KR20020048944A

KR20020048944A - 면역학적으로 중요한 ｈｓｖ 항원, 그의 확인방법 및 용도

Info

Publication number: KR20020048944A
Application number: KR1020027004169A
Authority: KR
Inventors: 데이빗.엠. 코엘; 첸홍보; 로렌스 코리; 낸시 앤 호스켄; 패트릭 맥고원; 스티븐.피. 플링; 크리스틴.엠. 포사바드
Original assignee: 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터; 추후보정; 유니버시티 오브 워싱턴; 길리스 스티브; 코릭사 코포레이션
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 2000-09-28
Publication date: 2002-06-24
Also published as: BR0014408A; NO20021479L; EP1222281A2; JP2003512305A; NZ517959A; AU7836400A; CA2379623A1; ATE345389T1; US6962709B2; AU2005234654B2; NZ531980A; WO2001023414A3; JP2012214478A; NO20021479D0; WO2001023414A2; US20020155122A1; CN1376201A; TR200200838T2; HK1044799A1; PL355265A1

Abstract

본 발명은 HSV 감염에대한 예방 및 치료에 사용될 수 있는 HSV 항원을 제공한다. 상기 항원의 에피토프는 HSV에 감염된 병소에서 유래된 T-세포에 의해 인지된다는 것이 확인되었다. 본 발명의 항원에 특이성을 지니는 T-세포들은 HSV에 감염된 세포들 및 바이러스를 인코드하는 펩타이드의 에피토프를 김염시킨 세포들에 대해 세포독성을 나타낸다. T-세포 특이성에 관련이 있는 면역원성을 가진 항원의 확인은 항-바이러스 치료 및 예방법의 개선을 가능하게 해 준다. 본 발명의 항원 또는 그 항원을 인코딩하는 폴레펩타이드가 포함된 조성물은 HSV 감염의 예방 및 치료를 위한 효과적인 백신으로서 이용될 수 있다.

Description

면역학적으로 중요한 ＨＳＶ 항원, 그의 확인방법 및 용도{Immunologically significant herpes simplex virus antigens and methods for identifying and using same}

세포성 면역 반응(cellular immune response)은 반복적인 HSV 감염을 제한하는데 필요하다. 생식기의 HSV 감염은 지속되어 심각해 질 수도 있으나 반면에 반복성 감염은 위험성이 상대적으로 적으며 증상이 나타나지 않기도 한다. 일차적인 HSV 감염은 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)를 포함하는 항원 특이적 T 세포의 침투와 관련되어 있다. 반복적 HSV 감염에 대한 단계적 생검 연구(serial lesion biopsy studies) 결과 상해가 심해질수록 CD8+가 우세해지는 것을 관찰하였으며, 국소적 CTL 활성에 의해 바이러스가 제거되는 것을 확인할 수 있었다(Koelle, DM et al.,J. Clin. Invest. 1998, 101:1500-1508; Cunningham, AL et al., J. Clin. Invest. 1985, 75:226-233). 따라서, CD8+ CTL에 의해 인지되는 HSV 항원들은 HSV 감염에 대한 치료 및 예방에 이용될 수 있다.

HSV(Herpes Simplex Virus)의 완전한 DNA 서열은 약 150 kb의 길이를 가지며 85개의 알려진 유전자들을 코딩하고 있다. 이들 유전자들은 각각 50-1000개의 아미노산으로 이루어진 단백질들에 대한 정보를 가지고 있다. 이들 단백질 중에서 바이러스의 감염에 대해 효과적인 T 세포 면역 반응을 유도하는 9-12개의 아미노산으로 이루어진 면역원성을 갖는 에피토프들은 알려져 있지 않다.

따라서, HSV 감염에 대해 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있는 특이적인 에피토프들을 확인하는 것이 필요하다. 이러한 정보는 더욱 효과적인 면역원성을 갖는 항원들을 확인하여 HSV 감염에 대한 예방 및 치료에 이용할 수 있을 것이다.

본 발명은 HSV 감염에 대한 예방 및 치료에 사용될 수 있는 분자, 조성물 및 방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 본 발명은 HSV 단백질의 에피토프(epitope)를 확인할 수 있는 방법, HSV 특이적 T 세포, 특히 CD8+ T 세포, 에 대해 특이적인 항원성을 갖는 분자 및 조성물에 관한 것이다.

도 1의A는 RW의 단핵구(bulk CD8-enriched PBMC)에 존재하는 TCR Cβ-Vβ PCR 산물(24 Vβ 패밀리 중 12개가 나타남)을 형광검출한 결과를 보여주는 그래프이고,

이 때, 두 개의 Vβ 프라이머를 사용하여 두 번씩 분석하였으며, X축은 PCR 산물의 분자량을, Y축은 상대적인 형광 강도를 나타낸다.

도 1의B는 일차 HSV-2 생검으로부터 얻은 LIL(bulk CD8-enriched lesion-infiltrating lymphocytes)의 TCR Cβ-Vβ PCR 산물(24 Vβ 패밀리 중 12개가 나타남)을 형광검출한 결과를 보여주는 그래프이고,

도 2의A는 자궁 경부의 사이토브러시로부터 유래된 림프구(bulk-expanded cervical cytobrush-derived lymphocytes)의 증식 반응(proliferation responses)을 나타내는 그래프이고,

도 2의B는 자궁 경부의 사이토브러시로부터 유래된 림프구(bulk-expanded cervical cytobrush-derived lymphocytes)의 세포독성 반응(cytotoxic responses)을 PSR(percent specific release)로 나타낸 그래프이고,

도 3은 HSV-2 DNA의Sau3AⅠ라이브러리로부터 얻은 양성 게노믹 클론(2번째 라인, ICP0 유전자의 일부를 포함)을 나타내는 모식도이고,

상기 게노믹 클론(genomic clone)을 세포내로 형질도입 시켰으며, cDNA 합성을 위해 프라이머 A를 사용하였다. 엑손-1/엑손2 C-A(5번째 라인) 및 HLA B45 cDNA는 Cos-7 세포에 형질도입된 후 TCC(T cell clone) RW51의 인터페론감마(interferon-gamma) 분비를 촉진시켰다. 엑손-1 B-C cDNA(네번째 라인)는 음성을 나타내었다.

도 4는 백시니아(vaccinia) ICP0(합성 ICP0 92-105)의 농도에 따른 RW51의 CTL 활성을 나타내는 그래프이고,

에펙터:타겟의 비율(effector:target ratio)을 10:1로 하여 네시간 동안⁵¹Cr 방출 분석을 수행하였다. 모든 경우에 있어서 자발적인 방출(spontaneous release)은 20% 이하였다.

도 5는 합성 ICP0 92-101의 농도에 따른 RW51의 CTL 활성을 나타내는 그래프이고,

도 6은 말초혈액(peripheral blood)으로부터 얻은 RW 림프구를 HSV-2 ICP0(92-101 아미노산)로 자극한 후 나타나는 CTL 활성을 보여주는 그래프이고,

에펙터:타겟의 비율(effector:target ratio)을 10:1로 하여 네시간 동안⁵¹Cr 방출 분석을 수행하였다. 모든 경우에 있어서 자발적인 방출(spontaneousrelease)은 20% 이하였다. 그래프의 막대 쌍에서 높은 막대는 CD8 클론(lesion-derived CD8 clone), 낮은 막대는 펩타이드로 자극된 PBMC로부터 얻은 결과를 나타낸다.

도 7은 CD8 클론들(lesion-derived CD8 clones)에 의한 HLA 제한 대립유전자(HLA restricting allele), HSV-2 반응성 및 IFN-감마 분비의 변화를 나타내는 모식도이고,

도 8의A는 상해 CD8 클론 dkRW.1991.22의 작용에 대한 펩타이드 농도-반응을 발현 클로닝(expression cloning)에 의해 나타낸 그래프이고,

도 8의B는 상해 CD8 클론 RW.1997.51의 작용에 대한 펩타이드 농도-반응을 발현 클로닝(expression cloning)에 의해 나타낸 그래프이고,

도 8의C는 상해 CD8 클론 HV.1999.23의 작용에 대한 펩타이드 농도-반응을 발현 클로닝(expression cloning)에 의해 나타낸 그래프이고,

도 9는 A*0201 한정, U_L47 289-298-특이 CD8 CTL과 B*4402 또는 B*4403의 교차반응을 나타내는 그래프이고,

도 10의A-O는 말초혈액 림프구(peripheral blood lymphocytes)에 U_L47-특이 CTL이 존재하는 것을 나타내는 그래프이고,

도 10의A는 U_L47 289-298에 의해 유도된 1874의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의B는 U_L47 551-559에 의해 유도된 1874의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의C는 gB2 443-451에 의해 유도된 1874의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의D는 U_L47 289-298에 의해 유도된 7282의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의E는 U_L47 551-559에 의해 유도된 7282의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의F는 gB2 443-451에 의해 유도된 7282의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의G는 U_L47 289-298에 의해 유도된 9107의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의H는 U_L47 551-559에 의해 유도된 9107의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의I는 gB2 443-451에 의해 유도된 9107의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의J는 U_L47 289-298에 의해 유도된 9383의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의K는 U_L47 551-559에 의해 유도된 9383의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의L은 gB2 443-451에 의해 유도된 9383의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의M은 U_L47 289-298에 의해 유도된 9410의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의N은 U_L47 551-559에 의해 유도된 9410의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 10의O는 gB2 443-451에 의해 유도된 9410의 특이적 방출을 나타내는 그래프이고,

도 11의A는 IFN-감마 ELISPOT 분석 결과 나타나는, ELISPOTS/웰에서의 펩타이드 농도(㎍/㎖)에 따른 작용을 보여주는 그래프이고,

상기의 그래프는 5개의 9-머(mer) U_L47 펩타이드를 사용하여 분석한 결과를 보여준다.

●: 548-556, ○: 549-557, ▲: 550-558,

△: 551-559, ■: 552-560

도 11의B는 IFN-감마 ELISPOT 분석 결과 나타나는, ELISPOTS/웰에서의 펩타이드 농도(㎍/㎖)에 따른 작용을 보여주는 그래프이고,

상기의 그래프는 5개의 10-머(mer) U_L47 펩타이드를 사용하여 분석한 결과를 보여준다.

●: 548-557, ○: 549-558, ▲: 550-559,

△: 551-560, ■: 552-561

도 12는 C1R-A2/3D9.6H7 세포의 HLA-A2로부터 용출된 펩타이드의 HPLC 분획 각각에 대한, ELISPOTS/웰에서의 IFN-감마 ELISPOT 분석 결과를 나타내는 그래프이고,

상기 결과는 17, 18 및 23번 분획이 CTL 클론 cpRW22에 의해 인지되는 펩타이드를 포함하고 있다는 것을 나타낸다. 삽입되어 있는 그래프는 T 세포 단독을 비롯한 여러 대조군(C1R-A2/3D9.5A1, C1R-A2/3D9.6H7, C1R-A2/HSV-2, C1R-A2/HSV-1 및 C1R-A2)에서의 결과를 보여준다.

도 13의A는 17번 분획의 여러 HPLC 부분획들(subfractions) 각각에 대한, ELISPOTS/웰에서의 IFN-감마 ELISPOT 분석 결과를 나타내는 그래프이고,

상기 결과는 17번 분획의 부분획들이 C1R-A2/3D9.6H7에서 유래된, CTL 클론 cpRW22에 의해 인지되는 펩타이드를 포함하고 있다는 것을 나타낸다. 화살표들은각각 서열번호 3, 1 및 2로 기재되는 펩타이드들을 가리킨다.

도 13의B는 18번 분획의 여러 HPLC 부분획들(subfractions) 각각에 대한, ELISPOTS/웰에서의 IFN-감마 ELISPOT 분석 결과를 나타내는 그래프이고,

상기 결과는 18번 분획의 부분획들이 C1R-A2/3D9.6H7에서 유래된, CTL 클론 cpRW22에 의해 인지되는 펩타이드를 포함하고 있다는 것을 나타낸다. 화살표들은 각각 서열번호 3, 1 및 2로 기재되는 펩타이드들을 가리킨다.

도 13의C는 여러 대조군(클론 22 단독, C1R-A2/3D9.5A1, C1RA2/3D9.6H7 및 T2 세포) 각각에 대한, ELISPOTS/웰에서의 IFN-감마 ELISPOT 분석 결과를 나타내는 그래프이고,

도 14는 C1R-A2/3D9.6H7 세포들로부터 얻은 23번 분획의 여러 HPLC 부분획들(subfractions) 각각에 대한, ELISPOTS/웰에서의 IFN-감마 ELISPOT 분석 결과를 나타내는 그래프이고,

상기 결과는 37번 부분획이 CTL 클론 cpRW22에 의한 인지를 위한 T2 세포의 감작을 유발한다는 것을 보여준다. 이 분획의 활성은 U_L47/550-559의 HPLC 상에서의 이동성(mobility)과 동일하게 나타났다. 화살표들은 각각 서열번호 3, 1 및 2로 기재되는 펩타이드들을 가리킨다. 삽입되어 있는 그래프는 대조군(T 세포 단독및 C1R-A2/3D9.6H7)에서의 결과를 보여준다.

도 15의A는 HSV2 합성 펩타이드 LGLADTVVAC(서열번호 1; U_L47/550-559)에 대한 HPLC 결과를 나타내는 그래프이고,

상기 펩타이는 부분획화 조건(subfractionation conditions)으로 HPLC를 수행하는 과정에서 37번 분획의 용출에서 발견되었다.

도 15의B는 HSV2 합성 펩타이드 GLADTVVACV(서열번호 2; U_L47/551-560)에 대한 HPLC 결과를 나타내는 그래프이고,

상기 펩타이는 부분획화 조건(subfractionation conditions)으로 HPLC를 수행하는 과정에서 40/41번 분획의 용출에서 발견되었다.

도 15의C는 HSV2 합성 펩타이드 GLADTVVAC(서열번호 3; U_L47/551-559)에 대한 HPLC 결과를 나타내는 그래프이고,

상기 펩타이는 부분획화 조건(subfractionation conditions)으로 HPLC를 수행하는 과정에서 32번 분획의 용출에서 발견되었다.

도 16은 C1R-A2/3D9.6H7으로부터 얻은 23번 분획/37번 부분획에 대한 질량스펙트럼(mass spectrum) 결과를 m/z 함수 및 상대적 풍부성(relative abundance)으로 나타낸 그래프이고,

상기 결과는 상기 부분획 내에 U_L47/550-559와 같은 분자량(MW=961)을 지닌 펩타이드가 존재한다는 것을 보여준다.

도 17은 C1R-A2/3D9.6H7 세포에 적어도 두 개의, HSV-2에서 유래한 레트로바이랄 인서트(retroviral inserts)가 존재한다는 것을 증명하기 위하여 수행한 PCR에 사용된 여러 프라이머들(서열번호 14-17)의 서열을 나타내는 모식도이고,

도 18의A는 C1R-A2/3D9.6H7 세포에 HSV-2에서 유래한 레트로바이랄 인서트(retroviral inserts)가 존재한다는 것을 증명하기 위하여 수행한 레트로바이랄 인서트에 대한 PCR 분석 결과를 나타내는 전기영동 사진이고,

밴드 2, 4 및 8은 도 18B에 설명된 U_L47의 부분이고, 밴드 7은 도 18C에 설명된 U_L52에 속하는 것이다.

도 18의B는 C1R-A2/3D9.6H7 세포에 존재하는 레트로바이랄 인서트가 코딩하는 U_L47 유전자의 많은 부분을 나타내는 모식도이고,

상기 인서트는 U_L47/550-559 펩타이드(서열번호 1)를 코딩하는 부분을 포함하고 있다.

도 18의C는 C1R-A2/3D9.6H7 세포에 존재하는 두 번째 레트로바이랄 인서트가 코딩하는 U_L52 유전자 두 절편(fragments)을 나타내는 모식도이고,

도 19는 U_L47 유전자가 형질도입된 VA13/A2 세포가 CD8+ T 세포 클론 cpRW22에 의해 인지되는지를 인터페론-감마의 분비정도(ELISPOTS/well)로 측정한 결과를 나타내는 그래프이고,

HLA-A2를 안정적으로 발현하고 있는 VA13 섬유아세포(fibroblasts)를 타겟으로 사용하였다. 타겟 세포에 U_L47 펩타이드를 짧은 시간 동안 처리하거나 또는 U_L47 발현 플라스미드 클론 #2, #4, 또는 #6를 순간적으로 형질도입 시켰다. 반응체(responders)로는 cpRW22 CD8+ T 세포 클론을 사용하였다.

도 20의A-L은 서로 다른 HLA-A2 도너에 따른 CTL 반응을 에펙터:타겟 비율과 PSL(percent specific lysis)로 나타낸 그래프이고,

●: 펩타이드 처리하지 않음,

○: 자극 펩타이드(stimulating peptide) 처리,

▲: HIV에서 유래된 대조군 펩타이드 처리

도 20의A는 도너 RW1874에 대한 결과를 나타내는 그래프이고,

PBMC는 인플루엔자 M1/58-66으로 자극됨.

도 20의B는 도너 RW1874에 대한 결과를 나타내는 그래프이고,

PBMC는 U_L47/550-559로 자극됨.

도 20의C는 도너 RW1874에 대한 결과를 나타내는 그래프이고,

PBMC는 U_L47/289-298로 자극됨.

도 20의D는 도너 HV5101에 대한 결과를 나타내는 그래프이고,

PBMC는 M158-66으로 자극됨.

도 20의E는 도너 HV5101에 대한 결과를 나타내는 그래프이고,

PBMC는 U_L47/550-559로 자극됨.

도 20의F는 도너 HV5101에 대한 결과를 나타내는 그래프이고,

PBMC는 U_L47/289-298로 자극됨.

도 20의G는 도너 AD120에 대한 결과를 나타내는 그래프이고,

PBMC는 M1/58-66으로 자극됨.

도 20의H는 도너 AD120에 대한 결과를 나타내는 그래프이고,

PBMC는 U_L47/550-559로 자극됨.

도 20의I는 도너 AD120에 대한 결과를 나타내는 그래프이고,

PBMC는 U_L47/289-298로 자극됨.

도 20의J는 도너 AD124에 대한 결과를 나타내는 그래프이고,

PBMC는 M1/58-66으로 자극됨.

도 20의K는 도너 AD124에 대한 결과를 나타내는 그래프이고,

PBMC는 U_L47/550-559로 자극됨.

도 20의L은 도너 AD124에 대한 결과를 나타내는 그래프이고,

PBMC는 U_L47/289-298로 자극됨.

본 발명은 HSV 감염에 대한 예방 및 치료를 위해 사용할 수 있는 HSV 항원들을 제공한다. 여기에는 바이러스 감염에 의해 상해를 입은 부위의 T-세포들에 의해 인지되는 것이 확인된 항원들 및/또는 그들을 구성하는 에피토프들(epitopes)이 포함된다. 본 발명의 항원들에 대해 특이성을 가지는 T-세포들은 바이러스가 감염된 세포들에 대해서 세포독성 활성을 나타낸다. T-세포 특이성에 반응하는 면역원성을 지닌 항원들을 확인하는 것은 항-바이러스 치료 및 예방법을 개발하는데 있어 매우 중요하다. 본 발명의 항원들 또는 본 발명의 항원들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 HSV 감염에 대한 치료 및 예방을 위한 백신으로 사용될 수 있다.

정의(Definitions)

본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적 용어들은 구체적 설명이 없는 한 보편적으로 사용되는 의미를 가진다. 본 명세서에 사용된 하기의 단어 및 구(phrases)에 대해서 구체적으로 설명한다.

"폴리펩타이드(polypeptide)"는 자연적으로 존재하는 것으로부터 분리하였거나, 재조합기술(recombinant techniques)에 의해 또는 화학적으로 합성된 단백질, 단백질의 절편 및 펩타이드를 모두 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 특히 적어도 6개의 아미노산으로 구성되어 있다.

