CN1376201A - 免疫学上重要的单纯疱疹病毒抗原 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于预防和治疗HSV感染的HSV抗原。本文公开了经确认可由疱疹病变衍生的T细胞识别的表位。对本发明抗原具有特异性的T细胞已经证明对装载了由病毒编码的肽表位的细胞有细胞毒性,而且在许多情况中对受HSV感染的细胞有细胞毒性。负责T细胞特异性的免疫原性抗原的鉴定提供了改良的抗病毒治疗和预防策略。包含本发明抗原或其编码多核苷酸的组合物为预防和治疗HSV感染提供了有效靶向的疫苗。

Description

免疫学上重要的单纯疱疹病毒抗原
本文公开的发明是在政府的资助下完成的，即国立卫生研究所(National Institutes of Health)授予的基金编号AI34616、AI30731、和CA70017。美国政府对本发明具有某些权利。
本申请要求1999年9月30日提交的美国临时专利申请编号60/157,181、2000年5月12日提交的编号60/203,660、和2000年7月13日提交的编号60/218,104的优先权，本文完整收入每一项作为参考。贯穿本申请书参考了多种发表物。因此，本申请书收入这些发表物的完整公开书作为参考，从而更充分的描述本发明所属领域的情况。
                     发明的技术领域
本发明涉及可用于治疗和预防HSV感染的分子、组合物、和方法。更具体的说，本发明鉴定了HSV蛋白质的表位，可用于开发具有HSV特异性T细胞(特别是CD8+T细胞)的抗原特异性的方法、分子、和组合物。
                      发明背景
在人体中需要细胞免疫应答来限制复发型HSV感染的严重程度。最初的生殖性HSV-2感染是漫长且严重的；而复发型较不严重，且常常没有症状。原发型HSV-2感染的消退与抗原特异性T细胞的渗透有关，包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。人体中复发型HSV-2感染的连续病变活组织标本研究显示随着病变成熟而趋向CD8+优势的变化和局部CTL活性与病毒清除的相关性(D.M.Koelle等人，1998，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)101：1500-1508；A.L.Cunningham等人，1985，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)75：226-233)。因而，由CD8+CTL识别的HSV抗原可用于新的疗法和疫苗。
单纯疱疹病毒(HSV)的完整DNA序列为大约150kb，编码大约85个已知基因，这些基因编码的蛋白质的长度范围为50-1000个氨基酸。这些蛋白质中能够引发针对病毒感染的有效T细胞免疫应答、长度为大约9-12个氨基酸的免疫原性表位是未知的。
仍然需要鉴定能够引发针对HSV感染的有效免疫应答的特异性表位。这种信息将导致可用于预防和治疗HSV感染的更有效的免疫原性抗原的鉴定。
                      发明概述
本发明提供了HSV抗原、包含HSV抗原的多肽、编码该多肽的多核苷酸、包含多核苷酸的载体和重组病毒、呈递多肽的抗原呈递细胞(APC)、针对HSV的免疫细胞、和制药学组合物。制药学组合物可用于预防和治疗。本发明的抗原可被由疱疹病变回收的T细胞识别。本发明还提供了多种方法，包括用于预防和治疗HSV感染的方法、用于杀死受HSV感染的细胞的方法、用于抑制病毒复制的方法、用于增强抗病毒和/或免疫调控淋巴因子分泌的方法、和用于增强HSV特异性抗体生成的方法。为了预防和治疗HSV感染、增强抗病毒和/或免疫调控淋巴因子分泌、增强HSV特异性抗体生成、和总体上刺激和/或提高HSV特异性免疫力，本发明的方法包括对对象施用本发明的多肽、多核苷酸、重组病毒、APC、免疫细胞、或组合物。用于杀死受HSV感染的细胞和用于抑制病毒复制的方法包括使受HSV感染的细胞接触本发明的免疫细胞。本发明的免疫细胞是经过本发明抗原或呈递本发明抗原的APC刺激的细胞。本发明还提供了用于生成这些免疫细胞的方法。该方法包括使免疫细胞接触经修饰而呈递本发明抗原的APC，优选树突细胞。在优选的实施方案中，免疫细胞是T细胞，诸如CD4+或CD8+T细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了包含HSV多肽的组合物。多肽包含ICP0或UL47蛋白质或其片段。在一个实施方案中，片段包含ICP0的第92-101位氨基酸或其替代型变体。在另一个实施方案中，片段包含UL47的第289-298、548-557、550-559、551-559、和/或551-561位氨基酸或其替代型变体。本发明还提供了编码本发明多肽的分离多核苷酸，和包含多核苷酸的组合物。本发明还提供了经遗传修饰而表达本发明多核苷酸的重组病毒，和包含重组病毒的组合物。在优选的实施方案中，病毒是痘苗病毒、金丝雀痘病毒(canary pox virus)、HSV、慢病毒、逆转录病毒、或腺病毒。本发明的组合物可以是制药学组合物。组合物可任选包含制药学可接受载体和/或佐剂。
本发明还提供了用于鉴定感染性生物体(诸如病毒、细菌、或寄生虫)的免疫原性表位的方法。感染性生物体优选病毒，诸如HSV。在一个实施方案中，本发明的方法包括制备该生物体基因组的随机片段集合。可使用多种标准方法来制备片段，包括但不限于限制酶消化和机械片段化，诸如受控超声处理(E.Mougneau等人，1995，科学(Science)268：563-566)。在优选的实施方案中，生物体是HSV-2，并通过Sau3AI消化来制备病毒基因组片段。可使用的其它限制酶的范例包括但不限于ApaI、SmaI、和AluI。然后将基因组DNA片段连接到载体中，优选通过部分补平反应。优选载体是pcDNA3.1(+)his系列的成员。然后使用常规技术表达片段。优选使用Cos-7转染法进行表达(E.De Plaen等人，在I.Lefkowits编的《免疫学方法手册》(ImmunologyMethods Manual)一书中，第2版，纽约，Academic出版社，1997，第691-718页)。可使用能够呈递靶抗原的适当HLA分子共转染Cos-7细胞。
然后测定表达的多肽引发细胞免疫应答的能力。引发细胞免疫应答的能力是存在免疫原性表位的指征。可用于检测引发细胞免疫应答能力的测定法包括但不限于细胞毒性测定法和淋巴因子分泌测定法。在一个实施方案中，测定法是γ-干扰素测定法。
在优选的实施方案中，本发明提供了用于鉴定具有针对CD8+T细胞的免疫原性的HSV表位的方法。该方法包括由HSV病变获得CD8+T细胞，并测定获得的T细胞以鉴定有能力识别受HSV感染的细胞的T细胞。该方法还包括由HSV获得核酸制剂并片段化，表达获得的核酸的一种或多种片段，并对表达的片段测定针对经鉴定HSV特异性T细胞的抗原反应性。将对HSV特异性T细胞有反应性的表达片段鉴定为编码针对CD8+T细胞有免疫原性的HSV表位。
可使用基因组片段的子片段重复上述步骤。该方法还可包括将基因组片段测序。在一个实施方案中，T细胞测定法包括进行细胞毒性测定法或γ-干扰素测定法。可使用由已暴露于感染性生物体的对象衍生的免疫细胞进行测定。在优选的实施方案中，细胞是由受感染对象的活性感染位点(诸如皮肤或子宫颈)或血液衍生的。
本发明还提供了经本发明方法鉴定的免疫原性表位、包含表位的多肽、和编码多肽的多核苷酸。合适的感染性生物体包括细菌、寄生虫、和病毒。病毒的范例包括DNA和RNA病毒，或是双链或是单链。本发明的方法提供了用于抗击多种感染性生物体(包括展示显著可变性的感染性生物体)的策略，而无需知道该生物体的具体核酸序列。
                     图的简述
图1A显示了来自受试者RW、CD8富集的大批PBMC中TCR Cβ-VβPCR产物(显示了24个Vβ家族中的12个)的荧光检测。将两种Vβ引物(所示)用于每道的双重分析。X轴：顶部显示的PCR产物的分子量基于荧光标记。Y轴：相对荧光强度。
图1B显示了来自原发型HSV-2活组织标本的CD8富集的大批病变渗透淋巴细胞LIL中TCR Cβ-Vβ PCR产物(显示了24个Vβ家族中的12个)的荧光检测。将两种Vβ引物(所示)用于每道的双重分析。X轴：顶部显示的PCR产物的分子量基于荧光标记。Y轴：相对荧光强度。
图2A显示了大批扩增的由子宫颈刷细胞衍生的淋巴细胞的增殖应答。
图2B显示了大批扩增的由子宫颈刷细胞衍生的淋巴细胞的细胞毒性应答，以特异性释放百分比作图。
图3是由HSV-2 DNA的Sau3AI文库(第2条线)分离的阳性基因组克隆的示意图，该克隆包含部分ICP0基因。将基因组克隆转染到细胞中，并将引物A用于cDNA合成。外显子1/外显子2C-A(第5条线)和HLA B45cDNA在转染到Cos-7细胞中后刺激T细胞克隆(TCC)RW51分泌γ-干扰素。外显子1B-C cDNA(第4条线)是阴性的。
图4的条形图显示了RW51针对牛痘ICP0和所示浓度的合成ICP092-105的CTL活性。4小时51Cr释放测定采用效应物∶靶比率10∶1。自发释放都＜20％。
图5显示了RW51针对所示浓度的合成ICP0 92-101的CTL活性。4小时51Cr释放测定采用效应物∶靶比率10∶1。自发释放都＜20％。
图6显示了由外周血衍生且用HSV-2 ICP0第92-101位氨基酸肽刺激的淋巴细胞对象RW的CTL活性。4小时51Cr释放测定法采用效应物∶靶比率10∶1。自发释放都＜20％。对于每一对条形图，上面的条形代表由病变衍生的CD8克隆的数据，下面的条形代表用肽刺激的PBMC的数据。
图7显示了HLA限制性等位基因、HSV-2反应性、和病变CD8克隆的IFNγ分泌的确认。
图8A显示了通过表达克隆建立的病变CD8克隆dkRW.1991.22的肽剂量应答。
图8B显示了通过表达克隆建立的病变CD8克隆RW.1997.51的肽剂量应答。
图8C显示了通过表达克隆建立的病变CD8克隆HV.1999.23的肽剂量应答。
图9显示了受A*0201限制的UL47 289-298特异性CD8 CTL与B*4402或B*4403的交叉反应。
图10A-O显示了外周血淋巴细胞中UL47特异性CTL的存在。
图10A显示了由UL47 289-298引发的对象1874的特异性释放。
图10B显示了由UL47 551-559引发的对象1874的特异性释放。
图10C显示了由UL47 443-451引发的对象1874的特异性释放。
图10D显示了由UL47 289-298引发的对象7282的特异性释放。
图10E显示了由UL47 551-559引发的对象7282的特异性释放。
图10F显示了由gB2 443-451引发的对象7282的特异性释放。
图10G显示了由UL47 289-298引发的对象9107的特异性释放。
图10H显示了由UL47 551-559引发的对象9107的特异性释放。
图10I显示了由gB2 443-451引发的对象9107的特异性释放。
图10J显示了由UL47 289-298引发的对象9383的特异性释放。
图10K显示了由UL47 551-559引发的对象9383的特异性释放。
图10L显示了由gB2 443-451引发的对象9383的特异性释放。
图10M显示了由UL47 289-298引发的对象9410的特异性释放。
图10N显示了由UL47 551-559引发的对象9410的特异性释放。
图10O显示了由gB2 443-451引发的对象9410的特异性释放。
图11A显示了IFNγ ELISPOT测定法的结果，每个孔中的ELISPOTS是肽浓度(μg/ml)的函数。显示了所测5种9聚体UL47肽的结果：548-556(实心圆圈)；549-557(空心圆圈)；550-558(实心三角)；551-559(空心三角)；552-560(方形)。
图11B显示了IFNγ ELISPOT测定法的结果，每个孔中的ELISPOTS是肽浓度(μg/ml)的函数。显示了所测5种10聚体UL47肽的结果：548-557(实心圆圈)；549-558(空心圆圈)；550-559(实心三角)；551-560(空心三角)；552-561(方形)。
图12的条形图显示了IFNγ ELISPOT测定法的结果，每个孔中的ELISPOTS是由C1R-A2/3D9.6H7细胞上HLA-A2洗脱的肽的多个HPLC级分的结果。结果显示级分17、18、和23包含可由CTL克隆cpRW22识别的肽。插图显示了多种对照的数据，包括仅用T细胞、C1R-A2/3D9.5A1、C1R-A2/3D9.6H7、C1R-A2/HSV-2、C1R-A2/HSV-1、和C1R-A2。
图13A的条形图显示了IFNγ ELISPOT测定法的结果，每个孔中的ELISPOTS是级分17的多种HPLC亚级分的结果。结果显示级分17的亚级分包含来自CTL克隆cpRW22可识别的C1RA2/3D9.6H7的肽。箭头指示分别对应于SEQ ID NO：3、1、和2的肽。
图13B的条形图显示了IFNγ ELISPOT测定法的结果，每个孔中的ELISPOTS是级分18的多种HPLC亚级分的结果。结果显示级分18的亚级分包含来自CTL克隆cpRW22可识别的C1RA2/3D9.6H7的肽。箭头指示分别对应于SEQ ID NO：3、1、和2的肽。
图13C的条形图显示了IFNγ ELISPOT测定法的结果，每个孔中的ELISPOTS是多种对照的结果：仅用克隆22；C1R-A2/3D9.5A1；C1R-A2/3D9.6H7；和T2细胞。
图14的条形图显示了IFNγN ELISPOT测定法的结果，每个孔中的ELISPOTS是来自C1R-A2/3D9.6H7细胞的级分23的多种HPLC亚级分。结果显示亚级分37使T2细胞敏化而由CTL克隆cpRW22识别。该级分的活性在HPLC上具有与UL47/550-559相同的迁移率。箭头指示分别对应于SEQ ID NO：3、1、和2的肽。插图显示了来自对照的数据，包括仅用T细胞和C1R-A2/3D9.6H7。
图15A显示了HSV2合成肽LGLADTVVAC(SEQ ID NO：1；UL47/550-559)的HPLC分级分离的结果。使肽在亚分级分离条件下流经HPLC，发现洗脱于级分37。
图15B显示了HSV2合成肽GLADTVVACV(SEQ ID NO：2；UL47/551-560)的HPLC分级分离的结果。使肽在亚分级分离条件下流经HPLC，发现洗脱于级分40/41。
图15C显示了HSV2合成肽GLADTVVAC(SEQ ID NO：3；UL47/551-559)的HPLC分级分离的结果。使肽在亚分级分离条件下流经HPLC，发现洗脱于级分32。
图16显示了来自C1R-A2/3D9.6H7的级分23/亚级分37的质谱数据，以相对丰度作为m/z的函数作图。这些数据显示具有与UL47/550-559相同分子量(MW＝961)的肽存在于该亚级分中。
图17显示了用于通过PCR证明C1R-A2/3D9.6H7细胞包含至少两个衍生自HSV-2的逆转录病毒插入片段的多种引物的序列(SEQ ID NO：14-17)。
图18A显示了来自C1R-A2/3D9.6H7细胞的逆转录病毒插入片段的PCR分析结果，确认了这些细胞包含来自HSV-2的插入片段。条带2、4、和8指在图18B中图解的UL47插入片段各部分；条带7指在图18C中图解的UL52插入片段。
图18B是由来自C1R-A2/3D9.6H7细胞的逆转录病毒插入片段编码的UL47基因大片段的示意图。该插入片段包含编码UL47/550-559肽(SEQ ID NO：1)的片段。
图18C是由来自C1R-A2/3D9.6H7细胞的第二逆转录病毒插入片段编码的UL52基因两个片段的示意图。
图19的条形图显示了用UL47基因转染的VA13/A2细胞可被CD8+T细胞克隆cpRW22识别，这是以ELISPOTS/孔测量γ-干扰素分泌而确定的。靶是稳定表达HLA-A2的VA13成纤维细胞。将靶用UL47肽进行脉冲，或者用UL47表达质粒克隆2号、4号、或6号进行瞬时转染。应答细胞是cpRW22 CD8+T细胞克隆。
图20A-L显示了不同HLA-A2供体的CTL应答，以特异性裂解百分比作为效应物∶靶比率的函数作图。将靶用不含肽(实心圆圈)、刺激肽(空心圆圈)、或由HIV衍生的对照肽(三角)进行脉冲。
图20A显示了捐献者RW1874的结果。PBMC用流感M1/58-66刺激。
图20B显示了捐献者RW1874的结果。PBMC用UL47/550-559刺激。
图20C显示了捐献者RW1874的结果。PBMC用UL47/289-298刺激。
图20D显示了捐献者HV5101的结果。PBMC用M1/58-66刺激。
图20E显示了捐献者HV5101的结果。PBMC用UL47/550-559刺激。
图20F显示了捐献者HV5101的结果。PBMC用UL47/289-298刺激。
