CN102439035A - 治疗和/或预防动脉粥样硬化的免疫调节方法和系统，以及相关蛋白、肽和组合物 - Google Patents

治疗和/或预防动脉粥样硬化的免疫调节方法和系统，以及相关蛋白、肽和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN102439035A
CN102439035A CN2010800207609A CN201080020760A CN102439035A CN 102439035 A CN102439035 A CN 102439035A CN 2010800207609 A CN2010800207609 A CN 2010800207609A CN 201080020760 A CN201080020760 A CN 201080020760A CN 102439035 A CN102439035 A CN 102439035A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
variable region
tcr
chain variable
reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800207609A
Other languages
English (en)
Inventor
古兰·K·汉森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forskarpatent I SYD AB
Original Assignee
Forskarpatent I SYD AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forskarpatent I SYD AB filed Critical Forskarpatent I SYD AB
Publication of CN102439035A publication Critical patent/CN102439035A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

治疗或预防个体的动脉粥样硬化和/或与其相关的病症的免疫刺激方法和系统。

Description

治疗和/或预防动脉粥样硬化的免疫调节方法和系统,以及相关蛋白、肽和组合物
相关申请的交叉参考
本申请要求2009年3月17日提交的，名为“消除T细胞对低密度脂蛋白的反应来治疗动脉粥样硬化”的瑞典专利申请号0950161-0的优先权，本文引入其全部内容作为参考。 
技术领域
本公开物涉及特别适于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或与其相关的病症的免疫调节方法和系统，以及相关蛋白、肽和组合物。 
背景技术
动脉粥样硬化现在被看作是一种与脂质相关的和免疫调节性的慢性动脉壁炎性疾病。已经鉴定了参与动脉粥样硬化的很多免疫成分，并且临床前研究已取得令人满意的结果，该结果提示靶向这些成分的免疫调节疗法可以减少动脉粥样硬化。 
概述
本文提供了诱导个体免疫调节反应的方法和系统。在几个实施方案中，本公开物的方法和系统诱导的免疫调节反应对个体动脉粥样硬化或与其相关的病症产生了治疗或预防作用。 
根据第一个方面，描述了治疗和/或预防个体动脉粥样硬化的方法和系统。该方法包括：抑制个体针对ApoB100的CD4+T细胞反应，特别是通过施用治疗有效量的能够抑制所述反应的化合物。该系统包括适于抑制个体针对ApoB100的CD4+T细胞反应的一种或多种试剂和适于检测个体中反应降低的一种或多种试剂。 
根据第二个方面，描述了治疗和/或预防个体动脉粥样硬化的方法和系统。该方法包括：抑制个体T细胞受体β链可变区(T cell receptor beta  variable)31(TCR TRBV31)，特别是通过施用治疗有效量的能够抑制所述受体的化合物进行抑制。该系统包括适于抑制个体中T细胞受体β链可变区31的一种或多种试剂和适于检测个体中这种抑制的一种或多种试剂。可供选择地，该方法包括：抑制个体的T细胞受体，该受体具有与TRBV31的序列高度同源的DNA序列，特别是通过施用治疗有效量的能够抑制所述受体的化合物进行抑制。该系统包括适于抑制个体中这种T细胞受体的一种或多种试剂和适于检测个体中这种抑制的一种或多种试剂。 
根据第三个方面，描述了治疗和/或预防个体动脉粥样硬化的方法和系统。该方法包括：针对T细胞受体β链可变区31免疫个体，所述免疫例如通过施用TCR TRBV31肽SEQ ID NO：1或其它TCR TRBV31免疫原性片段，尤其是来自CDR2可变区的TCR TRBV31免疫原性片段进行。该系统包括适于针对个体的T细胞受体β链可变区31免疫个体的一种或多种试剂和适于检测个体中这种免疫的一种或多种试剂。可供选择地，该方法包括：针对与TRBV31高度同源的T细胞受体免疫个体，所述免疫例如通过施用同源(人)TCR TRBV30或TCR TRBV30免疫原性片段，尤其是来自CDR2可变区的TCR TRBV30免疫原性片段进行。则该系统包括适于针对该个体的这种T细胞受体免疫个体的一种或多种试剂和适于检测个体中这种免疫的一种或多种试剂。 
根据第四个方面，描述了T细胞受体β链可变区31或其免疫原性片段，该T细胞受体β链可变区31，其用作药物。 
根据第五个方面，描述了T细胞受体β链可变区31或其免疫原性片段，该T细胞受体β链可变区31，其用于治疗动脉粥样硬化。 
根据第六个方面，与TRBV31的序列高度同源的T细胞受体，如同源人TCR TRBV30或TCR TRBV30免疫原性片段，尤其是来自CDR2可变区的TCR TRBV30免疫原性片段，用于治疗动脉粥样硬化。 
根据第七个方面，与T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)或其免疫原性片段具有反应性的抗体，其用作药物。 
根据第八个方面，与TRBV31的序列高度同源的T细胞受体具有反应性的抗体，例如同源人TCR TRBV30或TCR TRBV30免疫原性片段，尤其是来自CDR2可变区的TCR TRBV30免疫原性片段，用作药物。 
根据第九个方面，与T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)或其免疫原性片段具有反应性的抗体用于治疗动脉粥样硬化。 
根据第十和第十一个方面，一种抗体用于治疗动脉粥样硬化，该抗体是与TRBV31的序列高度同源的T细胞受体具有反应性的抗体，所述T细胞受体如同源人TCR TRBV30或TCR TRBV30免疫原性片段，尤其是来自CDR2可变区的TCR TRBV30免疫原性片段。 
根据第十一个方面，描述了一种组合物，特别是疫苗，该组合物包含至少一个T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)，其免疫原性片段或抗体，连同佐剂和/或赋形剂。在一些实施方案中，该佐剂和/或赋形剂是药用的并且该组合物是药物组合物。 
根据第十二个方面，描述了一种组合物，特别是疫苗，该组合物包含至少一个T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)，其免疫原性片段或抗体，连同佐剂和/或赋形剂。在一些实施方案中，该佐剂和/或赋形剂是药用的并且该组合物是药物组合物。 
根据第十三个方面，描述了一种杂交瘤，其来自用oxLDL免疫且携带人类ApoB100作为转基因(huB100t9)的小鼠，特别是已根据布达佩斯条约于2009年1月22日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH)，Inhofftenstrasse 7B，38124不伦瑞克(Braunschweig)，德国，保藏号为DSM ACC2986的杂交瘤克隆48-5。 
根据第十四个方面，使用已根据布达佩斯条约于2009年1月22日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心，Inhofftenstrasse 7B，38124不伦瑞克，德国，保藏号为DSM ACC2986的杂交瘤克隆48-5鉴定抑制针对ApoB100的CD4+T细胞反应的化合物。根据其阻止48-5暴露于apoB100或其片段时活化的能力来鉴定该化合物。 
本文描述的方法和系统可用于这些应用，其中所述应用期望在个体中抑制针对ApoB100的CD4+T细胞反应，抑制CD4+TRVB31与ApoB100结合，和/或对个体的动脉粥样硬化具有治疗或预防作用。 
附图和以下说明书中阐明了本发明公开内容的一个或多个实施方案的详情。根据说明书和附图，以及权利要求书，其它特征、目的和优点将 很明显。 
附图简述
引入附图并且其构成本说明书的一部分，和用来解释本发明公开内容的原理和实施过程的详细说明书和实施例部分，阐明本发明公开内容的一个或多个实施方案。 
图1显示了举例说明根据本文描述的实施方案，与T细胞识别天然LDL和ApoB100相关的结果的图表。 
图2显示了举例说明根据本文描述的实施方案，证明LDL的氧化和T细胞活化之间反相关的结果的图表。 
图3显示了举例说明证明在本文所述的实施方案中杂交瘤反应是I-Ab限制性的结果的图表。 
图4显示了这样的图表，其举例说明证明在本文描述的实施方案中杂交瘤反应不依赖CD1和MHC-I呈递的结果。 
图5显示了证明在本文描述的实施方案中T细胞受体(TCR)基因型的实验的结果。 
图6显示了这样的图表，其举例说明在本文描述的实施方案中，与FACS评估的TCR表达相关的结果。 
图7显示了这样的图表，其举例说明了根据本文描述的实施方案，表明胆固醇和甘油三酯血浆水平的结果。 
图8显示了这样的图表，其举例说明在本文描述的实施方案中，表明针对oxLDL和LDL的抗体滴度的结果。 
图9显示了这样的图表和相片，其表明在本文描述的实施方案中，TRVB31+细胞耗尽降低针对ApoB100的T细胞反应。 
图10显示了这样的图表，其举例说明表明在本文描述的实施方案中，针对TRBV31的免疫诱导封闭性抗体的结果。
图11显示了这样的图表，其举例说明表明在本文描述的实施方案中，针对TRBV31的免疫减少动脉粥样硬化的结果。 
优选实施方案的详细说明
本文提供了治疗和/或预防个体的动脉粥样硬化或与其相关的病症的方法和系统和相关产品和组合物。
本文使用的术语“治疗(treating)或治疗(treatment)”表示任何这样的活动，该活动是以医药(medically)或外科手术方式对病症进行医疗护理的一部分，或以医药或外科手术方式处理病症。本文使用的术语“预防(preventing)或预防(prevention)”表示降低个体的病症死亡率或发病率负担的任何活动。这在一级、二级和三级预防水平进行，其中：a)一级预防避免发生疾病；b)二级预防活动旨在疾病早期治疗，由此增加干预的机会来预防疾病进展和出现症状；和c)三级预防通过恢复功能和减少疾病相关并发症来降低已有疾病的负面影响。 
本文使用的术语“病症”通常表示个体身体的这样的身体状况(总体上或其一个或多个部位)，其不符合与完全的身体、精神以及可能地社会福利的状况有关的个体的身体状况(总体上或其一个或多个部位)。本文描述的状况包括但不限于紊乱和疾病，其中术语“紊乱”表示与身体或其任何部位的功能异常相关的有生命个体的状况，术语“疾病”表示有生命个体的这样的状况，该状况损害了身体或其任何部位的正常功能，并且典型地表现出显著的体征和症状。示例性的状况包括但不限于个体的损伤、失能、紊乱(包括精神和身体紊乱)、综合征、感染、异常行为，和个体的身体或身体部位的结构和功能的不典型变化。 
本文使用的关于两个项目的措辞“与……相关”表示两个项目之间的关系，以致于第一项的发生伴有第二项的发生，包括但不限于因-果关系和征兆/症状-疾病的关系。 
本文使用的术语“个体”表示单个生物体，如高等动物，特别是脊椎动物，如哺乳动物，更特别的是人类。 
动脉粥样硬化现在被看作是一种与脂质相关的和免疫调节性的慢性动脉壁炎性疾病。已经鉴定了参与动脉粥样化形成的很多免疫成分，并且临床前研究已经取得有前景的结果，该结果提示靶向这些成分的免疫调节疗法可以减少动脉粥样硬化。 