"HSV 폴리펩타이드"는 다른 구체적인 설명이 없는 한 HSV-1 및 HSV-2를 포함한다. HSV-2에 대한 게놈 서열 정보에 기초한 HSV 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산에 대한 참조문헌이 하기에 언급되어 있다(A. Dolan et al., 1998, J. Virol. 72(3):2010-2021). ICP0 절편을 형질도입시킨 세포의 RNA 서열을 기초로 하여 구성된 HSV-2 ICP0의 폴리펩타이드 서열은 아미노산 Q26이 빠져있음으로 인해 실제 공개된 서열과 차이가 있다.

"대체가능한 변이체(substitutional variant)"는 아미노산 서열 중에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 대체 또는 결실되었으나 면역세포에 의해 특이적으로 인지되는 특성은 유지하는 분자를 의미한다. 대체가능한 변이체의 아미노산 서열은 원래의 아미노산 서열과 적어도 80%의 상동성(identity)을 갖는 것이 바람직하며 적어도 90% 이상의 동일성을 갖는 것은 더욱 바람직하다. 분자가 면역세포에 의해 특이적으로 인지될 수 있는지의 여부는 Koelle 등이 언급한 세포독성 분석법(cytotoxicity assay)으로 결정할 수 있다(D. M. Koelle et al., 1997, Human Immunol. 53:195-205). 또 다른 방법은 본 명세서의 실시예에 기술되어 있으며, 여기에는 인터페론-감마의 분비를 촉진시키는 능력 또는 상기 분자를 만들어 내는 세포를 파괴하는 능력에 관한 것도 포함되어 있다. 분자가 대조군 분자에 비해 더욱 많은 인터페론-감마의 분비를 촉진할 수 있으면 면역세포는 이 분자를 특이적으로 인지할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 분자는 5 pg/㎖, 바람직하게는 10 pg/㎖ 이상의 인터페론-감마 분비를 촉진하는데 비해 대조군 분자는 5 pg/㎖ 이하의 인터페론-감마 분비를 촉진한다.

"벡터(vector)"는 숙주세포에 전달이 가능하며 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 목적하는 유전자 또는 서열의 발현도 가능하도록 만들어진 구조물을 의미한다. 예를 들면 벡터에는 바이러스 벡터(viral vectors), DNA 또는 RNA 발현 벡터(expression vectors), 플라스미드(plasmid), 코스미드(cosmid) 또는 파지벡터(phage vectors), CCA(cationic condensing agents)와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀(liposomes)으로 포장된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 프로듀서 세포(producer cells)와 같은 특정 진핵세포(eukaryotic cells) 등이 포함된다.

"발현 조절 서열(expression control sequence)"은 핵산의 전사(transcription)를 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열에는 구조 프로모터(constitutive promoter) 또는 유도 프로모터(inducible promoter)와 같은 프로모터 또는 인핸서(enhancer) 등이 있다. 발현 조절 서열은 전사될 핵산 서열에 연결되어 있다.

"핵산(nucleic acid)" 또는 "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)"는 단일- 또는 이중나선의 구조를 가진 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오타이드(ribonucleotide)를 의미하며, 특별한 언급이 없는 한 여기에는 자연형의 핵산서열과 혼성화될 수 있는 뉴클레오타이드의 유사체(analogs)도 포함된다.

"APC(antigen-presenting cell)는 림프구에 항원을 제공하거나 조절할 수 있는 세포를 의미한다. APC에는 대식세포(macrophages), LDCs(Langerhans-dendritic cells), B 세포, 단핵구(monocytes), 섬유아세포(fibroblasts) 및 섬유세포(fibrocytes) 등이 포함된다. 수지상세포(dendritic cells)는 APC의 바람직한 타입이다. 수지상세포는 많은 비-림프 조직(non-lymphoid tissues)에서 발견되나, 구심성 림프(afferent lymph) 또는 혈류(blood stream)를 통해 림프 기관(lymph organs)의 T-의존 지역(T-dependent areas)으로 이동될 수 있다. 비-림프 기관(non-lymph organs)에서 수지상세포는 랑게르한스 세포(Langerhans cells) 및 간질 수지세포(interstitial dendritic cells) 등을 포함한다. 림프 및 혈액에서는 구심성 림프 베일드 세포(afferent lymph veiled cells) 및 혈액 수지상세포 등을 포함한다. 림프 기관에서는 림프 수지상세포 및 지상돌기세포(interdigitating cells) 등을 포함한다.

에피토프 제공을 위해 "변형(modified)" 되었다는 것은 APC가 에피토프 제공을 위해 자연적 혹은 제조합 방법(recombinant methods)에 의해 조작되었다는 것을 의미한다. 예를 들어, APC는 분리된 항원에 노출시키거나 펩타이드를 도입시킴으로써 하나 또는 그 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 발현하도록 유전적으로 변형시킬 수 있다.

"약학적으로 허용 가능한 염(pharmaceutically acceptable salt)"은 모 화합물(parent compound)의 생물학적 활성을 유지시키며, 유효용량에서 어떠한 독성도 나타내지 않는 염을 의미한다. 이러한 염에는 (a)무기산hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid 등)이 첨가된 염 및 유기산(acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid, citric acid, maleic acid, ascorbic acid, benzoic acid, tannic acid, pamoic acid, alginic acid, polyglutamic acid, naphthalenesulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid, polygalacturonic acid 등)이 첨가된 염; (b)아연, 칼슘, 비스무스(bismuth), 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등의 다가 금속 양이온(polyvalent metal cations)과 결합된 염; (c)디벤질에틸렌디아민(N,N'-dibenzylethylenediamine) 또는 에틸렌디아민(ethylenediamine)으로부터 형성된 유기 양이온(organic cation)과 결합된 염; 또는 (d)아연 타닌산염(zinc tannate salt)와 같이 (a)와 (b) 또는 (c)가 조합된 염이 포함된다. 산이 첨가된 염으로서 바람직한 것은 삼불화 아세트산염(trifluoroacetate salt) 및 아세트산염(acetate salt)이다.

"약학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)란 활성 성분(active ingredient)과 결합하여 그 성분의 생물학적 활성을 유지시켜 주며 피투여자의 면역계와 반응하지 않는 모든 물질을 의미한다. 이러한 담체에는 인산염 완충 용액(phosphate buffered saline solution), 물, 기름/물 현탁액과 같은 여러 현탁액(emulsions)을 비롯한 여러 습윤제(wetting agents)들이 포함된다.

이러한 담체들을 포함하는 조성물은 잘 알려져 있는 공지의 방법(Remington's Pharmaceutical Sciences, Chapter 43, 14th Ed., Mark Piblishing Co, Easton PA 18042, USA 참조)으로 제조할 수 있다.

"증강제(adjuvant)"란 면역 반응의 자극을 촉진시키기 위해 사용되는 물질을 의미한다. 이러한 증강제로는 헬퍼 펩타이드(helper peptide), 알루미늄 하이드록사이드 겔(aluminum hydroxide gel, alum) 또는 알루미늄 포스페이트(aluminum phosphate), 프룬드의 불완전 및 완전 증강제(Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant, Difco Laboratories, Detroit, MI), 머크 증강제 65(Merck Adjuvant 65, Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), AS-2(Smith-Kline Beecham), QS-21(Aquilla), MPL 또는 3d-MPL(Corixa Corporation, Hamilton, MT), LEIF, 칼슘, 철, 아연염, 아실화 티로신(acylated tyrosine)의 불용성 현탁액(insoluble suspension), 아실화당(acylated sugars), 양이온 또는 음이온을 띠는 폴리사카라이드(cationically or anionically derivatized polysaccharides), 폴리포스파젠(polyphosphazenes), 생분해되는 작은 구(biodegradable microspheres), 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A) 및 쿠일 A(quil A), 뮤라밀 트리펩티드 포스파티딜 에탄올아민(muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine) 또는 사이토카인(cytokines, e.q., GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7, 또는 -12)을 포함하는 면역촉진 복합체(immunostimulating complex) 및 면역촉진 DNA 서열(immunostimulatory DNA sequences) 등이 포함된다. 구체예로서, 폴리뉴클레오타이드 백신 사용시 헬퍼 펩타이드 또는 사이토카인과 같은 증강제가 상기 증강제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 형태로 제공될 수 있다.

"a" 또는 "an"은 특별한 언급이 없는 한 적어도 하나를 의미한다.

HSV 폴리펩타이드

본 발명은 ICP0 또는 U_L47 또는 그들의 절편으로 구성된, 분리된 HSV 폴리펩타이드를 제공한다. 한 구체예로서 상기 절편은 ICP0 또는 그의 대체가능한 변이체의 92-101 아미노산으로 구성된다. 또 다른 구체예로서 상기 절편은 UL47 또는 그의 대체가능한 변이체의 289-298, 548-557, 550-559, 551-559 및/또는 551-561 아미노산으로 구성된다. HSV-2 게놈의 단백질과 관련되어 만들어진 아미노산 잔기에 대해서는 하기의 참고문헌에 기재되어 있다(A. Dolan et al., 1998, J. Virol. 72(3):2010-2021).

상기의 폴리펩타이드는 융합 단백질(fusion protein)의 형태가 될 수 있다. 한 구체예로서, 상기 융합 단백질은 수용성이다. 본 발명의 수용성 융합 단백질은 면역반응을 유도하기 위하여 피시술자에 주입하기 적당하다. 폴리펩타이드는 다중의 폴리펩타이드로 구성되거나 또는 하나의 폴리펩타이드 및 하나의 관계없는 서열로 이루어진 융합 단백질의 형태가 될 수 있다. 융합의 상대(fision partner)는 T헬퍼 에피토프를 제공하는데 도움을 줄 수도 있고(면역학적 융합 파트너), 인간에 의해 T 헬퍼 에피토프가 인지되는데 도움이 될 수도 있으며, 또는 단백질이 고수율로 발현되는데 도움이 되기도 한다(발현 인핸서). 면역학적 및 발현 인핸싱 융합 파트너들이 융합 파트너로서 바람직하다. 단백질의 수용성을 증가시키거나 또는 목적하는 세포내 구획에 단백질이 잘 전달되도록 해 주는 융합 파트너들이 선택될 수도 있다. 또한 융합 파트너들은 단백질 정제를 도와주는 어피니티 태그(affinity tags)를 포함하기도 한다.

융합 단백질의 제조에는 화학 융합(chemical conjugation) 같은 일반적인 방법이 사용된다. 융합 단백질은 발현 시스템(expression system)에서 재조합 단백질(recombinant protein)의 형태로 발현시키는 것이 바람직하다. 간단하게 설명하면 먼저, 폴리펩타이드 성분들을 코딩하는 DNA 서열들을 모아서 적절한 발현벡터에 삽입시킨다. 다음으로, 하나의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열의 3' 말단을 펩타이드 링커(peptide linker)를 사용하거나 또는 사용하지 않고 다른 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열의 5' 말단에 결합시킨다. 이러한 과정을 통해 서열들의 리딩 프레임(reading frame)이 형성되면 생물학적 활성을 유지하는 하나의 융합 단백질로 번역(translation)될 수 있다.

펩타이드 링커 서열은 각각의 폴리펩타이드가 2차 혹은 3차구조를 형성하는데 필요한 충분한 거리를 제공함으로 인해 각각의 폴리펩타이드 성분을 분리하는데 사용될 수 있다. 이러한 펩타이드 링커는 잘 알려져 있는 기존의 방법에 의해 융합 단백질 내에 삽입될 수 있다. 적절한 펩타이드 링커 서열은 하기의 요소들을 기초로 하여 선택될 수 있다: (1)구조에 있어 유연성을 가져야 한다; (2)첫 번째 및 두 번째 폴리펩타이드의 기능적 에피토프와 반응하여 2차구조를 형성하지 말아야 한다; (3)폴리펩타이드의 기능적 에피토프와 작용할 수 있는 소수성 또는 하전 잔기(charged residues)를 가지고 있지 않아야 한다. 펩타이드 링커에는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. Thr 및 Ala와 같은 다른 중성 아미노산을 포함하는 펩타이드 링커도 사용될 수 있다. 펩타이드 링커에 사용될 수 있는 아미노산 서열들은 하기의 참고 문헌에 언급되어 있다(Maratea et al., 1985, Gene 40:39-46; Murphy et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262; U.S. Patent No. 4,935,233 및 U.S. Patent No. 4,751,180). 일반적인 링커 서열은 1-50 아미노산으로 이루어져 있다. 첫 번째 및 두 번째 폴리펩타이드가 기능적 부위(functional domains)를 분리하거나 입체적 간섭(steric interference)을 방지하는데 사용될 수 있는 비필수 N-말단 아미노산 부위(non-essential N-terminal amino acid regions)를 포함하고 있는 경우에는 링커 서열이 필요하지 않다.

결합된 DNA 서열들은 전사 또는 번역 조절인자(regulatory elements)들과 연결되어 있다. DNA 발현에 대한 조절인자들은 첫 번째 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열의 5' 위치에 존재한다. 번역 및 전사의 종결에 필요한 종결암호(stop codond)들은 마찬가지로 두 번째 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열의 3' 위치에 존재한다.

본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 융합단백질은 면역원성 단백질(immunogenic protein)과 함께 제공된다. 바람직한 면역원성 단백질은 기억반응(recall response)을 유도할 수 있다. 이러한 단백질로는 테타누스(tetanus), 투베르큘로시스(tuberculosis) 및 간염 단백질(hepatitis proteins)을 예로 들 수 있다(Stoute et al., 1997, New Engl. J. Med., 336:86-9 참조).

본 발명의 바람직한 구체예에서, 면역학적 융합 파트너는 그람 음성 세균인 헤모필러스 인플루엔자 B(Haemophilus influenza B, WO 91/18926)의 표면단백질인 D 단백질(protein D)로부터 유래된 것이다. D 단백질의 유도체(derivative)는 D 단백질의 처음 1/3 부분(첫 번째 N-말단의 100-110 아미노산)을 포함하는 것이 바람직하며 또한 지질화(lipidated)되어 있는 것이 바람직하다. 특정한 바람직한 구체예로서, 지단백 D 융합 파트너(lipoprotein D fusion partner)의 처음 109 아미노산 잔기들이 N-말단에 포함되어 있으며, 이들이 폴리펩타이드에 부가적인 T-세포 에피토프를 제공해 주고 대장균 내에서의 발현을 증가시킨다(따라서, 발현 인핸서로서 작용). 지질로 이루어진 꼬리(lipid tail)는 APC(antigen presenting cells)가 최적의 항원성을 갖도록 해 준다. 다른 융합 파트너로는 인플루엔자 바이러스 NS1의 비-구조 단백질(non-structural protein, hrmaglutinin)을 예로 들 수 있다. 특히 상기 단백질의 N-말단 81개 아미노산이 사용되는데, T-헬퍼 에피토프가 포함된 다른 절편이 사용되기도 한다.

다른 구체예로서, 면역학적 융합 파트너로서 LYTA로 알려진 단백질이 사용되기도 한다(C-말단 부위가 바람직). LYTA는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에서 유래된 것으로, LYTA 아미데이즈(N-acetyl-L-alanine amidase)를 합성한다(LytA 유전자에 의해 코딩; Gene 43:265-292, 1986). LYTA는 오토라이신(autolysin)으로서 펩티도글리칸 백본(peptidoglycan backbone)의 특정 결합을 특이적으로 분해한다. LYTA 단백질의 C-말단 부위는 DEAE와 같은 콜린(choline)이나 콜린 유사체(choline analogues)에 대한 친화성을 나타내는데 관련이 있다. 이러한 특성을 이용하여 융합단백질을 발현시키는데 유용한 대장균 C-LYTA 발현 플라스미드(E.coliC-LYTA expression plasmids)가 개발되었다. C-LYTA 단편을 아미노 말단에 포함하고 있는 잡종 단백질(hybrid proteins)의 정제에 관한 것은 하기의 참고 문헌에 언급되어 있다(Biotechnology 10:795-798, 1992). LYTA의 반복 부위(repeat portion) 역시 융합단백질에 삽입될 수 있다. 반복 부위는 178번 잔기에서 시작되는 C-말단 부위에서 발견된다. 특히 바람직한 반복 부위의 삽입 위치는 188-305번 잔기 사이이다.

본 발명의 구체예로서, 하나의 치료제와 본 발명의 폴리펩타이드 하나 또는 둘 이상을 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 첫 번째 폴리펩타이드에 하나 이상의 치료제 또는 폴리펩타이드를 직접 결합시킬 수 있으며, 또는 여러부착부위(sites for attachment)를 제공해 주는 링커(linkers)를 사용해서 결합시킬 수도 있다. 또 다른 방법으로 운반체(carrier)를 사용할 수도 있다. 세포 사이의 이동 및 단백질 전달에 특히 적합한 것으로 VP22(Elliott and O'hare, 1997, Cell 88:223-233; Kim et al., 1997, J. Immunol. 159:1666-1668; Rojas et al., 1998, Nature Biotechnology 16:370; Kato et al., 1998, FEBS Lett. 427(2):203-208; Vives et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(25):16010-7; Nagahara et al., 1998, Nature Med. 4(12):1449-1452).

운반체는 직접적인 또는 링커에 의한 공유결합(covalent bonding)등의 여러 방법으로 치료제 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 적합한 운반체에는 알부민(e.q., U.S. Patent No. 4,507,234, to Kato et al)과 같은 단백질, 펩타이드 및 아미노덱스트란(aminodextran; e.q., U.S. Patent No. 4,699,784, to Shih et al.)과 같은 다당류(polysaccharides)가 포함되어 있다. 운반체는 또한 비공유결합(noncovalent bonding) 또는 리포좀 소낭(liposome vesicle)안에 봉입(encapsulation)함으로써 치료제를 포함할 수도 있다(e.q., U.S. Patent Nos. 4,429,008 및 4,873,088).

일반적으로, 본 명세서상에 언급되어 있는 폴리펩타이드들(융합 단백질 포함) 및 폴리뉴클레오타이드들은 분리된(isolated) 것이다. "분리된(isolated)" 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드란 원래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를들어, 자연 상태로 존재하는 단백질은 그 상태에서 함께 존재하는 물질들 전부 혹은 일부를 제거함으로써 분리되는 것이다. 이러한 폴리펩타이드는 적어도 90% 이상의 순도를 지녀야 하며, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 순도를 가져야 한다. 폴리뉴클레오타이드는 벡터내에서 클로닝 시킴으로써 분리된다.

폴리펩타이드는 재조합 방법(recombinant means) 또는 화학적 합성을 통해 제조함으로써 분리될 수 있다. 본 명세서상에 언급된 DNA 서열에 의해 인코드(encode)되는 재조합 폴리펩타이드는 알려져 있는 많은 발현벡터들 중 어느 것을 이용하든지 간에 공지의 방법으로 손쉽게 제조될 수 있다. 발현은 재조합 단백질을 인코드하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 적절한 숙주 세포(host cell) 내에서 시킬 수 있다. 적절한 숙주 세포에는 원핵세포들(prokaryotes), 효모(yeast) 및 진핵세포들(eukaryotes)이 포함된다. 대장균, 효모 또는 포유동물 세포주(Cos 또는 CHO 등의)를 숙주세포로 이용하는 것이 바람직하다. 재조합 단백질의 정제를 위해서는 먼저 수용성의 숙주/벡터 시스템에서 얻은, 배양액으로 분비된 재조합 단백질을 포함하는 상등액을 시판되는 필터를 이용하여 농축시킨다. 다음 단계로 상기에서 얻은 농축액을 친화 매트릭스(affinity matrix) 또는 이온교환수지(ion exchange resin) 등의 적절한 정제 매트릭스(purification matrix)를 이용하여 정제한다. 마지막으로 한 단계 또는 여러 단계의 역상(reverse phase) HPLC를 수행함으로써 순수한 재조합 단백질을 얻을 수 있다.