图20G显示了捐献者AD120的结果。PBMC用M1/58-66刺激。
图20H显示了捐献者AD120的结果。PBMC用UL47/550-559刺激。
图20I显示了捐献者AD120的结果。PBMC用UL47/289-298刺激。
图20J显示了捐献者AD124的结果。PBMC用M1/58-66刺激。
图20K显示了捐献者AD124的结果。PBMC用UL47/550-559刺激。
图20L显示了捐献者AD124的结果。PBMC用UL47/289-298刺激。
                       发明详述
本发明提供了可用于预防和治疗HSV感染的HSV抗原。本文公开了经确认可被由疱疹病变衍生的T细胞识别的抗原和/或其构成性表位。在有些实施方案中，对本发明抗原具有特异性的T细胞已经证明针对受病毒感染细胞有细胞毒性。负责T细胞特异性的免疫原性抗原的鉴定有助于开发改进型抗病毒治疗和预防策略。包含本发明抗原或编码抗原的多核苷酸的组合物为预防和治疗HSV感染提供了有效靶向的疫苗。定义
本申请书中使用的所有科学和技术术语具有本领域常用含义，除非特别说明。在用于本申请书时，下列词语或短语具有指定含义。
在用于本文时，“多肽”包括蛋白质、蛋白质片段、和肽，可以是由天然来源分离，或是通过重组技术生成，或是化学合成。本发明的多肽通常包含至少大约6个氨基酸。
在用于本文时，“HSV多肽”包括HSV-1和HSV-2，除非特别指明。对HSV蛋白质或多肽氨基酸的参照是基于A.Dolan等人，1998，病毒学杂志(J.Virol.)72(3)：2010-2021所述关于HSV-2的基因组序列信息。如下文所述，基于用ICP0片段转染的细胞的RNA测序而为HSV-2ICP0预测的多肽序列因缺乏氨基酸Q26而与发表的序列不同。
在用于本文时，“替代型变体”指在指定氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸替代或删除但保留了被免疫细胞特异性识别的能力的分子。替代型变体的氨基酸序列与天然氨基酸序列优选至少80％相同，更优选与天然氨基酸序列至少90％相同。用于测定分子能否被免疫细胞特异性识别的一种方法是细胞毒性测定法(D.M.Koelle等人，1997，人类免疫学(Human Immunol.)53：195-205)。下文提供的实施例描述了用于测定分子能否被免疫细胞特异性识别的其它方法，包括刺激γ-干扰素分泌的能力或裂解呈递该分子的细胞的能力。当例如使用分子进行的刺激导致γ-干扰素的分泌多于使用对照分子进行的刺激时，则认为免疫细胞可特异性识别该分子。例如，分子可刺激超过5pg/ml的γ-干扰素分泌，优选超过10pg/ml的γ-干扰素分泌，而对照分子将刺激不足5pg/ml的γ-干扰素分泌。
在用于本文时，“载体”指能够在宿主细胞中投递并优选表达一种或多种基因或目的序列的构建物。载体的范例包括但不限于病毒载体、裸露的DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒、噬菌体载体、与阳离子浓缩剂有关的DNA或RNA载体、包裹于脂质体中的DNA或RNA表达载体、和某些真核细胞(诸如生产者细胞)。
在用于本文时，“表达控制序列”指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，诸如组成性或可诱导启动子，或者是增强子。表达控制序列可操作连接待转录的核酸序列。
术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，而且除非特别限制，还涵盖以与天然发生核苷酸相似方式与核酸发生杂交的天然核苷酸的已知类似物。
在用于本文时，“抗原呈递细胞”或 “APC”指能够处理抗原并向淋巴细胞呈递抗原的细胞。APC的范例包括但不限于巨噬细胞、朗格汉斯树突细胞、滤泡树突细胞、B细胞、单核细胞、成纤维细胞、和纤维细胞。树突细胞是抗原呈递细胞的优选类型。树突细胞发现于许多非淋巴样组织中，但是可以经流入的淋巴或血流迁移至淋巴器官的T依赖区。在非淋巴样器官中，树突细胞包括朗格汉斯树突细胞和间质树突细胞。在淋巴和血液中，它们分别包括流入的淋巴隐蔽细胞和血液树突细胞。在淋巴样器官中，它们包括淋巴样树突细胞和交错突细胞。
在用于本文时，“经修饰”而呈递表位指通过天然或重组方法经操作而呈递表位的抗原呈递细胞(APC)。例如，通过暴露于分离抗原(单独或作为混合物的一部分)、肽装载、或遗传修饰APC以表达包含一或多个表位的多肽，可以对APC进行修饰。
在用于本文时，“制药学可接受盐类”指保留亲本化合物的期望生物学活性且不赋予任何非期望毒理学效果的盐类。这种盐类的范例包括但不限于(a)与无机酸形成的酸加成盐类，例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、等等，与有机酸形成的盐，例如与乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸(furmaric acid)、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸(单宁酸)、pamoic acid、藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸、等等形成的盐；(b)与多价金属阳离子形成的盐类，金属诸如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、等等；(c)与有机阳离子形成的盐类，有机阳离子如N，N’-二苄基乙二胺或乙二胺；或(d)(a)与(b)或(c)的联合，如单宁酸锌；等等。优选的酸加成盐类是三氟乙酸盐和乙酸盐。
在用于本文时，“制药学可接受载体”包括在与活性成份联合时使其能够保留生物学活性且与对象免疫系统无反应性的任何材料。范例包括但不限于任何标准制药学载体，诸如磷酸盐缓冲液、水、乳剂(诸如油/水乳剂)、和多种类型的润湿剂。用于气雾剂或胃肠外施用的优选稀释剂是磷酸盐缓冲液或生理盐水(0.9％)。
通过众所周知的常规方法(参阅例如《雷明顿制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Science)，第43章，第14版，Mack出版公司，Easton PA 18042，美国)，配制包含这些载体的组合物。
在用于本文时，“佐剂”包括本领域中常用的有助于刺激免疫应答的佐剂。佐剂的范例包括但不限于辅助肽；铝盐，诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；  弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories，底特律，MI)；Merck佐剂65(Merck and Company公司，Rahway，NJ)；AS-2(Smith-Kline Beecham)；QS-21(Aquilla)；MPL或3d-MPL(Corixa公司，Hamilton，MT)；LEIF；钙盐、铁盐、或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖类；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解的微球体；单磷酰脂质A和quil A；胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺或免疫刺激复合物，包括细胞因子(如GM-CSF、白介素-2、白介素-7、或白介素-12)；和免疫刺激DNA序列。在有些实施方案中，诸如在多核苷酸疫苗的使用中，佐剂诸如辅助肽或细胞因子可以通过编码佐剂的多核苷酸来提供。
在用于本文时，“一个”或“一种”指至少一个或一种，除非明确指明。HSV多肽
在一个实施方案中，本发明提供了分离的单纯疱疹病毒(HSV)多肽，其中多肽包含ICP0或UL47蛋白质或其片段。在一个实施方案中，片段包含ICP0的第92-101位氨基酸或其替代型变体。在另一个实施方案中，片段包含UL47的第289-298、548-557、550-559、551-559、和/或551-561位氨基酸或其替代型变体。提及氨基酸残基时针对的是A.Dolan等人，1998，病毒学杂志(J.Virol.)72(3)：2010-2021描述的HSV-2基因组蛋白质。
多肽可以是融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白是可溶性的。本发明的可溶性融合蛋白质可以适用于注射到对象体内并引发免疫应答。在某些实施方案中，多肽可以是包含多种本文所述多肽的融合蛋白，或者是包含至少一种本文所述多肽和无关序列的融合蛋白。融合配偶体可以例如帮助提供T辅助细胞表位(免疫学融合配偶体)，优选由人识别的T辅助细胞表位，或者可以帮助以高于天然重组蛋白的产量表达蛋白质(表达增强子)。某些优选的融合配偶体同时是免疫学的和增强表达的融合配偶体。可以选择其它融合配偶体来提高蛋白质的溶解度或使蛋白质靶向预期胞内区室。还有一些融合配偶体包括有助于蛋白质纯化的亲和标签。
通常可以使用标准技术(包括化学缀合)来制备融合蛋白。优选在表达系统中以重组蛋白的形式表达融合蛋白，从而产量得以高于非融合蛋白。简而言之，可以分开装配编码多肽成份的DNA序列，并连接到适当的表达载体中。通过或不通过肽接头，使编码一种多肽成份的DNA序列的3’端连接编码第二种多肽成份的DNA序列的5’端，使得这两种序列的读码框相同，从而得以翻译成保留两种多肽成份的生物学活性的单一融合蛋白。
可以采用肽接头序列将第一种和第二种多肽成份分隔开足够距离，从而确保每一种多肽折叠成各自的二级和三级结构。使用本领域众所周知的标准技术，将这种肽接头序列掺入融合蛋白。可以根据下列因素来选择合适的肽接头序列：(1)能够采取柔性伸展构象；(2)不能采取能够与第一种和第二种多肽上的功能表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可能与多肽功能表位发生作用的疏水性或带电荷残基。优选的肽接头序列包含Gly、Asn、和Ser残基。其它近中性氨基酸，诸如Thr和Ala，也可用于接头序列。可作为接头使用的有用氨基酸序列包括如下公开的：Maratea等人，1985，基因(Gene)40：39-46；Murphy等人，1986，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83：8258-8262；美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180。接头序列的长度通常可以是1-大约50个氨基酸。若第一种和第二种多肽具有可用于分隔功能结构域并预防空间干涉的非必需N端氨基酸区域，则不需要接头序列。
将连接后的DNA序列可操作连接合适的转录或翻译调控元件。负责DNA表达的调控元件位于编码第一种多肽的DNA序列的5’端。类似的，结束翻译所需终止密码子和转录终止信号位于编码第二种多肽的DNA序列的3’端。
还提供了包含本发明多肽和无关免疫原性蛋白质的融合蛋白。免疫原性蛋白质优选能够引发记忆应答。这种蛋白质的范例包括破伤风、肺结核、和肝炎蛋白质(参阅例如Stoute等人，1997，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)336：86-89)。
在优选的实施方案中，免疫学融合配偶体衍生自蛋白D，革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B(Haemophilus influenza B)的表面蛋白(WO91/18926)。优选的是，蛋白D衍生物包含该蛋白质的大约前三分之一(如N端最初的100-110个氨基酸)，而且蛋白D衍生物可以是脂化的。在某些优选实施方案中，N端包含脂蛋白D融合配偶体的前109个氨基酸，从而为多肽提供额外外源T细胞表位并提高在大肠杆菌中的表达水平(由此作为表达增强子起作用)。脂质尾确保了向抗原呈递细胞最佳呈递抗原。其它融合配偶体包括来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。通常使用N端81个氨基酸，但是也可以使用包含T辅助细胞表位的不同片段。
在另一个实施方案中，免疫学融合配偶体是称为LYTA的蛋白质或其片段(优选C端片段)。LYTA衍生自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，它合成称为酰胺酶LYTA的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；基因(Gene)43：265-292，1986)。LYTA是特异性降解肽聚糖主链中某些键的自溶素。LYTA蛋白质的C端结构域负责与胆碱或一些胆碱类似物诸如DEAE的亲和力。该特性已经用于开发可用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。已经描述了氨基末端包含C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化(参阅生物技术(Biotechnology)10：795-798，1992)。在优选的实施方案中，可以将LYTA的重复片段掺入融合蛋白中。重复片段发现存在于C端区，由第178位残基起始。特别优选的重复片段掺入第188-305位残基。
在有些实施方案中，可能期望偶联治疗剂和本发明的多肽，或者偶联超过一种本发明的多肽。例如，可以使本发明的第一种多肽直接偶联超过一种试剂或多肽，或者可以使用提供多个附着位点的接头。或者，可以使用载体。有些分子特别适用于胞间运输和蛋白质投递，包括但不限于VP22(Elliott和O’Hare，1997，细胞(Cell)88：223-233；Kim等人，1997，免疫学杂志(J.Immunol.)159：1666-1668；Rojas等人，1998，自然生物技术(Nature Biotechnolgy)16：370；Kato等人，1998，FEBS通讯(FEBS Lett.)427(2)：203-208；Vives等人，1997，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272(25)：16010-16017；Nagahara等人，1998，自然医学(Nature Med.)4(12)：1449-1452)。
载体可以多种方式携带试剂或多肽，包括直接的或经接头基团共价键合。合适的载体包括蛋白质(诸如清蛋白)(如授予Kato等人的美国专利号4,507,234)、肽、和多糖(诸如氨基葡聚糖)(如授予Shih等人的美国专利号4,699,784)。载体还可以通过非共价键合或通过包裹来携带试剂，诸如在脂质体囊泡中(如美国专利号4,429,008和4,873,088)。
一般而言，本文所述多肽(包括融合蛋白)和多核苷酸是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸指与其最初的环境分开。例如，若天然发生的蛋白质与天然系统中的有些或所有共存物质分开，则它是分离的。这些多肽优选至少大约90％纯，更优选至少大约95％纯，最优选至少大约99％纯。若将多核苷酸克隆到并非天然环境一部分的载体中，则认为它是分离的。
可以由天然存在形式分离，通过重组方法生成，或者化学合成多肽。使用本领域普通技术人员知道的多种表达载体，可以容易的由DNA序列制备由本文所述DNA序列编码的重组多肽。可以在用表达载体(包含编码重组多肽的DNA分子)转化或转染的任何适当宿主细胞中实现表达。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、和高等真核细胞。宿主细胞优选采用大肠杆菌、酵母、或哺乳动物细胞系(诸如Cos或CHO)。首先，可使用商品化的滤器浓缩来自将重组蛋白或多肽分泌到培养基中的可溶性宿主/载体系统的上清液。然后，可将浓缩液应用于合适的纯化基质，诸如亲和基质或离子交换树脂。最后，可采用一步或多步反相HPLC进一步纯化重组多肽。
还可使用本领域普通技术人员众所周知的技术通过合成方法生成具有少于大约100个氨基酸，通常少于大约50个氨基酸的片段和其它变体。例如，可使用任何商品化固相技术(诸如Merrifield固相合成法)合成这些多肽，即连续添加氨基酸以延长氨基酸链(Merrifield，1963，美国化学学会会刊(J.Am.Chem.Soc.)85：2146-2149)。多肽自动化合成的设备可由供应商处购买，诸如Perkin Elmer/AppliedBioSystems Division(Foster City，CA)，并依照制造商的指示进行操作。
