NO20021479L - Immunologiske signifikante herpes simplex virus antigener og metoder for å identifisere og å bruke dem - Google Patents

Description

IMMUNOLOGISKE SIGNIFIKANTE HERPES SIMPLEX VIRUS ANTIGENER OG METODER FOR Å IDENTIFISERE OG Å BRUKE DEM

Oppfinnelsen som utredes her ble gjort med støtte fra regjeringen under Grant nr. AI 34616, AI 30731 og CA 70017, tildelt av National Institutes of Health. Regjeringen har visse rettigheter i denne oppfinnelsen.

Denne søknaden krever fordelen av US midlertidige patentsøknadsnr. 60/157181, arkivert 30. september, 1999, nr. 60/203660, arkivert 12. mai, 2000, og nr. 60/218104, arkivert 13. juli, 2000. Hele innholdet av hver som er inkorporert her ved referanse. Gjennom hele denne søknaden blir det referert til flere publikasjoner. Utredingen av disse publikasjonene i deres helhet blir herved inkorporert ved referanse i denne søknaden for å beskrive mer fullstendig status for det området denne oppfinnelsen angår.

Oppfinnelsen relaterer til molekyler, sammensetninger og metoder som kan brukes for behandling og hindring av HSV-infeksjon. Mer bestemt identifiserer oppfinnelsen epitoper av HSV-proteiner som kan brukes til utvikling av metoder, molekyler og sammensetninger som har antigenspesifisiteten av HSV-spesifikke T-celler, og spesielt til CD8+ T-celler.

Cellulære immunresponser trengs for å begrense alvorligheten av tilbakevendende HSV-infeksjoner hos mennesker. Initielle genitale HSV-2-infeksjoner er prolongerte og alvorlige, mens tilbakefall er mindre alvorlige og oftere asymptomatiske. Løsningen på primære HSV-2-infeksjoner er assosiert med infiltrasjon av antigenspesifikke T-celler, inkludert CD8+ cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer). Serielesjonsbiopsistudier av tilbakevendende HSV-2-infeksjon hos mennesker har vist et skift til predominans av CD8+ ettersom lesjonene modnes og korrelasjon av lokal CTL-aktivitet med virus "clearance" (Koelle, DM et al., J. Clin. Invest. 1998,101:1500-1508; Cunningham, AL et al., J. Clin. Invest. 1985, 75:226-233). Således kan HSV-antigener som gjenkjennes av CD8+ CTL brukes for nye terapier og vaksiner. Den fullstendige DNA-sekvensen av herpes simplex virus (HSV) er ca. 150 kb og koder for ca. 85 kjente gener, som hver koder for et protein i området 50-1000 aminosyrer i lengde. Ukjent er de immunogene epitopene innen disse proteinene. Hver epitop er på ca. 9-12 aminosyrer i lengde, som er istand til å få frem en effektiv T-celle immunrespons på viral infeksjon.

Det gjenstår et behov for å identifisere spesifikke epitoper som er istand til å få frem en effektiv immunrespons på HSV-infeksjon. Slik informasjon kan føre til identifiseringen av mer effektive immunogene antigener som er nyttige for hindring og behandling av HSV-infeksjon.

Oppfinnelsen bidrar med HSV-antigener, polypeptider som omfatter HSV-antigener, polynukleotider som koder for polypeptidene, vektorer og rekombinante virus som inneholder polynukleotidene, antigen-presenterende celler (APC) som presenterer polypeptidene. Immunceller rettet mot HSV, og farmasøytiske sammensetninger. De farmasøytiske sammensetningene kan brukes både profylaktisk og terapeutisk. Antigenene i oppfinnelsen blir gjenkjent av T-celler som kommer fra herpeslesjoner.

, Oppfinnelsen bidrar i tillegg med metoder, inkludert metoder for å hindre og behandle HSV-infeksjon, for å drepe HSV-infiserte celler, for å hemme viral replikasjon, for å øke sekresjon av antivirale og/eller immunomodulatoriske lymfokiner, og for å øke produksjonen av HSV-spesifikke antistoff. For å hindre og behandle HSV-infeksjoner, for å øke sekresjon av antiviral og/eller immunmodulatoriske lymfokiner, for å øke produksjonen av HSV-spesifikke antistoff og generelt for å stimulere og/eller øke HSV-spesifikk immunitet, omfatter metoden at blir gitt til en person et polypeptid, polynukleotid, rekombinant virus, APC, immun-celle eller sammensetning av oppfinnelsen. Metodene for å drepe HSV-infiserte celler og for å hemme viral replikasjon omfatter at en HSV-infisert celle kommer i kontakt med en immun celle fra oppfinnelsen. Immun celle fra oppfinnelsen er en som er blitt stimulert med et antigen fra oppfinnelsen eller av en APC som presenterer et antigen fra oppfinnelsen. En metode for å produsere slike immunceller blir også gitt i oppfinnelsen. Metoden omfatter at en immun celle kommer i kontant med en APC, helst en dendritt celle som er blitt modifisert til å presentere et antigen fra oppfinnelsne. I en foretrukket utførelsesform er immuncellen en T-celle slik som CD4+ eller CD8+ T-celle.

I en utførelsesform gir oppfinnelsen en sammensetning som består av et HSV-polypeptid. Polypeptidet omfatter en ICPO eller UL47-protein eller et fragment derav. I en utførelsesform består fragmentet av aminosyrene 92-101 av ICPO eller en substitsjonsvariant av det. I andre utførelsesformer består fragmentet av aminosyrene 289-298, 548-557, 550.559, 551-559 og/eller 551-561 av UL47 eller en substitusjonsvariant av det. Det er også gitt et isolert polynukleotid som koder for et polypeptid i oppfinnelsen og en sammensetning som omfatter polynukleotidet. Oppfinnelsen bidrar også med et rekombinant virus som er genetisk modifisert til å uttrykke et polynukleotid i oppfinnelsen og en sammensetning som omfatter rekombinant virus. I ønskelige utførelsesformer, er viruset et vaccinia virus, canary pox virus, HSV, lentivirus, retrovirus eller adenovirus. En sammensetning av opprinnelsen kan være en farmasøytisk sammensetning. Sammensetningen kan valgfritt bestå av en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller en adjuvans.

I tillegg gir oppfinnelsen en metode for å identifisere en immunogen epitop av en infeksiøs organisme, slik som et virus, bakterie eller parasitt. Helst er den infeksiøse organismen et virus, slik som HSV. I en utførelsesform, omfatter metoden å lage en samling av random-rfagmenter fra organismens genom. Fragmentene kan lages ved å bruke hvilken som helst av en blanding av standard metoder inkludert, men ikke begrenset til, kutting med restriksjonsenzymer og mekanisk fragmentasjon, slik som ved kontrollert sonikering (Mougneau 'E. et al., Science 1995, 268:563-66). I en ønskelig utførelsesform er organismen HSV-2 og fragmentene fra det virale genomet blir laget ved å kutte med Sau2A I. Eksempler på andre restriksjonsenzymer som kan brukes inkluderer, men er ikke begrenset til, Aapa I, Sma I og Alu I. Fragmentene fra genomets DNA blir så ligert inn i en vektor, helst ved å bruke en partiell fyll-inn reaksjon. En ønskelig vektor er et medlem av pcDNA3.1(+)his serien. Fragmentene blir så uttrekt ved å bruke konvensjonelle teknikker. Helst blir ekspresjonen gjort ved å bruke en Cos-7 transaksjonsmetode (De Plaen E. et al., In: Lefkowits I, red. Immunology Methods Manual, v. 2, New York: Academic Press, 1997:691-718). Cos-7 cellene kan kotransfekteres med et passende HLA-molekyl som er i stand til å presentere target antigenet.

Evnen det uttrykte polypeptidet har til å få fram en cellulær immunrespons blir så målt. Evnen til å få fram en cellulær immunrespons er en indikasjon på tilstedeværelsen av en immunogenisk epitop. Assays som kan brukes for å detektere evnen til å få frem en cellulær immunrespons inkluderer, men er ikke begrenset til cytotoksiske assays og lymfokin-skresjons assays. I en utførelsesform er assayet et interferon-gamma assay.

I en foretrukket utførelsesform bidrar oppfinnelsen med en metode for å identifisere HSV-epitoper som er immunogene for CD8+ T-celler. Metoden omfatter at man får CD8+ T-celler fra en HSV-lesjon og å undersøke disse T-cellene for å identifisere T-celler som har evnen til å gjenkjenne HSV-infiserte celler. Videre omfatter metoden å få og å fragmentere en nukleinsyrepreparasjon fra HSV, å uttrykke et eller flere fragmenter av denne nukleinsyren, å teste de uttrykte fragmentene for antigen reaktivitet med identifiserte HSV-spesifikke T-celler. Et uttrykt fragment som har reaktivitet med HSV- spesifikke T-celler blir identifisert som at det koder for en HSV epitop som er immunogen for CD8+ T-celler.

Trinnene over kan repeteres med subfragmenter fra genomfragmentene. Metoden kan videre omfatte og sekvensere et fragment av genomet. I en utførelsesform omfatter testingen av T-cellene å gjøre et cytotoksisk assay eller et inteferon-gamma assay. Testingen kan utføres med en immuncelle derivert fra en person som er blitt utsatt for den infeksiøse organismen. I ønskelige utførelsesformer er cellen derivert fra et sted med aktiv infeksjon, slik som hud eller cervix, eller fra blod fra en infisert person.

Oppfinnelsen gir videre immunogene epitoper identifisert ved oppfinnelsens metode, polypeptider som består av et epitopene, og polynukleotider som koder for polypeptidene. Passende infeksiøse organismer inkluderer bakterier, parasitter og virus. Eksempler på virus inkluderer DNA- og RNA-virus, både dobbelttrådet og enkelttrådet. Oppfinnelsens metode bidrar med en strategi for å bekjempe en rekke infeksiøse organismer, inkludert de som viser signifikant variabilitet, for de kjennskap til organismens nukleinsyresekvens ikke trengs.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur IA viser fluorescensdeteksjon av TCR Cp-Vp PCR produkter (12 av 24 VP-familier er vist) i bulk CD8-anriket PBMC fra person RW. To vp primere (indikert) ble brukt pr. panel i dupleks-analyser. X-akse: molekylær vekt av PCR-produktene vist ved TOP basert på fluorescens-markører. Y-akse: relativ fluorescensintensitet. Figur IB viser fluorescensdeteksjon av TCR Cp-Vp-produkter (12 av 24 Vp familier er vist) i bulk CD8-anriket lesjonsinfiltrerende lymfocytter (LIL) fra primær HSV-2 biopsy. To vp primere (indikert) ble brukt pr. panel i dupleksanalyser. X-akse: molekylær vekt av PCR-produker vist ved TOP basert på fluorescens-markører. Y-akse: relativ fluorescensintensitet. Figur 2A viser proliferative responser av bulkekspanderte cervikale cytobruskderiverte lymfocytter. Figur 2B viser cytotoksiske responser av bulkekspanderte cervikale cytobruksderiverte lymfocytter, plottet som prosentspesifikk frigjøring. Figur 3 er en skjematisk presentasjon av den positive genomiske klonen som er isolert fra Sau3A I-biblioteket med HSV-2 DNA (andre linje), som inneholdt deler av ICPO-genet. Den genomiske klonen ble transfektert inn i celler og primer A ble brukt for å syntetisere cDNA. Exon-l/Exon-2 C-A (femte linje) og HLA B45 cDNA stimulerte inteferon gammasekresjon fra T-celle klonen (TCC) RW51 etter transfeksjon inn i Cos-7 celler. Exon-1 B-C cDNA (fjerde linje) var negativ. Figur 4 er et stolpediagram som viser CTL-aktiviteten av RW51 mot vaccinia ICPO og indikerte konsentrasjoner av syntetisk ICPO 92-105. Fire timers<5l>Cr-frigjøringsassay med effektor:målratio 10:1. Alle spontane frigjøringer er <20%. , Figur 5 er et diagram som viser CTL-aktiviteten av RW51 mot indikerte konsentrasjoner av syntetisk ICPO 92-101. Fire timers<5l>Cr-frigjøringsassay med effecor:målration 10:1. All spontan frigjøring er <20%. Figur 6 er et diagram som viser CTL-aktiviteten av lymfocytter fra person RW, derivert fra perifert blod og stimulert med et peptid fra HSV-2 ICPO aminosyrer 92-101. Fire timers<51>Cr-frigjøringsassay med effectonmålration på 10:1. Spontan frigjøring <20%. For hvert par av stolper, representerer den øvre stolpen data fra en lesjonsderivert CD8-klon og den nedre stolpen representerer data fra PBMC stimulert med peptid. Figur 7 viser bekreftelse av HLA-begrensende allele, HSV-2 reaktivitet og IFN-gammasekresjon ved lesjon CD8-kloner. Figur 8A viser peptid doserespons for lesjon CD8-klon dkRW. 1991.22 opparbeidet ved ekspresjonskloning. Figur 8B viser peptid doserespons for lesjon CD8-klon RW. 1997.51 opparbeidet ved ekspresjonskloning. Figur 8C viser peptid doserespons for lesjon CD8-klon HV. 1999.23 opparbeidet ved ekspresjonskloning. Figur 9 viser at A<*>0201 begrenset, UL47 289-298-spesifikk CD8 CTL kryssreagerer med B<*>4402 eller B<*>4403. Figur 1OA-0 viser nærværet av UL.47-sepsifikk CTL i perifere blodlymfocytter. Figur 10A viser spesifikk frigjøring fra person 1874 som en følge av Ul47 289-298. Figur 10B viser spesifikk frigjøring for person 1874 som en følge av Ul47 551-559. Figur 10C viser spesifikk frigjøring for person 1874 som en følge av gB2 443-451. Figur 10D viser spesifikk frigjøring for person 7282 som en følge av Ul47 289-298. Figur 10E viser spesifikk frigjøring for person 7282 som en følge av Ul47 551-559. Figur 10F viser spesifikk frigjøring for person 7282 som en følge av gB2 443-451. Figur 10G viser spesifikk frigjøring for person 9107 som en følge av Ul47 289-298. Figur 10H viser spesifikk frigjøring for person 9107 som en følge av Ul47 551-559. Figur 101 viser spesifikk frigjøring for person 9107 som en følge av gB2 443-451. Figur 10J viser spesifikk frigjøring for person 9383 som en følge av Ul47 289-298. Figur 10K viser spesifikk frigjøring for person 9383 som en følge av Ul47 551-559. Figur 10L viser spesifikk frigjøring for person 9383 som en følge av gB2 443-451. Figur 10M viser spesifikk frigjøring for person 9410 som en følge av UL47 289-298. Figur 10N viser spesifikk frigjøring for person 9410 som en følge av Ul47 551-559. Figur 10O viser spesifikk frigjøring for person 9410 som en følge av gB2 443-451. Figur 1 IA er et diagram som viser resultater fra et IFN-gamma ELISPOT assay, i ELISPOTS per brønn, som en funksjon av peptidkonsentrasjonen (ug/ml). Resultatene er vist for 5 9-mer UL47 peptider testet: 548-556 (fylte sirkler); 549-557 (åpne sirkler); 550-558 (fylte triangler); 551-559 (åpne triangler); 552-560 (firkanter). Figur 1 IB er et diagram som viser resultatene av et IFN-gamma ELISPOT assay, i ELISPOTS per brønn, som en funksjon av peptidkonsentrasjon (ug/ml). Resultatene er vsit for 5 10-mer UL47 peptider testet: 548-557 (fylte sirkler); 549-558 (åpne sirkler); 550-559 (fylte triangler); 551-560 (åpne triangler); 552-561 (firkanter). Figur 12 er et stolpedigram som viser resultater fra et IFN-gamma ELISPOT assay, i ELISPOTS per brønn, for hver av forskjellige HPLC-fraksjoner av peptider som er eluert fra HLA-A2 på ClR-A2/3D9.6H7-celler. Resultatene viser at fraksjon 17, 18 og 23 inneholder peptider som gjenkjennes av CTL-klon cpRW22. Det insatte diagrammet viser data fra forskjellige kontroller, inkludert T-celler alene, C1R-A2/3D9.5A1, C1R-A2/3D9,6H7, C1R-A2/HSV-2, C1R-A2/HSV-1 og C1R-A2. Figur 13 A er et søylediagram som viser resultatene fra et IFN-gamma ELISPOT assay, i ELISPOTS per brønn, for hver av forskjellige HPLC-subrfaksjoner av fraksjon 17. Resultatene viser at subfraksjonene av fraksjon 17 inneholder peptider fra C1RA2/3D9.6H7 som gjenkjennes av CTL-klon cpRW22. Pilene indikerer peptider som henholdsvis korresponderer til SEQ ID NO. 3, 1 og 2. Figur 13B er et søylediagram som viser resultatene fra et IFN-gamma ELISPOT assay, i ELISPOTS per brønn, for hver av forskjellige HPLC-subrfaksjoner av fraksjon 18. Resultatene viser at subfraksjonene av fraksjon 18 inneholder peptider fra ClR-A2/3D9.6H7 som gjenkjennes av CTL-klon cpRW22. Pilene indikerer peptider som henholdsvis korresponderer til SEQ ID NO. 3,1 og 2. Figur 13C et er søylediagram som viser resultatene fra et IFN-gamma ELISPOT assay, i ELISPOTS per brønn, for hver av forskjellige kontroller: bare klon 22; C1R-A2/3D9.5A1; C1R-A2/3D9.6H7 og T2-celler. Figur 14 er et søylediagram som viser resultater'av et IFN-gamma ELISPOT assay, i ELISPOTS per brønn, for hver av forskjellige HPLC-subrfaksjoner av fraksjon 23 fra ClR-A2/3D9.6H7-celler. Resultatene viser at subfraksjon 37 sensitiviserer T2-celler til gjenkjenning av CTL-klon cpRW22. Aktiviteten i denne fraksjonen har samme mobilitet på HPLC som Ui47/550-559. Pilene indikerer peptider som henholdsvis korresponderer til SQ ID NO: 3, 1 og 2. Det innsatte diagrammet viser data for kontroller, inkludert T-cellene alene og C1R-A2/3D9.6H7. Figur 15A viser resultatet av HPLC-fraksjonering av HSV-2 syntetisk peptid LGLADTVVAC (SEQ ID NO. 2; UL47/550-559). Peptidet ble kjørt gjennom HPLC under subfraksjoneringsbetingelser og ble funnet eluert i fraksjon 37. Figur 15B viser resultatene fra HPLC-fraksjoneringen av HSV-2 syntetisk peptid GLADTVVACV (SEQ ID NO. 2; UL47/551-560). Peptidet ble kjørt gjennom HPLC under subfraksjoneringsbetingelser og ble funnet eluert i fraksjon 40/41. Figur 15C viser resultatene fra HPLC-fraksjoneringen av HSV-2 syntetisk peptid GLADTVVACV (SEQ ID NO. 3; UL47/551-559). Peptidet ble kjørt gjennom HPLC under subfraksjoneringsbetingelser og ble funnet eluert i fraksjon 32. Figur 16 viser massespektrumsdata plottet som relativ abundance som en funksjon av m/z for fraksjon 23/subfraksjon 37 fra C1R-A2/3D9.6H7. Disse data viser at et peptid med samme masse (MW=961) som UL47/550-559 er tilstede i denne subfraksjonen. Figur 17 viser sekvensen (SEQ ID NO. 14-17) av forskjellige primere som er brukt for PCR for å demonstrere at C1R-A2/3D9.6H7 cellene inneholder minst to retrovirale innskudd derivert fra HSV-2. Figur 18A viser resultatet av PCR-analysen av retrovirale innskudd fra ClR-A2/3D9.6H7 celler, noe som bekrefter at disse cellene inneholder innskudd fra HSV-2. Bånd 2,4 og 8 refererer til deler av UL47-innskuddet som er illustrert i Figur 18B; bånd 7 refererer til UL52-innskuddet som er illustrert i Figur 18C. Figur 18B er en skjematisk illustrasjon av den store delen av UL47-genet som kodes for av et retroviralt innskudd fra C1R-A2/3D9.6H7 celler. Dette innskuddet inkluderer en del som koder for UL47/550-559 peptidet (SEQ ID NO. 1). Figur 18C er en skjematisk illustrasjon av de to fragmentene av Ut52-genet som er kodet for av et annet retroviralt innskudd fra C1R-A2/3D9.6H7 celler. Figur 19 er et stolpediagram som viser at Ul47 gentransfektert VA13/A2-celler blir gjenkjent av CD8+ T-celle klon cpRW22, bestemt ved interferon-gammasekresjon målt i ELISPOTS/brønn. Målene var VAI 3 fibroblaster som stabilt uttrykker HLA-A2. Målene ble pulset med UL47-peptid eller transient transfektert med UL47 ekspresjonsplasmidkloner #2, #4 eller #6. Respondere var cpRW22 CD8+ T-celleklonen. Figur 20A-L er diagrammer som viser CTL responser på forskjellige HLA-A2 donorer, plottet som prosentspesifikk lysis som en funksjon av effektonmålratio. Målene ble pulset med enten ingen peptid (fylte sirkler), stimmulerende peptid (åpne sirkler) eller et kontrollpeptid derivert fra HIV (triangler). Figur 20A viser resultater fra donor RW1874. PBMC ble stimulert med influensa Ml/58-66. Figur 20B viser resultater fra donor RW1874. PBMC ble stimulert med UL47/550-559. Figur 20C viser resultater fra donor RW1874. PBMC ble stimulert med UL47/289-298. Figur 20D viser resultater fra donor HV5101. PBMC ble stimulert med M1/58-66. Figur 20E viser resultater fra donor HV5101. PBMC ble stimulert med UL47/550-559. Figur 20F viser resultater fra donor HV5101. PBMC ble stimulert med UL47/289-298. Figur 20G viser resultater fra donor AD 120. PBMC ble stimulert med M1/58-66. Figur 20H viser resultater fra donor AD120. PBMC ble stimulert med UL47/550-559. Figur 201 viser resultater fra donor AD120. PBMC ble stimulert med UL47/289-298. Figur 20J viser resultater fra donor AD 124. PBMC ble stimulert med M1/58-66. Figur 20K viser resultater fra donor AD124. PBMC ble stimulert med UL47/550-559. Figur 20L viser resultater fra donor AD124. PBMC ble stimulert med UL47/289-298.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen bidrar med HSV-antigener som er nyttige for hindringen og behandlingen av HSV-infeksjon. Det som vises her er antigener og/eller deres epitoper som det er bekreftet blir gjenkjent av T-celler derivert fra herpeslesjoner. I noen utførelsesformer har T-celler som har spesifisitet til antigenene fra oppfinnelsen demonstrert cytotoksisk aktivitet mot viralt infiserte celler. Identifikasjonen av immunogene antigener som er ansvarlig for T-celle spesifisiteten fasiliterer utviklingen av forbedrede antivirale terapeutika og profylaktiske strategier. Sammensetninger som inneholder antigener eller polynukleotider som koder for antigener i oppfinnelsen bidrar med effektivt målrettete vaksiner for å hindre å behandle HSV-infeksjon.