100개 이하, 일반적으로는 50개 이하의 아미노산으로 구성된 절편이나 변이체들은 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리펩타이드들은 상용화되어 있는 고상 기법(solid-phase techniques), 즉 성장하는 아미노산 사슬에 순차적으로 아미노산을 부가시키는 메리필드 고상법(Merrifield solid-phase synthesis method)으로 합성할 수 있다(Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2146-2149). 폴리펩타이드의 자동 합성을 위한 장비는 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA, USA) 등의 공급사로부터 구입이 가능하며 공급자의 매뉴얼에 따라 조작이 가능하다.

본 발명의 폴리펩타이드의 변이체(varients)란 하나 또는 그 이상의 아미노산이 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 치환(substitutions), 결실(deletions), 첨가(additions) 및/또는 삽입(insertions)되어 있으면서 HSV나 HSV에 감염된 세포에 대해 면역반응을 유발하는 능력은 유지하고 있는 것을 말한다. 이러한 변이체들은 T 세포 분석법(T cell assay) 등과 같은 공지의 분석 기법에 의해 확인이 가능하다. 폴리펩타이드 변이체는 폴리펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성(identity)을 가지고 있어야 한다. 이러한 아미노산 치환체는 "보존성(conservative)"이라고 알려진 아미노산 치환체를 포함한다.

"보존성" 치환이란 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었을 때에도 폴리펩타이드의 2차구조 및 수치료성(hydropathic nature) 등의 특성에 큰 변화가 없는 것을 의미한다. 아미노산 치환체는 극성(polarity), 전하(charge), 수용성(solubility), 소수성(hydrophobicity), 친수성(hydrophilicity) 및/또는 양친화성(amphipathic nature) 등의 유사성을 기초로 하여 제조될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산에는 아스파트산(aspartic acid) 및 글루탐산(glutamic acid) 등이 포함되며, 양으로 하전된 아미노산에는 리신(lysine) 및 아르기닌(arginine) 등이 포함된다. 유사한 친수성을 보이는, 비하전된 극성 헤드 그룹(uncharged polar head groups)을 갖는 아미노산에는 류신(leucine), 이소류신(isoleucine) 및 발린(valine); 글리신(glysine) 및 알라닌(alanine); 아스파라진(asparagin) 및 글루타민(glutamine); 세린(serine), 트레오닌(threonine), 페닐알라닌(phenylalanine) 및 티로신(tyrosine) 등이 포함된다. 보존성 치환을 가능하게 해 주는 다른 아미노산 그룹들로는 (1)ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2)cys, ser, tyr, thr; (3)val, ile, leu, met, ala, phe; (4)lys, arg, his; 및 (5)phe, tyr, trp, his 등이 있다. 변이체는 또한 비보존성(nonconservative)의 변화를 포함할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 변이체 폴리펩타이드의 서열은 5개 또는 그 이하의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입됨으로서 원래의 서열과 달라지게 된다. 변이체들은 또한 폴리펩타이드의 면역원성(immunogenicity), 2차 구조(secondary structure) 및 수치료성(hydropathic nature)에 최소한의 영향을 주는 아미노산들의 결실 또는 부가에 의해 변화될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주세포 및 재조합 바이러스들(Polynucleotides, Vectors, Host Cells and Recombinant Viruses)

본 발명은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 폴리펩타이드를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드들을 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 벡터안에 포함될 수 있다. 벡터는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 연결된 발현조절서열(expression control sequence)을 포함한다. 본 발명의 구체예에서, 벡터는 목적하는 다른 분자들을 인코드하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하기도 한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 다른 폴리뉴클레오타이드와 결합하여 융합단백질을 인코드하기도 한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드들은 포유동물 세포내로 들어가서 발현되도록 조성되어 있다. 이러한 조성은 치료 목적에 사용하는 데에 특히 유용하다. 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포 내에서 발현시키는 데에는 많은 방법이 있으며 적절한 어느 방법도 사용 가능하다. 예를 들어 하나의 폴리뉴클레오타이드는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 백시니아(vaccinia) 또는 다른 폭스 바이러스(e.q., avian pox virus) 등의 바이러스 벡터에 삽입이 가능하다. DNA를 이러한 벡터에 삽입시키는 기술에 관해서는 이미 잘 알려져 있다. 레트로바이랄 벡터에는 형질도입된 세포들의 확인 또는 선택을 쉽게 해 주는 선택 마커(selectable marker)에 대한 유전자 및/또는 특정한 타겟 세포에 대한 수용체 역할을 하는 리간드(ligand)를 인코드하는 유전자와 같은 타겟팅 부위(targeting moiety)를 부가적으로 삽입시킬 수 있다. 타겟팅은 또한 항체를 이용한 공지의 방법에 의해서도 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 이용될 수 있다. 상기 방법은 숙주 세포의 배양 및 생산된 폴리펩타이드의 회수(recovering)를 포함한다. 회수된 폴리펩타이드는 배양 상등액으로부터 정제가 가능하다.

본 발명의 벡터는 세포를 세포내외(in vivo, ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro)에서 유전적으로 변형시키는데 이용될 수 있다. 세포를 유전적으로 변형시키는 방법으로는 세포를 바이랄 벡터로 감염 또는 형질도입 시키는 방법, 인산 칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation), 수용체 세포(recipient cells)를 DNA를 포함하는 세균 프로토플라스트(bacterial protoplasts)와 융합시키는 방법, 수용체 세포에 DNA를 포함하고 있는 리포좀(liposome) 또는 미세소구(microspheres)를 처리하는 방법, 엔도사이토시스(DEAE dextran, receptor-mediated endocytosis), 일렉트로포레이션(electroporation), 마이크로인젝션(micro-injection) 등을 포함한 여러 가지 방법이 알려져 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd ed.) 1-3, 1989; CurrentProtocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., 1994 Supplement 참조).

바이랄 벡터에는 HIV, SIV, 설치류 레트로 바이러스(murine retroviruses), 기본 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus), AAVs(adeno-associate viruses) 및 아데노바이러스(adenoviruses) 등에서 유래된 레트로바이랄 벡터가 포함되나 여기에 한정되는 것은 아니다(Miller et al., 1990, Mol. Cell Biol. 10:4239; J. Kolberg 1992, NIH Res. 4:43; Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther. 2:215). 설치류 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MuLV), 기본 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus, GaLV), 에코트로픽 레트로바이러스(ecotropic retroviruses), SIV(simian immunodeficiency virus), HIV(human immunodeficiency virus) 등에서 유래된 레트로바이랄 벡터들이 널리 사용되고 있다(Buchscher et al., 1992, J. Virol, 66(5):2731-2739; Johann et al., 1992, J. Virol. 66(5):1635-1640; Sommerfelt et al., 1990, Virol. 176:58-59; Wilson et al., 1989, J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al., 1991, J. Virol. 65:2220-2224; Rosenberg and Fauci 1993 in Fundermental Immunology, Third Edition, W. E. Paul(ed.) Raven Press, Ltd., New York and the references therein; Miller et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:4239; R. Kolberg 1992, J. NIH Res. 4:43; Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther. 2:215).

발현벡터에 서브클론된 서열을 증폭시키는 여러 가지 시험관내 증폭 기법들(in vitroamplification techniques)이 알려져 있다. 이러한 기법에는 PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction), Qβ-복제효소 증폭(replicase amplification) 및 다른 RNA 중합효소를 이용한 기법들이 있다(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd Ed) 1-3; U.S. Patent No. 4,683,202; PCR protocols A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds. Academic Press Inc. San Diego, CA 1990. Improved methods of cloning in vitro amplified nucleic acids are described in U.S. Patent No. 5,426,039).

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 유전적으로 변형된 재조합 미생물(recombinant microorganism)을 제공한다. 상기 재조합 미생물은 백신으로 사용이 가능하며, 생 약독화 백신(live attenuated vaccines)의 제조방법에 따라 제조가 가능하다.

조성물(Compositions)

본 발명은 HSV 감염에 대한 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 바이러스 증식을 제한하고 바이러스에 감염된 세포를 죽이는데 사용이 가능하다. 본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 약학적 조성물(pharmaceutical composition) 이다. 상기 조성물은 치료 또는 예방 효과를 나타낼 정도의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 바이러스, APC 또는 면역세포 등을 포함할 수 있다. 유효 용량(effective amount)은 T 세포에 의해 활성화되는 면역 반응을 유도하거나 강화시키는데 필요한 용량을 의미한다. T 세포의 활성화 정도는 세포독성 분석(cytotoxicity assay)에 의해 측정이 가능하다(D. M. Koelle et al., 1997, Human Immunol. 53:195-205). 상기 조성물은 또한 백신이 되기도 한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 전달체(carrier)를 포함하기도 한다. 약학적으로 허용 가능한 전달체란 투여되는 특정 조성물의 부분에 의해 또는 조성물을 투여하는데 사용되는 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물에는 여러 가지 조성(formulations)이 존재한다. 상기 조성물은 관절(intraarticular), 정맥(intravenous), 근육(intramuscular), 피내(intradermal), 복강(intraperitoneal) 및 피하(subcutaneous) 주사 등의 비경구 투여(parenteral administration)에 적합하며, 등장성 멸균 주사액(aqueous isotonic sterile injection solutions)을 포함하는 전달체에는 항산화제(antioxidants), 완충제(buffers), 세균 발육 저지제(bacteriostats) 등이 포함될 수 있다. 액성 및 비액성 멸균 현탁액에는 현탁제(suspending agents), 용제(solubilizers), 증량제(thickening agents), 안정제(stabilizers), 보존제(preservatives), 리포좀(liposomes), 미세소구(microspheres) 및 유제(emulsions) 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물에는 하나 또는 그 이상의 증강제(adjuvants)가 포함될 수 있다. 증강제로는 헬퍼 펩타이드(helper peptide), 명반(alum), 프룬드의 뮤라밀 트리펩타이드 포스파티딜 에탄올아민(Freund's muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine) 또는 사이토카인(cytokines)을 포함하는 면역 촉진 복합체(immunostimulation complex) 등이 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 백신으로 사용할 경우, 증강제로는 증강제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서 제공되는 헬퍼 펩타이드 또는 사이토카인이 사용된다. 백신의 제조는 하기의 참고문헌에 언급되어 있는 일반적인 방법에 의한다(M. F. Powell and M. J. Newman, eds., "Vaccine Design[the subunit and adjuvant approach]", Plenum Press, NY, 1995). 본 발명의 약학적 조성물 및 백신은 생물학적 활성을 가지고 있거나 비활성 상태인 다른 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다른 바이러스 항원의 하나 또는 그 이상의 면역원성 부분(immunogenic portions)들이 조성물 또는 백신 내에 융합 폴리펩타이드의 형태로 삽입되거나 또는 별개의 화합물의 형태로 존재할 수 있다.

약학적 조성물 또는 백신에는 하나 또는 그 이상의 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA가 포함되어 있다. 이러한 DNA는 핵산 발현 시스템(nucleic acid expression system), 세균 및 바이러스 발현 시스템 등을 포함하는 공지의 전달 시스템(delivery system) 상에 존재할 수 있다. 현재 수많은 유전자 전달 기법이 알려져 있다(Rolland, 1998, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198). 적절한 핵산 발현 시스템에는 환자내에서의 발현을 가능하게 해주는데 필수적인 DNA 서열들(적합한 프로모터 및 종결암호 등)이 포함되어 있다. 세균 발현 시스템에는 폴레펩타이드의 면역원성 부분을 세포 표면상에 발현하거나 에피토프를 분비하는 세균(Bacillus-Calmette-Guerrin과 같은)의 투여가 포함된다. 바람직한 구체예로서, DNA는 바이러스 발현 시스템(백시니아 또는 다른 폭스바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 이용하여 삽입된다. 적합한 시스템에 대해서는 하기의 참고문헌에 언급되어 있다(Fisher-Hoch et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann. My Acad. Sci. 569:86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine 8:17-21; U.S. Patent Nos. 4,603,112, 4,769,330 및 5,017,487; WO 89/01973; U.S. Patent No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91102805; Berkner, 1988, Biotechniques 6:616-627; Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation 88:2838-2848; Guzman et al., 1993, Cir. Res. 73:1202-1207). DNA를 발현벡터에 삽입시키는 것은 잘 알려진 공지의 기술에 의해 용이하게 수행할 수 있다. 상기 DNA는 "네이키드(naked)" 상태일 수도 있다(Ulmer et al., 1993, Science 259:1745-1749; Cohen, 1993, Science 259:1691-1692). 네이키드 DNA는 생분해성 구슬(biodegradable beads)에 코팅됨으로써 세포내로 더욱 효율적으로 전달될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에는 알려져 있는 어떠한 운반체(carriers)도 사용이 가능하지만, 투여 방법에 따라 사용하는 운반체의 종류가 결정된다. 본 발명의 조성물은 다양한 투여 방법 즉 국소(topical), 경구(oral), 비강(nasal), 두 개내(intracranial), 복강내(intraperitoneal), 피하(subcutaneous) 또는 근육내(intramuscular) 투여에 적합하도록 제제화될 수 있다. 피하주사와 같은 비경구 투여시에는 운반체는 물, 생리식염수, 알콜, 지방, 왁스 또는 완충액을 포함하는 것이 바람직하다. 경구 투여시에는 상기의 운반체 또는 만니톨(mannitol), 락토스(lactose), 전분(starch), 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 소듐 사카린(sodium saccharine), 탈크(talcum), 셀룰로스(cellulose), 글루코스(glucose), 슈크로스(sucrose) 및 마그네슘 카보네이트(magnesium carbonate) 등의 고체 운반체(solid carrier)가 사용된다. 생분해성 미세소구(biodegradable microspheres) 역시 본 발명의 약학적 조성물을 위한 전달체로 사용될 수 있으며, 적합한 생분해성 미세소구에 관해서는 하기의 참고문헌에 언급되어 있다(U. S. Patent Nos. 4,897,268 및 5,075,109).

본 발명의 조성물은 또한 완충제(neutral buffered saline 또는 phosphate buffered saline), 탄수화물(glucose, mannose, sucrose 또는 dextrans), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 글리신 등의 아미노산, 항산화제, EDTA 또는 글루타치온(glutathione) 등의 킬레이트화제(chelating agents), 증강제(aluminum hydroxide) 및/또는 보존제를 포함하기도 한다. 본 발명의 조성물은 또한 동결건조를 통해 제형화될 수도 있으며, 공지의 기술에 의해 리포좀으로 봉입(encapsulation)될 수도 있다.

여러 종류의 증강제들이 본 발명의 백신에 사용될 수 있다. 대부분의 증강제는 알루미늄 하이드록사이드 또는 미네랄 오일에 의한 이화작용(catabolism), 리피드 A, 보타델라 퍼투시스(Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래 단백질 등의 면역 반응 촉진제로부터 항원을 보호하도록 디자인되어 있다. 적합한 증강제들은 상업적으로 구입이 가능하다. 예를 들어, 프룬드의 불완전 및 완전 증강제(Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant, Difco Laboratories, Detroit, MI); 머크 증강제 65(Merck Adjuvant 65, Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); 알루미늄 하이드록사이드 겔(alum) 또는 알루미늄 포스페이트 등의 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연염; 아실화 티로신 아실화 당의 불용성 현탁액; 양이온화 또는 음이온화된 폴리사카라이드; 폴리포스파라진(polyphospharazenes); 생분해성 미세소구; 모노포스포릴 리피드(monophosphoryl lipid) A 및 쿠일(quil) A 등이 이에 속한다. GM CSF 또는 인터루킨-2, -7, 또는 -12 등의 사이토카인도 증강제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 백신에 있어서, 증강제 조성은 Th1-형의 면역반응을 우세하게 유도하도록 디자인되는 것이 바람직하다. Th1-형 사이토카인들(e.q., IFN-γ, IL-2 및 IL-12)이 높은 농도로 존재하면 투여된 항원에 대한 세포성 면역 반응(cellmediated immune responses)이 효과적으로 유도된다. 반대로, Th2-형 사이토카인들(e.q., IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 TNF-β)이 높은 농도로 존재할 경우에는 체액성 면역 반응(humoral immune responses)이 효과적으로 유도된다. 본 발명의 백신이 투여된 환자에서는 Th1-형 및 Th2-형 반응을 포함하는 면역 반응이 일어난다. Th1-형 반응이 우세하게 일어나는 것이 바람직한데, 이 경우 Th1-형 사이토카인들의 농도가 Th2-형 사이토카인들의 농도에 비해 급격히 증가한다. 사이토카인들의 농도는 공지의 분석법으로 용이하게 측정할 수 있으며, 이러한 시이토카인들의 종류에 대해서는 하기의 참고문헌에 언급되어 있다(Mosmann and Coffman, 1989, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173).

Th1-형 면역 반응을 우세하게 유도하는 증강제로는 모노포스포릴 리피드(monophosphoryl lipid) A, 바람직하게는 3-de-O-아실화 모노포스포릴 리피드 A(3D-MPL)와 알루미늄염(aluminum salts)을 혼합한 것을 사용하는 것이 바람직하다. MPL^TM증강제는 코리사 사(Corixa Corporation)로부터 구입이 가능하다(U. S. Patent Nos. 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 및 4,912,094 참조). CpG-포함 올리고뉴클레오타이드(이 경우 CpG 다이뉴클레오타이드는 메틸화되어 있지 않다) 역시 Th1-형 반응을 우세하게 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드들은 하기의 참고문헌에 언급되어 있다(WO 96/02555). 또 다른 증강제로서 사포닌(saponin), 바람직하게는 QS21이 사용될 수 있는데, 이들은 단독으로 또는 다른 증강제들과 혼합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, WO 94/00153에는 QS21 및 3D-MPL을 혼합 사용하였고, WO 96/33739에서는 QS21을 콜레스테롤로 억제한 보다 반응성이 적은 증강제를 사용하였다. 또 다른 바람직한 증강제 조성으로는 기름/물 유제(oil in water emulsion) 및 토코페롤(tocopherol)을 들 수 있다. QS21, 3D-MPL 및 기름/물 유제에 포함된 토코페롤로 구성된 특정한 단백질 증강제에 대한 예가 WO 95/17210에 언급되어 있다. 또 다른 증강제로서 AS-2(Smith-Kline Beecham)가 사용될 수 있다. 본 발명의 백신은 항원, 면역 반응 증가제 및 적합한 전달체를 혼합하는 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 천천히 방출되도록 고안된 제형의 일부로서 투여될 수 있다(즉, 투여 후 유효 성분이 천천히 방출되도록 해 주는 캡슐 또는 스폰지 등의 제형). 이러한 제형은 공지의 기술에 의해 제조될 수 있으며, 경구, 직장(rectal), 피하이식(subcutaneous implantation) 또는 목적 부위에 이식을 통해 투여될 수 있다. 천천히 방출되도록 고안된 제형에는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 전달체 기질에 분산되어 있거나 막으로 싸여 있는 저장기(reservoir) 안에 포함되어 있는 항체 등이 포함될 수 있다. 이러한 제형에 사용되는 전달체는 생체적합성(biocompatible) 및 생분해성(biodegradible) 특성을 가져야 한다. 상기 제형은 생체 내에서 유효성분을 일정한 정도로 방출시키는 것이 바람직하다. 상기 제형에 포함되는 유효 성분의 양은 이식 부위, 방출 시간 및 정도, 치료 또는 예방에 필요한 조건 등에 의하여 결정된다.