依照本发明使用的多肽变体可以在指定氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸替代、删除、添加、和/或插入，使得产生的多肽保留引发针对HSV或受HSV感染细胞的免疫应答的能力。通常可通过修饰本文所述多肽序列之一并使用已知测定法(诸如本文所述T细胞测定法)评价修饰后的多肽的反应性来鉴定这些变体。多肽变体优选展示与经鉴定多肽有至少大约70％，更优选至少大约90％，最优选至少大约95％的同一性。这些氨基酸替代包括但不必限于本领域称为“保守”的氨基酸替代。
“保守”替代指用具有相似特性的氨基酸替代另一种氨基酸，从而肽化学领域普通技术人员预测多肽的二级结构和亲水本质将基本上不变。通常可根据残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性、和/或兼性本质的相似性进行氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有亲水性值相似的不带电荷极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、和酪氨酸。可代表保守变化的其它氨基酸组包括：(1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr；(2)Cys、Ser、Tyr、Thr；(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；(4)Lys、Arg、His；和(5)Phe、Tyr、Trp、His。变体还(或者)可包含非保守变化。在优选的实施方案中，变体多肽因替代、删除、或添加5个或更少氨基酸而与天然序列不同。变体还(或者)可通过例如删除或添加对多肽的免疫原性、二级结构、和亲水性本质具有最小影响的氨基酸而进行修饰。多核苷酸、载体、宿主细胞、和重组病毒
本发明提供了编码本发明的一种或多种多肽的多核苷酸。多核苷酸可包含于载体中。载体还可包含可操作连接本发明多核苷酸的表达控制序列。在有些实施方案中，载体包含编码其它目的分子的一种或多种多核苷酸。在一个实施方案中，可以连接本发明的多核苷酸与额外的多核苷酸，从而编码融合蛋白。
在某些实施方案中，可配制多核苷酸使之能够进入哺乳动物细胞并在其中表达。如下文所述，这种配方对治疗性目的特别有用。本领域普通技术人员将领会到，有许多方法可实现多核苷酸在靶细胞中的表达，而且可采用任何合适方法。例如，可以将多核苷酸掺入病毒载体，诸如但不限于腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、或者牛痘或其它痘病毒(如鸟类痘病毒)。用于将DNA掺入这些载体的技术对于本领域普通技术人员而言是众所周知的。逆转录病毒载体可额外转移或掺入选择标记的基因，以便于鉴定或选择转导细胞；和/或靶向部分的基因，诸如编码特定靶细胞上受体的配体的基因，从而使载体具有靶向特异性。还可以通过本领域普通技术人员知道的方法使用抗体来实现靶向。
本发明还提供了用本发明载体转化的宿主细胞。经转化宿主细胞可用于生成本发明多肽的方法。该方法包括培养宿主细胞并回收由此生成的多肽。可以由培养物上清液纯化回收的多肽。
本发明的载体可用于遗传修饰细胞，或是体内，或是离体，或是体外。已知遗传修饰细胞的几种方法，包括用病毒载体直接或通过逆转录病毒生产者细胞进行的转导或感染、磷酸钙沉淀、受体细胞与含DNA的细菌原生质体的融合、用含DNA的脂质体或微球体处理受体细胞、DEAE葡聚糖、由受体介导的内吞、电穿孔、显微注射、和本领域技术人员知道的许多其它技术。参阅如Sambrook等人，《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)，第2版，1-3，1989；和《分子生物学通用方案》(Current Protocols inMolecular Biology)，F.M.Ausubel等人编，Greene PublishingAssociation公司，和John Willey&Sons公司，1994增刊。
病毒载体的范例包括但不限于基于如HIV、SIV、鼠逆转录病毒、长臂猿白血病病毒的逆转录病毒载体，和其它病毒诸如腺伴随病毒(AAV)和腺病毒(Miller等人，1990，分子和细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)10：4239；J.Kolberg，1992，NIH研究(NIH Res.)4：43；和Cornetta等人，1991，人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)2：215)。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、亲嗜性逆转录病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、及其联合的载体。参阅如Buchscher等人，1992，病毒学杂志(J.Virol.)66(5)：2731-2739；Johann等人，1992，病毒学杂志(J.Virol.)66(5)：1635-1640；Sommerfelt等人，1990，病毒学(Virol.)176：58-59；Wilson等人，1989，病毒学杂志63：2374-2378；Miller等人，1991，病毒学杂志65：2220-2224；Rosenberg和Fauci，1993，在《基础免疫学》(FundamentalImmunology)一书中，第3版，W.E.Paul编，Raven出版有限公司，纽约，及其参考文献；Miller等人，1990，分子和细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)10：4239；R.Kolberg，1992，NIH研究杂志(J.NIH Res.)4：43；和Cornetta等人，1991，人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)2：215。
适用于扩增将要亚克隆到表达载体中的序列的体外扩增技术是已知的。这些体外扩增方法的范例包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增、和其它由RNA聚合酶介导的技术(如NASBA)，可参阅Sambrook等人，1989，《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)，第2版，1-3；美国专利号4,683,202；《PCR方案-方法和应用指南》(PCR Protocols-A Guide to Methods and Applications)，Innis等人编，Academic出版公司，圣迭戈，CA，1990。体外克隆经扩增核酸的改进方法描述于美国专利号5,426,039。
本发明还涉及经遗传修饰而表达本发明多核苷酸的重组微生物。重组微生物可用作疫苗，而且可使用本领域用于制备活的减毒疫苗的已知技术进行制备。用作活疫苗的微生物的范例包括但不限于病毒和细菌。在优选的实施方案中，重组微生物是病毒。合适病毒的范例包括但不限于牛痘病毒、金丝雀痘病毒、逆转录病毒、慢病毒、HSV、和腺病毒。组合物
本发明提供了可用于治疗和预防HSV感染的组合物。组合物可用于抑制病毒复制并杀死受病毒感染的细胞。在一个实施方案中，组合物是制药学组合物。组合物可包含治疗或预防有效量的本发明多肽、多核苷酸、重组病毒、APC、或免疫细胞。有效量指足以如通过激活T细胞而引发或提高免疫应答的量。T细胞激活的一种量度是细胞毒性测定法(D.M.Koelle等人，1997，人类免疫学(Human Immunol.)53：195-205)。在有些实施方案中，组合物是疫苗。
组合物可任选包含载体，诸如制药学可接受载体。制药学可接受载体部分由待施用的具体组合物以及用于施用组合物的具体方法决定。因此，本发明涵盖制药学组合物的极其多种合适配方。适用于胃肠外(诸如关节内、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、和皮下路径)施用的配方和载体包括水性等渗无菌注射液，其中可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、和使得制剂与预期接受者血液等渗的溶质；和水性及非水性无菌悬浮液，其中可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂、脂质体、微球体、和乳剂。
本发明的组合物还可包含一种或多种佐剂。佐剂的范例包括但不限于辅助肽、明矾、弗氏佐剂、胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺、或免疫刺激复合物(包括细胞因子)。在有些实施方案中，诸如在多核苷酸疫苗的使用中，佐剂诸如辅助肽或细胞因子可以通过编码佐剂的多核苷酸来提供。疫苗制备一般性描述于例如M.F.Powell和M.J.Newman编，《疫苗设计(亚基和佐剂研究)》(Vaccine Design(the subunit andadjuvant approach))，Plenum出版社，NY，1995。本发明范围内的制药学组合物和疫苗还可包含有或无生物学活性的其它化合物。例如可以存在其它病毒抗原的一或多个免疫原性部分，在组合物或疫苗中或是掺入融合多肽或是作为分开的化合物。
制药学组合物或疫苗可包含编码本发明的一种或多种多肽的DNA，从而能够原位生成多肽。如上所述，DNA可存在于本领域普通技术人员知道的多种投递系统中，包括核酸表达系统、细菌、和病毒表达系统。本领域众所周知大量的基因投递技术，诸如描述于Rolland，1998，治疗性药物和载体系统的评论(Crit.Rev.Therap.Drug CarriesSystems)15：143-198，及其引用的参考文献。合适的核酸表达系统包含在患者中进行表达所必需的DNA序列(诸如合适的启动子和终止信号)。细菌投递系统包括施用在其细胞表面上表达多肽的免疫原性片段或分泌这种表位的细菌(诸如卡介苗)。在优选的实施方案中，可使用病毒表达系统(如牛痘或其它痘病毒、逆转录病毒、或腺病毒)导入DNA，可包括使用非致病(缺陷型)的能复制病毒。合适的系统公开于例如Fisher-Hoch等人，1989，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：317-321；Flexner等人，1989，纽约科学院年鉴(Ann.NY Acad.Sci.)569：86-103；Flexner等人，1990，疫苗(Vaccine)8：17-21；美国专利号4,603,112、4,769,330、和5,017,487；WO 89/01973；美国专利号4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91102805；Berkner，1988，生物技术(Biotechniques)6：616-627；Rosenfeld等人，1991，科学(Science)252：431-434；Kolls等人，1994，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91：215-219；Kass-Eisler等人，1993，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：11498-11502；Guzman等人，1993，循环(Circulation)88：2838-2848；和Guzman等人，1993，循环研究(Cir.Res.)73：1202-1207。用于将DNA掺入这些表达系统的技术对于本领域普通技术人员而言是众所周知的。DNA可以是“裸露”的，描述于例如Ulmer等人，1993，科学(Science)259：1745-1749；回顾见Cohen，1993，科学(Science)259：1691-1692。通过将DNA包被到有效转运到细胞中的生物可降解珠上可增加对裸露DNA的摄取。
虽然在本发明的制药学组合物中可以采用本领域普通技术人员知道的任何合适载体，但是载体的类型将随着施用模式而变化。可以配制用于任何适当施用方式的本发明组合物，包括例如局部、口服、鼻吸、静脉内、颅内、腹膜内、皮下、或肌肉内施用。对于胃肠外施用，诸如皮下注射，载体优选包含水、盐水、醇、脂肪、蜡、或缓冲液。对于口服施用，可采用任何上述载体或固相载体，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、和碳酸镁。也可采用生物可降解的微球体(如聚乳酸(酯)聚乙醇酸(酯))作为用于本发明制药学组合物的载体。合适的生物可降解的微球体公开于例如美国专利号4,897,268和5,075,109。
这些组合物还可包含缓冲液(如中性缓冲液或磷酸盐缓冲液)、碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽、或氨基酸诸如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(如氢氧化铝)、和/或防腐剂。
或者，本发明的组合物可配制成冻干剂。也可使用众所周知的技术将化合物包裹于脂质体中。
在本发明的疫苗中可采用多种佐剂。大多数佐剂包含设计用于保护抗原免于快速分解代谢的物质，诸如氢氧化铝或矿物油，和免疫应答刺激剂，诸如脂质A，由Bortadella pertussis或结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)衍生的蛋白质。合适的佐剂是商品化的例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratory，底特律，MI)；Merck佐剂65(Merck and Company公司，Rahway，NJ)；铝盐诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙盐、铁盐、或锌盐；酰化酪氨酸酰化糖类的不溶性悬浮液；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈生物可降解微球体；单磷脂酰脂质A和quilA。细胞因子，诸如GM-CSF、白介素-2、白介素-7、或白介素-12，也可用作佐剂。
在本文提供的疫苗中，佐剂组合物优选设计用于诱导Th1型占优势的免疫应答。高水平的Th1型细胞因子(如IFNγ、IL-2、和IL-12)趋向于促使诱导针对施用的抗原的细胞免疫应答。相反，高水平的Th2型细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、和TNFβ)趋向于促使诱导体液免疫应答。在应用本文提供的疫苗后，患者将支持包括Th1型和Th2型应答在内的免疫应答。在优选的实施方案中，其中Th1型是优势应答，Th1型细胞因子的水平将增加，并大大超过Th2型细胞因子的水平。可使用标准测定法容易的测定这些细胞因子的水平。细胞因子家族的回顾参阅Mosmann和Coffman，1989，免疫学年鉴(Ann.Rev.Immunol.)7：145-173。
用于引发Th1型占优势的应答的优选佐剂包括例如单磷脂酰脂质A(优选3-de-O-酰化单磷酰脂质A，3D-MPL)与铝盐的联合。MPLTM佐剂可由Corixa公司购买(参阅美国专利号4,436,727、4,877,611、4,866,034、和4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也诱导Th1型占优势的应答。这些寡核苷酸是众所周知的且描述于例如WO 96/02555。另一种优选佐剂是皂苷，优选QS21，它可单独使用，或与其它佐剂联合。例如，增效系统包括单磷脂酰脂质A与皂苷衍生物的联合，诸如WO 94/00153中所述的QS21与3D-MPL的联合，或者，在反应原性较低的组合物中，如WO 96/33793中所述用胆固醇将QS21淬火。其它优选配方包括水包油乳剂和生育酚。WO 95/17210中描述了特别有效的佐剂配方，包含QS21、3D-MPL、和生育酚的水包油乳剂。可使用的另一种佐剂是AS-2(Smith-Kline Beecham)。可使用生成抗原、免疫应答增强剂、和合适载体或赋形剂的联合的众所周知的方法来制备本文提供的任何疫苗。
可以作为缓释配方(即诸如施用后缓慢释放化合物的胶囊或海绵体等配方)的一部分来施用本文所述组合物。通常可使用众所周知的技术来制备这些配方，并通过例如口服、直肠、或皮下埋植，或者通过期望靶位点的埋植来进行施用。缓释配方可包含散布于载体基质中和/或包含于由控速膜包围的储器内的多肽、多核苷酸、或抗体。用于这些配方的载体是生物相容的，而且还可以是生物可降解的；优选的是，配方提供相对恒定水平的活性成份释放。缓释配方中活性化合物的含量取决于埋植位点、释放速率和预期持续时间、以及待治疗或预防的状况的本质。
