박테리아, 바이러스 또는 기생충 감염으로 인한 질환 또는 증상을 치료 또는 예방할 수 있다.
다른 예로, 본원에 기재된 헬리코박터 전달 시스템은 본원에 기재된 다수의 증상 또는 질환을 치료할 수 있는 산물을 코딩하는, 다수의 여러가지 핵산 분자를 동시에 또는 순차 전달할 수 있다. 또한, 바람직한 전달 시스템은 식욕 억제 또는 증가와 같이 부가적인 바람직한 생리 효과를 형성할 수 있는 조성물을 전달한다.
헬리코박터 필로리의 자살 시스템의 예는 Panthel et al . 2003 (Infection & Immunity, 71: 109-116)에 기재되어 있다. 이 시스템은 플라스미드를 PhiXl74 라이시스 유전자 E를 포함하는 헬리코박터 필로리에 도입시킨다. 균주를 박멸하기 위해, 42℃에서 5시간 동안 인큐베이션한다. 생체내에서, 이는 동물이 음료를 45-50℃에서 섭취하여, 위 환경의 온도를 42 ℃ 이상으로 상승시키는 것을 의미한다.
두번째 예는 L- Dap 선별 시스템으로, 통상적으로 이를 사용하여 보충된 플레이트에서의 박테리아 돌연변이의 생존을 가능하게 한다(예, Kirata et al . 1997 (Infection & Immunity, 65: 4158-4164). 이러한 시스템에서, DapE 결손 헬리코박터 필로리 돌연변이의 생존을 위하여, 부족한 기질, 즉 디아미노-피멜릭산(diamino-pimelic-acid (DAP))이 보강된 식이를 동물에게 제공하여야 한다. 이를 제거하기 위해서는, 이후, DAP 소비를 중지시키면 된다.
세번째 가능한 시스템은 그것의 rdxA 유전자로 인한 헬리코박터 필로리의 메트로니다졸 민감성에 관한 것이다. rdxA 유전자의 과도한 복제는 포유류 세포와 E. coli에 해롭다. 그러나, 복제는 박테리아에게는 허용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 헬리코박터 종들을 조작하여, 정상적인 돌연변이 의존적인 rdxA 소실을 방지하는 2 카피의 rdxA를 함유하게 할 수 있다. 2 이상의 기능적인 rdxA 유전자를 헬리코박터 게놈에 도입하면, 헬리코박터 균주는 메트로니다졸에 영구적으로 민감하게 된다. Jeong et al . 2000(J. Bacteriol., 182: 5082-5090)는 기능적 rdxA 유전자에 의해 생산된 니트로리덕타제가 프로드럭으로부터 메트로니다졸을 살박테리아 화합물로 변환시킨다는 것을 입증하였다. 이 활성 화합물의 작용 모드는 헬리코박터 게놈의 DNA 파괴를 유발하는 것이다.
명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 다른 의미를 가지는 경우를 제외하고는, 용어 "포함한다(comprise)" 또는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형 형태는 언급한 완전체 또는 완전체의 그룹의 포함을 내포하며, 임의의 그외 완전체 또는 완전체의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
정의:
본 발명을 기술하기 전에, 이하에서 사용되는 특정 용어에 대한 정의를 설명하여 이해를 도울 수 있다.
본 발명의 설명에서 사용된 "하나(a)" 및 "그(the)"는 하나(단수) 및 2 이상(복수)를 포함하는 의미이다.
표현 "유효 수준"은 약학적으로 활성인 대상 분자의 바람직한 활성 수준을 의미하며, 분자의 수를 반드시 한정하는 것은 아니다. 예컨대, 아밀린(예, 약학적으로 활성인 대상 분자)의 유효 수준은 아밀린 길항제를 이용하여 감소시켜 그렐린 분비를 자극할 수 있으며, 환자에 존재하는 유리 아밀린의 함량은 필수적으로 동반하여 감소되지 않는다.
본원에서 "항생제 내성 유전자"는 벡터에 제공되며 선별 시스템으로서 사용된 이종의 핵산 서열을 포함한다. 용어 "항생제 내성 유전자"는 자연적으로 형성되는 미생물총 유기체(micro-flora organism)에 항생제 내성을 부여하는 그외 기전 또는 유전자를 포함하지 않는다.
예컨대 본원에서 박테리아 균주, 특히 E. coli 또는 헬리코박터 필로리와 같은 헬리코박터 균주에 대해 사용되는 용어 "약독화된"은, 병독성 및 독성(침투성)이 낮은 천연, 야생형 타입의 박테리아 균주로서 정의된다.
용어 "생물학적으로 활성인"은 생물학적 기능을 수행할 수 있는 능력을 의미하며, 폴리펩타이드에 대해서는 폴리펩타이드가 그것의 본래 구조와 동일하거나 매우 유사한 안정적인 구조("folded form")를 취하는 것을 포함한다. 예컨대, 적절한 폴딩 유닛, α-나선, β-시트, 도메인, 이황화 결합 등을 구비하여 폴딩이 정확하게 또는 실질적으로 정확하게 이루어졌을 때, 폴리펩타이드는 본래 기능을 수행할 수 있는 능력을 가져야 한다. 일반적으로, 폴리펩타이드에서 기능 유닛은 도메인이다.
"임상 등급의 벡터"는 본원에서 헬리코박터 또는 헬리코박터의 특징을 가지도록 조작된 비-병원성 박테리아에서 발현될 수 있는 플라스미드 또는 그외 발현 벡터를 의미한다. 본 발명의 임상 등급의 벡터는 선별용 항생제 내성 마커를 사용하지 않으며/않거나, 자살 벡터와 같이 숙주 이외에서의 복제를 방지하도록 변형된 것이다.
"검출가능한 면역 반응"은 본원에서 일반적인 실험 방법을 이용하여 측정할 수 있는 항원에 대한 반응으로 동물에서 형성되는 항체(체액성) 또는 세포독성(세로성) 반응 중 어느 하나이며, 상기 실험 방법은 비제한적으로 ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay), RIA(radio-immune assay), ELISPOT(Enzyme-linked ImmunoSPOT), IFA(immunofluorescent assay), CF(complement fixation assay), 웨스턴 블롯(WB) 또는 이의 동급 방법을 포함한다.
"대상 유전자"는 본원에서 발현되길 바라는 폴리펩타이드 또는 단백질 등의 약학적으로 활성인 대상 분자를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 핵산 서열은 프로모터 또는 그외 조절 성분을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 또한, 벡터 및 플라스미드 벡터는 안티센스 RNA를 생산할 수 있는 구조체를 포함한다.
"유전자 요법"은 본원에서 재조합 벡터를 이용하여 대상 유전자를 이를 필요로 하는 동물에 전달하는 것으로서 정의된다. 대상 유전자는 치료 또는 예방적 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 트랜스유전자일 수 있으며, 비제한적으로는, 사이토카인, 항-염증제, 항-증식제, 항생제, 대사 저해제/활성화제 및 면역 활성 물질 및 그것의 단편을 포함한다. 나아가, 본원에서 "유전자 요법"은 또한 선천 및 후천적인 질환 모두에 대한 유전자 치환 기술을 포함한다.
용어 "헬리코박터"는 헬리코박터 필로리 및 헬리코박터 무스텔라(H. mustelae)를 포함한 헬리코박터 속의 모든 박테리아을 포함한다. 또한, 상기 용어는 영장류의 위 점막에 기주할 수 있으며/있거나 만성적으로 있을 수 있으며, 점막 감염에서 분리된다는 점에서 헬리코박터 필로리와 유사한 생태를 가지는 박테리아을 포함한다. 또한, 상기 용어는 박테리아이 위 점막에 거주할 수 있는 것과 같은 헬리코박터 필로리의 특성을 가지도록 변형된 박테리아를 내포한다.
"이종" 폴리펩타이드는 천연적인지 않은 펩타이드나 또는 헬리코박터에 존재하는 천연 형태에서 변형된 펩타이드, 즉 본래 헬리코박터에서는 발현되지 않거나 또는 헬리코박터에 도입하기 전에 또는 이의 시조(ancestor)에서는 발현되지 않는, 펩타이드이다.
"숙주"는 본원에서 본 발명의 치료 조성물에 대한 정해진 수여체를 의미한다. 숙주는 모든 동물을 포함한다. 특히, 숙주는 비제한적으로, 영장류(인간 포함), 소, 말, 개, 고양이, 돼지, 소, 토끼, 설치류, 조류 및 어류를 포함한다.
"면역학적으로 무활성"은 본원에서 그것의 숙주에서는 유의한 면역 반응을 일으키지 않는 미생물총과 같은 미생물을 포함한, 임의의 물질을 의미한다. 본원에서 면역학적으로 무활성인 물질의 예로는 스테인레스 스틸, 생체친화성 폴리머, 예컨대 폴리-L-락티드, 의료 등급의 플라스틱 및 본 발명의 미생물총의 유기체를 포함한다.
"삽입 구조체"는 본원에서 HopB 유전자를 코딩하는 핵산 서열의 일부분과 같은 헬리코박터 필로리 핵산 서열의 일부분, 및 대상 분자를 코딩하는 비-헬리코박터성 핵산 서열을 포함하는, 핵산 구조체를 의미한다.
"분리된 핵산"은 천연적으로 형성되는 핵산 또는 4개 이상의 분리된 유전자가 연결된(spanning) 천연적으로 발생되는 게놈 핵산의 임의 단편과 동일하지 않은 핵산 서열이다. 따라서, 상기 용어는, 예컨대 (a) 천연적으로 형성되는 유기체의 게놈에서 분자의 부분에 측면으로 있는 코딩 서열의 양측에 있는 않은, 천연적으로 형성되는 게놈 DNA 분자의 일부 서열을 가지는 DNA 분자; (b) 제조되는 분자가 임의의 천연적으로 발생되는 벡터 또는 게놈 DNA과 동일하지 않도록 하는 방식으로 원핵 또는 진핵의 게놈 DNA나 또는 벡터에 병합된 핵산; (c) cDNA, 게놈 단편, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 형성된 단편, 또는 제한 단편과 같은 분리된 분자; 및 (d) 하이브리드 유전자, 즉 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 일부인 재조합 뉴클레오티드 서열을 포괄한다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산의 "상동성%(상동)"은 Karlin and Altschul(Proc. Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5877, 1993)과 같이 변형된, Karlin 및 Altschul, 1990, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87:2264-2268, 1990의 알고리즘을 이용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 Altschul et al . (J. Mol . Biol. 215:403-410, 1990)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 병합되어 있다. BLSAT 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 워드 길이=12로 수행하여, 본 발명의 핵산 분자와 상동한 뉴클레오티드 서열을 구한다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 워드 길이=3으로 수행하여, 참조 폴리펩타이드(예, 서열번호 2)와 상동한 아미노산 서열을 구한다. 비교하기 위한 목적으로 갭이 채워진 정렬(gapped alignment)을 얻기 위해, Altschul et al .(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)에 개시된 바와 같이 Gapped BLAST를 이용한다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 해당 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용된다.
본 발명의 설명에 사용되는 "약학적으로 활성인 분자는 세포 배양물과 같은 세포에서 또는 화학적이나 생화학적 반응 매질이나 분석, 또는 동물에서 약학적으로 검출가능한 활성이나 반응을 도출할 수 있는, 펩타이드, 단백질, 핵산 또는 그외 유기나 무기 물질 등의 분자로 정의된다. 본 발명의 약학적으로 활성인 대상 분자는 예컨대 본원에 기술된 생물학적 활성인 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 설명에 사용되는 "대상 분자"는 세포나 동물에 제공되었을 때 질병 치료와 같이 병태, 결손 또는 그외 적절하다고 판단되는 증상을 보정 및/또는 치료할 수 있는, 단백질, 펩타이드, 효소 또는 그외 분자를 제공하는, 단백질, 펩타이드, 효소 또는 그외 분자로 정의된다.
"리포터 유전자"는 대상 분자를 발현하는 형질전환된 벡터에 식별가능한 표현형을 제공하는, 약학적으로 활성인 대상 분자를 코딩하는 이종 핵산 서열에 (또는 인접하게) 병합된 핵산 서열이다. 리포터 유전자의 비제한적인 예로는 GFP, β-갈락토시다제, 아밀라제 및 CAT가 있다.
"스크리닝 마커"는 본원에서 본 발명에 기재된 바에 따라 제조한 형질전환된 벡터에 제공된, 동정 특징(표면형)을 의미한다. 본 발명의 일예에서, 상기 스크리닝 마커는 리포터 유전자이다.
"선별 마커", "선별 유전자", "리포터 유전자" 및 "리포터 마커"(이하 "선별 마커"라 함)은 본원에서 형질전환된 박테리아성 벡터의 신속한 동정과 분리를 허용하는 표현형 특성을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 일반적으로, 본 발명에 기재된 바에 따라 제조되며 "임상 등급"으로 간주된 박테리아성 벡터는 항생제 내성을 코딩하지 않는 선별 마커를 가지고 있는 벡터이다.
"유의한 면역 반응"은 주어진 항원성 분자나 면역원에 대해 동물에서 면역성을 제공하게 되는 (즉 특이적인 항체의 생산을 유발함) 모든 면역 반응이다.
물질 또는 유기체의 생체내 이용을 한정 또는 제한하는 임의의 면역 반응이다. 검출가능한 면역 반응이 반드시 "유의한 면역 반응"인 것은 아니다.
본원에서 "치료학적 유효량"의 약학적으로 활성인 대상 분자 또는 상기 분자의 조합은 바람직한 반응을 유도하기데 유효하지만 독성 반응을 초래하기에는 불충분한 양을 포함하는 것으로 이해된다. 바람직한 반응을, 예컨대 혈액 샘플내 충분한 및/또는 허용가능한 검출성 항체 역가 수준을 형성할 수 있다. 환자에게 투여되는 조제물의 투여량 및 치료 기간은 치료가 필요한 환자를 진찰하는 보건 전문의가 결정할 것이며, 나이, 성별, 체중, 기존 질병 상태 및/또는 개체의 조직 손상 정도, 및 헬리코박터의 특정 제형 및 개체에 대한 치료제로서 사용중인 대상 산물의 유전자를 고려할 것이다.
"트랜스유전자"는 본원에서 cDNA 기술을 이용하여 그것의 기능, 복제 및 유전(transmission)을 정상 유전자로서 확보하는 방식으로 세포에 삽입되는 유전자를 의미한다.
"형질전환성 핵산 서열"은 본원에서 약학적으로 활성인 대상 분자를 코딩하는 핵산 서열을 함유하고 있는 플라스미드 또는 그외 발현 카세트를 의미한다. 본 발명의 일부 예에서, 핵산 서열은 하나 이상의 치료제를 코딩할 수 있다. "형질전환성 핵산 서열"은 또한 본 발명의 특정 예에 따라 "트랜스유전자"를 나타내는데 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 예에서, 상기 형질전환성 핵산 서열은 프로모터 및/또는 다른 조절 요소를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
용어 "암"은 본원에서 신생물 질환, 예, 백혈병, 암 및 "과다증식성 질환"을 의미한다. 신생물(neoplasm)은 결장, 복부, 뼈, 유방, 소화기계, 간, 이자, 전립선, 복막, 폐, 혈액(예, 백혈병), 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 자궁, 눈, 두경부, 신경(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 지라, 흉부 및 비뇨 생식기로 이루어진 군으로부터 선택된 조직내에 위치될 수 있다.
일 예로, 용어 "암"은 또한 과형성(hyperplasia)(예, 자궁내막 증식증), 화생(metaplasia)(예, 결합 조직 화생) 및/또는 형성 장애(dysplasia)(예, 자궁막 형성 장애 및 기관지폐 형성 장애)로 이루어진 군으로부터 선택된 전-암 증상(pre-neoplastic condition)을 포함한다.
다른 예로, 용어 "암"은 또한 양성 종양, 섬유낭종성 증상 및 조직 비대(tissue hypertrophy)로 이루어진 군으로부터 선택된 양성 증식이상 질환(benign dysproliferative disorder)을 포함한다.