HSV에 감염된 세포를 타겟으로 하는 항원 특이적 면역 반응을 촉진시키는 어떠한 전달체(delivery vehicles)도 본 발명의 약학적 조성물 및 백신에 사용될 수 있다. 상기 전달체는 수지상 세포(dendritic cells), 대식세포(macrophages), B 세포, 단핵구(monocytes) 및 효율적인 APCs로 조작된 다른 세포들과 같은 APCs(antigen presenting cells)를 포함한다. 이러한 세포들은 항원성 증가, T 세포 반응의 활성화 및 유지 증진, 항 바이러스성을 나타내거나 및 또는 수용체(HLA halotype 등의)와 면역학적으로 양립할 수 있도록 유전적으로 변형시키기도 한다. APCs는 종양 및 아종양 조직(peritumoral tissues)을 포함하는 여러 생물학적 용액 및 기관들로부터 분리가 가능하며, 자가(autologous), 동종(allogeneic), 동계(syngeneic) 또는 이종이식(xenogeneic)이 가능하다.

본 발명에서는 항원-발현 세포(antigen-presenting cells)로서 수지상세포(dendritic cells) 또는 그의 모세포(progenitors)를 사용하는 것이 바람직하다. 수지상세포는 매우 유력한 APCs이며(Banchereau and Steinman, Nature 392:245-251, 1988), 예방 또는 치료를 위한 면역을 유도하는데 있어 효과적인 생리학적 증강제로서 작용한다(Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999). 일반적으로, 수지상세포는 그들의 독특한 형태와 B 세포(CD19 및 CD20), T 세포(CD3), 단핵구(CD14) 및 NK(natural killer) 세포(CD56)의 분화 마커(differentiation markers)가 결여되어 있다는 사실을 기초로 공지의 분석법에의해 확인이 가능하다. 수지상세포는 또한 특이적 세포 표면 수용체(specific cell-surface receptors) 또는 리간드를 발현하도록 조작될 수 있다. 수지상세포 대신에 분비과립 항원-함유 수지상세포(secreted vesicles antigen-loaded dendritic cells, called exosomes)도 백신 내에 사용될 수 있다(Zitvogel et al., 1988, Nature Med. 4:594-600).

수지상세포 및 그 모세포는 말초 혈액(peripheral blood), 골수(bone marrow), 종양-침윤세포(tumor-infiltrating cells), 아종양조직-침윤세포(peritumoral tissues-infiltrating cells), 림프절(lymph nodes), 신장(spleen), 피부(skin), 탯줄도관혈액(umbilical cord blood) 또는 다른 적절한 조직이나 체액으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 말초혈액으로부터 수확한 단핵구의 배양액에 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFα등의 사이토카인들을 혼합하여 처리하면 수지상세포로의 분화를 유도할 수 있다. 또한, 말초혈액, 탯줄도관혈액 또는 골수로부터 수확한 CD34+ 세포의 배양액에 GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 수지상세포의 성숙 및 증식을 촉진하는 다른 화합물들을 혼합하여 처리하면 수지상세포로의 분화를 유도할 수 있다.

수지상세포는 표현형(phenotype)에 따라 "미성숙(immature)" 및 "성숙(mature)" 세포로 구분될 수 있다. 그러나, 이 외에도 분화의 중간 단계에 있는 많은 세포가 존재할 수 있다. "미성숙" 수지상세포는 높은 항원 흡입 및 처리 능력을 지닌 APC로 특징지어질 수 있으며, Fcγ 수용체, 만노스 수용체(mannose receptor) 및 DEC-205 마커들을 높은 수준으로 발현한다. "성숙" 수지상세포는 상기 마커들은 낮은 수준으로 발현하지만, 1형 및 2형 MHC, 유착분자들(adhesion molecules, e.q., CD54 및 CD11) 및 코스트이뮬로터리 분자들(costimulatory molecules, e.q., CD40, CD80 및 CD86) 등의 T 세포 활성화와 관련이 있는 세포 표면 분자들(cell surface molecules)을 높은 수준으로 발현한다. 일반적으로, APCs는 세포 표면에서 발현되는 폴리펩타이드 또는 그의 항원성을 나타내는 부분(immunogenic portion)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 감염시킨다. 이러한 감염은 체외(ex vivo)에서 수행될 수 있으며, 감염된 세포를 포함하는 조성물 또는 백신은 치료 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 수지상세포 또는 다른 항원-발현 세포를 타겟으로 하는 유전자 전달체(gene delivery vehicle)를 환자에게 투여함으로써 체내(in vivo)에서 감염을 일으킬 수도 있다. 수지상세포를 체내 또는 체외에서 감염시키는 방법에 대해서는 하기의 참고문헌에 언급되어 있다(WO 97/24447; Mahvi et al., 1997, Immunology and Cell Biology 75:456-460). 수지상세포에 항원을 로딩(loading)하는 것은 종양 폴리펩타이드, DNA(네이키드 상태 또는 플라스미드 벡터내에 존재하는 상태) 또는 RNA; 또는 항원을 발현하도록 재조합된 세균이나 바이러스(백시니아, 폴폭스(fowlpox), 아데노바이러스 또는 렌티바이러스(lentivirus) 벡터들) 등을 수지상세포 또는 그의 모세포와 같이 배양함으로써 수행할 수 있다. 로딩 전에, 폴리펩타이드는 T 세포에 도움을 주는 면역학적 파트너(immunological partner)와 공유적으로 결합시킬 수도 있고, 또는 수지상세포와 비결합 상태(non-conjugated)의 면역학적 파트너를 함께 펄스(pulse) 시킬 수도 있다

조성물의 투여(Administration of the Compositions)

치료(treatment)는 예방(prophylaxix) 및 치료(therapy)를 포함한다. 예방 또는 치료는 직접적인 한 번의 주입 또는 여러 번의 주입에 의해 성취될 수 있다. 투여는 또한, 동시에 여러 부위를 통하여 이루어질 수도 있다. 피투여자로는 인간, 소(bovine), 말(equine), 개(canine), 고양이(feline), 돼지(porcine), 양(ovine) 등의 포유동물이 포함된다. 피투여자로서 바람직한 것은 인간이다.

조성물은 정맥, 피하 및 근육을 통하여 비경구적으로 투여될 수 있으며, 또한 구강(buccal)/설하(sublingual), 직장(rectal), 경구(oral), 비강(nasal), 국소(topical), 질(vaginal), 폐(pulmonary), 동맥내(intraarterial), 복강내(intraperitoneal), 안구내(intraocular) 또는 비강내(intranasal) 경로를 통해 투여가 가능하다. 또한 특정 조직에 직접 투여하는 것도 가능하다.

조성물은 적합한 어떠한 방법으로도 투여될 수 있으며, 종종 약학적으로 허용 가능한 전달체와 함께 투여된다. 또한 본 발명의 조성물은 한 가지 이상의 경로를 통해서 투여될 수 있으며, 더욱 효과적인 작용을 위해서 특정한 경로로 투여되기도 한다.

투여량은 피투여자에 있어 충분한 치료 효과를 나타내어야 하며, 감염 또는 감염으로 인한 질병을 억제하는데 부족함이 없어야 한다. 따라서, 조성물은 특정 항원에 대한 면역 반응을 효과적으로 유도하고, 감염 또는 감염으로부터 생기는 질병의 제 증상을 완화 및 억제시키는데 충분할 만큼 투여하여야 한다. 이러한 양을 "치료 효과 용량(therapeutically effective dose)"이라 한다.

투여량은 조성물의 활성 및 피투여자의 상태는 물론 피투여자의 체중 및 치료가 필요한 표면적 등에 의하여 결정된다. 투여량은 또한, 특정한 피투여자에 특정 조성물을 투여할 경우 수반될 수 있는 부작용의 존재, 특성 및 정도에 의해서도 결정될 수 있다. HSV 감염과 같은 질병에 대한 치료 또는 예방 목적으로 투여되는 조성물의 효과 용량을 결정하기 위해서는 바이러스에 대한 면역 반응, 질병의 진행 및 치료에 따르는 독성 등의 평가가 먼저 이루어져야 한다.

예를 들어, HSV 단백질의 소단위체를 포함하고 있는 백신이나 다른 조성물은 1회 투여 용량에 1-10,000 ㎍의 HSV 단백질을 포함할 수 있다. 1회 투여량에 10-1,000 ㎍의 HSV 단백질을 포함하는 것이 바람직하며, 10-100 ㎍의 HSV 단백질을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 투여는 1회에 유효 용량을 모두 투여할 수도 있고, 수개월 동안 여러 번에 걸쳐 투여할 수도 있다. HSV 폴리뉴클레오타이드 또는 펩타이드를 포함하는 조성물의 경우에도 유사한 양으로 투여가 가능하다.

투여는 52주 동안 1-10회에 걸쳐 투여할 수 있다. 1개월을 주기로 하여 6회 투여한 후, 정기적으로 부스팅(booster vaccinations)하는 것이 바람직하다. 상기 투여 방법은 피투여자 각각에 따라 조금씩 달라질 수 있다. 조성물의 적절한 투여 용량은 투여시 항-바이러스성 면역 반응이 적어도 10-50% 증가되는 것이다. 이러한 백신은 또한 임상적 증상을 개선시키는 면역 반응을 유도한다. 일반적으로, 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 치료용 조성물 및 백신의 경우, 1회 투여량에는 각 폴리펩타이드가 0.1 ㎍-5 ㎎/㎏ 정도가 포함되어 있으며, 10-1000 ㎍ 정도가 포함되는 것이 바람직하다. 투여 용적(volumes) 역시 피투여자의 크기, 나이 및 면역 상태 등에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.1 ㎖-5 ㎖ 정도이며 대부분의 경우 1 ㎖ 이하이다.

조성물이 투여된 개체의 면역 세포로부터 면역 세포를 포함하는 조성물을 얻었다. 또는 HLA-적합성 제공자(HLA-compatible donor)로부터 면역 세포를 얻었다. 개체 또는 제공자로부터 공지의 기법을 이용하여 면역 세포를 얻은 후, 본 발명의 에피토프를 발현하도록 조작된 APCs에 노출시키고, 체외에서(ex vivo) 증식시킨 후 개체에 투여하였다. 체외 치료법(ex vivotherapy)의 방법은 하기의 참고문헌에 언급되어 있다(Rosenberg et al., 1990, New England J. Med. 9:570-578). 조성물은 또한, 본 발명의 에피토프를 발현하도록 조작된 APCs를 포함할 수 있다.

면역 세포는 시험관내(in vitro) 증식을 통하여 면역요법(immunotherapy)에 충분할 만큼 수확할 수 있다. 하나의 항원 특이적 효과기 세포(antigen-specific effector cell)를 수조개의 세포로 증식시키는 배양 조건에 대해서는 이미 잘 알려져 있다. 이러한 배양 조건에는 단속적인 항원 자극이 사용되며, 종종 IL-2와 같은 사이토카인 및 비-분열성 식세포(non-diving feeder cells)의 존재 하에서 이루어 지기도 한다. 면역요법에 충분한 수의 세포를 생산하기 위하여, 면역반응성 폴리펩타이드(immunoreactive polypeptides)가 항원-특이성 T 세포를 증식시키는데 사용되기도 한다. 특히, 수지상세포, 대식세포, 단핵구, 섬유아세포 및/또는 B 세포 등의 항원-발현 세포들을 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드로 감염시키거나, 면역반응성 폴리펩타이드와 함께 펄스된다. 예를 들어, 항원-발현 세포들은 재조합 바이러스 또는 다른 발현 시스템에서 발현을 증가시키는데 적합한 프로모터를 가지는 폴리뉴클레오타이드로 감염시킬 수 있다. 치료에 사용하기 위하여 배양된 효과기(effector) 세포들은 성장 및 분산 능력을 가져야 하며, 체내에서 장기간 생존 가능하여야 한다. 배양된 효과기 세포들이 체내에서 증식될 수 있으며, IL-2가 보강된 항원으로 반복 자극함으로써 오랜 기간 동안 생존이 가능하다는 것을 확인한 여러 연구가 있어 왔다(Cheever et al., 1997, Immunological Reviews 157:177).

투여는 상기에서 언급한 여러 경로를 통해서, 바늘(needle), 카데터(catheter) 또는 다른 장치를 사용하여, 1회 또는 수회에 걸쳐 이루어질 수있다.

확인된 항원의 시험관내 분석(In Vitro Testing of Identified Antigens)

확인된 HSV 항원의 효능을 시험관 내에서 분석하는데는 여러 공지의 기법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 생쥐 모델(mouse challenge model)을 사용하는 방법이 있으나, 이 모델이 루틴(routine)한 것으로 판단될 경우 다른 모델들을 사용할 수도 있다.

분석을 위한 화합물 또는 조성물이 준비되면 생쥐 또는 다른 개체를 일련의 주사를 통하여 면역시켜야 한다. 수개월에 걸쳐 10회까지 주사를 통해 투여가 가능하며, 4주마다 투여하는 것이 일반적이다. 일련의 면역과정의 마지막 주입 후에는 치사량(lethal dose)의 바이러스가 주입된다. 대조군에는 위약(placebo)을 투여한다. 치사량에 조금 못 미치는 양의 바이러스가 주입될 수도 있으며, 농도별로 투여하여 농도-의존성 실험(dose-response study)을 수행할 수도 있다. 치사 및 심각한 신경 손상(neurological impairment)을 유발하는 한계점(end points)을 측정한다. 생존한 동물들은 해부하여 척수관(spinal cord), 뇌(brain) 등의 주요 기관 및 투여 부위를 배양하여 바이러스의 양을 결정한다. 조성물은 또한 치료용 백신으로서의 효능을 확인하기 위하여 이전에 감염시킨 동물에서도 실험할 수 있다.

효능(efficacy)은 IC₅₀값을 측정하여 결정되는데, 이는 실험 동물 중 50%가 생존하는 경우의 백신양을 ㎍/㎏으로 표시한 것이다. 또한, LD₅₀로도 계산할 수 있는데, 이는 특정한 양의 백신을 투여하였을 때 투여받은 실험 동물의 50%를 치사시키는데 필요한 감염 단위(infectious units)를 의미한다. 사후의 바이러스 역가(post mortem viral titer)를 결정함으로써 바이러스의 증식이 면역 기구에 의해 제한되는 것을 확인할 수 있다.

질내 접종(vaginal inoculation)이 이용될 수도 있다. 급성 실험(acute protection studies)에는 주로 생쥐가 이용된다. 급성 실험 및 재발 방지 실험에는 인간과 좀 더 생리학적으로 밀접한 동물인 기니아피그(guinea pigs)가 이용되기도 한다. 이러한 경우에는 비치사량(non-lethal dose)의 바이러스가 투여되며, 기니아피그는 재발 및 치료가 가능한 정도의 증상을 보이게 된다. 급성 질환의 개선 및 재발 상황을 모두 측정한다. 실험 목적(예방 또는 치료)에 따라 접종 전후에 백신이나 조성물을 투여할 수 있다.

방법(Methods)

본 발명은 HSV 감염에 대한 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 상기의 방법에는 본 발명의 조성물을 투여하는 것이 포함된다. 상기 조성물은 치료용 또는 예방용 백신으로 사용될 수 있다. 본 발명의 구체예에서, HSV는 HSV-2 또는 HSV-1이다. 본 발명은 또한 HSV의 증식을 저지시키는 방법, HSV에 감염된 세포를 치사시키는 방법, 항바이서스 활성 및/또는 면역조절 활성을 지닌 림포카인(lymphokines)의 분비를 증가시키는 방법 및 HSV에 특이적인 항체의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 HSV에 감염된 세포를 본 발명의 항원에 특이적으로 반응하는 면역세포에 접촉시키는 것을 포함한다. 상기의 접촉은 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 수행된다. 본 발명의 구체예에서, 면역세포는 T 세포인 것이 바람직하다. T 세포는 CD4 및 CD8 T 세포들을 포함한다. 본 발명의 조성물은 또한 면역병리학적 질병(immunopathologic disease)에 대한 내성제(tolerizing agent)로도 사용이 가능하다.

또한, 본 발명은 HSV에 대해 특이적으로 작용하는 면역세포를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 면역세포를 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 항원을 발현하도록 변형시킨 항원-발현세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 항원-발현세포는 수지상세포인 것이 바람직하다. 상기 세포는 펩타이드 로딩(peptide loading) 또는 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열로 유전적 조작을 가함으로써 변형시킬 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 면역세포는 T 세포이다. T 세포에는 CD4 및 CD8 T 세포들이 포함된다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 생산된 면역세포들을 제공한다. 상기 면역세포들은 HSV 증식 억제, HSV에 감염된 세포의 치사, 항바이러스 활성 및/또는 면역조절 활성을 지닌 림포카인의 분비 증가, HSV에 특이적인 항체의 생산 증가 또는 HSV 감염의 치료 또는 예방의 목적으로 사용될 수있다.

본 발명은 감염성 유기체(infectious organism)와 연관된 면역원성 에피토프(immunogenic epitopes)를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법에는 유기체 게놈의 절편들(random fragments)을 모으는(collection) 과정이 포함된다. 상기 과정에는 전체 게놈(entire genome)을 하나 또는 그 이상의 제한효소(restriction enzymes)로 처리하여 적당한 길이를 가진 무작위성 절편(random fragments)의 조합으로 만드는 것이 포함된다. 또는, 초음파(sonicate), 분무(nebulize) 또는 다른 방법을 사용하여 적절한 크기의 절편들로 자를 수 있다.

분해 및 제한효소의 선택은 T 세포 에피토프의 평균 길이보다 긴 즉, 30 뉴클레오타이드 이상의 길이를 가진 절편을 얻을 수 있도록 선택되어야 한다. 절편들은 또한, 유전적 종결(genetic stops)이 빈번하지 않을 만큼 작아야 하며, 약 200-500 염기쌍 정도의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 게놈의 서열이나 제한효소 지도(restriction map)가 알려져 있는 경우에는 게놈의 분석을 통해 제한효소부위를 확인할 수 있으며, 적절한 제한효소들을 이용하여 적당한 길이 및 수의 절편들을 얻을 수 있다. 제한효소들은 또한, 클로닝 벡터에서 사용된 부위들과 양립성인(compatible) 부위들을 타겟으로 하는 것으로 선택될 수 있다.

무작위 절편들은 그 절편들을 인코드하는 폴리펩타이드들의 발현에 이용될 수 있다. 절편들은 각각 발현될 수도 있고, 또는 바람직하게는 폴리펩타이드들의 풀(pool)로서 발현될 수도 있다. 폴리펩타이드들은 DNA 또는 RNA를 출발물질(starting material)로 하여 발현될 수 있다. 예를 들어, RNA 바이러스로부터의 폴리펩타이드의 발현은 먼저, RNA 절편으로부터 cDNA를 만들고, 이어서 상기 cDNA를 이용하여 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다.

폴리펩타이드는 게놈 절편을 포함하고 있는 벡터로부터 발현될 수도 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 벡터는 pcDNA3.1(+)his 벡터와 같은 플라스미드인 것이 바람직하다. 인서트(insert)로부터 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 다른 벡터도 사용될 수 있다. 폴리펩타이드는 융합 단백질(fusion protein)의 형태로 발현되는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체예에서, 발현에는 게놈 절편을 포함하고 있는 벡터로 감염 또는 형질도입된 숙주 세포를 배양하는 과정이 포함된다. 절편들은 발현벡터의 세 개의 다른 리딩 프레임(reading frames)에 양쪽으로 결합되어 라이브러리(library)를 형성하는 것이 바람직하다.

라이브러리의 질(quality)은 게노믹 절편들을 부분적인 필인 반응(fill-in reaction)을 이용하여 결합시킴으로써 향상시킬 수 있다. 예를 들어, HSV-2를Sau3AⅠ으로 자르면 점착성의 말단(sticky ends)이 만들어지고, 이를 통해 여러 절편들을 동시에 결합시킬 수 있다. 부분적인 필인 반응은 바이러스 게놈의 절편들을 서로 결합시키지 않고 하나의 벡터에 하나의 바이랄 인서트(viral insert)만 포함하도록 점착성 말단을 변형시키는 데에도 이용된다. 이러한 방법은 라이브러리의 분석을 간편하게 해 준다.