本文使用的术语“动脉粥样硬化”表示心血管病症，尤其是慢性炎性疾病，其特征为引起动脉壁内膜中炎性反应的脂蛋白累积。血管内膜 (tunica intima)(或仅内膜)是动脉或静脉的最内层。内膜典型地由一层内皮细胞构成并由内侧弹性膜(lamina)支撑。在内膜中，内皮细胞直接接触血流。使用克隆扩充T细胞群的适应性免疫反应有助于这个炎性过程，由巨噬细胞和其它细胞支持的先天免疫反应亦然。几个证据线索指向低密度脂蛋白(LDL)颗粒成分作为血管炎症触发物。 
本文使用的术语“低密度脂蛋白”或“LDL”表示将胆固醇和甘油三酯从肝脏输送到外周组织的那种类型的脂蛋白。LDL是脂蛋白五个主族之一；这些族包括乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、中等密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白(HDL)。如同所有的脂蛋白一样，LDL能够使脂肪和胆固醇在血流的基于水的溶液中移动。典型地，天然LDL颗粒含有单个载脂蛋白B(apoB)分子，其使脂肪酸循环起来，保持它们溶于水性环境。LDL颗粒上的apoB在遍及全身的各种细胞中作为LDL受体的配体。该蛋白在血浆中主要以两种同工型ApoB48和ApoB100存在。第一种只由小肠合成，第二种由肝脏合成。载脂蛋白B-100分子具有4536个氨基酸残基和约514kD的分子量。另外，LDL典型地具有高度疏水核心，该核心由被称为亚油酸的多不饱和脂肪酸和约1500个酯化胆固醇分子组成。这个核心被磷脂和未酯化胆固醇以及单一拷贝的ApoB-100的外壳围绕。LDL颗粒直径为大约22nm，质量有约3百万道尔顿。低密度脂蛋白受体位于多种类型细胞的外表面上，它们在那里接受在血流中循环的低密度脂蛋白并将它们输送到细胞中。一旦进入细胞，低密度脂蛋白就分解而释放胆固醇。然后胆固醇被细胞利用、储存或从身体清除掉。低密度脂蛋白受体脱离它们的负载物后，循环返回到细胞表面以接受更多低密度脂蛋白。当LDL颗粒渗入内膜，它们易于遭受氧化修饰。这种变化可能包括被髓过氧化物酶和脂肪加氧酶进行酶学攻击，以及非酶学氧化反应。作为氧化的最初结果，磷脂、胆甾醇酯和甘油三酯中脂肪酸残基的双键被切开，产生反应性醛类和截短的脂类。在后者当中，修饰的磷脂如溶血卵磷脂和氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(ox-PAPC)可以活化内皮细胞、巨噬细胞和B1型B细胞，从而启动先天免疫反应，包括粘附分子表达、产生趋化因子和分泌天然抗体。LDL的蛋白结构部分也是氧化修饰的目标。它们包括载脂蛋白B-100(ApoB100) 的赖氨酰残基上丙二醛(MDA)、4-羟基壬烯醛和其它分子种类的加合物形成。形成针对LDL颗粒的MDA-赖氨酸和其它氧化产生的表位的抗体(Ketelhuth，D.F.，Tonini，G.C.，Carvalho，M.D.，Ramos，R.F.，Boschcov，P.，和Gidlund，M.(2008).Autoantibody response to chromatographic fractions from oxidized LDL in unstable angina patients and healthy controls(在不稳定的绞痛患者和健康对照中针对来自氧化的LDL的色谱级分的自身抗体反应那个).Scand J Immunol 68，456-462)。这种抗体在外周血中循环，也可以在动脉粥样硬化病变中发现。与B1细胞产生的氧化磷脂的天然抗体相比，抗MDA-ApoB100抗体主要是IgG分子(Yla-Herttuala，S.，Palinski，W.，Butler，S.W.，Picard，S.，Steinberg，D.，和Witztum，J.L.(1994).Rabbit and human atherosclerotic lesions contain IgG that recognizes epitopes of oxidized LDL(兔和人的动脉粥样硬化病变包含识别氧化的LDL的表位的IgG).Arterioscler Thromb 14，32-40.)。这暗示T细胞的参与有助于激活B细胞同种型转变。 
在一些实施方案中，本文描述的治疗和/或预防个体动脉粥样硬化的方法包括：抑制个体中针对ApoB100的CD4+T细胞反应。 
本文使用的术语“T细胞”表示一组被称为淋巴细胞的白细胞，它们在细胞介导的免疫中起着重要作用，并且在它们的细胞表面存在一种称作T细胞受体(TCR)的特殊受体，由此可以与其他类型淋巴细胞，如B细胞和天然杀伤细胞区分开来。T细胞中缩写T代表胸腺，因为它是T细胞发育的主要器官。在高胆固醇血症小鼠和从人动脉粥样硬化病变分离的克隆中已经鉴定到T细胞，由于LDL颗粒和氧化过程的生化复杂性，对T细胞表位的分子特性了解甚少。抗体通常由浆细胞产生，浆细胞是在活化CD4+T淋巴细胞产生的各种细胞因子存在下，和通过T淋巴细胞-B淋巴细胞的直接相互作用，由B淋巴细胞成熟而来。当CD4+T淋巴细胞遇到具有主要组织相容性复合体II类抗原呈递细胞例如B淋巴细胞和巨噬细胞的抗原性肽时，它们被活化。因此，T淋巴细胞识别主要组织相容性复合体II类肽复合体对于免疫反应的发展和抗体产生尤为重要。主要组织相容性复合体II类分子是高度多态的异源二聚膜糖蛋白，由α和β链组成。主要组织相容性复合体II类分子的功能是结合主要由胞外蛋白衍生的短 肽结合，接着形成主要组织相容性复合体II类肽复合体，该复合体与CD4+T淋巴细胞合适的T细胞受体相互作用。成熟时，MHC分子锚定在细胞膜中，在那里它们通过T细胞受体(TCRs)对T细胞展示短多肽。所有MHC分子接受来自它们所属细胞内部的多肽，并在细胞外表面上展示它们，用于被T细胞识别。 
术语“T细胞受体或TCR”表示T淋巴细胞(或T细胞)表面发现的分子，通常它负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原。TCR是异源二聚体，在95％的T细胞中，其由α和β链组成，而5％的T细胞的TCRs由γ和6链组成。TCR与抗原和MHC的接合通过由相关酶、共同受体和特异性辅助分子介导的一系列生化事件引起它的T淋巴细胞活化。TCR α链和β链的可变结构域都具有三个高变区或互补性决定区(CDRs)，而β链可变区具有另外的高变区域(HV4)，该区正常不接触抗原，因此不认为是CDR。CDR3是负责识别加工抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也可以与抗原性肽的N末端部分相互作用，以及β链的CDR1与该肽的C末端部分相互作用。CDR2区与呈递该肽的MHC分子相互作用。MHC分子同时结合特异性共同受体增强了来自T细胞复合体的信号。 
本文使用的术语“CD4+T细胞”表示T细胞，尤其是辅助T细胞和调节T细胞，它们的细胞表面存在共同受体CD4。在辅助T细胞上，CD4只与II类MHC结合。共同受体不仅确保TCR对于正确呈递的抗原的特异性，而且允许延长抗原呈递细胞和T细胞之间接合，由此增加必需分子(例如Lck)在涉及活化T淋巴细胞的信号传导的细胞内募集。例如，抗原与T细胞受体(TCR)结合刺激IL-2和一些其它细胞因子的分泌，以及IL-2受体(IL-2R)表达。 
在一些实施方案中，CD4+T细胞是存在T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)的CD4+T细胞。 
本文使用的关于化合物或功能基团的术语“呈递”表示实施连接以保持所连接的该化合物或功能基团的化学和/或生物学反应性。因此，细胞上呈递的蛋白在合适的条件下能够执行一个或多个化学和/或生物学反应，该反应从化学和/或生物学上表征该蛋白。 
本文使用的术语“T细胞受体β链可变区31”或“TRVB31”表示携带T细胞受体β链可变区31的T细胞，本领域技术人员阅读本发明公开内容后可以认识到。 
本文使用的术语“T细胞受体β链可变区30”或“TRVB30”表示携带T细胞受体β链可变区30的T细胞，本领域技术人员阅读本发明公开内容时可以认识到。 
本文使用的术语“具有与TRBV31的序列高度同源的DNA序列的T细胞受体”表示其β链可变结构域是TRBV31的直向同源物的T细胞受体，TRBV31如www.treefam.org中所限定。例如，在人类中，TRBV31的直向同源物是TRBV30。 
在一些实施方案中，使用抑制针对ApoB100的CD4+T细胞反应的化合物。这种化合物可以是根据其防止杂交瘤克隆48-5暴露于apoB100或其片段时被活化的能力而鉴定的化合物。杂交瘤克隆48-5已经根据布达佩斯条约于2009年1月22日保藏在DSMZ-德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH)，Inhofftenstrasse 7B，38124不伦瑞克，德国，保藏号DSM ACC2986。 
在一些实施方案中，抑制针对ApoB100的CD4+T细胞反应通过抑制TCR TRVB31来进行。 
在一些实施方案中，抑制针对ApoB100的CD4+T细胞反应通过抑制具有与TRBV31的序列高度同源的DNA序列的T细胞受体来进行。 
在一些实施方案中，治疗和/或预防个体的动脉粥样硬化和/或与其相关的病症可以通过施用治疗有效量的化合物来进行，该化合物抑制T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)与包含载脂蛋白B-100或其片段的分子结合。 
在一些实施方案中，治疗和/或预防个体的动脉粥样硬化和/或与其相关的病症可以通过施用治疗有效量的化合物来进行，该化合物抑制具有与TRBV31的序列高度同源的DNA序列的T细胞受体与包含载脂蛋白B-100或其片段的分子结合。 
在一些实施方案中，T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)与包含载脂蛋白B-100或其片段的分子的结合被抑制。 
在一些实施方案中，具有与TRBV31的序列高度同源的DNA序列的T细胞受体与包含载脂蛋白B-100或其片段的分子的结合被抑制。 
在一些实施方案中，抑制针对ApoB100的CD4+T细胞反应通过针对TCR TVB31或其免疫原性片段免疫个体来进行。 
接种疫苗引起抗原特异性免疫调节是预防或治疗慢性炎性疾病的具有吸引力的方法。以抗原特异性方式动员保护性免疫反应，避免了由于宿主抗感染的防御受阻造成的副作用。因此，在慢性炎症性疾病，如动脉粥样硬化中，抗原特异性抑制病理性自身免疫性是令人感兴趣的。 
通过几种不同机制可以实现抗原特异性免疫保护，如产生保护性抗体，致病性T细胞克隆缺损或失活(无反应性)，或诱导由调节性T细胞(Treg)家族介导的抑制性细胞免疫。 
在一些实施方案中，可以用TCR TRVB31蛋白进行免疫。在一些实施方案中，可以用TCR TRVB31的片段，尤其是包括TCR β链CDR2可变区的部分(氨基酸残基45-62，ATGGTLQQLFYSITVGQV-SEQ ID NO：1)的TRBV31肽进行免疫，其在本文也表示为TRVB31肽。 
本文使用的术语“蛋白”或“多肽”表示由两个或更多氨基酸单体和/或其类似物组成的有机聚合物。术语“多肽”包括任何长度的氨基酸聚合物，包括全长蛋白和肽，以及其类似物和片段。三个或更多氨基酸的多肽也称作寡肽。本文使用的术语“氨基酸”、“氨基酸性单体”或“氨基酸残基”是指二十个天然存在的氨基酸中任何一个，包括具有非天然侧链的合成的氨基酸并且包括D和L光学异构体二者。术语“氨基酸类似物”是指其中一个或多个个体原子已经被不同的原子、同位素，或不同的功能基团所取代，但在其他方面等同于其天然氨基酸类似物的氨基酸。 
本文使用的术语“片段”表示任何长度的多肽的一部分。因此TCRTVBR31的抗原性片段是表现出抗原性特性的TCR TVBR31的一部分。本文描述的TCR TVBR31的抗原性片段也包括无论是合成的还是可能是其衍生的任何肽。 