Definisjoner

Alle vitenskapelige og tekniske uttrykk som er brukt i denne søknaden har betydninger som er vanlig brukt i fagfeltet med mindre noe annet er spesifisert. Som de er brukt i denne søknaden har følgende ord eller fraser de spesifiserte betydningene.

Som brukt heri, inkluderer "polypeptid" proteiner, fragmenter av proteiner og peptider enten isolert fra naturlige kilder, produsert ved rekombinante teknikker eller kjemisk syntetisert. Polypeptider i oppfinnelsen består typisk av minst ca. 6 aminosyrer.

Som brukt heri, inkluderer "HSV-polypeptid" HSV-1 og HSV2-2 med mindre noe annet er indikert. Referanser til aminosyrer i HSV-proteiner eller polypeptider er basert på den genomiske sekvensinformasjonen angående HSV-2 som beskrevet i A. Dolan et al., 1998, J. Virol. 72(3):2010-2021. Som nevnt over, skiller den forutsagte polypeptidsekvensen av ICPO fra HSV-2 basert på sekvensering av RNA fra celler transfektert med et fragment av ICPO seg fra den publiserte sekvensen ved at aminosyre Q26 er utelatt.

Som brukt heri, refererer "substitusjonen variant" seg til et molekyl som har en eller flere aminosyresubstitusjoner eller delesjoner i den indikerte aminosyresekvensen, men som fremdeles har evnen til å spesifikk gjenkjennes av en immuncelle. Aminosyresekvensen av en substitusjonen variant er helst minst 80% identisk til den native aminosyresekvensen eller helst minst 90% identisk til den native aminosyresekvensen. En metode for å bestemme om et molekyl spesifikt kan gjenkjennes av en immuncelle er det cytotoksiske assayet som er beskrevet i D.M. Koelle et al., 1997, Human Immunol. 53:195-205. Andre metoder for å bestemme om et molekyl kan spesifikt gjenkjennes av en immuncelle er beskrevet i eksempler som er gitt heri under, inkludert evnen til å stimulere sekresjon av interferon-gamma eller evnen til å lysere celler som presenterer molekylet. En immuncelle vil spesifikt gjenkjenne et molekyl når for eksempel stimulerng med molekylet resulterer i sekresjon av mer inteferon gamma enn stimulering med kontrollmolekyler. For eksempel kan molekylet stimulere mer enn 5 pg/ml, eller helst mer enn 10 pg/ml interferon-gammasekresjon, mens et kontrollmolekyl vil stimulere mindre enn 5 pg/ml interferon-gamma.

Som brukt heri, betyr "vektor" en konstruksjon som er istand til å levere, og helst uttrykke et eller flere gener eller sekvenser av interesse i en vertcelle. Eksempler på vektorer inkluderer, men er ikke begrenset til virale vektorer, nakne DNA eller RNA-ekspresjonsvektorer, plasmid, kosmid eller fagvektorer, DNA eller RNA-ekspresjonsvektorer som er assosiert med kationiske kondenseringsagenter, DNA- eller RNA-ekspresjonsvektorer som er innkapslet i liposomer, og visse eukaryotiske celler slik som produsentceller.

Som brukt heri, betyr "ekspresjon kontrollsekvens" en nukleinsyresekvens som styrer transkripsjonen av en nukleinsyre. En ekspresjonskontrollsekvens kan være en promoter, slik som en konstitutiv eller en induserbar promoter, eller en enhancer. Ekspresjonskontrollsekvensen er virksomt koblet til nukleinsyresekvensen for å bli transkribert.

Uttrykket "nukleinsyre" eller "polynukleotid" refererer seg til et deoksyribonykleotid eller ribonukleotidpolymer i enten enkel eller dobbeltrådet form, og med mindre det er begrenset på annen måte, omfatter kjente analoger av naturlig nukleotider som hybridiserer til nukleinsyrer på en måte som ligner på naturlig forekommende nukleotider.

Som brukt heri, betyr "antigenpresenterence celle" eller "APC" en celle som er istand til å overgi og presentere antigen til en lymfocytt. Eksempler på APCer inkluderer, men er ikke begrenset til makrofager, Langerhans dendrittiske celler, follikulære dendrittiske celler, B-celler, monocytter, fibroblaster og fibrocytter. Dendrittiske celler er en ønskelig type av antigen presenterende celler. Dendrittiske celler blir funnet i mange ikke-lymfoide vev, men kan vandre via den afferente lymfen eller blodstrømmen til T-avhengige områder av de lymfoide organene. I ikke-lymfoide organer, inkluderer dendrittcellene Langerhans celler og interstitiale dendrittiske celler. I lymfen og blodet inkluderer de henholdsvis afferente lymfatiske veiled celler og bloddendrittiske celler. I lymfoide organer inkluderer de lymfoide dendrittiske celler og interdigiterende celler.

Som brukt heri, refererer "modifisert" til å presentere en epitop seg til antigen presenterende celler (APCer) som er blitt manipulert til å presentere en epitop ved naturlig eller rekombinante metoder. For eksempel kan APCene bli modifisert ved å bli utsatt for det isolerte antigenet, alene eller som en del av en blanding, ladning av peptid eller ved å genetisk modifisere APCen til å uttrykke et polypeptid som inkluderer en eller flere epitoper.

Som brukt heri, refererer "farmasøytisk akseptabelt salt" seg til et salt som har bevart den ønskede biologiske aktiviteten av utgangsforbindelsen og som ikke har noen uønskede toksikologiske effekter. Eksempler på slike salter inkluderer, men er ikke begrenset til;

(a) sure tilleggssalter som er dannet med inorganiske syrer f.eks. saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre og lignende; og salter dannet med organiske syrer slik som f.eks. eddiksyre, oksalsyre, tartarsyre, suksinatsyre, malatsyre, fumarsyre, glukonsyre, sitronsyre, malatsyre, askorbinsyre, benzoinsyre, garvesyre, pamoinsyre, algininsyre, polyglutaminsyre, naftalensulfonsyre, naftalendisulfonsyre, polygalakturonsyre; (b) salter med polyvalente metallkationer slik som sink, kalsium, bismut, barium,

magnesium, aluminium, kopper, kobolt, nikkel, kadmium og lignende; eller

(c) salter dannet med et organisk kation dannet fra N,N'-dibenzyletylendiamin eller

etylendiamin; eller

(d) kombinasjoner av (a) og (b) eller (c), f.eks. et sinktannatsalt; og lignende.

De foretrukne sure tilleggsaltene er trifluoracetatsalt og acetatsalt.

Som brukt heri, inkluderer "farmasøytisk akseptabel bærer" ethvert materiale som, når det kombineres med en aktiv ingrediens, tillater ingrediensen å bevare biologisk aktivitet og som ikke er reaktivt med personens immunsystem. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til ethvert av standard farmasøytiske bærere slik som fosfatbuffret saltvannsløsning, vann, emulsjoner slik som olje/vannemulsjon og forskjellige typer med våte agenter. Foretrukne fortynningsmidler for aerosol eller parenteral administrering er fosfatbuffret saltvann eller normal (0,9%) saltvann. Sammensetninger som omfatter slike bærere er formulert ved velkjente konvensjonelle metoder (se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences, kap. 43, 14. utg., Mack Publishing Co., Easton PA 18042, USA).

Som brukt heri, inkluderer "adjuvans" de adjuvanser som vanligvis er brukt i fagfeltet for å fasilitere stimuleringen av en immunrespons. Eksempler på adjuvanser inkluderer, men er ikke begrenset til hjelperpeptid; aluminiumsalter slik som aluminiUmhydroksidgel (alum) eller aluminiumfosfat; Freud's Incomplete Adjuvans og komplett adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvans 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (Smith-Kline Beecham); QS-2 (Aquilla); MPL eller 3d-MPL (Corixa Corporation, Hamilton, MT); LEIF; salter av kalsium, jern eller sink; en uløselig suspensjon av acylert tyrosin; acylerte sukkere; kationiske eller anioniske deriverte polysakkarider; polyfosfasener; biodegraderbare mikrosfærer; monofosforyllipid A og quil A; muramyltripeptidfosfatidyletanolamin eller et immunstimulerende kompleks inkludert cytokiner (f.eks. GM-CSF eller interleukin-2, - 7 eller-12) og immunostimulerende DNA-sekvenser. I noen utførelsesformer, slik som ved bruk av en polynukleotidvaksine kan et adjuvans slik som et hjelperpeptid eller cytokin gis via en polynukleotid som koder for adjuvansen.

Som brukt heri, betyr "en" minst en eller et, med mindre noe annet er klart indikert.

HSV-porypeptider

I en utførelsesform gir oppfinnelsen et isolert herpes simpleks virus (HSV) polypeptid hvor polypeptidet omfatter et ICPO eller UL47-protein eller et fragment derav. I en utførelsesform omfatter fragmentet aminosyrene 92-101 av ICPO eller en substitusjonsvariant derav. I en annen utførelsesform omfatter fragmentet aminosyrene 289-298, 548-557, 550-559, 551-559 og/eller 551-561 av UL47 eller en substitusjonsvariant derav. Referansen til aminosyreresidiene er gjort i henhold til proteinene i HSV-2 genomet som beskrevet i A. Dolan et al., 1998, J. Virol. 72(3):2010-2021.

Polypeptidet kan være et fusjonsprotein. I en utførelsesform er fusjonsproteinet løselig. Et løselig fusjonsprotein i oppfinnelsen kan være passende for injeksjon i en person og for å få frem en immunrespons. Innen visse utførelsesformer kan et polypeptid være et fusjonsprotein som omfatter flere polypeptider som beskrevet heri, eller som omfatter minst et polypeptid som beskrevet heri og en urelatert sekvens. En fusjonspartner kan f.eks. assistere i å gi T-hjelperepitoper (en immunologisk fusjonspartner), helst T- hjelperepitoper som gjenkjennes av mennesker, eller kan assistere i å uttrykke proteinet (en ekspresjonsenhancer) til høyere utbytte enn det native rekombinante proteinet. Visse foretrukne fusjonspartnere er både immunologiske og ekspresjonsenhancing fusjonspartnere. Andre fusjonspartnere kan selekteres slik at de øker løseligheten av proteinet eller gjør proteinet i stand til å bli dirigert til ønskede intracellulære kompartments. Enda videre inkluderer fusjonspartnere affinitet tags som fasiliterer rensingen av proteinet.

Fusjonsproteiner kan generelt lages ved å bruke standardteknikker inkludert kjemisk konjugasjon. Det er ønskelig at et fusjonsprotein blir uttrykt som et rekombinant protein, noe som tillater en større produksjon relativt til et ikke-fusert protein i et

, ekspresjonssystem. Kort så kan DNA-sekvenser som koder for polypeptidkomponenter sammenstilles separat og ligeres inn i en passende ekspresjonsvektor. Den 3' -enden av DNA-sekvensen som koder for en polypeptidkomponent blir ligert med eller uten en peptidlinker til den 5'-enden av en DNA-sekvens som koder for den ande polypeptidkomponenten slik at leserammene til sekvensene er i fase. Dette tillater translasjon til et enkelt fusjonsprotein som har bevart den biologiske aktiviteten av begge polypeptidkomponentene.

En peptidlinkersekvens kan brukes for å separere den første og den andre polypeptidkomponenten ved en distanse som er tilstrekkelig for å sikre at hvert polypeptid foldes til sin sekundære og tertiære struktur. En slik peptidlinkersekvens er inkorporert i fusjonsproteinet ved å bruke standardteknikker som er velkjent i faget. Passende peptidlinkersekvenser kan velges basert på følgende faktorer: (1) deres evne til å adaptere en fleksibel utvidet konformasjon; (2) deres manglende evne til å adaptere en sekundær struktur som kunne interagere med funksjonelle epitoper på det første og det andre polypeptidet; og (3) mangel av hydrofobe eller ladede residier som kunne reagere med polypeptidfunksjonelle epitoper.

Foretukne peptidlinkersekvenser inneholder Gly-, Asn- og Ser-residier Andre nesten nøytrale aminosyrer slik som Thr og Ala kan også brukes i linkersekvensen. Aminosyresekvenser som kan være nyttige brukte som linkere inkluderer de som er utgreiet i Maratea et al., 1985, Gene 40:39-46; Murphy et al., 1986, Proe. Nati. Acaad. Sei. USA 83:8258-8262; US patent nr. 4,935,233 og US patent nr. 4,751,180. Linkersekvensen kan generelt være fra 1 til ca. 50 aminosyrer i lengde. Linkersekvensene trengs ikke når det første og andre polypeptid har ikke-essensielt N-terminal aminosyreregioner som kan brukes for å separere de funksjonelle domenene og hindre sterisk interferens.

De ligerte DNA-sekvensene er virksomt koblet til passende transkripsjons- eller translasjonsregulatoriske elementer. De regulatoriske elementene som er ansvarlig for ekspresjon av DNA er lokalisert 5' til DNA-sekvensen som koder for det første polypeptidet. På samme måte er stop-kodonet som trengs for å slutte translasjonen og transkripsjons termineringssignalene tilstede 3' for DNA-sekvensen som koder for det andre polypeptidet.

Fusjonsproteiner gis også som omfatter et polypeptid i den foreliggende oppfinnelsen sammen med et urelatert immunogenisk protein. Det er ønskelig at det immunogene proteinet er istand til å få frem en "recall" respons. Eksempler på slike proteiner inkluderer tetanus, tuberkulose og hepatittproteiner (se f.eks. Stoute et al., 1997, New Engl. J. Med., 336:86-9).

Innen foretrukne utførelsesformer er en immunologisk fusjonspartner derivert fra protein D, et overflateprotein hos den gram-negative bakterien Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Mest ønskelig omfatter et protein D-derivat ca. den første tredjedelen av proteinet (f.eks. de første N-terminale 100-110 aminosyrene) og et protein D-derivat kan være lipidisert. Innen visse foretrukne utførelsesformer er de første 109 residiene av et lipoprotein D fusjonspartner inkludert på den N-terminale delen for å gi polypeptid med tillegg eksogene T-celle epitoper og for å øke ekspresjonsnivået i E. coli (således fungerer det som en ekspresjonsenhancer). Lipidhalen sikrer optimal presentasjon av antigenet til antigenpresenterende celler. Andre fusjonspartnere inkluderer det non-strukturelle proteinet fra influensavirus, NS1 (hemaglutinin). Typisk så blir de N-terminale 81 aminosyrene brukt, selv om forskjellige fragmenter som inkluderer T-hjelpeepitoper kan brukes.