본 발명의 방법에는 또한, 발현된 폴리펩타이드의 면역반응을 유발하는 능력을 분석하는 과정이 포함된다. 면역반응을 유발하는 능력은 폴리펩타이드내에 면역원성 에피토프가 존재하기 때문에 나타나는 것이다. 본 발명의 구체예에서, 면역반응은 세포성 면역 반응(cellular immune response)이다. 분석 과정에는 T 세포의 자극 또는 활성화 정도를 측정하는 것이 포함된다. T 세포에는 CD4 및 CD8 T 세포들이 포함된다.

T 세포의 자극을 분석하는 방법으로서 세포독성 분석법이 있다(Koelle, DM et al., Human Immunol. 1997, 53:195-205). 세포독성 분석법은 적절한 HLA 분자와 관련된 항원성 바이러스 펩타이드를 지니는 세포를 T 세포에 접촉시키는 단계 및 항원-발현 세포를 치사시키는 T 세포의 능력을 측정하는 단계로 이루어진다. 항원-발현 세포로부터 방출되는⁵¹Cr의 양을 측정함으로써 세포의 치사정도를 알 수 있다. 배양액으로⁵¹Cr이 방출된다는 것은 세포가 사멸했다는 의미가 된다. T 세포와 혼합한 항원-발현 세포의 배양액의⁵¹Cr 양을 배양액만으로 혼합한 항원-발현세포의 배양액의⁵¹Cr 양과 비교 측정하여 cpm(counts per minute) 으로 나타낸 결과가 통계학적으로 유의성이 있을 만큼 증가되었다면 세포 치사 능력이 증가되었다고 판정한다.

상기의 분석법은 폴리펩타이드의 풀에 활성 부위(active moiety)가 존재하는지를 확인하기 위하여 풀상에서 수행될 수도 있다. 이어서 목적하는 폴리펩타이드를 분리하기 위하여 원래 풀의 일부분을 대상으로 상기 분석을 수행할 수 있다. 목적하는 절편 즉 바이랄 인서트를 포함하는 플라스미드를 포함하는 물질은 용이하게 정제될 수 있으며 서열을 결정할 수도 있다. 결정된 서열 정보를 기초로 하여 다른 분석 및 항원의 확인에 사용될 수 있는 합성 펩타이드를 제조할 수 있다. 서열 정보는 또한 신규한 유전자를 확인하는 데에도 이용될 수 있다. 상기의 분석은 반복 수행될 수 있으며, 따라서 게놈 절편의 부절편(subfragments)이 만들어질 수 있다. 현저하게 작아진 절편들이 발현될 수 있으며, 따라서 최소한의 에피토프(minimal epitope)를 결정할 수 있다.

본 발명의 방법은 세균, 기생충(parasites) 및 바이러스를 비롯한 여러 감염성 유기체에 적용이 가능하다. 인트론이 없는(intronless) DNA 또는 코딩 서열(coding sequence)만으로 이루어진 바이러스가 바람직하다. 바이러스에는 이중나선 DNA 바이러스, 단일나선 DNA 바이러스, 이중나선 RNA 바이러스 및 단일나선RNA 바이러스가 포함된다. 이중나선 DNA 바이러스에는 EBV(Epstein-Barr virus), 사이토메갈로 바이러스(cytomegalovirus, CMV), HSV(herpes simplex virus)-1, HSV-2, VZV(varicella-zoster virus), HHV(human herpes virus)-6, HHV-7, HHV-8, 폭스바이러스(poxvirus) 및 아데노바이러스(adenovirus) 등이 포함되나 여기에 국한되는 것은 아니다. 단일나선 DNA 바이러스에는 파보바이러스(parvovirus)가 포함되나 여기에 국한되는 것은 아니다. 이중나선 RNA 바이러스에는 레트로바이러스(retrovirus) 및 레오바이러스(reovirus) 등이 포함되나 여기에 국한되는 것은 아니다. 단일나선 RNA 바이러스에는 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 믹소바이러스(myxovirus) 및 플라비바이러스(flavivirus) 등이 포함되나 여기에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법은 유기체의 핵산 서열에 대한 정보를 요구하지 않으므로 여러 생물학적 다양성을 보이는 감염성 유기체(HIV 및 HCV)들에 대한 치료법을 제공할 수 있다. 높은 변이성을 보이는 바이러스를 위해서는, 알려져 있는 핵산 서열을 지닌 원래의 스트레인(strain)과는 차이가 있는 특정 환자의 특정 부위(혈액, 피부, 자궁 경부 등의)로부터 얻은, 또는 특정한 지역이나 환자 집단에서 유행하는 대표적인 바이러스 스트레인(representative viral strain)의 바이러스 핵산을 사용하는 것이 유리하다.

본 발명의 바람직한 구체예로서, 유기체는 HSV-2이며 바이러스 게놈의 절편들은 제한효소Sau3AⅠ을 사용하여 분해함으로써 제조된다. 이 외에 사용될 수 있는 제한효소들로는ApaⅠ,SmaⅠ 및AluⅠ 등을 예로 들 수 있으나 여기에 국한되는 것은 아니다. 게노믹 DNA의 절편들은 다음 단계로 벡터 안으로 통합되는데, 이 때 부분적 필-인 반응(partial fill-in reaction)을 사용하는 것이 바람직하다(1999 Stratagene catalog, page 56 참조). 벡터로는 pcDNA3.1(+)his 계열을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 발현은 Cos-7 감염법(transfection method)을 사용하여 수행되는 것이 바람직하다(De Plaen E et al. In: Lefkowits I, ed. Immunology Methods Manual, v. 2. New York: Academic Press, 1997:691-718).

숙주세포는 HLA 중쇄(heavy chain)와 같은 HLA 분자를 인코딩하는 cDNA와 동시감염(co-transfection)시킬 수 있다. HLA 분자는 숙주세포를 감염성 인자로부터 유래된 항원의 인지를 위한 T 세포와 구분할 수 있도록 해 준다. HLA 분자는 표적 항원을 발현하는 HLA 분자와 일치(match)하도록 선택되어 진다. 적절한 HLA 분자를 확인하는 방법에 대해서는 하기의 참고문헌에 언급되어 있다(Koelle, D. M. et al., J. Infectious Dis. 1994, 169:956-961; DePlaen, E. et al., In Immunology Methods Manual, 1997, Academic Press, 704-705). 적합한 HLA 분자가 없을 경우에는 둘 또는 그 이상의 1형 HLA 분자(class Ⅰ HLA molecules)들을 인코딩하는 cDNA를 동시감염시킬 수도 있다.

이후 발현된 폴리펩타이드가 세포성 면역 반응을 유발하는 능력을 분석한다. 세포성 면역 반응을 유발한다는 것은 면역원성 에피토프가 존재한다는 것을 의미한다. 세포성 면역 반응을 유발하는 능력을 분석하는 방법에는 세포독성 분석법(cytotoxicity assay) 및 림포카인 분비 분석법(lymphokine secretion assay) 등이 포함되나 여기에 국한되는 것은 아니다. 한 구체예로서, 인터페론-감마 분석법(interferon-gamma assay)도 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명은 CD8+ T 세포에 대해 면역원성을 지닌 HSV 에피토프를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 HSV 감염 부위에서 CD8+ T 세포를 수득하는 단계, 수득한 T 세포가 HSV에 감염된 세포를 인지하는 능력이 있는지 분석하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한, HSV로부터 핵산을 수득하고 절편화시키는 단계, 하나 또는 그 이상의 절편을 발현시키는 단계 및 발현된 절편이 HSV-특이적 T 세포와 면역학적 반응성을 보이는지를 분석하는 단계를 포함한다. HSV-특이적 T 세포와 반응성을 보이는 발현된 절편은 CD8+ T 세포에 대해 면역원성을 지닌 HSV 에피토프를 인코딩하는 것이다.

본 발명은 또한, 진단법(diagnostic assay)을 제공한다. 상기 진단법은 HSV 감염이 의심되는 환자의 면역학적 반응성을 확인하는데 이용될 수 있고, 또한 특정한 치료 과정에 대한 환자의 반응성을 예측하는데 이용될 수 있다. 상기 진단법은 본 발명의 항원을 환자의 T 세포, 즉 적절한 APC에 노출시키는 단계 및 IFN-γ, 증식(proliferation) 또는 세포독성(cytotoxicity) 측정 등을 통해 면역반응성을 검사하는 단계로 구성된다. 적절한 분석 방법은 실시예에 상세히 설명되어 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재발성 생식기 HSV-2 감염 병소(recurrent genital HSV-2 lesions)에서 HSV-특이적 CD8 CTL의 검출

이 실시예에서는 특이적 CD8 CTL이 생식기 HSV-2 감염 병소에 집중된다는 것을 증명한다. 이는 항원에 노출시킨 APC 세포를 이용한 재발성 생식기 HSV-2 감염 병소에 대한 단계적 병소 생검(serial lesion biopsy)에 의해 이루어 졌다.

재료 및 방법(Materials & Methods)

병소-침투성 림프구(lesion-infiltrating lymphocytes, LIL)를 PHA(phytohemaglutinin), IL-2 및 50 μM의 아시클로버(acyclovir, ACV) 존재하에서 한 세포주기 동안 증식시켰다. 2주 후에 5X10⁶-5X10⁷세포를 수득하였다. 이들의 표현형에 관해서는 하기의 참고문헌에 언급되어 있다(Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998, 101:1500-1508). TCRαβ, CD3+ 세포들 중에서, 병소가 성장할수록 CD8이 우세해지는 현상을 관찰할 수 있었다.

결과(Results)

국소적 반응으로 K562 및 그의 동종이계(allogeneic)인 HSV-2-감염 LCL(lymphocyte continupus line)의 용해로서 결정되는 높은 수준의 NK 세포 활성이 증상을 보이기 시작한 2일째부터 관찰되었다. NK 세포들은 정상 피부와 비교하였을 때 병소에서 선택적으로 증가하였다. 이와 유사하게 HSV-특이 CD4 세포들도 초기에 증가하였다. 병소에서는 "Th1"(IFN-γ, IL-12p40, IL-2) 및 "Th2"(IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) mRNA가 모두 증가하였다. 병소-침투성 HSV-2-특이 CD8 CTL의 사이토카인 형(cytokine pattern)으로 인터페론-감마가 포함된다.

CD4 및 NK 활성과는 반대로, HSV-특이 CTL의 활성은 비교적 늦게(5-9일째) 관찰되었으며 이는 바이러스의 제거(virus clearance)와 관련이 있다(Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998, 101:1500-1508). CD4 및 CD8 성분들을 NK 그리고 CD4 또는 CD8을 제외함으로써 관찰하였다. CTL 활성을 CD8 세포 단독 또는 양쪽 서브셋(subsets) 모두에서 관찰하였다. 자가세포(autologous cells)는 제조가 용이하며, HSV는 이러한 세포에서 완벽한 용균 증식(lytic replication)을 보이고, HLA 및 코스트이뮬로터리(costimulatory)/부착(adhesion) 분자들이 높은 수준으로존재하기 때문에 EBV로 형질전환된 LCL(Tigges MA et al., J. Virol. 1992, 66:1622-1634)이 CTL 분석에 있어 타겟 세포로 사용되었다.

허피스성 수포액(herpetic vesicle fluid; Koelle DM et al., J. Infect. Dis. 1994, 169:956-961) 및 병소(Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998, 101:1500-1508)로부터 HSV-특이 CD8 클론들이 분리되었다(표 1). 항원에 2한 2차 자극은 수행되지 않았다. CD8이 다량 포함된 1000개 이상의 미세배양(microcultures)군을 표준방법에 따라 0.3-2 세포/웰로 클로닝하였으며(Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998, 101:1500-1508), 약 200개의 클론을 HSV(MOI=10)로 18시간 동안 감염시키거나 감염시키지 않은 자가(autologous) LCL에 대한 CTL 분석법으로 스크리닝 하였다. 모든 클론들은 CD3/8/TCRαβ(+) 및 CD4/TCRγδ(-)인 것을 유세포 분석(flow cytometry)으로 확인하였다.

재발성 HSV-2 병소로부터 얻은 CD8 T 세포 클론들(TCC)의 세포용해 활성. 용해 정도는 에펙터:타겟(E:T) 비율이 20:1 또는 그 이하일 경우에 퍼센트 특이적으로 표시하였다.

¹: HSV-2 게놈의 표준 지도(Dolan A et al., J. Virol. 1998, 72:2010-2021)상에서의 에피토프 위치; HSV-2-특이 TCC에 대한 에피토프 맵핑(epitope mapping)에는 HSV-1 X HSV-2 교잡형 재조합 바이러스(IRV, intertypic recombinant vituses)를 사용(Preston VG et al., J. Virol. 1978, 28:499-517; Koelle DM et al., J. Virol. 1994, 68:2803-2810; Koelle DM et al., J. Virol. 1998, 72: 7476-7483). 경계는 대략적으로 표현됨.

²: HSV-2에 감염된, LCL과 부분적으로 일치하는 세포들을 용해시키는 데 한정된 HLA 대립유전자(Koelle DM et al., J. Infect. Dis. 1994, 169:956-961); 혈청학적(serologic) 또는 DNA에 의한 정의(definitions)가 타이핑 방법에서 허용됨.

³: dkRW22. RW22 및 RW.1991.22는 RW로부터 1991년에 얻어진 T 세포 클론을 의미한다. 1991년에 "22"로 표기된 2개의 클론이 독립적으로 RW로부터 분리되었다. 이들은 각각 dkRW22 및 cpRW22로 표기되었다.

CD8 반응의 다양성을 측정하기 위하여, PHA와 함께 한 세포주기 동안 증식된 LIL로부터 얻은 CD8+ 세포들은 물론 같은 제공자의 말초혈액 단핵구로부터 얻은CD8 세포들에 대해 TCR Vβ 분석을 수행하였다. 총 RNA(Chomczynski P et al., in: Coligan JE et al., eds. Current Protocols in Immunology, New York: John Wiley and Sons, 1992, 10.11.7-10.11.14)를 올리고-dT 프라이머 및 MMLV RT(Pharmacia)를 이용하여 역전사 시켰다. 상기에서 얻은 cDNA를 Cβ 및 동족-특이성(family-specific) Vβ 프라이머를 이용한 24회의 독립적인 PCR 반응에 사용하였다. 30 사이클의 PCR 반응 후에, 각 반응에서 소량의 반응액을 형광 표지된 Cβ 프라이머와 혼합시킨 후 다시 5 사이클의 PCR 반응을 수행하여 재배치된 TCTVβ 유전자의 앰플라이머(amplimers)를 표지하였다. 상기 과정에서 사용된 프라이머 및 방법은 하기의 참고문헌에 언급되어 있다(Pannetier C et al., in: Oksenberg JR, ed. The antigen T cell receptor: selected protocols and applications, New York: Chapman and Hall, 1998: Section 9). 형광 MW 마커를 사용하여 ABI 서열분석기로 분석하였으며, 이는 프레드 허친슨 종양 연구 센터의 생명공학 연구실에서 수행되었다(Biotechnology Core, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA). 그 결과, CD8 PBMC들은 매우 다양한 다클론성(polyclonal)을 보이는 반면(도 1의A), 병소의 CD8 세포들은 결핍된 클론성(oligoclonal)을 나타내었다(도 1의B). 또 다른 제공자로부터도 유사한 결과를 얻었다. 이러한 결과는 HSV-2 감염 병소의 국소적 CD8 반응이 다양하지 않다는 사실과도 일치하는 것이다.

<실시예 2> 자궁 경부의 림프구(cervical lymphocytes)에서의 HSV-특이 T 세포 반응 검출

점막의 면역 반응(mucosal immune response)은 PBMC와 관계가 없으며, HSV-특이 CTL이 생쥐의 점막에 모인다는 것은 질을 통한 접종의 예방과 관련되어 있다. 이 실시예는 CD8+ 세포를 비롯한 HSV-특이 T 세포들이 자궁경부의 림프구에 존재한다는 것을 증명한다.

생식기 HSV-2 감염이 활발하게 진행되는 동안의 대표적인 자궁 경부의 세포쇄모 시료(cervical cytobrush specimens)로부터 얻은 세포들을 모아서 PHA/IL-2와 함께 증식시켰다. 그 후, HSV-특이적 증식(도 2의A) 및 세포독성 반응(도 2의B)을 분석하였다. 증식 및 세포독성 분석에 있어서, 자가의 PBMC 또는 LCL을 APC로서 사용하였다. 항-HLA 1형 mAb W6/32 또는 항-HLA Dr mAb L243을 하기의 참고문헌에서 언급된 바에 따라 사용하였다(Koelle DM et al., J. Virol. 1994, 68:2803-2810; Koelle DM et al., J. Infect. Dis. 1994, 169:956-961). 항원 특이적인 증식 및 세포독성 반응이 존재하는 것이 확인되었으며, 단편화(fractionation) 및 항체(mAb) 저해 실험을 통해서 세포독성 반응이 CD8 CTL에 의한다는 것을 확인하였다.

<실시예 3> 일차적 생식기 HSV-2 감염 병소에서 HSV-특이 T 세포 반응의 검출

일차적인 생식기 HSV-2 감염 증상을 보이는 환자로부터 생검시료(biopsyspecimens)를 얻었다. 수득한 세포들의 표현형(phenotypes)을 결정하고, 그 중에서 LIL 및 PBMC를 증식 및 세포독성 분석에 사용하였다. 그 결과, 일차적 생식기 HSV-2 감염 병소에서 나타나는 HSV-특이적 증식 및 세포독성 반응은 재발성 질환에서 검출되었던 것과 동일하다는 것을 확인하였다.

CW7477에서는 그의 마지막 성적 접촉 3일 후부터 배뇨곤란, 고열, 엉덩이 및 하복부 장애가 나타났다. 장애는 13일 동안 지속되었으며, HSV-2의 성장이 관찰되었다. 증상이 발생된지 4일째부터 아시클로버(acyclovir)를 사용하여 치료하였다. 4일째와 7일째에 생검을 실시하였다. 4일째의 혈청형(serostatus)은 불규칙한 양성(atypical positive)를 나타내었으며(이뮤노블롯상에서 단지 몇 개의 밴드만 나타남), 21일째에 향상된 화학발광법(enhanced chemiluminescence, ECL; Dalessio J. and Ashley R., J. Clin. Microbiol. 1992, 30(4):1005-1007)에 의한 분석을 수행하였을 때에는 좀 더 많은 그러나 회복기의 혈청에서보다는 적은 밴드가 나타났다. 임상적 및 실험실적 자료는 이것이 일차적 생식기 HSV-2 감염임을 보여준다. 생검시료는 증상이 나타난지 4일 및 7일째에 수득하였으며, LIL을 PHA/IL-2 존재하에서 증식시켰다.

증식된 세포들의 표현형은 15-25% CD3+/CD16,56+ 세포들과 5-10% TCR γδ+ 세포들과 함께 CD4 및 CD8 세포들로 구분된다. 반면에, 정상 피부에서 얻은 세포들에는 CD16,56(+) 및 TCRγδ 세포들이 거의 포함되어있지 않다. CD3+/CD16,56+ 세포들의 특성에 대해서는 알려진 바가 없으나 이들은 증식된 LIL에서 종종 발견된다. 항체의 칵테일에는 αCD16-PE 및 αCD56-PE가 혼합되어 존재한다.

인간의 일차적 생식기 HSV-2 감염에서 얻은 벌크(bulk) LIL 또는 PBMC의 기능적 활성

¹: 10⁴/웰 농도의 벌크 세포들이 자가 조사된(autologous irradiated) 10⁵/웰 농도의PBMC와 함께 APC로서 사용되었다. 결과들은 4일째에 삽입된³H 티미딘(thymidine)의 평균 cpm 값을 나타낸다. 15일째에서 PBMC는 10⁵생세포/웰의 농도로 사용되었다.

