CN1701120A - 用于基因表达的核酸构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了含有病毒基因组核酸的核酸构建体，其含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒生活周期中的相同阶段具有活性。该内源基因表达调控单元用于表达所选的特定异源编码基因以及特别用于表达异源抗原。可将构建体用在疫苗中以产生对异源抗原的免疫应答以及特别可用于DNA疫苗中。本发明还提供产生构建体的方法以及其施用方式。

Description

用于基因表达的核酸构建体
技术领域
本发明涉及分子生物学和免疫学领域，并主要涉及基因表达的方法。更具体地，本发明涉及用于表达多肽的核酸构建体，以及它们在通过免疫尤其是通过核酸免疫而在受试者中激发免疫应答中的应用。
背景技术
传统的接种疫苗策略通常包括施用“活的”或“死的”疫苗(Ertl等，(1996)J.Immunol.156：3579～3582)。所谓的活疫苗包括减毒微生物和基于活载体的重组分子。死疫苗包括那些基于灭活的完整病原体和亚单位疫苗的疫苗，所述亚单位疫苗例如可溶性的病原体亚单位或蛋白质亚单位。
活疫苗通常能在免疫个体中成功地提供有效的免疫应答；然而，这种疫苗在免疫缺乏的或怀孕的受试者中是危险的，其可能回复为致病性有机体，或可能被其它的病原体污染(Hassett等，(1996)Trends inMicrobiol.8：307～312)。死疫苗，如亚单位疫苗，避免了与活疫苗有关的安全问题。由于亚单位疫苗不含有完整病原体，所以它们通常能避免免疫调节性病毒蛋白的问题，所述免疫调节性病毒蛋白可从减毒病毒疫苗表达并能降低疫苗接种的效率。然而，死疫苗，尤其是亚单位疫苗，经常不能在免疫个体中提供合适的和/或有效的免疫应答。
增强亚单位疫苗的效率的一个可能的方法是，使疫苗包含多个亚单位。用多个抗原进行免疫接种是理想的，因为该方法通常诱导更显著的免疫应答，其能提供比用单个抗原进行免疫接种更好的保护。多个亚单位疫苗也有助于减少鉴定能提供保护性应答的特定单个抗原的需要。这对于在远交群体中诱导细胞免疫应答尤其重要，远交群体中的个体对单个基因产物的应答差异很大，因此，没有一个抗原能在该整个群体中引起保护性的免疫应答。
可通过很多途径将疫苗导入到待免疫的受试者中。最近，已经描述了通过肌肉内(Wolff等，(1990)Science 247：1465：1468)或使用针和注射器的皮内注射(Raz等，(1994)PNAS USA 91：9519～9523)来直接注射质粒DNA。从而，编码抗原的构建体，而不是抗原本身，被导入到受试者中。这种包含编码抗原的核酸构建体的疫苗称作DNA疫苗。
递送DNA疫苗的另一种方法称作弹道式或颗粒介导的DNA递送，其使用无针颗粒递送装置把DNA包被的微金珠直接施用到表皮细胞中(Yang等，(1990)PNAS USA 87：9568～9572)。因此，很多递送技术可用于递送免疫接种中使用的核酸，包括将核酸包被的微粒递送到靶组织中的颗粒介导的技术(参见，例如共同拥有的美国专利No.5,865,796，1999年2月2日出版)。
使用DNA疫苗获得的有效保护水平，与传统蛋白质亚单位疫苗和灭活或减毒病毒疫苗激发的有效保护水平类似；尽管它通常比在自然感染恢复后的康复期动物中观察到的低(Manickan等，(1997)CriticalReview Immunol.17：139～154)。颗粒介导的核酸免疫技术已经显示在表皮递送纳克量的DNA后，能激发体液和细胞毒性T淋巴细胞免疫应答(Pertmer等，(1995)Vaccine 13：1427～1430)。已将这种颗粒介导的递送技术与其它类型的核酸接种进行了比较，并发现了显著的优势。Fynan等，(1995)Iht.J.Immunopharmacology 17：79～83，Fynan等，(1993)Proc.Natl.Acad.SCI.USA 90：11478～11482，和Raz等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9519～9523。
发明内容
本发明是基于以下事实：病毒基因组中的基因群以使基因表达间的干扰最小化而使含有这些基因的区域的稳定性最大化的方式共同进化。病毒基因的这种协同进化可用于产生用于异源编码序列共表达的表达构建体。因此，获取包含两个或多个这种病毒基因的基因组核酸区域，而且用待表达的异源编码序列取代病毒基因的天然编码序列。因此，构建体受益于使用的病毒启动子与其它调控元件的相容性，并因此显示增强的稳定性和最小的干扰。然后可以引入对基因组核酸的进一步改变以使构建体最佳化。
因此，本发明提供了能表达多个异源编码序列的构建体。使用单个构建体来表达几个异源多肽，而不是从单独的构建体来表达每个异源多肽，能降低制备和质量控制的复杂性。它还可能降低获得调控认可的难度。由于使用了病毒基因组核酸的内源基因表达调控单元，所以增加了该构建体的稳定性并降低了干扰，这与把带有它们自身的启动子或通常用于获得高水平表达的其它启动子的多个基因插入到载体中而构建的构建体明显不同，因为后者所述的构建体常显示不稳定性以及启动子间的干扰。
因此，本发明提供了含有病毒基因组核酸的核酸构建体，所述病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒生活周期中的相同阶段具有活性，其中：
(a)至少两个含有在相同阶段具有活性的启动子的内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的分离的异源编码序列上；而且
(b)除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
本发明还提供了产生核酸构建体的方法，该核酸构建体用于直接施用于受试者以在受试者中激发免疫应答，所述方法包括：
(a)将病毒基因组核酸插入到载体骨架中，所述病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同阶段具有活性；而且
(b)在将病毒基因组核酸插入到载体骨架中之前、同时或之后，将病毒基因组核酸中的至少两个内源基因表达调控单元的内源启动子可操作地连接到异源编码序列上。
其中，除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
本发明还提供了适于由颗粒介导的递送装置进行递送的包被的颗粒，该颗粒包含由核酸构建体包被的载体颗粒，其中，所述构建体包含病毒基因组核酸，该病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同阶段具有活性，其中：
(a)至少两个含有启动子的内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的异源编码序列上；而且
(b)除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
本发明还提供：
-一种用于颗粒介导的递送装置的剂量容器，该剂量容器包含本发明的包被的颗粒；和
-一种颗粒介导的递送装置，该颗粒介导的递送装置装载有本发明的包被的颗粒。
在另一个实施方案中，本发明还提供了感兴趣的多肽在哺乳动物细胞中获得表达的方法，该方法包括将含有病毒基因组核酸的核酸构建体转移到所述细胞中，所述的病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同阶段具有活性，其中：
-至少两个含有启动子的内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的异源编码序列上；而且
-除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种核酸免疫的方法，该方法包括将有效量的包被的颗粒施用给受试者，所述的颗粒适于由颗粒介导的递送装置进行递送，该颗粒包含由核酸构建体包被的载体颗粒，其中所述构建体含有病毒基因组核酸，该病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同阶段具有活性，其中：
-至少两个含有启动子的内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的异源编码序列上；而且
-除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
本发明还提供了产生核酸构建体的方法，所述核酸构建体用于直接施用给受试者以在受试者中激发免疫应答，所述方法包括：
(a)将病毒基因组核酸插入到载体骨架中，所述病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同阶段具有活性；而且
(b)在将病毒基因组核酸插入到载体骨架中之前、同时或之后，从病毒基因组核酸缺失除了至少两个内源基因表达调控单元以外的一些或全部的病毒序列，其存在于与构建体的病毒基因组核酸的5’和3’末端之间区域相对应的病毒基因组区域中。
其中插入到载体骨架中的病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
本发明还提供了一种感兴趣的多肽在哺乳动物细胞中获得表达的方法，该方法包括将本发明所产生的核酸构建体转移到所述细胞中。
本发明还提供了一种核酸免疫的方法，该方法包括给受试者施用有效量的包被的颗粒，该颗粒适于从颗粒介导的递送装置进行递送，该颗粒包含由本发明的方法产生的核酸构建体包被的载体颗粒。
结合本文所公开的，本发明的这些和其它目的、方面、实施方案和优点对本领域的普通技术人员是显而易见的。
附图说明
图1提供了粘粒23和构建体OP23-6以及介于二者之间的各种中间构建体的质粒图谱。
图2提供了构建体OPhsv1-1和OPhsv1-6以及介于二者之间的各种中间构建体的质粒图谱。
具体实施方式
在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于特定的示例性分子或方法参数，因为这些当然是可以改变的。因此，例如，本发明不限于特定的抗原或编码抗原的核苷酸序列。
还应当理解，这里所用的术语只是用于描述本发明的特定实施方案的目的，而不是旨在限制本发明。另外，除非另有说明，本发明的实施将使用常规的病毒学、微生物学、分子生物学、重组DNA技术和免疫学的方法，所有这些都在本领域技术人员的范围内。在文献中彻底解释了这些技术。参见，例如Sambrook，等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第二版，1989)；DNA Cloning：A Practical Approach，第一卷和第二卷(D.Glover编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编辑，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；和FundamentalVirology，第二版，第一卷和第二卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编辑)。还应当理解，所公开方法的不同应用可以适合本领域的特定要求。
无论上文还是下文，这里引用的所有出版物、专利和专利申请，均以其全部内容引入本文作为参考。
必须注意的是，如该说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种”、“一个”和“所述的”包括复数指示物，除非该内容明显指示有其它意思。
定义
除非另有限定，这里使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同。下述术语是如下所述的定义。尽管很多与这里所述的方法和材料类似或等同的方法和材料都可用于实施本发明，但这里所述的那些材料和方法是优选的。
术语“疫苗组合物”指含有抗原(如编码抗原的多核苷酸)的任何药物组合物，该药物组合物可用于预防或治疗受试者的疾病或不适。该术语因此包括两种亚单位疫苗，即含有分离自并独立于整个有机体的抗原的疫苗组合物，该有机体与该抗原天然相关；以及含有整个的灭活、减毒或失活的细菌、病毒、寄生虫或其它微生物的组合物。
这里使用的术语“核酸免疫”指将编码一种或多种选定的抗原的核酸分子导入到宿主细胞中，用于一种抗原或多种抗原的体内表达。核酸分子可以直接导入到受体个体中，如通过标准的肌肉内或皮内注射；经皮颗粒递送；吸入；体表或通过口服、鼻内或粘膜模式给药。可替换地，可将分子导入到从受试者移出的来自体内的细胞中。在后面的情况中，将含有感兴趣的核酸分子的细胞重新导入到受试者中，以便针对核酸分子所编码的抗原引起免疫应答。这样的免疫中所用的核酸分子这里一般称为“核酸构建体”。
术语“经皮”递送指皮内(如，至真皮或表皮中)、经皮(如，“经由皮肤的”)以及经粘膜的施用，即将物质通过进入或经由皮肤或粘膜组织进行递送。(参见，例如Transdermal Drug Delivery：Developmental Issues and Research Initiatives，Hadgraft和Guy(编辑)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug Delivery：Fundamentals andApplications，Robinson和Lee(编辑)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；和Transdermal Delivery of Drugs，第1～3卷，Kydonieus和Berner(编辑)，CRC Press，(1987))。因此，该术语包括从如美国专利号5,630,796中所描述颗粒递送装置(如无针注射器)的递送以及如美国专利号5,865,796中所描述的颗粒介导的递送。