용어 "면역/조혈계 질환 또는 증상"은 빈혈, 범혈구 감소증, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 백혈병, 홉킨스 질환, 비-홉킨스 림프종, 급성 림프구성 빈혈(ALL), 형질세포종(plasmacytomas), 다발성 골수종, 버킷트 림프종, 관절염, 천식, AIDS, 자가면역 질환, 류마티스 관절염, 육아종성 질환, 면역 결핍증, 염증성 장 질환, 패혈증, 호중구 감소증, 호중구 증가증, 건선, 이식한 기관 및 조직에 대한 면역 반응, 홍반성 전신 루푸스, 혈우병, 과응고증(hypercoagulation), 당뇨병, 심내막염, 뇌막염, 림 질환(Lyme Disease), 셀리악병(글루텐 민감성) 및 알레르기로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "생식기계 질환 또는 증상"은 본원에서 잠복고환증, 전립선염, 서혜 헤르니아, 고환정맥류, 간질세포(leydig cell) 종양, 사마귀성 종양(verrucous carcinoma), 전립선염, 연화판증, 페이로니병(Peyronie's disease), 음경암, 편평세포 증식증, 월경통, 난소 선암종, 터너 증후군, 점액농성 자궁경부염(mucopurulent cervicitis), Sertoli-leydig 종양, 난소암, 자궁암, 골반염증성 질환, 고환암, 전립선암, 클라인펠터 증후군, 영 증후군(Young's syndrome), 조루증(premature ejaculation), 당뇨병, 낭성 섬유증, 카타제너 증후군, 고환 위축증(testicular atrophy), 고환 여성화(testicular feminization), 무고환증(anorchia), 이소성 고환(ectopic testis), 부고환염(epididymitis), 고환염, 임질, 매독, 고환염전(testicular torsion), 정관염 결절성(vasitis nodosa), 배아종(germ cell tumour), 기질종양(stromal tumour), 월경통(dysmenorrhea), 자궁후굴(retroverted uterus), 자궁내막증, 섬유양(fibroids), 샘근육증(adenomyosis), 무배란성 출혈(anovulatory bleeding), 무월경(amenorrhoea), 쿠싱 증후군, 포상기태(hydatidiform mole), 아셔만 증후군(Asherman's syndrome), 조기 폐경(premature menopause), 성조숙(precocious puberty), 자궁 용종(uterine polyp), 기능장애 자궁 출혈(dysfunctional uterine bleeding), 자궁경부염(cervicitis), 만성 자궁경부염, 점액 자궁경부염(mucopurulent cervicitis), 자궁목형성이상(cervical dysplasia), 경관폴립(cervical polyp), 나보트낭(Nabothian cyst), 자궁경부미란(cervical erosion), 자궁경부무력증(cervical incompetence), 자궁경부 종양(cervical neoplasm), 가성 반음양증(pseudohermaphroditism) 및 월경전증후군(premenstrual syndrome)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "근골격계 질환 또는 증상"은 본원에서 골암(예, 골연골종(osteochondromas), 양성 연골종(benign chondromas), 연골모세포종(chondroblastoma), 연골점액유사 섬유종(chondromyxoid fibroma), 유골골종(osteoid osteom), 거대세포종(giant cell tumor), 다발성 골수종(multiple myeloma), 골육종(osteosarcoma), 파제트 질병, 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 골수염, 림 질환, 통풍(gout), 윤활낭염(bursitis), 건염(tendonitis), 골다공증, 골관절염, 근육 퇴행 위축(muscular dystrophy), 사립체 근육병증(mitochondrial myopathy), 악액질(cachexia) 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "심혈관계 질환 또는 증상"은 본원에서 점액종(myxoma), 섬유종(fibroma), 횡문근종(rhabdomyoma), 심혈관이상증(예, 선천성 심내 결손증(congenital heart defect), 대뇌 동정맥 기형(cerebral arteriovenous malformation), 중격 결손증(septal defect)), 심장병(예, 심장기능상실, 울혈성 심장 질환(congestive heart disease), 부정맥(arrhythmia), 빈맥(tachycardia), 세동(fibrillation), 심낭질환(pericardial disease), 심내막염(endocarditis)), 심장 정지, 심장 판막 질환(예, 협착증, 역류(regurgitation), 탈출증(prolapse)), 혈관병(예, 고혈압, 관상 동맥 질환, 앙기나(angina), 혈관류(aneurism), 동맥경화증(arteriosclerosis), 말초 혈관 질환), 저나트륨혈증(hyponatremia), 고나트륨혈증(hypernatremia), 저칼륨증(hypokalemia) 및 고칼륨혈증(hyperkalemia)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "혼합성 태아(mixed fetal)로 설명되는 질환 또는 증상"은 본원에서 척추 갈림증(spina bifida), 무뇌수두증(hydranencephaly), 신경섬유종증(neurofibromatosis), 태아 알코올 증후군(fetal alcohol syndrome), 당뇨병, PKU, 다운 증후군, 파타우 증후군, 에드워드 증후군, 터너 증후군, 에이퍼트 증후군(Apert syndrome), 카펜터 증후군(Carpenter syndrome), 콘라디 증후군(Conradi syndrome), 크로존 증후군(Crouzon syndrome), 이완 피부증(cutis laxa), 코넬리아 디란지 증후군(Cornelia de Lange syndrome), 엘리스-반 크레벨트 증후군(Ellis-van Creveld syndrome), 홀트-오람 증후군(Holt-Oram syndrome), 카타제너 증후군(Kartagener syndrome), 멕켈-그루버 증후군(Meckel-Gruber syndrome), 누난 증후군(Noonan syndrome), 팔리스터-홀 증후군(Pallister-Hall syndrome), 루빈스타인-타비 증후군(Rubinstein-Taybi syndrome), 만도 증후군(Scimitar syndrome), 스미스-렘리-오피쯔 증후군(Smith-Lemli-Opitz syndrome), 저혈소판 요골 무형성(TAR) 증후군(thrombocytopenia-absent radius syndrome), 트리처 콜린스 증후군(Treacher Collins syndrome), 윌리암스 증후군, 휘르쉬스프룽병(Hirschsprung's disease), 멕켈게실암(Meckel's diverticulum), 다낭포성 신장질환(polycystic kidney disease), 터너 증후군 및 성선이발생증(gonadal dysgenesis), 클리펠-파일 증후군(Klippel-Feil syndrome), 불완전 골형성증(Ostogenesis imperfecta), 근육퇴행위축증(muscular dystrophy), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease), 윌름씨 종양(Wilm's tumour), 신경모세포종(neuroblastoma) 및 망막모세포종(retinoblastoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "배설계 질환 또는 증상"은 본원에서 방광암, 전립선암, 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia), 방광 장애(예, 요실금(urinary incontinence), 요폐(urinary retention), 요로폐색(urinary obstruction), 요로감염증(urinary tract Infection), 사이질 방광염(interstitial cystitis), 전립선염, 신경성 방광(neurogenic bladder), 혈뇨), 신장 장애(예, 수신증(hydronephrosis), 단백뇨(proteinuria), 신부전(renal failure), 신우신염(pyelonephritis), 요석증(urolithiasis), 역류성 신병변(reflux nephropathy), 편측 폐쇄성 요로병증(unilateral obstructive uropathy))으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "신경/감각 시스템 질환 또는 증상"은 본원에서 뇌암(예, 뇌줄기 신경아교종(brain stem glioma), 뇌 종양, 중추 신경계(원발성) 림프종, 중추신경계 림프종, 소뇌별아교세포종(cerebellar astrocytoma), 및 뇌신경모세포종(cerebral astrocytoma)), 신경퇴행성(예, 알츠하이머 질환, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob Disease), 파킨슨 질환 및 특발성 초로성 치매(Idiopathic Presenile Dementia)), 뇌척수염(encephalomyelitis), 대뇌 말라리아(cerebral malaria), 수막염(meningitis), 대사성 뇌 질환(예, 페닐케톤뇨증(phenylketonuria) 및 피루베이트 카르복실라제 결핍증), 소뇌 조화운동 불능(cerebellar ataxia), 모세혈관 확장성 조화운동 불능(ataxia telangiectasia) 및 후천성 면역결핍증-치매복합증(AIDS-Dementia Complex), 정신분열증, 주의력 결핍 장애(attention deficit disorder), 주의결핍 과잉활동 장애(hyperactive attention deficit disorder), 자폐증 및 강박 장애(obsessive compulsive disorder)로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "호흡기계 질환 또는 증상"은 본원에서 후두암(larynx cancer), 인두암(pharynx cancer), 기관암(trachea cancer), 후두개암(epiglottis cancer), 폐암, 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 소세포(귀리 세포) 암종, 거대세포 암종 및 선암종과 같은 호흡기계 암, 알레르기 반응, 낭성 섬유종, 사코이드증(sarcoidosis), 조직구증 X(histiocytosis X), 침윤성 폐 질환(예, 폐섬유증 및 림프양 간질성 폐렴(lymphoid interstitial pneumonia), 폐쇄성 기도 질환(예, 천식, 기종, 만성 또는 급성 기관지염), 직업성 폐 질환(occupational lung)(예, 규폐증 및 석면증), 폐렴 및 늑막염으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "내분비계 질환 또는 증상"은 본원에서 내분비 조직 및 기관의 암(예, 시상하부, 뇌하수체, 갑상선, 부갑상선, 이자, 부신, 난소 및 고환의 암), 당뇨병(예, 요붕증, 1형 및 2형 당뇨병), 비만, 뇌하수체 관련 장애(예, 뇌하수체항진증(hyperpituitarism), 뇌하수체저하증(hypopituitarism) 및 하수체 소인증(pituitary dwarfism)), 갑상선기능저하증(hypothyroidism), 갑상선기능항진증(hyperthyroidism), 갑상선종(goiter), 생식 장애(예, 남성 및 여성 불임증), 부신 관련 장애(예, 애디슨 질환(Addison's Disease), 코르티코스테로이드 결핍증(corticosteroid deficiency), 및 쿠싱 증후군(Cushing's Syndrome)), 신장암(예, 부신종(hypernephroma), 이행세포암(transitional cell cancer) 및 윌름암(Wilm's tumour)), 당뇨병성 신장병증(diabetic nephropathy), 간질성 신장염(interstitial nephritis), 다낭신장병, 사구체신염(glomerulonephritis)(예, IgM 혈관간세포 증식 사구체 신염(IgM mesangial proliferative glomerulonephritis) 및 자가면역 장애로 인한 사구체신염, 예컨대 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome)) 및 신장석회증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "소화기계 질환 또는 증상"은 본원에서 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 충수염, 크론씨 질환, 간염, 간성 뇌병증(hepatic encephalopathy), 문맥고혈압(portal hypertension), 담석증(cholelithiasis), 소화기계 암(예, 담관암, 위암(stomach cancer), 결장암, 위암(gastric cancer), 췌장암, 담관암(cancer of the bile duct), 결장 종양(예, 용종 또는 암) 및 경화증(cirrhosis)), 이자염(pancreatitis), 궤양 질환(ulcerative disease), 유문협착(pyloric stenosis), 위창자염(gastroenteritis), 위염(gastritis), 위 위축증(gastric atrophy), 십이지장의 양성 종양(benign tumours of the duodenum), 과잉팽창(distension), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 흡수장애(malabsorption), 선천성 소장 질환, 박테리아 감염증, 기생충 감염, 큰결장증(megacolon), 히르슈슈프룽병(Hirschsprung's disease), 선천 큰결장증(aganglionic megacolon), 후천성 큰결장증, 결장염, 항문곧창자 장애(anorectal disorder)(예, 치루(anal fistula), 치핵), 선천성 간 질환(예, 윌슨 질환, 혈색소침착증(hemochromatosis), 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 담도폐쇄증(biliary atresia) 및 α 1-항트립신 결핍증), 문맥고혈압(portal hypertension), 담석증(cholelithiasis) 및 황달로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
용어 "결합/상피 질환 또는 증상"은 본원에서 결합조직 화생(connective tissue metaplasia), 혼합성 결합조직 질환, 국소 상피 증식증(focal epithelial hyperplasia), 상피 화생, 상피 이형성(mucoepithelial dysplasia), 이식 편대 숙주 질환, 다발근육염(polymyositis), 낭성 증식증(cystic hyperplasia), 대뇌 이형성(cerebral dysplasia), 조직 비대증(tissue hypertrophy), 알츠하이머 질환, 림프세포 증식 질환(lymphoproliferative disorder), 발덴스트론 마크로글로불린혈증(Waldenstron's macroglobulinemia), 크론씨 질환, 악성 빈혈(pernicious anaemia), 특발성 애디슨 질환(idiopathic Addison's disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 쇼그렌 증후군, 당뇨병, 낭성 섬유증, 골모세포종(osteoblastoma), 파골세포종(osteoclastoma), 골육종(osteosarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골다공증, 골관절염(osteoarthritis), 치주병(periodontal disease), 상처 치유, 재발성 다발연골염(relapsing polychondritis), 혈관염(vasculitis), 결절다발동맥염(polyarteritis nodosa), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 연조직염(cellulitis), 류마티스 관절염, 건선 관절염(psoriatic arthritis), 원판상 홍반 루푸스, 전신 홍반 루푸스, 공피증(scleroderma), CREST 증후군, 다발근육염(polymyositis), 피부근육염(dermatomyositis), 혼합성 결합조직 질환, 재발성 다발연골염(relapsing polychondritis), 맥관염, 헤노흐-쇤라인 증후군(Henoch-Schonlein syndrome), 결절 홍반(erythema nodosum), 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 측두(거대 세포) 동맥염(temporal (giant cell) arteritis), 타카야수 대동맥염(Takayasu's arteritis), 베게너 육아종증, 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 베체트 증후군(Behcet's syndrome), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 연조직염(cellulitis), 켈로이드(keloid), 엘러스-단로스 증후군, 마르판 증후군(Marfan syndrome), 탄성섬유가황색종(pseudoxantoma elasticum), 골형성 부전증(osteogenese imperfecta), 연골형성장애(chondrodysplasia), 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa), 알포트 증후군(Alport syndrome) 및 이완피부증(cutis laxa)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 증상을 의미한다.
표현 "그렐린 관련 질환 및 장애"는 그렐린의 활성 조절을 통해 치료, 예방 또는 완화될 수 있는 모든 증상을 의미한다. 이러한 증상은 그렐린, 예컨대 성장 호르몬 분비에 의해 증강, 악화 또는 자극되거나 또는 식이로 유도되는 증상이다. 그렐린의 생리 작용은 예컨대, 성장 호르몬의 분비 자극, 프로락틴분비 세포(lactotroph) 및 부신피질자극 세포(corticotrope)의 호르몬 분비 자극, 식욕유발성 및 심혈관 기능, 갑상선과 유방 종양에 대한 항-증식성 효과, 및 미주 신경 매개(vagal mediation)를 통한 위 운동 및 산 분비의 조절의 방식에 의한 것을 포함하는 것으로 간주된다(WO 2005021026 참조).
용어의 정의가 용어의 일반적인 사용 의미와 상이한 경우, 출원인은 명확하게 나타낸 경우를 제외하고는, 본 명세서에 기재된 정의를 이용한다.
본 발명은 아래 비제한적인 예를 들어 상세히 설명된다. 그러나, 하기 실시예들은 설명하기 위한 것으로, 본원에 기재된 본 발명의 일반성을 제한하는 방식으로 취하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 특히, 본 발명은 특정 헬리코박터 필로리 균주의 사용을 들어 상세하게 설명되지만, 본 발명의 내용은 상기 균주로 한정되지 않는 것으로 명확하게 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 플라스미드 구조체 pHPA1(2.8kb)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 플라스미드 구조체 pHP3(3.4kb)의 개략도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 플라스미드 구조체 pTM103-8을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 설파살라진(SSN)의 화학 구조를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 염료(Azure-A)가 접합된 이온 교환 수지(Amberlite XE-96)를 이용하는 방법을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 HopE 구조를 예측한 것으로, HCCA 또는 p60 에피토프를 코딩하는 핵산 서열과 같은 대상 서열에 대한 삽입 부위가 표시된다. Bina 등에 의해 고안된 것으로 원용에 의해 본 명세서에 명백하게 포함된다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따라 SOe PCR을 이용하여 제조한 재조합 DNA 분자를 나타낸 것이다. HCCA 또는 p60 에피토프 중 어느 하나를 코딩하는 DNA를 HopE의 168에 해당되는 위치로 hopE에 삽입하였다. 헬리코박터 필로리에서 hopE 게놈 카피의 상동성 재조합 및 치환을 가능하게 하기 위해, 게놈 hopE에 상동인 서 열을 에피토프 코딩 DNA를 삽입하는 부위의 측면에 포함시켰다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에서 헬리코박터 필로리에서의 재조합 유전자를 나타낸 개략도이다. A: 추정상 표면 노출 루프에 해당되는 영역내 aa 168에 해당되는 위치에서 항원(Ag) 코딩 DNA를 hopE에 삽입함. B: cagA 정지 코돈의 바로 5' 상위에서 항원 코딩 DNA를 cagA에 삽입함. C: B128 vacA를 26695 vacA 프로모터 서열, 신호 서열(ss), 성숙형(m) vacA, 패신저 도메인(passenger domain) 및 자가수송(AT: autotransporter) 도메인을 코딩하는 DNA로 치환됨. 항원 코딩 DNA는 신호 서열 바로 위에 삽입하였다.
도 9는 본 발명의 일 구현예로 HCCA (B128:HCCA:hopE)를 포함하는 헬리코박터 필로리 B128(7, 13)의 웨스턴 블롯 분석 결과이다. 블롯 A. 일차 항체: α-HopE; 이차 항체; α-토끼 - AP 접합체, 레인 1: 마커; 레인 2: B128; 레인 3: B128:HCCA:hopE; 레인 4: B128:p60:hopE. 블롯 B: 일차 항체: α-HCCA; 이차 항체; α- 마우스 - AP- 접합체. 레인 1: 마커; 레인 2: B128:HCCA;hopE; 레인 3: B128. 블롯 C. 일차 항체: α-p60; 이차 항체; α-마우스 - Ap 접합체 (이차 항체). 레인 1: 마커; 레인 2: B128:p60:hopE; 레인 3: B128. 화살표는 HopE 또는 융합 단백질에 해당되는 밴드를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 구현예로 HopE에 삽입된 HCCA를 포함하는 헬리코박터 필로리 B128(B128:HCCA:hopE)의 면역형광 현미경 결과이다. 상단: 형광현미경. A: H. pylori B128. 일차 항체: α-HopE; 이차 항체; α-토끼 Alexafluor 488 (AF-488). B: H. pylori B128. 이차 항체; α-토끼 AF-488. C. H. pylori B128. 일차 항체: α-HCCA; 이차 항체: α-마우스 AF-488. D: H. pylori B128:HCCA:hopE. 이차 항체: α-마우스 AF-488. E. H. pylori B128:HCCA-hopE. 일차 항체: α-HCCA: 이차 항체: α-마우스 AF-488.
도 11은 본 발명의 일 구현예로 재조합 H. pylori 26695 및 B128 (7.13)의 세포 기반의 ELISA 분석 결과이다. A: 재조합체 26695:HCCA:hopE 또는 26695:p60:hopE; B: 재조합체 B128:HCCA:hopE B128:p60:hopE; p60 항원 검출: 일차 항체: α-p60; 이차 항체: α-마우스-알칼리 포스파타제(AP) 접합체; HCCA 검출: 일차 항체: α-HCCA; 이차 항체: α-마우스-AP 접합체. 에러 바: SEM (n=3).
도 12는 항원을 제시 단백질에 삽입할 수 있는 가능한 부위의 위치를 나타낸 것이다.
도 13은 SOE PCR을 이용한 DNA 조립 프로세스를 나타낸 것이다. A: 2개의 증폭 산물의 조립 프로토콜. B: 3개의 증폭 산물의 조립 프로토콜.
도 14는 rpsL.ermB 카세트(ref)로 치환된, 헬리코박터 필로리 균주 X47에서 ureA 또는 ureB의 결손된 부위를 나타낸다. 각 X47 재조합만 하나의 삽입을 포함하고 있다.
도 15는 기능성 유레아제를 생산하는 박테리아에 대한 유레아 플레이트 선별을 나타낸 것이다. 좌(증식): 야생형 X47(유레아제 양성); 우(무증식): UreA 및 UreB 생산이 파괴된, rpsLermB 카세트를 포함하는 X47(유레아제 음성).
도 16은 헬리코박터 필로리의 유레아제의 분자 구조이다.
도 17은 스트렙토마이신 역선택 시스템을 이용한 헬리코박터 필로리의 형질 전환 프로토콜이다.
도 18은 2종의 혈구응집소 에피토프에 인 프래임 융합을 위해 사용되는 삽입 부위를 나타낸 것이며, FLAG 에피토프는 해당 번호 1a 내지 8로 표시되어 있다. 링커는 에피토프 사이에 작은 GPSL과 함께 표시되어 있다. 유레아제 오페론의 게놈 구조를 나타낸다. 화살 헤드는 ureA, ureB, ispA 및 ureI 유전자를 나타낸다. 나타낸 DNA 단편의 길이는 염기 쌍 단위(bp)이다.
도 19는 재조합 유레아제의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 레인 1: 단백질 분자량 마커; 레인 2: 1a번 부위; 레인 3: 3번 부위; 레인 4: 4번 부위; 레인 5: 8번 부위; 레인 6: 1a번 부위; 레인 7: 3번 부위; 레인 8: 4번 부위; 레인 9: 8번 부위. 레인 2 - 5는 샘플을 1:6 희석한 것이고, 레인 6 -9는 샘플을 1:2로 희석한 것이다. 결과는, FLAG가 테깅된 에피토프가 유레아제 1a, 4 및 8번 부위에 있음을 나타낸다. 보다 높은 희석 비율에서는 3번 부위에서 에피토프를 검출할 수 없었으며, 에피토프는 보다 높은 희석에서 검출가능하였다(각각 레인 3 및 7)
도 20은 헬리코박터 필로리를 0일에 위내로 109 cfu/ml 200 ㎕를 투여하여 C57BL/6 암컷 마우스를 면역화한 것을 나타낸 것이다. 73일 후, 마우스에서 채혈하여 혈청을 수득하였다. HA IgG 역가를 ELISA로 결정하여, HA-B 세포 에피토프에 특이적인 IgG 생산을 측정하였다. BHIB는, 배양 배지 BHIB로 면역화한 대조군이고, X47은 야생형 헬리코박터 필로리 X47로 면역화한 그룹이고, Si1a, Si3, Si4 및 Si8은 각각 삽입 부위 1a, 3, 4 및 8에 혈구응집소 에피토프를 발현하는 재조합 헬 리코박터 필로리로 면역화한 그룹이다. 검게 칠한 라벨은 헬리코박터 필로리가 집락을 형성한 마우스이고, 속이 빈 백색 라벨은 73일에 집락을 형성하지 않은 마우스를 나타낸다.
실시예 1: 외부 단백질의 안정적인 발현용 벡터 및 형질전환 헬리코박터 필 로리 유기체
헬리코박터 필로리의 유전자 조작은 보기 드문 것이다. 본 실시예는 유전자 형질전환된 헬리코박터, 특히 형질전환된 헬리코박터 필로리를 제공하기 위한 본 발명의 이용을 개시한다. 형질전환된 박테리아은 헬리코박터로부터 유래된 플라스미드 및 플라스미드 벡터를 이용하여 제조되며, 이는 E. coli와 같은 비-헬리코박터 유기체에 이미 조작된바 있다.