本文使用的关于第一多肽的术语“衍生物”(例如TCR TVBR31抗原性片段)表示第二多肽，该第二多肽结构上与第一多肽有关并且通过修饰而衍生自第一多肽，这种修饰引入了第一多肽中不存在的特征，同时保留 了第一多肽的功能特性。因此，TCR TVBR31的抗原性片段的衍生多肽，通过氨基酸序列的修饰，通常不同于原始多肽或其部分，这种修饰可能伴有或可能不伴有原始多肽或其部分中不存在的额外功能。然而TCRTVBR31的抗原性片段的衍生多肽保留了可与对于TCR TVBR31或其抗原性片段所描述的抗原特性相媲美的抗原特性。 
在一些实施方案中，描述了TCR TRBV31肽或其片段用作药物，尤其是用于治疗动脉粥样硬化。 
在一些实施方案中，可以用与T细胞受体β链可变区31(TCRTRBV31)或其片段具有反应性的抗体进行免疫。 
在一些实施方案中，描述了与T细胞受体β链可变区31(TCRTRBV31)或其片段具有反应性的抗体用作药物，尤其是用于治疗动脉粥样硬化。 
本文使用的术语“抗体”是指一种类型蛋白，该蛋白在抗原刺激后由活化B细胞产生并可以与抗原特异性结合，促进生物系统中的免疫反应。全部抗体典型地由四个亚单位组成，包括两条重链和两条轻链。该术语抗体包括天然的和合成的抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体或其片段。示例性的抗体包括IgA、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgM等等。示例性的片段包括Fab Fv、Fab’F(ab′)2等等。单克隆抗体是与另一种生物分子的单一特定空间和极性结构(术语称作“表位”)特异性结合并由此被解释为与其互补的抗体。在一些情形中，单克隆抗体也可以具有相同的结构。多克隆抗体是指不同的单克隆抗体的混合物。在一些情形中，多克隆抗体可以是单克隆抗体的混合物，其中这些单克隆抗体中至少两个与不同的抗原表位相结合。不同的抗原表位可以在相同的靶标、不同的靶标上，或其组合上。抗体可以通过本领域熟知的技术来制备，如宿主免疫和收集血清(多克隆的)，或通过制备连续杂交瘤细胞系和收集分泌的蛋白(单克隆的)。 
在一些实施方案中，本文描述的抑制T细胞反应的蛋白(包括抗体)、肽和/或试剂和合适的佐剂和/或赋形剂一起包含在组合物中。 
本文使用的术语佐剂表示改变其它试剂(例如药物、疫苗)的作用，而当施用它们本身时，直接作用即使有也很少的药物学或免疫学试剂。它 们常常包括在疫苗中以增强接受者对所提供抗原的免疫反应，同时保持最少的注射外源物质。佐剂类型包括：刺激免疫系统和增强对疫苗的反应，本身不具有任何特定抗原作用的免疫佐剂。 
本文使用的术语赋形剂表示用作药物活性成分的载体的非活性物质。示例性的赋形剂还可以用于使含有非常有效活性成分的制剂膨胀，以允许方便且精确的给药。除了它们在单剂量的量中的用途之外，赋形剂可以用在制备过程中以辅助有关活性物质的处理。根据给药途径和药物形式，本领域技术人员可认识到可以使用不同的赋形剂。 
在一些实施方案中，组合物包含TCR TRVB31的选定(免疫原性的)肽片段，可能的毒素/类毒素：破伤风毒素、白喉类毒素、霍乱毒素B亚单位，以及BSA、HAS、rHSA、KLH、卵白蛋白。 
在一些实施方案中，佐剂和赋形剂是药物可接受的，所得组合物是药物组合物。在那些实施方案中的一些中，药物组合物是疫苗。 
本文公开的抑制CD4+T细胞对ApoB100反应和/或抑制TCR TRVB31与ApoB100结合的试剂，尤其是TCR TRVB31，其片段和/或相关抗体，可以提供作为系统的一部分来治疗和/或预防。该系统可以以成套阵列或试剂盒的形式提供。 
在成套试剂盒中，试剂和进行检测抑制和/或免疫的测定法的其它试剂可以分开包含在试剂盒中。试剂可以包括在一种或多种组合物中，并且每种试剂可以与合适的载体一起处于组合物中。 
本文使用的术语“检测”表示测定有限份空间中靶标的存在、出现或事实，该空间包括但不限于样品、反应混合物、分子复合体和底物。本文使用的“检测”可以包括测定靶标的化学和/或生物学特性，包括但不限于与其它化合物相互作用的能力，尤其是结合的能力，激活另一种化合物的能力，和本领域技术人员阅读本发明公开内容时可认识到的另外特性。检测可以是定量的或定性的。当检测涉及、关于或包括测量靶标或信号的量(也称作定量)时，这种检测是定量的，它包括但不限于目的是测定靶标或信号的量或比例的任何分析。当检测涉及、关于或包括依据与另外靶标或信号相比的相对丰度来鉴定靶标或信号的质量或类型时，这种检测是定性的，不是定量的。 
另外的组分可以包括标记分子，尤其是标记的多核苷酸、标记的抗体、标记、微流体芯片、比照标准，和本领域技术人员阅读本发明公开内容时可认识到的另外的组分。本文使用的作为复合体或分子组分的术语“标记”和“标记分子”是指能够检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光染料、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、纳米颗粒、金属溶胶、配体(如生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或半抗原)等等。术语“荧光团”是指能够在可检测图像中显示出荧光的物质或其一部分。因此，本文使用的措辞“标记信号”表示允许标记检测的标记发出的信号，包括但不限于放射性、荧光、化学发光、酶反应结果中化合物的产生等等。 
在一些实施方案中，抑制和/或免疫的检测可以通过基于荧光的读数来实施，其中标记抗体被荧光团标记，它包括但不仅仅是小分子染料、蛋白生色团、量子点和金纳米颗粒。另外的技术本领域技术人员在阅读本发明公开内容时可认识到，不再进一步详细讨论了。 
特别是，为了实施本文描述的方法，试剂盒的成分可以和合适的说明书和其它必需试剂一起提供。试剂盒中所含组合物通常处于分开的容器中。实施测定的说明书，例如在纸质或电子载体上的成文或音频说明书，例如磁带或CD-ROMs，通常也将包括在试剂盒中。根据所用的具体方法，试剂盒还可以含有其它包装试剂和材料(即洗涤缓冲液等等)。 
特别地，在一些实施方案中，公开了药物组合物，其含有本文描述的至少一种试剂，和一种或多种相容的和药物可接受载体，特别是药物可接受稀释剂或赋形剂。在那些药物组合物中，该试剂可以作为活性成分施用，用于治疗或预防个体的病症。 
在一些实施方案中，描述了来自用oxLDL免疫并携带人类转基因ApoB100的小鼠(huB100t9)的杂交瘤用于鉴定抑制CD4+T细胞对ApoB100反应的合适试剂的用途。特别地，杂交瘤克隆48-5已经根据布达佩斯条约于2009年1月22日保藏在DSMZ-德国微生物菌种保藏中心，Inhofftenstrasse 7B，38124不伦瑞克，德国，保藏号DSM ACC2986，和相关的用途和系统。 
本领域技术人员在阅读本发明公开内容时可以认识到关于本文描述的杂交瘤、试剂、组合物、方法的实施，包括实施该方法的系统(该系统可以是成套试剂盒的形式)，以及相关组合物(该组合物包括试剂和其它试剂，和组合物的合适载体、试剂或辅助试剂)，和试剂盒的一般制备和包装的更多详细情况。 
实施例
下列实施例进一步阐明本文描述的方法和系统，以举例说明方式提供这些实施例且并不意欲限制本发明。 
具体地，下列实施例阐明了示例性的方法和系统是基于用来自TCRTRVB31的特异性肽进行免疫来抑制针对ApoB100的CD4+T细胞反应。本领域技术人员会认识到详细描述的关于下述内容的特征的适用范围，用来自TCR TRVB31的不同肽进行免疫，或抑制针对ApoB100的CD4+T细胞反应的其它方法和系统，特别是根据本发明公开内容的存在TCRTRVB31的CD4+T细胞。 
在下列实施例中，数值以平均数±平均值的标准误差(SEM)表示，除非另有陈述。非参数的Mann-Whitney U检验用于配对比较。p小于0.05被认为组间差异是显著的。 
实施例1：T细胞杂交瘤的天然人类LDL和ApoB100_ 
对于这些实验，使用HuB100tg小鼠(携带人类ApoB100作为转基因的小鼠)表征针对oxLDL的T细胞反应。这些小鼠在肝脏以及肠中表达人类全长ApoB100，并显示出人源化脂蛋白谱。 
免疫
对于T细胞杂交瘤的产生，使用7周龄人类ApoB100雄性转基因小鼠huB100tg(C57BL/6，129-Apobtm2sgy，DNX Transgenics，Princeton，USA)。 
这些小鼠携带全长人APOB基因，其中密码子2153已由亮氨酸变为谷氨酰胺以防止ApoB48形成，仅允许ApoB100产生(Boren，J.，Lee，I.，Zhu，W.，Arnold，K.，Taylor，S.，和Innerarity，T.L.(1998).Identification of  the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100(鉴定载脂蛋白B100中的低密度脂蛋白受体结合位点并且通过家族缺陷型apo-B100中的羧基端调节其结合活性).J Clin Invest101，1084-1093；Linton，M.F.，Farese，RV.，Jr.，Chiesa，G.，Grass，D.S.，Chin，P.，Hammer，RE.，Hobbs，H.H.，和Young，S.G.(1993).Transgenic mice expressing high plasma concentrations of human apolipoprotein B100 and lipoprotein(a)(转基因小鼠表达高血浆浓度的人载脂蛋白B100和脂蛋白).J Clin Invest 92，3029-3037；Yao，Z.M.，Blackhart，B.D.，Johnson，D.F.，Taylor，S.M.，Haubold，K.W.，和McCarthy，B.J.(1992).Elimination of apolipoprotein B48 formation in rat hepatoma cell lines transfected with mutant human apolipoprotein B cDNA constructs(在用突变的人载脂蛋白B cDNA构建体转染的大鼠肝癌细胞系中去除载脂蛋白B48的形成).J Biol Chem 267，1175-1182.)。 
将50μg铜氧化人LDL(oxLDL)与完全弗氏佐剂(CFA)混合，皮下(s.c)首次免疫小鼠，2周后用与弗氏不完全佐剂(IFA)混合的50f.1goxLDL对小鼠加强免疫。Havel等(Havel，RJ.，Eder，H.A.，和Bragdon，J.H.(1955).The distribution and chemical composition of ultracentrifugallyseparated lipoproteins in human serum(在人血清中超速离心的脂蛋白的分布和化学组成).J Clin Invest 34，1345-1353)描述了氧化人LDL(oxLDL)如下制备：用超速离心法从健康供体合并的血浆中分离LDL(d＝1.019-1.063g/mL)。分离后，用PBS大面积透析LDL。一等分试样的LDL添加1mM EDTA用作未修饰的LDL。在20IJM CUS04存在下，37℃孵育1mL LDL(1mg/mL蛋白含量，用Bradford，Biorad，USA测定)18h获得高度氧化的LDL。 
T细胞杂交瘤的产生
在如上所述的oxLDL初次免疫和加强注射后，收集淋巴结(LN)细胞并与胸腺瘤细胞融合产生杂交瘤如下： 
Kappler等(Kappler，J.W.，Skidmore，B.，White，J.，和Marrack，P.(1981).Antigen-inducible，H-2-restricted，interleukin-2-producing T cell hybridomas. Lack of independent antigen and H-2recognition(抗原可诱导的、H-2局限性的、产生白介素-2的T细胞杂交瘤。缺乏独立的抗原和H-2识别).J Exp Med 153，1198-1214)描述了聚乙二醇诱导5 x 107个淋巴结细胞(LN)和3 x 107个BW5147胸腺瘤细胞融合以产生T细胞杂交瘤。简言之，融合前3天期间用3μg/ml oxLDL刺激来自免疫小鼠的LN细胞。融合后，添加1 x 106个胸腺细胞作为饲养细胞，将细胞混悬液接种在96孔板中并在3rC、7.5％CO2下温育。温育24小时后，向培养基中添加次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)以选择成功融合的细胞。在268个生长的杂交瘤培养物中，发现有117个表达CD3和CD4。接着，经有限稀释克隆23个HAT抗性单克隆杂交瘤并筛选它们针对天然LDL、铜oxLDL和纯化的未修饰ApoB100的反应性。 