I en annen utførelsesform er den immunologiske fusjonspartneren proteinet som er kjent som LYTA eller en del av det (helst en C-terminal del). LYTA er derivert fra Streptococcus pneumoniae som syntetiserer en N-acety-L-alanin amidase kjent som amidase LYTA (kodet for av LytA-genet; Gene 43:265-292, 1986). LYTA er en autolysin som spesifikt degraderer visse bindinger i peptidoglykanryggraden. Det C- terminale domenet av LYT A-proteinet er ansvarlig for affiniteten til kolin eller til visse kolinanaloger slik som DEAE. Denne egenskapen er utnyttet for utviklingen av E. coli C-LYTA uttrykkende plasmider som er nyttige for ekspresjon av fusjonsproteiner. Rensing av hybridproteiner som inneholder C-LYTA fragmentet i den aminoterminale delen er blitt beskrevet (se Biotechnology 10:795-798, 1992). Innen en ønsket utførelsesform kan en repetert del av LYTA inkorporeres i et fusjonsprotein. En repetert del finnes i den C-terminale regionen som starter ved residiet 178. En spesielt foretrukket "repeat" del inkorporerer residiene 188-305.

I noen utførelsesformer kan det være ønskelig å koble en terapeutisk agent og et polypeptid i oppfinnelsen, eller å koble mer enn et polypeptid i oppfinnelsen. For eksempel kan flere enn en agent eller polypeptid kobles direkte til et første polypeptid av oppfinnelsen, eller linkere som bidrar med flere seter for binding kan brukes. Alternativt kan en bærer brukes. Noen molekyler er spesielt passende for intracellulær trafikk og proteinlevering inkludert, men ikke begrenset til VP22 (Elliott og 0'Hare, 1997, Cell 88:223-233, se også Kim et al., 1997, J. Immunol. 159:1666-1668; Rojas et al., 1998, Nature Biotechnology 16:370; Kato et al., 1998, FEBS Lett 427(2):203-208; Vives et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(25):16010-7; Nagahara et al., 1998, Nature Med. 4(12): 1449-1452).

En bærer kan bære agentene eller polypeptidene på en rekke måter, inkludert kovalent binding enten direkte eller via en linkergruppe. Passende bærere inkluderer proteiner slik som albuminer (f.eks. US patent nr. 4,507,234 til Kato et al.), peptider og polysakkarider slik som aminodekstran (f.eks. US patent nr. 4,699,784 til Shih et al.). En bærer kan også bære et agent ved ikke-kovalent binding eller ved innkapsling, slik som innen en liposomvesikkel (f.eks. US patent nr. 4,429,008 og 4,873,088).

Generelt blir polypeptider (inkludert fusjonsproteiner) og polynukleotider som beskrevet heri isolert. Et "isolert" polypeptid eller polynukleotid er et som er fjernet fra sin opprinnelige omgivelse. For eksempel er et naturlig forekommende protein isolert hvis det er separert fra noen eller alle av de koeksisterende materialene i det naturlige systemet. Helst er slike polypeptider minst ca. 90% rene, enda mer ønskelig minst ca. 95% rene og mest ønskelig minst ca. 99% rene. Et polynukleotid blir betraktet å være isolert hvis f.eks. det er klonet inn i en vektor som ikke er del av den naturlige omgivelsen.

Polypeptidet kan være isolert fra sin naturlig forekommende form, produsert ved rekombinante metoder eller syntetisert kjemisk. Rekombinante polypeptider som kodes for av DNA-sekvenser som er beskrevet heri kan lett lagres fra DNA-sekvensene ved å bruke enhver av en rekke ekspresjonvektorer som er allment kjent i fagfeltet. Ekspresjonen kan oppnås i enhver passende vertcelle som er blitt transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor som inneholder et DNA-molekyl som koder for et rekombinant polypeptid. Passende vertsceller inkluderer prokaryoter, gjær og høyere eukaryote celler. Ønskelige brukte vertceller er E. coli, gjør eller en mammalske cellelinje slik som Cos eller CHO. Supernatantene fra de løselige vert/vektorsystemene som utskiller rekombinant protein eller polypeptid i kulturmedia kan først konsentreres ved å bruke kommersielt tilgjengelige filter. Etter konsentrering kan konsentratet brukes til en passende rensematriks slik som en affinitetsmatriks eller en ionebytte resin. Til slutt kan en eller flere reversfase HPLC-trinn brukes for videre å rense et rekombinant polypeptid.

Fragmenter og andre varianter som har mindre enn ca. 100 aminosyrer og generelt mindre enn ca. 50 aminosyrer kan også lages på syntetisk måte ved å bruke teknikker som er velkjente i fagfeltet. For eksempel kan slike polypeptider syntetiseres ved å bruke enhver av de kommersielt tilgjengelige "solid-phase" teknikkene slik som Merrifield "solid-phase" syntesemetode, hvor aminosyrene blir sekvensielt addert til en voksende aminosyrekjede (Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2146-2149). Utstyr for automatisk syntese av polypeptider er kommersielt tilgjengelig fra firma slik som Perkin Eimer/Applied BioSystems Division (foster City, CA) og kan brukes ifølge instruksjoner fra produsenten.

Varianter av polypeptider for bruk ifølge oppfinnelsen kan ha en eller flere aminosyresubstitusjoner, delesjoner, addisjoner og/eller insersjoner i den indikerte aminosyresekvensen som resulterer i et polypeptid som har beholdt evnen til å få frem en immunrespons på HSV eller HSV-infiserte celler. Slike varianter kan generelt identifiseres ved å modifisere et av polypeptidsekvensene som er beskrevet heri og å evaluere reaktiviteten av det modifiserte polypeptidet ved å bruke kjente "assays" slik som et T-celle "assay" beskrevet heri. Polypeptidvarianter viser helst minst ca. 70%, mer ønskelig minst ca. 90% og mest ønskelig minst ca. 95% identitet til de identifiserte polypeptidene. Disse aminosyresubstitusjonene inkluderer, men er ikke nødvendig begrenset til aminosyresubstitusjoner som i fagfeltet er kjent som "konservative".

En "konservativ" substitusjon er en hvor en aminosyre er substituert for en annen aminosyre som har lignende egenskaper slik at en fagperson i peptidkjemi ville forvente at den sekundære strukturen og den hydropatiske naturen av polypeptidet så å si er uforandret. Aminosyresubstitusjoner kan generelt gjøres på basis av likheter i polaritet, ladning, løselighet, hydrofobisitet, hydrofilisitet og/eller den amfipatiske naturen til residiene. For eksempler inkluderer negativt ladede aminosyrer aspartat og glutamat; positivt ladede aminosyrer inkluderer lysin og arginin; og aminosyrer med uladede polare hodegrupper som har lignende hydrofilisitetsverdier inkluderer leusin, isoleusin og valin; glysin og alinin; asparagin og glutamin; serin, treonin, fenylalanin og tyrosin. Andre grupper med aminosyrer som kan representere konservative forandringer inkluderer: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe;

(4) lys, arg, his; og

(5) phe, tyr, trp, his.

En variant kan også eller alternativt inneholde ikke-konservative forandringer. I en foretrukket utførelsesform skiller flere polypeptider seg fra en nativ sekvens ved substitusjon, delesjon eller addisjon av 5 aminosyrer eller færre. Flere kan også (eller alternativt) bli modifisert ved for eksempel delesjon eller addisjon av aminosyrer som har minimal innflytelse på immunogenisiteten, den sekundære strukturen og den hydropatiske naturen til polypeptidet.

Polynukleotidene, vektorene, vertcellene og rekombinante virus

Oppfinnelsen bidrar med polynukleotider som koder for et eller flere polypeptider i oppfinnelsen. Polynukleotidet kan inkluderes i en vektor. Vektoren kan videre omfatte en ekspresjons kontrollsekvens som er virksomt linket til polynukleotidet i oppfinnelsen. I noen utførelsesformer inkluderer vektoren et eller flere polynukleotider som koder for andre molekyler av interesse. I en utførelsesform kan polynukleotidet i oppfinnelsen og et tilleggspolynukleotid linkes slik at de koder for et fusjonsprotein.

Innen visse utførelsesformer kan polynukleotidene formuleres slik at de tillater inngang i en mammalsk celle og ekspresjon i cellen. Slike formuleringer er spesielt nyttige for terapeutiske hensikter som beskrevet under. Vanlige fagfolk vil sette pris på at der er mange måter å oppnå ekspresjon av et polynukleotid i en "target" celle, og enhver passende metode kan brukes. For eksempel kan et polynukleotid bli inkorporert i en viral vektor slik som, men ikke begrenset til, adenovirus, adenoassosiert virus, retrovirus eller vaksinia eller andre pox virus (f.eks. avian pox virus). Teknikker for å inkorporere DNA i slike vektorer er velkjente for vanlige fagfolk. En retroviral vektor kan i tillegg overføre eller inkorporere et gen for en seleksjonsmarkør (for å hjelpe til med identifiseringen eller seleksjonen av transduserte celler) og/eller en målrettet del, slik som et gen som koder for en ligand for en reseptor på en spesifikk målcelle, for å gjøre vektoren målspesifikk. Å være målrettet kan også oppnås ved å bruke et antistoff ved metoder som er kjent for vanlige fagfolk.

Oppfinnelsen bidrar også med en vertcelle som er transformert med en vektor i

, oppfinnelsen. Den transformerte vertcellen kan brukes i en metode for å produsere et polypeptid i oppfinnelsen. Metoden omfatter å dyrke vertcellene og gjenvinne polypeptidet som produseres. Det gjenvunnede polypeptidet kan renses fira kultursupernatanten. Vektorer fra oppfinnelsen kan brukes får å genetisk modifisere en celle, enten in vivo, ex vivo eller in vitro. Flere måter for genetisk modifisering av celler er kjent, inkludert transduksjon og infeksjon med en viral vektor, enten direkte eller via en retroviral produsentcelle, kalsiumfosfatpresipitering, fusjon av mottakercellene med bakterielle protoplaster som inneholder DNAet, behandling av mottakercellene med

liposomer eller mikrosfærer som inneholder DNAet, DEAE dekstran, reseptormediert endocytose, elektroporering, mikroinjeksjon og mange andre teknikker som er kjent i feltet. Se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2. utg.) 1-3, 1989; og Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., red. Greene Publishing Associates, Inc. og John Wiley & Sons, Inc., (1994 Supplement).

Eksempler på virale vektorer inkluderer, men er ikke begrenset til retrovirale vektorer basert på f.eks. HIV, SIV og murine retroviruser, gibbon ape leukemivirus og andre virus slik som adenoassosierte viruser (AAVer) og adenoviruser. (Miller et al., 1990, Mol. Cell Biol. 10:4239; J. Kolberg 1992, NIH Res. 4:43, og Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther. 2:215). Mye brukte retrovirale vektorer inkluderer de som er basert på murine leukemivirus (MuLV), gibbon ape leukemivirus (GaLV), ekotropisk retrovirus, simian immunodeficiency virus (SIV), human immunodeficiency virus (HIV) og kombinasjoner derav. Se f.eks. (Buchscher et al, 1992, J. Virol. 66(5):2731-2739; Johann et al., 1992, J. Virol. 66(5): 1635-1640; Sommerfelt et al. 1990, Virol. 176:58-59, Wilson et al., 1989, J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al., 1991, J. Virol. 65:2220-2224, og Rosenberg og Fauci 1993 i Fundamental Immunology, 3. utg. W.E. Paul (red.) Raven Press Ltd., New York og referansene heri; Miller et al. 1990, Mol. Cell, Biol.

10:4239; R. Kolberg 1992, J. NIH Res. 4:43 og Cornettaet al., 1991, Hum. Gene Ther. 2:215.

In vitro amplifiseringsteknikker som er passende for å amplifisere sekvenser som skal subklones i en ekspresjonsvektor er kjent. Eksempler på slike in vitro-amplifiseringsmetoder inkludert polymerase kjedereaksjonen (PCR), ligasekjedereaksjonen (LCR), QP-replikaseamplifikasjon og andre RNA-polymerasemedierte teknikker (f.eks. NASBA) finnes i Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2. utg.) 1-3; og US patent nr. 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., red.) Academic Press Inc. San Diego, CA 1990. Forbedrede metoder for kloning av in vitro amplifiserte nukleinsyrer er beskrevet i US patent nr. 5,426,039.

Oppfinnelsen bidrar i tillegg med en rekombinant mikroorganisme som er genetisk modifisert til å uttrykke et polynukleotid i oppfinnelsen. Den rekombinante mikroorganismen kan være nyttig som en vaksine og kan lages ved å bruke teknikker velkjent i feltet for preparering av levende attenuerte vaksiner. Eksempler på mikroorganismer for bruk som levende vaksiner inkluderer, men er ikke begrenset til virus og bakterier. I en foretrukket uførelsesform er den rekombinante mikroorganismen et virus. Eksempler på passende virus inkluderer, men er ikke begrenset til vaksinia virus, canary pox virus, retrovirus, lentivirus, HSV og adenovirus.

Sammensetningene

Oppfinnelsen bidrar med sammensetninger som er nyttige for behandling og hindring av HSV-infeksjon. Sammensetningene kan brukes for å hemme viral replikasjon og for å drepe virusinfiserte celler. I en utførelsesform er sammensetningen en farmasøytisk sammensetning. Sammensetningen kan omfatte en terapeutisk eller en profylaktisk effektiv mengde av et polypeptid, polynukleotid, rekombinant virus, APC eller immuncelle i oppfinnelsen. En effektiv mengde er en mengde som er tilstrekkelig for å få frem eller øke en immunrespons, for eksempel ved å aktivere T-celler. Et mål for aktiveringen av T-celler er et cytotoksisitets "assay" som beskrevet i D.M. Koelle et al., 1997, Human Immunol., 53:195-205.1 noen utførelsesformer er sammensetningen en vaksine.

Sammensetningen kan valgfritt inkludere en bærer, slik som en farmasøytisk akseptabel bærer. Farmasøytisk akseptable bærere blir bestemt delvis ved den spesielle sammensetningen som blir gitt, så vel som ved den spesielle metoden som brukes for å gi sammensetningen. Som en følge av dette er det en rekke varianter av passende formuleringer av farmasøytiske sammensetninger i den foreliggene oppfinnelsen. Formuleringene som er passende for parenteral administrering, slik som for eksempel ved intraartikulære (i sammenføyningene), intravenøse, intramuskulære, intradermale, intraperitoneale og subkutane ruter, og bærerere inkluderer vanndige isoton sterile injeksjonsløsninger som kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostater og løste ting som gjør formuleringen isotonisk med blodet til den påtenkte mottageren og vanndige og ikke-vanndige sterile suspensjoner som kan inkludere suspenderende agenter, oppløsere, tykkningsagenter, stabilisatorer, preservativer, liposomer, mikrosfærer og emulsjoner.

Sammensetningen i oppfinnelsen kan videre omfatte et eller flere adjuvanser. Eksempler på adjuvanser inkluderer, men er ikke begrenset til hjelperpeptider, alum, Freund's, muramyltripeptidfosfatidyletanolarnin eller en immunostimulerende kompleks, inkludert cytokiner. I noen utførelsesformer, slik som ved bruk av en polynukleotidvaksine, kan en adjuvans slik som et hjelperpeptid eller cytokin gis via et polynukleotid som koder for adjuvansen. Vaksinepreparasjon er generelt beskrevet i f.eks. M.F. Powell og M.J. Newman, red., "Vaccine Design (the subunit and adjuvans approach," Plenum Press (NY, 1995). Farmasøytiske sammensetninger og vaksiner innen målet for den foreliggende oppfinnelsen kan også inneholde andre forbindelser som kan være biologisk aktive eller inaktive. For eksempel kan et eller flere immunogeniske deler av andre virale antigener være tilstede, enten inkorporert i et fusjonspolypeptid eller som en separat forbindelse innen sammensetningen eller vaksinen.

En farmasøytisk sammensetning eller vaksine kan inneholde DNA som koder for et eller flere av polypeptidene i oppfinnelsen slik at polypeptidet lages in situ. Som nevnt over kan DNA være tilstede innen ethvert av en rekke leveringssystemer som er kjent for vanlige fagfolk inkludert nukleinsyre ekpresjonssystemer, bakterier og virale ekspresjonssystemer. Flere genleveringsteknikker er velkjente i feltet, slik som de som er beskrevet av Rolland, 1998, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198 og referanser heri. Passende nukleinsyre ekspresjonssystemer inneholder de nødvendige DNA-sekvensene for ekspresjon i pasienten (slik som en passende promoter og termineringssignal). Bakterielle leverignssystemer involverer administreringen av en bakterie (slik som Bacillus- Calmette- Buerriri) som uttrykker en immunogen del av polypeptidet på dens celleoverflate og utskiller en slik epitop. I en foretrukket utførelsesform kan DNA introduseres ved å bruke et viralt ekspresjonssystem (f.eks.

vaksinia eller andre pox virus, retrogvirus eller adenovirus) som kan involvere bruken

av et non-patogent (ødelagt), replikasjonskompetent virus. Passende systemer er utgreid i f.eks. Fisher-Hoch et al., 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:317-321; Felxner et al., 1989, Ann. My Acad. Sei. 569:86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine 8:7-21; US patent nr. 4,603,112, 4,769,330 og 5,017,487; WO 89/01973; US patent nr. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91102805; Berkner, 1988, Biotechniques 6:616-627; Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Kolls et al., 1994, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:251-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation 88:2838-2848 og Guzman et al., 1993, Cir. Res. 73:1202-1207. Teknikker for å inkorporere DNA i slike ekspresjonssystemer er velkjente for vanlige fagfolk. DNA kan også være "nakent" som beskrevet for eksempel i Ulmer et al., 1993, Science 259:1754-1749 og gjennomgått av Cohen, 1993, Science 259:1691-1692. Opptaket av nakent DNA kan økes ved å kode DNA på biodegraderbare kuler som effektiv transporteres inn i cellene.

Mens enhver passende bærer som er velkjent for vanlige fagfolk kan brukes i den farmasøytiske sammensetningen i denne oppfinnelsen, vil type bærer variere avhengig av måten den gis på. Sammensetningene i den foreliggende oppfinnelsen kan formuleres for enhver passende type av administrering, inkludert f.eks. lokal, oral, nasal, intravenøs, intrakranial, intraperitoneal, subkutan eller intramuskulær administrering. For parenteral administrering slik som subkutan injeksjon, omfatter bæreren helst vann, saltvann, alkohol, et fett, en voks eller en buffer. For oral administrering kan enhver av bærerene over eller en fast bærer slik som mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, talkum, cellulose, glukose, sukkrose og magnesiumkarbonat brukes. Biodegraderbare mikrosfærer (f.eks. polyacetatpolyglykolat) kan også brukes som bærere for farmasøytiske sammensetninger i denne oppfinnelsen. Passende biodegraderbare mikrosfærer er utgreiet i for eksempel US patent nr. 4,897,268 og 5,075,109.