在制药学组合物和疫苗中可采用多种投递载体，从而有助于产生靶向受HSV感染细胞的抗原特异性免疫应答。投递载体包括抗原呈递细胞(APC)，诸如树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞、和可改造成为有效APC的其它细胞。可以而非必需遗传修饰这些细胞，从而提高呈递抗原的能力，改进T细胞应答的激活和/或维持，本身具有抗病毒效果，和/或与接受者在免疫学上相容(即匹配HLA单元型)。通常可由多种生物学流体和器官分离APC，包括肿瘤和肿瘤周围组织，而且可以是自体的或异体的、同基因的或异基因的细胞。
本发明的某些优选实施方案使用树突细胞或其祖细胞作为抗原呈递细胞。树突细胞是高度有效的APC(Banchereau和Steinman，自然(Nature)392：245-251，1998)，而且显示是用于引发预防性或治疗性免疫力的有效生理学佐剂，(参阅Timmerman和Levy，医学年鉴(Ann.Rev.Med.)50：507-529，1999)。一般而言，可根据其典型形态(原位是星形的，在体外可看见显著的细胞质突起即树突)和根据缺乏B细胞(CD19和CD20)、T细胞(CD3)、单核细胞(CD14)、和天然杀伤细胞(CD56)的分化标记(使用标准测定法进行确定)来鉴定树突细胞。当然，可以改造树突细胞以表达在体内或离体情况中不常在树突细胞上发现的特定细胞表面受体或配体，而且本发明涵盖这些修饰后的树突细胞。作为树突细胞的候选，疫苗中可以使用装载分泌泡抗原的树突细胞(称为外来体)(Zitvogel等人，1998，自然医学(NatureMed.)4：594-600)。
可以由外周血、骨髓、肿瘤渗透细胞、肿瘤周围组织渗透细胞、淋巴结、脾、皮肤、脐带血、或任何其它合适组织或流体获得树突细胞及其祖细胞。例如，通过向由外周血收获的单核细胞培养物中加入细胞因子诸如GM-CSF、IL-4、IL-13、和/或TNFα的联合可以离体分化得到树突细胞。或者，通过向培养基中加入GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体、和/或诱导树突细胞成熟和增殖的其它化合物的联合，可以使由外周血、脐带血、或骨髓收获的CD34阳性细胞分化成树突细胞。
出于方便，将树突细胞分成“未成熟的”与“成熟的”细胞，从而能够简便的区别两种详细鉴定的表型。然而，不应当将这种命名法解释为排除所有可能的中间分化阶段。经鉴定，未成熟的树突细胞是具有高抗原摄取和加工能力的APC，这种能力与Fcγ受体、甘露糖受体、和DEC-205标记的高表达有关。成熟表型的特征通常是这些标记的表达较低，但是负责T细胞激活的细胞表面分子，诸如I型和II型MHC、粘着分子(如CD54和CD11)、和共刺激分子(如CD40、CD80、和CD86)的表达水平高。通常可使用编码多肽(或其片段或其它变体)的多核苷酸转染APC，从而在细胞表面表达多肽或其免疫原性片段。如本文所述，可离体进行这种转染，然后将包含这种经转染细胞的组合物或疫苗用于治疗性目的。或者，可以对患者施用靶向树突细胞或其它抗原呈递细胞的基因投递载体，从而在体内进行转染。例如，通常可使用任何本领域已知方法来进行树突细胞的体内和离体转染，诸如WO 97/24447中所述方法，或Mahvi等人，1997，免疫学和细胞生物学(Immunologyand Cell Biology)75：456-460中所述的基因枪法。可通过树突细胞或其祖细胞与肿瘤多肽、DNA(裸露的或位于质粒载体内)、或RNA；或者与表达抗原的重组细菌或病毒(如牛痘、禽痘、腺病毒、或慢病毒载体)一起保温来实现树突细胞的抗原装载。在装载前，可以使多肽共价缀合提供T细胞辅助(如载体分子)的免疫学配偶体。或者，可以用非缀合型免疫学配偶体，分开的或在存在多肽的情况中，对树突细胞进行脉冲。组合物的施用
处理包括预防和治疗。可通过一个时间点或多个时间点的一次直接注射实现预防或治疗。也可近乎同时施用于多个位点。患者或对象包括哺乳动物，诸如人、牛、马、狗、猫、猪、和绵羊动物。患者或对象优选是人。
通常经胃肠外(如静脉内、皮下、和肌肉内)或其它传统的直接路径，诸如口腔/舌下、直肠、口服、鼻吸、局部(诸如经皮和眼)、阴道、肺、动脉内、腹膜内、眼内、或鼻内路径体内施用组合物，或者直接施用到特定组织中。
可以任何合适方式施用组合物，常常是与制药学可接受载体一起。可利用对患者施用本发明细胞的合适方法，而且，虽然可以使用超过一种路径来施用特定细胞组合物，但是特定路径常常可提供比另一种路径更直接且更有效的反应。
在本发明的内容中，对患者的施用剂量应当足以随时间在患者体内实现有益的治疗性应答，或者抑制感染或由感染引起的疾病。因而，以足以引发针对特定抗原的有效免疫应答和/或减轻、减少、治愈、或至少部分抑制疾病或感染的症状和/或并发症的量，对患者施用组合物。本文将适于实现该目的的量定义为“治疗有效量”。
将根据生成的组合物的活性和患者的状况，以及待治疗患者的体重或表面积来确定剂量。还根据在特定患者体内施用特定组合物时伴随的任何不利副作用的存在、本质、和程度来确定剂量大小。在确定为了治疗或预防疾病诸如HSV感染而施用组合物的有效量时，医师需要评价针对病毒的免疫应答的产生、疾病发展、和任何与治疗有关的毒性。
例如，含亚基HSV蛋白质的疫苗或其它组合物可每剂包含1-10,000微克HSV蛋白质。在优选的实施方案中，每剂包含10-1000微克HSV蛋白质。在更优选的实施方案中，每剂包含10-100微克HSV蛋白质。优选的是，选择一剂就足够的剂量，或者在几个月的时间里施用几剂。对于含HSV多核苷酸或肽的组合物，每剂施用相似数量。
在一个实施方案中，可在52周的时间里施用1-10剂。优选的是，间隔1个月施用6剂，此后可定期给予加强接种。候选方案对于个别患者可能是合适的。合适剂量指如上所述施用化合物后能够发动抗病毒免疫应答且比基线(即未处理)水平高至少10-50％的量。这些疫苗还应当能够引起导致接种患者与未接种患者相比临床效果获得改进的免疫应答。一般而言，对于包含一种或多种多肽的制药学组合物和疫苗，每剂中每种多肽的存在量范围为大约0.1μg-大约5mg/kg宿主。优选的是，剂量范围为大约10-大约1000μg/剂。合适的施用体积将随患者的体形、年龄、和免疫状况而变化，但是通常范围为大约0.1ml-大约5ml，最常见的是小于大约1ml的体积。
优选将由将要施用组合物的患者获得的免疫细胞用于制备含免疫细胞的组合物。或者，可由HLA相容性捐献者制备免疫细胞。使用本领域知道的常规技术由对象或捐献者获得免疫细胞，暴露于经修饰而呈递本发明表位的APC，离体扩增，并施用于患者。用于离体疗法的方案描述于Rosenberg等人，1990，新英格兰医学杂志(New England J.Med.)9：570-578。另外，组合物可包含经修饰而呈递本发明表位的APC。
如本文所述，通常可通过体外培养获得足够数量的免疫细胞用于过继免疫疗法。用于在体外将单一抗原特异性效应细胞扩增成数十亿并保留体内抗原识别能力的培养条件在本领域是众所周知的。这些体外培养条件通常使用抗原进行间歇刺激，常常存在细胞因子(诸如IL-2)和不分裂的饲养细胞。如上所述，本文提供的免疫反应性多肽可用于富集和快速扩增抗原特异性T细胞培养物，从而产生足够数量的细胞用于免疫疗法。具体而言，可使用本领域众所周知的标准技术，用免疫反应性多肽对抗原呈递细胞(诸如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、和/或B细胞)进行脉冲，或者用一种或多种多核苷酸进行转染。例如，可使用具有适用于在重组病毒或其它表达系统中增加表达的启动子的多核苷酸转染抗原呈递细胞。用于治疗的培养效应细胞必须能够广泛生长和分布，而且能够在体内长期存活。研究显示，用添加IL-2的抗原进行重复刺激可诱导培养效应细胞在体内大量生长且长期存活(参阅例如Cheever等人，1997，免疫学回顾(Immunological Reviews)157：177)。
仅仅使用针头、导管、或相关装置在一个时间点或多个时间点进行直接施用，就可实现通过本文所述多种施用路径或其它本领域已知施用路径进行的施用。经鉴定抗原的体内测试
可使用常规技术来确认经鉴定HSV抗原的体内功效。例如，一种技术是利用小鼠攻击模型。然而，本领域熟练技术人员将领会到，这些方法是常规的，而且可使用其它模型。
一旦制备了待测试的化合物或组合物，就通过系列注射免疫小鼠或其它对象。例如，可在几个月的时间里施用多达10次注射，通常是间隔1-4周。系列注射的最后一次之后，用确认为统一致死剂量的一剂病毒攻击对象。对照组接受安慰剂，而实验组积极接种。或者，可设计使用亚致死剂量的研究。可任选包括剂量-应答研究。该研究中待测量的终点包括死亡和严重的神经学损伤，例如表现为脊髓gait。还可以处死存活者以量化关键器官的病毒培养物，包括脊髓、脑、和注射位点。可测量磨碎组织样品中存在的病毒数量。也可在先前受感染的动物中测试组合物降低复发的作用，以确认作为治疗性疫苗的功效。
可通过计算IC50来测定功效，IC50指保护50％的对象免于死亡所需的每千克体重的疫苗微克数。IC50将取决于采用的攻击剂量。另外，可以计算LD50，LD50指杀死半数接受特定剂量疫苗的对象所需的感染单位数。死后病毒滴度的测定确认了病毒复制受到免疫系统的限制。
测试的随后阶段将是阴道接种攻击。对于急性保护研究，可使用小鼠。由于豚鼠可用于研究急性保护和复发预防，因此对于外推至人，它们提供了在生理学上更相关的对象。在这种类型的攻击中，施用非致死剂量，豚鼠对象形成病变，治愈，并复发。测量可包括急性疾病的改善和病变的复发。在接种之前或之后，根据是希望研究预防还是治疗，可提供疫苗或其它组合物的干预。方法
本发明提供了用于治疗和/或预防对象体内HSV感染的方法。该方法包括对对象施用本发明的组合物。组合物可作为治疗性或预防性疫苗使用。在一个实施方案中，HSV是HSV-2。或者，HSV是HSV-1。本发明还提供了用于抑制HSV复制，用于杀死受HSV感染的细胞，用于增加具有抗病毒和/或免疫调控活性的淋巴因子的分泌，和用于增强疱疹特异性抗体生成的方法。该方法包括使受HSV感染的细胞接触针对本发明抗原的免疫细胞，例如如本文展示的实施例所述。可以在体外或体内进行这种接触。在优选的实施方案中，免疫细胞是T细胞。T细胞包括CD4和CD8 T细胞。本发明的组合物还可以作为针对免疫病理学疾病的耐受剂使用。
另外，本发明提供了用于生成针对HSV的免疫细胞的方法。该方法包括使免疫细胞接触抗原呈递细胞，其中抗原呈递细胞经修饰而呈递本发明多肽所含抗原。抗原呈递细胞优选树突细胞。可通过例如使用编码多肽的核酸序列进行肽装载或遗传修饰来修饰细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。T细胞包括CD4和CD8 T细胞。本发明还提供了由该方法生成的免疫细胞。免疫细胞可用于抑制HSV复制，在体外或在体内杀死受HSV感染的细胞，增加具有抗病毒和/或免疫调控活性的淋巴因子的分泌，增强疱疹特异性抗体的生成，或者治疗或预防对象体内的HSV感染。
本发明提供了用于鉴定与感染性生物体有关的免疫原性表位的方法。在一个实施方案中，该方法包括制备生物体基因组的随机片段集合。制备可包括消化完整基因组，但是并不是必需由完整基因组开始。消化优选包括使基因组接触一种或多种限制酶，以获得具有期望长度范围的随机片段集合。或者，可以通过超声处理、喷雾、或其它方法处理含目的基因组的材料，并由凝胶分离适当大小的片段。
消化和限制酶的选择设计用于获得比T细胞表位平均长度更长的基因组片段，即长度超过大约30个核苷酸。优选的是，片段足够小使得遗传终止密码子罕见，如长度为大约200-大约500bp。当目的生物体的基因组序列或限制性图谱是已知的时，可以分析基因组以鉴定限制性位点，若用适当的限制酶靶向这些限制性位点，将产生期望数目的适当长度的片段。还可以选择限制酶靶向与将使用的克隆载体中的位点相容的位点。
然后，可以将随机片段用于表达该片段编码的多肽。可以进行单个多肽的表达，或者优选单独或作为融合蛋白进行多肽集合的表达。本领域熟练技术人员将领会到，可以DNA或RNA作为起始材料表达多肽。例如，首先由RNA片段制备cDNA，然后使用cDNA表达多肽，由此可实现自RNA病毒表达多肽。
可以由含基因组片段的载体表达多肽。在优选的实施方案中，载体是质粒，诸如pcDNA3.1(+)his载体。本领域熟练技术人员将领会到，可使用能够由插入片段表达多肽的其它载体。优选的是，作为融合蛋白表达多肽。在一个实施方案中，表达包括培养用含基因组片段的载体转染或转导的宿主细胞。在优选的实施方案中，以3种不同的读码框、2种取向将片段连接到表达载体中以构建文库。
可通过部分补平反应来连接基因组片段而改进文库的品质。例如，通过用Sau3AI消化HSV-2产生的粘端可导致多种病毒片段相互之间多种取向的连接。部分补平反应可用于修饰粘端，使得病毒基因组片段彼此不会连接，而且每个载体中只会存在一个病毒插入片段。如此构建的文库分析起来更简单且耗时更少。
本发明的方法还包括测定表达的多肽引发免疫应答的能力。引发免疫应答的能力指示多肽内免疫原性表位的存在。在一个实施方案中，免疫应答是细胞免疫应答。测定法可包括进行测量T细胞刺激或激活的测定法。T细胞的范例包括CD4和CD8 T细胞。
T细胞刺激测定法的一个范例是细胞毒性测定法(D.M.Koelle等人，1997，人类免疫学(Human Immunol.)53：195-205)。在一个范例中，细胞毒性测定法包括使在合适HLA分子中呈递抗原性病毒肽的细胞接触T细胞，并检测T细胞杀死抗原呈递细胞的能力。可通过测量来自抗原呈递细胞的放射性51Cr的释放来检测细胞杀伤。由抗原呈递细胞释放51Cr进入培养基指示细胞杀伤。杀死增加的例示性标准是基于由抗原呈递细胞与T细胞混合物收集的培养基中51Cr放射计数的每分钟计数(cpm)和由抗原呈递细胞与培养基混合物收集的对照培养基相比的统计学显著增加。
可在多肽集合上进行测定，以鉴定含活性部分的集合。然后，可以在原始集合越来越小的子集上进行进一步测定，以分离目的多肽。可纯化含目的片段的材料(如含病毒插入片段的质粒)，并将病毒片段测序。根据获得的序列信息，可制备合成肽用于随后的经鉴定抗原的测试和确认。片段测序还可导致新基因的鉴定。可重复上述方法步骤，其中制备基因组片段的子片段。可表达并测试越来越小的片段，以测定最小表位。
本发明的方法可用于多种感染性生物体，包括细菌、寄生虫、和病毒。优选病毒是包含无内含子DNA或主要是编码序列的病毒。病毒的范例包括双链DNA病毒、单链DNA病毒、双链RNA病毒、和单链RNA病毒。双链DNA病毒的范例包括但不限于EB病毒(Epstein-Barr virus)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒-1(HSV-1)、HSV-2、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒-6(HHV-6)、HHV-7、HHV-8、痘病毒、和腺病毒。单链DNA病毒的范例包括但不限于细小病毒。双链RNA病毒的范例包括但不限于逆转录病毒和呼肠孤病毒。单链RNA病毒的范例包括但不限于副粘病毒、粘病毒、和黄病毒。
由于本发明的方法不需要知道生物体的核酸序列，因而它提供了抗击展示大量生物学可变性的感染性生物体(如HIV和HCV)的策略。对于展示高可变性的病毒，有利的是使用由特定患者、特定位点(如血液、皮肤、子宫颈)、或者在特定地理学区域或患者群中循环的代表性病毒株衍生的病毒核酸材料来源，这可能与已知核酸序列的原型株不同。
在优选的实施方案中，生物体是HSV-2，并且通过Sau3AI消化来制备病毒基因组片段。可使用的其它限制酶的范例包括但不限于ApaI、SmaI、和AluI。然后优选使用部分补平反应，将基因组DNA片段连接到载体中(参阅Stratagene目录1999年，第56页)。优选载体是pcDNA3.1(+)his系列的成员。然后使用常规技术表达片段。优选使用Cos-7转染法进行表达(E.De Plaen等人，在I.Lefkowits编的《免疫学方法手册》(Immunology Methods Manual)一书中，第2版，纽约，Academic出版社，1997，第691-718页)。
可使用核酸分子诸如编码相关HLA分子(诸如HLA重链)的cDNA共转染宿主细胞。HLA分子使得来自与T细胞来源不同的物种(如在Cos细胞的情况中是猴子)的宿主细胞识别由感染剂衍生的抗原。选择HLA分子以匹配能够呈递靶抗原的HLA分子。用于鉴定合适HLA分子的方法描述于D.M.Koelle等人，1994，感染病杂志(J.Infectious Dis.)169：956-961；和E.De Plaen等人，在《免疫学方法手册》(ImmunologyMethods Manual)一书中，1997，Academic出版社，第704-705页。在没有明确鉴定呈递HLA分子的情况中，可以共转染编码两种或多种候选I型HLA分子的cDNA。