筛选阳性克隆
在同源的照射的抗原呈递细胞(APC)存在下，在23个HAT抗性单克隆杂交瘤暴露于推定的抗原(天然LDL、铜oxLDL和纯化的未修饰ApoB100)后，评估由它们产生的IL-2引起的活化(抗原与T细胞受体(TCR)结合刺激IL-2分泌)。这种细胞吸收并加工抗原，引起与MHC分子结合的抗原性肽的呈递。为了防止T细胞识别外来MHC分子作为抗原而活化，需要同源的APC，即来自携带与T细胞相同的MHC的小鼠的APC。以96孔测定法测定T细胞反应性，采用1 x 105个T杂交瘤细胞和4x105个照射的(1.6Gy)APCs，采用不同的抗原。如实施例1中讨论的来制备LDL和oxLDL。如Wessel等以前描述的(Wessel，D.，和Flugge，U.I.(1984)A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids(在存在去垢剂和脂质时定量回收稀释溶液中的蛋白的方法)Anal Biochem 138，141-143)并做少许变动获得ApoB100。简言之，向0.1ml LDL(1mg/mL)中添加0.4ml甲醇、0.1ml氯仿和0.3ml水；接着用力混合混悬液并以9000x g离心1分钟。除去上相并向含沉淀蛋白的下相和分界面添加0.3ml甲醇，再次用力混合并以9000x g离心2分钟使蛋白沉淀。为了获得可溶且高度纯的ApoB100，将沉淀的蛋白重悬于最小体积的10％SDS(Bio-Rad实验室，Hercules，CA，USA)溶液中直至完全溶解。然后这些ApoB100制剂经受首次过滤，采 用PD-10柱(GE Healthcare，以前的Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)以除去过量的SDS，随后使用大小排阻柱Superdex-200(0.5mL/min，在Tris-HCl中pH 7.4)进行纯化。收集含ApoB100的第一峰，并丢弃含有来自LDL纯化步骤的污染蛋白的额外峰。当第二次注入Superdex-200柱(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)评估时，ApoB 100制剂显示出90％以上的纯度。最后，用Bradford测定法(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)测定蛋白浓度。 
通过将脾脏在尼龙过滤器(1001-1m)上网筛，之后裂解红细胞并洗涤来制备APCs。用伴刀豆球蛋白A(concavalin)(ConA)作为阳性对照。将细胞在补充5％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s改良Eagle’s培养基(DMEM)中，在3rC、7.5％CO2下培养24小时。通过ELISA(R&DSystems，Abingdon，United Kingdom)测定培养物上清液的白介素2(IL-2)并将其作为T细胞活化的读数。结果可以参见图1A，其中二十三个HAT抗性单克隆杂交瘤中的每一个的1 x 105个杂交瘤细胞与4 x 105个照射的APCs连同40μg/mL LDL、oxLDL或ApoB100一起培养。用培养基作为阴性对照。 
明显地，所有23个检验的单克隆T细胞杂交瘤中，11个对天然人LDL和ApoB100起反应，但是没有一个对氧化LDL有反应。 
用聚合酶链式反应(PCR)对TCR进行基因分型
用PCR对可以对天然LDL和ApoB100起反应的十一个克隆进行基因分型。用RNeasy mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)制备来自11个杂交瘤克隆的每一个的1 x 107个杂交瘤细胞的总RNA，并使用Superscript II(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)将其逆转录为cDNA，采用随机六核苷酸引物(pdN6)在RNasin(Life Technologies，Cergy Pontoise，France)存在下进行。用合适的Vα家族特异性5‘引物(表1)连同恒定区Cα3’引物，或相关的Vβ家族特异性5‘引物(表2)连同恒定区Cβ3’引物扩增所产生的cDNA。 
表1用于TRAV的基因分型的引物 
    α-链家族   引物序列  SEQ ID NO
  1   TRAV01   5′TGGATGGTTTGAAGGACAGTG 3′   2
  2   TRAV02   5′CTGTTTA TCTCTGCTGACCGG 3′   3
  3   TRAV03-3   5′ACGAAGGACAAGGATTCACTGT 3′   4
  4   TRAV04   5′CTGGAGGACTCAGGCACTTACT 3′   5
  5   TRAV06   5′GGTACCCGACTCTTTTCTGGT 3′   6
  6   TRAV06D-4   5′ACCCTTTCAGAAGATGACTTCC 3′   7
  7   TRAV06D-5   5′TTT AAAGTCCCAAAGGCCAA3′   8
  8   TRAV06-6   5′TCCTGAAAGTCA TTACGGCTG 3′   9
  9   TRAV06-7   5′AGAGCCTCAAGGGACAAAGAG 3′   10
  10   TRAV07-3   5′AGACTCCCAGCCCAGTGACT 3′   11
  11   TRAV07-5   5′ACA TCAGAGAGCCGCAACC 3′   12
  12   TRAV080-1   5′CCCTGCCCAGCT AA TCTT AA T 3′   13
  13   TRAV09-3   5′CTGCAGCTGAGATGCAAGTATT3′   14
  14   TRAV090-1   5′TCCTATGGTGGATCCATTTACC 3′   15
  15   TRAV10   5′TGGACAGAAAACAGAGCCAA 3′   16
  16   TRAV11   5′CAGGCAAAGGTCTTGTGTCC3′   17
  17   TRAV12-1   5′ACGCCACTCTCCAT AAGAGCA 3′   18
  18   TRAV13-1   5′GCTCTTTGCACATTTCCTCC 3′   19
  19   TRAV14-1   5′TGCAGTTATGAGGACAGCACTT 3′   20
  20   TRAV14-3   5′CTGCAGTTATGAGAACAGTGCTT 3′   21
  21   TRA V15-1/0V6-1   5′CCAGACGATTCGGGAAAGTA 3′   22
  22   TRAV16   5′TTCCATCGGACTCATCATCAC3′   23
  23   TRAV17   5′AACCTGAAGAAA TCCCCAGC 3′   24
  24   TRAV19   5′GGAAGACGGAAGATTCACAGTT 3′   25
  25   TRAV20   5′ACGCTCCT AA TAGACATTCGCT 3′   26
  26   TRAV21   5′GTTCCTCTTCAGGGTCCAGA 3′   27
  27   TRAC   5′CACCAGCAGGTTCTGGGTTC 3′   28
[0106] 表2  用于TRBV的基因分型的引物 
Figure BDA0000107612200000191
用国际免疫遗传信息系统命名法(IMGT)对惯用T细胞的TCR-V链进行命名。所有的TCR-V链序列取自IMGT数据库(http://imgt.cines.frl))(Lefranc，M.P.，Pommie，C.，Ruiz，M.，Giudicelli，V.，Foulquier，E.，Truong，L.，Thouvenin-Contet，V.，和Lefranc，G.(2003).IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains(关于免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和Ig超家族V-样结构域的IMGT独特编号).Dev Comp Immunol 27，55-77)。新旧命名法之间的对比参见http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/#J。PCR反应物mastermix含有10mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2、1mM dNTP和0.2U/ml Taq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。所有引物添加至终浓度0.2μM。反应采用94℃(40秒)变性，58℃(40秒)退火和72℃(1分钟)聚合，进行35个循环。在1.5％琼脂糖凝胶上分析PCR产物并用凝胶红色染料进行显象。 
根据TCR基因分型，从十一个克隆鉴定到可以对天然LOL和ApoB100起反应的三个不同亚组，每个亚组(15-2、45-1和48-5)的代表性数据与非反应克隆20(97-3)一起显示。如图1B-E所见，每个亚组的杂交瘤克隆对未修饰ApoB100蛋白有着明确的剂量-反应。杂交瘤克隆关于TCR的表征在下表3给出。 
为了确定反应性不依赖于蛋白的人特异性修饰，还从huB100tg x Ldlr-/-小鼠分离LOL和ApoB100并检验杂交瘤。这些小鼠产生含人ApoB100的LDL。然而，这些颗粒缺少仅在人中才发生并设想可能引起免疫反应的翻译后修饰。 
在图1B-E中，将1x105个杂交瘤细胞与4 x 105个照射的APCs，不同浓度的(□)从人LOL纯化的人ApoB100和(x)得自huB100tg x Ldlr-/-小鼠的转基因人ApoB100一起培养。在两个实验中，以IL-2的分泌作为活化的读数。从该图可以看出，这个重组人ApoB100也可以被T细胞杂交瘤亚组15-2、45-1和48-5识别。因此，天然LDL和人ApoB100含有这些T细胞识别的T细胞表位。 
实施例2：用LDL或oxLDL免疫的小鼠的T细胞识别天然ApoB100
以前已经确定动脉粥样硬化病变含有寡克隆T细胞，现在发现由oxLDL免疫的小鼠产生的杂交瘤可以识别LDL的天然ApoB 100，问题是多克隆T细胞群中是否可以发生这种自身免疫反应。通过用LDL或oxLDL(高度氧化的)免疫huB100tg x Ldlr-/-小鼠，之后用oxLDL或天然ApoB100对来自这些小鼠的脾细胞进行体外攻击来检验这个假设。这些小鼠缺少负责从循环中清除LDL的LDL受体。当喂给脂肪饮食时，它们发生高胆固醇血症和动脉粥样硬化。在这种病情下，对LDL的免疫反应增强，使其适于分析这种反应。 
体外增殖测定法