“核心载体”是指其上包被了核酸(如DNA)的载体颗粒，以赋予规定的颗粒大小以及足以获得穿透细胞膜所需的动量的高密度，以便可以使用颗粒介导的递送技术如美国专利5,100,792中所描述的那些技术来递送核酸。核心载体一般包括如钨、金、铂、铁素体、聚苯乙烯和橡胶等材料。参见，例如，Particle Bombardment Technology for GeneTransfer，(1994)Yang，N.编辑，Oxford University Press，New York，NY，第10～11页。
“无针注射器”指经皮递送颗粒组合物的装置，其没有穿透皮肤的常规的针。本文讨论了与本发明一起使用的无针注射器。
“抗原”指任何物质，通常是大分子，其能在个体中激发免疫应答。该术语用于指单个的大分子或抗原大分子的同源或异源群体。如这里所使用的，“抗原”通常用于指含有一个或多个表位的蛋白质分子或其部分。为了本发明的目的，抗原可获自或源自任何合适的来源。更进一步地，为了本发明的目的，只要蛋白质保持足够的免疫原性，“抗原”包括相对于天然序列具有改变如缺失、添加和取代(通常为天然保守的)的蛋白质。这些改变可以是有目的的，例如通过定点突变，或者可以是偶然的，如通过能产生抗原的宿主的突变。抗原激发的免疫应答可以是细胞抗原特异性免疫应答，或者体液抗体应答或者二者都有。可以从例如任何已知的病毒、细菌、寄生虫、植物、原生动物或真菌中获得抗原。术语“抗原”也包括肿瘤抗原。该术语还包括自身抗原和来自过敏原的抗原。类似地，如在DNA免疫应用中，能表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸也包括在抗原的定义内。也包括合成的抗原，例如，多表位、侧翼表位和其它重组或合成来源的抗原(Bergmann等，(1993)Eur.J.Immunol.23：2777～2781；Bergmann等，(1996)J.Immunol.157：3242～3249；Suhrbier，A.(1997)Immunol.and Cell Biol.75：402～408；Gardner等，(1998)第十二届世界艾滋病大会，日内瓦，瑞士，1998年6月28日～7月3日)。
术语对感兴趣抗原的“免疫应答”，是指在个体中对该抗原的体液和/或细胞免疫应答的发展。为了本发明的目的，“体液应答”指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是指由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。
术语“多肽”是使用其最广泛的意义，指两个或多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或其它肽模拟物的化合物。亚单位可以通过肽键或诸如酯、醚等其它键连接。如这里所使用的，术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。如果肽链是短的，三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。如果肽链是长的，肽一般称为多肽或蛋白质。
术语“病原体”是使用其广泛的含义，指能激发免疫应答的任何分子的来源。因此，病原体包括，但不限于，有毒或减毒的病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫、癌细胞等等。通常，免疫应答由这些病原体产生的一种或多种肽激发。如下面详细描述的，编码来自这些和其它病原体的抗原肽的核酸，被用于产生模拟针对自然感染的应答的免疫应答。根据这里的教导，很显然这些方法包括使用获自超过一个病原体的编码抗原的核酸。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”可互换使用，指任何长度的核苷酸或其类似物的多聚形式，所述核苷酸为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。多核苷酸可具有任何三维结构，并可行使任何已知的或未知的功能。多核苷酸的非限制性例子包括，基因、基因片段、外显子、内含子、开放阅读框、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、粘粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。
多核苷酸通常由四种核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T))。因此，术语多核苷酸序列是多核苷酸分子的依字母顺序的表达。这种依字母顺序的表达可被输入到具有中央处理单元的计算机的数据库中，并用于生物信息学应用如功能基因组和同源搜索。
“构建体”是能将核酸序列转移至靶细胞中的任何部分(如，非病毒载体、颗粒载体、脂质体和病毒载体)。“质粒”构建体是能在宿主细胞中自我复制的染色体外遗传单元。“粘粒”是使用λ噬菌体(λ)的cos序列的特殊类型的质粒构建体。术语“cos末端”或“cos位点”指λDNA的单链12个碱基对的互补延伸。粘粒可携带大的插入片段，例如大小达约50kb，而一般的质粒能携带大小约10kb以下的插入片段。由于粘粒具有携带大片段的能力，它们可用于构建基因组文库，并用于需要大插入片段的场合。一般，“载体”、“构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”是指能指导感兴趣的基因的表达并能把基因序列转移到靶细胞中的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆载体、表达载体以及病毒载体。
“基因组文库”是指重组核酸分子的集合，该集合一起代表有机体的整个或几乎整个基因组。在文库具有几乎，但不是完全，全部基因组的情况中，它可以例如包括基因组中大于95％、98％、99％或甚至99.9％的序列。
术语“编码序列”或“编码”选定的多肽的序列，是指当置于合适的调控序列(或“控制元件”)的控制下，能在体内转录(在DNA的情况下)并翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的范围通过5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括，但不限于，来自病毒的cDNA、原核的或真核的mRNA、来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列，甚至合成的DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3’端。编码序列的转录和翻译通常由“控制元件”调控，所述“控制元件”包括，但不限于，转录启动子、转录增强元件、SD序列、转录终止信号、聚腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3’端)、用于使翻译的起始最佳化的序列(位于编码序列的5’端)和翻译终止序列。“基因表达调控单元”指最少含有启动子的核苷酸序列。该单元可另外包含编码序列的表达所需要的或影响其表达的其它序列，所述编码序列可操作地连接到启动子上。该单元的元件不必是邻近的，可以被间隔序列分开。该单元的元件可以在转录、RNA稳定性，RNA加工和/或翻译水平影响编码序列的表达。一般地，该单元不包括可操作地连接到其上的编码序列。在一些情况中，基因表达调控单元可包括或基本上由以下组成：除基因的编码序列之外的天然存在的基因。
“启动子”是指导编码多肽的多核苷酸的转录的核苷酸序列。启动子可包括诱导型启动子(其中可操作地连接到启动子上的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调控蛋白等诱导)、阻抑型启动子(其中可操作地连接到启动子上的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调控蛋白等抑制)和组成型启动子。术语“启动子”或“控制元件”包括全长的启动子区域和这些区域的功能性(如控制转录或翻译)片段。
“内源基因表达调控单元”指基因表达调控单元，其源自与存在该基因表达调控单元的核酸序列的部分或全部相同的有机体。因此，内源基因表达调控单元一般具有所述核酸序列的上游或下游序列，或者二者，所述核酸序列来自与基因表达调控单元自身相同的有机体，而且优选相当于有机体基因组中基因表达调控单元侧翼的部分或全部序列。一般地，来自与基因表达调控单元相同的有机体的部分或全部侧翼序列，可以如其在有机体的基因组中那样，位于相对于基因表达调控单元的相同的位置，也可能紧邻基因表达调控单元的上游和/或下游。因此，在本发明的核酸构建体的情况下，内源基因表达调控单元一般来源于存在于构建体中的病毒基因组核酸序列，并为该序列的一部分。
“异源编码序列”是可操作地连接到天然与其不相关的基因表达调控单元，尤其是启动子上的编码序列。一般地，这二者可通过重组DNA技术可操作地连接。异源编码序列可来自与其可操作地连接的内源基因表达调控单元相同的有机体，或可替换地，它可来自与其连接的基因表达调控单元不同的有机体。异源编码序列可以，例如，是本文提到的任何编码序列，而且尤其可以编码异源抗原。
“分离的多核苷酸”分子是从天然存在该分子的整个有机体分开和分离的核酸分子；或缺乏全部或部分通常天然与其相连的序列的核酸分子；或以其天然状态存在，但具有与其相连的异源序列(如下面定义)的序列。如果某序列具有与来源分子的某区域、其cDNA、或互补序列相同或基本相同的碱基对序列，或者如果它显示如下面所述的序列同一性，则该序列“源自或获自”该分子。
“可操作地连接”指元件的排列，其中将所述的组件如此装配以使其能执行它们通常的功能。因此，当存在合适的酶时，可操作地连接于编码序列(如编码感兴趣的抗原)的给定基因表达调控单元，尤其是启动子，能影响编码基因的表达。只要启动子或其它控制元件能执行指导编码基因表达的功能，它们不必与编码序列邻近。例如，启动子序列与编码序列之间可以存在非翻译但转录的间插序列，启动子序列仍然可被认为“可操作地连接”于编码序列。
这里用于描述核酸分子的“重组体”指根据其来源或操作，基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，所述来源或操作为：(1)不与其天然连接的多核苷酸全部或部分连接；和/或(2)连接到除了与其天然连接的多核苷酸之外的多核苷酸上。重组体包括该限定范围内的DNA和RNA分子。使用的关于蛋白质或多肽的术语“重组体”，指由重组的多核苷酸表达所产生的多肽。
这里使用了多核苷酸的同源性。一般地，与另一个多核苷酸同源的多核苷酸至少与该多核苷酸70％同源，优选与其至少80％或90％，更优选至少95％、97％或99％同源。测定同源性的方法是本领域熟知的，而且本领域的技术人员应当理解，在本上下文中，同源性是在核酸同一性的基础上的计算的。这种同源性可以存在于跨越至少15个，优选至少30个，例如40、60或100或更多个连续核苷酸的区域。
测定多核苷酸的同源性或同一性以及多肽的同源性或同一性的方法是本领域已知的。例如，UWGCG包提供了BESTFIT程序，其可用于计算同源性(如，根据它的默认设置来使用)(Devereux等(1984)NucleicAcids Research 12，第387～395页)。
PILEUP和BLAST算法也可用于计算同源性或排列序列(一般根据它的默认设置)，例如，如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36：290～300；Altschul，S，F等(1990)J Mol Biol 215：403～410中所述。
用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得。该算法包括，首先通过在查询序列中鉴别长度为W的短字，来鉴定高分值序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，所述长度为W的短字匹配或者满足某一正的阈值T。T称为邻近字阈值(Altschul等，参见上文)。将这些起始的击中邻近字(neighbourbood word hit)用作种子，起动搜索以寻找含所述击中字的HSP。只要累积比对分值可以增加，则将所述击中字沿每个序列在两个方向上延伸。在以下情况下每个方向上所述击中字的延伸停止：由于累积了一个或多个负分值的残基比对，累积比对分值转为零或低于零；或达到任一序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定了该比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用的默认参数为：字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915～10919)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝4、并且比较两条链。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析；参见，例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873～5787)。BLAST算法提供的一种相似性的测量是最小总和概率(P(N))，其提供偶然发生两个核苷酸序列或氨基酸序列之间匹配的概率的指标。例如，如果在第一序列与第二序列的比较中，最小总和概率低于约1，优选低于约0.1，更优选低于约0.01，最优选低于约0.001时，认为一个序列与另一个序列相似。