然后测定表达的多肽引发细胞免疫应答的能力。引发细胞免疫应答的能力指示免疫原性表位的存在。可用于检测引发细胞免疫应答的能力的测定法包括但不限于细胞毒性测定法和淋巴因子分泌测定法。在一个实施方案中，测定法是γ-干扰素测定法。
在优选的实施方案中，本发明提供了用于鉴定对CD8+T细胞有免疫原性的HSV表位的方法。该方法包括由HSV病变获得CD8+T细胞，并测定获得的T细胞以鉴定有能力识别受HSV感染细胞的T细胞。该方法还包括由HSV获得核酸制剂并使之片段化，表达所获得核酸的一种或多种片段，并对表达的片段测定与经鉴定的HSV特异性T细胞的抗原反应性。将对HSV特异性T细胞有反应性的表达片段鉴定为编码对CD8+T细胞有免疫原性的HSV表位。
本发明还提供了诊断性测定法。该诊断性测定法可用于鉴定怀疑患有疱疹感染的患者的免疫学应答性，并用于预测对象对特定治疗过程的应答性。该测定法包括使对象的T细胞暴露于在合适APC中的本发明抗原，并通过例如测量IFNγ、增殖、或细胞毒性来测试免疫反应性。实施例更详细的描述了合适的测定法。
                        实施例
下列实施例例示了本发明，帮助本领域普通技术人员完成并使用本发明。实施例绝非意欲限制本发明的范围。实施例1：复发型生殖性HSV-2病变中HSV特异性CD8 CTL的检测
本实施例证明了特异性CD8 CTL定位于生殖性HSV-2病变。这是通过复发型生殖性HSV-2病变的一系列病变活组织标本研究显示的，使用了原位遭遇抗原/APC且在读数测定前未用抗原体外再刺激的细胞。材料和方法
在存在50μM无环鸟苷的情况中用植物凝集素(PHA)和IL-2将病变渗透淋巴细胞(LIL)扩增一个循环。通常在两周后获得5×106-5×107个细胞。这些大批群体的表型已有描述(D.M.Koelle等人，1998，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)101：1500-1508)。在TCRαβ中，随着病变成熟和培养物变成阴性，存在CD3+细胞逐渐转变成CD8优势。结果
早在出现症状的第2天，通过K562和异基因的受HSV-2感染的淋巴细胞连续系(LCL)的裂解，就测定到局部应答具有高水平NK细胞活性。在由病变扩增的细胞中NK细胞相对于正常皮肤获得了选择性富集。HSV特异性CD4细胞早先获得了相似富集。病变中 “Th1”(γ-干扰素(IFNγ)、IL-12 p40、IL-2)和“Th2”(IL-4、IL-5、IL-10、IL-13)mRNA都获得了富集(W.C.Van Voorhis等人，1996，感染病杂志(J.Infect.Dis.)173：491-495)。病变渗透的HSV-2特异性CD8 CTL的细胞因子模式包括γ-干扰素。
与CD4和NK活性相反，HSV特异性CTL稍后(通常是第5-9天)渗透复发型HSV-2生殖性病变，而且它们的存在与病毒清除有关(D.M.Koelle等人，1998，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)101：1500-1508)。通过扣除NK然后或是CD4或是CD8细胞，研究了CD4和CD8成分。只在CD8细胞中或在这两个子集中观察到CTL活性。由于自体细胞易于制备，HSV在这些细胞中经历全部裂解性复制，且存在高水平的HLA和共刺激/粘着分子，因此将用EBV转化的LCL(M.A.Tigges等人，1992，病毒学杂志(J.Virol.)66：1622-1634)作为靶细胞用于CTL测定。
已经由疱疹囊泡流体分离得到了HSV特异性CD8克隆(表1)(D.M.Koelle等人，1998，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)101：1500-1508)。没有进行抗原的次级再刺激。通过标准方法(D.M.Koelle等人，1998，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)101：1500-1508)，以0.3-2个细胞/孔克隆了CD8富集细胞的许多(＞1,000个)微量培养物，并在针对用或未用HSV-2感染18小时(感染复数即MOI为10)的自体LCL的CTL测定法中筛选了大约200个克隆。根据流式细胞计量术，所有克隆都是CD3/8/TCRαβ(+)和CD4/TCRγδ(-)。表1：来自复发型HSV-2病变的CD8 T细胞克隆(TCC)的溶细胞活性。裂解是效应物∶靶(E∶T)比率为20∶1或更低时的特异性释放百分比。
                  特异性释放百分比
对象  Bx年代  TCC    模拟物  HSV-1  HSV-2   表位定位1  HLA限制2
RW    1997    51     0       1      87      0.0-0.12    B*4501
RW    1991    223   0       2      54      0.66-0.72   A*02011 HSV-2基因组标准图谱中的表位定位(A.Dolan等人，1998，病毒学杂志(J.Virol.)72：2010-2021)；如Koelle等人所述(D.M.Koelle等人，1994，病毒学杂志(J.Virol.)68：2803-2810；D.M.Koelle等人，1998，病毒学杂志(J.Virol.)72：7476-7483)，HSV-2型特异性TCC的表位作图使用HSV-1 x HSV-2型间重组病毒(IRV)(V.G.Preston等人，1978，病毒学杂志(J.Virol.)28：499-517)。边界是近似的。2如Koelle等人所述(D.M.Koelle等人，1994，感染病杂志(J.Infect.Dis.)169：956-961)，HLA等位基因限制性杀伤受HSV-2感染的、部分匹配的LCL；血清学或DNA定义按分型方法中的理解。3 dkRW22。RW22和RW.1991.22指1991年由对象RW衍生的T细胞克隆。命名为“22”的两个克隆是1991年由RW分开衍生的。贯穿本申请书，两个分开衍生的克隆区分为dkRW22和cpRW22。
为了测量CD8应答的多样性，对来自用PHA扩增一个循环的LIL(CD8CTL克隆RW51的来源培养物，表1和下文)的大批阳性选择的CD8+细胞以及来自相同捐献者的PBMC的CD8细胞进行TCR Vβ分析。用oligo-dT引物和MMLV RT(Pharmacia)将总RNA(P.Chomczynski等人，在J.E.Coligan等人编的《免疫学通用方案》(Current Protocols inImmunology)一书中，纽约，John Wiley and Sons，1992，10.11.7-10.11.14)逆转录。将cDNA用于使用Cβ和家族特异性Vβ引物的24个分开的PCR反应。30个循环的PCR后，将每个反应的一部分与荧光标记的内部Cβ引物混和，并将PCR继续5个循环以标记重排TCR Vβ基因的扩增产物。引物和方案描述于C.Pannetier等人，在J.R.Oksenberg编的《抗原T细胞受体：选择方案和应用》(The antigen T cellreceptor：selected protocols and applications)一书中，纽约，Chapman and Hall，1998，第9部分。在Fred Hutchinson癌症研究中心(西雅图，WA)的生物技术中心用荧光NW标准和ABI测序仪进行分析。根据TCR Vβ扩增产物“梯”内泊松分布和多重峰的判断，CD8 PBMC是极其多克隆的(图1A)，而病变CD8群体显得相当寡克隆的(图1B)。由另一个捐献者获得了相似结果。这些数据与HSV-2病变中的局部CD8应答的有限多样性是一致的。实施例2：子宫颈淋巴细胞中HSV特异性T细胞应答的检测
粘膜免疫应答与PBMC是隔离的，而且小鼠粘膜中HSV特异性CTL的定位与阴道接种的保护有关。本实施例证明了可以在子宫颈淋巴细胞中检测到HSV特异性T细胞(包括CD8+细胞)。
在急性生殖性HSV-2的发作过程中由代表性子宫颈刷细胞样本收集细胞，并用PHA/IL-2大批扩增，随后分析HSV特异性增殖(图2A)和细胞毒性应答(图2B)。增殖和细胞毒性测定法使用自体PBMC或LCL作为APC，如上文关于由皮肤衍生的淋巴细胞所述。如Koelle等人所述(D.M.Koelle等人，1994，病毒学杂志(J.Virol.)68：2803-2810；D.M.Koelle等人，1994，感染病杂志(J.Infect.Dis.)169：956-961)，使用抗HLA I型mAb W6/32或抗HLA DR mAb L243。存在抗原特异性增殖应答和细胞毒性应答。分级分离和mAb抑制研究显示CD8CTL对细胞毒性应答有贡献。实施例3：原发型生殖性HSV-2病变中HSV特异性T细胞应答的检测
在本实施例中，由展示与原发型生殖性HSV-2感染一致症状的患者收集活组织标本样本。确定收集的细胞的表型，并将来自样本的LIL和PBMC进行增殖和细胞毒性测定法。结果显示在原发型生殖性HSV-2病变中存在的CTL的HSV特异性增殖和细胞毒性应答对于在复发型疾病中检测到的应答是典型的。
CW7477在他最后一次性接触后3天显现排尿困难、发热、臀部和下腹部病变。病变持续了13天并发展HSV-2。于出现症状的第4天开始无环鸟苷处理。第4天和第7天进行活组织标本检查。第4天的血清状况是非典型性阳性(免疫印迹上只存在少数条带)。第26天，通过特异性HSV-2免疫印迹的增强型化学发光(ECL；J.Dalessio和R.Ashley，1992，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)30(4)：1005-1007)变体，具有更多条带，但是仍然少于大多数康复期中的血清。临床和实验室资料与原发型生殖性HSV-2感染是一致的。出现症状的第4天和第7天获取活组织标本样本，并如上所述用PHA/IL-2扩增大批LIL。
扩增细胞的表型界于CD4与CD8细胞之间，在LIL中15-25％是CD3+/CD16、56+细胞，5-10％是TCRγδ+细胞。比较而言，来自正常皮肤的细胞几乎没有CD16、56(+)事件且没有TCRγδ细胞。CD3+/CD16/56+细胞的本质未知，但是常常在扩增的LIL中看到这些细胞。抗体鸡尾酒具有αCD16-PE与αCD56-PE的联合。表2：来自人原发型生殖性HSV-2感染的大批LIL或PBMC的功能活性。
                         增殖1                          细胞毒性2
                         应答者                          效应物
  第4天   第7天   第4天   第15天   第4天   第7天     第4天   第4天
  抗原   病变   病变   正常皮肤   PBMC     靶   病变   病变     正常皮肤 病变CD8+
  培养基 203 587 153 1,092 自体模拟物 2.9 2.2 4.3 1.1
  模拟物病毒1∶100  187   775  146     1,296     自体HSV-1 16.2 28.3 2.9
  UV HSV-11∶100 12,926 26,328 143     自体HSV-2 48.3 29.8 4.4 67.5
  UV HSV-21∶100 12,685 14,481 152 20,179     自体牛痘野生型 -2.5 4.8 2.3
    gB21μg/ml 16,416 23,351 234 15,282     自体vgB2 15.8 16.8 -5.2
    gD21μg/ml 8,750 13,392 216 3,976     自体vgD2 5.1 13.1 2.1
    VP161μg/ml 816 8,689 166     自体vVP16 3.0 6.6 2.1
    PHA0.8μg/ml 12,795 22,318 41,229 59,691     异体模拟物 1.0 5.9 2.8
    异体HSV-2 3.6 4.5 2.7
    K562   1.1   69.2     2.1     10.4
1以104个/孔使用大批细胞，以自体经照射PBMC(105个/孔)作为APC。结果是第4天的3H-胸苷掺入平均值cpm。第15天以105个活细胞/孔使用PBMC。2在自体或HLA错配(异体)LCL感染(MOI为10)18小时后的51Cr释放中以20∶1的效应物∶靶比率使用大批细胞。通过MidiMacsTM(Miltenyi)富集CD8+细胞。结果是特异性释放百分比；自发释放＜22％。
在复发型疾病中检测到的HSV特异性增殖和细胞毒性应答相当典型(D.M.Koelle等人，1998，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)101：1500-1508)。存在与HSV-1和HSV-2的交叉反应应答，就像针对HSV糖蛋白的抗原特异性应答一样。正常皮肤应答是低的，而且第15天显现PBMC应答发展。实施例4：由HSV特异性CD8 CTL识别的ICP0抗原的鉴定
本实施例通过表达克隆证明了ICP0的抗原性。具体而言，鉴定了ICP0第92-101位氨基酸内的表位。另外，使用牛痘确认了ICP0的抗原性。氨基酸编号使用Dolan等人，1998，病毒学杂志(J.Virol.)72：2010-2021的命名法和编号。材料和方法
将Boon等人的Cos-7表达克隆方法用于表达克隆(E.De Plaen等人，在I.Lefkowits编的《免疫学方法手册》(Immunology MethodsManual)一书中，第2版，纽约，Academic出版社，1997，第691-718页)。在200μl TCM中涂布1×104个清洗后的自体LCL刺激物(模拟物或以MOI 10受HSV-2感染18小时)和5×104个应答者TCC 24小时，一式三份，以CD8 T细胞读数测试γ-干扰素分泌(M.A.Tigges等人，1992，病毒学杂志(J.Virol.)66：1622-1634)。
文库使用pcDNA3.1(+)his A、B、和C(Invitrogen)作为表达载体。这些特定载体在多克隆位点(MCS)的5’端具有内在的ATG起始密码子，产生前导肽与病毒多肽片段的融合蛋白。存在六分之一的机会，其中病毒DNA片段是正向的且处于ATG的读码框内。因此，使用3种载体(A、B、和C)，它们在ATG与MCS之间分别具有额外的0、1、或2bp。
使用由Vero细胞纯化(A.R.MacLean，在S.M.Brown、A.R.MacLean编的《分子医学方法：单纯疱疹病毒方案》(Methods in MolecularMedicine：Herpes Simplex Virus Protocols)一书中，第10版，Totowa，NJ，Humana出版公司，1998，第19-25页)的HSV-2毒株HG52DNA构建文库。用Sau3AI消化约155,000bp的基因组，预测产生456个片段，平均长度为几百个碱基对。将末端部分补平，并在分开的反应中将片段连接到经XbaI消化、部分补平、去磷酸化的A、B、和C载体中，以构建初级文库。部分补平预防了＞1个插入片段/载体的连接。在20个随机克隆中没有检测到细胞DNA的污染。立即扩增初级文库并分装保存。达到了6倍基因组过度取样的目标，假定每个文库只有六分之一是正向的且符合读码框：每个文库包含＞15,000个转化体。在每个文库中研究了3000个克隆。将文库滴定，并在深孔微量滴定板中稀释至15个克隆/孔。于300rpm、37℃旋转18小时后纯化DNA(Millipore 96孔板形式；硅化学法处理)。获得了10μg/孔(分光光度计)的平均产量，足以用于将来的许多筛选。