分离来自用LDL或oxLDL免疫的huB100tg x Ldlr-/-小鼠的脾细胞并制备细胞混悬液。在96孔板中，将5 x 105个脾细胞一式两份与如下所述的不同抗原在200μL无血清培养基，1∶100BD ITS+Premix(BD生物科学(BD Biosciences)，Franklin Lakes，NJ，USA)，1mg/mL BSA(Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，USA)，10mmoi/L HEPES(Gibco Invitrogen，卡尔斯巴德，CA，25USA)，1mmol/L丙酮酸钠(Gibco Invitrogen，卡尔斯巴德，CA，USA)，1mmol/L非必需氨基酸(Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，USA)，和50μg/mL庆大霉素硫酸盐(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)中，37℃，5％CO2湿润环境中一起培养72小时。添加五十微升H3-胸腺嘧啶核苷(Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，USA，无血清培养基中1μCi)，温育18h后，用闪烁计数器(Wallac，Turku，芬兰)估计T细胞增殖。 
在图2(A)中，将来自LDL或oxLDL皮下免疫的huB100tg x Ldlr-/-小鼠的5 x 105个脾细胞，用20μ/mL人oxLDL或天然人ApoB100体外攻击。将数值用获自H3_胸腺嘧啶核苷掺入的刺激指数的平均数±SEM来表示。此外，天然ApoB100得到最强的反应，而oxLDL不激发活化(图2A)。此外，这个数据显示用天然LDL或oxLDL免疫引起识别LDL颗粒的天然的而不是氧化的表位的T细胞群的增殖。 
实施例3：LDL氧化引起T细胞表位的识别降低
通过将T细胞杂交瘤暴露于已被铜氧化不同时间产生氧化程度不同的一系列LDL颗粒来进一步分析LDL颗粒的氧化和抗原性之间的关系。 通过将1mL LDL(蛋白含量1mg/mL，用Bradford，Biorad，USA测定)在20～M CuSO4存在下37℃温育18小时获得高度氧化的LDL；通过将LDL与20～M CuSO4温育1、2、4或8小时获得不同的氧化程度。如(Puhl，H.，Waeg，G.，和Esterbauer，H.(1994).Methods to determine oxidation of low-density lipoproteins(确定低密度脂蛋白氧化的方法).Methods Enzymol(酶学方法)233，425-441)以前描述用TBARS估计氧化程度(图2B)。 
如上面实施例2所述分离用LDL或oxLDL免疫的huB100tgx Ld/r′-小鼠的脾细胞并制备细胞混悬液。将来自细胞混悬液的1.0 x 105个杂交瘤细胞与4 x 105个照射的APCs连同40～g/ml天然LDL或已与20～M CuSO4温育1、2、4、8或18小时的oxLDL温育24小时。温育24小时后，估计培养细胞上清液中IL-2的分泌(图2C＝15-2克隆；图2D＝48-5克隆；图2E＝45-1克隆；图2F＝97-3阴性对照克隆)。 
令人惊讶的是，对于所有T细胞杂交瘤，氧化程度和活化幅度之间呈反比关系(图2C-F)。因此，天然LDL得到最强的IL-2反应，而重度氧化的LDL(即已氧化18小时的LDL)根本不激发任何活化。检测oxLDL对温育后细胞活力的影响，显示组间无显著差异(未显示数据)。这些数据提示氧化后，T细胞对LDL中表位的反应逐渐降低。 
实施例4：T细胞对天然LDL和ApoB100的反应取决于特异性II类MHC分子
由于纯化的ApoB100能够诱导被免疫小鼠中获得的CD4+T细胞杂交瘤活化，因此设想表位可能是MHC II类复合体呈递的肽；至于本发明的小鼠，其是I-Ab单倍型。对于评估II类MHC限制性，将1 x 105个杂交瘤细胞与取自同源的供体(C57BL6；I-Ab)即I-Ab单倍型小鼠，或不同基因型(BALB/c；I-Ad)，5即I-Ad单倍型小鼠的4 x 105个照射的APCs，连同不同浓度的人ApoB100一起培养。同时，在照射的I-Ab单倍型APCs存在下，连同抗II类MHC阻断性抗体，用ApoB100攻击杂交瘤细胞。培养24小时后，评价培养细胞上清液中IL-2的分泌。A＝15-2克隆；B＝48-5克隆；C＝45-1克隆；D＝97-3阴性对照克隆。 
从图3可以看出当添加抗小鼠I-Ab的阻断性抗体时，所有克隆都有明确的T细胞活化抑制。来自BALB/c小鼠的错配的表达I-Ad的APCs不 能将ApoB100呈递给抗原特异性T细胞杂交瘤。因此，抗原特异性T细胞识别ApoB100蛋白要求抗原性蛋白成分由同源的II类MHC分子呈递。 
为检测与ApoB100结合或可能与其共纯化的脂质抗原是否参与，评价T细胞对携带I-Ab而缺乏CD1d的APCs呈递的ApoB100的反应，所述CD1d是将脂质抗原呈递给T细胞的MHC样分子。然而，APCs上缺少CD1d并不削弱T细胞反应(图4)。类似地，缺乏I类MHC分子的I-Ab小鼠的APCs能够将ApoB100抗原呈递给T细胞杂交瘤(图4)。这些结果表明ApoB100抗原被II类MHC限制性CD4+T细胞所识别。综上，这个实施例描述的实验表明细胞对apoB 100的免疫反应由CD4+型T细胞建立并需要包括携带与应答T细胞的MHC类型相同的APC上的II类MHC分子的抗原呈递。这种方案的特征是接受自细胞间隙的肽抗原向T细胞的经典呈递。 
实施例5：对天然LDL和ApoB100反应的T细胞表达TRBV31
用RT-PCR扩增重排可变结构域来在mRNA水平上表征T细胞杂交瘤的TCR。分离RNA并合成cDNA如实施例1中提及的进行。 
用合适的vβ家族特异性5′引物(表2)连同恒定区Cβ3′引物，或相关的Vα家族特异性5′引物(表1)连同恒定区Cα3′引物扩增产生的cDNA。所有引物的设计根据以前公开的序列(Lefranc，M.P.，Pommie，C.，Ruiz，M.，Giudicelli，V.，Foulquier，E.，Truong，L.，Thouvenin-Contet，V.，和Lefranc，G.(2003).IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains(关于免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的IMGT独特编号).Dev Comp Immunol27，55-77)。PCR反应的mastermix含有10mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2、1mM dNTP和0.2U/ml Taq聚合酶(Invitrogen)。添加全部引物至终浓度为0.2μM。反应进行35个循环，采用94℃(40秒)变性、56℃(40秒)退火和72℃(1分钟)聚合。在1.5％琼脂糖凝胶上分析PCR产物并用溴化乙锭染色进行显象。 
用CD3的按需测定(assay-on-demand)引物和探针和次黄嘌呤胍核糖核酸转移酶(hypoxanthine guanidine ribonucleosyl transferase)(HPRT)(Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA，USA)在ABI 7700 序列检测仪(Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA，USA)上进行实时PCR。 
对于TRBV31表达定量分析，将基因分型引物与根据TCRβ链恒定区的核苷酸序列设计的探针(5′-TCCACCCAAGGTCT-3’-SEQ ID NO：53)组合使用。使用ABI引物表达软件(Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA，USA)设计探针并合成它，在其5′末端连接有6-羧基-荧光素(FAM)报道分子(Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA，USA)。根据公式2ΔΔCT的相对表达方法分析数据，其中ΔΔCT＝ΔCT(样品)-ΔCT(校准＝每组内所有样品的CT平均值)，和ΔCT是靶基因的CT减去看家基因(HPRT)的CT(Giulietti，A，Overbergh，L.，Valckx，D.，Decallonne，B.，Bouillon，R.，和Mathieu，C.(2001).An overview of real-time quantitative PCR：applications to quantify cytokine gene expression (实时定量PCR的综述：量化细胞因子基因表达的应用).Methods(San Diego，Calif25，386-401)。表3总结了结果。 
表3
Figure BDA0000107612200000241
用融合配偶体胸腺瘤BW5147生产表达重排TRAV20和TRBV12.1可变链的杂交瘤细胞(见实施例1)，并且所有杂交瘤也在mRNA水平表达这些链(表1、2和3和图5)。天然人LDL和ApoB 100特异性的所有T细胞杂交瘤一致表达TCR TRBV31(携带T细胞受体β链可变区31的T 细胞)并且在它们当中没有鉴定到其它Vβ家族。相比之下，反应性杂交瘤当中的Vα链的应用包括不同的家族；对于15-2、45-1和48-5分别是TRAV 3、4和13(表3)。对于非反应性杂交瘤，Vβ以及VαTCR可变链以非限制性方式表达，且不包括TRBV31(未显示数据)。流式细胞术分析证实了在每个LDL反应性杂交瘤中，TRBV31T细胞受体链的表面表达(表3和图6)。使用所有市售抗小鼠TCR-Vα和TCR-Vβ单克隆抗体(mAb，BDPharMingen，San Diego，CA，USA)对选定的T细胞杂交瘤上的TCR-Vα和TCR-Vβ进行染色。TCR-V mAbs与PE、FITC或生物素/链霉抗生物素蛋白-Cy5缀合。这些抗体、抗CD3-Pacific Blue和抗CD4-APC组合使用。将来自未免疫小鼠的脾细胞用作所有抗体的阳性对照。在CyAnTM ADP流式细胞仪(Dako，Glostrup，丹麦)上分析细胞。 
实施例6：TRBV31 +  T细胞耗尽降低对ApoB100的增殖反应
为直接检验TRBV31可变链对于ApoB100识别的总体重要性，用ApoB100免疫和加强小鼠，之后体外耗尽来自脾的TRBV31+T细胞。用用ApoB100给HuB100tg x Ldlr-/-小鼠皮下免疫和加强。收获脾细胞，之后用荧光激活细胞分选术(FACS)体外耗尽来自脾的TRBV31+或TRBV19+T细胞。将60 x 106个脾细胞分成2组并分别用抗TRBV31和抗TRBV19(PharMingen，San Diego，CA，USA)分别单独进行染色。将TRBV19用作分选程序的对照，因为识别ApoB100的杂交瘤无一表现出TRBV19应用。值得注意的是表达TRBV19ITRAV13.2链，不识别LDL或ApoB100的克隆96.7和97.3确实对HDL显示出反应性(未显示数据)。染色后，细胞在MoFlo Cytomation细胞分选仪(Cytomation Bioinstruments，Freiburg，德国)中基于耗尽阳性事件进行分选。然后收集阴性细胞并用于针对ApoB100的增殖测定法。 
此后，用不同浓度的人ApoB100在体外攻击5 x 105个TRBV31+/TRBV19-或TRBV19+/TRBV31-脾细胞。如实施例2所述，通过H3-胸腺嘧啶核苷掺入获得刺激指数。来自脾的TRBV31+T细胞的耗尽导致体外攻击后对ApoB 100抗原的反应明显减少，当脾细胞群中表达可变链TRBV19的T细胞耗尽时，没有观察到这点(图7)。因此，在这个模式中，由TRBV31+T细胞实现的对ApoB100的细胞免疫反应的比例显著。 
实施例7：针对TRBV31+TCR的免疫防止动脉粥样硬化
为测定ApoB 100反应性TRBV31+T细胞群对动脉粥样硬化的影响，用衍生自TCR TRBV31的肽免疫huB100tg x Ldlr-/-小鼠。在这些实验中，使用Jan Boren， 
Figure BDA0000107612200000261