同源物一般以显著高于背景的水平与相关多核苷酸杂交。同源物与该多核苷酸之间反应所产生的信号水平，一般比“背景杂交”强至少10倍，优选至少100倍。可以通过例如放射性标记如用32P标记的探针，来测量反应的强度。选择性杂交一般使用中度到高度严紧条件获得(例如，0.03M氯化钠和0.003M柠檬酸钠，温度为约50℃到60℃)。
严紧杂交条件可包括50％甲酰胺、5×Denhardt’s溶液、5×SSC、0.1％SDS和100μg/ml变性的鲑精DNA；洗涤条件可包括2×SSC、0.1％SDS于37℃，接着1×SSC、0.1％SDS于68℃。限定合适的杂交条件在本领域技术范围内。参见，例如Sambrook等，上文。
同源物可以通过少于3、5、10、15、20个或更多的突变(其中每个都可以是取代、缺失或插入)而不同于相关多核苷酸中的序列。可以在同源物的至少30个，例如至少40、60或100或更多个连续核苷酸区域测定所述的突变。当多核苷酸编码多肽时，取代优选在编码的氨基酸中产生“保守性”变化。这些可根据下面的表格定义。在第二栏的相同区域，优选在第三栏的相同行的氨基酸可以在保守性改变中彼此取代。
  脂肪族   非极性   甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)
  异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)
  极性-不带电荷   半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、甲硫氨酸(M)
  天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)
  极性-带电荷   天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)
  赖氨酸(K)、精氨酸(R)
  芳香族   组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)
如这里使用的术语“佐剂”，指能增强药物、抗原、多核苷酸、载体或其类似物的作用的任何物质。其目的是，尽管不是经常明确地陈述，与野生型或纯化的肽佐剂(如重组产生的或其突变蛋白)具有相似的生物学活性的分子以及编码这些分子的核酸，都旨在用于本发明的精神和范围内。
如这里使用的，术语“治疗”包括任何下述方面：预防感染或再感染；减轻或消除症状；减少或完全清除病原体；减轻、预防、改善或消除疾病或紊乱。治疗可以是起预防性(如在感染之前)或治疗性(如感染之后)作用。
术语“个体”和“受试者”这里可互换使用，指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于，人类和包括非人类的灵长类在内的其它灵长类如黑猩猩和其它猿以及猴类；养殖动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟，包括家养鸟、野生鸟和猎鸟如小鸡、火鸡和其它鹑鸡类鸟、鸭、鹅等。该术语不限定特定的年龄。因此，成年的和新生个体都包括在内。这里所述的方法旨在用于任何上述的脊椎动物种类，因为所有这些脊椎动物的免疫系统以相似的方式发挥作用。
发明综述
在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于特定的制剂或方法参数，因为这些当然是可以改变的。还应当理解，这里所用的术语只是旨在描述本发明的特定实施方案，而不是旨在限制本发明。
本发明涉及核酸构建体，其允许从相同构建体表达多个抗原，以及这些构建体在核酸免疫中的应用。本发明还提供了构建这些构建体的方法。该构建体包含病毒基因组核酸，并利用存在于该病毒基因组核酸中的两个和多个内源基因表达调控单元来表达所需的异源多肽。将待表达的异源编码序列插入到构建体中，以便它们被可操作地连接到选择的内源基因表达调控单元上，尤其是连接到这些单元的内源启动子上。该构建体可以在宿主中有效地表达异源编码序列，尤其是编码抗原的基因。
本发明的核酸构建体一般包含或在一些实施方案中基本由以下组成：病毒基因组核酸，该病毒基因组核酸包含至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒生活周期中的相同阶段具有活性，其中：
(a)至少两个含有在相同阶段有活性的启动子的内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的独立异源编码序列中；和
(b)除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
本发明的优点包括，但不限于：(i)构建体稳定性高以及基因间干扰低；(ii)提供了一批抗原(如表位)而不是单个抗原，这样该构建体更密切模拟自然感染的抗原；(iii)获得了抗原进入相同细胞中的共递送以取得多个抗原的协同表达；(iv)由于多个抗原的表达，激发了与自然感染类似的免疫应答；(v)例如由于选择的抗原不包括可能存在于整个病毒疫苗中的抑制免疫应答的免疫显性抗原或多肽，激发了比自然感染激发的免疫应答更具保护性的免疫应答；和(vi)触发了通常参与清除细胞内感染的抗原加工和递呈途径。
内源基因表达调控单元
本发明构建体中的病毒基因组核酸包含至少两个内源基因表达调控单元。每个该内源基因表达调控单元包含内源启动子。然而，通常该单元将包含其它的核苷酸序列。尤其是，该单元将包含编码序列的转录和/或翻译所必需的或影响其的核苷酸序列，所述编码序列与内源基因表达调控单元可操作地连接。在很多实施方案中，一个或多个单元将包含或基本上由以下组成：内源基因，其中与该基因天然相连的编码序列被异源编码序列所取代。
每个内源基因表达调控单元可包含从编码序列的转录所必需或影响其的元件，所述编码序列可操作地连接到该单元上。这些元件可包括增强子序列，或对可操作地连接的编码序列的表达进行调节的其它序列。调节编码序列和/或其它序列的构象和/或可接近性的序列可存在于该单元中。在优选的实施方案中，还可存在内源转录终止序列。
内源基因表达调控单元至少包含内源启动子。一般地，其是整个内源启动子，即获得与内源启动子天然可操作地连接的编码序列的正常表达和/或本发明的构建体中的异源编码序列的相同表达特异性和水平所需的内源序列，所述异源编码序列与该单元可操作地连接。在一些实施方案中，可以对启动子进行一些序列改变。例如，可以引入碱基取代、插入或缺失，如例如，0、2、5、10或更多碱基取代、插入和/或缺失。在其它的实施方案中，可以引入更大的改变。例如，引入2到5个、5到10个、10到20个或更多碱基缺失。在一些情况中，可以将启动子截短到获得其可操作地连接的编码序列的表达所需的最小序列，尽管通常都不是这种情况。在一些实施方案中，将保留启动子与转录起始位点之间的内源序列。
内源基因表达调控单元还可包含参与或影响翻译的序列。该单元中也可存在与获得该单元的内源基因有关的转录但非翻译序列。例如，可以保留该单元的部分或全部的非翻译的5’和/或3’区域。尤其是保留影响转录物加工和/或稳定性的区域。也可保留SD序列、起始密码子和/或终止密码子。影响转录物构象的序列可保留在该单元中，尤其是影响可操作地连接到该单元上的编码序列的表达水平的这些序列。
内源基因表达调控单元不必包含从其中获得该单元的内源基因的全部非编码序列，尽管也可以包含全部的非编码序列。它可包含内源启动子和选择性的该内源基因中除了编码序列之外的任何区域。它可包含内源启动子以及这里提到的一个或多个内源基因元件。内源基因表达调控单元可包含该内源基因中空间上分离的序列。
该单元中可缺失内源基因非编码区中的一些序列，如对转录和/或翻译不起作用或对其没有影响的序列。在一些情况下，可使用与异源编码序列天然有关的调控元件，而不使用来自内源基因的对应物，其中所述基因表达调控单元源自该内源基因。例如，转录物的5’或3’非翻译区域可以是那些天然与异源编码序列有关的区域。内含子可来自与异源编码序列相同的来源。在一些情况中，也可使用来自与异源编码序列来源不同的异源来源的调控区域。
内源基因表达调控单元可来自任何合适的病毒基因，尤其是来自本文提及的任何病毒基因。
本发明构建体中的病毒基因组核酸包含至少两个内源基因表达调控单元，例如，可以包含2、3、4、5个或更多的内源基因表达调控单元。至少两个内源基因表达调控单元包含，在病毒基因组核酸来源病毒的病毒生活周期中的相同阶段表达的内源启动子，优选3、4、5或更多个内源基因表达调控单元包含这种在病毒生活周期中的相同阶段表达的启动子。在一些实施方案中，该单元的所有内源启动子可以在相同阶段被表达。在病毒生活周期中的相同阶段表达的至少两个内源启动子，可单独可操作地连接到异源编码序列上，而且优选3、4、5或更多个这种启动子也如此可操作地连接到异源编码序列上。在一些实施方案中，该单元的所有内源启动子可单独连接到异源编码序列上。
内源基因表达调控单元通常具有相同的来源，并且是它们存在于其中的病毒基因组核酸的部分。因此，病毒基因组核酸优选作为单个片段获自病毒基因组，然后进行改变以导入到异源编码序列中，并进行所需的任何其它改变。虽然这是产生本发明构建体的优选途径，但是能获得相同最后结果的其它途径，如获得病毒基因组核酸的几个片段，并逐步装配它们，并且在同时或之后将其它的序列插入到合适的载体中，也包括在本发明中。
在很多实施方案中，内源基因表达调控单元，尤其该单元的内源启动子可以具有其在病毒基因组中具有的同样的上游和/或下游序列。尤其，内源基因表达调控单元在该构建体中的病毒基因组核酸的界限内，可以具有其在病毒基因组中具有的一些或全部的相同上游序列。在一些实施方案中，与该单元尤其是内源启动子可操作地连接的异源编码序列下游的一些或全部序列，可以与该单元尤其是内源启动子天然有关的编码序列的下游序列等同。该单元中存在的内源下游元件包含来自内源启动子的转录物中的元件，如，例如，那些与确定转录物的稳定性相关的元件。存在的内源下游序列可包含转录终止元件和/或多腺苷酸信号。异源编码序列上游和/或下游的序列或编码序列内的基因内无信息序列中的序列可包含内源增强子元件。存在的上游序列可包括内源SD序列。在一些实施方案中，除了编码序列之外，全部内源基因均保留在该构建体中，内源基因表达调控单元源自该内源基因。此外，也可保留影响从该单元的内源启动子进行表达的任何序列，如增强子。
在一些实施方案中，该单元尤其是启动子上游，和/或异源编码序列下游，大于100个碱基对(bp)，优选大于500bp，更优选大于1kb，甚至更优选大于2kb的序列，可以与该单元，尤其是病毒基因组中的内源启动子和它的编码序列上游和/或下游的序列同源或相同。与病毒基因组中的序列相同的上游和/或下游序列区域，可以延伸到可操作地连接到异源编码序列上的另一个内源基因表达调控单元，和/或另一个异源编码序列。在一些实施方案中，该构建体中内源基因表达调控单元和异源编码序列上游和/或下游的病毒基因组核酸中可以存在缺失，这意味着与病毒基因组中发现的某些上游和/或下游序列等同的上游和/或下游序列，可被有效地移动至与该构建体中的内源基因表达调控单元更接近。
与异源编码序列可操作地连接的内源启动子，优选在病毒基因组核酸来源病毒的病毒生命周期的相同阶段，典型地在相似或相同时间被表达。病毒生活周期一般分为很多阶段，其中每个阶段都包括特定基因亚类的表达，这些基因可根据它们在那个阶段的被表达情况而进行分类，例如，病毒生活周期可包括立即早期、早期和晚期基因表达和整个潜伏期的基因表达。因此，在很多实施方案中，基因表达调控单元的内源启动子可以是来自病毒生活周期中相同或邻近阶段，而且优选相同阶段的启动子。这样，它们都是立即早期、早期、晚期或潜伏期相关的启动子。
一般地，在病毒生活周期的一些阶段，内源启动子二者/全部被表达，即，将会有重叠或启动子引起转录的时间。优选从连接到异源编码序列上的内源启动子的起始和/或终止转录的时间，将会发生在相似或相同的时间点。
在一些情况下，选择的启动子可以在病毒基因表达的相同阶段中被表达，如例如，立即早期，但是在母鸡中并不是真正重叠地表达启动子，而是在相同阶段，顺序表达所有的启动子。
在本发明的一些实施方案中，可选择立即早期基因来表达异源编码序列。这尤其在下面的情况中更是如此，在所述情况中需要病毒蛋白质来从病毒生活周期晚期的启动子进行表达。因此，优选地，选择的启动子不需要病毒蛋白质来进行表达。
在其它的实施方案中，选择启动子以模拟病毒生活周期中的特定阶段。因此，通过使用立即早期基因启动子，可以模拟病毒如例如HSV，自潜伏期出现的情形。
优选的内源启动子组的例子包括：
(i)HSV的ICP0、4、22和27基因中的至少2个，尤其是ICP0和4；ICP4和22；ICP22和27；ICP0、4和22；ICP4、22和27；或ICP0、4、22和27。
(ii)至少两个HSV被膜启动子，尤其是UL48、49和50中的至少两个，如：UL48和UL49；UL49和50；或UL48、49和50。
(iii)巨细胞病毒UL83和UL84；UL122和UL123；或UL36、37和38中的至少两个，尤其是人巨细胞病毒如：UL36和37；或UL37和38。