²: 벌크 세포들은⁵¹Cr 방출 vs 자가(au) 또는 HLA 미스매치드(al) LCL(MOI=10의 바이러스로 18시간 동안 감염시킨)에서 20:1의 에펙터:타겟 비율로 사용되었다. CD8+ 세포들의 증식에는 MidiMacs^TM(Miltenyi)를 이용하였다. 결과는 % 특이적 방출(specific release)로 나타내었다; 우연히 발생하는 방출은 22% 이하였다.

HSV-특이적 증식 및 세포독성 반응은 재발성 질환에서 검출되었던 것과 일치한다(Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998, 101:1500-1508). HSV-1 및 HSV-2에 대한 교차반응(cross-reactive response)도 HSV 당단백질(glycoproteins)에 대한 항원-특이적 반응의 형태로 나타난다. 정상 피부에서의 반응성은 낮게 나타났으며, PBMC 반응은 15일째에서 나타났다.

<실시예 4> HSV-특이적 CD8 CTL에 의해 인지되는 ICP0 항원의 확인

이 실시예에서는 발현 클로닝을 통해 ICP0의 항원성을 증명한다. 특히, ICP0의 92-101번 아미노산에 존재하는 에피토프를 확인한다. 또한,백시니아(vaccinia)를 사용하여 ICP0의 항원성을 확인한다. 아미노산 의 번호는 돌란 등의 명명법 및 번호매기기 방법에 따라서 붙였다(Dolan et al., J. Virol. 1998, 72:2010-2021).

재료 및 방법

발현 클로닝은 분 등의 Cos-7 발현 클로닝법(expression cloning method)을 사용하여 수행하였다(De Plaen E et al., In: Lefkowits I., ed. Immunology Methods Manual, v. 2. New York: Academic Press, 1997, 691-718). 인터페론-감마의 분비 분석은 촉진자(stimulator)로서 1X10⁴정도의 세척된 자가(autologous) LCL(mock- 또는 MOI 10의 HSV-2로 18시간 동안 감염시킨) 및 반응세포(responder)로서 5X10⁴TCC를 200 ㎕의 TCM에서 24시간 동안 배양한 후 그 결과를 분석함으로써 수행하였다(Tigges MA et al., J. Virol. 1992, 66:1622-1634).

발현벡터(expression vectors)로는 pcDNA3.1(+)his A, B 및 C(Invitrogen)가 사용되었다. 이러한 특정 벡터들은 리더펩타이드(leader peptide) 및 바이러스 폴리펩타이드 절편으로 이루어진 융합 단백질의 생산에 필요한 다중 클로닝 부위(multiple cloning site; MCS)의 5' 시작 암호(start codon)인 하나의 ATG를 지닌다. 바이러스 DNA 절편이 ATG와 함께 프레임(frame)상으로 들어가는 확률은 1/6 이므로, ATG와 MCS 사이에 0, 1 또는 2개의 여분의 염기쌍을 지니는 벡터들(A,B, 및 C)이 사용된다.

베로(vero) 세포들에서 정제된 HSV-2 스트레인 HG52 DNA(MacLean AR. In: Brown SM, MacLean AR, eds. Methods in Molecular Medicine: Herpes Simplex Virus Protocols, v. 10. Totowa, NJ: Humana Press Inc., 1998, 19-25)를 이용하여 라이브러리를 제작하였다. 155,000 bp의 게놈을Sau3AⅠ으로 짤라서 수백 bp의 평균 길이를 지닌 456개의 절편들을 얻었다. 말단들을 부분적으로 필인(fill-in)시킨 절편들과, XbaⅠ으로 처리하고 부분적으로 필인시킨 탈인산화된 A, B 및 C 벡터들을 연결시켜 1차 라이브러리를 제조하였다. 부분적 필인은 벡터당 하나 이상의 절편이 연결되는 것을 방지해 준다. 세포 DNA의 오염은 20개의 클론을 무작위로 선정하여 검사해 본 결과 검출되지 않았다. 1차 라이브러리는 즉시 증폭시킨 후 분주하여 저장하였다. 각각의 라이브러리에서 바이러스 DNA가 프레임내로 진행될 확률은 1/6이므로 게놈의 6배에 달하도록 시료를 준비하였다. 1차 라이브러리 각각에는 15,000 이상의 형질전환체(transformants)가 포함되어 있었으며, 라이브러리당 3,000개의 클론이 분석되었다. 37℃, 300 rpm으로 18시간 동안 진탕배양 시킨 후 DNA를 정제하였다(Millipore 96-well format; silica chemistry). 10 ㎍/웰 정도의 DNA를 얻을 수 있었으며 이는 다른 많은 스크리닝 과정에 충분한 양이었다.

RW의 병소로부터 얻은 클론(lesion clone)인 RW51(표 1)이 발현 클로닝에 사용되었다. CD8 TCC RW51의 HLA 한정 대립유전자(restricting allele)인 HLA B*4501의 cDNA를 RT-PCR을 이용하여 클로닝 하였다. cDNA의 합성은 RW LCL로부터 얻은 총 RNA를 주형으로 하고(Chomczynski P, Sacchi N. In: Coligan JE et al., eds. Current Protocols in Immunology. New York: John Wiley and Sons, 1992, 10.11.7-10.11.14), 올리고-dT 프라이머 및 MMLV RT(Pharmacia)를 사용하여 수행하였다(Sambrook J et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, v. 2, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989). HLA B*4501 PCR 산물(프라이머 AAGGTACCATGCGGTCACGGCACCCCGAA 및 GGTCTAGAAGTTCGACACTCTCTGTGTAGT; 밑줄 표시된 부분은KpnⅠ 및XbaⅠ 부위; 각각서열번호 4및5로 기재되어 있음)을 제한효소로 자른 후 pcDNA 3.0으로 클로닝시키고 서열을 분석하였다. 그 결과 유전자은행(Genebank)의 B*4501인 61710과 일치하는 것을 확인하였다. FITC로 표지된 대립유전자 특이적 단클론항체(allele-specific mAb) B12(One Lambda, Inc.)를 이용하여 발현을 분석하였다. 유세포 분석 결과, 감염된 Cos-7(Fugene 6, Boehringer Mannheim)의 약 40%에서 HLA B45가 발현되는 것이 확인되었다. CD8 TCC RW3 및 dkRW22(표 3)의 한정 대립유전자인 HLA A*0201도 상기와 유사한 과정으로 클론되었으며, 단클론항체 MA2.1(McMichael AJ et al., Human Immunol. 1980, 1:121-129)을 사용하여 그 발현을 분석하였다.

라이브러리에서 항원성 단백질(antigenic protein)을 스크리닝하기 위하여, Cos-7 세포를 편평한 마이크로타이터 플레이트(flat microtitet plates)에 7,000세포/웰의 농도로 깔고 라이브러리 풀(library pool) 및 B*4501 DNA(50 및 25 ng/웰)로 동시감염 시켰다. 48시간 후에 클론된 RW51 T 세포(5X10⁴세포/웰)를 첨가하였다. 다시 24시간 후에 상등액에서 일치되는 단클론항체 쌍(Endogen)을 이용하여 인터페론-감마 ELISA(검출 한도, -2 pg/㎖)를 수행하였다. 각각의 리딩 프레임 라이브러리(reading frame library; A, B 및 C)에서 2-4개의 양성 풀이 확인되었다. 양성 풀의 세균을 플레이트에서 배양하여 군집을 얻은 후, 다른 분석을 위한 DNA를 추출하였다. 모든 양성 클론에서 IE 단백질 ICP0를 인코딩하는 HSV-2 ORF의 엑손 1, 인트론 1 및 엑손 2의 일부를 포함하는 1164 bp HSV-2Sau3AⅠ 인서트(도 3)가 존재하는 것을 확인하였다. 또한, ICP0의 ATG 시작 암호 5' 쪽의 445 bp 크기의 게노믹 DNA도 존재하는 것을 확인하였다. 다른 분석을 위한 대표적인 양성 클론으로 A1:H3:B8을 선택하였다.

A 및 B 리딩 레지스터 라이브러리(reading resister library) 모두에서 양성 게노믹 클론들에 벡터의 ATG 및 전술한 ICP0 ATG와 함께 세 개의 종결암호들이 프레임상에 존재한다는 것은 이들이 벡터의 CMV 프로모터 보다는 HSV-2 프로모터를 이용한다는 것을 의미한다. VP16(αTIF)이 결여되어 있을 경우 5' 요소들(elements)에 의한 프로모터 활성 및 "바이러스의 전후관계(viral context)"는 HSV-1 ICP0를 통해 설명될 수 있다.

에피토프의 발견을 위하여, HSV-1 ICP0의 mRNA가 Cos-7 세포내에서 스플라이스되어(spliced)있는지 여부를 분석하였다. (+) 게노믹 절편 A1:H3:B8(표 4)로 감염시킨 Cos-7 세포로부터 얻은 총 RNA를 주형으로 하고, MMLV RT 및 프라이머 C를 사용하여 cDNA를 합성하였다(도 3). PCR은 번역 개시점의 프라이머 A 및 프라이머 C를 사용하여 수행하였다. 8개의 cDNA 클론들의 서열에서는 모두 스플라이스되어 있는 것이 확인되었다. 억셉터 부위(acceptor site)는 아미노산 Q26이 제거되어 공지의 위치보다 3' 쪽으로 3 염기쌍 떨어진 부위임을 확인하였다. 에피토프를 더욱 상세히 밝히기 위하여, A-C(엑손 1, 엑손 2의 시작 부위) 및 A-B(엑손 1) PCR 산물을 pcDNA 3.1 벡터에 클로닝 시키고 인프레임(in frame) 발현을 분석하였다. T 세포 클론 RW51과의 반응성을 분석한 결과, 엑손-1-엑손-2 클론은 양성을 보였으나 엑손-1 클론은 음성을 나타내었다(표 4).

ICPO의 발현 클로닝 확인을 위하여 백시니아-ICP0(Manickan, E et al., J. Virol. 1995, 69(8):4711-4716)를 사용하였다(도 4).

결과

모든 HSV-특이적 CD8 클론들에서 IFN-γ의 분비가 확인되었다(표 3). 또한, 인터페론-감마의 분석은 HLA 한정에 대한 확인 실험으로 사용되었다. 클론 RW51은 HLA B*4501 및 HSV-2에 감염된 Cos-7 세포에 노출된 후 특이적으로 인터페론-감마를 분비하였으며, A*0201에 감염된 Cos-7에 노출된 경우에는 인터페론-감마를 분비하지 않았다(표 3).

병소에서 얻은 HSV-특이 CD8+ TCC(RW51)의 인터페론-감마 분비(pg/㎖ by ELISA).

여러 DNA 또는 펩타이드로 감염된 Cos-7 세포와 반응시킨 CD8 TCC RW51 의 인터페론-감마의 분비(pg/㎖ by ELISA). 5X10⁴TCC를 7X10³Cos-7 세포에 반응시키고 24시간 후에 분석함.

펩타이드를 효과적으로 선택하기 위하여, B45-한정 펩타이드들 및 B*4501에서 용출된 펩타이드들로부터 얻은 서열로부터 HLA B45 결합 모티프(motif)를 수득하였다. 상기 모티프는 2번 위치에 글루탐산(glutamic acid)을 가지고 있으며, 10번 위치는 소수성(hydrophobic)이다(Rammansee H-G, Current Opinion in Immunology 1995, 7:85-96). 펩타이드 ICP0 92-125(AERQGSPTPADAQG;서열번호 19)는 CTL(도 4) 및 인터페론-감마(표 4) 분석에서 활성을 나타내었다. 다른 엑손-2 펩타이드들은 활성을 보이지 않았다. 높은 EC₅₀값(∼1 μM)을 보이는 것은 카르복시 말단의 꼬리(carboxy-terminus tail)이 밖으로 뻗어 마치 펩타이드 결합 구르브(peptide-binding groove)처럼 작용하여 실제 HLA B*4501의 결합을 저해하기 때문이다. B. 라우스(Rouse)로부터 얻은 백시니아-ICP0(Manickan E et al., J. Virol. 1995, 69:4711-4716)를 성장시켜서 역가(titer)를 분석하였다(Koelle DM et al., J. Virol. 1994, 68:2803-2810). 클론 RW51은 백시니아-ICP0 타겟을 특이적으로 용해시켰다(도 4). 발현 클로닝 결과를 확인할 필요도 없이 백시니아의 유효성이 밝혀졌다. 에피토프를 정확히 밝히기 위하여, ICP0의 92-101번 아미노산(AERQGSPTTP;서열번호 6)을 포함하는 펩타이드를 합성하였다. 이 펩타이드의 IC₅₀는 1∼10 나노몰(nanomolar) 정도였다(도 5).

HSV-2에 감염된 환자가 그의 말초혈액 안에서 순환하고 있는 T 세포 항원에 반응성이 있는 T 세포를 가지고 있는지를 확인하기 위하여, 환자의 말초혈액 단핵구(PBMC; peripheral blood mononuclear cells)를 펩타이드로 자극하였다. PBMC는 2X10⁶세포/1.88 ㎠ 웰의 농도로 1.0 ㎍/㎖의 펩타이드 HSV-2 ICP0 92-101를 포함하는 2 ㎖의 T 세포 배양액에서 3일 동안 배양되었다. 배양 4일째에, IL-2(32 units/㎖)를 첨가하였다. 8일째에 세포들을 세척하고 2X10⁶자가(autologous), 3300 rad의 감마선으로 조사된 PBMC, 1.0 ㎍/㎖의 펩타이드(HSV-2 ICP0 92-101) 및 IL-2(32 U/㎖)를 첨가하여 다시 자극시켰다.

세포들을 IL-2의 존재 하에서 9일 동안 추가로 배양하여 필요한 만큼의 세포들을 얻었다. 펩타이드 HSV-2 ICP0 92-101을 1㎍/㎖로 18시간 동안 처리하거나 처리하지 않은, 또는 MOI 10의 HSV-2 333주를 18시간 동안 감염시킨 자가 또는 HLA 1형-미스매치드(mismatched) LCL을 이용하여 세포독성 분석을 수행하였다. 세포독성 분석에는 표준형의 4-hr⁵¹Cr 방출 분석을 사용하였다.

그 결과, 펩타이드 HSV-2 ICP0 92-101로 자극된 PBMC는 HSV-2에 감염된 세포에 세포독성을 보였으며, 이러한 활성은 HLA 1형-미스매치드 세포에 대해서는 나타나지 않았다(도 6). 비교를 위하여 T 세포 클론 RW51도 이 분석에 효과세포(effector cell)로서 사용하였으며 10:1의 에펙터:타겟 비율에서의 세포독성을 표시하였다(도 6).

<실시예 5> HSV-특이 CD8 CTL에 의해 인지되는 U _L 47 항원의 확인

본 실시예는 발현 클로닝을 통해 UL47 단백질에 대한 코딩 지역(coding region)에 포함되어 있는 DNA가 인코드하는 HSV 폴리펩타이드의 항원성을 증명하는 것이다. 발현 클로닝 및 라이브러리 제조에 대한 방법은실시예 4에 언급되어 있다.

발현 클로닝에는 dkRW22.1991을 사용하였다. 상기 클론은 HSV-2에 감염된, 자가 LCL에 대한 세포용해 활성(cytolytic activity)을 가지고 있다(표 1). CD8 TCC dkRW22.1991의 HLA-한정 대립유전자는 HLA A*0201이다. 따라서 Cos-7 세포들을 B*4501이 아닌 HLA A*0201로 감염시켰으며, 이어서 HSV-2로 감염시켰다. 상기와 같이 처리된 Cos-7 세포들은 dkRW22.1991의 인터페론-감마 분비를 특이적으로 촉진시켰다(표 5). 유세포 분석(flow cytometry)에 의한 dkRW22.1991의 표현형은 하기와 같다: CD(+), CD4(-), CD8(+), CD16 및 56(-), 및 T-세포 수용체 α/β(+).

결과

항원성 단백질의 스크리닝을 위하여, Cos-7 세포들을 9,000 세포/웰의 농도로 마이크로타이터 플레이트에 깔고, 24시간 후에 라이브러리 풀 및 A*0201 DNA(50 및 25 ng/웰)로 감염시켰다. 48시간 후에 클론된 T 세포들을 첨가하였으며,실시예 4의 방법에 따라 인터페론-감마 분석을 수행하였다. 그 결과, pcDNA3.1-his C 라이브러리 중에서 하나의 양성 풀을 발견하였다. 상기 양성 풀의 세균을 배지에 도말하고, 여기에서 생긴 96개의 군집으로부터 DNA를 추출하여 분석에 사용하였다. 인터페론-감마 분석을 통하여 하나의 양성 클론, C1F1C7, 을 발견하였다. 바이랄 인서트의 서열을 결정해 본 결과, HSV-2 게놈 뉴클레오타이드 102875-101383을 지닌 1.4 kb 길이의Sau3aⅠ 절편임을 확인하였다. 상기 서열은 HSV-2 U_L47의 C-말단 부위(아미노산 292-696), 짧은 간섭 부위(short intervening region) 및 HSV-2 U_L46의 N-말단 70 아미노산 지역을 인코드하고 있다.

항원성을 지닌 에피토프를 인코딩하는 HSV-2 DNA 지역을 상세히 밝히기 위하여, HSV-2의 U_L47 및 U_L46에 대한 전체 길이의 유전자를 열안정성 DNA 중합효소(thermostable DNA polymerase)를 이용한 PCR로 클로닝하였다. U_L47을 위한 프라이머로는 CTAGGATCCCCTCCGGCCACCATGTCC(5' 프라이머;서열번호 7) 및 CGATCTAGACCTATGGGCGTGGCGGGC(3' 프라이머;서열번호 8)을 사용하였고, U_L46을 위한 프라이머로는 CGAGGATCCGTCTCCGCCATGCAACGCCG(5' 프라이머;서열번호 9) 및CGCTCTAGATTTTAATGGCTCTGGTGTCG(3' 프라이머;서열번호 10)을 사용하였다. 각각의 경우에 있어서, 5' 프라이머에는BamHⅠ 부위(밑줄 친 부분)가, 3' 프라이머에는XbaⅠ 부위(밑줄 친 부분)가 클로닝을 용이하게 하기 위하여 삽입되어 있다.

PCR 산물들을BamHⅠ 및XbaⅠ으로 자른 후, 인-프레임 융합단백질(in-frame fusion proteins)를 얻기 위하여 pcDNA3.1-his-C 벡터에 클로닝시켰다. pcDNA3.1-his-C로 삽입된 HSV-2 유전자의 5'-말단에 위치하는 융합 지역의 서열을 분석하였다. 또한, 원래의 양성 클론 C1F1C7에 포함되어 있는 모든 U_L46 코딩 서열을 제한효소로 자르고 재결합시킴으로써 제거하였다. 상기 과정을 통하여 조제된 콘스트럭트(construct)를 C1F1C7-ApaⅠ(-)라 명명하였다.

병소에서 얻은 T 세포 클론들의 반응성을 검사하기 위하여, Cos-7 세포들을 A*0201 DNA 및 HSV-2 또는 상기의 콘스트럭트로 감염시켰다. 항원은 HSV-2의 U_L47을 인코딩하는 DNA에 의해 인지되는 것을 확인하였다. 즉, 클론 C1F1C7-ApaⅠ(-)는 양성을 나타내었다. 상기 클론은 모든 U_L46 서열이 제거되어 있는 것이므로, U_L46은 인지 과정과 관련이 없음을 확인할 수 있었다. 또한, U_L46이 아닌 전체 길이의 U_L47을 A*0201과 함께 Cos-7 세포에 감염시켰을 경우, 이 세포들은 dkRW22.1991의 인터페론-감마 분비를 특이적으로 촉진시킨다는 것을 확인하였다.