University)友情提供的十一周龄雄性huB100tg xLdlr-/-小鼠(C57BL/6，129-Apobtm2sgyLdlrtmlHer(Skalen，K.，Gustafsson，M.，Rydberg，E.K.，Hulten，L.M.，Wiklund，0.，Innerarity，T.L.，和Boren，J.(2002).Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis(在早期动脉粥样硬化中致动脉粥样硬化的脂蛋白的内皮下保留).Nature(自然)417，750-754)。这些小鼠具有200-400mg/dl的升高的血清30胆固醇水平，并且当喂给高脂饮食时它们具有非常高的水平(＞2,000mg/dl)。用100μgTRBV31肽皮下免疫小鼠。这个TRBV31肽包括TCRβ链CDR2可变区的一部分(氨基酸残基45-62，“ATGGTLQQLFYSITVGQV”-SEQ ID NO：1)。合成该肽并与Anaspec，San Jose，CA，USA的钥孔血蓝蛋白(KLH)缀合。 
KLH是从海洋软体动物钥孔帽贝(keyhole limpet)分离的天然蛋白，其是免疫原性载体蛋白，在体内增加对半抗原和其他弱抗原如独特型蛋白的抗原免疫反应。用完全弗氏佐剂乳化TRBV31肽-KLH缀合物，4周后用IFA乳化的相同抗原加强免疫小鼠。用与该肽相同的方案，用100μgKLH皮下免疫对照组小鼠。免疫后5天小鼠开始保持高脂饮食(0.15％胆固醇)直到10周后用CO2杀死。此外，在杂交瘤实验中，将来自C57BLl6背景小鼠的照射脾细胞用作抗原呈递细胞(APC)。所有实验经当地道德委员会批准。 
用处于弗氏佐剂中的该TRBV31肽皮下免疫，诱导针对TCR TRBV3的抗体产生，所述TRBV31肽代表CDR2结构域的一部分并与载体蛋白融合(图8A-D)。用ELISA测量针对TRBV31的特异性抗体的滴度。简言之，向96孔ELISA板中添加50μl TRBV31肽(5μg/ml，在pH 7.4的PBS中)并在4℃过夜温育。用PBS洗涤包被的板，之后用含1％明胶(Gibco Invitrogen，卡尔斯巴德，CA，USA)的PBS在室温下封闭1小时。接下来，洗涤板，之后用Tris缓冲盐水(TBS)/明胶0.1％稀释的小鼠血浆再温育2小时。洗涤之后，用酶缀合的抗小鼠抗体(BD Biosciences，Franklin Lakes， NJ，USA)检测总IgG和IgG同种型。洗涤该板并用TMB底物试剂(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)进行显色反应。用微量培养板阅读器(VersaMax，Molecular Devices(分子装置)，Sunnyvale，CA，USA)测量吸光度。图8A显示了ELISA测定的TRBV31肽的IgG抗体滴度。这个数据证明免疫诱导出针对衍生自TRBV31的肽的高滴度抗体。 
来自免疫小鼠的亲和纯化的循环IgG抗体将LDL反应性TRBV31+杂交瘤(48-5克隆)染色(图8B)，表明这些IgG抗体与这种细胞的TCR结合。使用蛋白-G柱(GE healthcare，Uppsala，Sweden)亲和性纯化来自KLH或TRBV31免疫的小鼠的总IgG血浆抗体。将1 x 104个杂交瘤细胞(克隆48-5)在4 x 104个照射的APCs存在下与40μ/ml ApoB 100一起培养。对于阻断杂交瘤活化，在开始培养时添加不同的抗体(KLH IgG或TRBV31IgG)并始终存在，所述抗体的浓度为0.1、1、10和100μg/ml，如图8C所示。培养24小时后，测定上清液中的IL-2。在图8C中，能够看出来自TRBV31肽免疫的小鼠的IgG抑制T细胞杂交瘤(克隆48-5)响应于ApoB100的活化。因此，免疫引起防止抗原识别TCR TRBV31的抗体产生。杂交瘤克隆48-5已经根据布达佩斯条约于2009年1月22日保藏在DSMZ-德国微生物菌种保藏中心，Inhofftenstrasse 7B，38124不伦瑞克，德国，保藏号DSM ACC2986。 
最后，以用HuB100tg x Ldlr-/-小鼠的实验检验TRBV31+T细胞在动脉粥样硬化中的作用。用与KLH载体蛋白缀合的TRBV31-肽，和随后单次加强注射来免疫这些动物，在这些动物免疫后10周分析动脉粥样硬化病变。用KLH免疫的小鼠仅用作对照。 
杀死后，通过心脏穿刺术收集小鼠的血液。这之后用无菌无RNase的PBS进行血管灌注。解剖胸主动脉和心脏并保存用于病变分析。保存三分之二的脾脏用于细胞实验，三分之一快速冰冻用于随后的RNA分离。快速冰冻来自腹股沟区以及腹主动脉的引流淋巴结并保存用于RNA分离。如前(Nicoletti，A.，Kaveri，S.，Caligiuri，G.，Bariety，J.，和Hansson，G.K.(1998).Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice(在apo E敲除小鼠中用免疫球蛋白治疗减少动脉粥样硬化).J Clin Invest 102，910-918)所述进行病变分析。简言之，从主动脉根近端1mm， 对心脏进行连续恒冷切片。使用Image J软件(NIH，Bethesda，MD，USA)对苏木精/油红O染色切片进行病变大小评估。在图9A中，测定越过主动脉根1mm那段后每100I-lm收集的8个切片后，确定平均病变大小。图9B显示了每个切片捕获的图像，并测定了病变和整个血管的表面积。病变区域分数(％)是病变所占横截面积和总血管横截面积之间的比率。 
可以看出与KLH载体蛋白单独免疫的对照小鼠相比，用TRBV31-肽免疫导致主动脉根病变大小急剧和十分显著地降低70％(P＜0.01)。 
这个作用与抗TRBV31抗体的诱导并行，但是不影响针对oxLDL的抗体滴度、血浆胆固醇或甘油三酯水平(图10和11)。 
用酶比色特异性试剂盒(Randox Lab.Ltd.Crumin，UK)根据生产商规程评估血浆胆固醇和甘油三酯。 
用实时PCR对两个免疫组的主动脉的TCR TRBV31mRNA进行定量，如下：如前(参见上面)提及进行RNA分离和cDNA合成。用CD3的按需测定(assay on demand)引物和探针和次黄嘌呤胍核糖核酸转移酶(HPRT)(Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA，USA)在ABI 7700序列检测仪(Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA，USA)上进行实时PCR。对于TRBV31表达分析，基因分型引物与根据TCR13链恒定区核苷酸序列设计的探针(5′-TCCACCCAAGGTCT-3′SEQID NO：54)组合使用。使用ABI引物表达软件(Primer Express software)(Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA，USA)设计该探针并合成它，在其5′末端连接有6-羧基-荧光素(FAM)报道分子(Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA，USA)。根据公式2ΔΔCT的相对表达方法分析数据，其中ΔΔCT＝ΔCT(样品)-ΔCT(校准＝每组内所有样品的CT平均值)，并且ΔCT是靶基因的CT减去看家基因(HPRT)的CT(Giulietti等，2001)。 
TCR TRBV31mRNA存在于免疫的小鼠以及对照小鼠的主动脉中(图10D)，证实这个T细胞群没有被清除，而是阻止识别它们的同源抗原。总之，消除TCR TRBV31识别天然ApoB100蛋白抑制动脉粥样硬化。 
显然oxLDL颗粒引发强大的免疫反应(例如，见Palinski，W.，Yla-Herttuala，S.，Rosenfeld，M.E，Butler，S.W.，Socher，S.A.，Parthasarathy， S.，Curtiss，L.K.，和Witztum，J.L.(1990).Antisera and monoclonal antibodies specific for epitopes generated during oxidative modification of low density lipoprotein(在低密度脂蛋白的氧化修饰过程中产生的特异于表位的抗血清和单克隆抗体).Arteriosclerosis(动脉粥样硬化)10，325-335和Zhou X等，Arterioscler Thromb Vasc Biol 21：108-114，2001)。由于T细胞依赖性抗体形成为ApoB100上醛类加合物，并且APC-T细胞培养物暴露于oxLDL可以引起CD4+T细胞活化，因此推定T细胞识别由天然载脂蛋白氧化诱导的ApoB100上的表位。相反地，本发明表明oxLDL免疫小鼠的T细胞优先识别天然LDL上的基序。这些表位是天然ApoB 100蛋白的成分，并且氧化修饰LDL颗粒消除而不是增加它们的免疫反应性。 
本研究鉴定的对LDL的细胞免疫反应由CD4+T细胞建立，显示出II类MHC限制性。这一点和纯化ApoB100蛋白激发与完整LDL颗粒等同的反应的事实强烈提示ApoB 100在抗原呈递细胞中的胞内加工产生寡肽表位，所述表位作为肽-MHC复合体被T细胞识别。I-Ab被T细胞反应所需且不能由另一种MHC II类分子I-Ad代替的事实进一步支持与MHC结合的特异性寡肽组成可以与克隆型TCR相互作用的配体的观念。 
由于APC具有这样高的呈递ApoB 100表位的容量，因此对LDL的自身免疫反应风险显著。这种类型的全身性反应显然可能有害，这是因为LDL普遍存在于循环系统和所有的器官中。以前设想胸腺在生命早期去除了所有的ApoB100反应性T细胞克隆，即中枢性耐受避免了自身免疫性。当前的数据排除了这个可能性。清楚地证明了在huApoB100tg x Ldlr-/-鼠中存在LDL反应性T细胞。与这个发现一致，已提示免疫系统可能根本不对很多外周抗原耐受，健康个体中自身反应性T细胞本身的存在可能并不形成自身免疫危险。因此，ApoB100反应性T淋巴细胞很可能是外周细胞所有组成部分的一部分。 
如果在生命早期自身反应性未被中枢性耐受完全消除，那么自身免疫反应必需由外周耐受机制来避免。它们依赖于自身反应性的主动抑制，例如被分泌免疫调节的细胞因子的细胞抑制，如M2巨噬细胞和调节性T细胞。此外，已报道肝脏中合成的蛋白优先诱导致耐受性的免疫。既然ApoB100在肝脏中产生，那么在正常环境下可以避免自身免疫攻击。然而， 在有利于Th1效应细胞活化的条件下在动脉壁中蓄积可以引起耐受性丧失和诱导对ApoB 100成分的免疫反应。 
当前数据强调携带TCR TRBV31和识别LDL的天然ApoB 100蛋白的CD4+T细胞作为疾病进程致动脉粥样硬化的贡献者。然而，它们不排除其它抗原和免疫细胞的参与。因此，不能排除某些类型的LDL修饰诱导对该颗粒的自身免疫反应。该颗粒中体内诱导的氧化改变可能不同于金属离子例如铜诱导的那些。此外，杂交瘤策略提供了细胞的小子集的详细信息和在分析的杂交瘤所有组成部分中可能不表现出某些反应性。最后，本策略集中于专门的APC通过内吞、II类MHC限制性的途径呈递给CD4+T细胞的抗原。对LDL免疫反应性的另外的重要贡献可能在于识别脂质抗原的NKT细胞，所述脂质抗原通过识别I类MHC限制性抗原的CD1、CD8+T细胞和B细胞来呈递。 
易于动脉粥样硬化的huApoB100tg x Ldlr-/-小鼠的针对TCR TRBV31的免疫为对动脉粥样硬化免疫病理学提供了重要见解。从超免疫血清分离的抗体阻断了T细胞响应于ApoB100的活化，并且用流式细胞术消除TCRTRBV31+细胞减弱了针对脾细胞培养物中ApoB100的T细胞反应。然而，本免疫策略诱导的抗体阻断TCR TRBV31+细胞识别抗原，而不是从主动脉清除它们。 