在很多情况下，在病毒生活周期中的相似阶段被表达的病毒基因是彼此邻近的，它们之间没有间隔基因。在很多实施方案中，因此选择的内源基因表达调控单元来源于获得该内源基因表达调控单元的病毒基因组的邻近或紧密相连的基因。因此，选择用于驱动异源编码序列的表达的内源基因表达调控单元，可以是源自病毒基因组中2、3、4或更多个连续基因的那些单元，虽然在一些实施方案中，在选择的内源基因表达调控单元二者之间存在如例如1、2或3或更多个间隔基因。
一些病毒的基因组中含有重复序列。例如，HSV具有两组这种重复。在本发明的很多实施方案中，存在于该构建体中的病毒基因组核酸不含有重复序列，尤其是不含有多拷贝的这种基因、单元或启动子。优选地，该构建体在病毒基因组核酸中不含有反向重复，尤其是不含有基因、启动子或单元的反向重复，或两个同源启动子、基因或单元的反向重复。
优选地，可操作地连接到异源启动子上的异源编码序列，不具有与其天然可操作地连接的任何启动子元件。因此，负责它们的表达的启动子，为内源基因表达调控单元的内源病毒启动子，而不是例如与异源编码序列一起插入的启动子。但是，在一些实施方案中，天然与异源编码序列连接的部分或全部启动子元件，可以引入到内源启动子的上游或其下游，但是位于转录起始位点的上游。在这些实施方案中，异源启动子一般位于内源启动子的下游。
一般地，将插入异源编码序列以取代与启动子天然相关的编码序列。因此，天然与内源启动子连接的编码序列，一般将缺失并被异源编码序列所取代。在一些实施方案中，可以保留天然编码序列的开始几个密码子，并与异源编码序列融合。可以使用导致异源序列编码的多肽的表达的任何安排。在一个实施方案中，天然与启动子有关的编码序列与位于其下游的异源编码序列一起保留，并具有内部核糖体进入序列(IRES)以确保翻译。
在一些实施方案中，构建体可以包含可操作地连接到异源编码序列上的两组或多组内源基因表达调控单元。每组基因表达调控单元可操作地将包含在病毒(构建体的病毒基因组核酸源自该病毒)生活周期的相同阶段表达的至少两个启动子。不同组的单元引起不同时间的表达。这允许在不同时间表达特定的抗原。
抗原
本发明构建体中存在的异源编码序列通常编码抗原。这里所述的方法和构建体可用于激发对各种细胞、组织和人或动物病原体的免疫应答。这些病原体包含一个或多个抗原。本发明构建体表达的异源多肽可以是这些抗原中的任何一个或多个。本发明构建体要表达的抗原的来源的非限制性例子包括病毒、细菌细胞、真菌细胞、寄生虫和其它致病有机体。在很多实施方案中，抗原可源自导致传染性因素的疾病。
本发明构建体中的异源编码序列所编码的抗原，可来源于与该构建体的病毒基因组核酸相同的有机体或不同的有机体。它们可均来自相同的有机体，或者它们中的两个或多个或全部可来自不同的有机体。抗原可以来自几种紧密相关的有机体。因此，例如，抗原可来自相同病原体的几个株系，其目标是免疫实验者，以便产生针对抗原来源株系中的每个的保护性应答。它们可编码来自每个株系的等价抗原。
一般地，异源编码序列将编码不同的抗原，虽然在一些实施方案中，两个或多个或甚至全部的异源编码序列可编码相同的抗原以获得较高水平的抗原表达。
该构建体表达的抗原，可出现在病原体中相似的位置和/或具有类似的功能。例如，它们都在病原体的表面表达，或可替换地，它们可以是不暴露于病原体表面上的抗原如细胞内抗原。抗原可以全部是病毒外壳蛋白、糖蛋白或在病毒表面表达的其它蛋白质。在一些实施方案中，构建体可以表达表面抗原和非表面抗原。
在一些实施方案中，抗原可以是从内源启动子表达的融合蛋白的部分。因此，抗原性序列可以融合到通常由基因表达调控单元的内源启动子表达的序列上。可替换地，内源启动子可驱动融合蛋白的表达，融合蛋白包含或者在一些实施方案中，基本上由以下组成：几种不同的抗原或抗原表位。融合蛋白可包含这里讨论的两个或多个抗原的任何组合。除了编码抗原的序列以外，插入的异源编码序列还可包含将抗原靶向到合适位点的序列。它们也可包含特异性蛋白酶的切割位点，以从融合蛋白中释放特异性抗原或序列。
在本发明的一些实施方案中，抗原主要是或全部是，那些能引起初次细胞或体液应答的抗原，以使这些应答主要或几乎全部都为细胞或体液应答。因此，抗原可以是不存在于病原体表面的抗原，例如，它们可以不是糖蛋白，以尽力产生细胞介导的初次应答而不是体液应答。在一些实施方案中，反过来也可以是正确的。在一些实施方案中，可选择抗原来特异性激发细胞和体液应答。
合适的病毒抗原包括，但不限于，那些从肝炎病毒家族获得或来源的抗原，所述病毒包括甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)和庚型肝炎病毒(HGV)。参见，例如WO 89/04669；WO 90/11089和WO 90/14436。HCV基因组编码几种病毒蛋白质，包括E1和E2。参见，例如，Houghton等，(1991)Hepatology 14：381～388。类似地，来自HDV的δ-抗原的编码序列是已知的(参见，例如，美国专利号5,378,814)。
以类似的方式，来自疱疹病毒家族的多种蛋白可用作本发明中的抗原，包括来自单纯疱疹病毒(HSV)1和2型的抗原，如HSV-1和HSV-2糖蛋白gB、gD和gH；来自水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)的抗原包括CMV gB和gH；和来自人疱疹病毒属的其它抗原如HHV6和HHV7。(参见，例如Chee等，(1990)Cytomegalovirus(J.K.McDougall编辑，Springer-Verlag，第125～169页；McGeoch等，(1988)J.Gen.Virol.69：1531～1574；美国专利号5,171,568；Baer等(1984)Nature 310：207～211；和Davison等，(1986)J.Gen.Virol.67：1759～1816)。
人免疫缺陷病毒(HIV)抗原，如对于多种HIV-1和HIV-2分离物的gp 120分子，包括HIV的各种遗传亚型成员，是已知的并已经报导过(参见，例如Myers等，Los Alamos Database，Los Alamos NationalLaboratory，Los Alamos，New Mexico(1992)；和Modrow等，(1987)J.Virol.61：570～578)，从这些分离物来源或者获得的编码抗原的序列可用于本发明。而且，本发明的构建体表达的抗原可以是从任何不同HIV分离物来源或获得的其它免疫原性蛋白，包括一种或多种不同的包膜蛋白或其片段，如gp160和gp41，gag抗原如p24gag和p55gag，以及源自HIV的pol、env、tat、vif、rev、nef、vpr、vpu和LTR区域的蛋白。
从其它病毒来源或获得的抗原也可用于这里，如非限制性的，来自以下病毒的抗原：小核糖核酸病毒科(如脊髓灰质炎病毒、鼻病毒等等)；杯状病毒科；披膜病毒科(如风疹病毒、登革热病毒等等)；黄病毒科；冠状病毒科；呼肠孤病毒科(如轮状病毒等等)；双RNA病毒科；弹状病毒科(如，狂犬病毒等等)；正粘病毒科(如A、B和C型流感病毒，等等)；线状病毒科；副粘病毒科(如流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等等)；布尼亚病毒科；沙粒病毒科；逆转录病毒科(如HTLV-I；HTLV-II；HIV-1(也称作HTLV-III、LAV、ARV、hTLR等等))家族的成员，包括但不限于，尤其是来自分离物HIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN；HIV-1CM23S、HIV-1US4；HIV-2等的抗原；猴免疫缺陷病毒(SIV)；乳头瘤病毒；蜱传脑炎病毒；等等。参见，例如Virology，第三版(W.K.Joklik编辑，1988)；Fundamental Virology，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe编辑，1991)，描述了这些病毒和其它病毒。
在上下文中，选择的抗原优选是从病毒病原体获得或来源的病毒抗原，所述病毒病原体一般通过粘膜表面进入体内，并已知会导致人类疾病或与人类疾病相关，如但不限于，HIV(AIDS)、流感病毒(Flu)、单纯疱疹病毒(生殖传染、单纯性疱疹、STD)、轮状病毒(腹泻)、副流感病毒(呼吸道感染)、脊髓灰质炎病毒(脊髓灰质炎)、呼吸道合胞病毒(呼吸道感染)、麻疹和流行性腮腺炎病毒(麻疹、流行性腮腺炎)、风疹病毒(风疹)和鼻病毒(普通感冒)。
本发明构建体的异源编码序列所编码的细菌性和寄生性抗原，包括获自或源自与以下疾病相关的已知致病因子的那些抗原，所述疾病包括但不限于，白喉、百日咳、破伤风、结核、细菌或真菌性肺炎、中耳炎、淋病、霍乱、伤寒、脑膜炎、单核细胞增多症、瘟疫、志贺氏菌病或沙门氏菌病、军团病、莱姆病、麻风病、疟疾、钩虫病、盘尾丝虫病、血吸虫病、锥虫病(Trypamasomialsis)、利什曼病(Lesmaniasis)、贾第虫病、阿米巴病，丝虫病、疏螺旋体病和旋毛虫病。
抗原还可以获自或源自非常规病毒如朊病毒，包括库鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、瘙痒病、传染性水貂脑病和慢性萎缩病的致病因子，或获自或源自与疯牛病相关的朊病毒。它们也可以是，或源自导致家族性致命性失眠的朊病毒。在朊病毒疾病中，具有与疾病相关的朊病毒蛋白的特定构象形式以及正常构象形式，构建体表达的抗原优选的是只引起针对与朊病毒蛋白的疾病相关构象形式的应答，而不是针对该蛋白的正常形式的应答。
能从中获得抗原的特异性病原体可以包括，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体属(Chlamydia)、淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio Cholera)、苍白密螺旋体(Treponema pallidua)、假单胞菌属(Pseudomonas)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、布鲁氏菌(Brucella)、弗朗西丝氏菌(Franciscellatulorensis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、钩端螺旋体(Leptospria interrogaus)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、链球菌(Streptococcus，A和B型)、肺炎球菌(Pneumococcus)、脑膜炎球菌(Meningococcus)、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza，b型)、弓形体(Toxoplamagondic)、Complybacteriosis、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)、腹股沟肉芽肿(Donovanosis)和放线菌病(Actinomycosis)；真菌病原体包括念珠菌病和曲霉病；寄生性病原体包括绦虫、吸虫、线虫、阿米巴病、贾第虫病、隐孢子虫、血吸虫、卡氏肺孢子虫、毛滴虫病和旋毛虫病。因此，本发明也可用于提供合适的针对许多兽类疾病的免疫应答，所述兽类疾病如口蹄疫、冠状病毒、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、螺杆菌、寻常圆线虫(Strongylus vulgaris)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumonia)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、肺炎克雷白菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(E.Coli)、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertusssis)和支气管脓毒博德特氏菌(Bordetella brochiseptica)。
在一些实施方案中，本发明构建体表达的一个或多个，优选所有的抗原为肿瘤抗原。优选这些抗原是肿瘤特异性的，而且不由其它细胞类型或至少该受试者的其它细胞类型表达。这种抗原可以源自恶性肿瘤，尤其是转移性肿瘤。在一些情况下，抗原可以是特异性地从要治疗的受试者分离的，或与受试者的肿瘤表达的特异性肿瘤抗原相匹配。
在其它的实施方案中，抗原可以是自身抗原，尤其是参与或导致自身免疫疾病或紊乱的自身抗原。可替换地，抗原可以是或源自过敏原。
佐剂