문헌에 개시된 수종의 헬리코박터 필로리 플라스미드를 헬리코박터 필로리/E.coli 셔틀 벡터로 성공적으로 변환시켰다. 수종의 E. coli 균주는 DNA 획득(uptake)에 선천적으로 적합한 것으로 보고되어 있다. 스트렙토마이신, 리팜핀 및 메트로니다졸에 대한 내성 마커 역시 대부분의 헬리코박터 필로리 균주로 성공적으로 형질전환되었다. 그러나, E. coli 및 다른 유기체 유래의 플라스미드 DNA도 헬리코박터 필로리로 도입될 수 있지만, 이들 플라스미드는 안정적으로 유지될 수 없다. 또한, 헬리코박터 필로리 플라스미드는 E. coli 또는 헬리코박터 종에 형질전환시킬 수 없다. 따라서, 헬리코박터 필로리 셔틀 벡터를 구축하여야 한다.
헬리코박터 유래 2종의 플라스미드를 도 1 및 2에 개략적으로 나타내었다. 벡터 pHPA1(2.8kb)(도 1) 및 pHP3(3.4kb)(도 2)를 서열 분석하였고, pHPA1이 플라스미드 복제 세타(theta) 모드를 통해 복제되는 것으로 확인하였다. 롤링-서클 복제 플라스미드와는 반대로, 세타 플라스미드는 복제하는 동안 단일가닥의 DNA 중간체를 만들지 않으며, 이들은 변칙 재조합(illegitimate recombination)을 겪는 경향이 낮으므로, 더욱 안정적인 벡터 후보체이다. 나아가, pHPA1 복제 오리진(ori)은 복제 통제 및 안정적인 카피수 유지에 관여하는 일련의 직접 반복 서열(direct repeat sequence, "iterons")을 함유하고 있다. 벡터 pHP3은 이러한 특성의 많은 부분을 공유하고 있다. 이들 2종의 벡터의 뉴클레오티드 서열은 하기에 나타낸다.
(1) 플라스미드 pHP1은 이종 가닥 형태로 나타내었다(위쪽 가닥은 (+ 가닥)서열번호 1이고, 아랫쪽 가닥은 (- 가닥) 서열번호 2임):
Figure 112009035098288-PCT00002
Figure 112009035098288-PCT00003
플라스미드 pHP3은 단일가닥 형태로 나타내었다(서열번호 3):
Figure 112009035098288-PCT00004
클로닝된 추가적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4로 기재하며, 이는 45개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 135 bp 단편을 포함한다(서열번호 5). 이처럼 작은 45개의 아미노산 펩타이드는 C형 간염 바이러스(HCV) 코어 항원의 면역원 폴리펩타이드이다. 45개의 아미노산 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 하기에 나타내며, 135개의 뉴클레오티드는 밑줄로 표시하였다(서열번호 5).
서열번호 4:
Figure 112009035098288-PCT00005
서열번호 5:
Figure 112009035098288-PCT00006
서열번호 4의 핵산을 헬리코박터 필로리 26695의 hopE 유전자(서열번호 6, 하기 기재)를 서열번호 4의 504번(굵은체/밑줄로 표시/ 단백질 산물의 아미노산 잔기 168번에 해당)에 클로닝하여, 발현된 산물은 HopE 유전자 산물의 표면 노출된 루프의 일부로서 위치될 것이다. 이러한 구조체, 벡터 pTM103-8(도 3)을 E. coli의 표면에서 발현시켰다.
서열번호 6:
Figure 112009035098288-PCT00007
Figure 112009035098288-PCT00008
간략하게는, hopE 유전자 분리를 수행하는 한가지 방법은 Taq DNA 중합효소를 이용하여 헬리코박터 필로리 22695로부터 증폭시키는 것이다. 상류 프라이머는 BamHI 부위를 포함하는 5'-AAGGATCCGATAGGAATGTAAAGGAATGG-3'(서열번호 7)이고, 하류 프라이머는 EcoRI 부위를 포함하는 5'-CCGAATTCTAAAGGCATGAACGCTTGCA-3'(서열번호 8)으로, 이들은 Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc. model 332(ABI; Mississauga, Ontario, Canada)와 같은 DNA 합성기로 구축할 수 있다. 제조되는 PCR 단편은 lac 프로모터와 동일한 배위로 pBluescript II KS(+)의 EcoRV 부위에 블런트-엔드 클로닝할 수 있다.
이후, C형 감염 바이러스(HCV) 코어 항원의 135bp 면역원 코딩 서열을 삽입하기 위해, hopE 유전자에 2가지 고유한 제한효소 부위를 삽입을 위한 PCR 프라이머를 제작할 수 있다. Taq DNA 중합효소를 이용한 PCR 증폭은 다음과 같이 터치다 운(touchdown) 증폭 공정으로 수행할 수 있다. PCR 써모사이클러(thermocycler)는 96℃에서 4분간 첫번째 변성 단계, 이후의 65℃(90초) 첫번째 어닐링, 이는 연속적인 각 사이클에서 0.5℃ 감온, 72℃에서 6분간 연장 단계, 및 96℃에서 1분간 변성 단계로 이루어진 18회의 사이클이 수행되도록 프로그래밍되어 있다. 처음 18번의 사이클이 끝나면, 72℃ 연장, 96℃ 변성 및 일정한 55℃에서의 어닐링으로, 추가적인 14번의 증폭 사이클을 수행할 수 있다. 수득되는 증폭물은 컬럼으로 정제하고, 에탄올을 이용하여 침전시킨 다음, DNA 중합효소의 클레나우 절편으로 절단하여 블런트를 만든다. PCR 산물은 제한 효소로 절단하여, 주형 DNA를 제거할 수 있으며, pTM103.8과 같은 적정 벡터에 아라비노스 유도성 프로모터의 통제하에 다시 연결시키고, 이를 E. coli JM105에 형질전환할 수 있다.
재조합 클론은 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-AGATCTAAGGACGTC-3'(서열번호9) 및 증폭 반응에서의 역방향 시퀀싱 프라이머를 이용하여 동정할 수 있다. 동정한 클론은 서열 분석하여, 삽입된 제한 엔도뉴클레아제 부위가 인 프래임이고, hopE 유전자에 실수없이 도입되었음을 검증할 수 있다. C형 간염 바이러스(HCV) 코어 항원의 135 bp 면역원 코딩 서열은 이후 표준 기법으로 삽입할 수 잇다.
벡터 pTM103-8이 만들어졌으며, 이를 E. coli를 형질전환시킨 다음 37℃에서 증식시켰다. 이후, 세포를 회수하여, HCV 삽입체의 발현을 웨스턴 블롯으로 계속 진행하였다.
간략하게는, 이러한 공정은 다음과 같다. 약 20개의 플레이트에서 세포를 회수하여, 10mM Tris-HCl (pH8.0) 중의 50mg의 DNase I(Boehringer Mannheim)이 함 유된 20% 슈크로스 용액에 재현탁하였다. 이후, 고압력 세포 파쇄기(French pressure cell)를 이용하여 15,000 lb/in2에서 세포를 파괴시켰다. 파괴된 세포는 10mM Tris-HCl(pH8.0) 중의 70% 1ml과 70% 6ml의 슈크로스로 구성된 슈크로스 단계 농도 구배위에 적층하였다. 외막 분획을 수집하여 150,000 xg에서 펠렛화한 다음, 펠렛은 증류수 100㎕에 재현탁하였다. 다른 방법으로는, 대수기 배양물 500ml로부터 수득한 외막을 10mM Tris-HCl(pH 8.0)-3% n-옥틸-폴리옥시에틸렌에 용해시키고, 23℃에서 1시간 배양한 다음, 173,000 xg에서 30분간 원심분리하였다. 펠렛은 10mM Tris-HCl - 3% n-옥틸-폴리옥시에틸렌 - 5mM EDTA(pH8.0)에 현탁하여, 23℃에서 1시간 배양한 다음, 173,000 xg에서 30분간 원심분리하여, 상층액을 회수하였다. 웨스턴 면역블롯에서 두번째 용해 단계의 상층액에 HCV/hopE가 존재하는 것으로 나타났다. HCV/hopE를 함유하는 상층액을 동일 부피의 0.125 M Tris-HCl(pH 6.8), 4%(wt/vol) 소듐 도데실 설페이트(SDS) 및 20% (vol/vol) 글리세롤과 혼합하여, SDS-12% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 수행하였다. 필요한 경우, HCV/hopE 밴드를 겔의 염색되지 않은 부위에서 적출하여, 4℃에서 하룻밤동안 10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA(pH8.0) 및 100mM NaCl로 용출시킬 수 있다. 용출 상층액은 이후 순도를 확인하기 위해, SDS-PAGE 겔상에 전기영동하고, 표준적인 기술로 웨스턴 면역블롯을 수행할 수 있다. 예컨대, 분리된 외막은 15㎍/레인의 농도로 로딩할 수 있다. 이후 불연속적인 12% 폴리아크릴아미드 겔상에서 SDS-PAGE를 수 행한다. 단백질은 코마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한다. 웨스턴 면역블롯팅을 위해, 염색되지 않은 겔을 Immobilon-P membranes(Millipore, Bedford, Mass.) 상으로 전기블롯팅할 수 있다. PBS(phosphate-buffered saline) 중의 3% 소 혈청 알부민(BSA; Boehringer Mannheim) - 0.1% 트윈20(Sigma)으로 막을 23℃에서 2시간 블롯킹한 다음, PBS 중에서, 1% BSA - 0.05% 트윈20 중의 항-HCV 토끼 항혈청 1/10,000 희석물과 함께, 37℃에서 한시간 반응시켰다. 이후, 막은 PBS로 세정하고, 알칼라인 포스파타제가 접합된 이차 항체(Bio-Rad, Richmond, Calif.)의 1/5,000 희석물과 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 결합된 항체는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트(BCIP, Calbiochem, La Jolla, Calif.) 및 니트로블루 테트라졸륨(NBT, Sigma)으로 검출한다.
실시예 2: 안정적인 발현을 위한 발현 벡터 및 항원의 선택
HopE는 헬리코박터 필로리의 천연 단백질이고, 이 유기체에서 허용되기 때문에, 헬리코박터 필로리에서 외부 항원 또는 그외 이종 유전자 산물을 발현하는데 유용한 구조체를 제조할 수 있다. 전술한 바와 같이 쉽게 개발가능한 그외 헬리코박터 필로리/E. coli 셔틀 벡터로는, 예컨대 2종의 플라스미드 ori 부위와 각 숙주에서 안정적인 마커를 포함하는 벡터가 있다. 마커는 E. coli 및 헬리코박터 필로리의 전사 시스템 모두에서 인지될 수 있는 프로모터 뿐만 아니라 클로람페니콜/카 나마이신 내성에 대한 유전자를 포함할 수도 있다.
E. coli 복제에 필요한 사항은 공지된 다수의 모든 E. coli 플라스미드(예, pBR322)를 이용하여 해결할 수 있다.
구축한 셔틀 벡터는 E. coli와 헬리코박터 필로리 둘다에서 시험관내 복제를 테스트할 수 있으며, 문헌에 개시된 기존 셔틀 플라스미드와 비교할 수 있다.
발현되는 항원 또는 그외 이종 유전자 산물의 선택은 헬리코박터 필로리 및 E. coli에 무독하며, 동물의 선택부에 전달하였을때 면역원성이 높은(또는 다른 바람직한 특성을 가진) 것이 이상적이다. 포유류의 면역화를 위한 발현 항원은 경우, 상기 부위는 점막 부위일 수 있다.
실시예 1에 개시한 바와 같이, hopE/HCV 코어 항원 융합 단백질은 E. coli 표면에서 발현시킬 수 있다. pTM103-8(도 3)의 산물은 바람직하기로는 헬리코박터 필로리의 외막을 표적화하여, 점막 환경에서 HCV 코어 항원을 노출시킬 것이다.
파상풍 톡소이드(TT)는 인간에서의 항원으로서 널리 연구되었으며, 그것에 대한 면역 반응도 잘 알려져 있다. TT는 박테리아 포자의 표면에 노출되었을때 경구 또는 비내 투여시 우수한 점막성 면역 반응을 도출한다(Duc & Cutting, 2003, Expert Opinion Biol Ther, 3(8), 1263-70). 파상풍 독소 C 단편은 전술한 바와 같이 hopE 유전자 산물에 융합하거나, 또는 막 고정(abchor) 및 세포 표면 표적 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 이러한 시스템의 이점은 백신접종의 효과를 판단할 수 있는 매우 잘 특정화된 뮤라인 모델이 있다는 것이지만, HCV 경우는 공지의 뮤라인 모델은 전형적으로 면역 결핍성 마우스에 의존한다. 사이토메갈로바이 러스(CMV)의 gB 단백질은 gB 항원을 발현하는 조작된 백신 바이러스의 치사량에 대하여 마우스를 면역화하는 것으로 입증되었다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은, HCV 항원 대신 gB 항원을 포함하는 셔틀 벡터를 실시예 1의 프로토콜을 이용하여 구축할 수 있다.
셔틀 벡터에 다수의 프로모터를 사용할 수 있다. 이상적으로, 사용되는 프로모터는 헬리코박터의 생체내 천연 집락화 메카니즘이나 소모될 수 있는 무해한 영양소 또는 화합물을 이용하여 유도함으로써 유도가능하다. 예컨대, 헬리코박터 필로리 히스티딘 키나제 HP165 유래 프로모터를 사용할 수 있다. 헬리코박터 필로리 히스티딘 키나제 HP165 유래 프로모터는, 산성 pH에 의해 유도되는 것으로 보고되었으며, 위 점막에서의 집락화와 관련된 병독성 인자일 수 있다. 이러한 프로모터의 이점은 구조체를 시험관내에서 만들 수 있다는 것이다. 외부 항원은 위 점막의 산성 환경에 노출되었을 때에만 발현될 것이다.
다른 프로모터로는 pTM103.8에 사용된 아라비노스 유도성 프로모터, FlaB sigma 54 프로모터(Josenhans et al ., 1998, FEMS Microbial Lett., 161(2), 263-73), 구성적인 및 유도성 E. coli 시스템에서 사용되는 T7 프로모터, 혐기성 환경에서 유도되는 살모넬라의 nir 프로모터(Chatfield et al ., 1992, Biotechnology, 10(8): 888-92)가 있다. 이들 프로모터의 헬리코박터에서 기능하는 능력은 헬리코박터 필로리 플라스미드 벡터에서 프로모터 활성의 판독으로서 CAT 및 GFP 리포터를 이용하는, Angelini et al . (2004) (Plasmid, 51:101-107)가 개발한 시스템으로 테스트할 수 있다.
표적 부위의 발현은 항원 또는 그외 사용되는 유전자 산물에 따라 결정될 것이다. 초기 연구는 발현된 폴리펩타이드(예, 항원)을 헬리코박터 필로리의 세포 표면으로 표적화하는 HopE 단백질 및 융합 폴리펩타이드에 집중되었다.
또한, 플라스미드 안정성 역시 매우 중요하며, 플라스미드 유지에 대한 선택적인 결정인자로서 항생제 내성 유전자를 시험관내에서 사용하는 것이 유용하지만, 생체내에서는 실용성이 낮다. 대안책은 안정된-치사 시스템(balanced-lethal system)이며, 그 예로는 살모넬라에서 불활성화에 사용되는 asd 유전자가 있다. asd 유전자는 본래 헬리코박터 필로리에 존재하는 것으로, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 디하이드로게나제(그람 음성 박테리아의 세포 벽 펩티도글리칸의 필수 구성인 디아미노피멜릭산(DAP)의 생합성 경로 효소)를 코딩한다. DAP가 없으면, asd 돌연변이는 라이시스된다. DAP는 포유류 조직에 존재하지 않기 때문에, 상기 안정된-치사 시스템은 모두 살아있는 헬리코박터 필로리가 재조합 asd 유전자를 포함하고 있는 플라스미드를 수송한다는 요건을 이용한다.
asd 유전자 시스템을 이용하기 위해, asd 유전자의 게놈 카피는 표준 유전자 낫아웃 프로토콜로 불활성화한다. 이러한 헬리코박터 필로리 균주는 DAP 공급시에만 또는 asd 유전자를 함유하는 플라스미드 존재시에만 증식할 것이다.
유사한 목적으로 사용할 수 있는 그외 시스템으로는 점막 보강제로서 E. coli 장독소(enterotoxin) 또는 콜레라 독소(CT)가 있다. 또한, 보강제를 사용하여 점막 면역 반응을 부스트할 수 있다. 이러한 2종의 보강제는 CT 및 E. coli 장독소(LT)이며, 발현된 항원은 그것의 강력한 점막 보강제 특성을 유지하지만 독성 은 감소된 LTB 및 CTB 돌연변이에 융합되어 있다.
실시예 3: 병독성, LD 50
실시예 1 및 2에 개시된 바와 같이, pHP3 및 pHP623과 같은 헬리코박터를 기초로한 벡터는 마우스 또는 인간과 같은 포유류 감염에 대한 방어를 제공할 수 있다. 본 실시예에서는, 뮤라인 모델을 사용하여 인간을 포함하는 포유류에 대상 약리 활성 분자의 전달을 제공하는데 있어 헬리코박터를 기초로한 시스템을 이용하는 활용성을 설명한다. 뮤라인 모델을 채택하여, 생체내에서 발현된 표면 항원에 대하여 혈청학적 반응을 도출하는 헬리코박터 필로리의 형질전환 균주의 활성을 설명한다.
천연형 헬리코박터 필로리로 마우스를 감염시키고, 나머지 마우스에는 실시예 2와 같이 온도에 민감한 헬리코박터 필로리를 섭식(gavage)으로 접종하였다. 대조군 및 실험 동물 모두에서 혈청을 취하여 항체를 분석하고, 표 1에 기재된 계획에 따라 치사시킨 동물의 위 조직을 분석하였다. 마우스 요소 호기 검사(mouse urea breath test)도 또한 실시하였다.
병독성은 50%(75 % 내지 40%) 감소하였다. 특이적인 항체 역가는 베이스라인보다 4배 증가하였는데, 이는 혈청학적 반응을 시사한다. 혈청 샘플을 베이스라인, 12, 24, 48주에 취하였다. 이러한 시간대에, 10 및 20마리의 동물을 죽여 위 조직을 분석하였다.
실시예 4: 온도에 민감한 수종의 헬리코박터 균주들의 병독성 및 항원성 비교
외막 단백질의 발현/변형과 연관된 병독성에 있어 변화를 검출하기 위해, 마우스에 실시예 3과 같이 온도에 민감한 헬리코박터 필로리를 접종하였다. 동일 크기의 마우스 대조군에는 천연형 헬리코박터 필로리 균주를 감염시켰다. 비침투적인 수단을 이용하여 헬리코박터 필로리의 존재 또는 부재를 확인하였다. 항체 측정을 위해 6 및 6달째에 마우스로부터 채혈하였다. 죽인 후, 조직 분석을 수행하여, 위염을 분석하고, 집락화를 검증하였다.
실시예 5: 폐렴 쌍구균 항원에 대한 온도 민감성 헬리코박터 필로리 백신의 효능을 평가하기 위한 LD 50 실험
표준적인 병원체(폐렴 쌍구균)로부터 헬리코박터를 토대로한 백신의 방어 효과를 확인하기 위해, 마우스에 온도 민감성 헬리코박터 필로리를 섭식으로 접종하였다. 동일 크기의 대조군에는 천연형 헬리코박터 필로리 균주를 감염시켰다. 비침투적인 방법을 이용하여 실시예 4와 같이 헬리코박터 필로리의 존재 또는 부재를 결정하였다. 감염 6개월 후에, Aaberge et al. (1995, Microb. Pathog. 18:141-52)에 따라, 마우스 모두에 병독성의 살아있는 폐렴 쌍구균 타입 4의 10배의 LD50(~20 CFU/mouse)을 복막내 접종하였다.
대조군은 75%의 치사율을 보였으며, 사망율 50% 감소(75% vs 50%)를 검출하기 위한 실험의 파워는 0.8이다.