huApoB100tg x Ldlr-/-小鼠中诱导阻断抗TRBV31抗体伴有动脉粥样硬化减少70％。减少的大小甚至比用LDL制剂以类似方式免疫所达到的(Urban，R.G.，Chicz，R.M.，和Strominger，J.L.(1994)Selective release of some invariant chain-derived peptides from HLA-DR 1 molecules at endosomal pH(在内体pH，一些不变的链衍生的肽从HLA-DR 1分子的选择性释放).J Exp Med 180，751-755；Freigang，S.，Horkko，S.，Miller，E.，Witztum，J.L.，和Palinski，W.(1998)Immunization of LDL receptor-deficient mice with homologous malondialdehyde-modified and native LDL reduces progression of atherosclerosis by mechanisms other than induction of high titers of antibodies to oxidative neoepitopes(通过除了诱导针对氧化新抗原的高滴度的抗体之外的机制，用同源丙二醛修饰和天然LDL免疫的LDL受体-缺陷型小鼠减少动脉粥样硬化的进展).Arterioscler  Thromb Vasc Biol 18，1972-1982))更好，因此强烈提示识别ApoB 100表位的T细胞子集在动脉粥样硬化的发展中起着重要作用。由于免疫后TCRTRBV31不从主动脉消失，因此阻断它们识别MHC抗原复合体可能足以抑制疾病进程。 
huApoB100tg x Ldlr-/-模型的使用允许使用充分定义的人LDL制剂剖析动脉粥样硬化中的细胞自身免疫反应。 
根据上述T细胞识别oxLDL的实施例，创建了用oxLDL免疫的小鼠的T细胞杂交瘤，该小鼠携带人类ApoB100作为转基因(huB100tg)。这些小鼠产生高水平的ApoB100并且预期也对天然人LDL有耐受性。 
因此上述实施例中举例说明的实验表明令人惊奇地，在携带来自用oxLDL免疫和携带人类ApoB100作为转基因(huB100t9)的小鼠的T细胞杂交瘤的小鼠中，记录针对天然LDL和纯化ApoB100的T细胞反应，而LDL的氧化减弱这些反应。反应性T细胞是II类MHC限制性CD4+细胞并表达含有TRBV31型可变13结构域的T细胞受体(TCR)。消除TRBV31+T细胞减弱对ApoB100的细胞免疫反应，并且针对衍生自TCRTRBV31的肽免疫高胆固醇血症小鼠抑制动脉粥样硬化的发展。 
这些结果强烈提示识别来自天然LDL的蛋白表位的自身免疫T细胞促进动脉粥样硬化。 
总之，在各个实施方案中，通过用oxLDL免疫小鼠研究了针对修饰的LDL的T细胞反应。从这种小鼠建立了T细胞杂交瘤并分析它们对氧化和天然形式的LDL的反应性。反应性克隆中无一对氧化的LDL反应，而是仅对天然LDL和纯化的载脂蛋白B-100反应。反应性杂交瘤是CD3+4+8-，被II类MHC抗原I-Ab限制，并表达一个单T细胞受体可变(V)β链(TRBV31)连同不同的Vα链。huApoB100tg x Ldlr-/-小鼠的针对TRBV31免疫减少动脉粥样硬化，与阻断T细胞识别ApoB100的抗TRBV3抗体的发展相似。 
提供上面阐明的实施例，给那些本领域技术人员如何制备和使用本公开物的组合物、肽、蛋白、方法和系统的实施方案提供完整的公开和说明，并且没有意图限制本发明人认为的其公开物的范围。意欲将对于本领域技术人员来说显而易见的对以上描述的实施本公开物的方式的改进，包含在 下列权利要求的范围内。说明书中提到的所有专利和出版物表示该公开物所属领域技术人员的技术水平。本公开物中引用的全部参考文献引入作为参考，其程度如同每篇参考文献以逐一全部引入作为参考的程度。 
因此，在背景技术、概述、详细说明和实施例中引用的每篇文件(包括专利、专利申请、期刊论文、摘要、实验手册、书或其它公开物)的全部公开内容引入本文作为参考。 
应该理解该公开物不限于特定的组合物或生物系统，其当然可以变化。也应该理解本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而不意欲限制。本说明书和附加权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数对象，除非内容另外清楚规定。术语“多个”包括两个或更多对象，除非内容另外清楚规定。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开物所属领域普通技术人员通常理解的具有相同意思。 
尽管在检验本公开物的产品、方法和系统的实践中，可以使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但是本文描述示例性的合适材料和方法作为实例和为了指导的目的。 
已经描述了本公开物的很多实施方案。然而，很清楚可以进行各种改进而不背离本公开物的精神和范围。因此，其它实施方案在下列权利要求范围之内。 

Claims (36)

1.一种治疗和/或预防个体中动脉粥样硬化的方法，所述方法包括：
施用治疗有效量的抑制个体中针对ApoB100的CD4+T细胞反应的化合物。
2.权利要求1的方法，其中抑制针对ApoB100的CD4+T细胞反应的化合物是被鉴定具有阻止杂交瘤克隆48-5暴露于apoB100或其片段时活化的能力的化合物，其中所述杂交瘤克隆48-5是已根据布达佩斯条约于2009年1月22日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心，Inhofftenstrasse7B，38124不伦瑞克，德国，保藏号为DSM ACC2986的杂交瘤克隆。
3.权利要求1或2的方法，其中所述CD4+T细胞是存在T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)的CD4+T细胞。
4.权利要求1或2的方法，其中所述CD4+T细胞是存在这样的T细胞受体的CD4+T细胞，所述T细胞受体具有与TRBV31高度同源的β链可变区区段的DNA序列。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述CD4+T细胞是T辅助细胞。
6.一种治疗和/或预防个体中动脉粥样硬化的方法，所述方法包括：
施用治疗有效量的抑制个体中T细胞受体β链可变区31的化合物。
7.权利要求5的方法，其中所述抑制是通过抑制所述T细胞受体β链可变区31与ApoB100或其片段结合而进行的。
8.一种治疗和/或预防个体中动脉粥样硬化的方法，所述方法包括：
施用治疗有效量的抑制个体中T细胞受体的化合物，所述T细胞受体具有与TRBV31的序列高度同源的DNA序列。
9.权利要求8的方法，其中所述抑制是通过抑制T细胞受体与ApoB100或其片段结合而进行的，所述T细胞受体具有与TRBV31的序列高度同源的DNA序列。
10.一种治疗和/或预防个体中动脉粥样硬化的方法，所述方法包括：
针对T细胞受体β链可变区31免疫所述个体。
11.权利要求10的方法，其中所述免疫是通过施用TCR TVRB31的CDR2可变区的免疫原性片段而进行的。
12.权利要求10或11的方法，其中所述免疫是通过施用具有SEQ IDNO：1的序列的肽或其免疫原性片段而进行的。
13.一种治疗和/或预防个体中动脉粥样硬化的方法，所述方法包括：
针对T细胞受体β链可变区30免疫所述个体。
14.权利要求13的方法，其中所述免疫是通过施用TCR TVRB30的CDR2可变区的免疫原性片段而进行的。
15.一种药物组合物，其包含能够抑制针对ApoB100的CD4+T细胞反应的试剂，以及药用佐剂和/或赋形剂。
16.一种治疗和/或预防动脉粥样硬化的疫苗，所述疫苗包含T细胞受体β链可变区31的免疫原性试剂。
17.权利要求16的疫苗，其中所述试剂是TCR TRVB31或其片段。
18.权利要求17的疫苗，其中所述试剂是具有SEQ ID NO：1的序列的肽或其片段。
19.权利要求16的疫苗，其中所述试剂是与T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)或其片段具有反应性的抗体。
20.T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)或其片段，其用作药物。
21.T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)或其片段，其用于治疗动脉粥样硬化。
22.与T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)或其片段具有反应性的抗体，其用作药物。
23.与T细胞受体β链可变区31(TCR TRBV31)或其片段具有反应性的抗体，其用于治疗动脉粥样硬化。
24.一种治疗和/或预防动脉粥样硬化的疫苗，所述疫苗包含T细胞受体β链可变区30的免疫原性试剂。
25.权利要求24的疫苗，其中所述试剂是TCR TRVB30或其片段。
26.权利要求24的疫苗，其中所述试剂是与所述T细胞受体β链可变区30(TCR TRBV30)或其片段具有反应性的抗体。
27.T细胞受体β链可变区30(TCR TRBV30)或其片段，其用作药物。
28.T细胞受体β链可变区30(TCR TRBV30)或其片段，其用于治疗动脉粥样硬化。
29.与T细胞受体β链可变区30(TCR TRBV30)或其片段具有反应性的抗体，其用作药物。
30.与T细胞受体β链可变区30(TCR TRBV30)或其片段具有反应性的抗体，其用于治疗动脉粥样硬化。
31.杂交瘤克隆48-5，其根据布达佩斯条约于2009年1月22日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心，Inhofftenstrasse 7B，38124不伦瑞克，德国，保藏号为DSM ACC2986。
32.一种治疗和/或预防个体中动脉粥样硬化的系统，所述系统包含：
一种或多种适于抑制所述个体的针对ApoB100的CD4+T细胞反应的试剂和一种或多种适于检测所述个体中反应降低的试剂。
33.一种治疗和/或预防个体中动脉粥样硬化的系统，所述系统包含：
一种或多种适于抑制所述个体的T细胞受体β链可变区31的试剂和一种或多种适于检测所述个体中这种抑制的试剂。
34.一种治疗和/或预防个体中动脉粥样硬化的系统，所述系统包含：
一种或多种适于针对所述个体的T细胞受体β链可变区31免疫所述个体的试剂和一种或多种适于检测所述个体中这种免疫的试剂。
35.一种治疗和/或预防个体中动脉粥样硬化的系统，所述系统包含：
一种或多种适于抑制所述个体的T细胞受体β链可变区30的试剂和一种或多种适于检测所述个体中这种抑制的试剂。
36.一种治疗和/或预防个体中动脉粥样硬化的系统，所述系统包含：
一种或多种适于针对所述个体的T细胞受体β链可变区30免疫所述个体的试剂和一种或多种适于检测所述个体中这种免疫的试剂。
CN2010800207609A 2009-03-17 2010-03-17 治疗和/或预防动脉粥样硬化的免疫调节方法和系统，以及相关蛋白、肽和组合物 Pending CN102439035A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE0950161 2009-03-17
SE0950161-0 2009-03-17
PCT/SE2010/050299 WO2010107380A1 (en) 2009-03-17 2010-03-17 Immunomodulatory methods and systems for treatment and/or prevention of atherosclerosis and related proteins, peptides and compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102439035A true CN102439035A (zh) 2012-05-02

Family

ID=42739859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800207609A Pending CN102439035A (zh) 2009-03-17 2010-03-17 治疗和/或预防动脉粥样硬化的免疫调节方法和系统，以及相关蛋白、肽和组合物

Country Status (4)