在一些实施方案中，本发明可有效地与任何合适的佐剂或佐剂的组合一起使用。例如，合适的佐剂包括，但不限于，由铝盐(铝)如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等等形成的佐剂；水包油和油包水乳剂形式，如完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；由细菌细胞壁组分形成的佐剂，如包含脂多糖类(如脂质A或单磷酰脂质A(MPL)，Imoto等，(1985)Tet.Lett.26：1545～1548)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的佐剂；热激蛋白或其衍生物；源自ADP-核糖基化细菌毒素的佐剂，包括白喉毒素(DT)、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热毒素(LT1和LT2)、假单胞菌内毒素A、假单胞菌外毒素S，腊状芽孢杆菌(B.cereus)胞外酶、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)毒素、肉毒梭菌(C.botulinum)C2和C3毒素、泥渣梭菌(C.limosum)胞外酶、以及来自产气荚膜梭菌(C.perfringens)、螺状梭菌(C.spiriforma)和艰难梭菌(C.difficile)的毒素、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)EDIN，和ADP-核糖基化细菌毒素的突变体如CRM197，无毒的白喉毒素突变体(参见，例如Bixler等(1989)Adv.Exp.Med.Biol.251：175；和Constantino等(1992)Vaccine)；皂甙佐剂如Quil A(美国专利号5,057,540)，或从皂甙产生的颗粒如ISCOM(免疫刺激复合物)；趋化因子和细胞因子，如白细胞介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、等等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-SCF)、肿瘤坏死因子(TNF)、防御素1或2、RANTES、MIP1-α和MIP-2，等等；胞壁酰肽如N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰基-sn-甘油基-3羟基磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)等等；源自CpG家族分子、CpG二核苷酸和含有CpG基序的合成寡核苷酸的佐剂(参见，例如Krieg等，Nature，(1995)，374：546，Medzhitov等，(1997)Curr.Opin.Immunol.9：4～9，和Davis等，J.Immunol.(1998)160：870～876)如TCC ATGACG TTC CTG ATG CT(SEQ ID NO：1)和ATC GAC TCT CGA GCGTTC TC(SEQ ID NO：2)；以及合成的佐剂如PCPP(聚[二(羧基苯氧基)磷腈)(Payne等，Vaccines(1998)16：92～98)。这些佐剂从很多销售商如Accurate Chemicals c；Ribi Immunechemicals，Hamilton，MT；GIBCO；Sigma，St.Louis，MO，购买。
优选用于本发明的佐剂是咪喹莫特。咪喹莫特是1-(2-甲基-丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺。它的分子式为C14H16N4，分子量为240.3。咪喹莫特的结构如下：
Figure A0382539900331
另一种优选的佐剂是瑞喹莫德：
Figure A0382539900341
瑞喹莫德是4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇。(R-848；S-28463)。咪喹莫特和瑞喹莫德的适当衍生物也可使用。
佐剂可以单独递送或以两种或多种佐剂的组合递送。在这点上，组合佐剂在促进免疫应答上可能具有加成或协同效应。协同效应是其中组合两种或多种佐剂获得的效果比把每个佐剂单独施用时获得的效果简单相加所预期获得的效果大。
佐剂可由施用给受试者的核酸构建体表达。佐剂可由本发明的构建体或其它构建体编码。本发明的构建体可因此包括编码佐剂的区域，其可操作地连接到允许在受试者中表达佐剂的调控元件上。
在佐剂由核酸编码的实施方案子中，可使用任何合适的基因表达调控单元来表达该佐剂。可使用能引起高水平组成型表达佐剂的启动子。可替换地，也可使用与用于表达抗原的那些基因调控单元相似或相同的基因表达调控单元。
在佐剂由来自与本发明核酸构建体不同的其它构建体编码的实施方案中，编码佐剂的构建体优选与本发明的构建体一起同时或依次施用。一般地，二者可作为单个组合物施用。例如，可将两个构建体包被到相同的颗粒上，或可替换地包被到单独的颗粒上然后混合。本发明提供了包含这种颗粒或颗粒的混合物的组合物。
在佐剂由待施用给受试者的核酸编码的实施方案中，优选佐剂的例子包括这里提及的任何多肽佐剂，尤其是PT、CT、LT和DT。
病毒基因组核酸的制备
一般地，用于本发明的病毒基因组核酸可从选择的特定病毒的基因组文库获得。也可使用其它方法，如以几个片段或者单个片段对病毒基因组的选定区域进行PCR扩增，或从病毒基因组的亚区域的已存在克隆获得该区域。
病毒基因组文库可通过本领域已知的任何方法产生。在本发明的很多实施方案中，本发明构建体中的病毒基因组核酸可以是来自基因组文库的片段，或可以源自该片段。各种来源可用于基因组DNA。基因组DNA可以商购，例如，来源于如Advanced Biotechnologies Inc(ABI)和Clonetech，Inc。另一种标准来源是直接从选择的病毒分离的基因组DNA。
用于本发明构建体的病毒基因组核酸以及构建体本身，可以是双链或单链核酸，而且可以是RNA或DNA。在本发明中使用RNA病毒的实施方案中，RNA可以首先转换成DNA，然后在从该DNA产生RNA构建体之前以这种形式进行人工操作。
来自选定来源的基因组DNA可通过标准程序分离，其一般包括连续的苯酚和苯酚/氯仿提取，之后乙醇沉淀。沉淀之后，来自感兴趣病毒的DNA可用限制性内切酶进行处理。可故意地用限制性内切酶进行部分消化以获得较长的片段。可替换地，基因组DNA可进行完全消化。使用的限制性内切酶可基于使用其切割DNA的平均频率来进行选择，以使得到的消化物中的大部分片段都在某个所需的大小范围内。选定大小的DNA片段可通过多种技术进行分离，包括琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或脉冲场凝胶电泳(Carle等(1984)Nuc.Acid Res.12：5647～5664；Chu等，(1986)Science 234：1582；Smith等(1987)Methods inEnzymology 151：461)，以提供用于克隆的合适大小的起始材料。
基因组片段可进行平末端化，并克隆到相似的平末端化载体中，或可具有来自限制性酶切割的特定单链突出端，从而克隆到已经制备成能提供相容的突出端的载体中。限制性切割的片段可进行平末端化，如果需要，在存在四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)时，使用标准技术用大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段(Kleow)进行处理。Kleow片段填补5’单链突出端，但是尽管存在4种dNTP，仍消化突出的3’单链。如果需要，可通过提供仅仅一种、或几种选定的dNTP而在突出端的性质所规定的限制范围内进行选择性修复。在用Klenow处理后，混合物用如苯酚/氯仿进行提取，并进行乙醇沉淀。在合适的条件下用S1核酸酶或BAL-31进行处理，导致限制性片段中的任何单链部分的水解，也产生平末端化的片段。
一旦制备了合适的基因组片段，可以将它们克隆到任何合适的载体构建体或复制子中。合适的载体的例子是本领域熟知的。载体可以是，例如质粒，或在本发明的一些实施方案中可以是粘粒。当使用粘粒克隆载体时，克隆到它们中的基因组核酸片段一般是大的，优选大小在大约20,000bp(20kb)与50,000碱基对(50kb)之间(或其间的任何整数)，优选大约25kb与50kb之间，更优选大约30kb～35kb与50kb之间，甚至更优选大约35kb与大约50kb之间。合适的粘粒载体可商购，例如SuperCos 1粘粒载体试剂盒(Stratagene，La Jolla，California)。可如制造商的说明那样进行将DNA连接到粘粒中的操作，或根据说明书的教导使用本领域已知的方法根据经验确定。
在另一个优选的实施方案中，将病毒基因组片段克隆到质粒中以产生质粒文库。当使用质粒克隆载体时，片段的大小一般在5,000bp(5kb)与25,000碱基对(25kb)之间(或其间的任何整数)，优选大约10kb与25kb之间，更优选大约10kb～15kb与25kb之间，甚至更优选大约15kb与20kb之间。合适的质粒载体是可商购的。根据说明书的教导使用本领域已知的方法进行将DNA连接到质粒中的操作。
在本发明的需要从构建体的病毒基因组核酸中除去一些序列的实施方案中，除了插入的异源核酸外，存在于构建体中的病毒基因组核酸的量可以较小。例如，除了导入的异源编码序列长度外，载体中病毒基因组核酸的总大小可以为，长度为1kb到20kb，优选1kb到15kb，更优选3kb到12kb，甚至更优选5kb到10kb。
在本发明的很多实施方案中，将天然与选择的内源基因表达调控单元相关的内源编码序列缺失。这可通过任何合适的方法完成，但在很多实施方案中通过PCR完成。
两步PCR的策略可用于缺失编码序列。选择针对特定基因的单一限制性酶位点；一个位于内源编码序列内部，一个位于在基因外的5’区域内(基因上游)，第三个位于在3’区域内(基因下游)。然后用扩增从5’单一限制性位点刚好到编码序列上游的引物进行PCR反应。下游引物包含编码序列中单一限制性位点的序列。这提供了包含基因的5’区域的PCR产物，包含内源启动子和任何所需的其它调控元件，但缺乏编码序列，并包含5’限制性位点和编码序列内部的位点。含有野生型病毒基因组核酸的载体，然后用对单一5’和内部位点具有特异性的限制性酶进行消化，从而切除了基因的5’区域，然后用PCR产物取代该区域。对于基因的3’末端，重复相同的一系列步骤，得到以下构建体，其具有该基因的原始5’和3’末端，但其中已经除去了编码区。编码序列的全部剩余物为单一限制性位点，该单一限制性位点内可以插入异源编码序列。
通过产生其中具有单一限制性位点的构建体，该位点为内源编码序列以前所在的位置，这意味着可以将任何选择的异源编码序列插入到载体中。在一个实施方案子中，选择的异源编码序列可使用包含单一限制性位点的引物进行PCR扩增，以容易地克隆到所需位点中。在一些实施方案中，可将多个单一性位点设计到选择的启动子的下游，以在克隆策略中达到最大的机动性。
虽然，优选地，可通过从基因组病毒核酸的单个片段开始，然后对其进行改变，来生产本发明的构建体，但是使用其它的策略也可以获得相同的最终结果。例如，可将基因组核酸的区域一部分接一部分地组装起来。这可使导入必要的异源编码序列更容易。在一些实施方案中，这可允许缺失以有效地引入到基因组核酸中，如从病毒基因组核酸中除去不必要的序列。
在一些实施方案中，PCR可用于获得单个基因组核酸片段，以用于后续的改变，或用于扩增构建体的基因组核酸的特定亚区。PCR也可用于引入所需的序列改变如突变和/或引入特定的限制性位点。
本发明的构建体一般不包含全部的病毒基因组，但它们将包含病毒基因组的一个或多个亚区。因此，一般地，构建体本身将缺乏产生感染性病毒颗粒的能力。构建体可缺乏病毒的复制原点和/或病毒复制必要的一个或多个基因(构建体的病毒基因组核酸源自该病毒)。构建体的病毒基因组核酸序列可缺乏包装信号。该序列可缺乏编码包含于野生型病毒的病毒颗粒中的蛋白质或参与病毒复制的蛋白质的特定基因，构建体可不含这种基因。在一些实施方案中，从构建体中的病毒核酸序列表达的序列仅仅为异源编码序列，其可操作地连接到内源基因表达调控单元上。
在本发明的一个实施方案中，可通过除去选择的内源基因表达调控单元之间的一些不必要的序列，来缩短存在于构建体中的病毒基因组核酸序列。因此，可缺失来自与异源编码序列有关的转录终止子元件末端以及可操作地连接到异源编码序列上的另一个内源基因表达调控单元的部分或全部间隔序列。此外，或可替换地，可缺失基因表达调控单元5’和3’末端之间的部分或全部内源序列，其不构成单元本身的部分。这可使构建体更容易操作和繁殖。这也意味着，减少了野生型病毒与本发明构建体之间的重组机会。
至于缺失的无关(extraneous)序列的总量，相对于病毒基因组区域的大小(对应于构建体中病毒基因组核酸的5’和3’末端之间)，可除去超过10％，优选超过20％，更优选超过30％，甚至更优选超过50％的序列。在一些实施方案中，可缺失达75％，优选达85％，甚至更优选达95％的病毒基因组核酸序列。在一些情况下，可操作地连接到异源编码序列上的一个或多个内源基因表达调控单元上游的内源序列的长度，小于5kb，优选小于2.5kb，甚至更优选小于1kb，进一步优选小于500bp。这些可以是内源启动子上游的内源序列的量。紧邻内源基因表达调控单元下游尤其是异源编码序列下游的内源序列的量，可以为相似大小。
可以除去所有内源基因表达调控单元之间，或仅仅部分的内源基因表达调控单元之间的序列。在一些情况下，除了参与异源编码序列的表达的内源序列，可缺失所有的内源序列。该缺失可以是，例如，大小为至少250bp，优选至少1kb，更优选至少2.5kb，甚至更优选至少5kb。引入的缺失可对应于邻近内源基因表达调控单元配对之间的单个缺失，或者也可引入多个缺失。缺失可限定于非编码区。一般地，引入缺失是为了降低构建体的大小，而不是为了减毒的目的。
在本发明的一些实施方案中，内源基因表达调控单元由内源启动子组成。在这些实施方案中，可操作地连接到异源编码序列上的内源启动子之间的部分或全部间隔序列可以缺失。缺失的区域可以典型地为这里描述的任何大小。内源基因的其它组件如转录的非编码序列和/或增强子元件也可除去，并可用异源序列取代任何组件。