실시예 6: 마우스의 헬리코박터 필로리 상태 결정: 호기 검사 방법
본 실시예에서는, 인간에서 행해지는 요소 호기 검사를 마우스에 적용하였다.
10마리의 마우스에 유레아제가 없는 식이(uncooked soy)를 제공하였다. 이후 마우스에 섭식에 의해 200㎕의 향이나는 사이트레이트(flavoured citrate) 중의 3.7 kBq(14) 요소를 투여하고, 20분간 공기가 충진된 2L 플라스틱 지퍼락 백에 위치시켰다. 이후, 백내 공기 교환없이 마우스를 이동시켰다. 에탄올 중의 히아민 0.1 mmol을 투입하고, 신틸런트(scintillant)를 상기 히아민 용액에 첨가한 다음, 10분 또는 카운트 1,000 dpm가 될때까지 카운트하였다.
실시예 7: 인간 실험
인간에 대한 병독성 및 항체 반응을 확인하기 위해, 헬리코박터 필로리 유사 "베일러 균주(Baylor Strain)"를 사용하였고, 하기 기준을 적용하였다:
1. 감염된 개체에는 증상이 없으며, 가벼운 조직 손상 이상의 손상이 없으며, 간염 바이러스 또는 HIV로 감염된 증거가 없다.
2. 분리물은 단일 균주, cagA 음성, 및 메트로니다졸, 클라리트로마이 신(clarithromycin), 테트라사이클린 및 아목시실린(amoxicillin)에 민감성이다.
3. 시험감염을 투여받은 지원자는 정상적인 위 조직력을 가진 건강한 사람으로, 소화궤양 병력이 없으며, 집에 어린이가 없으며, 어린이와 주기적으로 접촉하지 않으며, 감염증 치료에 필요할 수 있는 항생제에 알레르기가 없다.
시험감염은 취침시의 40mg의 파모티딘(famotidine) 투여 및 아침에 비프 브로스중의 헬리코박터 필로리의 경구 투여로 구성된다. 개체에게 14일간 매일 투여하였다. 7일 및 14일 후에 13C-UBT을 수행하였고, 2주 및 3개월 후에 내시경 검사, 정량 배양 및 조직학 검사를 실시하였다. 항생제를 사용하여, 감염증을 치료하였다.
실시예 8: 천연형 및/또는 TSHP 의 생체내 검출용 외인성 화학 마커의 개발
천연형 또는 TSHP를 생체내에서 검출하기 위해 사용할 수 있는 화합물 마커의 예는 도 2의 구조로 표시되는 설파살라진(SSN)이다. 무균 마우스와 일반적인 랫 연구에서, 장내 박테리아이 디아조본드(diazo-bond) 환원에 단독 원인이어서, 설파피리딘 및 5-아미노살리실레이트의 분지 및 SSN의 환원성 이화작용을 발생시킨다. 이러한 반응을 촉매하는 효소(들)를 디아조리덕타제(들)(동의어 아조리덕타제(들)라 한다. SSN을 투여한 일반적인 랫은 뇨와 변으로 5-아미노살리실레이트와 설파피리딘(및 그와 관련된 접합체)를 배출하였지만, 무균 랫은 SSN 분해 증거를 보이지 않았다.
수종의 박테리아 종들이 디아조리덕타제(AZR's)를 가지는 것으로 알려져 있 다. 예비적인 바이오인포메틱스 연구를 통해, 헬리코박터 필로리토박터 필로리가 AZR 유전자를 함유하지 않을 수 있다는 것이 시사되었다. 또한, 비슷한 유사 서열이 존재하여도 음성적인 결과가 나타난다. 이러한 상황에서, 생활가능하고, 기능적인 아조리덕타제(azr + TSHP)를 가지는 헬리코박터 필로리 형질전환 균주(TSHP)를 사용하여, 이러한 마커의 사용을 조사할 수 있었다.
플라스미드 pTM103-02를 EcoRI 및 HindIII로 절단하여, EcoRI 및 HindIII로 절단한 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)의 아조리덕타제(AZR)에 연결하여, pTMI03-azr라고 하는 HopE 168aa 및 AZR을 함유하는 벡터를 제조한다. 이 플라스미드를 E.coli에 형질전환시켜, HopE 168aa 및 바실러스 섭틸리스의 AZR 발현 여부를 조사하였다. pTMI02는, 전장 C형 간염 코어 항원(HCCA)으로 유사하게 처리하였을때, 웨스턴 블롯 및 항-HopE Abs를 적용한 E. coli 외막으로의 HopE::HCCA 전달을 나타내었다.
섭식을 통해 azr + TSHP를 마우스(n =30)에 감염시키고, 뇨와 변에서 5-아미노살리실레이트 및 설파피리딘(및 그와 관련된 접합체)를 생산하기 위한 생체내 AZR 발현이 확인되면, 인간에게 시도해볼 수 있다.
실시예 9: 마커로서 디아그넥스 블루(DIAGNEX BLUE)의 사용
진단제 "디아그넥스 블루"는 염료(Azure-A)가 접합된 이온 교환 수지(Amberlite XE-96)로 구성되어 있다. 이 검사는 pH 2.5 미만에서 수지-염료 조합이 분해되는 사실을 이용한 것으로, 염료는 흡수된 후 뇨에서 나타난다. 뇨에 염료가 없는 사람은 무산증(achlorhydric)이다. 이러한 원리는 도 5에 나타내었다.
동일한 원칙을 사용하여 헬리코박터 필로리를 테스트할 수 있다. 예컨대, pH >7.0에서 분해되는 염료-수지 조합은 수지를 요소와 함께 제공한다면 유레아제를 검출할 수 있다. 이는 헬리코박터 필로리가 거주하여 염료를 분비하는 점액 층에 pH>7.0을 형성한다.
마우스(n = 30)에 천연형 헬리코박터 필로리를 접종하고, 무균 마우스(n =30)는 대조군(Pilot study)으로 사용하였다. 헬리코박터 필로리가 활성 감염으로 확립되는 최적의 기간이 경과된 후, 실험군과 대조군에 섭식에 의해 정해진 함량의 수지-염료 복합체를 투여하였다. 이후 요소 용액을 투여하였다(Range 0.01M 내지 0.5M). 마우스를 메타볼릭 케이지(metabolic cage)에 사육하고, 아주레(azure) 염료 배출을 모니터링하여 정량하였다. 여러가지 비율의 수지 및 요소 농도를 테스트하여, 사용되는 최적 조합을 검증하였다.
실시예 10: 전달 제형
전달 형태로, 본 실시예에서는 에어로졸 스프레이 조제물을 제공하는 것과 같은 본 발명의 이용성을 기술한다. 이러한 일부 예들에서, 에어로졸 스프레이는 적합한 추진제를 사용하여 가압 팩 또는 분무기의 형태를 취할 수 있다. 가압 에어로졸 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 측정할 수 있다. 제형은 흡입에 의한 투여용 분말로서 제조된다. 흡입에 의한 투여는 또 한 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 원자화 용액(atomizing solution) 또는 현탁액에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 정맥내 조제물로서 개체에 투여하기 위한 경구 소화용 액체 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 여러가지 조제물은 적절하다면 추가적인 적합한 약학 보조제를 이용하여, 당업자에게 친숙한 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 헬리코박터 종을 단독으로 또는 그외 적합한 성분과 조합하여 포함하는 것이 이롭다. 상기 단독 또는 헬리코박터 제형의 조합은 본 발명에 따른 약리학적으로 허용가능한 조성물을 포함하는 약리학적 조성물내에 함유될 수 있다. 본원에서 약리학적 조성물은 고형(예, 분말, 입자, 과립, 사케트, 정제, 캡슐 등), 반고형(젤, 페이스트 등), 또는 액체(용액, 분산액, 현탁액, 에멀젼, 혼합물 등) 형태일 수 있으며, 예컨대 위장관 및 위 점막을 통해 투여하기 위해 고안될 수 있다. 따라서, 약리학적 조성물은 사용하기 전에 수계 매질에 분산시키도록 고안된 분말 또는 미립자 형태일 수 있다.
액체 형태의 약리학적 조성물은 헬리코박터 조성물과 예컨대 생리 조건에 순응된 조성물, 예컨대 생리학적으로 허용가능한 용액과 같은 전해액을 포함하는 분산액 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약리학적 조성물은 다른 치료학적, 예방학적 및/또는 진단학적으로 활성인 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 제1 및 제2 용기를 포함하는 약학 키트에 관한 것으 로, 제1 용기는 본 발명에 따른 플라스미드 및/또는 플라스미드 벡터를 포함하는 재조합 헬리코박터 조성물을 포함하며, 제2 용기는 헬리코박터 조성물에 대한 분산 매질을 포함하며, 사용하기 전에 상기 분산 매질에 상기 헬리코박터 조성물을 투여 및/또는 투약하기 위한 설명서가 수반된다.
상기 키트에 함유된 본 발명에 따른 헬리코박터 조성물은 분말 또는 미립자 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 약학 키트는 헬리코박터 조성물을 분산 매질중에 분산한 후 투여하는 과정의 시간 간격에 대한 추천사항이 기재된 설명서를 포함할 수 있다.
실시예 11: 헬리코박터 백신 조제물을 이용한 면역 조절
TH1 반응(T-헬퍼 세포 타입 1)은 세포 매개성 반응이다. 상기 반응의 과도한 활성은 류마티스 관절염(RA) 및 루푸스와 같인 질환의 원인으로 추정된다. 대조적으로, TH-2는 백신의 특징적인 항체 타입의 혈청 반응이다. 본 실시예는 본 발명에 따라 헬리코박터 기반의 백신 치료 조제물을 처리하였을때 동물에서 TH-2 타입의 반응을 얻기 위한 기법을 제공함에 있어서의 본 발명의 이용성을 기술한다.
헬리코박터 필로리가 항체 반응(TH2)를 형성하지만, 최근에는 위 점막에서의 주된 반응은 TH1 세포 매개 반응일 수 있다. 따라서, 본 발명은 동물의 점막에 제공되었을 때 2가지 타입의 면역 반응을 제공할 수 있는 것으로 생각된다.
본원에서, 헬리코박터 벡터 및 벡터 플라스미드 시스템을 사용하여, 동물에서 항체 반응을 유발할 수 있다. 예컨대, 박테리아, 클로스트리듐의 형질전환을 위해 제공된 구조체에서 유전자 발현 카세트를 이용하는 시스템, 이후 형질전환된 클로스트리듐의 표면으로부터 단백질(S-layer 단백질)의 분비, 점막 백신접종 개시가 WO0194599에 개시되어 있으며, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 발명에 포함된다. 이들 구조체는 또한 ORF1, ORF3, ORF5-7, ORF7 또는 ORF11 중에서 선택된 분비 리더 서열을 포함할 수 있다.
일부 백신 예에 있어서, 헬리코박터 기반의 벡터 및 벡터 플라스미드는 박테리아 표면 층 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 표면 층 단백질은 본원에서 단백질(proteinaceous) 특성의 임의 분자로서 정의되며, 예컨대 단백질, 당단백질 또는 박테리아의 외막에서 형성되고 박테리아의 막에 노출될 수 있는 리포단백질을 포함한다. S-층 단백질은 세포에서 다른 단백질 클래스 보다 다량으로 연속적으로 및 자발적으로 생산될 수 있다.
S-층 단백질을 가지는 그람 음성 숙주 세포, 클로스트리듐을 포함하는 재조합 세포 조제물의 제조 공정은 또한 WO-97/28263에 개시되어 있다. 공정은 변형될 수 있으며, 이후 본원에 기재된 과정에 따라 본 발명의 헬리코박터 구조체의 일부로서 S-단백질을 병합할 수 있다.
따라서, 일부 벡터 및 벡터 플라스미드 구조체에서, 대상 비-헬리코박터성 약학적으로 활성인 분자와 헬리코박터 서열을 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 본 발명의 헬리코박터 구조체를 채택하고 있는 백신의 면역원성을 증강하기 위해, 융합 단백질의 헬리코박터 서열은 S-층 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 융합 단백질의 일부로서 S-층 단백질을 포함하는 바실러스 구조체는 바실러스 표면 에 S-층 단백질을 발현하는 것으로 보고되었으며(WO-95/19371, Bacillus sphaericus), 따라서 조제물의 면역원성을 증강시킨다.
점막 면역화는 이미 일부 질환에 대해 제공되고 있으며, 그 예로 경구 폴리오 백신과 콜레라와 E. coli에 의한 설사에 대한 경구(음용의) 백신(불활성화 백신)이 있다. 일부 예들에서, 본 발명의 백신은 불활성화된 백신을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명은 단회 투여를 제공하며, 운반 유기체, 헬리코박터가 계속적으로 항원, 즉 대상 비-헬리코박터성 약리 활성 분자를 계속적으로 생산하므로, 장기간 백신 효과가 지속되고(vaccination), 생체내 부스트 면역될 수 있는 생백신을 포함한다. 또한, 백신은 보강제와 병용 투여될 것이다. 이러한 보강제는 투여된 부분의 제거가 강한 부위를 서행시킴으로써 백신 노출 시간을 증가시키는 알루미늄 하이드록사이드나 지질 소포와 같은 분자를 포함한다. 또한, 보강제는 사이토카인 및 케모카인이라고 하는 면역조절 펩타이드의 생산을 유발함으로써 작용한다(Brewer et al. 1997, J. Cytokines Cell Mol. Ther., 4:223-246). 따라서, 본 발명의 백신은 면역 반응을 강화하기 위해 사이토카인 보강제를 포함할 수 있다. 인간 또는 동물과 같은 포유류에 경구 또는 위에 투여하였을때, 형질전환된 헬리코박터 또는 E. coli 박테리아는 위장에 집락화되고, 본래 집락화되는 부위인 위벽 도처에 원하는 폴리펩타이드가 생산 및 존재될 것이다. 위장관은 다양한 타입의 면역 반응 증가에 특수화된 거대한 면역 장치에 의해 둘러싸여 있다. 따라서, 재조합 헬리코박터 백신이나 펩타이드 생산 균주에 의한 위장 집락화는 전통적인 백신접종보다 장기간 면역을 자극할 수 있다. 부가적으로, 항원은 장벽이나 루멘에 선호적으로 존재될 수 있다.
실시예 12: 헬리코박터 및 그것의 식욕 억제제로서의 용도
본 실시예는 식욕 억제를 제공하는 조제 및 치료 요법에 헬리코박터를 채택하는 방법으로서, 본 발명의 이용성을 설명한다. 특히, 약독화된 헬리코박터와 그렐린 또는 그렐린 작용제의 수준을 조절하는 대상 비-헬리코박터의 약리학적으로 활성인 분자와 함께 포함하는 구조체를 장 점막에 전달하는 것은, 식욕과 정신을 조절하는 장-뇌 축의 억제를 제공하는 유효한 수단을 제공하는 것으로 예상된다.
연구를 통해, 그렐린이 식욕 자극제인 것으로 시사되며, 즉 그렐린이 마우스에서 식품 섭취를 증가시킨다(Asakawa et al. 2003, Gut, 52(7):947-52). 또한, 그렐린은 설치류의 지방 조직에서의 지방 이용성을 감소시키고(Tschop et al., 2000, Nature, 407: 708-13), 랫의 지방세포 형성(adipogenesis)에 관여하는 것으로 보고되었다(Choi et al. (2003), Endocrinology, 144 (3):751-9). 또한, 그렐린은 영양분 이용성이 낮을 때 개체의 음식 섭취를 촉진시키는 공복 신호인 것으로 보고되었다.
그렐린 유사체 및 핵산 구조체에 대한 미국 특허 6,967,237 - Bednarek(2005)에 기술된 내용과, 그렐린-캐리어 접합체에 대한 미국 특허 공개공보 20050191317에 기술된 내용은, 원용에 의해 이러한 보충적인 내용의 범위내에서 본 명세서에 명백하게 포함되며/되고, 본 발명에 대한 이해와 인식을 더욱 강화한 다.
성장 호르몬 분비 촉진 리셉터(growth hormone secretagogue receptor (GHS-R))에 대한 내인성 리간드인 그렐린은, 투여량 의존적인 양식으로 배양된 뇌하수체 세포로부터 성장 호르몬(GH) 분비를 자극하며, 주로 위 바닥(gastric fundus)의 산분비선(oxyntic gland)에서 발견되는 A 유사 세포에서 생산 및 분비된다. 그렐린은 현재 GH 분비 뿐만 아니라 식욕 및 체중을 조절하는데 작용하는 것으로 알려져 있다.
비경구 및 뇌실내(intracerebro)- 심실 투여된 그렐린은 식품에 자유롭게 접근할 수 있는 상태에서 GH 결핍된 경우에서도 마우스와 랫의 식품 섭취를 자극하고 체중을 증가시키는 것으로 확인되었다. 식욕 및 체중 조절은 GH 분비와는 독립적일 수 있다.
28개의 아미노산 펩타이드인 그렐린은 이의 3번째 세린 잔기가 n-옥타노익산에 의해 아실화되었을때 활성화되며, GHS-R은 전체 그렐린 펩타이드의 옥타닐화된 세린 잔기를 포함하는 첫번째, 네번깨 또는 다섯번째 잔기에 반응성을 갖는다. GHS-R은 뇌하수체, 시상하부, 부신, 갑상선, 이자, 심근, 비장 및 고환에 존재하는 것으로 확인되었다. 그렐린은 시상하부에서 NPY 및 AGRP mRNA의 발현을 자극한다. 그렐린의 중추 식욕유발(orexigenic) 효과는 시상하부의 NPY/AGRP-발현 신경에 의해 매개된다. 또한, 그렐린은 미주신경 구심 활성(vagal afferent activity)을 억제하는 것으로 보고된 바 있다. 그렐린의 말초 식욕유발 효과는 적어도 일정 부분 이상으로 미주신경 구심 활성에 대한 억제 효과에 의해 매개될 수 있다. IL-1β는 렙틴의 발현 및 분비를 자극함으로써, 및/또는 렙틴으로부터 과도한 음성적인 피드백 시그널링의 시상하부에 대한 효과를 모방함으로써, 악액질(cachectic) 과정을 매개하는, 전염증성 사이토카인이다.
그렐린 길항제가 동물의 장 점막에 제공된다면, 동물의 식품 섭취를 감소시키고, 체중 증가를 감소시킬 것으로 제시된다.
실시예 13: 세포 쇠퇴를 수반하는 암 및 AIDS
본 실시예는 세포 쇠퇴, 특히 AIDS 및 암의 질환 상태와 관련있는 세포 쇠퇴를 예방 또는 저해하는, 조제물로서 이용하기 위한 본 발명의 이용성을 설명한다.
악액질은 쇠퇴, 쇠약, 연약, 영양 실조(inanition)를 특징으로 하는 증상이다. 이는 최근 암 악액질 마우스 모델에서 그렐린 펩타이드 및 그렐린 mRNA 모두의 수준이 위에서 상향 조절된 것으로 보고되었다. IL-1β의 혈장 수준이 증가된 악액질 마우스에서, 그렐린의 농도 역시 악액질의 진행에 따라 증가되었다. 이러한 결과는, 그렐린 동태 및 IL-1에 의해 매개된 악액질 과정 사이에 밀접한 관계가 존재하는 것으로 시사한다. IL-1β는 CCK, 렙틴, 게스트린 관련 단백질 및 봄베신(bombesin)과 같은 식욕 억제성 물질이며, 그렐린의 작용을 길항한다.
Asakawa 등은 비경구 투여한 IL-1β가 시상하부에서의 NPY mRNA 발현과 위에서의 프리-프로그렐린 mRNA 발현을 억제하며, 복막내 투여한 그렐린은 심각한 IL-1β-유발성 식욕 감퇴를 저해하는 것으로 보고하였다.