选择病变克隆RW51(表1)用于表达克隆。CD8 TCC RW51的HLA限制性等位基因是B45，因为只在B45匹配的LCL在CTL测定法中裂解。通过RT-PCR克隆HLA B*4501的cDNA。cDNA合成使用来自RW LCL的总RNA(在P.Chomczynski、N.Sacchi在J.E.Coligan编的《免疫学通用方案》(Current Protocols in Immunology)一书中，纽约，John Wiley andSons，1992，10.11.7-10.11.14)、ologo-dT引物和MMLV RT(Pharmacia)，以及标准方案(J.Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，纽约，冷泉港出版社，1989)进行。将HLA B*4501的PCR产物(引物AA GGTACCATGCGGGTCACGGCACCCCGAA和GG TCTAGAAGTTCGACACTCTCTGTGTAGT；KpnI和XbaI位点标有下划线；分别为SEQ ID NO：4和5)进行消化，克隆到pcDNA3.0中，并测序。它与B*4501的Genbank 61710相同。用FITC标记的等位基因特异性mAb B12(One Lambda公司)检查表达。根据流式细胞计量术，在第48小时时，40％经转染(图6，Boehringer Mannheim)Cos-7表达表面HLA B45，比较而言，载体＜1％。类似克隆HLA A*0201，即CD8 TCC RW3和dkRW22(表3)的限制性等位基因，并用mAb MA2.1(A.J.McMichael等人，1980，人类免疫学(Human Immunol.)1：121-129)证明表达。
为了对文库筛选抗原性蛋白质，24小时后用文库集合与B*4501DNA(50和25ng/孔)共转染以7,000个/孔涂布于平底微量滴定板中的Cos-7细胞。48小时后加入克隆的RW51 T细胞(5×104个/孔)。用匹配的mAb对(Endogen)对上清液(再过24小时)进行γ-干扰素ELISA(检测低限为约2pg/ml)。在每个读码框文库(A、B、和C)中找到2-4个阳性集合。将来自阳性集合的细菌涂板，挑取菌落，并制备DNA用于下一轮测定。所有阳性克隆具有相同的1164bp HSV-2Sau3AI插入片段(图3)，包含HSV-2中编码IE蛋白质ICP0的ORF的外显子1、内含子1、和外显子2的一部分。存在位于ICP0的ATG起始密码子5’端的另一445bp基因组DNA。选择代表性阳性克隆A1：H3：B8用于进一步的测定。
由于A和B读码框文库中存在阳性基因组克隆，而且在A和B文库阳性克隆中在载体ATG的读码框中且在ICP0 ATG前存在3个终止密码子，因此赞成使用HSV-2启动子而非载体的CMV启动子。对HSV-1 ICP0，不存在VP16(αTIF)和“病毒内容”时的5’元件具有组成型启动子活性。
为了找到表位，检查HSV-1 ICP0 mRNA在Cos-7细胞中是否且如何剪接。ICP0 mRNA是少数进行剪接的HSV基因之一；旁路剪接已有报导。使用引物C，将来自用(+)基因组片段A1：H3：B8(表4)转染的Cos-7细胞的总RNA和MMLV RT用于生成cDNA(图3)。然后在PCR中使用位于翻译起点的引物A和引物C。8个cDNA克隆的序列都显示剪接。受体位点位于发表位点3’端3bp，除去了氨基酸Q26。为了缩小表位，将A-C(外显子1，外显子2的起点)和A-B(外显子1)的PCR产物克隆到基于pcDNA3.1的合适载体中，以相同(正确)读码框表达。在用T细胞克隆RW51测试反应性时，外显子1-外显子2克隆是阳性的，但是外显子1克隆是阴性的(表4)。
使用牛痘-ICP0(E.Manickan等人，1995，病毒学杂志(J.Virol.)69(8)：4711-4716)来确认ICP0的表达克隆鉴定(图4)。结果
所有HSV特异性CD8克隆以特异性方式释放IFNγ(表3)。另外，检查了γ-干扰素测定法作为HLA限制的确认性测试的效用。克隆RW51在暴露于用HLA B*4501而非A*0201转染并用HSV-2感染的Cos-7细胞后特异性释放γ-干扰素(表3)。表3：来自由病变衍生的HSV特异性CD8+TCC(RW51)的γ-干扰素分泌(pg/ml)(通过ELISA测定)。
              刺激物                    应答者TCC
            自体LCL模拟物                 ＜5
            自体LCl HSV-2                 440
            Cos-7 A*0201/HSV-2            ＜5
            Cos-7 B*4501/HSV-2            600表4：CD8 TCC RW51在应答用多种DNA转染(或以1μM装载肽)的Cos-7细胞时的γ-干扰素分泌(pg/ml)(通过ELISA测定)。于24小时检查5×104个TCC对7×103个Cos-7细胞的应答。
                     HSV-2 DNA或肽
HLA I型  空       集合      克隆          ICP0      ICP0         ICP0
cDNA     载体     A1：H3    A1：H3：B8    外显子1   外显子1、2   92-105
空载体   未进行   未进行    ＜2           ＜2       ＜2          ＜2
B*4501   ＜2      420       ＞600         ＜2        ＞600       1,100
为了有效的选择肽，由B45限制肽衍生了HLA B45结合基序，并合并来自由B*4501洗脱的肽的序列。在基序中，谷氨酸位于第2位，疏水氨基酸位于第10位(在“结合”命名法(H.G.Rammansee，1995，免疫学现行观点(Current Opinion in Immunology)7：85-96)中的P1和P9)。肽ICP0 92-105(A ERQGSPTP ADAQG；SEQ ID NO：19)在CTL(图4)和γ-干扰素(表4)测定法中有活性。其它候选外显子2肽没有活性。高EC50值(约1μM)可能是由于预测位于肽结合凹槽以外并降低与HLA B*4501的结合的羧基末端尾所致。培养并滴定(D.M.Koelle等人，1994，病毒学杂志(J.Virol.)68：2803-2810)来自B.Rouse(E.Manickan等人，1995，病毒学杂志(J.Virol.)69：4711-4716)的牛痘-ICP0。克隆RW51特异性裂解牛痘-ICP0靶(图4)。牛痘的有效性是幸运的，而且对于确认表达克隆的结果并不需要。为了缩小表位，合成了包含ICP0第92-101位氨基酸的肽(AERQGSPTTP；SEQ ID NO：6)。该肽的IC50在1和10nM之间(图5)。
为了确认患有HSV-2感染的患者具有与最近发现的在他们的外周血中循环的T细胞抗原发生反应的T细胞，将患者(曾经回收病变衍生克隆RW51的同一患者)的外周血单核细胞(PBMC)用肽进行刺激。将PBMC以2×106个细胞/1.88cm2孔在2ml含1.0μg/ml肽HSV-2 ICP092-101的T细胞培养基中培养3天。第4天加入32U/ml IL-2。第8天清洗细胞并在相同大小的孔中用额外的2×106个经照射(3300rad γ照射)自体PBMC、1.0μg/ml相同肽、和32U/ml IL-2进行再刺激。
将应答者在存在IL-2的情况中继续培养9天并根据需要进行扩增。使用未处理、用肽HSV-2 ICP0 92-101以1μg/ml处理18小时、或用HSV-2毒株333以MOI 10感染18小时的自体或HLA I型错配LCL进行细胞毒性测定法。细胞毒性测定法是标准的4小时51Cr释放测定法。
结果(图6)显示，肽HSV-2 ICP0 92-101对PBMC的刺激能够刺激细胞具有针对受HSV-2感染细胞的细胞毒性，而且不存在针对HLA I型错配细胞的这种活性。为了比较，指标T细胞克隆RW51也作为效应细胞用于该测定法，并在效应物∶靶比率10∶1展示可比的然而略微更高的细胞毒性(图6)。实施例5：由HSV特异性CD8 CTL识别的UL47抗原的鉴定
本实施例通过表达克隆证明了由蛋白质UL47编码区内所含DNA编码的HSV多肽的抗原性。实施例4中描述了表达克隆和文库制备。
选择病变克隆dkRW22.1991用于表达克隆。该克隆具有针对受HSV-2感染的自体LCL的溶细胞活性(表1)。CD8 TCC dkRW22.1991的HLA限制性等位基因是HLA A*0201，因为用HLA A*0201而非B*4501转染然后用HSV-2感染的Cos-7细胞可特异性刺激dkRW22.1991的γ-干扰素释放(表5)。根据流式细胞计量术，克隆dkRW22.1991具有如下表型：CD3(+)、CD4(-)、CD8(+)、CD16和56(-)、和T细胞受体α/β(+)。结果
为了对文库筛选抗原性蛋白质，24小时后用文库集合与A*0201DNA(50和25ng/孔)共转染以9,000个/孔涂布于平底微量滴定板中的Cos-7细胞。48小时后加入克隆的T细胞，并如实施例4所述对第24小时时的上清液进行γ-干扰素测定法。在来自pCNA3.1-his C的文库中发现一个阳性集合。将来自该集合的细菌涂板，并由96个菌落制备DNA用于下一轮测定。在后续轮的γ-干扰素释放测定法中发现一个阳性克隆，命名为C1F1C7。病毒插入片段的测序揭示了它是HSV-2基因组第102875-101383位核苷酸的1.4kb Sau3AI片段。该序列编码HSV-2 UL47的C端区域第292-696位氨基酸、一段短插入区、然后是HSV-2 UL46的N端70个氨基酸。
为了部分缩小编码抗原性表位的HSV-2 DNA区域，使用具有校读功能的热稳定DNA聚合酶(pfu，Invitrogen)通过PCR克隆HSV-2 UL47和UL46全长基因。用于UL47的引物是CTA GGATCCCCTCCGGCCACCATGTCC(5’引物；SEQ ID NO：7)和CGA TCTAGACCTATGGGCGTGGCGGGC(3’引物；SEQID NO：8)；用于UL46的引物是CGA GGATCCGTCTCCGCCATGCAACGCCG(5’引物；SEQ ID NO：9)和CGC TCTAGATTTTAATGGCTCTGGTGTCG(3’引物；SEQ ID NO：10)。在每种情况中，5’引物包含掺入的BamHI位点(下划线)，3’引物包含掺入的XbaI位点(下划线)，以便于克隆。
用BamHI和XbaI消化PCR产物，并克隆到pcDNA3.1-his-C中，从而在两种情况中都产生符合读码框的融合蛋白。通过测序确认了位于克隆到pcDNA3.1-his-C中HSV-2基因5’端的融合区的序列。另外，通过限制性消化和重新连接删除了最初阳性克隆C1F1C7内所含所有UL46编码序列。子构建物命名为C1F1C7-ApaI(-)。
为了测试由病变衍生的T细胞克隆的反应性，用A*0201 DNA转染Cos-7细胞，并且或是用HSV-2感染或是用这些构建物的每一种转染。结果与由编码HSV-2 UL47的DNA编码的抗原的识别是一致的。克隆C1F1C7-ApaI(-)是阳性的。因为该克隆删除了所有的UL46序列，因此UL46不被识别。另外，全长UL47而非UL46与HLA A*0201一起转染进入Cos-7细胞，产生的细胞特异性刺激dkRW22.1991分泌γ-干扰素。表5：TCC dkRW22.1991在应答用功能性HLA I型重链cDNA转染并用HSV-2感染(MOI约为5)的Cos-7细胞时的γ-干扰素分泌。
        HLA cDNA      无    A*0201   A*0201   B*4501
        活的HSV-2     无    无        HSV-2     HSV-2
        IFNγ(pg/ml)  ＜10  ＜10      ＞600     ＜10表6：克隆dkRW22.1991在应答用HLA A*0201转染并且或是用HSV-2感染作为阳性对照或是用含HSV-2基因组特定片段的真核表达载体共转染的Cos-7细胞时的γ-干扰素分泌。
HLA cDNA      无    A*0201 A*0201   A*0201         A*0201  A*0201
活的HSV-2     无    无      无        无              无       无
HSV-2 DNA     无    无      C1F1C7    C1F1C7-ApaI(-)  UL47    UL46
IFN-γ，pg/ml ＜10  ＜10    ＞600     ＞600           ＞600    ＜10实施例6：UL47第289-298、551-559、和551-561位氨基酸鉴定由HSV特异性CD8 CTL识别的抗原材料和方法
细胞系和病毒：EBV-LCL是内部由PBMC制备的；ARENT、PITOUT、HERLUF、和KAS011是由G.Nepom获得的。HSV-1 E115和HSV-2 333和HG52和重组牛痘-ICP0-HSV-2(由B.Rouse提供)和野生型牛痘NY是在Vero或BSC-40细胞中产生和滴定的。
HSV特异性T细胞是由HSV-2培养物阳性臀部病变获得的。第5天由病变或由疱疹囊泡流体采集活组织标本。用PHA和IL-2大批扩增淋巴细胞。用免疫磁珠(Minimacs，Miltenyi)选择并克隆CD8细胞。对于对象HV，将活体组织在胶原酶IV-S(Sigma)中于37℃消化5小时，并通过10倍系列稀释克隆产生的细胞悬浮液。用抗CD3mAb、IL-2、和饲养细胞扩增克隆。通过将4×106个PBMC与1μg/ml肽一起保温来制备衍生自用肽刺激的PBMC的淋巴细胞。3天后加入10U/ml人重组IL-2(Chiron)。7天后清洗应答者，并与2×106个新鲜解冻的经照射自体PBMC、肽、和IL-2一起再次涂板。第14-21天测定细胞。
表达克隆：用Sau3AI消化HSV-2基因组DNA，再次提取，并用Klenow片段、dTTP、和dCTP部分补平。用XhoI消化质粒pcDNA3.1(+)myc-hisA、B、和C(Invitrogen)，并用dATP和dGTP部分补平。连接后，将DNA电穿孔到大肠杆菌菌株DH10B中。每个文库具有几千个初级转化体。立即将每个文库的大多数在4ml添加氨苄青霉素的LB中大批扩增过夜，并分装。20个随机克隆的每一个都包含一个HSV-2 Sau3AI片段。为了制备用于转染的DNA，或用文库(约15个菌落/孔)或用选择的单个克隆接种96孔深孔板。培养过夜后，用96孔滤器制备DNA。
为了制备HLA A*0201、B*4402、B*4403、和B*4501的cDNA，由LCL提取总RNA。用oligo-dT和MMLV逆转录酶制备cDNA。PCR使用pfu DNA聚合酶、2.5mM(每种)dNTP、cDNA、和设计与重链基因互补且末端包含KpnI或XbaI位点的引物。用KpnI和XbaI消化扩增产物，并连接到pcDNA3.0中。插入片段的序列与Genbank相同。
为了研究由包含ICP0片段(下文)的阳性基因组克隆衍生的cDNA种类，用ICP0基因组克隆转染Cos-7细胞，并在48小时后制备总RNA。用于cDNA合成的引物(TGC TCTAGAGACTCGATCCCTGCGCGTCGG，XbaI位点标有下划线；SEQ ID NO：11)是由ICP0基因组克隆中HSV-2 DNA 3’端序列衍生的。使用MMLV逆转录酶。为了检查剪接，PCR使用pfu聚合酶、cDNA、上文3’引物、和5’引物TAA GGTACCTGAACCCCGGCCCGGCACGAGC(KpnI位点标有下划线；SEQ ID NO：12)。为了分离ICP0的外显子1，PCR使用相同的5’引物和3’引物TGC TCTAGACCAGGCGTGCGGGGCGGCGGG(XbaI位点标有下划线；SEQ ID NO：13)。将产物克隆到pcDNA3.1-his-B中。
使用上文鉴定的相同引物(SEQ ID NO：7和8)，通过PCR将HSV-2的全长UL47克隆到pcDNA3.1-his-C中。使用上文鉴定的相应引物(SEQID NO：9和10)，通过PCR将HSV-2的全长UL46克隆到pcDNA3.1-his-C中。相似的，使用上文5’引物、合适的3’引物、和pcDNA3.1-his-C，通过PCR制备表达UL47第1-595和1-640位氨基酸的构建物。使用位于第535位氨基酸的天然NotI位点制备构建物UL47 1-535和536-696。通过测序确认了符合读码框的融合。
淋巴细胞功能测定法：通过标准4小时51Cr释放进行CTL测定法。用HSV以MOI 10和效应物∶靶比率20∶1感染靶EBV-LCL达18小时。以10μg/ml使用抗I型mAb W6/32。在感染前30分钟及90分钟感染，清洗和测定周期中，以5μg/ml使用放线菌素D，以研究对病毒RNA表达的抑制效果。
将HSV反应性CD8 CTL的IFNγ分泌作为终点用于确认功能性HLAcDNA的分离并用于表达克隆。第1天将Cos-7细胞以9,000个/孔涂布于平底96孔板中。第2天用50ng HLA cDNA(Fugene-6)进行转染。第3天用HSV-2 333感染细胞。第4天加入0.7-1.0×105个克隆CD8 T细胞。第5天保存上清液。