可使用任何合适的技术引入缺失。例如，可用限制性酶切割构建体，该限制性酶在要缺失的区域的任何一侧进行消化。可从不想要的片段纯化所得到的载体，并进行再连接以提供含有所需缺失的载体。其它技术如PCR可用于引入选择的缺失。测序和限制性酶消化可用于确认想要的缺失已经减少了。为了在克隆过程中筛选具有所需的缺失的构建体，在转化之前，可使用能在要缺失的区域内部进行切割的限制性酶对消化物进行消化。
除去部分或全部的序列以减少载体的大小，同样也可用于含有与这里讨论的其它构建体相似的构建体的病毒基因组核酸，所述与这里讨论的其它构建体相似的构建体仅仅在以下方面有所不同，其中在相同阶段表达的内源启动子可操作地连接到天然与内源启动子相关的编码序列上，而不是异源编码序列上。例如，病毒基因组核酸可分离自HSV，并且意欲将构建体用于产生针对立即早期蛋白如ICP 0、4、22和27的免疫应答，这些立即早期蛋白在它们的正常内源启动子的控制下从病毒基因组核酸表达。将编码要表达的抗原的无关序列以及与这些序列可操作地连接的内源基因表达单元除去，同样对这种基因组核酸构建体有利。此外，可以将基因表达调控单元的两个末端之间的无关序列除去，以进一步减小构建体的大小。
因此，本发明还提供了一种产生核酸构建体的方法，该核酸构建体用于直接施用给受试者以在受试者中激发免疫应答，所述方法包括：
(a)将病毒基因组核酸插入到载体骨架中，所述的病毒基因组核酸包含至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒生活周期中的相同阶段具有活性；而且
(b)在将病毒基因组核酸插入到载体骨架中之前、同时或之后，从病毒基因组核酸缺失除了至少两个内源基因表达调控单元之外的部分或全部病毒序列，其存在于与构建体的病毒基因组核酸的5’与3’末端之间区域对应的病毒基因组区域中，
其中插入到载体骨架中的病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
引入的缺失可以具有与这里讨论的任何缺失相似的性质，而且产生的构建体可具有相似的特性并用于本发明的任何其它构建体，除了内源基因表达调控单元连接到它们天然的编码序列上，而不是异源编码序列上的事实之外。因此，可使用这些构建体生产包被的颗粒、剂量容器，颗粒介导的递送装置等，而且构建体可用于免疫方法与获得本文其它地方所讨论的基因表达的方法中。
构建体的施用
这里所述的核酸构建体与辅助物质可通过合适的方法施用。在一个优选的实施方案中，下面所述，可通过将合适的构建体(如粘粒或质粒)包被到核心载体颗粒上，然后把该包被的颗粒施用给受试者或细胞，来施用该构建体。然而，基因组片段也可使用其它非病毒系统如裸核酸递送来进行递送。
虽然构建体可通过病毒的方式递送，但是优选不使用该方式。因此，一般地，构建体通过非病毒方式直接递送给受试者。从而该构建体可缺少病毒包装信号序列和/或病毒复制原点。一般地，它将缺少病毒基因组核酸来源病毒的天然的病毒包装序列和/或病毒复制原点。构建体优选不需要辅助病毒和/或反式提供的病毒蛋白质以进行复制，尤其不使用辅助病毒或来自基因组核酸来源病毒的蛋白质来进行复制。然而，在基于粘粒的构建体的情况中，可以反式提供λ蛋白，而且病毒具有用于复制的必要的粘粒序列。
在将单独的核酸构建体用于表达佐剂的实施方案中，构建体可与本发明的构建体一起制备或单独制备。如果单独制备，制备方法可与用于制备本发明的构建体相同；和/或制备方法也可除了存在的构建体之外，彼此相同。两种构建体可以采用任何合适的比例施用，如，例如，以等摩尔量或摩尔比为1∶2，优选1∶5，或更优选1∶10，而且任一个构建体均可为较多的那个。本发明还提供了包含本发明的构建体和编码佐剂的构建体的疫苗。
常规的药物制品
含有本发明构建体的制品，其添加有或未添加有佐剂组合物，可使用标准的药物制备化学和方法进行制备，所有药物制备化学和方法对本领域普通技术人员来说都是很容易获得的。例如，含有一种或多种构建体的组合物可与一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体组合，以提供液体制品。
辅助物质，如湿润或乳化剂，pH缓冲物质等等，可存在于赋形剂和载体中。这些赋形剂、载体和辅助物质通常为药物制剂，其不能在接受该组合物的受试者中诱导免疫应答，其可以被施用而不具有不适当的毒性。药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，液体如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。其中也包括药学上可接受的盐，例如，无机酸盐如氢氯化物、氢溴化物、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸盐如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。
尽管不是必需的，但也优选所述制品含有作为稳定剂的药学上可接受的赋形剂，特别是在疫苗组合物包含多肽，蛋白质或其它类似分子时，更是如此。同样用作肽的稳定剂的合适载体的例子包括，但不限于，药学级的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、葡聚糖等等。其他合适的载体包括，但不限于，淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEGs)，以及它们的组合。Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中有对药物可接受赋形剂、载体和辅助物质的全面讨论，引入本文作为参考。
核酸的吸收和/或表达的某些促进剂(“转染促进试剂”)也可包含在组合物中，例如，促进剂如布比卡因、心脏毒素和蔗糖，以及转染促进载体如脂质体或常规用于递送核酸分子的脂质制剂。阴离子和中性脂质体可广泛获得且熟知用于递送核酸分子(参见，例如，Liposomes：APractical Approach，(1990)RPC New Ed.，IRL Press)。阳离子脂质体制剂也是熟知用于递送核酸分子的载体。合适的脂质体制剂包括DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基铵氯化物)，可从商标名LipofectinTM获得，以及DOTAP(1，2-双(油酰氧)-3-(三甲铵基)丙烷)，参见，例如，Felgner等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413～7416；Malone等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6077～6081；美国专利号5,283,185和5,527,928，以及国际公布号WO 90/11092、WO91/15501和WO 95/26356。这些阳离子脂质体可优选与中性脂质联合使用，所述中性脂质例如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)。更进一步的可加入到上述脂质或脂质体制剂的转染促进组合物包括精胺衍生物(参见，例如，国际公布号WO 93/18759)和膜渗透化合物如GALA、短杆菌肽S和带正电的胆盐(参见，例如，国际公布号WO 93/19768)。
或者，本发明的核酸分子可装入胶囊，吸附到颗粒载体上或与颗粒载体联合。合适的颗粒载体包括那些源自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物，以及源自聚(交酯类)和聚(丙交酯-并-乙交酯)的PLG颗粒。参见，例如，Jeffery等(1993)Pharm.Res.10：362～368。也可使用其他的颗粒系统和多聚物，例如，多聚物如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺，以及这些分子的偶联物。
所制得的疫苗组合物将包含本发明的构建体。合适的有效量可由本领域技术人员很容易地确定。该有效量将落入相对较宽的范围，其可通过常规试验确定。例如，使用少至1μg的DNA已获得了免疫应答，然而在其他施用中，使用高至2mg的DNA。通常可预料的是构建体的有效剂量将落入约10μg至1000μg构建体的范围内，然而，该范围之上或之下也可以确实是有效的。该组合物因此可包含约0.1％至约99.9％的构建体。
常规药物制剂的给药
上述药物制剂的给药可以在治疗过程连续或间歇以一个剂量的形式完成。递送最典型的是通过用于液体组合物和用于包含颗粒组合物的液体悬浮液的常规的针和注射器。另外，各种液体喷射注射器是现有技术中已知的且可用于施用本发明组合物。确定给药的最有效途径和剂量的方法对于本领域技术人员来说是熟知的且可随递送载体、治疗组合物、靶细胞和被治疗个体而改变。单次或多次给药可按主治医师选择的剂量水平和模式进行。
此外，还涉及由本发明方法递送的构建体与其他合适组合物以及治疗的联合。例如，为了在受试者中增强免疫应答，本文描述的组合物和方法可进一步包括辅助物质(如佐剂)，例如药理学试剂、细胞因子等等。辅助物质可以在施用本文所述DNA疫苗(例如粘粒或质粒)的同时、之前或之后以例如蛋白质或其他大分子给药。该组合物也可使用本领域技术人员熟知的方法直接施用于受试者或可替换地，递送至来自受试者体内的细胞。
包被的颗粒
在一个实施方案中，本发明的构建体，以及其他辅助成分如佐剂用载体颗粒进行递送。用于施用核酸制剂的颗粒介导递送方法是现有技术中已知的。因此，一旦制备和适当纯化，上述构建体可使用现有技术中的许多技术而被包被在载体颗粒(例如，核心载体)上。载体颗粒选自在粒径范围内具有合适密度的材料，所述粒径范围为在通常用于由适当的颗粒递送装置进行胞内递送的范围。显然，最适的载体颗粒大小将取决于靶细胞的直径。
为实现本发明的目的，可使用的核心颗粒包括钨、金、铂和铱核心载体颗粒。优选钨和金颗粒。很容易得到直径为0.5μm至2.0μm平均大小的钨颗粒。虽然这样的颗粒具有微粒递送方法中使用的最佳密度，且允许用核酸进行高效包被，但是钨可能潜在地对某些细胞种类具有毒性。因此，金颗粒或微晶金(例如，金粉A1570，可从Engelhard Corp.，East Newark，NJ获得)将在本发明方法中发挥作用。金颗粒提供大小方面的均一性(可从Alpha Chemicals获得大小为1μm～3μm的颗粒，或从Degussa，South Plainfield，NJ获得大小范围包括0.95μm的微粒)以及降低的毒性。
许多方法是已知的且已被描述用于将DNA或RNA包被或沉淀到金或钨微粒上。大部分这样的方法中通常将预定量的金或钨与质粒DNA、CaCl2以及亚精胺联合。在包被过程中连续涡旋所得到的溶液以确保反应混合物的均一性。在核酸沉淀后，可将包被的颗粒转移至合适的膜上且使其在使用前干燥，将其包被至样品模块或盒的表面上，或装载入递送盒用于合适的微粒递送装置中。
也可将多肽佐剂(例如，细胞因子和细菌毒素)包被在同样或类似的核心载体微粒上。例如，多肽可通过以下方法而粘附到载体颗粒：通过以根据经验确定的比率简单地混合两种组分载体颗粒，硫酸铵沉淀或其他本领域技术人员熟知的溶剂沉淀方法，或通过将多肽化学偶联至载体颗粒。将L-半胱氨酸残基偶联至金的方法先前已有描述(Brown等，Chemical Society Reviews 9：271～311(1980))。其他方法可包括，例如，将多肽佐剂溶解至纯乙醇、水、或醇/水混合物中，将溶液加入至定量的载体颗粒，随后将混合物在涡旋时在空气或氮气流下干燥。或者，佐剂可通过真空离心而干燥在载体颗粒上。一旦干燥，可将包被的颗粒重悬浮入合适的溶剂中(例如，乙酸乙酯或丙酮)，随后粉碎(例如，通过超声波)以提供基本上均一的悬液。用佐剂包被的核心载体颗粒随后可与携带本发明核酸构建体的核心载体颗粒联合且在单个微粒注射步骤中施用，或与核酸构建体组合物分开施用。
在某些实施方案中，编码佐剂的构建体可被包被至与本发明构建体同样的颗粒上或可被包被至分离的颗粒上随后与包被本发明构建体的颗粒混合。
包被的颗粒的施用
制备后，将包被有本发明构建体的核心载体颗粒，单独或与例如佐剂制剂的联合，用颗粒介导的递送技术递送到受试者。
多种适于进行颗粒介导的递送技术的颗粒递送装置在现有技术中是已知的。目前的装置设计应用爆发性的放电或放气以向靶细胞推进包被的核心颗粒。包被的载体颗粒本身可释放性地附着于活动的载体薄片上，或可移动地附着于气流沿着经过的表面，将颗粒从表面提起并使其向目标加速。一个放气装置的例子描述于美国专利号5,204,253。一种爆发式的装置描述于美国专利号4,945,050中。一个放电式的颗粒加速装置的例子描述于美国专利号5,120,657中。另一个适于用于本文的放电装置描述于美国专利号5,149,655中。所有这些专利所公开的内容在此全部引入本文作为参考。
包被的颗粒以与剂量相容的方式和以引起所需免疫应答的有效量施用于待治疗的受试者。待递送组合物的量，对于核酸分子，其通常在每剂量从0.001μg至100.0μg，更典型地从0.01μg至10.0μg，以及优选从0.1μg至5μg核酸分子的范围，而对于多肽或蛋白质分子，其为1μg至5mg，更典型地从1μg至50μg，优选从5μg至25μg多肽的范围，这取决于待治疗的受试者。
在欲施用编码抗原的构建体的实施方案中，可以施用类似量的这样的构建体。或者，本发明构建体以及编码佐剂构建体的总量可落于上述范围内。
所必需的构建体的精确量将随被免疫受试者的年龄和总体状况、所选择的特定核酸序列或多肽、以及其他因素的改变而改变。合适的有效量可由本领域技术人员通过阅读本说明书而很容易地确定。