헬리코박터 필로리 감염은 위염, 위궤양 질환 및 위 악성 종양의 발병에 주 된 병원성 인자인 것으로 알려져 있다. 헬리코박터 필로리가 위의 점막에 부착되면, IL-1β를 포함한 다양한 사이토카인의 분비와 관련있는 염증이 유발된다.
헬리코박터 필로리 근절은 종종 체중, 혈청내 총 콜레스테롤, 총 단백질 및 알부민 수치와 같은 일부 영양성 파라미터의 개선을 이끄는 것으로 임상적으로 관찰되고 있다. 헬리코박터 필로리 감염은 몽골리아 저빌(Mongolian gerbil)에서의 혈장 및 위의 그렐린 동태를 변형시킬 수 있는 것으로 보고되고 있다. 그러나, 인간에서는, 헬리코박터 필로리의 근절이 혈장내 그렐린 수치의 증가와 관련있는 것으로 일부 관찰되었지만, 헬리코박터 필로리 감염은 혈장내 그렐린 수치의 어떠한 변화와도 관련성이 없는 것으로 보고되고 있다.
헬리코박터 필로리를 캐리어로서 사용하여, 위 점막에 예컨대 캐리어 비히클로서 작용함으로써, 이를 필요로하는 환자에게 아밀린을 제공할 수 있는 것으로 추측된다. 일부 예에서, 헬리코박터 캐리어는 아밀린, 아밀린 작용제, 유사체 및 유도체, 및 아밀린 작용제(칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 포함), 및 그 유사체를 포함하여 그렐린 수준을 감소시킬 것으로 이해될 것이다.
아밀린 길항제는 그렐린 수치를 증가시킬 수 있다. 아밀린, 아밀린 작용제, 아밀린 길항제, 또는 항체와 같은, 아밀린의 유효 수준을 감소시키는 그외 유사 화합물을 이용하여 아밀린의 유효 수준을 조정하여, 길항제 및 항체, 그렐린 분비를 저해 또는 자극할 수 있다. 따라서, 상기 방법의 일부 예는 체내 아밀린 또는 아밀린 작용제의 유효 수준을 증가시킴으로써, 직접 또는 간접적인 수단에 의해, 또는 아밀린 길항제를 이용하여 아밀린의 유효 수준을 낮춤으로써 또는 아밀린 생산 을 저해함으로써, 그렐린의 내인성 수준을 조정한다.
실시예 14: 고셰병의 치료
본 실시예는 고셰병과 같은 효소 결핍증으로 유발되는 질환의 치료제로서 사용하기 위한 본 발명의 이용성을 설명한다. 고셰병은 가장 일반적인 인간의 리소솜 축적 질환(lysosomal storage disorder)이며, 글루코세레브로사이드(GC)라는 효소의 결핍에 의해 발생된다(Nolta et al., (1992), J. Clin. Invest. 90 (2):342-348).
효소 치환 요법은 화학 샤페론을 코딩하는 서열을 포함하는 헬리코박터 백신 구조체와 함께 제공된다(Sawker et al., (2002), PNAS USA 99(24): 15428-15433). 따라서, 기능적인 β-글리코시드(β-Glu, 글루코세레브로사이드)의 증강된 수준을 수득할 수 있다. 특히, 화학 샤페론 데옥시노기리마이신(NN-DNJ)은 헬리코박터 필로리 구조체에서 사용되며, 환자에게 경구 또는 위내로 투여될 수 있다.
방법의 또다른 예의 일부로서, 이 경우, 글루코세레브로사이다제(GC)를 코딩하는, 비-헬리코박터성 약학적으로 활성인 대상 분자를 가지고 있는 벡터를 포함하는 본 명세서에 기술된 헬리코박터 기반의 구조체를 제공한다. 배양된 고셰 골수에 글루코세레브로시다제의 레트로바이러스 매개 전달 방법은 Nolta et al. (1992)에서 고셰 질환을 치료하는 한가지 방법으로서 개시되어 있다. 그러나, 이러한 방법은 매우 침투적이다. 결핍성 효소, 글루코세레브로시다제에 대한 코딩 서열을 포함하는 본 발명의 헬리코박터를 토대로한 구조체를 채택하는 다른 효소 치환 요 법은, 이러한 요법에 비해 보다 더 매력적이고 저렴한 대안책이다.
실시예 15: 림프종의 치료
본 실시예는 본원에서 헬리코박터 벡터 및/또는 플라스미드 벡터를 포함하는 백신 접종 조제물을 이용하여, 림프종, 특히 MALT 림프종과 같은 박테리아 유발성 악성 종양을 치료 및/또는 저해하는데 적합한 이용한 조제물을 제공하기 위한 본 발명의 이용성을 설명한다.
Sutton et al.(2004)(Vaccine, 22 (20): 2541-6)은 헬리코박터 펠리스(Helicobacter felis)에 대한 동물의 백신접종/면역화 결과로서, 박테리아 유발성 악성 종양, 특히 원발성 위 MALT 림프종에 대한 방어를 보고하였다.
헬리코박터 필로리를 제외한 대상 면역성 항원을 포함하는 면역화 조제물을 제공하기에 적합한 벡터 및/또는 플라스미드 벡터를 포함하는 본 발명의 개시된 헬리코박터 필로리 구조체를 사용하여, 박테리아 유발성 악성 종양, 특히 원발성 위 MALT 림프종에 대한 백신접종 예방을 제공할 수 있다. 예컨대, 플라스미드 벡터의 일부 예들은 헬리코박터 필로리 코딩 서열 및 비-헬리코박터 필로리성 즉, 예컨대 헬리코박터 팰리스 항원 종 이외의 종의 코딩 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함할 것이다.
실시예 16: 헬리코박터 필로리를 이용한 생 백신 전달 시스템
본 실시예는 생백신에서의 헬리코박터 필로리의 이용, 특히 동물의 위 점막 에 대상 단백질을 전달하기 위한 생바이러스 조제물의 일부분으로서의 헬리코박터 필로리의 사용을 설명한다. 특히, 본 실시예는 재조합 헬리코박터 필로리 외막의 외표면을 통해 동물의 위 점막에 대상 항원을 전달하는 본 발명의 이용을 기술한다.
본 연구는 헬리코박터 필로리 균주 B128, 변이체 7.13 (Franco et al. (2005)를 이용하여 먼저 수행되었다. 슈크로스 민감성 및 카나마이신 내성을 부여하는 sacB 카세트를 헬리코박터 필로리의 hopE 유전자에 삽입하였다.
헬리코박터 필로리는 백신을 전달하기 위한 유용한 비히클인 것으로 본 명세서에 기술되어 있으며, 동물, 특히 인간을 치료하기 위한 개선된 박테리아성 전달 방식을 제공한다. 인간 치료에 있어 헬리코박터 필로리 기반의 백신의 이용을 확립하는데 있어 중요한 인자는 다음과 같다:
1. 헬리코박터 필로리에 감염된 대부분의 개체가 무증상이며;
2. 헬리코박터 필로리 감염이 후천성 및 선천성 면역 반응 둘다를 유도하며;
3. 헬리코박터 필로리 감염이 위 점막에서 계속 유지하여 항원에 대한 장기 노출을 용이하게 하며;
4. 헬리코박터 필로리 감염이 위 상피를 파괴하는 분자를 생성하여, 점막하 면역 시스템에 박테리아의 노출을 용이하게 하며;
5. 헬리코박터 필로리에 대한 게놈 데이타 및 분자 기법을 쉽게 이용할 수 있어, 유전자 조작이 용이하다.
HopE는 헬리코박터 필로리의 외막 단백질이다. 본 실시예는, 대상 분 자("X")를 코딩하는 바람직한 서열을 포함하도록 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 변형될 수 있으며, 변형된 HopE - 서열을 포함하는 헬리코박터 필로리를 이후 대상 분자("X")를 동물의 점막 표면에 전달하기 위한 백신에 사용할 수 있다.
본 실시예에서, p60 단백질 및 HCCA 단백질을 사용하여 전달 원리를 입증하고, 이러한 조작된 헬리코박터 필로리 HopE 유전자를 제공하도록 사용할 수 있는 단백질들에 대한 간단한 예이다.
방법:
박테리아 균주 및 배양
헬리코박터 필로리 균주 B128(7.13) (52) 또는 26695 (64)를 5% 말 혈액이 보충된 콜럼비아 아가에서 배양하고, 37 ℃에서 미세호기 조건(10% CO2)에서 인큐베이션하였다. 자연적인 형질전환에 의해 헬리코박터 필로리를 형질전환시켰다(65, 66). 형질전환체는 클로람페니콜(10 ㎍/mL) 또는 카나마이신(10 ㎍/mL)을 이용하여 선별하였다. E. coli DH5-α(67)를 LB(LuriaBertani) 배지에서 37 ℃에서 배양하고, 전기충격에 의해 형질전환시켰다(68). 형질전환체는 5% (w/v) 슈크로스, 카나마이신(50 ug/mL) 또는 암피실린(100 ug/mL)을 이용하여 선별하였다. 그 후, DNeasy Tissue Kit (Quiagen)로 게놈 DNA를 추출하였다. 플라스미드 추출은 QlAprep Spin Miniprep Kit (Quiagen)를 이용하여 수행하였다.
재조합 DNA 분자의 구축
중첩 연장 PCR에 의한 스플라이싱(SOE: splicing by overlap extension)을 이용하여 각각의 PCR 산물들을 조립하여, 재조합 DNA 분자를 구축하였다(69). 프라이머는 PCR하는 동안에 산물들이 서로 연결가능하게 하는 PCR 산물의 말단 12 bp의 중첩을 도입하도록 설계하였다(도 8). 예비 증폭은 Pwo 중합효소(Roche Pharmaceuticals)를 이용하여 수행하였다.
HopE에 클로람페니콜 내성 유전자를 삽입하기 위한 재조합 DNA를 제조하였다. hopE의 섹션, 및 연장 상류를 포함하는 부분은 프라이머 HopEF3 및 HopER3(산물 A)을 이용하여 증폭시켰다. opa 프로모터와 클로람페니콜 내성 유전자는 프라이머 CATF 및 CATR (산물 B)를 이용하여 pHe12 (70)로부터 증폭시켰다. hopE의 섹션, 및 연장 하류를 포함하는 부분은 프라이머 HopEF4 및 HopER5를 이용하여 증폭시켰다. 산물, A, B 및 C를 프라이머 HopEF3 및 HopER5를 이용하여 Chalker 등이 기술한 바와 같이 서로 연결시켰다(69).
대립유전자 치환은 sacB를 이용한 선별 시스템으로 수행하였다(71). 슈크로스 민감성과 카나마이신 내성을 부여하는 sacB 카세트를 대상 유전자에 삽입하였다. 재조합 DNA는 슈크로스-민감성 헬리코박터 필로리에 형질전환시켰다. 형질전환체는 DNA 형질전환에 의한 sacB 치환의 결과로, 슈크로스 내성을 보였다.
sacB 카세트를 여러 단계로 hopE DNA에 연결하였다. 먼저, hopE 유전자를 프라이머 HopEF6 및 HopER6을 이용하여 증폭하였다. 증폭산물을 정제하여 NcoI 및 BglII(Roche Pharmaceuticals)으로 절단하였다. 증폭 산물과 동일하게 절단한 pBADMyc-HisB(Invitrogen Life Technologies)를 Quick-stick Ligation Kit (Bioline)를 이용하여 연결한 다음, 플라스미드 pBAD1을 생산하는 E. coli에 형질전 이하였다. 다음으로, hopE와 하류에 위치한 marW 추정 유전자(5-S-아데노실메틸트랜스포라제 코딩) 사이에 있는 804 bp의 영역을 포함하는 DNA 영역을 프라이머 HopEF7 및 HopER7로 증폭하였다. 정제한 증폭 산물을 BglII 및 XbaII로 절단하고, 동일하게 절단한 pBAD1과 연결한 다음, E. coli에 형질전이시켜, 플라스미드 pBAD2를 제조하였다. 마지막으로, sacB 카세트를 프라이머 KanSacF 및 KanSacR을 이용하여 pENKSF (59)로부터 증폭하였다. 증폭산물과 pBAD2를 BglII로 절단하여 연결한 다음 E. coli에 형질전이시켜, 플라스미드 pBAD3을 제조하였다.
마찬가지로, sacB 카세트를 cagA 및 vacA에 삽입하였다. cagA의 경우, 첫번째 단계에서, cagA 바로 하류 영역을 프라이머 cagAF2 및 cagAR2를 이용하여 증폭하고, Xbal 및 Bglll로 절단하였다. 두번째 단계에서, 3' 말단까지 이어지는 섹션을 프라이머 cagAF1 및 cagAR1으로 증폭하여, Bglll 및 Ncol으로 절단하였다. 마지막 단계에서, sacB 카세트를 pBAD3에서 BgIll를 이용하여 적출하여, 동일하게 절단한 pBADMyc-HisB에 삽입하였다. vacA의 경우, 첫번째 단계에서, vacA의 C-말단 영역을 포함하는 섹션을 프라이머 vacAF4 및 vacAR4를 이용하여 증폭하고, Hindlll 및Xbal로 절단하였다. 단편을 동일하게 절단한 pUC19에 클로닝하여 pUC1을 제조하였다. 두번째 단계로, vacA 의 N-말단 영역을 포함하는 DNA 섹션을 프라이머 vacAF3 및 vacAR3을 이용하여 증폭하고, EcoRl 및 Kpnl로 절단하였다. 단편을 동일하게 절단한 pUC1에 클로닝하여 pUC2를 제조하였다. 마지막으로, sacB 카세트를 프라이머 KanSacF 및 KanSacR을 이용하여 증폭시키고, BgIll로 절단하여 pUC3을 제조하였다.
C형 간염 코어 항원(HCCA) 또는 L. monocytogenes p60 단백질의 항원 부분을 코딩하는 DNA를 hopE에 삽입하여 sacB 카세트를 치환하기 위해, 재조합 분자를 구축하였다. 재조합 DNA는 SOE PCR을 이용하고, PCR 산물 A, B 및 C를 연결하여 제조하였다. hopE에서부터 nt573까지의 영역을 프라이머 HopEF8 및 HopER1 (산물 A)로 증폭하였다. aa 7-53으로부터 HCCA 항원을 코딩하는 서열 영역을 프라이머 HCCAF1, HCV.2a, HCV3.s, HCCAR1 (산물 B)으로 증폭하여 제조하였다. hopE nt 573 하류 영역을 프라이머 HopEF2 및 HopER8 (산물 C)로 증폭하였다. SOE PCR로 제조되는 산물을 플라스미드 pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen Life Technologies)에 클로닝하여, pCR4HCH를 제조하였다.
유사하게, p60 항원의 DNA 코딩 섹션을 hopE 및 cagA에 삽입하였다. hopE의 경우, hopE에서 시작하여 nt573까지의 영역을 프라이머 HopEF8 및 HopER9(산물 A)를 증폭하였다. p60 항원을, 프라이머 Lmp60F2 및 Lmp60R2(산물 B)를 어닐링하에 제조하였다. hopE 바로 하류 영역 nt 573을 프라이머 HopEF9 및 HopER8(산물 C)을 이용하여 증폭하였다. SOE PCR로 제조되는 산물을 Smal 절단한 pUC19 플라스미드에 클로닝하여 pUCHLm을 제조하였다. cagA의 경우, cagA의 3' 말단을 포함하는 영역을 프라이머 CagAF6 및 CagER6(산물 A)으로 증폭하였다. p60 항원은 프라이머 Lmp60F2 및 Lmp60R2(산물 B) 어닐링에 의해 제조하였다. cagA 바로 하류 영역을 cagAF6 및 cagAR8(산물 C)을 이용하여 증폭하였다. SOE PCR로 제조되는 산물을 Smal 절단한 pUC19 플라스미드에 클로닝하여 pUCCLm을 제조하였다.
vacA에 대해서는, 유전자 프로모터 및 신호 서열 등의 vacA 영역을 균주 26695로부터 프라이머 vacAF1 및 vacAR1(산물 1)을 이용하여 증폭하였다. p60 항원은 프라이머 Lmp60F3 및 Lmp60R3(산물 B) 어닐링에 의해 제조하였다. 오토트랜스포터 및 성숙 VacA를 코딩하는 영역을 포함하는 vacA 섹션을 vacAF2 및 vacAR2(산물 C)를 이용하여 증폭하였다. SOE PCR로 제조되는 산물을 Xbal 및 Kpnl로 절단하고, 동일하게 절단한 pUC2에 클로닝하여 pUCVLm을 제조하였다.
웨스턴 블롯 분석
재조합 박테리아가 HopE 및 항원성 에피토프간의 융합을 만드는지를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
24 h 혈액 아가로부터 헬리코박터 필로리를 HEPES (pH 7.4)로 수확하고, 5분간 4500 rcf로 원심분리하여 펠렛화한 다음 음파 처리로 파괴하였다. 용혈물을 5분간 4500 rcf로 원심분리하여, 용혈되지 않은 박테리아는 펠렛화하여 제거하였다. 전체 막 분획을 회수하기 위해, 상층물을 60분간 100 000 rcf로 원심분리하였다. 모든 과정은 4 ℃에서 수행하였다. 샘플을 HEPES 완충액에 재현탁하고, 동량의 Laemmli 완충액에 첨가하였다. 소듐 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(PAGE)에 의해 12% Tris-HCI Ready Gel (BioRad)에서 단백질을 분리시킨 후, 0.45 pM 니트로셀룰로스(Biorad)에 전기-이동시켰다. HopE와 다른 단백질들을 검출하기 위해, 막을 Tris 완충 염수(TBS) pH7.4 중에서 10% 또는 5% NFDM(non-fat dairy milk)로 블롯킹하였다. 막을 1차 항체나 2차 항체로 TBS 중의 1% NFDM 내에서 프로브 반응시켰다. 다클론 토끼 항-HopE 항체를 기증받아(Astra Zenica), 2:4000 희석으로 사용하였다. 단일클론 마우스 항-p60 (K3A7)를 기증받아 (University of Wurzburg, Germany), 2:4000 희석율로 사용하였다. 마우스 항-HCCA(C7-50; Sigma)는 희석율 2:4000로 사용하였다. 이차 항체는 알칼리 포스파타제에 접합되어 있어, 니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드/5-브로모-4-클로로 3-인돌릴 포스파타제 용액(Roche Applied Science)을 이용하여 검출하였다.
표면 국지화의 면역성 분석
헬리코박터 필로리를 24 h 혈액 아가 플레이트에서 PBS(pH 7.4)로 회수하였다. 박테리아를 총 3번 세정하고, OD (600nm) 0.5로 표준화하였다. 세정한 박테리아를 폴리-L-라이신 코딩된 챔버 슬라이드에 하룻밤 동안 4 ℃에서 결합시켰다. 결합된 박테리아를 0.25% 글루타르알데하이드와 함께 고정한 다음, 100 mM 글리신 완충액으로 더욱 블롯킹하였다. 단계들 사이에, 슬라이드는 0.05% Tween 20 (PBST)를 포함하는 PBS로 3번 세정하였다. 슬라이드를 37 ℃에서 2시간 동안 PBST 중에서 3% 소 혈청 알부민(BSA)로 블롯킹하였다. 일차 항체를 1% BSA가 포함된 PBST 중에서 1:200으로 희석하고, 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. Alexafluor 488가 접합된 이차 항체를 PBST에서 1:400으로 희석하고, 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 헹구고, 표면에 결합된 항체를 형광 현미경으로 검출하였다. 세포 기반의 ELISA는, 하기 사항을 제외하고는 간접 면역-형광실험과 유사하게 수행하였다: 박테리아를 하룻밤 동안 또는 4 ℃에서 한시간 동안 Maxisorp (Nunc) 플레이트에 결합시키고; 일차 항체는 1:300으로 희석하여 사용하고; 알칼리 포스파타제가 접합된 이차 항체는 1:1000으로 희석하여 사용하고; 니트로페닐 포스페이트(Sigma)를 마이크로타이터 플레이트 리더를 이용하여 405 nm 에서 검출하기 위한 기질로서 사용하였다.