Slike sammensetninger kan også omfatte buffere (f.eks. nøytralt buffret saltvann eller fosfatbuffret saltvann), karbohydrater (f.eks. glukose, mannose, sukkrose og dekstraner), mannitol, proteiner, polypeptider eller aminosyrer slik som glysin, antioksidanter, gelaterende agenter slik som EDTA eller glutation, adjuvanser (f.eks. aluminiumhydroksid) og/eller konserveringsmidler. Alternativt kan sammensetningene av den foreliggende oppfinnelsen formuleres som et lyofilisat. Forbindelsene kan også bli innkapslet i liposomer ved å bruke velkjent teknologi.

Hvilken som helst av en rekke adjuvanser kan brukes i vaksinene i denne oppfinnelsen. De fleste aduvanter inneholder en substans som er designet for å beskyttet antigenet fra hurtig katabolisme slik som aluminiumhydroksid eller mineralolje, og en stimulator av immunresponsene slik som lipid-A, Bortadella pertussis eller Mycobacterium tuberculosis deriverte proteiner. Passende adjuvanter er kommersielt tilgjengelige som for eksempel Freund's Incomplete Adjuvant og Complete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); aluminumsalter slik som aluminiumhydroksidgel (alum) eller aluminiumfosfat; salter av kalsium, jern eller sink; en uløselig suspensjon av acylert tyrosin acylerte sukkere; kationiske eller anioniske deriverte polysakkarider; polyfosfasenbiodegraderbare mikrosfærer; monofosforyl lipid A og quil A. Cytokiner slik som GM CSF eller interleukin-2, -7 eller -12 kan også brukes som adjuvanser.

Innen vaksinene som er gitt heri er adjuvanssammensetningen helst designet for å indusere en immunrespons dominert av Th 1-typen. Høye nivåer av TH 1-type cytokiner (f.eks. IFN-y, IL-2 og IL-12) tenderer til å favorisere induksjonen av cellemedierte immunresponser til et gitt antigen. Motsatt tenderer høye nivåer av Th2-type cytokiner (f.eks. IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 og TNF-P) å favorisere induksjon av humorale immunresponser. Etter bruk av en vaksine som er gitt heri, vil en pasient opprettholde en immunrespons som inkluderer Thl- og Th2-typeresponser. Innen en ønskelig utførelsesform, hvor en respons domineres av type Thl, vil nivået av Thl-type cytokiner øke i større grad enn nivået av Th2-type cytokiner. Nivåene av disse cytokinene kan lett måles ved å bruke standard "assay". For en oversikt av cytokinfamiliene se Mosmann og Coffman, 1989, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173.

Foretrukne adjuvanser for bruk i å få frem en dominant Thl-type respons inkluderer for eksempel en kombinasjon av monofosforyl lipid A, fortrinnsvis 3-de-O-aclyert monofosforyl lipid-A (3D-MPL) sammen med et aluminiumsalt. MPL™-adjuvanser er tilgjengelige fra Corixa Corporation (se US patent nr. 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 og 4,912,094). CpG-inneholdende oligonukleotider (hvor CpG-dinukleotidet er umetylert) induserer også en dominant Thl-respons. Slike oligonukleotider er velkjente og beskrevet for eksempel i WO 96/02555. Et annet foretrukket adjuvans er et saponin, helst QS21, som kan brukes alene eller i kombinasjon med andre adjuvanser. For eksempel involverer et "enchance" system kombinasjonen av et monofosforyl lipid-A og saponinderivat slik som kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL som beskrevet i WO 94/00153 eller en mindre reaktogen sammensetning hvor QS21 blir kvensjet med kolesterol som beskrevet i WO 96/33739. Andre foretrukne formuleringer omfatter en olje-i-vann emulsjon og tokoferol. En spesielt potent adjuvansformulering involverer QS21, 3D-MPL og tokoferol i en olje-i-vann emulsjon som beskrevet i WO 95/17210. Et annet adjuvans som kan brukes er AS-2 (Smith-Kline Beecham). Enhver vaksine som er gitt heri kan lages ved å bruke velkjente metoder som resulterer i en kombinasjon av antigen, immunrespons "enhancer" ogen passende bærer eller bindemiddel.

Sammensetningene som er beskrevet heri kan gis som del av en vedvarende frigjøringsformulering (f.eks. en formulering slik som en kapsel eller svamp som fører til en langsom frigjøring av forbindelsen etter administrering). Slike formuleringer kan generelt lagres ved å bruke velkjente teknologier og gis ved feks.oral, rektal eller subkutant implantering, eller ved implantering ved det ønskede målsetet. Vedvarende frigjøringsformuleringer kan inneholde et polypeptid, polynukleotid eller antistoff spredd i en bærermatriks og/eller at de er inne i et reservoar som er omgitt av en hastighetskontrollerende membran. Bærere for bruk innen slike formuleringer er biokompatible og kan også være biodegraderbare; helst gir formuleringen et relativt konstant nivå av den aktive komponenten som frigjøres. Mengde av aktiv komponent som finnes i en vedvarende frigjøringsformulering avhenger av setet for implantering, hastigheten og den forventede varigheten av frigjøringen og naturen av tilstanden som skal behandles eller forhindres.

Ethvert av en rekke leveringsverktøy kan brukes innen farmasøytiske sammensetninger og vaksiner for å fasilitere produksjonen av en antigenspesifikk immunrespons som har HSV-infiserte celler som mål. Leveringsverktøy inkluderer antigenpresenterende celler (APCer) slik som dendrittceller, makrofager, B-celler, monocytter og andre celler som kan lages til å være effektive APCer. Slike celler kan, men trenger ikke, være genetisk modifiserte til å øke kapasiteten for å presentere antigenet, forbedre aktiveringen og/eller opprettholdelsen av T-celleresponsen, til å ha antivirale effekter per se og/eller til å være immunolgisk kompatible med mottageren (f.eks. passe med HLA haplotype). APCer kan generelt isoleres fra enhver av en rekke biologiske væsker og organer, inkludert tumor og peritumorale vev, og kan være autologe, allogeniske, syngeniske eller xenogeniske celler.

Visse foretrukne utførelsesformer i den foreliggende oppfinnelsen bruker dendrittceller eller avkom fra de som antigenpresenterende celler. Dendrittceller er høyst potente APCer (Banchereau og Stelnman, Nature 392:245-251,1998) og er blitt vist å være effektive som et fysiologisk adjuvans for å få frem profylaktisk eller terapeutisk immunitet (se Timmerman og Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529,1999). Generelt kan dendrittceller identifiseres basert på deres typiske fasong (stjerne in situ, med markerte cytoplasmiske prosesser (dendrittes) som er synlige in vitro) og basert på mangelen av differensieringsmarkører av B-celler (CD 19 og CD20), T-celler (CD3), monocytter (CD 14) og naturlige dreperceller (CD56), som bestemmes ved å bruke standard "assays". Dendrittceller kan selvfølgelig bli laget slik at de uttrykker spesifikke celleoverflatereseptorer eller ligander som ikke vanligvis finnes på dendrittceller in vivo eller ex vivo, og slike modifiserte dendrittceller blir sett på i den foreliggende oppfinnelsen. Som et alternativ til dendrittceller kan utskilte vesikler antigelladede dendrittceller (kalt eksosomer) brukes innen en vaksine (Zitvogel et al., 1998, Nature Med. 4:594-600).

Dendrittceller og deres avkom kan fås fra perifert blod, beinmarg, tumorinnfiltrerende celler, peritumorale vevinnfiltrerende celler, lymfeknuter, milt, hud, navlestrengsblod eller ethvert annet passende vev eller væske. For eksempel kan dendrittceller differensieres ex vivo ved å tilsette en kombinasjon av cytokiner, slik som GM-CSF, IL-4, IL-13 og/eller TNFa til kulturer med monocytter som er høstet fra perifert blod. Alternativt kan CD34 positive celler som er høstet fra perifert blod, navlestrengsblod eller beinmarg differensieres til dendrittceller ved å tilsette kulturmediet kombinasjoner av GM-CSF, IL-3, TNFa, CD40-ligand, LPS, flt3-ligand og/eller andre forbindelser som induserer modning og proliferasjon av dendrittceller. Dendrittceller blir passende kategorisert som "umodne" og "modne" celler som tillater en enkel vei for å skille mellom to godt karakteriserte fenotyper. Imidlertid må ikke denne nomenklaturen tolkes slik at alle mulige mtemediattrinn i differensieringen ekskluderes. Umodne dendrittceller erkarakterisertsom APC med en høy kapasitet for å ta opp antigen og prosessere dem, noe som korrelerer med høy ekspresjon av Fcy-reseptor, mannose-resepotor og DEC-205 markør. Den modne fenotypen er typiskkarakterisert veden lavere ekspresjon av disse markørene, men en høy ekspresjon av celleoverflatemolekyler som er ansvarlig for T-celle aktivering, slik som klasse I og klasse II MHC, adhesjonsmolekyler (f.eks. CD54 og CD11) og kostimulatoriske molekyler (f.eks. CD40, CD80 og CD86). APCer kan generelt bli transfektert med et polynukleotid som koder for et polypeptid (eller del eller andre varianter av det) slik at polypeptidet, eller en immunogen del av det, blir uttrykt på celleoverflaten. Slik transfeksjon kan finne sted ex vivo, og en sammensetning eller vaksinasjon som omfatter slike transfekterte celler kan så brukes for terapeutiske formål, som beskrevet heri. Alternativt kan et genleveringsverktøy som har som mål en dendrittisk eller en annen antigenpresenterende celle gis til en pasient, noe som resulterer i transfeksjon som finner sted in vivo. In vivo og ex vivo transfeksjon av dendrittceller, kan for eksempel generelt utføres ved å bruke enhver metode som er kjent i faget, slik som de som er beskrevet i WO 97/24447 eller i gen "gun" tilnærmingsmåten som er beskrevet i Mahvi et al., 1997, Immunology and Cell Biology 75:456-460. Antigenlading av dendrittceller kan oppnås ved å inkubere dendrittcellene eller avkomceller med tumorpolypeptid, DNA (nakent eller inn i en plasmidvektor) eller RNA; eller med antigenekspresserende rekombinante bakterier eller virus (f.eks. vaksinia, fowlpox, adenovirus eller lentivirusvektorer). Før lading kan polypeptidet bli kovalent konjugert til en immunologisk partner som gir T-cellehjelp (f.eks. et bærermolekyl). Alternativt kan en dendrittcelle pulses med en ikke-konjugerende immunologisk partner, separat eller i nærvær av polypeptidet.

Administreringen av sammensetningene

Behandling inkluderer profylakse og terapi. Profylakse eller behandling kan oppnås ved en enkel direkte injeksjon på et enkelt tidspunkt eller flere tidspunkt. Administrering kan også være omtrent samtidig på flere seter. Pasienter eller individer inkludert pattedyr slik som menneske, bovin, ekvin, kanin, felin, porcin og ovine dyr. Fortrinnsvis er pasientene eller individene mennesker.

Sammensetningene blir typisk gitt in vivo via parenteral (f.eks. intravenøs, subkutan og intramuskulær) eller andre tradisjonelle direkte ruter slik som bukale/sublinguale, rektale, orale, nasale, topikale (slik som transdermale og oftalmiske), vaginale, pulmonare, intraarteriale, intraperiotoneale, intraokkulare eller intranasale ruter, eller direkte i et spesifikt vev.

Sammensetningene blir gitt på en passende måte, ofte med farmasøytisk akseptable bærere. Passende metoder for å gi celler i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen til en pasient er tilgjengelige og selv om flere enn en rute kan brukes for å gi en spesiell cellesammensetning, kan en spesiell rute ofte gi en mer øyeblikkelig og effektiv reaksjon enn andre ruter.

Dosen som gis til en pasient i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen skulle være tilstrekkelig for å få en heldig terapeutisk respons i pasienten over tid, eller for å hemme infeksjonen eller sykdommen som skyldes infeksjonen. Således blir sammensetningen gitt til en pasient i en mengde som er tilstrekkelig for å få frem en effektiv immunrespons til de spesifikke antigenene og/eller for å lette, redusere, kurere eller i det minste delvis arrestere symptomer og/eller komplikasjoner fra sykdommen eller infeksjonen. En mengde som er adekvat for å utføre dette blir definert som en "terapeutisk effektiv dose".

Dosen vil bli bestemt av aktiviteten sammensetningen produserte og tilstanden til pasienten, så vel som kroppsvekten eller overflateområdene til pasienten som skal behandles. Størrelsen på dosen vil også bestemmes av eksistens, natur og graden av enhver uheldig sideeffekt som følger administreringen av en bestemt sammensetning i en bestemt pasient. I bestemmelsen av den effektive mengden av sammensetningen som skal administreres i behandling eller profylakse av sykdommer slik som HSV-infeksjon behøver legen å evaluere produksjonen av en immunrespons mot viruset, progresjonen av sykdommen og enhver behandlingsrelatert toksisitet. For eksempel kan en vaksine eller andre sammensetninger som inneholder en subenhet av HSV-proteinet inkludere 1-10.000 (ig av HSV-protein per dose. I en foretrukket utførelsesform er 10-1000 ug av HSV-protein inkludert i hver dose, en enda mer foretrukket utførelsesform 10-100 ug av HSV-proteindose. Helst blir en dose selektert slik at en enkel dose vil være tilstrekkelig eller alternativt blir flere doser gitt over en tid på flere måneder. For sammensetninger som inneholder HSV-polynukleotider eller peptider, blir lignende kvantiteter gitt per dose.

I en utførelsesform kan mellom 1 og 10 doser gis over en 52-ukers periode. Fortrinnsvis blir 6 doser gitt med intervaller på 1 måned og "booster" vaksinasjoner kan gis periodevis etter det. Alternerende protokoller kan være passende for individuelle pasienter. En passende doser er en mengde av en forbindelse som, når den gis som beskrevet over, er i stand til promotere en antiviral immunrespons og er minst 10-50% over basal (f.eks. ubehandlet) nivået. Slike vaksiner skulle også være istand til å forårsake en immunrespons som fører til et forbedret klinisk utbytte i vaksinerte pasienter sammenlignet med ikke-vaksinerte pasienter. Generelt for farmasøytiske sammensetninger og vaksiner som består av et eller flere polypeptider, er mengde av hvert polypeptid tilstede i en dose i området fra ca. 0,1 \ xg til ca. 5 mg pr/kg av verten. Helst er mengden i området fra ca. 10 til ca. 1000 ug per dose. Passende volumer for administrering vil variere med størrelse, alder og immunstatus til pasienten, men vil typisk være i området fra 0,1 ml til ca. 5 ml, med volumer mindre enn ca. 1 ml som det mest vanlige.

Sammensetninger som omfatter immunceller blir helst preparert fra immunceller som er fått fra individer til hvem sammensetningen vil bli gitt. Alternativt kan immuncellene lages fra en HLA-kompatibel donor. Immuncellene fås fra individet eller donoren ved å bruke konvensjonelle teknikker som er kjent i fagfeltet, utsettes for APCer som er modifisert for å presentere en epitop fra oppfinnelsen, ekspandert ex vivo og administrert til individet. Protokoller for ex v/vo-terapi er beskrevet i Rosenberg et al., 1990, New England J. Med. 9:570-578.1 tillegg kan sammensetninger omfatte APCer som er modifisert til å presentere en epitop fra oppfinnelsen.

Immunceller kan generelt fås i tilstrekkelige mengder for adoptiv immunterapi ved vekst in vitro som beskrevet heri. Dyrkningsbetingelser for ekspandering for å ekspandere enkle antigenspesifikke effektorceller til flere billioner i antall med retensjon av antigengjenkjennelse in vivo er velkjent i fagfeltet. Slike in vitro dyrkningsbetingelser bruker typisk tilbakevendende stimuleringer med antigen, ofte i nærvær av cytokiner (slik som IL-2) og ikke delende foringsceller. Som nevnt over, kan immunoreaktive polypeptider som gis heri brukes for å anrike og hurtig ekspandere antigenspesifikke T-cellekulturer for å generere et tilstrekkelig antall celler for immunterapi. Spesielt kan antigenpresenterende celler slik som dendritter, makrofager, monocytter, fibroblaster og/eller B-celler pulses med immunreaktive polypeptider eller transfekteres med et eller flere polynukleotider ved å bruke standardteknikker velkjent i fagfeltet. For eksempel kan antigenpresenterende celler transfekteres med et polynukleotid som har en promoter som er passende for økt ekspresjon i et rekombinant virus eller andre ekspresjonssystemer. Dyrkede effektorceller for bruk i terapi må være istand til å gro og distribueres vidt og til å overleve langtids in vivo. Sturider har vist at dyrkede effektorceller kan induseres til å gro in vivo og til å overleve lang tid i betydelig antall ved repetert stimulering med antigen som er supplementert med IL-2 (se for eksempel Cheever et al., 1997, Immunological Reviews 157:177).

Administrering ved mange av de rutene for administrering som er beskrevet heri og andre som er kjent i fagfeltet kan oppnås enkelt ved direkte administrering ved å bruke en nål, kateter eller relatert utstyr ved et enkelt tidspunkt eller ved flere tidspunkt.

In vivo testing av indentifiserte antigener

Konvensjonelle teknikker kan brukes for å bekrefte in vivo kraften til det identifiserte HSV-antigene. For eksempel bruker en teknikk en museutfordringsmodell. De som er kjent i fagfeltet vil imidlertid være klart over at disse metodene er rutine, og at andre modeller kan brukes.

Med en gang en forbindelse eller en sammensetning som skal testes er blitt lagret, blir musen eller andre individer immunisert med en serie av injeksjoner. For eksempel kan opp til 10 injeksjoner gis over et tidsaspekt på flere måneder. Typisk går det en til fire uker mellom dosene. Etter den siste injeksjonen i serien, blir individet utfordret med en dosevirus som er etablert til å være en uniformt dødelig dose. En kontrollgruppe mottar placebo, mens den eksperimentelle gruppen blir aktivt vaksinert. Alternativt kan en studie designes ved å bruke subdødelige doser. Valgfritt kan en doseresponsstudie inkluderes. Endepunktene som skal måles i denne studien inkluderer død og flere neurologiske forstyrrelser vist ved f.eks. ryggmarg"gate". Overlevende kan også ofres for kvantitative virale kulturer av nøkkelorganer inkludert ryggmargen, hjernen og injeksjonssetet. Kvantiteten av virus som er tilstede i oppmåplte vevsprøver kan måles. Sammensetningene kan også testes i tidligere infiserte dyr for redaksjon i tilbakekomst for å bekrefte kraften som en terapeutisk vaksine.

Kraften kan bestemmes ved å kalkulere IC50som indikerer mikrogram vaksine pr/kg kroppsvekt som trengs for en 50% beskyttelse av individene fra død. IC50vil avhenge av utfordringsdosen som er brukt. I tillegg kan man kalkulere LD50, som indikerer hvor mange infeksiøse enheter som trengs for å drepe halvdelen av individene som får en bestemt dose av vaksinen. Bestemmelsen av det post morten virale titeret gir bekreftelsen at viral replikasjon var begrenset av immunsystemet.