因此，此处所述的构建体的有效量将足以在被免疫受试者中引起适当的免疫应答，且将落入通过常规试验可确定的相对较宽的范围。优选，将包被的核心微粒递送至合适的受体细胞以在被治疗的受试者中引起免疫应答(例如，T细胞激活)。
颗粒组合物
可替代地，本发明的构建体，连同一种或多种选择的佐剂，可制成颗粒组合物。更具体地，包含感兴趣的构建体的颗粒的制备可使用标准的药物制备化学和方法学进行，所有的这些是本领技术人员很容易得到的。例如，一种或多种构建体和/或佐剂可与一种或多种药物可接受的赋形剂或载体联合而提供免疫组合物。在某些实施方案中，编码佐剂的核酸，而不是佐剂本身，可包含于组合物中。辅助物质，如湿润或乳化剂、pH缓冲液物质等，可存在于赋形剂或载体中。这些赋形剂、载体和辅助物质通常为在接受组合物的个体中本身并不引起免疫应答的药物试剂，且可被施用而不带有不适当的毒性。药物可接受赋形剂包括，但不限于，液体如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。药物可接受盐也可包括在内，例如，无机酸盐如盐酸盐、氢溴化物、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。
优选地，虽不是必需的，核酸组合物包含用作稳定剂的药物可接受载体，尤其是对肽、蛋白质或其他类似的佐剂或辅助物质，更是如此。同样用作肽的稳定剂的合适载体的例子包括，但不限于，药学级的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、葡聚糖等等。其他合适的载体包括，仍不限于，淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEGs)，以及它们的组合。Remingtons Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中有对药物可接受的赋形剂、载体、稳定剂和其他辅助物质的全面讨论，引入本文作为参考。
将制得的组合物以足以引起免疫应答的量，如上述定义的，进行递送。合适的有效量可由本领域技术人员很容易地确定。该有效量将落入相对较宽的范围内，通常感兴趣的核酸构建体为约0.1μg至25mg或更多的范围内，且具体的合适量可通过常规试验确定。
组合物可包含约0.1％至约99.9％，优选1％至80％，更优选10％至50％以及甚至更优选20％至40％的核酸分子。如果组合物包含佐剂，或将该方法用于提供颗粒佐剂组合物，则佐剂将以上述合适的量存在。随后可使用标准技术，如通过简单蒸发(空气干燥)、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥(冻干)、喷雾-冷冻干燥、喷雾包被、沉淀、超临界液体颗粒形成等等将组合物制成颗粒。如果需要，得到的颗粒可使用共同拥有的国际公布号WO 97/48485中描述的技术增加密度，将其引入作为参考。
单个单位剂量或多剂量容器(颗粒可在使用前被包装入该容器中)，可包括密封的容器，该容器内封有合适数量的颗粒，该颗粒包含合适的核酸构建体和/或选择的佐剂(例如，以提供疫苗组合物)。颗粒组合物可包装成无菌制剂，且可因此对密封容器进行设计以在本发明方法中使用前保持制剂的无菌。如果需要，容器可适应于在颗粒递送装置中的直接使用。所述容器可以采用胶囊、箔袋、小囊、盒等形式。在此处描述了合适的颗粒递送装置(例如，无针注射器)且其也可与用于递送的颗粒一起包装。
其中包装了颗粒的容器可进一步贴上标签以识别组合物和提供相关的剂量信息。另外，容器可用以政府机构例如食品和药品管理机构规定的形式进行标注，其中标注显示在制造业联邦法律下由该机构批准、其中含有的用于人类施用的抗原、佐剂(疫苗组合物)的使用或出售。
颗粒组合物(单独包含一种或多种感兴趣的构建体，或与选择的佐剂的联合)可随后使用经皮递送技术施用。优选，颗粒组合物通过粉末注射方法进行递送，例如，从如共同拥有的国际公布号WO 94/24263、WO 96/04947、WO 96/12513和WO 96/20022中描述的无针注射系统进行递送，所有这些国际申请引入本文作为参考。颗粒从所述无针注射系统的递送通常以具有大致大小通常在0.1μm至250μm范围，优选约10μm～70μm范围的颗粒来实施。大于约250μm的颗粒也可从该装置进行递送，其上限为颗粒大小会引起对皮肤细胞的不当损伤时所在的点。所递送的颗粒将穿透靶表面的实际距离取决于颗粒大小(例如，假定为大致球形颗粒球的标称颗粒直径)、颗粒密度、颗粒撞击表面的起始速度、以及靶皮肤组织的密度和动力学粘度。鉴于此，用于无针注射的最佳颗粒密度通常在约0.1g/cm3至25g/cm3范围，优选为约0.9g/cm3至1.5g/cm3，更优选为约1.2g/cm3至1.4g/cm3；而注射速率通常在约从100m/sec至3000m/sec的范围内，或更大。在合适的气体压力下，平均直径为10μm～70μm的颗粒可以被加速到通过喷嘴时接近推进气流的超音速时的速度。
如果需要，这些无针注射系统可在包含合适剂量的颗粒的预装载条件下提供，所述颗粒包含构建体和/或选择的佐剂。装载的注射器可被包装入密封的容器，可将该容器进一步如上所述贴上标签。
因此，该方法可用于获得具有以下大小范围的核酸颗粒：约10μm至约250μm，优选约10μm至约150μm，最优选约20μm至约60μm；且颗粒密度范围为约0.1g/cm3至约25g/cm3以及体积密度为约0.5g/cm3至约3.0g/cm3，或更大。
同样地，可获得具有以下大小范围的所选佐剂颗粒：约0.1μm至约250μm，优选约0.1μm至约150μm，最优选约20μm至约60μm；颗粒密度范围为约0.1g/cm3至约25g/cm3以及体积密度优选约0.5g/cm3至约3.0g/cm3，最优选约0.8g/cm3至1.5g/cm3。
颗粒组合物的施用
制备后，颗粒组合物(例如，粉末)可使用合适的经皮递送技术经皮递送到脊椎动物受试者的组织。各种适合施用感兴趣的物质的颗粒递送装置在现有技术中是已知的，且将在本发明的实践中发挥作用。特别优选的经皮颗粒递送系统应用无针注射器以将受控剂量的固体颗粒喷射进且穿过完整的皮肤和组织。参见，例如，Bellhouse等的美国专利号5,630,796，其描述了一种无针注射器(也称作“PowderJect颗粒递送装置”)。其他无针注射器结构在现有技术中是已知的且在本文中得以描述。
本文描述的含有治疗有效量的粉末状分子的组合物可通过上述的颗粒递送装置递送至任何合适的靶组织。例如，可将组合物递送至肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、软骨、胰脏、肾脏、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、腺和结缔组织。对于核酸构建体，优选递送至终末分化细胞并且在其中表达分子；然而，分子也可递送至未分化或部分分化的细胞如血液干细胞和皮肤成纤维细胞。
粉末状组合物以与剂量制剂相容的方式和以预防和/或治疗的有效量施用于待治疗的受试者。待递送的组合物的量，通常范围为每剂量0.5μg/kg至100μg/kg核酸构建体，这取决于待治疗的受试者。对于其他药物，如有生理活性的肽和蛋白质，通常范围为约0.1μg至约20mg，优选10μg至约3mg。所必须的精确量将随待治疗受试者的年龄和总体状况、所治疗病症的严重性、递送的特定制剂、给药部位以及其他因子的改变而改变。合适的有效量很容易由本领域技术人员确定。
因此，本发明颗粒组合物的“治疗有效量”会足以带来疾病或病症的治疗或预防，且将落入通过常规试验可确定的相对较宽的范围。
以下为实施本发明的特定实施方案的实施例。提供实施例仅用于解释目的，而不是旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
已尽力保证所用数字(例如，含量、温度等)的准确，但是一些实验误差和偏差当然应该是允许的。
实施例1：OP23-6构建体的构建
构建包含所有4个立即早期基因，但缺乏无关病毒基因组序列的HSV-2构建体。构建该载体的起始点是包含三个EcoRI片段的粘粒，基于已公开序列(HG52株系)，所述片段来自HSV-2基因组的HSV-2MS株系跨越110,931至147,530的核苷酸。基因顺序也在已公开序列中显示。
粘粒用EcoRI部分消化并重新连接且选择只有28,000片段(110,931～139,697)的构建体。将该分子命名为OP-23。从该分子进行六种改变以除去大部分来自病毒基因组核酸的非必须序列。改变如下：
1.粘粒的Bst1107I和ScaI消化以及重新连接(除去氨苄青霉素抗性基因)以产生OP23-1。
2.NsiI消化和重新连接以除去SV40的复制起点并产生OP23-2。
3.BstXI部分消化和重新连接以除去ICP27和ICP0间的区域而得到OP23-3。
4.用BspHI进行彻底消化，随后用BsiWI进行部分消化然后重新连接以除去邻近ICP22基因的序列和一些骨架序列。这得到OP23-4。
5.SrfI消化和重新连接以产生OP23-5(除去ICP4和ICP0间的序列)。
6.BstXI全部消化和重新连接以产生OP23-6(除去来自ICP27和ICP0间的小片段)。
对OP23-6构建体进行测序以证实载体的结构和其序列。
构建体OP23和OP23-1至OP23-6的结构在图1中显示。
实施例2：缺乏无关序列的多抗原HSV1疫苗的产生
可以制备与实施例1中所述与针对HSV-2的疫苗相似类型的针对HSV-1的疫苗。
对HSV-1进行EcoRI部分消化以产生基因组片段，随后用来自Stratagene的superCos试剂盒产生包含这些片段的粘粒。接着选择包含HSV-1基因组的从110,095至146,694序列的粘粒。随后可进行几次消化和重新连接以产生最终的紧密型载体，该紧密型载体表达4个来自HSV-1的立即早期基因，但缺乏大部分非必要的间插序列：
进行下列步骤以产生所需的构建体：
1.将粘粒HSV1(43392bp)用ScaI和NdeI消化且重新连接以得到OPhsv1-1。
2.将OPhsv1-1(39694bp)用AflII和ClaI消化且重新连接以得到OPhsv1-2。
3.将OPhsv1-2(31365bp)用EcoRV和SwaI消化且重新连接以得到OPhsv1-3。
4.将OPhsv1-3(30727bp)用BbvC1消化且重新连接以得到OPhsv1-4。
5.将OPhsv1-4(27688bp)用Bpu11021和BbvC1消化且重新连接以得到OPhsv1-5。
6.将OPhsv1-5(26121bp)用kpn消化以及用Psp14061部分消化，且重新连接，以得到OPhsv1-6最终构建体，其具有所有4个立即早期基因，但大部分其他无关序列已经被从其中除去。
实施例3：异源编码序列的插入
(i)一般策略
实施例1中产生的OP23-6构建体用于产生其中ICP 0、4、22和27编码序列由异源编码序列置换的构建体。所用的基本策略为首先除去原先的编码序列，随后在其位置插入异源编码序列。对于每个欲被置换的编码序列，原则是找到三个单一限制性酶位点；一个在基因内部；一个在基因外5’区域内，位于上游；和一个在3’区域内，位于下游。随后采用两个步骤来置换编码序列。
选择PCR引物来对从并包含5’上游单一限制性位点刚好至编码序列的起点进行扩增。3’引物包含编码序列内的单一限制性位点。PCR产生具有基因的5’区域、非编码序列的DNA片段，并用编码序列中的单一限制性位点加尾。随后将原始载体用对5’限制性位点和编码序列内部的限制性位点特异的特定酶消化以切除基因的5’部分。随后将其用同样的酶消化的PCR产物置换。对编码序列的3’端重复同样的一系列步骤以得到具有基因的原始5’和3’端的最终构建体，但所述基因中的编码序列已被除去。构建体所保留的是其中的单一酶切位点。然后将新基因插入该位点。随后可对与所需量同样多的OP23-6中存在的ICP基因重复该过程。
(ii)分子生物学
利用操作DNA序列的标准分子生物学方法将OP23-6转化为所需的多基因构建体，其表达异源抗原。为产生合适的DNA片段以置换原始OP23-6的片段，进行多聚酶链式反应(PCR)且将片段克隆入pTARGET载体(Promega)中。随后通过限制性消化鉴定阳性克隆并将从阳性克隆的细菌培养物中纯化的DNA用于分离所需片段的纯制备物。将从琼脂糖凝胶纯化的片段连接入OP23-6载体中，该载体先前已用合适的限制性酶进行酶切并从琼脂糖凝胶中进行纯化。随后通过限制性消化筛选阳性克隆。
欲插入载体中的异源基因通过PCR反应获得，其中在PCR片段的5’和3’末端经改造加入了适当的限制性位点。含有所需插入片段的阳性克隆通过限制性消化来筛选且同时证实正确的定向。进行DNA测序以证实得到的克隆包含所需的序列。
(iii)DNA疫苗的制备
使用用于DNA疫苗的钙/亚精胺制剂的标准方法获得DNA至金颗粒上的沉淀。DNA与2微米的金颗粒在含有300ml的50mM亚精胺的小离心管中混合。加入的DNA量为2μg DNA/mg金颗粒且制得常规批量的26mg金颗粒(52μg DNA)。通过在旋转混合器上连续振荡试管过程中加入1/10体积的10％CaCl2而将DNA沉淀在金颗粒上。DNA-金复合物用纯乙醇洗涤三次随后装入Tefzel管中，干燥并切成0.5英寸的片断用于XR-1装置中。
对于免疫，将DNA疫苗通过XR-1装置递送入Balb/C小鼠的腹部。每次免疫进行单个注射且给动物进行初次免疫并在4星期进行增强免疫。最终免疫两星期后从动物体收集样品。
(iv)抗体ELISA(酶联免疫吸附测定)