결과
재조합 헬리코박터 필로리 의 구축
hopE, cagA 또는 vacA 유전자 중 어느 하나에 sacB 카세트를 가지고 있는 재조합 헬리코박터 필로리 B128 (7.13) 또는 26695를 제조하였다. 이들 유전자내 특정 위치에서 sacB 카세트를 DNA 코딩 항원과 치환하였다. 추정상의 루프 구조를 보이는 영역내, 성숙형 HopE의 아미노산 168번에 해당되는 위치에서 HCCA 및 p60 항원 DNA를 hopE에 삽입하였다(51). 또한, p60 항원 DNA도 CagA의 C-말단에 해당되는 cagA 정지 코돈의 바료 상류에 삽입하였다. VacA와 항원성 단백질의 융합은 VacA를 생산하지 않는 균주 B128 (7.13)에서 수행하였다. p60 항원 DNA를 26695 프로모터, 신호 서열 및 오토트랜스포터 DNA에 연결한 다음, B128 (7.13) vacA에 삽입하였다.
융합 단백질 및 표면 제시 분석
지금까지, HCCA 또는 p60 항원에 융합된 HopE만 분석하였다. hopE에 삽입된 HCCA(B128:HCCA:hopE) 또는 p60 항원(B128:p60:hopE) DNA를 생산하는 H. pylori B128을 웨스턴 블롯 분석한 결과, 항원이 HopE에 융합된 것으로 확인되었다(도 9). 특히, 항-HopE 항체를 이용하여 수행한 분석으로, 재조합 헬리코박터 필로리 천연 HopE(약 31 kDa)가 p60 항원(약 32 kDa) 또는 HCCA(약 35 kDa) 중 어느 하나에 융합된 HopE로 치환된 것으로 확인되었다. 항원 특이적인 항체를 이용한 추가적인 분석으로 유사한 크기의 단백질들이 검출되었다.
표면 제시를 조사하기 위해, 표면 국지화에 대한 2가지의 간접 면역 분석을 채택하였다. H. pylori B128:HCCA:hopE를 면역형광 현미경으로 분석한 결과, HCCA에 융합된 HopE의 표면 제시가 확인되었다(도 10). 그러나, p60 항원이 융합된 HopE의 표면 국지화는 확인되지 않았다. 이러한 결과들은 세포 기반의 ELISA 분석에 의해 검증되었다(도 11B). p60 항원은 박테리아를 ELISA 플레이트에 하룻밤 동안 결합시킨 후, 이러한 방법에서만 검출되었다(도 11A).
본 실시예에서의 연구는 헬리코박터 필로리 균주 B128, variant 7.13 (Franco, 2005)(52)에서 우선적으로 수행되었다. 슈크로스 민감성과 카나마이신 내성을 부여하는 sacB 카세트를 헬리코박터 필로리의 hopE 유전자에 삽입하였다. HCCA 또는 p60 내성을 코딩하는 DNA를 SOE PCR을 이용하여 hopE에 연결시켰다. 재조합 DNA는 자연적인 형질전환과 상동 재조합으로 슈크로스 민감성 헬리코박터 필로리에 형질전이시켰다. 재조합 헬리코박터 필로리는 DNA 형질전환으로 인한 sacB 치환의 결과로 슈크로스 내성이었다. 표 1에 나타낸 다음의 올리고뉴클레오타이드 프라이머들을 본원에 기술된 분석들에 사용하였다.
표 1 - 올리고뉴클레오타이드 프라이머:
Figure 112009035098288-PCT00009
표 2 - 사용하고 개발한 헬리코박터 필로리 균주
균주 삽입한 항원 DNA 삽입부 명칭
Figure 112009035098288-PCT00010
헬리코박터 필로리 균주 B128의 자연적인 형질전환으로, 서열 분석에 의해 검증하였을 때 p60 또는 HCCA DNA 중 어느 하나가 융합된 hopE를 생산하는 재조합 박테리아가 만들어졌다. 제조되는 융합 단백질들은 변이되지 않은 HopE 보다 크기가 더 컸다(도 8). 형광 현미경(도 9)을 이용하여 HCCA 표면 국지화를 검증하였고, 세포 기반의 ELISA 분석 결과에 의해 입증하였다.
실시예 17: 유레아제 유전자에서 FlAG TAG 삽입 부위 결정
헬리코박터 필로리 세포 표면이나 분비된 단백질 상에 백신 항원의 제시는 항원 특이적인 예방 면역 반응 개발을 가능하게 할 것으로 생각된다. 본 실험에서는, 단백질 UreA 및 UreB를 제시 분자로 하였다. 이들 분자는 조합하여 다중-서브유닛 효소 유레아제를 형성한다. 여러가지 이유로 유레아제를 선택하였으며, 그 이유는 다음과 같다:
1. 헬리코박터 필로리 단백질들 중 가장 비율이 높은 비율을 차지하며(총 단백질의 >5%);
2. 헬리코박터 필로리 감염 동안에 항원성이며;
3. 구조가 공지되었으며;
4. 활성을 콜로니 색으로 쉽게 검출할 수 있으며;
5. 활성 유레아제는 배양하는 동안에 직접 선택할 수 있으며;
6. 유레아제는 생체내에서 필수적이며, 활성 유레아제의 선별이 가능한 것으로 생각됨.
유레아제 서브유닛들의 조립으로 복합체로 형성되며, 효소가 어떠한 삽입에 허용적일지는 알 수 없다. 이에, FLAG 텍(8 aa)과 나중에 P60 항원(총 31 aa)에 인접한 FLAG 텍을 이용하여 삽입의 초기 허용성을 조사하였다. FLAG는 짧은 면역성 텍으로 이용가능한 상업적인 항체이다. L. monocytogenes p60 단백질은 세포 분열에 필수적인 고면역성의 뮤라인 하이드롤라제이다. 단백질은 리스테리아 spp.에 의해 배양 배지로 다량 분비되며, 크기는 약 60 kDa이며, Iap(감염-연관성 단백질: invasion-associated protein)에 의해 코딩되어 있다. 본 실험에 사용한 p60의 섹션은 p60 단백질의 CD4 T 세포 및 B 세포 에피토프로 구성되며, 표면에 에피토프를 발현하는 살모넬라 균주 백신 접종에 의해 제시되었을 때 뮤라인 리스테리아병에 대한 예방을 부여하는 것으로 알려져 있다.
다른 항원 캐리어로서, 관련있는 HcpA 및 HcpC 단백질 역시 고려될 수 있다. HcpC의 경우 결정 구조가 해명되었다. 이들 분자는 단백질의 Sel-1계 패밀리에 속하는 것으로, 대부분 분비되며, 인간에서 면역 시스템에 의해 "읽혀(seen)"진다. 이들은 박테리아 배양이 필요하지 않으며, 감염 동안에 필요하거나 활력에 기여할 가능성은 조사되어야 할 과제로 남아 있다.
전술한 바를 기반으로, 본 과제의 목적은 FLAG 텍 삽입: 헬리코박터 필로리의 마우스-복제 균주(colonizing strain)에서 유레아제의 허용 부위에 리스테리아 p60 단백질 에피토프 삽입 및 헬리코박터 필로리의 마우스-복제 균주에서 HcpA 및 HcpC의 허용 부위에 리스테리아 p60 단백질 에피토프 삽입의 유레아제 허용 부위를 결정하는 것이다.
방법
박테리아는 일반적으로 혈액을 기본으로 한 배지에서 배양하였다. 사용한 균주는 26695(코돈 43에 rpsL 돌연변이)의 스트렙토마이신 내성(StrR) 변이체와 및 X47(rpsL 코돈 88의 돌연변이로 인해 이미 StrR 내성임)이었다. 유전자 융합에는 Douglas Berg Lab (Washington University)에서 개발한 스트렙토마이신 카운터셀렉션 시스템, 표 3에 기재된 프라이머 및 자연적인 형질전환(도 17)을 사용하였다.
수여체 균주는 rspLermB 카세트를 대상 유전자에 삽입하여 제조하였다(도 14). 상동성 재조합을 위한 FLAG 및 측면 서열을 포함하는 PCR 산물을 이용한 rspLermB 카세트의 치환은 스트렙토마이신 내성과 유레아제 활성을 부여한다. 기능성 유레아제로 형질전환된 형질전환체는 스트렙토마이신, 유레아 및 페놀 레드가 포함된 아가 플레이트로 선별하였다(표 4). 기능성 재조합 유레아제를 생산하는 박테리아만 유레아 플레이트에서 증식할 수 있었다(도 15).
표 3. 본 실험에서 제작한 프라이머, 상류 및 하류는 항원 삽입 부위에 대해 상동적인 영역의 측면 영역의 위치를 나타낸다. 게놈은 5'-3'으로 나타낸다.
Figure 112009035098288-PCT00011
Figure 112009035098288-PCT00012
유레아제에서 부위 8(도 16)을 선택하였고, HcpA 및 HcpC 각각 부위 2는 아 미노산 삽입을 허용할 것으로 보인다(도 12b; 12c). 가능성있는 정지 코돈 3개중 2개를 배제하도록 선택된, 5 또는 6 세미-랜덤 코돈 측면에 바람직한 에피토프(FLAG)를 가지고 있는 PCR 산물을, 2차 PCR에서 함께 스팔라이싱하여, 수여 균주의 DNA 형질전환에 사용하였다(도 13a). p60을 FLAG (p60FLAG)에 인접하게 삽입하는데에도 유사한 방법으로 수행하였다. 그러나, 게놈 주형 DNA은 희석하였고, 제조되는 증폭 산물은 DpnI으로 처리하여 게놈 DNA를 제거하였다(도 13b).
결과
ureA 및 ureB 유전자를 제거하고, 잠재적인 삽입 부위인 3가지의 상이한 그룹에 해당되는 ureA 또는 ureB의 3개의 소형 섹션도 제거하고, Dr. SungSook Choi (Sahmyook University, currently on sabbatical in Berg Lab)에 의해 rpsLermB 카세트로 치환되었다(도 14). 3가지 rpsLermB 삽입체는 ureA 또는 B내에 각 8개 부위에 FLAG 텍을 포함하는 조립된 PCR 산물을 이용하여 DNA 형질전환으로 치환하였다. 이들 PCR 산물을 이용하여 행해진 박테리아 형질전환은 기능성 유레아제 포함된 것을 선별하였고, DNA 서열분석을 통해 3, 4 및 8 부위에 FLAG 텍을 가지고 있는 3가지 삽입체를 검증하였다(도 12a). 유레아제에서 FLAG 텍에 인접하게 8번 부위에 p60 항원을 삽입하기 위해, 조립힌 PCR 산물을 증폭하였고, 그 결과 기능성 유레아제에서 1a, 3 또는 4번 부위에 p60 FLAG 텍을 포함하는 재조합체를 PCR로 검출하여 분리하였다(도 12a).
실시예 18: FLAG -텍 삽입을 위한 헬리코박터 필로리 유레아제의 분석
헬리코박터 필로리의 유레아제 복합체의 3차 구조를, 크리스탈 대칭 조 작(crystallographic symmetry operator)을 적용하여 등재된 좌표(deposited coordinate)(PDB-id: 1e9y)로부터 재구성하였다. 유레아제는 큰 구형 복합체이며, 12 UreA(SwissProt-id: P14916) 및 12 UreB(SwissProt-id: P69996) 폴리펩타이드 체인으로 구성되어 있다(도 16a). 이 복합체는 또한 높은 열 이동성을 보이는 표면에 노출된 루프들에 대해 가시적으로 조사하였다. 도 16b는 열 이동성에 따라 색칠된 분자의 표면을 나타낸 것이다.
육안 조사로, flag-텍(DYKDDDDK 펩타이드) 삽입에 적합한 것으로 보이는 3가지 부위가 확인되었다. 이들 부위는 적합성에 따라 등급이 매겨졌다.
1번 부위 - 이 부위가 가장 적합한 것으로 보인다. UreB에서 잔기 324 - 333은 완전히 용매에 노출되며, 높은 열 가요성(thermal flexibility)(도 16b에서 붉은 표면)을 보인다. 높은 가요성은 유레아제 코어와의 상호작용의 안정화 결핍에 의해 초래되는 것으로 보인다. 따라서, 펩타이드 체인의 구조를 속박하지 않으며, Flag 옥타펩타이드(결정 구조에서 L324는 라이신임)에 대해 UreB(P69996)의 잔기 L324DKSIKEDVQ333를 치환함으로써, 더 큰 삽입체의 삽입을 수용하기에 적합한 것으로 보인다. 루프는 상대적으로 긴 몇가지 치환체이므로, 삽입이 가능하여 테스트하여야 한다. 이러한 루프는 매우 유연하기 때문에, 몇종의 UreB 서열에 현저하게 잘 보존되어 있다. 미확인된 세포 기능에 관여하지 않는다면(예로, 헬리코박터 필로리 세포에 부착), 유레아제의 분자 기능을 파괴하지 않아야 한다.
2번 부위 - UreA (P14916)의 잔기 H224GAKSDDN231은 Flag 옥타펩타이드에 대한 치환에 적합하지만, 이 루프는 3중 대칭축(three-fold symmetry axis)에 가까이 위치되어 있기 때문에 예컨대 C형 간염 막 단백질과 같이 보다 큰 단편의 삽입에는 적합하지 않은 것으로 보인다. 이 루프는 UreA C-말단에 근접하게 위치되어 있으며, 용매에 노출된다. 따라서, 돌연변이는 유레아제 활성에 영향을 미치지 않아야 한다. N231과 UreA C-말단 사이에 있는 아미노산 7개는 대칭에 관여하는 서브유닛과 상호작용한다. 이에, 다중 서열 정렬에서 UreA C-말단이 낮은 서열 보존성을 가지고 있더라도 이들 잔기를 유지할 것이 권고된다.
3번 부위 - 또한 UreA의 잔기 E101ANGKLV107은 DYKDDDDK로 치횐할 수 있다. 이 루프는 놓은 열 가요성을 보이기 때문에, 하나의 부가적인 아미노산의 삽입은 전체 구조에 허용적이어야 한다. 다중 서열 정렬로, 이 루프가 여러 종으로부터 유래된 UreA 상동체에 삽입체를 포함하고 있는 것으로 나타난다.
이들 부위들은 HP 유레아제 구조만을 근거로 최상인 것으로 생각된다. 이들 부위는 다른 박테리아로부터 유래된 상동성 유레아제 구조 상에 HP 유레아제 구조를 겹쳐, 이를 토대로 살펴보았다. 이러한 겹침은 에피토프 삽입에 유용할 수 있는 가요성 표면 루프들로부터 이를 구별하고 견고하며 잘 보존된 부위를 파악하는데 유용하다. 모두 다소 비슷한 유레아제 구조는, 기능 제한으로 인해 구조적 유연성이 낮음을 나타낸다. 그러나, 겹침으로 1번 내지 3번 부위, UreA C-말단 및 UreB N-말단이 텍을 수용하는데 적합한 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명자들은 벡업으로서 간주되어야 하는 UreB 상에 3개의 부가적인 부위를 발견하였다.
넘버링은 SwissProt entry P69996을 참조한다:
4번 부위(UreB).NNPSKEE(65) NNNNNN DYKDDDDK NNNNNN L(66)DLIIT...
5번 부위 (UreB).HIEVNPE(541) NNNNNN DYKDDDDK NNNNNN T(542)YHVFV...
6번 부위(UreB).YHVFVDG(549) NNNNNN DYKDDDDK NNNNNN K(550)EVTSKP...
N-말단과 C-말단에 자유자재로 접근할 수 있으므로, C-말단(3개 내지 4개의 패딩(padding) 잔기와 함께)
...DILKQLKIKV XXX (Flag-Tag)
이나, 또는
...GGLMA XXX (Flag-Tag) XXX EQDPK...
와 같은 25번 잔기와 26번 잔기 사이에 리더 펩타이드 다음에 우측에 Flag-텍을 넣는 것을 추천한다.
상기에서 "X"는 패딩 잔기이다. HcpC (Hp1098) 외에도 HcpA (Hp0211)를 생각해볼 수 있다. 지금까지 HcpA가 마우스 면역화 모델에서 보다 우수한 예방과 관련있는 더욱 강한 IFN-감마 방출을 도출하는 것으로 알고 있다. HcpA에 대한 해당 구조체는 ...ALKELKIEL XXX (Flag-Tag) 및 ...RGLMA XXX (Flag-Tag) XXX EPDAK...이다.
구조적인 관점에서, 양 말단에 자유롭게 접근할 수 있기 때문에 링커를 삽입할 필요가 전혀 없다. 이에, C-말단 구조체에 대한 링커를 생략(skipping)하고 바로 천연 C-말단 다음의 우측에 flag-텍을 넣었다. N-말단 구조체에서, N-말단 신호 펩타이드와 Flag-텍 사이에 아미노산 2개 길이의 링커를 넣었다. 그 이유는, 리더-펩티다제의 정확한 절단 부위를 예측하는데 다소 애매하기 때문이며, Flag-텍 내부 어느 곳에서의 리더-펩티다제 절단을 방지할 수 있을 것 같다. HcpA 및 -C에 대한 가능한 구조체는 하기일 수 있다.
(HcpA/Hp0211)
MLGNVKKTLFGVLCLGTLCLRGLMA EP (Flag-Tag) EPDAKELVNLGIESA...
(HcpC/Hp1098)
MLENVKKSFFRVLCLGALCLGGLMA EQ (Flag-Tag) EQDPKELVGLGAKSY...
규정된 3차 구조로 접히는 큰 텍의 경우, 링커를 고려하여야 할 수 있다.
배지 제조
하기 항생제 및 성장 보조제의 조합은, 진균 및 박테리아의 오염 없이 정기적으로 헬리코박터 필로리를 배양하였다.
1. 항생제를 추가하기에 꼭 부피가 충분하게 배지 성분을 혼합
2. 자동멸균한 후 배지를 수조에서 50 ℃까지 냉각
3. 이소비탈렉스(0.4% v/v), 암포테리신 B(8 ㎍/mL), 반코마이신(6 ㎍/mL) 및 트리메토프림(5 ㎍/mL)으로 최종 배지 농도가 되도록, 항생제 스톡 100 ml을 미리 따뜻하게 함. 또한 혈액을 미리 가온함.
4. 미리 가온한 혈액을 자동멸균한 배지에 첨가
5. 거품이 형성되지 않도록 하면서 완전히 혼합
6. 미리 데운 항생제 용액 100 ml을 자동멸균한 배지에 첨가
7. 거품이 형성되지 않도록 하면서 완전히 혼합
8. 임의의 에탄올 용해성 항생체를 배지에 첨가(에리트로마이신)
9. 플레이트에 붓기
마우스 실험용 배지에는 날리딕식산(10 ㎍/mL), 폴리마이신 B(10 ㎍/mL) 및 박시트렉신(200 ㎍/mL)를 추가적으로 보충한다.
유레아 선별 플레이트
표 4. 유레아제 양성 헬리코박터 필로리 선별용 배지 조성물
성분 중량/무게 지시
브루셀라 브로스 28 g 자동멸균하기 전
박토 아가 15 g 자동멸균하기 전
페놀 레드 100 mg 자동멸균하기 전
말 혈청 70 mL 자동멸균한 후
유레아(40% w/v) 1.5 mL 자동멸균한 후
HCl (1N)* 노란색이 될때까지(~10mL?) 자동멸균한 후 또는 플레이트가 노란색-오렌지색이 될 때까지
반코마이신(6mg/mL) 1 mL 자동멸균한 후
물 잔량
총 부피 1L
저장 배지
트립트 소이 브로스(g/L) 및 20% (v/v) 글리세롤. 이 배지에서의 24시간 배양물을 섞고, 드라이 아이스를 이용하여 순간 동결시켰다. 스톡은 샘플로 해동시키지 않고, 배양물의 동결 표면으로부터 긁어 벗겼다. 스톡은 여러번 재사용할 수 있다.