Et etterfølgende trinn i testingen ville være en vaginal inokkuleringsutfordring. For akutte beskyttelsesstudier kan mus brukes. Fordi de kan studeres for både akutt beskyttelse og hindring av tilbakevendelse, marsvin gir et mer fysiologisk relevant individ for ekstrapolering til mennesker. I denne type utfordring blir en ikke-dødelig dose gitt, marsvinene utvikler lesjoner som heler og tilbakevender. Målinger kan inkludere både akutt sykdomsforbedring og tilbakekomst av lesjoner. Intervensjonen med vaksine eller andre sammenstillinger kan gis før eller etter inokkuleringen, avhengig av om en ønsker å studere hindring vis a vis terapi.

Metoder

Oppfinnelsen bidrar med en metode for behandling og/eller hindring av HSV-infeksjon i et individ. Metoden omfatter adrriinistrering av en sammensetning i oppfinnelsen til et individ. Sammensetningen kan brukes som en terapeutisk eller profylaktisk vaksine. I en utførelsesform er HSV HSV-2. Alternativt er HSV HSV-1. Oppfinnelsen bidrar i tillegg med en metode for hemme HSV-replikering for å drepe HSV-infiserte celler, for å øke sekresjonen av lymfokiner som har antivirale og/eller immunmodulatorisk aktivitet, og for å øke produksjonen av herpesspesifikke antistoffer. Metoden omfatter å utsette en HSV-infisert celle med en immuncelle rettet mot et antigen i oppfinnelsen, for eksempel som beskrevet i eksemplene som presenteres heri. Kontakten kan utføres in vitro eller in vivo. I en foretrukket utførelsesform er immuncellen er T-celle. T-cellene inkluderer CD4 og CD8 T-celler. Sammensetningene i oppfinnelsen kan også brukes som en tolererbar agent mot immunopatologisk sykdom.

I tillegg bidrar oppfinnelsen med en metode for å produsere immunceller som er rettet mot HSV. Metoden består i å sette en immuncelle i kontakt med en antigenpresenterende celle, hvor den antigenpresenterende cellen er modifisert til å presentere et antigen som er inkludert i et polypeptid i oppfinnelsen. Helst er den antigenpresenterende cellen en dendrittcelle. Cellen kan modifiseres ved for eksempel peptidloading eller genetisk modifisering med en nukleinsyresekvens som koder for polypeptidet. I en utførelsesform er immuncellen en T-celle. T-celler inkluderer CD4-og CD8 T-celler. Det blir også bidratt med immunceller produsert ved metoden. Immuncellene kan brukes for å hemme HSV-replikering, drepe HSV-infiserte celler, in vitro eller in vivo, til å øke sekresjonen av lymfokiner som har antiviral og/eller immunmodulatorisk aktivitet, til å øke produksjon av herpesspesifikke antistoffer, eller i behandling eller hindring av HSV-infeksjon i et individ.

Oppfinnelsen bidrar med metoder for å identifisere immunogene epitoper som er assosiert med infeksiøse organismer. I en utførelsesform består metoden i å preparere en samling med tilfeldige fragmenter fra organismens genom. Prepareringen kan bestå i å fordøye hele genomet, selv om det ikke er nødvendig å begynne med hele genomet. Fordøyingen omfatter helst å sette genomet i kontakt med et eller flere restriksjonsenzymer for å få en samling av tilfeldige fragmenter som har lengder i et ønsket område. Alternativt kan man sonikere, nebulisere eller på annen måte behandle materialet som inneholder genomet av interesse og isolere fra en gel fragmenter av passende størrelse.

Fordøyingen og seleksjon av restriksjonsenzymer er designet for å få fragmenter fra genomet som er lengre enn gjennomsnittsstørrelsen til en T-celle i epitop, f.eks. størren enn ca. 30 nukleotider i lengde. Fortrinnsvis er fragmentene små nok slik at genetiske stopp er sjeldne, f.eks. 200 til ca. 500 basepar i lengde. Der hvor den genomiske sekvensen eller et restriksjonskart til en organisme av interesse er kjent, kan man analysere genomet for å identifisere restriksjonsseter som, hvis det blir behandlet med passende restriksjonsenzymer, vil resultere i et ønsket antall av fragmenter av en passende lengde. Restriksjonsenzymene kan også velges til målseter som er kompatible med seter i en kloningsvektor som skal brukes.

De tilfeldige fragmentene kan så brukes for å uttrykke polypeptider som kodes for av fragmentene. Fragmentene kan uttrykkes individuelt eller fortrinnsvis som en "pool" av polypeptider, enten alene eller som fusjonsproteiner. Fagfolk vil forstå at polypeptidene kan uttrykkes fra enten DNA eller RNA som et startmateriale. For eksempel kan ekspresjon av polypeptider fra RN A-virus oppnås ved først å lage et cDNA fra RNA-fragmentet og så bruke cDNA til å uttrykke polypeptidet.

Polypeptidet kan uttrykkes fra en vektor som inneholder fragmenter fra genomet. I en foretrukket utførelsesform er vektoren et plasmid, slik som en pcDNA1.3(+)-vektor. Fagfolk vil skjønne at andre vektorer kan brukes som er istand til å uttrykke polypeptider fra et "insert". Helst blir polypeptidet uttrykt som et fusjonsprotein. I en utførelsesform består ekspresjonen av å dyrke en vertcelle som er transfektert eller trandusert med en vektor som inneholder fragmenter fra genomet. I en foretrukket utførelsesform av denne metoden blir fragmentene ligert inn i ekspresjonsvektorer i de tre forskjellige leserammene, og i begge retningene for å lage et bibliotek.

Kvaliteten av biblioteket kan forbedres ved å ligere genomfragmentene ved å bruke en partiell fyll-inn-reaksjon. For eksempel kan de "sticky" endene som er laget ved fordøying av HSV-2 med Sau3A I resultere i ligering av flere virale fragmenter til hverandre og i en variasjon av orienteringer. En partiell fyll-inn-reaksjon kan brukes for å modifisere de "sticky" endene slik at fragmentene fra viralgenomet ikke vil ligere til hverandre, og bare et viralt "insert" vil være tilstede i hver vektor. Dette resulterer i et bibliotek som er enklere og mindre tidsforbrukende å analysere.

Metoden omfatter viderere å undersøke evnen det uttrykte polypeptidet har for å få frem en immunrespons. Evnen til å få frem en immunorespons er en indikering på nærværet av en immunogen epitop innen polypeptidet. I en utførelsesform er immunresponsen en cellulær immunrespons. Undersøkelsen kan bestå i å utforme et "assay" som måler T-celle simulering eller aktivering. Eksempler på T-celler inkluderer CD4 og CD8 T-celler.

Et eksempel på en T-celle stimulerings"assay" er et cytotoksisk "assay" slik som det som er beskrevet i Koelle, DM et al., Human Immunol. 1997, 53:195-205.1 et eksempel består det cytotoksiske "assayet" å sette en celle som presenterer det antigene virale peptidet i kontekst med passende HLA-molekyl i kontakt med en T-celle, og detektere evnen som T-cellen har til å drepe den antigenpresenterende cellen. Celledreping kan detekteres ved å måle frigjøring av radioaktivt51 Cr fra den antigenpresenterende cellen. Frigjøring av51 Cr til mediet fra den angitenpresenterende cellen er en indikasjon på celledreping. Et eksemplarisk kritene for å øke drepingen er en statistisk signifikant økning i "counts" per minutt (cpm) basert på å telle<51>Cr-stråling i media som er samlet fra antigenpresenterende celler blandet med T-celler sammenlignet med kontrollmedia som er samlet fra antigenpresenterende celler blandet med media.

"Assayet" kan utformes på polypeptidpoler for å identifisere poler som inneholder aktive deler. Videre undersøkelser kan så utføres på økende mindre "subset" av de originale "poolene" for å isolere polypeptider av interesse. Materialer som inneholder et fragment av interesse, feks. et plasmid med sitt virale "insert" kan renses og det virale fragmentet sekvenseres. Basert på den sekvensinformasjonen man får kan syntetiske peptider lages for etterfølgende testing og bekreftelse på de identifiserte antigenene. Sekvensering av fragmentene kan også føre til identifiseringen av nye gener. De foregående metodetrinnene kan så repeteres, hvor subfragmentene av de genomiske fragmentene blir preparert. Økende mindre fragmenter kan uttrykkes og testes for å bestemme den minimale epitopen.

Metoden i oppfinnelsen kan brukes på en rekke infeksiøse organismer, inkludert bakterier, parasitter og virus. Foretrukne virus er de som inneholder DNA uten intron eller for det meste kodende sekvens. Eksempler på viruser inkluderer dobbelttådet DNA-virus, enkelttrådet DNA-virus, dobbelttrådet RNA-virus og enkelttrådet RNA-virus. Eksempler på dobbelttrådet DNA-virus inkluderer, men er ikke begrenset til Epstein-Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV), herpes simplex virus-1 (HSV-1), HSV-2, varicella-zoster virus (VZV), humant herpes virus-6 (HHV-6), HHV-7, HHV-8, poxvirus og adenovirus. Eksempler på enkelttrådet DNA-virus inkluderer, men er ikke begrenset til parvovirus. Eksempler på dobbelttrådet RNA-virus inkluderer, men er ikke begrenset til retrovirus og reovirus. Eksempler på enkelttrådet RNA-virus inkluderer, men er ikke begrenset til paramyxovirus, myxovirus og flavivirus.

Siden metoden ikke krever kjennskap til organismens nukleinsyresekvens, bidrar den med en strategi for å bekjempe infeksiøse organismer som viser en stor grad av biologisk variabilitet (feks. HIV og HCV). For virus som har en høy variabilitet er det en fordel å bruke en kilde av virale nukleinsyrematerialer derivert fra en bestemt pasient, et bestemt sete (f.eks.blod, hud, cervix) eller representative virale stammer som sirkulerer i en bestemt geografisk region eller pasientpopulasjon, som kan skille seg fra prototypiske stammer med kjent nukleinsyresekvens.

I en foretrukket utførelsesform er organismen HSV-2 og fragmentene fra det virale genomet blir laget ved fordøying med Sau3A I. Eksempler på andre restriksjonsenzymer som kan brukes inkluderer, men er ikke begrenset til Apa I, Sma I og Alu I. Fragmentene fra genomets DNA blir så ligert inn i en vektor, helst ved å bruke en partiell fyll-inn reaksjon (se 1999 Strategene katalogen, s. 56). En foretrukket vektor er et medlem av pcDNA3. l(+)his seriene. Fragmentene blir så uttrykket ved å bruke konvensjonelle teknikker. Fortrinnsvis blir ekspresjonen utført ved å bruke en Cos-7 transfeksjonsmetode (De Plaen E et al. In: Lefkowits I, red. Immunology Methods Manual, v. 2, New York: Academic Press, 1997:691-718).

Vertcellene kan kotransfekteres med et nukleinsyremolekyl slik som cDNA, som koder for et relevant HLA-molekyl, slik som en HLA-tungkjede. HLA-molekylet gjør at en vertcelle fra en art (f.eks. ape i tilfellet av Cos-celler) forskjellig fra T-celle kilden, er istand til å gjenkjenne antigenet derivert fra de infeksiøse agentene. HLA-molekylet blir selektert for å "matche" HLA-molekylet som er istand til å presentere målantigenet. Metoder for å identifisere det passende HLA-molekylet er beskrevet i Koelle, DM et al., J. Infectious Dis. 1994,169:956-961; og DePlaen, E. et al. In Immunolgoy Methods Manual, 1997, Academic Press, 704-705.1 fravær av en definitiv identifikasjon av det presenterende HLA-molekylet, kan cDNA som koder for to eller flere kandidat klasse I HLA-molekyler kotransfekteres.

Evnen det uttrykte polypeptidet har til å få frem en cellulær immunrespons blir så undersøkt. Evnen til å få frem en cellulær immunrespons er en indikasjon på nærværet av en immunogen epitop. Undersøkelser som kan brukes for å oppdage evnen til å få frem en cellulær immunrespons inkluderer, men er ikke begrenset til cytotoksiske "assays" og lymfokine sekresjons"assays". I en utførelsesform er "assayet" et interferon-gamma "assay".

I en foretrukket utførelsesform bidrar oppfinnelsen med en metode for å identifisere

HSV-epitoper som er immunogene for CD8+ T-celler. Metoden omfatter å få CD8+ T-celler fra en HSV-lesjon og undersøke disse T-cellene for å identifisere T-celler som har evnen til å gjenkjenne HSV-infiserte celler. Videre består metoden i å få og fragmentere en nukleinsyrepreparasjon fra HSV, uttrykke et eller flere fragmenter av denne nukleinsyren og undersøke de uttrykte fragmentene for antigen reaktivitet med de identifiserte HSV-spesifikke T-cellene. Et uttrykt fragment som har reaktivitet med de HSV-spesifikke T-cellene blir identifisert som å kode for en HSV-epitop immuogen for CD8+ T-celler.

Oppfinnelsen bidrar også med et diagnostisk "assay". Det diagnostiske "assayet" kan brukes for å identifisere den immunologiske responsen til en pasient som er mistenkt for å ha en herpes infeksjon og å forutsi responsen til et individ på en bestemt type terapi. "Assayet" består i å utsette T-celler fra et individ til et antigen i oppfinnelsen, i sammenheng med en passende APC, og teste for immunreaktivitet ved for eksempel å måle IFNy, proliferasjon eller cytotoksisitet. Passende "assays" er beskrevet i mer detalj 1 eksemplene.

EKSEMPLER

Følgende eksempler er presentert for å illustrere den foreliggende oppfinnelsen og for å hjelpe en vanlig fagmann i å lage å bruke dem. Eksemplene er ikke på noen måte ment å begrense målet for oppfinnelsen.

Eksempel 1: Deteksjon av HSV-spesifikk CD8 CTL i tilbakevendende genitale HSV-2-lesjoner

Dette eksempelet demonstrerer at spesifikk CD8 CTL lokaliseres til genitale HSV-2 lesjoner. Dette er vist ved serielesjons biopsistudier av tilbakevendende genitale HSV-2-lesjoner ved å bruke celler som har fått antigen/APC in situ og som ikke blir restimulert med antigen in vitro før "readout assays".

Matrialer og metoder

Lesjonsinifltrerende lymfocytter (LIL) ble utvidet ved en sykel med fytohemaglutinin (PHA) og IL-2 i nærvær av 50 uM acyklovir (ACV). Typisk ble 5 x IO<6>- 5 x 10<7->celler oppnådd etter 2 uker. Fenotypen til disse bulkpopulasjonene er blitt beskrevet (Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998:101:1500-1508). Blant TCR ap, CD3+ celler er det et gradvis skift til CD8 predominans etter som lesjonene modnes og kulturene blir negative.

Resultater

Den lokale responsen hadde høye nivåer av NK-celleaktivitet som bestemt ved lysis av K562 og allogenisk, HSV-2 infisert lymfocytt kontinuerlig linje (LCL) så tidlig som dag 2 etter symptomene. NK-celler ble selektivt anriket i celler ekspandert fra lesjoner sammenlignet med normal hud. HSV- spesifikke CD4-celler ble på samme måte anriket tidlig. Lesjonene var anriket i både "Thl" (interferon-gamma (IFN-y), IL 12 p40, IL2) og "Th2" (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) mRNA (Van Voorhis WC et al., J. Infect. Dis.

1996; 173:491-95). Det cytokine mønsteret til lesjonsinnfiltrerende HSV-2 spesifikke CD8 CTL inkluderer interferon-gamma.

I motsetning til CD4 og NK-aktiviteter, infiltrerte HSV-spesifikk CTL tilbakevendende HSV-2 genital lesjon ved et senere tidspunkt (typisk dag 5-9) og deres nærvær korrelerte med virus "clearance" (Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998:101:1500-1508). CD4 og CD8 komponentene ble studert ved å subtrahere NK og så enten CD4 eller CD8-celler. CTL-aktiviteten ble observert i enten CD8-cellene alene eller i begge subsettene. EBV-transformert LCL (Tigges MA et al., J. Virol. 1992; 66:1622-34) ble brukt som målceller i CTL-"assayene" fordi autologe celler ble passende laget, HSV gjennomgår fullstendig lytisk replikasjon i disse cellene og høye nivåer av HLA og kostimulatoriske/adhesjonsmolekyler er tilstede.

HSV-spesifikke CD8-kloner (Tabell 1) er isolert fra herpes vesikkelvæske (Koelle DM et al., J. Infect. Dis 1994;169:956-61) og lesjoner (Koelle DM et al, J. Clin. Invest. 1998;101:1500-1508). Sekundær restimulering med antigen ble ikke brukt. Mange (>1000) mikrokulturer med CD8-anrikede celler ble klonet ved 0,3-2 celler/brønn ved standard metoder (Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998;101:1500-1508) og -200 kloner ble screenet i CTL-"assayene" mot auto log LCL med og uten 18 timers infeksjon med HSV-2 (multiplisitet av infeksjon, eller MOI, 10). Alle klonene var CD3/8/TCR aP(+) og CD4fTCR y8(-) ved flytcytometri.

<1>Lokalisering av epitop innen standardkart (Dolan A et al., J. Virol. 1998;72:2010-21) av HSV-2 genomet; epitop kartlegging for HSV-2-typespesifikk TCC bruker HSV-1 X HSV-2 intertypiske rekombinante virus (IRV) (Preston VG et al, J. Virol., 1978;28:499-517) som beskrevet (Koelle DM et al., J. Virol. 1994;68:2803-10; Koelle DM et al., J. Virol. 1998;72:7476-83). Grensene er omtrentlige. 2 HLA allele begrenset dreping av HSV-2-infisert delvis matchet LCL som beskrevet (Koelle DM et al, J. Infect. Dis. 1994;169:956-61); serologisk eller DNA-definisjoner som tillatt ved typemetoden.

<3>dkRW22. RW22 og RW. 1991.22 refererer seg til en T-celleklone derivert fra individ R W i 1991. To kloner ble gitt betegnelsen "22" ble hver for seg derivert fra R W i 1991. Gjennom denne søknaden blir de to separat deriverte klonene skilt ved dkRW22 og cpRW22.