为了筛选文库，用50ng HLA cDNA与100ng文库DNA(15个菌落的集合或单个菌落)共转染Cos-7细胞。2天后，加入1×105个克隆T细胞/孔，并于24小时后保存上清液。裂解阳性集合以鉴定活性细菌克隆。将活性克隆中的HSV-2 DNA测序。
流式细胞计量术：通过标准方法用针对CD3、CD4、CD8、CD16/56、TCRαβ、或TCRγδ的经标记mAb对淋巴细胞进行染色。为了测量经转染Cos-7细胞中的HLA表达，将用胰蛋白酶消化的细胞与1μg对HLAB*4501有反应性的FITC标记mAb B12(One Lambda公司)进行混合；或者与对HLA A*0201反应性的mAb MA2.1细胞的上清液进行混合，随后混合FITC标记的山羊抗小鼠IgG。
HLA分型：为了定义HLA B44等位基因，对可变外显子进行直接测序。
ELISA：使用购自Endogen的试剂通过ELISA测量γ-干扰素。用100μl 0.25μg/ml捕获mAb M700A-E包被平板，并用溶于0.2M NaCl/3mMKCl/0.05M Tris pH9(TBS)的1％BSA封闭1小时。随后的保温每个孔加入100μl，之前用PBS/0.2％吐温20清洗3-5次，并于室温进行旋转。加入在添加0.1％BSA、0.05％吐温20、和4μg/ml免疫球蛋白抑制剂#6LD1068的TBS(Bioreclamation公司，East Meadow，纽约)(样品缓冲液)中稀释的样品和标准品达2小时。加入在样品缓冲液中稀释至100ng/ml的生物素化检测mAb(M701B)达1小时。加入在添加1％BSA、0.05％吐温20的TBS中稀释至100ng/ml的亲和素D：HRP(A-2004)达1小时。加入TMB底物达10分钟。检测范围的低限是2-10pg/ml。
结果显示于图7-10和表7-9。表7
                          自体                    HLA错配1        HLA部分匹配2T细胞克隆       模拟物    HSV-1  HSV-2   HSV-2/   模拟物  HSV-2  等位基因  模拟物  HSV-2
                                       Act D3dkRW.1997.51    1         3.7    73.6    45.1     2.9     4.5    B*4501    0      61.8dkRW.1991.22    1.2       0.1    38.3    12.1     0       0      A*0201    3.3    65.2HV.1999.23      6         0      56.6    35.8     2.5     2.1    A*0201    0      33.4表8T细胞克隆     HLA cDNA  基因组克隆    HSV-2序列(核苷酸)    HSV-2ORF(s)(氨基酸)dkRW.1997.51  B*4501   A1：H3：B8    1,858-3,022         ICP0 1-105dkRW.1991.22  A*0201   C1：F1：C7    102,875-101,383     UL47 299-696...UL46 1-71HV.1999.23    A*0201   C2：C10：B9   102,943-102,875     UL47 278-298表9
              HLAI型等位基因    裂解EBV-LCL    HLA A          HLA B           禾感染    受HSV-2感染自体       *01，*0201   *08，*57      9.1       70.4CW 7477    *0301，*11   *4402，1801     70.3      94.2HERLUFF    *02           *4402，35       60.0      nd2HH 7894    *03，*31     *4402，*1524  77.2      75.5KK 6806    *02，*03     *4402，*2705  57.4      62.3PITOUT     *2902         *4403           71.0      51.2MK 8080    *03，*30     *4405，*39    2.6       1.0
结果显示渗透病变的CD8 CTL识别立即早期(ICP0)或病毒体输入(UL47)蛋白，正如放线菌素D抑制和由HSV编码的TAP和转录抑制剂的预测一样。此外，HSV-2 UL47 289-298/A*0201特异性CD8 CTL与HLAB*4402和B*4403而非B*4405发生交叉反应。TCR可识别这些B44等位基因加上存在于B细胞以及人和灵长类肾上皮细胞中的目前未知的“特家”肽。这些资料说明，在将来自A*0201/非B*4402或B*4403类人的干细胞置于A*0201(受HSV-2感染的个人)中时，交叉反应性T细胞可介导GVHD；在将携带B*4402或B*4403的器官置于A*0201(受HSV-2感染的个人)中时，还介导移植排斥。实施例7：UL47第548-557位氨基酸作为由HSV特异性CD8 CTL识别的抗原的鉴定
针对预测可结合HLA-A2并由HSV-2基因UL47衍生的一系列合成肽测试了CD8+T细胞克隆cpRW22(由与dkRW22相同的来源分开衍生)。这些肽之一在IFNγ ELISPOT测定法中被cpRW22阳性识别。得分为阳性的UL47肽的序列是：NH2-RLLGLADTVV-COOH(SEQ ID NO：18)，该肽包含UL47的第548-557位氨基酸。
制备了与UL47/548-557交叠的一系列10聚体肽(UL47/549-558、550-559、551-560、和552-561)和9聚体肽(UL47/548-556、549-557、550-558、551-559、和552-560)，以更好的确定最佳靶肽。一种9聚体(UL47/551-559)和两种10聚体(UL47/550-559，551-560)在ELISPOT测定法中在低浓度的得分为强阳性(图11A和11B)。UL47/550-559和UL47/551-559肽在测试的所有肽浓度具有相似活性。实施例8：UL47第550-559位氨基酸作为天然加工抗原的鉴定
为了确定天然加工的UL47肽，由1.5×1010个C1R-A2/3D9.6H7细胞纯化A2分子，并通过酸洗脱剥落结合的肽。将这些肽在HPLC柱上在如下条件下进行分级分离：TFA离子配对试剂；0-10％乙腈(ACN)达5分钟，10-45％ACN达50分钟，45-60％ACN达5分钟。对这些级分测试敏化T2靶，从而在IFNγ ELISPOT测定法中被cpRW22 T细胞识别的能力。靶是用溶于无血清培养基+3μg/ml HuB2M的5％每种级分于32℃脉冲4小时的T2细胞(20,000个)。然后将靶清洗2次，并转移至ELISPOT板的孔中(10,000个/孔)，一式两份。应答者是CTL克隆cpRW22(20,000个/孔)。
发现级分17、18、和23包含这种活性(图12)。将级分17和18在HPLC柱上在如下条件下进行亚分级分离：HFBA离子配对试剂；0-10％ACN达5分钟，10-35％ACN达50分钟，35-60％ACN达5分钟。发现亚级分24和25使T2细胞敏化而被cpRW22识别(图13B；比较图13A与13C)。将级分23通过HPLC以相同方式进行亚分级分离。发现亚级分37使T2细胞敏化而在IFNγ ELISPOT测定法中被cpRW22识别(图14)。将UL47/551-559、550-559、和551-560肽在亚分级分离条件下进行HPLC，发现洗脱于级分37(UL47/550-559；图15A)、40/41(UL47/551-560；图15B)、和32(UL47/551-559；图15C)。
UL47/550-559在与来自C1R-A2/3D9.6H7细胞的天然加工肽相同的级分(37)中洗脱，因此有可能具有与天然加工肽相同的序列。级分23/亚级分37的MS/MS数据显示存在分子量为961的肽(图16)。UL47/550-559的分子量也是961。这为UL47/550-559是天然加工的UL47肽提供了支持性证据。
UL47/550-559肽的氨基酸序列是LGLADTVVAC(SEQ ID NO：1)。随后使用针对pBIB逆转录病毒载体克隆位点的侧翼区和编码UL47/550-559的DNA序列的引物，通过PCR确认了能够编码UL47/550-559肽的HSV-2基因片段包含于C1R-A2/3D9.6H7细胞中(图17)。使用这些PCR引物和变化的PCR条件，证明了C1R/A2/3D9.6H7细胞包含至少两个由HSV-2衍生的逆转录病毒插入片段(图18A-C)。一个插入片段编码UL52基因的两个片段。第二个插入片段编码UL47基因的大部分，包括编码UL47/550-559肽的部分。实施例9：用于鉴定由HSV特异性CD8 CTL识别的蛋白质的方法
该实施例证明了如何能够使用由病变衍生的材料鉴定由HSV特异性CD8 CTL识别的其它蛋白质。由生殖性臀部HSV-2病变分离HSV特异性CD8 T细胞
清洁和麻醉后由直肠周围、臀部和/或大腿皮肤打孔采集活组织样本(3-4mm)。尽可能早的由怀疑患有原发型疱疹的病变采集活组织标本，优选在原发型感染过程中至少进行两次系列活组织标本采集。优选将康复阶段的复发型生殖性HSV-2病变(晚期溃疡/硬皮)用于寻找抗原/表位，因为来自这些病变的LIL具有高CTL活性。可以将病变部分在异戊烷/液氮中在OCT培养基中快速冻结以用于免疫组织学。解离一部分活组织标本，以有限稀释度培养细胞，并取一部分用于大批培养(D.M.Koelle等人，1998，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)101：1500-1508)。切碎组织，并在48孔板中在含50μM无环鸟苷的T细胞培养基中用0.8μg/ml PHA和7.5×105个饲养细胞PBMC/孔进行刺激，由此大批扩增LIL。用50U/ml IL-2(Hemagen)帮助扩增，通常在14-21天产生1-5×107个细胞。在4小时51Cr释放测定法中，以效应物∶靶比率20∶1，对由CD8选择的细胞测试针对自体和异基因模拟物和受HSV-2感染LCL的CTL活性(M.A.Tigges等人，1992，病毒学杂志(J.Virol.)66：1622-1634)。该阶段的裂解活性是回收HSV特异性CD8 CTL克隆的预兆。
为了提高稀有CD8 CTL或在大批培养中可能具有生长劣势的CTL的回收，可以规避最初的大批扩增步骤。在病变发展的中期，HSV-2病变是囊泡。可以如下由囊泡流体克隆HSV特异性CD8 CTL。弄破囊泡，并用细胞刮刀将流体回收到培养基中。取一部分用于细胞旋转制备(固定后保存于-70℃)。在进行了菲科尔(Ficoll)衬垫和标准密度梯度离心之后，清洗位于界面的细胞，并以100-1个细胞/孔的系列稀释与克隆鸡尾酒(如下)一起铺于U底96孔板中。由囊泡回收的细胞通常是每个病变大约1×104-2×105个。
T细胞克隆使用已建立的流程(D.M.Koelle等人，1994，感染病杂志(J.Infect.Dis.)169：956-961)。以2和0.3个细胞/孔接种在一轮LIL大批扩增中由CD8选择的细胞。以改良的有限稀释方案，由30-100个细胞/孔开始，每步降低2-3倍至1个细胞/孔，涂布来自新鲜破裂的病变活组织标本或囊泡流体的细胞(Koelle等人，1994，见上文)。对于由CD8富集的新鲜LIL和囊泡细胞，可以取一部分大批扩增(D.M.Koelle等人，1998，感染病杂志(J.Infect.Dis.)101：1500-1508)。每周两次用IL-2饲养微量培养物并于约第14天进行筛选。为每个输入数目记录显示生长的孔所占百分比，以评估微量培养物克隆性的可能性。筛选候选培养物
用于候选培养物的优选筛选是针对受HSV-2感染(18小时，MOI 10)或未感染的自体LCL的分裂孔CTL测定法。LCL是用大约6周时间由PBMC建立的EBV转化的B细胞系(D.M.Koelle等人，1993，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)91：961-968；G.Miller等人，1972，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)69：383-387)。LCL允许HSV感染，但是与真皮成纤维细胞相比相对抵抗由HSV介导的HLA I型下调。登记大多数个体并在活组织标本采集前制备LCL。由此，当TCC能够用于筛选时，将可获得LCL。优选在Vero细胞上分离、培养、和滴定自体HSV-2(Koelle等人，1993，见上文)。
对于由大批扩增LIL衍生的克隆，将产生37％或更少生长阳性孔的细胞输入数目命名为大致“克隆”。将每种微量培养物的半数与2×103个靶一起以效应物∶靶比率约15∶1进行一式双份涂布(最后，培养物/测定孔1/8)。认为受HSV-2感染靶的净裂解超过未感染靶的裂解达15％的克隆是阳性的。通过流式细胞计量术分析具有CTL活性的克隆，并扩增携带CD8的CTL克隆。以有限稀释形式扩增来自新鲜的破裂的病变活组织标本和囊泡的微量培养物(如上)。在没有进行预先大批扩增的情况中，微量培养物包含“姐妹”克隆的机会将更小，尽管有可能在分开的微量培养物中由新鲜病变材料独立回收相同细胞。扩增具有CTL活性的培养物
通过Riddell等人的方法(Riddell等人，1996，自然医学(NatureMedicine)2：216-223；美国专利号5,827,642)扩增在筛选测定法中得分为阳性的T细胞。将原始微量培养孔中的剩余半数细胞(约5×104个细胞)在25mlT细胞培养基(D.M.Koelle等人，1994，感染病杂志(J.Infest.Dis.)169：956-961)中与2.5×107个经照射(3300rad)混合型异基因PBMC、5×106个经照射(8000rad)LCL、和30ng/ml mAb OKT3(抗CD3)混合在一起。24小时时，然后是每周两次，加入50U/ml rhIL-2(Chiron，Emeryville，CA)。第4天通过清洗除去OKT3。通常，T细胞在第一轮的终点扩增至约1-5×107个细胞。当于约第12天生长明显放慢时，可进行确认性CTL测定法。相同第二轮后保存的细胞数目本质上不受限制，因为通常发生进一步的200-1000倍扩增。扩增细胞的解冻部分在CTL、增殖、和细胞因子测定法中起作用。大约10-20％的克隆不能扩增；抗原特异性的丧失是少见的，但是可能发生复制潜力的丧失。
上文所述Cos-7共转染方法可用于表达克隆。可以使用来自经测序HSV-2毒株HG52的DNA，Sau3AI消化，并连接到pcDNA3.1(+)his系列的每一种成员中。可以克隆编码HLA I型重链(限制选择的TCC)的cDNA用于表达克隆，如果需要，如上所述通过RT-PCR克隆到pcDNA3.0中。已经发表了通用方法(P.D.Ennis，1990，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：2833-2837)。可以使用校读聚合酶，并将cDNA测序。引物是等位基因特异性完美匹配，并含靶序列中不存在的内切核酸酶位点的“尾”。可以用优先切割非期望cDNA的酶消化PCR产物，由此减少非期望的重链PCR产物(可能是共扩增的)。为了测试cDNA功能，可以1)用等位基因特异性mAb检查48小时转染的Cos-7细胞中的细胞表面表达，并2)通过上文表3例示的方法检查HSV-2抗原呈递。期望结果是转染重链后等位基因特异性mAb对Cos-7细胞的特异性染色；包括空白载体和对照mAb。预计用重链转染并用HSV-2感染的Cos-7细胞对CD8 TCC的γ-干扰素分泌存在特异性刺激。
每个文库筛选的克隆数目将取决于文库构建过程中产生的限制性片段数目，但是通常是几千。集合大小(每个孔受感染Cos-7细胞的克隆数目)将由约15个病毒DNA片段/孔开始。分解阳性集合，并测试单个克隆。将阳性克隆测序，并与发表的HSV-2序列进行比较以鉴定抗原。表位作图
可以借助分子、生物信息、和合成方法进行表位作图。基因组文库筛选(如上)产生基因片段，即长度范围为25-300个氨基酸的最初“阳性物”。可以使用标准方法缩短阳性分子克隆中的HSV-2编码序列，诸如外切核酸酶III消化(M.A.Gavin等人，1993，免疫学杂志(J.Immunol.)151：3971-3980)，以产生HSV-2插入片段的嵌套式截短片段，或者在内部限制性位点切割HSV-2 DNA并重新构建质粒。优选使用校读聚合酶进行PCR以重新扩增阳性构建物的片段。将截短片段设计成长度为50-100个氨基酸的阳性片段。对于基序匹配肽，将P1“锚”置于合成肽的第2位残基，因为位于“P减1”位置的N端肽通常面对TCR而且是T细胞激发所需要的。如果没有已知的基序，制备交叠5个残基的15聚体肽。在CTL和/或γ-干扰素测定法中以1和10μM测试肽。