액체 배지
7% (v/v) 말 혈청과 반코마이신(6 ㎍/mL)이 보강된 브루셀라 브로스(g/L). 일잔적으로 50 ml 스크류 캡의 코니칼 플라스크에서 10 ml을 이용하여 가스 조절되는 인큐베이터에서 150 rpm으로 37 ℃에서 교반한다.
SOE PCR 에 의한 조립
구조체들 모두 SOE PCR로 조립하고, 박테리아 형질전화에 사용하였다. 과정 은 도 13에 나타낸다.
헬리코박터 필로리 의 형질전환
Berg 형질전환 프로토콜의 개략도를 도 17에 나타낸다.
실시예 19: 유레아제에 인플루엔자 혈구응집소 에피토프 융합
재조합 유레아제에 의한 제시 및 헬리코박터 필로리에 의한 전달에 있어 항원으로서 A/PR/8/34 혈구응집소(HA) 에피토프를 사용하였다. 프로젝트에서 선택한 HA 에피토프는 HA T-세포 에피토프(아미노산 서열: SFERFEIFPKE) 및 HA B-세포 에피토프(아미노산 서열: WLTEKEGSYP)이다. 백신에서 이들 에피토프의 조합으로 숙주에서 체액성 및 세포 매개성 반응 모두가 유도되어야 한다. 구조체들 모두 도 13에 나타낸 과정으로 SOE PCR로 조립하였다. A/PR/8/34 혈구응집소(HA) 에피토프의 해당 핵산 서열은 전술한 프라이머를 이용하여 PCR하고 도 18에 나타낸 바와 같이 유레아제에 삽입하여 구축하였다. 헬리코박터 필로리의 형질전환은 도 17에 나타낸 형질전환 프로토콜 개략도에 따라 수행하였으며, 기능성 재조합 유레아제 융합을 선별하였다.
재조합 유레아제에서 에피토프를 검출하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 인플루엔자 에피토프에 인접하게 FLAG 단백질 텍 서열을 포함시켜, 상업적으로 이용가능한 항체를 이용하여 재조합 단백질을 검출할 수 있게 하였다. 웨스턴 블롯으로, FLAG가 작은 단백질 서브유닛인 ureA의 1a 부위와 큰 단백질 서브유닛인 ureB의 4 및 8번 부위에 삽입되어 있는 것으로 나타났다. 3번 부위에서 FLAG 단백질 텍 신호가 매우 약하게 검출되었다(도 19). 이 밴드의 크기를 정확하지 않았으며, ureB가 아닌 ureA 상의 FLAG 텍에 해당되었다.
실시예 20: 유레아제 융합된 인플루엔자 혈구응집소 에피토프를 이용한 면역화
유전자 변형된 헬리코박터 필로리의 면역원성을 측정하기 위해, 유레아제 1a, 3, 4 또는 8번 부위(si1a, si3, si4 및 si8)에서 HA 에피토프를 발현하는 헬리코박터 필로리 109 cfu/ml 200 ㎕를 위내 투여로 C57BL/6 마우스를 면역화하였다. 73일 후, 혈청을 채혈하고, 항-HA IgG 역가를 ELISA로 측정하였다. 간략하게, 플레이트를 C-말단(SFERFEIFPKEC)을 통해 리보뉴클레아제 H에 커플링된 B-세포 에피토프 펩타이드 5 mg/ml로 코팅하고, 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 2% PBST-BSA로 37 ℃에서 2시간 동안 플레이트를 블롯킹한 다음, 혈청 샘플을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 항-HA IgG 항체를 알칼리-포스포타제-표지된 염소 항-마우스 IgG 이차 항체로 검출하였다. 기질로는 니트로페닐 포스페이트를 사용하였고, 30분 후 NaOH로 반응을 중지시켰다. 광학 밀도(OD)를 405 nm에서 측정하였다. 도 20은 살아있는 재조합 헬리코박터 필로리로 면역화한 마우스가 위에서의 73일간의 군락 형성 후 항원 특이적인 항체를 생산함을 나타낸다. 면역화한 마우스 20마리 중 5마리는 혈청에서 항원 특이적인 항체를 생산하였다. 면역화한 마우스 20마리 중 11마리는 73일 후 헬리코박터 필로리가 집락을 형성하 는 것으로 확인되었다. 이러한 혈청학적으로 양성인 마우스는 si1a, si4 및 si8로 면역화한 그룹들에서 나타났다. si3재조합 헬리코박터 필로리 면역화한 그룹에서는 항원 특이적인 면역 반응이 없었다.
본 실험에 사용한 프라이머는 다음과 같다:
프라이머 명칭 서열 5' -> 3'
si1aF3 GGC CCT TCT TTA GGA AAA ATT TCA AAT CTT TCA AAG CTV NNV NNV NNV NNV NNV NNG GCC TCA ATA GGG GTA TGC ACG GTT
si3F3 GGC CCT TCT TTA GGA AAA ATT TCA AAT CTT TCA AAG CTV NNV NNV NNV NNV NNV NNC TCC TTA ATT GTT TTT ACA TAG TTG T
si4F3 GGC CCT TCT TTA GGA AAA ATT TCA AAT CTT TCA AAG CTC ATT TCT TAC TCC TTA ATT GTT TTT ACA
si8F3 GGC CCT TCT TTA GGA AAA ATT TCA AAT CTT TCA AAG CTV NNV NNV NNV NNV NNV NNG CCA TCC ACG AAC ACA TGG TAA GTT
HAFLAG TTT ATC ATC GTC ATC TTT ATA ATC TAA GCT AGG CCC AGG ATA GCT CCC TTC TTT TTC GGT TAA CCA TAA GCT AGG CCC TTC TTT AGG AAA AAT TTC AAA T
HAFLAG ATT TGA AAT TTT TCC TAA AGA AGG GCC TAG CTT ATG GTT AAC CGA AAA AGA AGG GAG CTA TCC TGG GCC TAG CTT AGA TTA TAA AGA TGA CGA TGA TAA A
UseqSite8R CAG AGA AAT GTT CGC TCA TCA TGG T
UF1 CGA CTT TGG TTA ACC CGC AAA TCC CAT
UF6 GGG CGT GGT GGA TTA TGT GTA TTA
UF7 GGT GGA GTG CAG AAT AAG TGA TGA CAA
UF7 CCA TGC GAT AGA GTT TGG CAT GGT GT
si1aR1 GAT TAT AAA GAT GAC GAT GAT AAA NNB NNB NNB NNB NNB NNB AAT GGT AAA TTA GTT CCT GGT GA
si3R1 TTT ATC ATC GTC ATC TTT ATA ATC VNN VNN VNN VNN VNN CTC CTT AAT TGT TTT TAC ATA GTT GT
si4R1 GAT TAT AAA GAT GAC GAT GAT AAA NNB NNB NNB NNB NNB NNB AAA AAG ATT AGC AGA AAA GAA TAT GTT
si8R1 GAT TAT AAA GAT GAC GAT GAT AAA NNB NNB NNB NNB NNB NNB AAA GAA GTA ACT TCT AAA CCA GCC A
UseqF1 CCC AAC ATA TAA CAA TAC AAG TCC TAG CAT
UseqF3 CAG TAG CAG GAC CTA CGC TAA
UseqR1 CGT GGC AAG CAT GAT CCA TGA AGT
본 출원에 인용된 모든 문헌, 특허, 저널 및 그외 자료는 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 여러가지 예를 함께 들어 충분히 설명되지만, 당업자들에게 여러가지 수정 및 변형은 자명한 것이다. 이러한 수정 및 변 형은 본 발명을 벗어나지 않는 한 첨부된 청구항에 의해 규정된 바와 같이 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해된다.
참조문헌
하기에 기술한 문헌들과 본 명세서에 인용된 문헌들은 본원에 사용되는 방법, 기법 및/또는 조성물을 보충, 설명, 배경을 제공 또는 기술하기 위한 범위로 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
1. 미국 특허 6,570,004- Blaser et al . (2003).
2. 미국 특허 6,680,179 - Collins et al. (2004).
3. 미국 특허 6,383,496 - Curtiss et al . (2002).
4. 미국 특허 6,150,170 - Powell et al . (2000).
5. 미국 특허 6,410,012 - Seizmore et al . (2002).
6. 미국 특허 6,550.419 - Hone et al . (2002).
7. 미국 특허 6,531,313 - Goudsmit et al . (2003).
8. 미국 특허 6,682,729 - Powell et al . (2004).
9. 미국 공개공보 2005/0075298 - Chen et al . (2005).
10. 미국 공개공보 2002/0176848 - Seizemore et al . (2002).
11. 미국 공개공보 2005/0096288 - Guevara et al . (2005).
12. 미국 공개공보 2004/0236072 - Olmsted et al . (2004).
13. 미국 공개공보 2004/0203039 - Hensel et al . (2004).
14. 미국 공개공보 2004/0005325 - Kusters et al . (2004).
15. 미국 공개공보 2002/0032152 - Torossian (2002).
16. 미국 공개공보 2003/0170264 - Turner et al . (2003).
17. 미국 공개공보 2003/0204068 - Blasec et al . (2003).
18. 미국 공개공보 2002/0161192 - Meyer et al . (2002).
19. WO96/33274 - Covacci et al . (1996).
20. WO99/21959 - Ellis et al . (1999).
21. WO01/94599 - Burman et al . (2001).
22. WO2005 021026 - Baron, et al . (2005).
23. Graham et al (2002), Gastroenterology, 123:1637-1648.
24. Liu et al (2005), World J. Gastroentero., 11(14): 2154-2156.
25. Conway (2005), Curr. Pharm. Res., 11(6): 775-90.
26. Sawker et al (2002), PNAS USA, 99(24): 15428-15433.
27. Sutton et al (2004), Vaccine, 22(20): 2541-6.
28. Kang et al (2005), World J. Gastroentero., 11(3): 454-456.
29. Moschos et al . (2004), Immunology and Cell Biology, 82(6): 628-637.
30. Reddy et al . (2004), Inter. J. Antimicrob. Agents, 24(6): 536-47.
31. Bai et al . (2003), Sheng Wugong Cheng Xu Bao, 19(4):433-8.
32. Nolta et al . (1992), J. Clin. Invest, 90(2): 342-348.
33. Shi et al . (2005), Helicobacter, 10(1): 71-9.
34. Deml et al . (2005), Infection Immunity, 73(8): 4732-42.
35. Cosima et al . (2005), Trends in Immunology, 26(4): 199-207.
36. Velin et al . (2005), Gastroenterology, 129(1): 142-155.
37. Kong et al . (2000), NAR, 28(17) 3216-3223.
38. Mao et al . (2003), World J. Gastroentero., 9(7): 1529-1536.
39. Chu et al . (2005), World J. Gastroentero, 11(23): 3518-22.
40. Kathy Parton. (2000), Institute of Veterinary, Animal and Biomedical Sciences, "Helicobacter mustelae as vector for biological control in stoats" Wildlife Health and Conservation Research Program; Landcare Research (Funding Body).
41. Forrester & Parton (2000), NZ Vet. J., 48: 65-69.
42. Spranger et al . (2005), Br. Nutr., 93 (6):765-71.
43. Garbom et al . (2004), Infect Immun., 72(3): 1333-1340.
44. Tschop et al . (2000), Nature, 407:908-13.
45. Choi et al . (2003), Edocrinology, 144 (3).
46. Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition, Mack Publishing Company.
47. Jones et al . (2005), Nat. Med. 11 (7): 786-90.
48. Curtis (2005), In Mestecky, et al . (eds.), Mucosal Immunity, 3 ed. Academic Press, pp. 1009-1037.
49. Portal-Calthay & Perez-Perez (2006), Clin. Sci (Lond), 110:305-314.
50. Amieva et al . (2003), Science, 300:1430-1343.
51. Bina et al . (2000), J. Bacteriol., 182:2370-2375.
52. Franco et al (2005), PNAS USA, 102: 10646-10651.
53. Doig et al . (1995), J. Bacteriol, 177: 5447-5452.
54. Doig & Trust (1994), Infect Immun, 62, 4526-4533.
55. Odenbreit et al . (2000), Science , 287, 1497-1500.
56. Orsini et al. (1998), Helicobacter , 3: 15-20.
57. Hohlfeld et al . (2006), Mol Microbiol ,59: 1624-1637.
58. Sarker et al . (2004), Acta Paediatr , 93: 1432-1436.
59. Fischer et al. (2001), Infect Immun:, 67: 69-6775.
60. Chien et al . (1999), J Clin Microbiol , 37: 1393-1397.
61. Bubert et al . (1992), J Bacteriol , 174: 8166-8171.
62. Spreng et al . (2003), Vaccine , 21: 746-752.
63. Kuhn & Goebel (1989), Infect Immun , 57: 55-61.
64. Akopyants et al . (1995), Infect Immun , 63: 116-121.
65. Bijlsma et al . (1999), Infect Immun , 67: 2433-2440.
66. Wang et al . (1993), J Gen Microbiol , 139: 2485-2493.
67. Hanahan (1983), J. Mol Biol , 166: 557-580.
68. Dower et al . (1988), Nucleic Acids Res , 16: 6127-6145.
69. Chalker et al. (2001), J Bacteriol , 183: 1259-1268.
70. Heuermann & Haas (1998) Mol Gen Genet , 257: 519-528.
71. Copass et al . (1997) Infect Immun , 65: 1949-1952.
SEQUENCE LISTING <110> Marshall, Barry J <120> METHODS AND DEVICES FOR THE DELIVERY OF PEPTIDES INTO THE GASTRIC MUCOSA <130> P75728.PCT <140> WO2008/055316 <141> 2007-11-09 <150> US 11/558,570 <151> 2006-11-10 <150> AU2007901331 <151> 2007-03-14 <160> 9 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2795 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 1 gtcatgcgcg ttgtttttaa ttacatttta aacaacttgt tgttgttttt acatgtttta 60 ctcgcatgcg cgcgcgtgag ggattggggg ttgcaacccc ctaaataacg aagctgtagg 120 gtttctcatt tttgtggtga aaatgaataa aacagaactt cttgccaaca ctaacagaac 180 ttcttgccaa cactaacaga acttcttgcc aacactaaca gaacttcttg ccaacactaa 240 cagaacttct ttattttaaa gttatgatta ttaacaattt ttagacataa taacagcgtg 300 tgaagatact tttgtagcgg tatttcctat gtgcggcaaa atttggagca attagcttga 360 cttggttgag ttagtgggtt ggaggataga gagggcgaca cctcgttagg aggtatcaat 420 gtgaaagtat ttgtcgtatt agttctagta ttagtaattc tcgcacaatt gctatattag 480 gcttattcgt ggtctaaccc cttgtttatg ggggttggct cgttataagc atactgatac 540 gatcacactt attatacacc aaaagataag gagtatagag tggaatttga tcaatcagat 600 ttacaaaaag cgttgaaaat attagataca ctcccacaaa ccccacaaat tgagctacaa 660 aaacaagaaa tacaaaaccg catcaacaaa ataacagaga caatcattaa agaattacta 720 tcaaagcatg aaatcaagaa agaagaacta gaacccactc taaccccaaa acccacacca 780 ctcaaagagc cacaaaccac cccaacacca tgcaaagatt tagtggttag cacccctaaa 840 gataaaacct aatatcacct accacaataa cgctaataag gtcaatctag ggaaattgag 900 cgaaagggaa gccaatcttt tattcgctat ttttcaaaaa ctcaaagccc aagggaatac 960 cctcattcgt tttgaaccgc aagatttgaa acgcatgcta aacatagata tttctaatga 1020 gcgcttatca gaagtcgtta ttaagctgtg ggatagcatt aaaaccgctg atttttggaa 1080 aattagcgaa accgaaactt caatcattca agaaaattac atgcttttta gtcggtgtaa 1140 aattgaattg aacaaaccga gtaaagattt gaagtattta gaaatccaac tcaacgataa 1200 ctatcaagac ttactcaaca atctgggcat gggtcaatac acttctttca atctgttaga 1260 atttcaaaga gtgaggggta aatacgctaa aacgctctat cgcttgctca agcaatacaa 1320 aagcacaggg attttgagcg tggaatggac tcaattcagg gagcttttag acattccaaa 1380 agactacaaa atggaaaaca tcgatcaaaa agtcttaacc ccctctctca aagaactcag 1440 aaaaatctac ccttttgaac acttgagcta taaaaaagaa cgcaaaagcc attacaagcg 1500 caaagtaacc cacattgatt tttattttga gcaatttcct taaggcgaaa ataagaaaca 1560 aaacaaagcc gacaagcaac gcgctcaaag ggacatcaag cttgtagcat gggatattca 1620 caaccaaatc gctaaaagaa acgcaaaagc cactatggaa gctaggtttc ttgaattgaa 1680 aactttgatc ggctatcagt tcaggaacaa tgacagtagg aacaaattaa agattgacaa 1740 caccactttt gaaagaatca aatgtattta catgtatctt aaccctaaaa taagcataac 1800 ccccaaaaat tccttgtatc caacaagaca ttcgcattgg aactactata tatcaataga 1860 tacagcctaa aaaaaagaca acttgctaga agaatttaac cccccaaaat ccaccctatc 1920 accaacgaac ctatcaagga atttgcagaa tacatcggca aaacgattaa catcaccaac 1980 ttcaatgtgg atcaatgcca tgagggaatc agcaactacc tgacaatcac taggatcgtg 2040 aactggacgt aatcggatct gtatttggtc cagatgtgga taagcctggg acttctcaag 2100 cctttcattg ctaaagtgag aaaatttggg gattggttca agaacactac aggtgaaaag 2160 acagatgcat gctgactaaa ctcatagaaa aactgaatca cgaaagaaag aatgcaagca 2220 gaaaacaaac acctaaaaga acaaggacta gaaaaaatct acactcaaaa agactacgag 2280 cagttaaaag aacagcattt gaaagaaatt gaagcactca aaaaagaaat ccaaaaaacc 2340 aagcaagaaa catacacgca accaaaagaa tgtagccatt tagcgcattc ttttagccct 2400 aattcattct ttcaatcaaa atccgactaa ttcatcggct aaacgctaaa aatcgcttaa 2460 aacgaaaaat acaaagcaaa aaacttcatt ccccttttag tcgttaacca tttagccaat 2520 ctaactagtt tagcatctaa aggcgaatct atcttgtgtt agacatccaa ccttaccaaa 2580 accgcagagc gagcttaaga gagattcaag cggttttgca cgattgtttg ctgccaagaa 2640 aaccaacaag cgaagtaagg cgcatagaca aaagcgcatc gcagtttgaa agcgtaggcg 2700 tcagaagtgg tttgcgttag aatcaaacaa gatagcgcaa acctggcgtt aggctaaaaa 2760 acccctaaaa actaaaaccc caaaatatgt agtgc 2795 <210> 2 <211> 2796 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 2 cagtacgcgc aacaaaaatt aatgtaaaat ttgttgaaca acaacaaaaa tgtacaaaat 60 gagcgtacgc gcgcgcactc cctaaccccc aacgttgggg gatttattgc ttcgacatcc 120 caaagagtaa aaacaccact tttacttatt ttgtcttgaa gaacggttgt gattgtcttg 180 aagaacggtt gtgattgtct tgaagaacgg ttgtgattgt cttgaagaac ggttgtgatt 240 gtcttgaaga aataaaattt caatactaat aattgttaaa aatctgtatt attgtcgcac 300 acttctatga aaacatcgcc ataaaggata cacgccgttt taaacctcgt taatcgaact 360 gaaccaactc aatcacccaa cctcctatct ctcccgctgt ggagcaatcc tccatagtta 420 cactttcata aacagcataa tcaagatcat aatcattaag agcgtgttaa cgatataatc 480 cgaataagca ccagattggg gaacaaatac ccccaaccga gcaatattcg tatgactatg 540 ctagtgtgaa taatatgtgg ttttctattc ctcatatctc accttaaact agttagtcta 600 aatgtttttc gcaactttta taatctatgt gagggtgttt ggggtgttta actcgatgtt 660 tttgttcttt atgttttggc gtagttgttt tattgtctct gttagtaatt tcttaatgat 720 agtttcgtac tttagttctt tcttcttgat cttgggtgag attggggttt tgggtgtggt 780 gagtttctcg gtgtttggtg gggttgtggt acgtttctaa atcaccaatc gtggggattt 840 ctattttgga ttatagtgga tggtgttatt gcgattattc cagttagatc cctttaactc 900 gctttccctt cggttagaaa ataagcgata aaaagttttt gagtttcggg ttcccttatg 960 ggagtaagca aaacttggcg ttctaaactt tgcgtacgat ttgtatctat aaagattact 1020 cgcgaatagt cttcagcaat aattcgacac cctatcgtaa ttttggcgac taaaaacctt 1080 ttaatcgctt tggctttgaa gttagtaagt tcttttaatg tacgaaaaat cagccacatt 1140 ttaacttaac ttgtttggct catttctaaa cttcataaat ctttaggttg agttgctatt 1200 gatagttctg aatgagttgt tagacccgta cccagttatg tgaagaaagt tagacaatct 1260 