For å måle diversiteten på CD8 responsen ble TCR Vp-analyse utført på bulk, positiv selekterte CD8+ celler fra LIL ekspandert en syklus med PHA (kildekultur for CD8 CTL klonen RW51, Tabell 1 og under), så vel som CD8-celler fra PBMC fra samme donor. Total RNA (Chomczynski P et al., i: Coligan JE et al., red. Current Protocols in Immunology. New York: John Wiley and Sons 1992:10.11.7-10.11.14) ble reverstranskribert med oligo-dT primer og MMLV RT (Pharmacia). cDNA ble brukt i 24 separate PCR reaksjoner med Cp primer og familiespesifikke Vp primere. Etter 30 sykluser med PCR ble en allikvot av hver reaksjon blandet med et fluorescensmerket intern cp primer og PCR fortsatte i 5 sykluser til for å merke amplimerer av rearrangerte TCRVP-gener. Primere og protokoller ble beskrevet i Pannetier C et al., i: Oksenberg JR, red. The antigen T cell receptor: selected protocols and applications. New York: Chapman and Hall, 1998:Section 9. Analyse ved ABI-sekvensator med fluorescerende MW-markører ble gjort ved Biotechnology Core ved Fred Hutchinson Cancer Research Center (Seattle, WA). CD8 PBMC ble veldig polyklonal bedømt ved Poisson-distribusjon og multiple topper innen TCR Vp amplimert "stigene" (Figur IA), mens lesjon CD8-populasjonen viste seg å være ganske oligoklonal (Figur IB). Lignende resultater ble oppnådd for andre donorer. Disse data er i overensstemmelse med begrenset diversitet av den lokale CD8-responsen i HSV-2-lesjonene.

Eksempel 2 Deteksjon av HSV-spesifikke T-celleresponser i cervikale lymfocytter

Mukosale immunresponser segregeres fra PBMC og lokalisering av HSV-spesifikk CTL til mukosa hos mus er assosiert med beskyttelse fra vaginal inokkulasjon. Dette eksempelet demonstrer at HSV-spesifikke T-celler, inkludert CD8+ celler kan oppdages i cervikale lymfocytter.

Celler fra en representativ cervikal cytobrush prøve ble samlet under et aktivt genitalt HSV-2 utbrudd og ekspandert i bulk med PHA/IL-2, og deretter analysert for HSV-spesifikke proliferativer (Figur 2A) og cytotoksiske responser (Figur 2B). Prolifererings og cytotosisitetassay brukte autologe PBMC eller LCL som APC som beskrevet over for hud-deriverte lymfocytter. Anti-HLA klasse I mAb W6/32 eller anti-HLA DR mAb L243 ble brukt som beskrevet (Koelle DM et al., J. Virol. 1994, 68:2803-10; Koelle DM et al., J. Infect. Dis. 1994, 169:956-61). Antigenspesifikke proliferative responser og cytotoksiske responser var tilstede. Fraksjonerings- og mAb-inhiberingsstudier viser et bidrag av CD8 CTL til den cytotoksiske responsen.

Eksempel 3 Deteksjon av HSV-spesifikke T-celleresponser i primære genitale HSV-2-lesjoner

I dette eksempelet ble biopsiprøver samlet fra en pasient som hadde symptomer som var i overensstemmelse med primær genital HSV-2-infeksjon. Fenotypen av de samlede cellene ble bestemt og LIL og PBMC fra prøvene ble utsatt for proliferative og cytotoksiske "assays". Resultatene viser at de HSV-spesifikke proliferative og cytotoksiske responsene til CTL som er tilstede i primære genitale HSV-2-lesjoner er typiske for de man ser under tilbakevendende sykdom.

CW7477 utviklet dysuria, feber, "buttock" og lavere abdome lesjoner tre dager etter hans siste seksuelle kontakt. Lesjonene varte i 13 dager og grodde HSV-2. Acyklovirbehandling ble startet på dag 4 av symptomene. Biopsier ble utført på dag 4 og dag 7. Serostatus var atypisk positive (bare noen få bånd tilstede på immunoblot) ved dag 4, med flere bånd, men fremdeles mindre enn de fleste konvalesentsera på dag 26 ved øket kjemiluminiscens (ECL; Dalessio J. Og Ashley R. J. Clin. Microbiol. 1992, 30(4): 1005-7) variant av typespesifikk HSV-2 immunoblot. Kliniske- og laboratoriedata var i overensstemmelse med primær genital HSV-2-infeksjon. Biopsiprøver ble tatt på dag 4 og 7 av symptomer og bulk-LIL ekspandert med PHA/IL-2 som beskrevet over.

Fenotypen til de ekspanderte cellene var splittet mellom CD4- og CD8-celler med 15-25% Cd3+/CD 16,56+ celler og 5-10% TCR y8 + celler i LIL. I sammenligning hadde celler fra normal hud nesten ikke CD 16,56 (+) begivenheter og ingen TCR y8-celler. Naturen til CD3+/CD 16,56+ cellene er ukjente, men disse sees ofte i ekspanderte LIL. Antistoffcoktailen har en kombinasjon av aCD16-PE og aCD56-PE.

2 Bulkceller brukt ved 20:1 effektor:målratio i51 Cr frigjøring versus auto log (au) eller

HLA "mismatched" (al) LCL-infisert 18 timer, MOI 10 som indikert (v=vaksinia). CD8+ celler anriket ved MidiMacs (Miltenyi). Resultatene er % spesifikk frigjøring;

spontan frigjøring <22%.

De HSV-spesifikke proliferative og cytotoksiske responsene var klart typiske til de som ble detektert under tilbakevendende sykdom (Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998;

101:1500-1508). Kryssreaktive responser til HSV-1 og HSV-2 var tilstede, det var også antigenspesifikke responser til HSV-glykoproteiner. Normale hudresponser var lave og PBMC-responsene ble utviklet ved dag 15.

Eksempel 4 Identifisering av et ICPO-antigen gjenkjent av HSV-spesifikk CD8

CTL

Dette eksempelet demonstrerer via ekspresjonskloning antigenisiteten av ICPO. Spesielt blir en epitop innen aminosyre 92-101 av ICPO identifisert. I tillegg blir antigenisiteten til ICPO bekreftet ved å bruke vaksinia. Aminosyrenummereringen som brukes er nomenklaturen og nummereringen til Dolan et al., J. Virol 1998, 72:2010-21.

Materialer og metoder

Cos-7-ekspresjonskloningsmetoden til Boon et al. ble brukt for ekspresjonskloning (De Plaen E et al., In: Lefkowits I. Red. Immunology Methods Manual, v. 2 New York: Academic Press, 1997, 691-718). Interferon-gammasekresjon ble testet som en CD8 T-celle "readout" ved å plate 1 x 10<4>vaskede autologe LCL stimulatorer (mock- eller HSV-2 infisert ved MOI 10 i 18 timer) og 5 x IO<4>TCC-responder i triplikat i 24 timer i 200 ul TCM (Tigges MA et al., J. Virol. 1992, 66:1622-34).

Bibliotekene brukte pcDNA3.1 (+) his A, B og C (Invitrogen) som ekspresjonsvektorer. Disse spesifikke vektorene har en indre ATG start 5' til deres multiple kloningssete (MCS), og gir fusjonsproteiner med et lederpeptid og et viralt polypeptidfragment. Det er en 1/6 sjanse for at ethvert viralt DNA-fragment vil være "forward" eller "in-frame" med ATG. Derfor blir tre vektorer (A, B og C) brukt med et ekstra 0, 1 eller 2 bp mellom ATG og MCSen.

Bibliotekene ble laget fra HSV-2-stamme HG52 DNA renset (MacLean AR. In: Brown SM, MacLean AR, red. Methos in Molecular Medicine: Herpes Simplex Virus Protocols, v. 10, Totowa, NJ: Humana Press Inc., 1998, 19-25) fra Veroceller. Det -155.000 bp genomet ble fordøyet med Sau3A I, forutsagt til å gi 456 fragmenter med en gjennomsnittlengde på flere hundre basepar. Endende ble partielt fylt inn og fragmentene legert til Xba I-fordøyd, partielt fylt-i defosforylert A-, B- og C-vektorer i separate reaksjoner for primære biblioteker. Partiell fyll-inn hindrer ligering av mer enn et "insert" per vektor. Kontaminering med celle-DNA ble ikke oppdaget i 20 tilfeldige valgte kloner. Primære laboratorier ble amplifisert øyeblikkelig og oppbevart som alikvoter. Målet på 6-ganger genomisk oversampling ble oppnådd, antatt at hvert bibliotek var bare 1/6 "forward og in-frame": hvert primært bibliotek hadde mer enn 15000 transformanter. 3000 kloner per bibliotek ble studert. Bibliotekene ble titrert og fortynnet til 15 kloner per brønn i dype mikrotiterplater. DNA ble renset (Millipore 96-brønners format; silika kjemi) etter 18 timers rotasjon ved 300 rpm, 37°C. Utbytter på omtrent 10 ug/brønn (spektrofotometer) ble oppnådd, nok til mange fremtidsscreeninger.

Lesjonsklonene RW51 (Tabell 1) ble valgt for ekspresjonskloning. Det HLA-begrensende allele til CD8 TCC RW51 er B45 ettersom LCL bare matchet ved B45 og ble lysert i CTL "assays". HLA B<*>4501 cDNA ble klonet ved RT-PCR. cDNA-syntese benyttet total RNA fra RW LCL (Chomczynski P, Sacchi N. In: Coligan JE et al., red. Current Protocols in Immunology, New York: John Wiley and Sons, 1992, 10.11.7-10.11.14), oligo-dT-primer og MMLV RT (Pharmacia) med standard protokoller (Sambrook J et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, v. 2, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989). HLA B<*>4501 PCR produkt (primere

A AGGTACCATGCGGGTCACGGCACCCCGAA OG

GGTCTAGAAGTTCGACACTCTCTGTGTAGT; Kpn I og Xba I setene er markert: SEQ ID NO. henholdsvis 4 og 5 ble fordøyd, klonet inn i pcDNA 3,0 og sekvensert. Den var identisk til Genbank 61710 for B<*>4501. Ekspresjonen ble sjekket ved FITC-merket, allele-spesifikt mAb B12 (One Lambda, Inc.). Etter 48 timer uttrykte 40% av de transfekterte (Fugene 6, Boehringer Mannheim) Cos-7 overflate HLA B45 ved flytcytometri sammenlignet med <1% for vektor. HLA A<*>0201 det begrensende allele for CD8 TCC RW3 og dkRW22 (Tabell 3) ble på samme måte klonet og ekspresjonen ble dokumentert med mAb MA2,1 (McMichael AJ et al., Human Immunol. 1980, 1:121-29).

For å screene bibliotekene fof det antigene proteinet ble Cos-7-celler som var platet ut (7000/brønn) i flate mikrotiterplater ko-transfektert etter 24 timer med bibliotekpool og B<*>4501 DNA (50 og 25 ng/brønn). Klonet RW51 T-celler (5 x 10<4>/brønn) ble tilsatt 48 timer senere. Supernatant (24 timer i tillegg) interferon-gamma ELISA (lavere grense for deteksjon,~2 pg/ml) ble gjort med matchet mAb-par (endogen). To til fire positive pooler ble funnet i hvert leserammebibliotek (A, B og C). Bakterier fra positive pooler ble platet ut, kolonier ble plukket og DNA ble isolert for neste runde med "assay". Alle de positive klonene hadde identiske 1164 pb HSV-2 Sau3A I "inserts" (Figur 3) som inneholdt exon 1, intron 1 og litt av exon 2 fra HSV-2 ORF som koder for IE-protein ICPO. Andre 445 bp av genomisk DNA 5' til ATG start av ICPO var tilstede. Representativt positivt klon A1:H3:B8 ble selektert for videre studier.

De positive genomiske klonene i både A og B leseregisterbibiliotekene og nærvær av 3 stoppkodoner i-ramme med vektor ATG og foran ICPO ATG i både de A og B-bibliotekpositive klonene, argumenterer for bruk av HSV-2 promoter heller enn vektorenes CMV-promoter. Konstitutiv promoteraktivitet fra 5'-elementer i fravær av VP 16 (ctTIF) og den "virale konteksten" kan finne sted for HSV-1 ICPO.

For å finne epitopen ble en undersøkelse gjort om og hvordan HSV-1 ICPO mRNA var spleiset til Cos-7-cellene4. ICPO mRNA er en av få spleisede HSV-gener; alternativ

spleising er blitt rapportert. Total RNA fra Cos-7-celler transfektert med (+) genomiske fragment Al :H3:B8 (Tabell 4) og MMLV RT ble brukt for å lage cDNA med primer C (Figur 3). Primerne A ved translasjonsstart og primer C ble så brukt i PCR. Sekvensene av 8 cDNA kloner viser alle spleising. Akseptorsetet var 3 pb 3' til det publiserte setet, noe som fjernet aminosyre Q26. For å innsnevre epitopen ble A-C (exon 1, start av exon 2) og A-B (exon 1) PCR-produkter klonet inn i den passende pcDNA3.1 baserte vektoren for i-ramme ekspresjon. Exon 1 til exon 2 klonen var positiv, men exon 1 klonen var negativ (Tabell 4) når de ble testet for reaktivitet med T-celleklon RW51.

Et vaksinia-ICPO (Manickan, E. et al., J. Virol. 1995, 69(8):4711-4716) ble brukt for å bekrefte ekspresjonskloningsidentiifseringen av ICPO (Figur 4).

Resultater

Alle HSV-spesifikke CD8-klonene frigjorde IFN-y på en spesifikk måte (Tabell 3). I tillegg ble nyttigheten av interferon-gamma "assayet" undersøkt som en bekreftende test for HLA-restriksjon. Klon RW51 frigjorde spesifikt interferon-gamma etter å ha blitt eksponert til Cos-7-celler transfektert med HLA B<*>4501, men ikke med A<*>0201 og infeksjon med HSV-2 (Tabell 3).

For å velge peptider effektivt ble et HLA B45-bindingsmotiv derivert fra B45-begrensende peptider og en poolsekvens fra peptider eluert fra B<*>4501. Motivet er glutamatsyre ved posisjon 2, hydrofob ved posisjon 10 (Pl og P9 i "binding" nomenklatur (Rammansee H-G, Current Opinoin in Immunology 1995, 7:85-96)). Peptid ICPO 92-105 (AERQGSPTPADAQG; SEQ ID NO. 19) var aktiv i CTL (Figur 4) og interferon-gamma (Tabell 4) "assays". Det var ikke andre kandidat exon 2-peptider. Den høye EC50-verdien (~1 uM) kan skyldes den karboksyterminale halen som er forutsagt å ligge på utsiden av den peptidbindende gropen og redusere bindingen til HLA B<*>4501. Vaksinia-ICPO fra B. Rouse (Manickan E. et al., J. Virol. 1995,69:4711-16) ble dyrket og titrert (Koelle DM et al., J. Virol. 1994, 68:2803-10). Klon RW51 lyserte spesifikt vac-ICPO-mål (Figur 4). Tilgjengeligheten til vaksinia var tilfeldig og ikke nødvendig for å bekrefte resultatene av ekspresjonskloning. For å innskrenke epitopen, ble et peptid som bestod av aminosyrene 92-101 i ICPO (AERQGSPTTP; SEQ ID NO. 6) syntetisert. IC50for dette peptidet er mellom 1 og 10 nM (Figur 5).

For å bekrefte at pasienter med HSV-2 infeksjon har T-celler reaktive med det nylig oppdagende T-celle antigenet sirkulerende i deres perifere blod, ble perifere blodmononukleære celler (PBMC) fra pasienten som den lesjonderiverte klonen RW51 var gjenvunnet fra peptidstimulert. PBMC ble dyrket i 3 dager ved 2 x IO<6>celler per 1,88 cm<2>brønn i 2 ml T-cellemedium som inneholdt 1.0 ug/ml peptid HSV-2 ICPO 92-101. På den fjerde dagen ble IL-2 (32 enheter/ml) tilsatt. På den 8. dagen ble cellene vasket og restimulert i den samme størrelsebrønn med et tilleggs 2 x IO<6>autologt, bestrålt (3300 rad gamma bestrålinger) PBMC, 1,0 ug/ml av samme peptidet og IL-2 (32 U/ml).

Respondere ble dyrket i enda 9 dager i nærvær av IL-2 og ekspandert som nødvendig. Cytoksisitet "assay" ble utført ved å bruke autolog eller HLA klasse l-"mismatched" LCL behandlet enten med ingenting, peptid, HSV-2 ICPO 92-101 i 1 ug/ml i 18 timer, eller infeksjon med HSV-2 stamme 333 ved MOI 10 i 18 timer. Cytotoksisitets "assayet" var et standard 4-timers<51>Cr-frigjørings"assay".

Resultatene (Figur 6) viser at stimuleringen av PBMC med peptid HSV-2 ICO0 92-101 - var istand til å stimulere cellene med cytotoksisitet mot HSV-2 infiserte celler, og at denne aktiviteten ikke er tilstede mot HLA klasse l-"mismatcede" celler. For sammenligning ble indeks T-celleklon RW51 også brukt som en effektorcelle i dette "assayet" og viste sammenlignbare, selv om det var litt høyere, cytotoksisitet ved effektor til målratio på 10:1 vist i Figur 6.

Eksempel 5 Identifisering av et Ul47 antigen gjenkjent av HSV-spesifikk CD8

CTL

Dette eksempelet demonstrerer via ekspresjonskloning antigenisiteten til et HSV-polypeptid som kodes for av DNA som finnes i den kodende regionen for protein Ul47. Ekspresjonskloning og bibliotekpreparering var som beskrevet i Eksempel 4.

Lesjonsklonet dkRW22.1991 ble valgt for ekspresjonskloning. Denne klonen har cytologisk aktivitet mot HSV-2 infisert, autologt LCL (Tabell 1). Det HLA-begrensende allele til CD8 TCC dkRW22.1991 er HLA A<*>0201 ettersom Cos-7-ceUer transfektert med HLA A<*>0201, men ikke B<*>4501, og så infisert med HSV-2, spesifikt stimulerte interferon-gammafrigjøring fra dkRW22.1991 (Tabell 5). Klon dkRW22.1991 har følgende fenotype ved flytcytometri: CD3(+), CD4(-), CD8(+), CD16 og 56(-) og T-cellereseptor a/p(+).

Resultater

For å screene biblioteker for det antigene proteinet, ble Cos-7-celler som var platet ut (9000/brønn) i flate mikrotiterplater kotransfektert etter 24 timer med bibliotekpooler og A<*>0201 DNA (50 og 25 ng/brønn). Klonede T-celler ble tilsatt 48 timer senere, og interferon-gamma"assay" ble utført på 24 timers supernatanter som beskrevet for Eksempel 4. En positiv pol i biblioteket fra pCNA3.1-his C ble funnet. Bakterier fra denne "poolen" ble platet ut og DNA ble isolert fra 96 kolonier til neste runde med "assay". En positiv klon kalt Cl Fl C7 ble funnet i en oppfølgingsrunde av interferon-gammafrigjørings"assayene". Sekvensering av det virale "insertet" viste at det var et 1,4 kg Sau2A I fragment fra HSV-2 genomet fra nukleotidene 102875 til 101383. Sekvensene koder for den C-terminale regionen av HSV-2 UL47 fra aminosyrene 292 til 696, en kort mellomregion og så de N-terminale 70 aminosyrene av HSV-2 Ul46.