血清样品使用ELISA测定法测定针对由载体表达的异源抗原的抗体。Falcon Pro Bind微量滴定板用PBS(磷酸缓冲盐溶液，BioWhittaker)中的抗原在4℃包被过夜。滴定板用5％干乳/PBS在室温封闭1小时，随后用洗涤缓冲液(10mM的Tris缓冲盐水、0.1％的Brij-35)洗涤三次。在稀释缓冲液(2％干乳/PBS/0.05％ Tween 20(吐温20))中稀释的血清样品加入所述板上并随后在室温孵育2小时。将板洗涤三次且将在稀释缓冲液中1∶8000稀释的生物素偶联的羊抗鼠抗体(Southem Biotechnology)加入所述板上并随后在室温孵育1小时。孵育后，将板洗涤三次，随后加入在PBS中1∶8000稀释的链亲合素-辣根过氧化物酶偶联物(Southern Biotechnology)且在室温进一步孵育1小时。将板洗涤三次，随后加入底物溶液(BioRad)且用1N的H2SO4终止反应。在450nm读取光密度。
(v)细胞培养
从小鼠的脾获得单细胞悬液。将脾挤过栅网以产生单细胞悬液并随后将细胞沉淀，用ACK缓冲液(Bio Whittaker，Walkersville MD)处理以融解红细胞。随后将细胞在添加有HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸)、1％谷氨酰胺(Bio Whittaker)和5％热灭活的胎牛血清(FCS，Harlan，Indianapolis IN)的RPMI 1640培养基中洗涤两次。对细胞进行计数，且在由HEPES、1％谷氨酰胺和RPMI 1640组成的“完全”培养基中重悬为合适的浓度，所述“完全”培养基添加有5％热灭活的FCS、50mM的巯基乙醇(Gibco-BRL，Long Island NY)、庆大霉素(Gibco-BRL)、1mM的MEM丙酮酸钠(Gibco-BRL)和MEM非必需氨基酸(Sigma，St.Louis MO)。细胞悬液随后用于各种免疫测定。对于CD8特异性测定，细胞在相应于已知CD8表位的多肽存在时进行体外培养。将多肽加入DMSO(二甲级亚砜)中(10mg/ml)且在培养基中稀释至10μg/ml。
(v)ELISPOT(酶联免疫斑点测定)
对于IFN-g的ELISPOT测定，Millipore Multiscreen膜过滤板用溶于pH 9.6的无菌0.1M碳酸盐缓冲液中的50μl的15μg/ml的抗IFN-g抗血清(Pharmingen)于4℃包被过夜。将所述板用无菌PBS洗涤六次并随后用含有10％胎牛血清(FBS)的组织培养基在室温封闭1小时～2小时。除去培养基，将脾细胞以每孔1×106个细胞的总数分配到孔中。对于所加入的已免疫动物来源的细胞少于1×106的孔，使用未免疫动物来源的细胞使总数达到1×106。在组织培养箱中，将细胞在上述肽存在时孵育过夜。将所述板用PBS洗涤两次并用蒸馏水洗涤一次。随后用PBS洗涤三次。将生物素偶联的IFN-g单克隆抗体(Pharmingen)加入所述板中(50μl的于PBS中的1μg/ml溶液)且在室温孵育2小时。将所述板用PBS洗涤六次并随后加入50μl链亲合素碱性磷酸酶偶联物(1∶1000于PBS中，Pharmingen)，并在室温孵育2小时。将板用PBS洗涤六次，加入生色底物(BioRad)且使反应进行到黑斑点出现为止。通过用水洗涤三次终止反应。将所述板空气干燥且在显微镜下对斑点进行计数。

Claims (43)

1.含有病毒基因组核酸的核酸构建体，所述病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒生活周期中的相同阶段具有活性，其中：
(a)含有在相同阶段有活性的启动子的至少两个内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的分离的异源编码序列上；和
(b)除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
2.如权利要求1所述的核酸构建体，其中所述至少两个内源启动子在基因组核酸来源病毒的病毒生活周期中的相同点转换(are switchedon)。
3.如权利要求1所述的核酸构建体，其中所述至少两个内源基因表达调控单元中的两个/全部来自立即早期病毒基因，或两个/全部来自早期病毒基因。
4.如权利要求1所述的核酸构建体，其中所述至少两个内源基因表达调控单元是不同的。
5.如权利要求1所述的核酸构建体，其中所述的病毒基因组核酸来源病毒选自DNA病毒或RNA病毒。
6.如权利要求5所述的核酸构建体，其中所述DNA病毒是选自疱疹病毒或腺相关病毒(AAV)的双链DNA病毒。
7.如权利要求6所述的核酸构建体，其中所述的疱疹病毒选自单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)或EB病毒(EBV)。
8.如权利要求7所述的核酸构建体，其中所述的HSV选自HSV-1或HSV-2。
9.如权利要求7所述的核酸构建体，其中所述的病毒基因组核酸源自单纯疱疹病毒，并且所述至少两个内源基因表达调控单元中的每个均包含内源启动子，该内源启动子选自ICP0、ICP4、ICP22或ICP27基因启动子。
10.如权利要求7所述的核酸构建体，其中所述的病毒基因组核酸源自单纯疱疹病毒，并且所述至少两个基因表达调控单元的两个内源启动子为HSV的被膜蛋白基因启动子。
11.如权利要求7所述的核酸构建体，其中所述的病毒基因组核酸来自人巨细胞病毒，并且所述至少两个基因表达调控单元的内源启动子为：
-选自UL36、UL37或UL38基因启动子的至少两个；
-UL82和UL83基因启动子；或
-UL122和UL123基因启动子。
12.如权利要求1所述的核酸构建体，其中通过内源基因表达调控单元表达的所有异源编码序列源自同样的生物体。
13.如权利要求1所述的核酸构建体，其中两个或更多的异源编码序列编码抗原。
14.如权利要求1所述的核酸构建体，其中抗原为来自病原体的抗原。
15.如权利要求1所述的核酸构建体，其中该构建体缺失除了所述至少两个内源基因表达调控单元之外的一些或所有病毒序列，其存在于与构建体中的病毒基因组核酸的5’和3’末端之间区域相对应的病毒基因组区域中。
16.如权利要求15所述的核酸构建体，其中所述的缺失区域包含位于两个邻近的内源基因表达调控单元之间的部分或全部间插序列，所述内源基因表达调控单元与异源编码序列相连。
17.如权利要求15所述的核酸构建体，其中所述的缺失区域相当于病毒基因组区域中存在的一个或多个基因，而不是那些用来表达异源编码序列的至少两个内源基因表达调控单元的基因。
18.如权利要求15所述的核酸构建体，其中所述的病毒基因组核酸来自HSV-2，并且病毒序列已通过下列一种或多种技术从构建体中除去：
(a)用BstXI酶部分消化并且然后重新连接以除去ICP27和ICP0之间的序列；
(b)用BspHI酶彻底消化，随后用BsiWI酶部分消化并且然后重新连接以除去邻近ICP22的序列；
(c)用SrfI酶消化并且然后重新连接以除去ICP4和ICP0之间的序列；和
(d)用BstXI酶全部消化并且然后重新连接以除去ICP27和ICP0之间的序列。
19.如权利要求15所述的核酸构建体，其中所述病毒基因组核酸来自HSV-1并且已从构建体除去病毒序列以基本上去除所有与ICP0、ICP4、ICP22和ICP27编码序列无关的HSV-1序列。
20.如权利要求1所述的核酸构建体，其中除了与内源基因表达调控单元天然可操作地连接的编码序列被异源编码序列取代外，来自病毒基因组的病毒基因组核酸与该病毒基因组的邻近区域一致。
21.如权利要求1所述的核酸构建体，其中所述可操作地连接于异源编码序列的内源基因表达调控单元为内源启动子。
22.产生核酸构建体的方法，所述核酸构建体用于直接施用给受试者以在受试者中激发免疫应答，所述方法包括：
(a)将病毒基因组核酸插入到载体骨架中，所述病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同阶段具有活性；而且
(b)在将病毒基因组核酸插入到载体骨架中之前、同时或之后，将病毒基因组核酸中的至少两个内源基因表达调控单元的每个内源启动子可操作地连接到异源编码序列上；
其中，除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
23.如权利要求22所述的方法，其中该方法还包括从病毒基因组核酸缺失除了至少两个内源基因表达调控单元之外的一些或所有病毒序列，其存在于与构建体的病毒基因组核酸的5’和3’末端之间区域相对应的病毒基因组区域中。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述的缺失的序列为相邻的内源基因表达调控单元间的非编码间插序列中的一些或全部，所述内源基因表达调控单元与异源编码序列可操作地相连。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述的基因组核酸作为单个片段插入到载体骨架中。
26.适于由颗粒介导的递送装置进行递送的包被的颗粒，该颗粒包含由核酸构建体包被的载体颗粒，其中，所述构建体包含病毒基因组核酸，该病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同点具有活性，其中：
-至少两个含有基因表达调控单元的内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的异源编码序列上；而且
-除了插入到其中的异源序列之外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
27.如权利要求26所述的包被的颗粒，其中所述的载体颗粒为金或钨。
28.一种用于颗粒介导的递送装置的剂量容器，该剂量容器包含权利要求26所述的包被的颗粒。
29.一种颗粒介导的递送装置，该递送装置装载有权利要求26所述的包被的颗粒。
30.如权利要求29所述的颗粒介导的递送装置，该递送装置为无针注射器。
31.感兴趣的多肽在哺乳动物细胞中获得表达的方法，该方法包括将含有病毒基因组核酸的核酸构建体转移到所述细胞中，所述的病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同阶段具有活性，其中：
-至少两个含有启动子的内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的异源编码序列上；而且
-除了插入到其中的异源序列之外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述的构建体被直接递送到受试者中。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述的构建体通过注射、经皮的颗粒递送、吸入、体表、口服、鼻内或经粘膜进行递送。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述构建体通过无针注射进行递送。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述核酸构建体被包被在载体颗粒上。
36.一种核酸免疫的方法，该方法包括将有效量的包被的颗粒施用给受试者，所述的颗粒适于由颗粒介导的递送装置进行递送，该颗粒包含由核酸构建体包被的载体颗粒，其中，所述构建体含有病毒基因组核酸，该病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同阶段具有活性，其中：
-至少两个含有启动子的内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的异源编码序列上；而且
-除了插入到其中的异源序列之外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
37.一种产生核酸构建体的方法，所述核酸构建体用于直接施用给受试者以在受试者中激发免疫应答，所述方法包括：
(a)将病毒基因组核酸插入到载体骨架中，所述病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同阶段具有活性；而且
(b)在将病毒基因组核酸插入到载体骨架中之前、同时或之后，从病毒基因组核酸中缺失除了至少两个内源基因表达调控单元之外的一些或全部的病毒序列，其存在于与构建体的病毒基因组核酸的5’和3’末端之间区域相对应的病毒基因组的区域；
其中，插入到载体骨架中的病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述的缺失的核酸序列为两个内源启动子间的非编码间插序列的部分或全部。
39.适于由颗粒介导的递送装置进行递送的包被的颗粒，该颗粒包含由核酸构建体包被的载体颗粒，所述核酸构建体是通过权利要求36所定义的方法产生的。
40.一种用于颗粒介导的递送装置的剂量容器，该剂量容器包含权利要求39所述的包被的颗粒。
41.颗粒介导的递送装置，该递送装置装载有权利要求40所述的包被的颗粒。
42.感兴趣的多肽在哺乳动物细胞中获得表达的方法，该方法包括将权利要求37所述的方法产生的核酸构建体转移到所述细胞中。
43.一种核酸免疫的方法，该方法包括将有效量的包被的颗粒施用于受试者，所述颗粒适于从颗粒介导的递送装置进行递送，该颗粒包含由权利要求37所述的方法产生的核酸构建体包被的载体颗粒。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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