taaagtttct cactccccat ttatgcgatt ttgcgagata gcgaacgagt tcgttatgtt 1320 ttcgtgtccc taaaactcgc accttacctg agttaagtcc ctcgaaaatc tgtaaggttt 1380 tctgatgttt taccttttgt agctagtttt tcagaattgg gggagagagt ttcttgagtc 1440 tttttagatg ggaaaacttg tgaactcgat attttttctt gcgttttcgg taatgttcgc 1500 gtttcattgg gtgtaactaa aaataaaact cgttaaagga attccgcttt tattctttgt 1560 tttgtttcgg ctgttcgttg cgcgagtttc cctgtagttc gaacatcgta ccctataagt 1620 gttggtttag cgattttctt tgcgttttcg gtgatacctt cgatccaaag aacttaactt 1680 ttgaaactag ccgatagtca agtccttgtt actgtcatcc ttgtttaatt tctaactgtt 1740 gtggtgaaaa ctttcttagt ttacataaat gtacatagaa ttgggatttt tattcgtatt 1800 gggggttttt aaggaacata ggttgttctg taagcgtaac cttgatgata tatagttatc 1860 tatgtcggat tttttttctg ttgaacgatc ttcttaaatt ggggggtttt aggtgggata 1920 gtggttgctt ggatagttcc ttaaacgtct tatgtagccg ttttgctaat tgtagtggtt 1980 gaagttacac ctagttacgg tactccctta gtcgttgatg gactgttagt gatcctagca 2040 cttgacctgc attagcctag acataaacca ggtctacacc tattcggacc ctgaagagtt 2100 cggaaagtaa cgatttcact cttttaaacc cctaaccaag ttcttgtgat gtccactttt 2160 ctgtctacgt acgactgatt tgagtatctt tttgacttag tgctttcttt cttacgttcg 2220 tcttttgttt gtggattttc ttgttcctga tcttttttag atgtgagttt ttctgatgct 2280 cgtcaatttt cttgtcgtaa actttcttta acttcgtgag ttttttcttt aggttttttg 2340 gttcgttctt tgtatgtgcg ttggttttct tacatcggta aatcgcgtaa gaaaatcggg 2400 attaagtaag aaagttagtt ttaggctgat taagtagccg atttgcgatt tttagcgaat 2460 tttgcttttt atgtttcgtt ttttgaagta aggggaaaat cagcaattgg taaatcggtt 2520 agattgatca aatcgtagat ttccgcttag atagaacaca atctgtaggt tggaatggtt 2580 ttggcgtctc gctcgaattc tctctaagtt cgccaaaacg tgctaacaaa cgacggttct 2640 tttggttgtt cgcttcattc cgcgtatctg ttttcgcgta gcgtcaaact ttcgcatccg 2700 cagtcttcac caaacgcaat cttagtttgt tctatcgcgt ttggaccgca atccgatttt 2760 ttggggattt ttgattttgg ggttttatac atcacg 2796 <210> 3 <211> 3434 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 3 tctacacaat taacaatctt tagctacaat aacagcgtgt gaagatgctt tcacagcggt 60 atttcctatg tgcggcaaaa tttggagcaa ttaacttgac ttggttgggt tagtgggttg 120 gaggatagag agggcgacac ctcgttagga ggtatcaatg tgaaagtatt tgtcgtatta 180 gttctagtat tagtaattct cgcacaattg ctatattagg cttatttgtg gtctaacccc 240 ttgtttatgg gggttagatc cttataagca tactgatacg atcacactta ttatacacca 300 aaagataagg agtatagagt ggaatttgat caattagaat cacaaagatc agacttacaa 360 aaagtgttaa aagaattaga tacactccca aaaaccccac aaattgagct acaaaaacaa 420 gaaatacaaa accgcatcaa caaaataaca gacacaatca ttaaagaatt actatcaaaa 480 catgaaatca aaaaagaaga actagaaccc actctaaccc caaaacccac accaacaaaa 540 gagccacaaa ccacccccac accatgcaaa aatttagtgg ttagcacccc taaagataaa 600 acctatatca cctaccacaa taacgctaat aaggtcaatc tagggaaatt gagcgaaagg 660 gaagccaatc ttttattcgc tatttttcaa aggcttaaag atcaagggaa taccctcatt 720 cgttttgaac cgcaagattt aaaacgcatg atcatggtca aatccaactt aaccaacagg 780 caattattgc aagtcttaaa aaatttgctt gacaacatta gcggtgctaa tttttggatc 840 aattagagag catgttgaaa atggcgaaat ctatgaagat cacactagct acatgctttt 900 caaacaattt gaaatccgca tccataagcc aacacaaact atagaatact tagatgtcca 960 actcaatgat agctatcaat acttgctcaa caatctagga atgggcggtc aatacacttc 1020 tttcaatctc ttagaatttc aaagggtgag gggcaaatag tgagagcgtt aaatttcccc 1080 cccctattcc ccttaaaaag gacccttatc ccagggaatt tttggcccca atacaattag 1140 ggccaaaaac ccggtccctt ccatggctta accaacccaa ttgggggatt ccaatttccc 1200 ctggatggga ataacccaag gctttttttg aattccacct accatttggt ccaaaattgg 1260 atggacaatt ccaaattcca aatcttcttt tccaagaatg ggggccaacc cttgacaaac 1320 tccttaaacc ttttcattcg gctaaaaggt tgaaaaacat ttggaagatt tggtttaagg 1380 aaatatttat cgggtgaaaa gaccagatgc atggctaact taaactccat agaaaaactg 1440 aatcacgaaa gaaagaatgc tatcaaaaat ggcatttacc acttgatcca aatcaaattt 1500 tcttacaact ccaatcgcat tgaaggaagc ggtttgactt atgaacaaac cgctcatatt 1560 tttgacaaat ccgttctcat aactgaaaaa aacaccaata tcaaacttga tgatattttt 1620 gaaactatca atcattttga atgcgtgaat tacttgcttg aaagctataa agaacctttg 1680 agtttagaat actttaagaa tttacacaaa atcttgaaaa agaattgttc tgatgaagtt 1740 attggtgatt ttaaaaaacg ccctaatttt gtaggcaata gcgccacaac aagacccaaa 1800 ttagttgaaa gcgaattgac aaatcttgtg aaaaattatc aacgcaacct tgaagtgagt 1860 ttgaaaaaca atatcatgcc tttcatcata gaaaacgaac acaaagcctt ttactacagg 1920 ggcatcaaag aatatgacaa cacaaaaggc tacttgaaag acaccatttt gcaaagtcaa 1980 gacaatttca atgaaatggt tagctatttc ttttcttgag tgaaaccgct tatttttgct 2040 tgtgtgcttt tgttttttgc gtttttagtt gtaggtggta agaaatatcg gttttttgct 2100 tttcgttggt tgtaggcgat tttagatagc aaaaaacagc taaaaaatcc aagcaaccta 2160 attgatttca aaccaacttc atttcccttt tagtcgttag ccatttagcc aatctaacta 2220 gtttagcatc taaaagcgca tataacttga gttagcaatc caaccaatac taaaaccgcc 2280 tagcgaagcg ttagcgagca aaataagcgg ttttagaccg attgtttgct gacaagcaaa 2340 caccaataag cgagcgttag cgagcatgga caaaagcgca tcgcagtttg aaagcgtagg 2400 cgttagccga agctgttttg cgtaagcaaa tcaaacaaga tagcgcaagc cgaggtgcag 2460 cccaagaatt tgaattaatc catgcggtgt ttagggcgtt ttagcgtgat cgctttatta 2520 catgttttaa acagcatgct gttttttaca tgttttactc gcatgcgcgc gcgctaggta 2580 ttggtggttg gaatagccta aataacgcag ctgtatggtt tctcattttt cggtgacatg 2640 ataggggtgt tcttgcggtc ataagtgtag ttcttgcgag tcataagtgt agttcttgcg 2700 agtcataagt gtagttcttg cgagtcataa gtgtagttct cttcacaata tctacacaat 2760 tcacaatctc tagctacaat aacagcgtgt gaagatgctt tcacagcggt atttcctatg 2820 tgcggcaaaa tttggagcaa ttagctttaa aagctagtgg gttgggagtt tgtagcgggt 2880 atgcactccg ttaggaggca caccatgaaa gcatttttga tagtagtgat tttagtggta 2940 atcttgacac agccactata ttaaaacctt agcgttttaa taacccttat aagtccgcca 3000 agacttctta agggtttcac tcctgttatt atatcgtctt ttgaaaaata agcattaaaa 3060 ggcgcttaaa tgcccatgaa tacgaatttt gaacagctta gaaaacaaga attggaatta 3120 cgaaaattat tagaagaatt agaaacgctc ccacaaaccc cacaaattaa actgcaaaaa 3180 caaaaaatac aaacttacat agacaagata acaccaagta ttttgagcgg ttttgatcaa 3240 aaattcaaag aaattataga aaatctatca aatgaatttg aaaaagaaaa atccacacca 3300 ctcaaagagc cacaaaccac ccccacacca tgcaaagatt tagtggttag cacccctaaa 3360 gatacaccta taccacctac cacaataacg ctaatggtca atctagggaa attgagcgaa 3420 agggaagcca atct 3434 <210> 4 <211> 580 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 4 catgagcacg aatcctaaac ctcaaagaaa aaccaaacgt aacaccaacc gtcgcccaca 60 ggacgtcaag ttcccgggtg gcggtcagat cgttggtgga gtttacttgt tgccgcgcag 120 gggccctaga ttgggtgtgc gcgcgacgag gaagacttcc gagcggtcgc aacctcgagg 180 tagacgtcag cctatcccca aggcacgtcg gcccgagggc aggacctggg ctcagcccgg 240 gtacccttgg cccctctatg gcaatgaggg ttgcgggtgg gcgggatggc tcctgtctcc 300 ccgtggctct cggcctagct ggggccccac agacccccgg cgtaggtcgc gcaatttggg 360 taaggtcatc gataccctta cgtgcggctt cgccgacctc atggggtaca taccgctcgt 420 cggcgcccct cttggaggcg ctgccagggc cctggcgcat ggcgtccggg ttctggaaga 480 cggcgtgaac tatgcaacag ggaaccttcc tggttgctct ttctctatct tccttctggc 540 cctgctctct tgcctgactg tgcccgcttc agcctaccaa 580 <210> 5 <211> 135 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 5 aatcctaaac ctcaaagaaa aaccaaacgt aacaccaacc gtcgcccaca ggacgtcaag 60 ttcccgggtg gcggtcagat cgttggtgga gtttacttgt tgccgcgcag gggccctaga 120 ttgggtgtgc gcgcg 135 <210> 6 <211> 996 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 6 atggaattta tgaaaaagtt tgtagcttta gggcttctat ccgcagtttt aagctcttcg 60 ttgttagccg aaggtgatgg tgtttatata gggactaatt atcagcttgg acaagcccgt 120 ttgaatagta atatttataa tacaggggat tgcacaggga gtgttgtagg ttgcccccca 180 ggtcttaccg ctaataagca taatccagga ggcaccaata tcaattggca tgctaaatac 240 gctaatgggg ctttgaatgg tcttgggttg aatgtgggtt ataagaagtt cttccagttc 300 aagtcttttg atatgacaag caagtggttt ggttttagag tgtatgggct ttttgattat 360 gggcatgcca ctttaggcaa gcaagtttat gcacctaata aaatccagtt ggatatggtc 420 tcttggggtg tggggagcga tttgttagct gatattattg ataacgataa cgcttctttt 480 ggtatttttg gtggggtcgc tatcggcggt aacacttgga aaagctcagc ggcaaactat 540 tggaaagagc aaatcattga agctaagggt cctgatgttt gtacccctac ttattgtaac 600 cctaacgctc cttatagcac caaaacttca accgtcgctt ttcaggtatg gttgaatttt 660 ggggtgagag ccaattttac aagcataatg gcgtagagtt tggcgtgaga gtgccgctac 720 tcatcaacaa gtttttgagt gcgggtccta acgctactaa tctttattac catttgaaac 780 gggattattc gctttattta gggtataact acactttttc tcgagatctg cagctggtac 840 gatatgggaa ttcgaagctt tctagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatagc 900 gccgtcgacc atcatcatca tcattgagtt taacggtctc cagcttggct gttttggcgg 960 atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatc 996 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 7 aaggatccga taggaatgta aaggaatgg 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 8 ccgaattcta aaggcatgaa cgcttgca 28 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Helicobacter pylori <400> 9 agatctaagg acgtc 15

Claims (3)

  1. i) 펩타이드를 코딩하는 유전자를 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 유레아제 효소를 코딩하는 유전자에 삽입하여, 인-프래임(in-frame) 유전자가 발현되었을 때 유레아제 효소 기능이 손상되지 않도록 인-프래임 유전자를 생산하는 단계; 및
    ii) 헬리코박터 필로리가 점막에서 집락을 형성하도록 동물에 감염시키는 단계;
    를 포함하는 동물의 점막에 펩타이드를 전달하는 방법.
  2. i) 펩타이드를 코딩하는 유전자를 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 유레아제 효소를 코딩하는 유전자에 삽입하여, 인-프래임 유전자가 발현되었을 때 유레아제 효소 기능이 손상되지 않도록 인-프래임 유전자를 생산하는 단계; 및
    ii) 헬리코박터 필로리가 점막에서 집락을 형성하도록 동물에 감염시키는 단계;
    를 포함하는 동물에 백신 예방(vaccinating)하는 방법.
  3. 도 12에 나타낸 헬리코박터 구조체.
KR1020097011998A 2006-11-10 2007-11-09 펩타이드를 위 점막에 전달하기 위한 방법 및 장치 KR20090083927A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/558,570 US8029777B2 (en) 2004-08-13 2006-11-10 Helicobacter system and uses thereof
US11/558,570 2006-11-10
AU2007901331A AU2007901331A0 (en) 2007-03-14 Methods and devices for the delivery of peptides into the gastric mucosa
AU2007901331 2007-03-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20090083927A true KR20090083927A (ko) 2009-08-04

Family

ID=39364114

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097011998A KR20090083927A (ko) 2006-11-10 2007-11-09 펩타이드를 위 점막에 전달하기 위한 방법 및 장치

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP2069493B1 (ko)
JP (1) JP2010508828A (ko)
KR (1) KR20090083927A (ko)
CN (1) CN101611143B (ko)
AU (1) AU2007317206B2 (ko)
CA (1) CA2668984A1 (ko)
WO (1) WO2008055316A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2010265799A1 (en) * 2009-06-26 2012-02-02 Ondek Pty Ltd Synthetic operon
AU2012225146A1 (en) 2011-03-09 2013-09-26 Ondek Pty Ltd Gene expression and eradication system in Helicobacter pylori
CN107184967A (zh) * 2017-03-27 2017-09-22 广州市妇女儿童医疗中心 一种基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6290962B1 (en) * 1992-11-03 2001-09-18 Oravax, Inc. Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection
US5972336A (en) * 1992-11-03 1999-10-26 Oravax Merieux Co. Urease-based vaccine against helicobacter infection
WO1998027819A1 (en) * 1996-12-23 1998-07-02 Vanderbilt University dapE GENE OF HELICOBACTER PYLORI AND dapE- MUTANT STRAINS OF $i(HELICOBACTER PYLORI)
AU2003235745C1 (en) * 2002-01-08 2009-09-24 R. Michael Raab Transgenic plants expressing CIVPS or intein modified proteins and related method
CN1701120A (zh) * 2002-09-27 2005-11-23 磨粉机械研究有限公司 用于基因表达的核酸构建体
DK200201473A (da) * 2002-10-02 2004-04-03 Coloplast As Vaccinepræparater
EP1408114B1 (de) * 2002-10-11 2007-01-03 Imvision GmbH Moduläre Antigen-Transporter Moleküle (MAT-Moleküle) zur Modulierung von Immunreaktionen, zugehörige Konstrukte, Verfahren und Verwendungen
CN1705681A (zh) * 2002-10-14 2005-12-07 诺沃挪第克公司 Glp－2化合物、制剂及其用途
DE10258400A1 (de) * 2002-12-13 2004-06-24 N.V. Nutricia Trans-Sialidasen aus Trypanosoma congolense
WO2006015445A1 (en) * 2004-08-13 2006-02-16 Marshall Barry J Bacterial delivery system
CN103946374A (zh) * 2011-09-12 2014-07-23 奥加诺沃公司 用于体外研究用途的工程化组织、其阵列及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN101611143B (zh) 2015-01-14
AU2007317206A1 (en) 2008-05-15
EP2069493A4 (en) 2011-02-23
JP2010508828A (ja) 2010-03-25
CA2668984A1 (en) 2008-05-15
EP2069493B1 (en) 2013-07-10
WO2008055316A1 (en) 2008-05-15
EP2069493A1 (en) 2009-06-17
CN101611143A (zh) 2009-12-23
AU2007317206B2 (en) 2013-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1789094B1 (en) Bacterial delivery system
US8029777B2 (en) Helicobacter system and uses thereof
JPH04504204A (ja) 病原性のないｐｈｏＰ型微生物を含有するワクチン
US11857613B2 (en) Vaccine for prevention of necrotic enteritis in poultry
Aliramaei et al. Expression of Helicobacter pylori CagL gene in Lactococcus lactis MG1363 and evaluation of its immunogenicity as an oral vaccine in mice
KR101030792B1 (ko) 돼지 써코바이러스２(ｐｃｖ２) 유전자의 표면발현용 벡터 및 이로 형질전환된 살모넬라 백신 균주
EP2069493B1 (en) Methods and devices for the delivery of peptides into the gastric mucosa
EP4196158A1 (en) Salmonella vaccine for the treatment of coronavirus
KR20040101258A (ko) 세균성 포자
AU751517B2 (en) TGC method for inducting targeted somatic transgenesis
KR101245335B1 (ko) 세균 전달 시스템
AU2005270660B2 (en) Bacterial delivery system
Liu et al. Construction and characterization of recombinant attenuated Salmonella typhimurium expressing the babA2/ureI fusion gene of Helicobacter pylori
Curtiss 3rd Antigen delivery system II: Development of live attenuated bacterial vectors
KR20040099293A (ko) 재조합 포자
CN110229234A (zh) 一种具有免疫保护性的副猪嗜血杆菌融合蛋白CdtB-OppA
YUAN et al. Removal of Antibiotic Resistance of Live Vaccine Strain Escherichia coli MM‐3 and Evaluation of the Immunogenicity of the New Strain

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application