For delvis å innskrenke regionen i HSV-2 DNA som koder for den antigene epitopen, ble fullengdegenene for Ul47 og UL46 i HSV-2 klonet ved PCR ved å bruke en termostabil DNA-polymerase med korrekturlesingsfunksjon (pfu, Invitrogen). Primerne var CT AGGATCCCCTCCGGCCACCATGTCC (5' primer; SEQ ID NO. 7) og CG ATCTAGACCTATGGGCGTGGCGGGC (3' primer; SEQ ID NO. 8) for UL47 og CG AGGATCCGTCTCCGCATGCAACGCCG (5' primer; SEQ ID NO. 9) og CGC TCTAGATTTTAATGGCTCTGGTGTCG (3' primer; SEQ ID NO. 10) for UL46. I hvert tilfelle inneholdt den 5' primeren et inkorporert BamH I sete (understreket) og den 3' primeren inneholdt et inkorporert Xba I sete (understreket) for å fasilitere kloning.

PCR-produktene ble fordøyd med BamH I og Xba I og klonet inn i pcDNA3.1-his-C for å gi i begge tilfeller i-ramme fusjonsproteiner. Sekvensene i fusjonsregionene ved de 5' endene i HSV-2 genene i pcDNA3.1-his-C ble bekreftet ved sekvensering. I tillegg ble alle de Ui46-kodende sekvensene som var i den originale positive klonen C1F1C7 slettet ved restriksjonsfordøying og re-ligering. Datterkonstruktet kalles C2F1C7-Apa

I(-).

For å teste reaktiviteten av lesjonsderiverte T-celleklon ble Cos-7-celler transfektert med A<*>0201 DNA og enten infisert med HSV-2 eller transfektert med hvert av disse konstruksjonene. Resultatene er i overensstemmelse med gjenkjenningen av et antigen som kodes for av DNA som koder for UL47 i HSV-2. Klonen C1F1C7-Apa I(-) var positiv. Fordi denne klonen er slettet for alle UL46-sekvensene blir ikke Ul46 gjenkjent. I tillegg ga transfeksjon av fullengde UL47, men ikke UL46, sammen med HLA A<*>0201 i Cos-7-celler, celler som spesifikt stimulerte interferon-gammasekresjon ved klon dkRW22.1991.

Eksempel 6 Identifisering av aminosyrene 289-298, 551-559 og 551-561 i Ui 47 som antigener gjenkjent av HSV-spesifikk CD8 CTL

Materialer og metoder

Cellelinjer og virus: EBV-LCL ble laget fra PBMC "i-hus"; ARENT, PITOUT; HERLUF og KAS011 ble skaffet fra G. Nepom. HSV-1 El 15 og HSV-2 333 og HG52 og rekombinant vac-ICPO-HSV-2 (gitt av B. Rouse) og vildtype vaksinia NY ble laget og titrert i Vero eller BSC-40-celler.

HSV-spesifikke T-celler ble skaffet fra HSV-2 kulturpositive "buttock" lesjoner. Biopsier ble tatt på lesjon dag 5 eller fra herpes vesikkelvæske. Lymfocytter ble ekspandert i bulk med PHA og IL-2. CD8-celler ble selektert med immunomagnetiske kuler (Minimacs, Miltenyi) og klonet. For individ HV, ble biopsivevet fordøyet i 5 timer ved 37°C i Collagenase IV-S (Sigma) og den resulterende cellesuspensjonen ble klonet i serie 10 ganger fortynninger. Klonene ble ekspandert med anti-CD3 mAb, IL-2 og næringsstoffer. Peptidrestimulerte PBMC-deriverte lymfocytter ble laget ved å inkubere 4 x IO6 PBMC med 1 ug/ml peptid. Etter 3 dager ble 10 U/ml human rekombinant IL-2 (Chiron) tilsatt. Etter 7 dager ble respondere vasket og platet ut igjen med 2 x 10<6>fersk tinet, bestrålt autologt PBMC, peptid og IL-2. Cellene ble undersøkt på dag 14-21.

Ekspresjonskloning: HSV-2 genomisk DNA ble fordøyet med Sau3 A I, re-ekstrahert og partielt fylt inn med Klenow-fragment, dTTP og dCTP. Plasmidene pcDNA3.1 (+) og myc-his A, B og C (Invitrogen) ble fordøyet med Xho I og partielt fylt inn med dATP og dGTP. Etter ligering ble DNA elektroporert inn i E. coli stamme DH10B. Hvert bibliotek hadde flere tusen primære transformanter. Mesteparten av hvert bibliotek ble øyeblikke amplifisert i bulk (4 ml LB-amp, over natt) og alikvotert. 20 tilfeldige kloner inneholdt hver enkle HSV-2 Sau3A I fragmenter. For å lage DNA til transfeksjon ble dype 96-brønners plater inokulert enten med biblioteker ved~15 kolonier per brønn, eller med utvalgte individuelle kloner. Etter overnatt vekst, ble DNA preparert med 96-brønners filtere.

For å lage HLA A<*>0201, B<*>4402, B<*>4403 og B<*>4501 cDNA ble total RNA ekstrahert fra LCL. cDNA ble preparert med oligo-dT og MMLV reverstranskriptase. PCR brukte pfu DNA polymerase 2,5 mM (hver) dNTP, cDNA og primere designet for å komplementere tungkjede genet og inneholde distale Kpn I- eller Xba I-seter. Amplimerer ble fordøyet med Kpn I og Xba I og ligert inn i pcDNA.3.0. Insert-sekvensene var identisk til Genbank.

For å studere cDNA spesiene som var derivert fra det positive genomklonet som inneholdt deler av ICPO (under), ble Cos-7-celler transfektert med den ICPO genomiske klonen og total RNA ble preparert etter 48 timer. Primeren som ble brukt for cDNA-syntesen (TGCTCTAGAGACTCGATCCCTGCGCGTCGG, Xba I-sete understreket; SEQ ID NO. 11) ble derivert fra sekvensen i den 3'-enden av HSV-2 DNA i ICPO genomiske klon. MMLV reverstranskriptase ble brukt. For å undersøke spleising brukte PCR pfu polymerase, cDNA, 3' primer over og 5' primer TAAGGTACCTGAACCCCGGCCCGGCACGACG (Kpn I sete; SEQ ID NO. 12). For å isolere exon I i ICPO, brukte PCR samme 5'-primer og 3'-primer TGCTCTAGACCAGGCGTGCGGGGCGGCGGG (Xba I sete; SEQ ID NO: 13). Produktet ble klonet inn i pcDNA3.1-his-B.

Fullengde UL47 fra HSV-2 ble PCR-klonet inn i pcDNA.3.1-his-C ved å bruke samme primer som er identifisert over (SEQ ID NO. 7, 8). Fullengde UL47 fra HSV-2 ble PCR-klonet inn i pcDNA2.1-his-C med de korresponderende primerne identifisert over (SEQ ID NO. 9,10). På samme måte ble konstruksjoner som uttrykker aminosyrene 1-595 og 1-640 av Ul47 laget ved PCR, ved å bruke den ovennevnte 5'-primeren, passende 3'-primere og pcDNA3.1-his-C. Konstruksjonene UL47 1-535 og 536-696 ble laget ved å bruke et naturlig Not I-sete ved aminosyre 535.1-rammefusjon ble bekreftet ved sekvensering.

Lymfocyttfunksjonelle "assays": CTL-"assays" ble gjort ved standar 4-timers51 Cr frigjøring. Mål EBV-LCL ble infisert i 18 timer med HSV ved MOI 10; Effektonmålratioen var 20:1. Anti-klasse I mAb W6/32 ble brukt ved 10 |ig/ml. Aktinomycin D ble brukt ved 5 ug/ml i 30 minutters preinfeksjon, under 90 minutters infeksjon, vask og "assay" perioder for å studere effekten av hemmingen av viral RNA ekspresjon.

IFN-gammasekresjon ved HSV-reaktiv CD8 CTL ble brukt som endepunktet for å bekrefte isolering av funksjonell HLA cDNA og for ekspresjonskloning. Cos-7-celler som var platet ut på dag 1 ved 9000 celler/brønn i 96-brønners flatbunnede plater ble transfektert på dag 2 med 50 ng HLA cDNA (Fugene-6). På dag 3 ble cellene infisert med HSV-2 333. På dag 4 ble 0,7-1,0 x IO<5>klonede CD8 T-celler tilsatt. Supernatantene ble bevart på dag 5.

For å screene bibliotekene ble Cos-7-celler ko-transfektert med 50 ng HLA cDNA og 100 ng av bibliotek-DNA ("pooler" på 15 eller en enkel koloni). To dager senere \, ble 1 x 10<5>klonede T-celler/brønn tilsatt og supernatanene ble bevart etter 24 timer. Positive "pooler" ble brutt ned for å identifisere aktive bakteriekloner. HSV-2 DNA i aktive

kloner ble sekvensert.

Flytcytometri: Lymfocytter ble farget med merkede mAb for CD3, CD4, Cd8, Cd 16/56, TCR ap elle rTCR y8 ved standard metoder. For å måle HLA-ekspresjonen i transfekterte Cos-7-celler ble trypsinerte celler blandet med 1 ug FITC-merket mAb B12 reaktivt med HLA B<*>4501 (One Lambda, Inc. eller supernatant av mAb MA2.1-celler reaktive med HLA A<*>0201, etterfulgt av FITC-merket geite-antimus IgG.

HLA-typing: For definisjon av HLA B44 alleler ble direkte sekvensering av varierende exoner utført.

ELISA: Gamma-interferon ble målt ved ELISA med reagenser fra Endogen. Plater ble belagt med 100 ul av 0,25 ug/ml "capture" mAb M700A-E og blokkert med 1% BSA i 0,2M NaCl, 3 raM KC1, 0,05M Tris, pH 9 (TBS) i en time. Etterølgende inkubasjoner var alle 100 fil, først 3-5 vasker med PBS/0,2% Tween-20 og utført med rotasjon i romtemperatur. Prøver og standardfotrynninger i TBS med 0,1% BSA, 0,05% Tween-20 og 4 jig/ml Immunoglobulin Inhibiting Reagent #6LD1068 (Bioreclamation, Inc., East Meadow, New York) (prøvebuffer) ble tilsatt i 2 timer. Biotinylert deteksjons mAb (M701B) fortynnet til 100 ng/ml i prøvebuffer ble tilsatt i 1 time. AvidinD:HRP (A-2004) fortynnet til 100 ng/ml i TBS med 1% BSA, 0,05% Tween-20 ble tilsatt i 1 time. TMB-substratet ble tilstt i 10 minutter. Den lavere grensen for deteksjon var i området fra 2 til 10 pg/ml.

Resultatene er vist i Figurene 7-10 og i Tabellene 7-9.

Resultatene viser at lesjonsinfiltrerende CD8 CTL gjenkjenner umiddelbart tidligere (ICPO) eller virion "input" (UL47) proteiner som forutsagt ved ACT D inhibering og HSV-kodende TAP og transkripsjonelle nemmere. Videre kryssreagerer HSV-2 UL47 289-298/A<*>0201-spesifikk CD8 CTL med HLA BM402 og B<*>4403, men ikke B<*>4405. TCR kan gjenkjenne disse B44 allelene pluss et "husholdnings"peptid, på dette tidspunktet ukjent, som er tilstede innen B-cellene og også i humane og primate nyreepitelceller. Dataene tyder på at kryssreaktive T-celler kunne mediere GVHD når stamcellene fra en A<*>0201/ ikke B<*>4402 eller<*>4403-person blir plassert i en A<*>0201, HSV-2 infisert person så vel som en transplantasjonsawisning når et B<*>4402 eller

<*>4403-bærende organ blir plassert i et A<*>0201, HSV-2 infisert person.

Eksemel 7 Identifisering av aminosyrene 548-557 fra Ul47 som antigener gjenkjent av HSV-spesifikk CD8 CTL

CD8+ T-celleklon cpRW22 (separat derivert fra samme kilde som dkRW22) ble testet mot en rekke syntetiske peptider foutsagt å binde til HLA-A2 og derivert fra HSV-2 gen Ul47. Et av disse peptidene ble positivt gjenkjent av cpRW22 i et IFNy ELISPOT "assay". Sekvensen til UL47 peptidet som skåret positivt var: NH2-RLLGLADTW-COOH (SEQ ID NO. 18), hvis peptid inneholder aminosyrene 548-557 i UL47.

En rekke av 10-mer (UL47/549-558, 550-559, 551-560 og 552-561) og 9-mer peptider (UL47/548-556, 549-557, 550-558. 551-559 og 552-560) som overlappet UL47/548-557 ble laget for bedre å definere det optimale målpeptidet. En 9-mer (UL47/551-559) og to 10-mer (Ul47/550-559, 551-560) skoret sterkt positivt ved lave konsentrasjoner i et ELISPOT "assay" (Figurene 1 IA & 1 IB). UL47/550-559 og UL47/551-559 peptidene hadde lignende aktivitet ved alle peptidkonsentrasjonene som ble testet.

Eksempel 8 Identifisering av aminosyrene 550-559 i Ul47 som et naturlig prosessert antigen

For å bestemme det naturlig prosesserte Ul47 peptidet ble A2-molekylene renset fra 1,5 x 10<10>C1R-A2/3D9.6H7 celler og de bundne peptidene ble strippet ved sur eluering. Disse peptidene ble fraksjonert på en HPLC-kolonne under følgende betingelser: TFA ioneparingsagent; 0-10% acetonitril (ACN) i 5 minutter, 10-45% ACN i 50 minutter, 45-60% ACN i 5 minutter. Disse fraksjonene ble testet for deres evne til å sensitivisere T2 mål for gjenkjenning av cpRW22 T-celler i et IFN-gamma ELISPOT "assay". Målene var T2-celler (20000) som var pulset med 5% av hver fraksjon i serumfritt medium + 3 |Ag/ml HuB2M ved 32°C i 4 timer. Målene ble så vasket to ganger og overført til duplikate brønner (10000/brønn) i ELISPOT-plater. Respondere var CTL-klon cpRW22 (20000/brønn).

Fraksjonene 17, 18 og 23 ble funnet å inneholde denne aktiviteten (Figur 12). Fraksjonene 17 og 18 ble subfraksjonert på HPLC-kolonnen under følgende betingelser: HFBA ioneparingsagent; 0-10% ACN i 5 minutter, 10-35% ACN i 50 minutter, 2Y35-60% ACN i 5 minutter. Subfraksjonene 24 og 25 ble funnet å sensitivisere T2-celler for gjerikjenning av cpRW22 (Figur 13B; sammenlign figurene 13 A og 13C). Fraksjon 23 ble subfraksjonert ved HPLC på samem måten. Subfraksjon 37 ble funnet å sensitivisere T2-celler for gjenkjenning av cpRW22 i et IFN-gamma ELISPOT "assay" (Figur 14). UL47/551-559, 550-559 og 551-560 peptidene ble kjørt på HPLC under subfraksjoneringsbetingelsene og funnet å eluere i fraksjonene 37 (Ul47/550-559; Figur 15A), 40/41 /UL47/551-560; Figur 15B) og 32 (Ul47/55 1-559; Figur 15C).

Ul47/550-559 elueres i samme fraksjon (37) som det naturlig prosesserte peptidet fra C1R-A2/3D9.6H7 celler, og det er derfor sannsynlig at det har samme sekvens som det naturlig prosesserte peptidet. MS/MS dataene for fraksjon 23/subfraksjon 37 viser nærværet av et peptid med en molekylær masse på 961 (Figur 16). Den molekylære masse av U[47/550-559 er også 961. Dette bidrar med støttende bevis for at Ul47/550-559 er det naturlig prosesserte UL47-peptidet.

Aminosyresekvensen til UL47/550-559 peptidet er LGLADTWAC (SEQ ID NO. 1). Det ble etterpå verifisert at et genfragment av HSV-2 som kan kode for Ul47/550-559 peptidet finnes innen C1R-A2/3D9.6H7 cellene. Dette ble gjort ved å utføre PCR med primere laget til flankerende regioner av kloningssetet i den pBIB retrovirale vektoren og til DNA sekvensen som koder for UL47/550-559 (Figur 17). Ved å bruke disse PCR primere og variere PCR-betingelsene ble det demonstrert at C1R-A2/3D9.6H7 celler inneholder minst to retrovirale "inserts" derivert fra HSV-2 (Figurene 18A-C). Et "insert" koder for to fragmenter i UL52-genet. Det andre "insertet" koder for en stor del av UL47-genet, inkludert den delen som koder for Ul47/550-559 peptidet.

Eksempel 9 Metoder for å identifisere proteiner som gjenkjennes av HSV-spesifikk CD8 CTL

Dette eksempelet demonstrerer hvordan man kan identifisere tilleggsproteiner som gjenkjennes av HSV-spesifikk CD8 CTL ved å bruke lesjonsderivert materiale.

Isolering av HSV- spesifikt CD8 T- celler fra genital/ buttock HSV- 2 lesjoner Punch biopsier (3-4 mm) blir tatt fra perirektal, buttock og/eller lårhud etter rensing og anestesi. Lesjoner fra mistenkte primære herpes blir tatt ut så snart som mulig, og seriebiopsier ved minst to ganger under primær infeksjonen er foretrukket. Tilbakevendende genitale HSV-2 lesjoner i helbredelsesstadiene (sen ulcus/skorpe) blir foretrukket for oppdagelse av antigen/epitop fordi LIL fra slike lesjoner har høy CTL-aktivitet. Deler av lesjonene kan hurtig fryses i isopentan/flytende nitrogen i OCT-media for immunhistologi. En del av biopsien blir dissosiert og celler dyrket i begrenset fortynning, og en porsjon blir brukt til bulk-kultur (Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998, 101:1500-1508). LIL blir ekspandert i bulk ved "mincing" vev og stimulert med 0,8 ug/ml PHA og 7,5 x IO<5>tilbringere PMBC/brønn i 48-brønners plater i T-cellemedium med acyklovir (50 uM). Ekspansjonen blir assistert av IL-2 (50 U/ml, Hemagen) og vanligvis gir dette 1-5 x IO7 celler på 14-21 dager. CTL-aktiviteten i CD8-selekterte celler blir testet mot autologe og alogeniske mock- og HSV-2 infiserte LCL i 4 timers<51>Cr-frigjørings"assay" ved effektonmål 20:1 (Tigges MA et al., J. Virol. 1992, 66:1622-34). Lytisk aktivitet på dette trinnet er forutsigende for gjenvinning av HSV-spesifikke CD8 CTL kloner.