HLA-1형 중쇄(heavy chain) cDNA 및 MOI(multiplicity of infection) 5 정도의 HSV-2로 감염된 Cos-7 세포들과 반응시킨 TCC dkRW22.1991에서의 인터페론-감마 분비 양상.

HLA A*0201 및 HSV-2로 감염된 Cos-7 세포들과 반응시킨(양성 대조군), 또는 HLA A*0201과 HSV-2 게놈의 특정 단편을 포함하고 있는 진핵 발현벡터로 동시에 감염된 Cos-7 세포들과 반응시킨 TCC dkRW22.1991에서의 인터페론-감마 분비 양상.

<실시예 6> HSV-특이 CD8 CTL에 의해 인지되는 항원으로서 U _L 47의 289-298, 551-559 및 551-561 아미노산의 확인

재료 및 방법

세포주 및 바이러스: EBV-LCL은 PBMC로부터 제조하여 사용하였으며; ARENT, PITOUT, HERLUF, 및 KAS011은 G. Nepom으로부터 제공받아 사용하였다. HSV-1 E115, HSV-2 333, HG52 및 재조합 vac-ICP0-HSV-2는 B. Rouse로부터 제공받았으며, 야생형의 백시니아 NY는 Vero 또는 BSC-40 세포에 감염시켜 증식시키고 그 역가를 측정하였다.

HSV-특이 T 세포는 HSV-2 배양 실험에 양성을 보인 엉덩이 부위의 병소로부터 수득하였다. 생검은 증상이 나타난지 5일째의 병소 또는 포진성 수포액(herpetic vesicle fluid)을 이용하여 수행되었다. 림프구들은 PHA 및 IL-2의 존재 하에서 증식되었으며, CD8 세포들을 이뮤노마그네틱 비드(immunomagnetic beads; Minimacs, Miltenyi)를 이용하여 분리하고 클로닝시켰다. HV 환자에서는 생검 조직을 콜라게나제(collagenase) Ⅳ-S(Sigma)에서 37℃, 5시간 동안 용해시키고, 그 결과 생긴 세포 현탁액을 단계적으로 10배씩 희석하여 클로닝시켰다. 클론들을 항-CD3 mAb, IL-2 및 피더(feeders)의 존재 하에서 증식시켰다. 4X10⁶PBMC를1 ㎍/㎖의 펩타이드와 함께 배양하였다. 3일 후에, 10 U/㎖의 인간 재조합 IL-2(Chiron)를 첨가하였다. 7일 후에, 세포들을 세척한 후, 2X10⁶개의 새로운, 감마선 조사된 자가의 PBMC, 펩타이드 및 IL-2와 함께 다시 배양하였다. 세포들에 대한 분석은 14-21일 사이에서 수행되었다.

발현 클로닝(expression cloning): HSV-2의 게노믹 DNA를Sau3AⅠ으로 자른 후, 클레나우 절편(Klenow fragment), dTTP 및 dCTP와 함께 부분적 필인(partially filled-in)을 수행하였다. 플라스미드 pcDNA3.1(+)myc-his A, B, 및 C(Invitrogen)를 XhoⅠ으로 자른 후, dATP 및 dGTP와 함께 부분적 필인을 수행하였다. 라이게이션(ligation) 후에, DNA를 대장균 균주인 DH10B로 일렉트로포레이션(electroporation)시켰다. 각각의 라이브러리는 수천개의 일차 형질전환체를 포함하고 있는데, 이들의 대부분을 즉시 증폭시킨 후(4 ㎖의 LB-amp에서 하룻밤 동안) 분주하여 보관하였다. 무작위적으로 선택한 클론 모두에서 단일가닥의 HSV-2Sau3AⅠ절편이 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 감염(transfection)을 위한 DNA를 제조하기 위하여, 15군집/웰의 농도로 플레이팅한 후 하룻밤 동안 증식시키고, DNA를 추출하였다.

HLA A*0201, B*4402, B*4403, 및 B*4501 cDNA를 제조하기 위하여 LCL로부터 총 RNA를 추출하였다. cDNA는 올리고-dT 및 MMLV 역전사효소를 사용하여 합성하였다. pfu DNA 중합효소, 2.5 mM의 dNTP, cDNA 및 HLA 중쇄에 상보적이며KpnⅠ 또는XbaⅠ의 말단부위를 포함하는 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행하였다. 앰플라이머(amplimers)들을KpnⅠ 및XbaⅠ으로 자른 후 pcDNA3.0으로 통합시켰다. 인서트의 서열은 유전자은행의 서열과 일치함을 확인하였다.

ICPO의 일부를 포함하고 있는 양성 게노믹 클론으로부터 유래된 cDNA를 분석하기 위하여, Cos-7 세포들을 ICP0 게노믹 클론으로 감염시키고, 48시간 후에 총 RNA를 추출하였다. ICP0 게노믹 클론상의 HSV-2 DNA의 3'-말단 부위의 서열로부터 얻은 프라이머(TGCTCTAGAGACTCGATCCCTGCGCGTCGG,XbaⅠ 부위를 포함;서열번호 11) 및 MMLV 역전사효소를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 스플라이싱의 분석은 pfu DNA 중합효소, cDNA, 상기의 3' 프라이머 및 5' 프라이머(TAAGGTACCTGAACCCCGGCCCGGCACGAGC,KpnⅠ 부위 포함;서열번호 12)를 사용한 PCR로 수행하였다. 상기의 5' 프라이머 및 3' 프라이머(TGCTCTAGACCAGGCGTGCGGGGCGGCGGG,XbaⅠ 부위 포함;서열번호 13)을 이용한 PCR을 수행하여 ICP0의 엑손 1을 분리하였다. PCR 산물은 pcDNA3.1-his-B로 클로닝시켰다.

서열번호 7및8로 기재되는 프라이머들을 사용한 PCR을 수행하여 전체 길이의 HSV-2 U_L47을 pcDNA3.1-his-C로 클로닝시켰다. 또한,서열번호 9및10으로 기재되는 프라이머들을 사용한 PCR을 수행하여 전체 길이의 HSV-2 U_L46을 pcDNA3.1-his-C로 클로닝시켰다. U_L47의 1-595 및 1-640 아미노산 지역을 발현하는 콘스트럭트들도 역시 상기의 방법에 의해 제조되었다. U_L47의 1-535 및 536-696 아미노산 지역을 발현하는 콘스트럭트들은 535번 아미노산에 위치하는 자연형의NotⅠ 부위를 이용하여 제조되었다. 인-프레임 융합은 서열을 분석하여 확인되었다.

림프구의 기능적 분석(Lymphocyte functional assays): CTL 분석은 표준적인 4-hr⁵¹Cr 방출 분석으로 수행되었다. 타겟 EBV-LCL을 MOI 10인 HSV로, 20:1의 에펙터:타겟 비율로 18시간 동안 감염시켰다. 10 ㎍/㎖의 항-1형 mAb W6/32가 사용되었으며, 액티노마이신(actinomycin) D는 5 ㎍/㎖의 농도로 30분 동안의 전감염(pre-infection)시, 90분간의 감염시, 세척시 및 분석기간 동안에 바이러스 RNA 발현에 대한 저해 효과를 측정하기 위하여 사용되었다.

HSV-반응성 CD8 CTL에서의 인터페론-감마의 분비는 발현 클로닝에서 기능적 HLA cDNA의 분리를 확인하기 위한 지표로서 사용되었다. Cos-7 세포들을 9,000 세포/웰의 농도로 편평한 바닥을 가진(flat-bottom) 96-웰 플레이트에 깔고, 다음날, 50 ng의 HLA cDNA(Fugene-6)로 감염시켰다. 3일째에 세포들을 HSV-2 333으로 감염시키고, 4일째에는 0.7-1.0X10⁵개 정도의 클론된 CD8 T 세포들을 첨가하였다. 5일째에 상등액(supernatants)을 수확하여 보관하였다.

라이브러리의 스크리닝을 위하여, Cos-7 세포들을 50 ng의 HLA cDNA 및 100 ng의 라이브러리 DNA로 동시감염 시켰다. 이틀 후에, 웰당 1X10⁵개의 클론된 T 세포들을 첨가하고 다시 24시간 후에 상등액을 수확하였다. 양성 풀들을 파쇄시켜 활성을 지닌 세균 클론들을 확인하였다. 활성 클론에 포함되어 있는 HSV-2 DNA의 서열을 분석하였다.

유세포분석(Flow cytometry): 림프구들을 CD3, CD4, CD8, CD16/56, TCR αβ, 또는 TCR γδ에 대한 표지된 단클론항체로 염색하였다. 감염된 Cos-7 세포들에서의 HLA 발현을 측정하기 위하여, 세포들을 트립신(trypsin)으로 처리하고, HLA B*4501에 반응하는 단클론항체(FITC-labeled mAb B12, One Lambda, Inc) 1 ㎍ 또는 HLA A*0201에 반응하는 단클론항체(mAb MA2.1)와 혼합하였다. 그 후, FITC로 표지된 염소 항-생쥐 IgG를 반응시켰다.

HLA 타이핑(typing): HLA B44 대립유전자를 규명하기 위하여, 여러 엑손들(exons)에 대한 직접적인 서열분석을 수행하였다.

ELISA: 엔도젠(Endogen) 사의 시약들을 사용한 ELISA를 수행하여 인터페론 -감마를 측정하였다. 0.25 ㎍/㎖의 단클론항체 M700A-E 100 ㎕로 플레이트를 코팅한 후, 1% BSA가 포함된 TBS(0.2 M NaCl, 3 mM KCl, 0.05 M Tris, pH 9) 용액으로 차단반응(blocking)을 1시간 동안 실시하였다. PBS/0.2% Tween-20으로 3-5회 실온에서 세척하였다. 0.1% BSA, 0.05% Tween-20 및 4 ㎍/㎖의 이뮤노글로불린 저지 시약(immunoglobulin inhibition reagent) #6LD1068(Bioreclamation, Inc., East Meadow, New York)을 포함한 TBS(sample buffer)로 희석한 시료 및 대조군을 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. M701B(biotinylated detection mAb, 100 ng/㎖ in sample buffer)를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 1% BSA, 0.05% Tween-20을 포함한 TBS로 희석한 AvidinD:HRP(A-2004, 100 ng/㎖)를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. TMB 기질을 첨가하여 10분간 반응시켰다. 이 때 검출 한계는 2-10 pg/㎖ 이었다.

결과들을도 7-10및표 7-9에 나타내었다.

병소-침투성(lesion-infiltrating) CD8 CTL은 ICP0 또는 U_L47을 비교적 초기에 인지하는 것으로 나타났다. 또한, HSV-2 U_L47 289-298/A*0201-특이 CD8 CTL은 HLA B*4402 및 B*4403에는 교차반응을 보였으나, B*4405에는 교차반응을 보이지 않았다. TCR은 B44 대립유전자와 더불어 인간 및 영장류 신장상피세포(renal epitherial cells) B 세포 상에 존재하는, 현재까지 정확히 알려져 있지 않은 하우스키핑(housekeeping) 펩타이드를 인지한다. 상기의 결과는 B*4402 또는 *4403이아닌 A*0201형의 사람으로부터 얻은 간세포(stem cells)를 HSV에 감염된 A*0201형의 사람에게 이식하는 경우의 GVDH 및 B*4402 또는 B*4403을 포함하는 기관들이 HSV-2에 감염된 A*0201형의 사람에게 이식될 경우 나타나는 거부반응(graft rejection)을 교차 반응성을 지닌 T 세포들이 조정한다는 것을 암시한다.

<실시예 8> HSV-특이 CD8 CTL에 의해 인지되는 항원으로서 U _L 47의 548-557 아미노산의 확인

CD8+ T 세포 클론인 cpRW22이 HSV-2 유전자 U_L47로부터 유래된, HLA-A2에 결합성이 있는 여러 합성 펩타이드들을 인지하는지를 실험하였다. 상기 펩타이드들 중 하나가 cpRW22에 의해 인지된다는 것을 IFNγ ELISPOT 분석을 통해 확인하였다. 상기 펩타이드는 NH₂-RLLGLADTVV-COOH(서열번호 18)의 서열을 가지고 있었으며 이는 U_L47의 548-557 아미노산에 해당하는 것이다.

최적의 타겟 펩타이드를 밝히기 위하여, U_L47/548-557에 중첩되는 10-머(UL47/549-558, 550-559, 551-560 및 552-561) 및 9-머(U_L47/548-556, 549-557, 550-558, 551-559 및 552-560)의 펩타이드들을 합성하였다. 이들 중에서, 하나의 9머(U_L47/551-559) 및 두 개의 10머(U_L47/550-559, 551-560) 펩타이드들이ELISPOT 분석에서 낮은 농도에서도 강한 양성을 나타내었다(도 11A및11B). U_L47/550-559 및 U_L47/551-559는 모든 농도에서 비슷한 반응성을 보였다.

<실시예 9> 자연형 항원으로서 U _L 47의 550-559 아미노산의 확인

자연적으로 형성되는 U_L47 펩타이드를 결정하기 위하여, 1X10¹⁰개 정도의 C1R-A2/3D9.6H7 세포로부터 A2 분자들을 정제하고, 산-용출(acid elution)을 이용하여 붙어 있는 펩타이드들을 떼어내었다. 상기 펩타이드들을 하기의 조건하에서 HPLC 칼럼상에서 분주하였다(TFA ion-paring agent; 0-10% acetonitrile over 5 mins, 10-45% ACN over 50 mins, 45-60% ACN over 5 mins). 분주된 분획(fractions)들의 cpRW22 T 세포에 의한 인지를 위한 T2 타겟에 대한 감수성(sensitivity)을 IFN-감마 ELISPOT 분석을 통하여 검사하였다. 타겟으로 사용된 T2 세포들(20,000)은 각 분획의 5%와 4시간 동안 32℃의 혈청이 포함되어있지 않은 배양액(3 ㎍/㎖의 HuB2M 포함)에서 반응시켰다. 그 후 T2 세포들을 2회 세척한 후, ELISPOT 플레이트의 2개의 웰에 10,000개씩 분주하였다. 반응세포(responders)로는 20,000/웰의 CTL 클론 cpRW22를 사용하였다.

분획 번호 17, 18 및 23에서 활성을 나타내었다(도 12). 17번 및 18번 분획을 하기의 조건으로 HPLC 칼럼상에서 부-분획(subfraction)화 시켰다(HFBA ion-paring agent; 0-10% ACN over 5 mins, 10-35% ACN over 50 mins, 35-60% ACN over 5 mins). 24번 및 25번 부분획에서 cpRW22에 의한 인지에 필요한, T2 세포에 대한 감수성을 확인하였다(도 13B;도 13A및13C와 비교). 23번 분획도 상기와 같이 부분획화 시켰다. 37번 부분획이 cpRW22에 의한 인지에 필요한, T2 세포에 대한 감수성을 나타내는 것을 IFN-감마 ELISPOT 분석을 통하여 확인하였다(도 14). U_L47/551-559, 550-559 및 551-560 펩타이드들을 상기의 부분획화 시킬 때의 조건으로 HPLC를 수행한 결과, U_L47/550-559는 37번 분획에서(도 15A), U_L47/551-560은 40/41번 분획에서(도 15B), U_L47/551-559는 32번 분획에서(도 15C) 용출되는 것을 확인하였다.

C1R-A2/3D9.6H7 세포들로부터 유래한 자연적으로 형성된 펩타이드와 U_L47/550-559가 같은 분획(37번)에서 용출되는 것으로 보아, U_L47/550-559의 서열은 자연적으로 형성된 펩타이드의 서열과 같을 것으로 사료된다. 23번 분획/37번 부분획에 대한 MS/MS 데이터는 분자량 961의 펩타이드가 존재한다는 것을 보여준다(도 16). U_L47/550-559의 분자량이 961이므로, 이는 U_L47/550-559가 자연적으로 형성되는 U_L47 펩타이드라는 증거이다.

U_L47/550-559 펩타이드의 아미노산 서열은 LGLADTVVAC(서열번호 1)이다.C1R-A2/3D9.6 세포에는 U_L47/550-559 펩타이드를 인코드하는 HSV-2의 유전자 단편이 포함되어 있다는 것이 pBIB 리트로바이랄 벡터의 클로닝 부위 및 UL47/550-559를 인코딩하는 DNA의 인접 지역에서 만들어진 프라이머들을 사용한 PCR에 의해 증명되었다(도 17). 상기의 프라이머들을 사용하면서 PCR 조건들을 변화시키면서 PCR을 수행해 본 결과, C1R-A2/3D9.6H7 세포에는 HSV-2에서 유래한 적어도 2개의 리트로바이랄 인서트가 포함되어 있음을 확인하였다(도 18A-C). 한 인서트는 U_L52 유전자의 두 절편을 인코드하며, 다른 하나의 인서트는 U_L47/550-559 펩타이드를 인코딩하는 부위를 포함한 U_L47 유전자의 많은 부분을 인코드한다.

<실시예 9> HSV-특이 CD8 CTL에 의해 인지되는 항원의 확인 방법

본 실시예는 병소에서 유래한 시료를 사용하여 HSV-특이 CD8 CTL에 의해 인지되는 단백질을 확인하는 방법에 관한 것이다.

HSV-2에 감염된 생식기/엉덩이 병소로부터 HSV-특이 CD8 T 세포들의 분리

세척 및 마취후에 직장 주위(perirectal), 엉덩이 및/또는 허벅지 피부로부터 3-4 ㎜의 생검 시료를 채취하였다. 일차적 허피스의 감염이 의심되는 병소를 가능한 한 빠른 시간에 생검하였다. 일차적 허피스 감염에 있어서 적어도 2회의 단계적 생검을 실시하는 것이 바람직하다. 재발성 생식기 HSV-2에 감염된 병소의경우는 치료기(궤양 말기/딱지)의, 높은 CTL 활성을 가지고 있는 병소에서 항원/에피토프 확인을 위한 실험을 수행하는 것이 바람직하다. 면역조직학(immunohistology)용 OCT 배양액에 들어 있는 병소의 조각은 이소펜탄/액체질소(isopentane/liquid nitrogen)에서 순간적으로 냉동시킬 수 있다. 생검 시료 조각으로부터 세포들을 분리하여 제한희석(limiting dilution)으로 증식시키거나, 조각 자체를 벌크 상태로 배양할 수도 있다(Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998, 101:1500-1508). 조직을 잘게 짤라서 벌크 상태로 LIL을 증식시키고, 0.8 ㎍/㎖의 PHA 및 아시클로버(acyclovir)를 50 μM로 포함하고 있는 T-세포 배양액에 있는 PBMC(7.5X10⁵세포/웰)로 자극하였다. IL-2(50 U/㎖)를 사용하여 증식을 촉진시켰으며, 일반적으로 배양 후 14-21일에 1-5X10⁷세포를 수확하였다. 에펙터:타겟 비율 20:1에서 4-hr⁵¹Cr 방출 분석(Tigges MA et al., J. Virol. 1992, 66:1622-1634)을 수행하여 자가(autologous) 및 동계(allogenic)의 대조군 및 HSV-2에 감염된 LCL에 대한 CD8 세포의 CTL 활성을 측정하였다. 상기 단계에서 HSV-특이 CD8 CTL 클론들의 회수 정도로 용균 활성을 예측할 수 있다.