若这些方法没有找到表位，则可以进行活性HSV-2构建物两端的进一步分子修剪”以发现最小编码序列(J.Schneider等人，1998，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)75：451-458)。若该肽在CTL测定法中仍然不是阳性的，则翻译后修饰可能是需要的。通过电穿孔或渗透休克将通过分子遗传学方法预测为阳性的肽装载到APC中(W.Chen等人，1993，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)15：49-57)。实施例10：其他HLA-B45对象中CTL应答的ICP0刺激
本实施例证明了其他HLA-B45阳性捐献者具有针对先前确定的ICP0 92-101肽的可检测CD8+T细胞应答。
大批形式的肽再刺激适用于CTL的敏感检测，而病变衍生抗原(LDA)形式可产生CTL水平，但是为了检测需要延长细胞增殖。在本实施例中，用1μg/ml HSV-2肽刺激2ml T细胞培养基中的4×106个PBMC，并在第3天加入10-30U/ml IL-2。第8天清洗应答者，在2ml中用2×106个经照射自体PBMC、新鲜肽、和IL-2进行再刺激，并根据需要进行分解直至第14-16天。对于两名携带HLA B*4501的人，包括指标对象，检测HLA I型限制性CD8 CTL，其不仅裂解装载肽的靶，而且杀死受HSV-2感染的靶，并受到抗I型mAb的抑制(表10)。表10：用肽HSV-2 ICP0 92-101刺激的PBMC或对照克隆RW.1997.51对HLA B*4501 LCL的裂解。结果是4小时CTL测定法中于效应物∶靶比率10∶1-20∶1的特异性释放百分比。
                                         靶1
效应物     RW模拟物  RW肽1 RW HSV-2  RW HSV-2/抗I型2  HV模拟物  HV肽   HV HSV-2
RW PBMC       1      45.3    48.2       12.2               0        -1      0
PO PBMC       0      54.9    33.5       5.8                4        -1      0克隆RW.1997.51    0      65.3    67.3       5.2                1        0       21用1μg/ml ICP0 92-101装载靶LCL(RW＝B*4501，HV＝非B*4501)达90分钟，或者用HSV-2以MOI 5感染18小时。2包含10μg/ml抗HLA I型mAb W6/32。实施例11：其他HLA-A2对象中CTL应答的UL47刺激
本实施例证明了其他HLA-A2阳性捐献者对先前确定的UL47肽550-559具有可检测CD8+T细胞应答。
通过PCR方法由基因组HSV-2(毒株333)DNA扩增UL47基因，并克隆到pBIB逆转录病毒载体中。由几个UL47/pBIB克隆制备DNA，并转染到稳定表达HLA-A2的VA13细胞中。这些转染体可被UL47/550-559特异性、HLA-A2限制性的CTL克隆cpRW22识别(图19)。将用UL47/550-559肽脉冲的VA13/A2细胞用作阳性对照。
对来自几个HLA-A2阳性捐献者(RW1874、HV5101、AD116、AD120、和AD124)(他们中的一些对HSV-2是血清阳性的)的PBMC测试UL47特异性CD8+T细胞的存在。事先由捐献者RW1874衍生UL47/550-559特异性、HLA-A*0201限制性CTL克隆cpRW22。由捐献者HV5101衍生HSV-2UL47/289-298(FLVDAIVRVA；SEQ ID NO：20)特异性、A2限制性克隆HV2。因而，预期在RW1874和HV5101的PBMC中可检测到UL47特异性CD8+T细胞。在体外用1μg/ml 3种A2限制性表位之一将PBMC刺激两次：流感M1/58-66、UL47/289-298、或UL47/550-559。然后在51Cr释放测定法中针对用无肽、刺激肽、或由HIV衍生的对照肽(RT)脉冲的靶测试T细胞。已知测试的所有捐献者是HIV阴性。
结果显示于图20A-L。RW1874只应答M1和UL47/550-559肽(图20A-C)。HV5101应答所有3种肽(图20D-F)，即使UL47/289-298是使用该捐献者的细胞鉴定的唯一HSV-2肽。AD120不应答3种肽中任何一种(图20G-I)，说明他可能属于显著不同的A2亚型。AD124应答M1，但是不应答任何一种UL47肽(图20J-L)。这是预期的，因为AD124对HSV是血清阴性。这些结果概述于表11。表11：  CD8+T细胞对UL47表位应答的概述。
    血清状况         CTL应答(PBMC)
捐献者  HLA-A2  HSV-1 HSV-2  M1   UL47/550 UL47/289 RT
RW1874    +            +HV5101    +            +AD116     +       -    +AD120     +       +    +AD124     +       -    -  +    +           -       -+    +           +       -+    -           -       --    -           -       -+    -           -       -
本领域熟练技术人员将领会到，可容易的利用在上述描述中公开的概念和具体实施方案作为改良或设计其它实施方案的基础，以实现本发明的相同目的。本领域熟练技术人员还将领会到，这些等同的实施方案不违背所附权利要求中列出的本发明的精神和范围。
                序列表<110>华盛顿大学等<120>免疫学上重要的单纯疱疹病毒抗原<130>30967.6WOU3<150>60/157，181<151>1999-09-30<150>60/203，660<151>2000-05-12<150>60/218，104<151>2000-07-13<160>20<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>10<212>PRT<213>单纯疱疹病毒-2<400>1Leu Gly Leu Ala Asp Thr Val Val Ala Cys1               5                  10<210>2<211>10<212>PRT<211>单纯疱疹病毒-2<400>2Gly Leu Ala Asp Thr Val Val Ala Cys Val1               5                  10<210>3<211>9<212>PRT<213>单纯疱疹病毒-2<400>3Gly Leu Ala Asp Thr Val Val Ala Cys1               5<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4aaggtaccat gcgggtcacg gcaccccgaa                30<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5ggtctagaag ttcgacactc tctgtgtagt                   30<210>6<211>10<212>PRT<213>单纯疱疹病毒-2<400>6Ala Glu Arg Gln Gly Ser Pro Thr Thr Pro1               5                  10<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7ctaggatccc ctccggccac catgtcc                     27<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8cgatctagac ctatgggcgt ggcgggc                      27<210>9<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9cgaggatccg tctccgccat gcaacgccg                   29<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10cgctctagat tttaatggct ctggtgtcg                   29<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11tgctctagag actcgatccc tgcgcgtcgg                    30<210>12<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12taaggtacct gaaccccggc ccggcacgag c                  31<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13tgctctagac caggcgtgcg gggcggcggg                    30<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14ccttacacag tcctgctgac                               20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15gtttccgggc cctcacattg                               20<210>16<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16gcctggccga cacg                                     14<210>17<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17cgtgtcggcc aggc                                     14<210>18<211>10<212>PRT<213>单纯疱疹病毒-2<400>18Arg Leu Leu Gly Leu Ala Asp Thr Val Val1               5                  10<210>19<211>14<212>PRT<213>单纯疱疹病毒-2<400>19Ala Glu Arg Gln Gly Ser Pro Thr Pro Ala Asp Ala Gln Gly1               5                          10<210>20<211>10<212>PRT<213>单纯疱疹病毒-2<400>20Phe Leu Val Asp Ala Ile Val Arg Val Ala1               5                  10<210>21<211>11<212>PRT<213>单纯疱疹病毒-2<400>21Gly Leu Ala Asp Thr Val Val Ala Cys Val Ala1               5                  10

Claims (40)

1.包含单纯疱疹病毒(HSV)多肽和制药学可接受载体的制药学组合物，其中所述多肽包含ICP0或UL47蛋白质或其片段。
2.权利要求1的制药学组合物，其中所述片段包含ICP0的第92-101位氨基酸或其替代型变体。
3.权利要求1的制药学组合物，其中所述片段包含UL47的第289-298、548-557、550-559、551-559、或551-561位氨基酸或其替代型变体。
4.权利要求1的制药学组合物，其中多肽是融合蛋白。
5.权利要求4的制药学组合物，其中融合蛋白是可溶性的。
6.权利要求1的制药学组合物，其中还包含佐剂。
7.编码ICP0的第92-101位氨基酸，UL47的第289-298、548-557、550-559、551-559、或551-561位氨基酸，或其替代型变体的多核苷酸。
8.包含权利要求7的多核苷酸的载体。
9.用权利要求8的载体转化的宿主细胞。
10.用于生成HSV多肽的方法，包括培养权利要求9的宿主细胞并回收由此生成的多肽。
11.由权利要求10的方法生成的HSV多肽。
12.包含编码ICP0或UL47或其片段的多核苷酸和制药学可接受载体的制药学组合物。
13.包含权利要求6的多核苷酸和制药学可接受载体的制药学组合物。
14.经遗传修饰而表达ICP0的第92-101位氨基酸，UL47的第289-298、548-557、550-559、551-559、或551-561位氨基酸，或其替代型变体的重组病毒。
15.权利要求14的重组病毒，其是痘苗病毒、金丝雀痘病毒、或腺病毒。
16.包含权利要求14的病毒和制药学可接受载体的制药学组合物。
17.权利要求12、13、或16的制药学组合物，还包含佐剂。
18.用于生成针对HSV的免疫细胞的方法，包括使免疫细胞接触抗原呈递细胞，其中抗原呈递细胞经修饰而呈递ICP0或UL47蛋白质所含表位或其替代型变体。
19.权利要求18的方法，其中所述表位包含ICP0的第92-101位氨基酸，或者UL47的第289-298、548-557、550-559、551-559、或551-561位氨基酸。
20.权利要求18的方法，其中免疫细胞是T细胞。
21.权利要求20的方法，其中T细胞是CD4+或CD8+T细胞。
22.由权利要求18的方法生成的免疫细胞。
23.杀死受HSV感染的细胞的方法，包括使受HSV感染的细胞接触权利要求22的免疫细胞。
24.抑制HSV复制的方法，包括使单纯疱疹病毒接触权利要求22的免疫细胞。
25.增强抗病毒或免疫调控淋巴因子分泌的方法，包括使受HSV感染的细胞接触权利要求22的免疫细胞。
26.增强HSV特异性抗体生成的方法，包括使对象体内受HSV感染的细胞接触权利要求22的免疫细胞。
27.治疗或预防对象体内的HSV感染的方法，包括对对象施用权利要求1的组合物。
28.治疗或预防对象体内的HSV感染的方法，包括对对象施用权利要求22的免疫细胞。
29.治疗或预防对象体内的HSV感染的方法，包括对对象施用经修饰而呈递ICP0或UL47蛋白质所含表位的抗原呈递细胞。
30.权利要求29的方法，其中表位包含ICP0的第92-101位氨基酸，或者UL47的第289-298、548-557、550-559、551-559、或551-561位氨基酸。
31.权利要求29的方法，其中抗原呈递细胞被能够介导表位表达的病毒、肽、或微球体修饰。
32.用于鉴定对CD8+T细胞具有免疫原性的HSV表位的方法，包括：
a)由HSV病变获得CD8+T细胞；
b)测定获得的T细胞，以鉴定有能力识别受HSV感染的细胞的T细胞；
c)由HSV获得核酸制剂并片段化；
d)表达所获得核酸的一种或多种片段；并
e)对表达的片段测定与由步骤b测定法鉴定的HSV特异性T细胞的抗原反应性，其中将对HSV特异性T细胞有反应性的表达片段鉴定为编码对CD8+T细胞具有免疫原性的HSV表位。
33.权利要求32的方法，其中表达包括使用部分补平反应将单个片段限制性连接一种或多种载体的每一种，从而将所述一种或多种片段连接到该一种或多种载体中。
34.权利要求33的方法，其中载体还包含编码可由HSV特异性T细胞识别的HLA分子重链的核酸。
35.权利要求32的方法，其中步骤e测定法包括淋巴因子分泌测定。
36.权利要求35的方法，其中淋巴因子是γ-干扰素。
37.权利要求32的方法，其中还包括对步骤e测定法鉴定的片段进行测序。
38.权利要求32的方法，其中HSV是HSV-2。
39.权利要求32的方法，其中片段化包括用限制酶进行消化。
40.权利要求39的方法，其中限制酶是Sau3AI。
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