For å øke gjenvinningen av sjeldne CD8 CTL eller CTL som kan ha en vekstulempe i bulk-kultur kan man hoppe over det initielle bulk-ekspansjonstrinnet. HSV-2 lesjoner er vesikulære under midtfasen i lesjonevulosjonen. HSV-spesifikk CD8 CTL kan klones fra vesikkelvæske som følge. Vesiklene blir brutt og væsken blir gjenvunnet med celleskrapere til mediet. En del blir brukt for cytospin prepper (oppbevart ved -70°C etter fiksering). Etter at Ficoll er lagt under og etter standard tetthetsgradientsentrifugering, blir cellene i interfasen vasket og platet ut i seriefortynninger fra 100 til 1 celle/brønn i 96-brønners U-bunnet plater sammen med kloningscoktail (under). Cellegjenvinningen fra vesiklene er typisk ca. 1 x IO<4>til 2 x IO<5>per lesjon.

T-cellekloner bruker etablerte prosedyrer (Koelle DM et al., J. Infect. Dis. 1994, 169:956-61). CD8-selekterte celler fra en runde med bulk-ekspansjon av LIL såes ut ved 2 og 0,3 celler/brønn. Celler fra friske ødelagte lesjonsbiopsier eller vesikkelvæsker blir platet ut i et modifisert begrensende fortynningsskjema som starter ved 30-100 celler/brønn og minker i 2-3 gangers trinn ned til 1 celle/brønn som rapportert i Koelle et al., 1994, supra. For CD8-anrikede friske LIL og vesikkelceller kan en porsjon ekspanderes i bulk (Koelle DM et al., J. Clin. Invest. 1998,101:1500-1508). Mikrokulturer blir foret to ganger i uken med IL-2 og screenet etter -14 dager. Prosentbrønner som viser vekst ved hvert input nummer blir nedtegnet for å estimere sannsynligheten for klonalitet i mikrokulturene.

Screening av kandiatkulrurene

En foretrukket screening for kandidatkulturene er et split-brønn CTL-"assay" mot autolog LCL infisert (18 timer, MOI 10) av HSV-2 eller uinfisert. LCL er EBV-transformerte B-cellelinjer (Koelle DM et al., J. Clin. 'Invest. 1993,91:961-68; Miller G et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1972, 69:383-87) som det tar ca 6 uker å etablere fra PBMC. LCL er mottagelig for HSV-infeksjon, men er relativt resistente for HSV-mediert HLA-klasse I nedregulering sammenlignet med hudfibroblaster. De fleste individene blir innrulert og LCL blir gjort før biopsi. LCL vil derfor være tilgjengelig når TCC er klar for screening. Helst blir autolog HSV-2 isolert, dyrket og titrert på Vero-celler (Koelle et al., 1993, supra).

For kloner som er derivert fra bulk-ekspandert LIL blir celle "input" antallet som gir 37% eller mindre av brønnene positive for vekst utpekt som mulige "kloner". Halvparten av hver mikrokultur blir platet ut i duplikater (final, 1/8 av kulturen/"assay" brønn) med 2 x IO<3>mål for et effektor:målratio på —15:1. Kloner med en nettlysis på HSV-2-infiserte mål på 15% over deres lysis av uinfiserte mål blir betraktet som positive. Kloner med CTL-aktivitet blir analysert med flytcytometri og CD8-bærende CTL-kloner blir ekspandert. Mikrokulturer fra friske, ødelagt lesjonsbiposier og vesikler vil ha blitt ekspandert i et begrenset fortynningsformat (over). Uten den forrige ruden med bulk-ekspansjon vil det være en mindre sjanse for at mikrokulturene vil inneholde "søster" kloner, selv om det er mulig at identiske celler kan bli uavhengig gjenvunnet fra frisk lesjonsmateriale i separate mikrokulturer.

Å ekspandere kulturer med CTL- aktivitet

T-celler som skårer positivt i screenings "assays" blir ekspandert etter metoden av Riddel et al. (Nature Medicine 1996, 2:216-23; US patent nr. 5,827,642). Den "til overs" halvdelen av cellene i en original mikrokulturbrønn (~5 x 10<4>celler) blandes i 25 ml T-cellemedium (Koelle DM et al., J. Infect. Dis. 1994, 169:956-61) med 2,5 x IO<7>bestrålt (3300 rad) mikset allogenisk PBMC, 5 x IO<6>bestrålt (8000 rad) LCL og 30 ng/ml mAb OKT3 (anti-CD3). Ved 24 timer og så to ganger i uken blir rhJL-2 (50 U/ml, Chiron; Emeryville, CA) tilsatt. OKT3 blir fjernet ved vasking på dag 4. Typisk blir T-cellene ekspandert til -1-5 x IO7 celler på slutten av første syklus. Et bekreftende CTL "assay" kan gjøres når veksten synlig blir langsommere ved ca. dag 12. Celletallet som lagres etter en identisk andre syklus er essensielt ubegrenset. Ettersom en videre 200-1000 ganger ekspansjon vanligvis finner sted. Tinte alikvoter av ekspanderte celler virker i CTL, proliferasjon og cytokin "assays". Ca. 10-20% av klonene mislykkes i å ekspandere; tap av antigenspesifisitet er sjelden, men tap av replikativt potensiale kan finne sted.

Cos-7 ko-transfeksjonsmetoden beskrevet over kan brukes til ekspresjonskloning. DNA fra den sekvenserte HSV-2 stammen HG52 kan brukes, fordøyet med Sau3A I og ligert inn i medlemmer av pcDNA3.1(+) his seriene. cDNA som koder for de HLA klasse I tunge kjedene som begrenser TCCene som er selektert for ekspresjonskloning kan klones, hvis nødvendig ved RT-PCR inn i pcDNA3.0 som beskrevet over. En universell metode er blitt publisert (Ennis PD et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1990, 87:2833-37). Korrekturlesningspolymerase kan brukes og cDNA sekvenseres. Primere er allelespesifikke perfekte matcher med "haler" som inneholder endonukleaseseter som ikke er tilstede i målsekvensen. Uønskede tungkjede PCR produkt (som kan bli koamplifisert) kan reduseres ved å fordøye PCR produktet med et enzym som fortrinnsvis kutter det uønskede cDNA. For å teste cDNA funksjonen kan det bli 1) sjekket for celleoverflateekspresjon i 48 timers transfekterte Cos-7-ceIler med allelespesifikt mAb, og 2) sjekket for presentasjon av HSV-2-antigen ved metoden illustrert i Tabell 3 over. De forventede resultatene er spesifikk farging av Cos-7-celler med allelespesifikt mAb etter tranfeksjon av tungkjede; tom vektor og kontroll mAb er inkludert. Spesifikk stimulering av CD8 TCC interferon-gammasekresjon av Cos-7-celler transfektert med den tunge kjeden og infisert med HSV-2 er forventet.

Antall kloner screenet per bibliotek vil avhenge av antall av restriksjonsfragmenter som er laget når biblioteket ble laget, men vil typisk være flere tusen. "Pool" størrelse (antall kloner tranfektert per brønn av Cos-7-celler) vil starte ved -15 virale DNA fragmanter/brønn. Positive "pooler" blir brutt ned og individuelle kloner testet. Positive kloner blir sekvensert og sammenlignet til den publiserte HSV-2-sekvensen for å identifisere antigener.

Epitop mapping

Epitop mapping kan gjøres med molekylære, bioinformatiske eller syntetiske metoder. Genomisk bibliotekscreening (over) gir genfragmenter som initielt "positive" som er i området fra 25 til 300 lange aminosyrer. De HSV-2 kodende sekvensene i positive molekylære kloner kan forkortes ved å bruke standar metoder slik som exonuklease III fordøying (Gavin MA et al., J. Immunol. 1993, 151:3971 -80) for å lage nestede trunkeringer av HSV-2 "insertet" eller kløyve HSV-2-DNA i interne restriksjonsseter og rekonstruksjon av plasmidene. Det er ønskelig å bruke PCR med en korrekturlesningspolymerase for å reamplifisere en del av den positive konstruksjonen. Trunkeringer blir designet for et 50-100 aminosyre langt positivt fragment. For motivmatchende peptider blir Pl "anker" plasert ved residiet 2 i de syntetiske peptidene, fordi det N-terminale peptidet ved posisjon "P minus 1" ofte vender mot TCR og trengs for å trigge T-cellen. Hvis det ikke er noe motiv kjent, blir det laget 15 mer peptider som overlapper md 5. Peptidene blir testet ved 1 og 10 uM i CTL og/eller interferon-gamma "assays".

Hvis disse metodene ikke finner epitopen, kan videre molekylær "trimming" fra begge ender av den aktive HSV-2 konstruksjonen gjøres for å finne den minimale kodende sekvensen (Schneider J et al., Int. J. Cancer 1998, 75:451-58). Hvis dette peptidet fremdeles ikke er positivt i CTL "assay" kan det være at posttranslasjonelle modifiseringer er nødvendige. Peptidet som er forutsagt å være positivt ved molekylær genetiske metoder "loades" inn i APC ved elektroporering eller osmotisk sjokk (Chen W et al., J. Immunol. Methods 1993,15:49-57).

Eksempel 10 ICPO stimulering av CTL-responsene i tilleggs HLA-B45 individer

Dette eksempelet demonstrerer at andre HLA-B45 positive donorer har detekterbare CD8+ T-celle responser på det tidligere definerte ICPO 92-101 peptider.

Peptidrestimulering i bulkformat er passende for sensitiv deteksjon av CTL, mens lesjonsderiverte antigen (LDA) formater gir CTL nivåer, men krever forlenget cellereplikasjon for deteksjon. I dette eksempelet ble 4 x IO6 PBMC i 2 ml T-cellemedium stimulert med 1 ng/ml HSV-2-peptider og IL-2 (10-30 U/ml) ble tilsatt på dag 3. På dag 8 ble responderne vasket og stimulert i 2 ml med 2 x IO6 autologt bestrålet PBMC, friskt peptid og IL-2 og splittet som nødvendig til undersøkelse på dag 14-16. For to HLA B*4501-bærende personer inkludert indeksindividet ble overbevisende HLA klassebegrenset CD8 CTL detektert som ikke bare lyserte peptidladede mål, men også drepte HSV-2-infiserte mål og ble hemmet av antiklasse I mAb (Tabell 10).

Eksempel 11 Ul47 stimulering av CTL-responser i tilleggs HLA-A2 individer

Dette eksempelet demonstrer at andre HLA-A2-positive donorer har detekterbare CD8+ T-celleresponser til det tidligere definerte UL47-peptid 550-559.

UL47-genet blir amplifisert med PCR-metoder fra genomisk HSV-2 (stamme 333) DNA og klonet inn i pBIB retroviral vektor. DNA ble laget fra flere Ul47/pBIB kloner og transfektert inn i VA13-celler som stabilt uttrykker HLA-A2. Disse transfektantene ble gjenkjennet av den UL47/550-559 spesifikke HLA-A2 begrensede CTL klon cpRW22 (Figur 19). UL47/550-559 peptid pulset VA13/A2-celler ble brukt som en positiv kontroll.

PBMC fra flere HLA-A2 positive donorer (RW1874, HV5101, AD116, AD120 og AD 124), hvorav noen var seropositive for HSV-2, ble testet for nærværet av UL47 spesifikke CD8+ T-celler. Ved UL57/550-559 spesfikke, HLA-A<*>0201-begrensede CTL klon cpRW22 var tidligere derivert fra donor RW1874. HSV-2 UL47/289-

, 298(FLVDAIVRA; SEQ ID NO: 20)-spesifikke, A2-begrensede klon HV-2 ble derivert for donor HV5101. Således var deteksjon av UL47-spesifikk CD8+ T-celler i PBMC fra RW1874 og HV5101 forventet. PBMC ble stimulert to ganger in vitro med 1 |ig/ml av en av tre av A2-begrensede epitoper: influensa Ml/58-66, Ul47/289-298 eller Ul47/550-559. T-cellene ble så testet i et<51>Cr-frigjørings"assay" mot mål som var pulset med enten ikke noe peptid, stimuleringspeptid eller et kontrollpeptid (RT) derivert fra HIV. Alle donorene som er testet er kjent for å være HIV-negative.

Resultatene er vist i Figur 20A-L. RW1874 responderte bare på Ml og UL47/550-559 peptidene (Figur 20A-C). HV5101 responderte på alle tre peptidene (Figur 20D-F), selv om Ul47/289-298 er det eneste HSV-2 peptidet som ble identifisert ved å bruke celler fra denne donoren. AD 120 responderte ikke til noen av de tre peptidene (Figur 20G-I), noe som tyder på at det kan tilhøre en signifikant distinkt A2 subtype. AD124 responderte på Ml, men ikke på noen av UL47-peptidene (Figur 20J-L). Dette var forventet fordi AD 124 er seronegativt for HSV. Disse resultatene er oppsummert i Tabell 11.

Fagfolk vil skjønne at begrepene og spesifikke utførelsesformer som er utgreiet i den foregående beskrivelsen lett kan brukes som en basis for å modifisere eller designe andre utføreselsformer for å utføre de samme hensiktene av den foreliggene oppfinnelsen. Fagfolk vil også skjønne at slike ekvivalente utførelsesformer ikke skiller seg fra ånden og målet av oppfinnelsen som er fremstilt i de vedlagte kravene.

Claims (37)

1. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et herpes simplex virus (HSV) polypeptid, hvori polypeptidet omfatter et ICPO eller U[ 47-protein eller et fragment derav og en farmasøytisk akseptabel bærer.

2. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at fragmentet omfatter aminosyrene 92-101 eller 92-105 i ICPO eller en substitusjonsvariant derav.

3. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1, karakterisert v e d at fragmentet omfatter aminosyrene 289-298, 548-557, 550-559, 551-559.

551-560 eller 551-561 i Ul 47 eller en substitusjonsvariant derav.

4. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1, karakterisert v e d at polypeptidet er et fusjonsprotein.

5. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 4, karakterisert v e d at fusjonsproteinet er løselig.

6. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1, videre karakterisert ved at den omfatter en aduvant.

7. Polynukleotid som koder for aminosyrene 92-101, 92-105 i ICPO, aminosyrene 289-298, 548-557. 550-559, 551-559, 551-560 eller 551-561 i UL 47 eller en substitusjonsvariant derav.

8. Vektor, karakterisert ved at omfatter polynukleotidet ifølge krav 7.

9. Vertcelle, karakterisert ved at den er transformert med vektoren ifølge krav 8.

10. Fremgangsmåte for å produsere et HSV-polypeptid, karakterisert ved at den omfatter å dyrke vertcellen ifølge krav 9, og gjenvinne polypeptidet som produseres.

11. HSV-polypeptid, karakterisert ved at den er produsert etter metoden ifølge krav 10.

12. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et polynukleotid som koder for ICPO eller U[ 47 eller et fragment derav, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

13. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter polynukleotidet ifølge krav 7 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

14. Rekombinant virus, karakterisert ved at det er genetisk modifisert for å uttrykke aminosyrene 92-101 eller 92-105 i ICPO, aminosyrene 289-298, 548-557, 550-559, 551-559, 551-560 eller 551-561 i UL 47 eller en substitusjonsvariant derav.

15. Rekombinant virus ifølge krav 14, karakterisert ved at det er et vaksinia virus, canary pox virus eller adenovirus.

16. Farmasøytisk sammensetning karakterisert ved at den omfatter viruset ifølge krav 14 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

17. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 12,13 eller 16, karakterisert ved at den videre omfatter en adjuvant.

18. Fremgangsmåte for å produsere immunceller rettet mot HSV, karakterisert ved at den omfatter å kontakte en immuncelle med en antigenpresenterende celle, hvori den antigenpresenterende cellen er modifisert til å presentere en epitop inkludert i et ICPO eller UL 47-protein eller en substitusjonsvariant av dem.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at epitopen omfatter aminosyrene 92-101 eller 92-105 i ICPO eller aminosyrene 289-298, 548-557, 550-559, 551-559, 551-560 eller 551-561 i UL 47.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at immuncellen er en T-celle.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20, karakterisert ved atT-cellen er en CD4+ eller CD8+ T-celle.

22. Immuncelle, karakterisert ved at den er produsert etter metoden ifølge krav 18.

23. Anvendelse av en immuncelle ifølge krav 22, for preparering av en sammensetning for å behandle eller hindre HSV-infeksjon.

24. Anvendelse av et polypeptid, ved at det omfatter et ICPO eller UL 47-protein eller et fragment derav, eller av et polynukleotid som koder for et ICPO eller UL,47-protein eller et fragment derav for prepareringen av en sammensetning for å forhandle eller forhindre HSV-infeksjon.

25. Anvendelse ifølge krav 24, hvor fragmentet omfatter aminosyrene 92-101 eller 92-105 i ICPO eller aminosyrene 289-298, 548-557, 550-559, 551-559, 551-560 eller 551-561 i U[ 47 eller en substitusjonsvariant derav.

26. Anvendelse av en antigenpresenterende celle, modifisert til å presentere en epitop inkludert i en ICPO eller UL 47-protein for prepareringen av en sammensetning for behandling eller hindring av en HSV-infeksjon.

27. Anvendelse ifølge krav 26, hvor epitopen omfatter aminosyrene 92-101 eller 92-105 i ICPO eller aminosyrene 289-298, 548-557, 550-559, 551-559, 551-560 eller 551-561 i UL 47.

28. Anvendelse ifølge krav 26, hvor den antigenpresenterende cellen er modifisert med et virus, peptid eller mikrosfære som er istand til å mediere ekspresjon av epitopen.

29. Anvendelse for å identifisere HSV-epitoper som er immunogene for CD8+ T-celler, og som omfatter: (a) å få CD8+ T-celler fra en HSV-lesjon; (b) undersøke de oppnådde T-cellene for å identifisere T-celler som har evnen til å gjenkjenne HSV-infiserte celler; (c) å få og fragmentere en nukleinsyrepreparasjon fra HSV; (d) uttrykke et eller flere fragmenter av de oppnådde nukleinsyrene; og (e) undersøke de uttrykte fragmentene for antigenreaktivitet med HSV-spesifikke T-celler som er identifisert ved undersøkelsene i trinn (b), hvorved et uttrykt fragment har reaktivitet med de HSV-spesifikke cellene blir identifisert som å kode for en HSV-epitop som er immunogen for CD8+ T-cellene.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert ved at uttrykkingen omfatter å ligere det ene eller flere fragmenter inn i en eller flere vektorer ved å bruke en partiell fyll-inn-reaksjon for å begrense ligeringen av et enkelt fragment til hver av den ene eller flere vektorer.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at vektoren videre omfatter en nukleinsyre som koder for en tungkjede av et HLA-molekyl som gjenkjennes av den HSV-spesifikke T-cellen.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert ved at undersøkelsen av trinn (e) omfatter et lymfokinsekresjons"assay".

33. Fremgangsmåte ifølge krav 32, karakterisert ved at lymfokinet er inteferon-gamma.

34. Fremgangsmpte ifølge krav 29, karakterisert ved at den videre omfatter sekvensering av fragmentet som er identifisert ved undersøkelse i trinn (e).

35. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert ved at HSV er HSV-2.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert ved at fragmenteringen omfatter fordøying med et restriksjonsenzym.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at restriksjonsenzymet er Sau3A I.