벌크 배양(bulk culture)에서 잘 성장하지 않는 CD8 CTL 또는 CTL의 회수율을 증가시키기 위하여, 초기의 벌크 증식 단계를 생략할 수 있다. 감염이 진행되는 동안 HSV-2에 감염된 병소는 포진형으로 나타난다. 이 경우 HSV-특이 CD8 CTL은 이 포진의 수포액(vesicle fluid)으로부터 클론될 수 있다. 구체적으로, 수포들을 터뜨린 후, 스크래퍼(cell scrapers)를 이용하여 수포액을 배양액으로 모은다. 피콜(Ficoll)을 이용한 농도구배 원심분리(density gradient centrifugation)로 세포들을 모은 후 세척하고 클로닝 칵테일(cloning cocktail)이 들어 있는, U-자형 바닥을 지닌 96-웰 플레이트에 100-1 세포/웰이 되도록 희석하여 플레이팅하였다. 포진으로부터 회수되는 세포의 수는 병소당 1X10⁴-2X10⁵정도였다.

T-세포의 클로닝에는 공지의 방법을 사용하였다(Koelle DM et al., J. Infect. Dis. 1994, 169:956-961). LIL의 벌크 증식으로부터 얻은 CD8 세포들을 2 및 0.3 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 병소의 생검 시료 또는 수포액으로부터 수확한 세포들을 30-100 세포/웰의 농도에서부터 제한희석하여 1 세포/웰까지 1/2-3으로 감소시켰다(Koelle DM et al., J. Infect. Dis. 1994, 169:956-961). CD8이 풍부한 신선한 LIL 및 수포 세포들에 있어서 그 비율은 벌크 상태에서 증가될 수 있다(Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998, 101:1500-1508). 미소배양들은 일주일에 2회씩 IL-2를 첨가하고, -14일째에 스크리닝 하였다. 성장을 보이는 웰의 비율을 기록하여 미소배양에서의 클론화율을 측정하였다.

후보 배양의 스크리닝(Screening candidate culture)

후보 배양의 스크리닝을 위한 바람직한 방법은 HSV-2로 감염시킨(MOI 10으로 18시간 동안) 또는 감염시키지 않은 자가(autologous) LCL에 대한스플리트-웰(split-well) CTL 분석법이다. LCL은 EBV를 이용하여 형질전환시킨 B-세포주(EBV-transformed B-cell line(Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1993, 91:961-968)로서, PBMC로부터 LCL을 확립하는데는 약 6주가 소요된다. LCL에는 HSV의 감염이 일어나기는 하지만, 섬유아세포에 비해 HSV에 의한 HLA 1형의 다운레귤레이션(downregulation)에 상당한 저항성을 가지고 있다. 모든 환자로부터 생검전에 LCL이 준비되었다. 따라서, 스크리닝을 위한 TCC가 준비되었을 경우 LCL도 역시 준비되어 있다. 자가의 HSV-2는 베로세포(Vero cells)에서 증식 및 분리시키고 역가를 결정하는 것이 바람직하다(Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1993, 91:961-968).

벌크 상태로 증식시킨 LIL로부터 유래된 클론들에서, 37% 또는 그 이하의 웰에서 성장 양성을 보이는 것을 잠재적 "클론"이라 표현하였다. 각 미소배양의 절반을 둘로 나누어 2X10³의 타겟 세포들과 함께 에펙터:타겟의 비율이 ∼15:1이 되도록 플레이팅하였다(최종적으로 배양/분석 웰의 1/8). 감염시키지 않은 타겟 세포들을 용해시키는 정도에 비해 HSV-2로 감염시킨 타겟 세포들을 용해시키는 정도가 15% 이상인 클론들을 양성으로 판정하였다. CTL 활성을 가진 클론들을 유세포분석으로 분석하였으며, CD8을 포함하는 CTL 클론들을 증식시켰다. 병소의 생검 시료 및 수포액의 미소배양을 제한희석하여 증가시켰다. 초기의 벌크 상태의 증식이 없을 경우, 미소배양에 "비슷한(sister)" 클론들을 포함할 가능성은 적어질 것이지만서로 다른 미소배양에서 동일한 세포들이 각각 독립적으로 회수될 가능성은 여전히 존재한다.

CTL 활성을 가진 배양의 증식(Expanding cultures with CTL activity)

스크리닝 과정에서 양성으로 판정된 T 세포들을 리델 등의 방법으로 증식시켰다(Riddell et al., Nature Medicine 1996, 2:216-223; U.S. Patent No. 5,827,642). 원래의 미소배양 웰에 "남은(leftover)" 반 정도의 세포들(∼5X10⁴)을 25 ㎖의 T-세포 배양액(Koelle DM et al., J. Infect. Dis. 1994, 169:956-961)에서 3300 rad로 조사된 2.5X10⁷의 동계의 PBMC, 8000 rad로 조사된 5X10⁶LCL 및 30 ng/㎖의 mAb OKT3(항-CD3)와 혼합시켰다. 24시간 후에, 그리고 일주일에 2번씩 rhIL-2(50 U/㎖, Chiron, Emeryville, CA)를 첨가하였다. OKT3는 배양 4일째에 제거하였다. 첫 번째 배양 주기를 거치면 세포들은 ∼1-5X10⁷정도로 증가하였다. 12일째에 세포들이 느리게 성장하는 것이 육안으로 보일 즈음에 CTL 분석을 수행하여 CTL 활성을 확인하였다. 두 번째 배양 주기를 거쳐 다시 200-1000배로 증식시킨 세포들을 분주하여 보관하면서 다음 실험을 진행하였다. 냉동 보관된 CTL 활성을 보이는 증식된 세포들의 일부를 녹여 증식시킨 후, 사이토카인(cytokine) 분석을 수행하였다. 이 과정에서 10-20%의 클론들은 증식되지 않았다; 항원특이성이 소실되는 경우는 거의 없었으나 증식 능력의 소실은 가끔 발견되었다.

발현 클로닝에는 Cos-7 동시감염법을 이용하였다. 서열이 결정된 HSV-2 스트레인인 HG52의 DNA를Sau3AⅠ을 이용하여 자른 후, pcDNA3.1(+)his 계열의 각 플라스미드에 통합시켰다. 발현 클로닝을 위해 필요한 경우에는 HLA 1형 중쇄를 인코딩하는 cDNA를 RT-PCR을 수행하여 pcDNA3.0으로 클로닝시켰다. 상기 과정은 공지의 방법을 사용하여 실시하였다(Ennis PD et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2833-2837). 타겟의 서열에는 존재하지 않는 제한효소 부위를 포함하는 "꼬리(tails)" 부분과 완전히 일치하는 대립유전자-특이 프라이머들이 사용되었다. 원하지 않은 중쇄 PCR 산물(종종 함께 증폭된다)은 PCR 산물을 바람직하지 않은 cDNA를 우선적으로 자를 수 있는 제한효소로 처리함으로써 줄일 수 있다. cDNA 기능의 분석은 1)48시간 동안 대립유전자-특이 단클론항체로 감염시킨 Cos-7에서 발현된 모든 세포 표면 항원들을 검사, 및 2)HSV-2 항원의 발현을 검사함으로써 이루어진다.

라이브러리당 스크리닝하는 클론들의 수는 라이브러리 제조시에 만들어진 제한 단편들(restrictopn fragments)의 수에 의해 결정되지만, 대개는 수천개 정도이다. 풀의 크기(Cos-7 세포의 웰당 감염된 클론의 수)는 ∼15 바이랄 DNA 단편/웰에서부터 시작된다. 양성 풀들을 파쇄하여 각각의 클론을 분석하였다. 양성 클론들의 서열을 분석하여 공지된 HSV-2의 서열과 비교함으로써 항원들을 확인하였다.

에피토프 맵핑(Epitope mapping)

에피토프 맵핑은 분자적(molecular), 생물정보학적(bioinformatic) 및 합성(synthetic) 방법에 의해 수행되었다. 상기의 게노믹 라이브러리 스크리닝에 의해 25-300개의 아미노산으로 이루어진 양성의 유전자 단편들이 얻어졌다. 양성 클론내의 HSV-2 코딩 서열들은 엑소뉴클레아제(exonuclease) Ⅲ를 처리함으로써(Gavin MA et al., J. Immunol. 1993, 151:3971-3980) 길이를 줄일 수 있다. 즉, 상기의 제한효소로 HSV-2 인서트의 말단 또는 내부의 제한효소 부위를 잘라서 플라스미드를 재조립(reconstruction)할 수 있다. 양성 콘스트럭트(construct)의 일부를 다시 증폭시키기 위한 PCR에는 교정형 중합효소(proof-reading polymerase)를 사용하는 것이 바람직하다. 끝을 자르는 것은 50-100개의 아미노산으로 이루어진 양성 단편을 얻기 위하여 고안되었다. 모티프-매칭(motif-matching) 펩타이드에서는 펩타이드의 N-말단의 "P-1" 부위가 TCR에 빈번히 "노출(face up)"되며 또한 이 부위는 T-세포 자극에 필수적이므로 합성 펩타이드의 P1 "앵커(anchor)"는 잔기(residue) 2에 위치시켰다. 모티프가 알려져 있지 않은 경우에는 5개의 아미노산이 중첩되는 15-머의 펩타이드를 제조하였다. CTL 및/또는 인터페론-감마 분석에서 펩타이드는 1 및 10 μM의 농도로 사용되었다.

상기 방법으로 에피토프를 확인하지 못할 경우에는 활성 HSV-2 콘스트럭트의 양 쪽 말단을 분자적으로 "트리밍(trimming)" 함으로써 최소 코딩 서열(minimal coding sequence)을 밝힐 수 있다(Schneider J et al., Int. J. Cancer 1998,75:451-458). 상기 펩타이드가 CTL 분석에서 음성을 나타낼 경우에는 번역 후 변형(post-translational modification) 과정이 필요하다. 분자유전학적 방법에 의해 양성으로 판정된 펩타이드를 일렉트로포레이션(electroporation) 또는 삼투 충격(osmotic shock)으로 APC내에 로딩하였다(Chen W et al., J. Immunol. Methods 1993, 15:49-57).

<실시예 10> HLA-B45에서 ICP0 자극에 대한 CTL 반응

본 실시예는 ICP0 92-101 펩타이드에 대한 CD8+ T 세포의 반응이 HLA-B45 양성인 제공자자에서 검출된다는 것을 증명하는 것이다.

CTL의 검출에는 벌크 상태에서 펩타이드를 재자극하는 것으로도 충분하지만, 병소유래항원(lesion derived antigen, LDA)의 검출에는 더 많은 세포의 증식이 요구된다. 본 실시예에서는 2 ㎖의 T-세포 배양액에 들어 있는 4X10⁶PBMC를 1 ㎍/㎖의 HSV-2 펩타이드로 자극시키고, 배양 3일째에 IL-2(10-30 U/㎖)를 첨가하였다. 8일째에 세포들(responders)을 세척하고, 감마선 조사된 자가의 PBMC 2X10⁶, 새로운 펩타이드 및 IL-2로 다시 자극시켰다. 14-16일째에 CTL 분석을 수행하여 HLA 한정 CD8 CTL의 파괴 정도, HSV-2에 감염된 세포의 사멸 정도 및 항-1형 mAb에 의한 저해 정도를 측정하였다(표 10).

HSV-2 ICP0 92-101 펩타이드로 자극된 PBMC 또는 양성대조군 클론 RW.1997.51에 의한 HLA B*4501의 파괴 정도. 결과들은 10:1-20:1의 에펙터:타겟 비율에서 수행된 4-hr CTL 분석 결과를 퍼센트 특이적 방출(percent specific release)로 나타낸 것이다.

¹ICP0 92-101을 1 ㎍/㎖로 90분 동안 처리 또는 MOI 5의 HSV-2를 18시간 동안 감염시킨 타겟 LCL(RW=B*4501, HV=not B*4501).

²항-HLA 1형 단클론항체 W6/32를 10 ㎍/㎖의 농도로 포함.

<실시예 11> HLA-A2에서 U _L 47 자극에 대한 CTL 반응

본 실시예는 U_L47 펩타이드 550-559에 대한 CD8+ T 세포의 반응이 HLA-A2 양성인 제공자에서 검출된다는 것을 증명하는 것이다.

HSV-2 스트레인 333의 게노믹 DNA로부터 U_L47 유전자를 PCR로 증폭시켜 pBIB 레트로바이랄 벡터에 클로닝시켰다. 여러 U_L47/pBIB 클론들로부터 DNA를 얻어 HLA-A2를 안정적으로 발현하는 세포인 VA13에 감염시켰다. 상기와 같이 형질전환된 세포들은 U_L47/550-559에 특이적인, HLA-A2-한정 CTL 클론인 cpRW22에 의해 인지된다는 것을 확인하였다(도 19). U_L47/550-557 펩타이드를 처리한 VA13/A2 세포들이 양성대조군으로 사용되었다.

여러 HLA-A2 양성인 제공자들(RW1874, HV5101, AD116, AD120 및 AD124; 이들 중 일부는 HSV-2에 대해 양성인 혈청형을 지님)로부터 얻은 PBMC에 U_L47-특이 CD8+ T 세포가 존재하는지를 검사하였다. 이전에 RW1874로부터 U_L47/550-559에 특이적인, HLA-A*0201-한정 CTL 클론인 cpRW22를 얻었다. HSV-2의 U_L47/289-298(FLVDAIVRVA;서열번호 20)에 특이적인, A2-한정 클론인 HV2는 제공자 HV5101로부터 얻었다. 따라서, RW1874 및 HV5101의 PBMC에는 U_L47에 특이적인 CD8+ T 세포가 존재할 것으로 판단할 수 있다. PBMC들을 세 개의 A2-한정 에피토프들(인플루엔자 M1/58-66, U_L47/289-298 또는 U_L47/550-559) 중의 하나로 인비트로(in vitro)상에서 2회 자극시켰다(1 ㎍/㎖).⁵¹Cr-방출 분석법을 사용하여 T 세포들을 검사하였다. 모든 제공자들은 HIV-음성이었다.

결과들을도 20A-L에 나타내었다. RW1874는 M1 및 U_L47/550-559 펩타이드에 반응을 보였으며(도 20A-C), HV5101은 세 종류의 펩타이드 모두에 대해 반응을 보였다(도 20D-F). AD120은 세 종류의 펩타이드 중 어느 것에 대해서도 반응을 보이지 않았는데(도 20G-I), 이는 AD120에는 매우 다른 A2 아형(subtype)이 존재한다는 것을 의미한다. AD124는 두 가지 종류의 U_L47 펩타이드에 대해서는 반응을 보이지 않았으나 M1에 대해서는 반응을 보였는데(도 20J-L), 이는 AD124가 HSV에 대해 음성인 혈청형(seronegative)을 가지고 있기 때문인 것으로 사료된다. 상기 결과들을표 11에 요약하여 나타내었다.

U_L47 에피토프들에 대한 CD8+ T 세포 반응의 요약.

Claims

ICP0 또는 U_L47 단백질 또는 그 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 전달체로 구성된 허피스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 단편은 ICP0의 92-101번 아미노산 또는 그 변이체로 구성되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 단편은 U_L47의 289-298, 548-557, 550-559, 551-559 또는 551-561번 아미노산 또는 그 변이체로 구성되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 폴리펩타이드는 융합 단백질(fusion protein)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 융합 단백질은 수용성인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 증강제(adjuvant)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
ICP0의 92-101번 아미노산, U_L47의 289-298, 548-557, 550-559, 551-559 또는 551-561번 아미노산, 또는 그 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드.
제 7항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
제 8항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 9항의 숙주세포를 배양하는 단계 및 배양된 세포에서 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 단계로 구성되는 HSV 폴리펩타이드의 생산방법.
제 10항의 방법에 의해 생산된 HSV 폴리펩타이드.
ICP0 또는 U_L47 또는 그 단편을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드, 및 약학적으로 허용 가능한 전달체를 포함하는 약학적 조성물.
제 6항의 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용 가능한 전달체를 포함하는 약학적 조성물.
ICP0의 92-101번 아미노산, U_L47의 289-298, 548-557, 550-559, 551-559 또는 551-561번 아미노산 또는 그 변이체를 발현하도록 유전학적으로 변형된 재조합 바이러스.
제 14항에 있어서, 바이러스는 백시니아(vaccinia) 바이러스, 카나리 폭스(canary pox) 바이러스 및 아데노바이러스(adenovirus)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 재조합 바이러스.
제 14항의 바이러스 및 약학적으로 허용 가능한 전달체를 포함하는 약학적 조성물.
증강제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제 12, 13 또는 제 14항의 약학적 조성물.
면역세포를 ICP0 또는 U_L47 단백질 또는 그 변이체에 속하는 에피토프를 발현하도록 변형시킨 항원-발현 세포(antigen-presenting cell)에 접촉시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는, HSV에 대한 면역세포들의 생산방법.
제 18항에 있어서, 에피토프는 ICP0의 92-101번 아미노산, 또는 U_L47의 289-298, 548-557, 550-559, 551-559 또는 551-561번 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 면역세포는 T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 20항에 있어서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항의 방법에 의해서 생산된 면역세포.
HSV에 감염된 세포를 제 22항의 면역세포에 접촉시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는, HSV에 감염된 세포를 사멸시키는 방법.
허피스 심플렉스 바이러스(HSV)를 제 22항의 면역세포에 접촉시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는, HSV 증식을 저해시키는 방법.
HSV에 감염된 세포를 제 22항의 면역세포에 접촉시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항바이러스성(antiviral) 또는 면역조절활성(immunomodulatory)을 가진 림포카인(lymphokines)의 분비를 증강시키는 방법.
HSV에 감염된 세포를 제 22항의 면역세포에 접촉시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는, HSV-특이 항체의 생산을 증강시키는 방법.
제 1항의 조성물을 투여하여 HSV 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
제 22항의 면역세포를 투여하여 HSV 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
ICP0 또는 U_L47 단백질에 속하는 에피토프를 발현하도록 변형된 항원-발현 세포를 투여하여 HSV 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
제 29항에 있어서, 에피토프는 ICP0의 92-101번 아미노산, 또는 U_L47의 289-298, 548-557, 550-559, 551-559 또는 551-561번 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29항에 있어서, 항원-발현 세포는 에피토프의 발현을 조절하는 능력이 있는 바이러스, 펩타이드 또는 미세소구(microsphere)를 이용하여 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
하기의 단계들로 구성되는 것을 특징으로 하는 CD8+ T 세포에 대해 면역원성을 지닌 HSV 에피토프를 확인하는 방법:

(a) HSV에 감염된 병소로부터 CD8+ T 세포를 수득하는 단계;

(b) 상기 단계에서 수득한 T 세포가 HSV에 감염된 세포를 인지하는지를 확인하는 단계;

(c) HSV로부터 핵산을 얻어 이를 절편화시키는 단계;

(d) 상기 단계에서 수득한 하나 또는 그 이상의 핵산 절편을 발현시키는 단계; 및

(e) HSV-특이 T 세포에 대한 반응성이 있는 발현된 절편은 CD8+ T 세포에 대해 면역원성을 지닌 HSV 에피토프를 인코딩하는 것이라는 전제하에, 발현된 절편들이 단계 (b)에서 확인된 HSV-특이 T 세포에 대해 항원성이 있는지를 분석하는 단계.
제 32항에 있어서, 발현은 하나 또는 그 이상의 단편들을 하나의 단편이 하나 이상의 벡터로 통합되는 것을 제한하기 위하여 부분적 필인 반응(partial fill-in reaction)을 이용하여 하나 또는 그 이상의 벡터내로 통합시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 33항에 있어서, 벡터는 HSV-특이 T 세포에 의해 인지되는 HLA 중쇄를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 32항에 있어서, 단계 (e)의 분석에는 림포카인 분비 분석(lymphokinesecretion assay)이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35항에 있어서, 림포카인은 인터페론-감마인 것을 특징으로 하는 방법.
제 32항에 있어서, 단계 (e)의 분석에 의해 확인된 단편에 대한 서열 결정 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 32항에 있어서, HSV는 HSV-2인 것을 특징으로 하는 방법.
제 32항에 있어서, 단편화는 제한효소를 이용한 분해 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39항에 있어서, 제한효소는Sau3AⅠ인 것을 특징으로 하는 방법.