Country Link
US (2) US8609605B2 (zh)
EP (1) EP2408812B1 (zh)
CN (1) CN102439035A (zh)
WO (1) WO2010107380A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2408812B1 (en) 2009-03-17 2015-12-16 CardioVax, LLC Immunomodulatory methods and systems for treatment and/or prevention of atherosclerosis and related proteins, peptides and compositions
JP2013510586A (ja) * 2009-11-14 2013-03-28 チュウ、カン−ユウ アテローム性動脈硬化を治療及び／又は予防するための免疫調節方法及びシステム
EP2618836A1 (en) * 2010-09-22 2013-07-31 Hansson, Göran K. Immunomodulatory methods and systems for treatment and/or prevention of atherosclerosis and related proteins, peptides and compositions
US20130273089A1 (en) 2011-11-03 2013-10-17 Tolera Therapeutics, Inc. Antibody and methods for selective inhibition of t-cell responses
WO2013067517A2 (en) 2011-11-03 2013-05-10 Tolera Therapeutics.Inc Antibody and methods for selective inhibition of t-cell responses
WO2018011573A1 (en) * 2016-07-12 2018-01-18 Kymab Limited Animals, cells, ligands, polypeptides & methods

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2143186A1 (en) * 1992-08-31 1994-03-17 Charles W. Rittershaus Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t cell antigen receptor
US20020150891A1 (en) * 1994-09-19 2002-10-17 Leroy E. Hood Diagnostic and therapeutic compositions and methods which utilize the t cell receptor beta gene region
WO2005062959A2 (en) * 2003-12-22 2005-07-14 The University Of Tennessee Research Foundation Isolated t lymphocyte receptors specific for human autoantigens complexed with human mhc molecules and methods of making and using same
US20050152900A1 (en) * 2002-06-19 2005-07-14 Genfit Compositions and methods for apo-b48 and apo-b100 assay
US20050260222A1 (en) * 2003-12-24 2005-11-24 Goutam Gupta Structure-based receptor MIMICS targeted against bacterial superantigen toxins

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223426A (en) 1988-12-15 1993-06-29 T Cell Sciences, Inc. Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t-cell antigen receptor
US6652860B1 (en) 1997-12-12 2003-11-25 University Of Western Ontario Peptide, apoEp 1.B, compositions and uses thereof
AU782676B2 (en) 1999-09-30 2005-08-18 Corixa Corporation Immunologically significant herpes simplex virus antigens
SE0000855D0 (sv) 2000-03-15 2000-03-15 Karolinska Innovations Ab Antigenic composition useful as a vaccine against atherosclerosis
US6835383B2 (en) 2000-03-23 2004-12-28 City Of Hope Protein kinase deficient, immunologically active CMVpp65 mutants
CA2408935A1 (en) * 2000-05-12 2001-11-15 Halina Offner Method of treating immune pathologies with low dose estrogen
US20030165819A1 (en) 2000-06-29 2003-09-04 Corixa Corporation Compositions and methods for the diagnosis and treatment of herpes simplex virus infection
SE0302312D0 (sv) * 2002-10-04 2003-08-27 Forskarpatent I Syd Ab Peptide-based passive immunization therapy for treatment of atherosclerosis
WO2007116409A2 (en) 2006-04-11 2007-10-18 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Improved vaccines comprising multimeric hsp60 peptide carriers
WO2008055354A1 (en) 2006-11-10 2008-05-15 Université de Montréal Rna-loaded dendritic cell compositions for eliciting cd4+ t cell help and related methods
US7928190B2 (en) 2007-07-05 2011-04-19 Darnell Robert B Methods and compositions for tumor vaccination and therapy
EP2408812B1 (en) 2009-03-17 2015-12-16 CardioVax, LLC Immunomodulatory methods and systems for treatment and/or prevention of atherosclerosis and related proteins, peptides and compositions
EP2618836A1 (en) 2010-09-22 2013-07-31 Hansson, Göran K. Immunomodulatory methods and systems for treatment and/or prevention of atherosclerosis and related proteins, peptides and compositions

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2143186A1 (en) * 1992-08-31 1994-03-17 Charles W. Rittershaus Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t cell antigen receptor
US20020150891A1 (en) * 1994-09-19 2002-10-17 Leroy E. Hood Diagnostic and therapeutic compositions and methods which utilize the t cell receptor beta gene region
US20050152900A1 (en) * 2002-06-19 2005-07-14 Genfit Compositions and methods for apo-b48 and apo-b100 assay
WO2005062959A2 (en) * 2003-12-22 2005-07-14 The University Of Tennessee Research Foundation Isolated t lymphocyte receptors specific for human autoantigens complexed with human mhc molecules and methods of making and using same
WO2005062959A3 (en) * 2003-12-22 2007-02-01 Univ Tennessee Res Foundation Isolated t lymphocyte receptors specific for human autoantigens complexed with human mhc molecules and methods of making and using same
US20050260222A1 (en) * 2003-12-24 2005-11-24 Goutam Gupta Structure-based receptor MIMICS targeted against bacterial superantigen toxins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
任丽丽, 等: "动脉粥样硬化疫苗的研究进展", 《中国生物制品学杂志》, vol. 18, no. 2, 25 March 2005 (2005-03-25) *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010107380A1 (en) 2010-09-23
EP2408812B1 (en) 2015-12-16
US20120148605A1 (en) 2012-06-14
EP2408812A4 (en) 2013-03-27
US20130189292A1 (en) 2013-07-25
EP2408812A1 (en) 2012-01-25
US8609605B2 (en) 2013-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Webb et al. Cellular and molecular mechanisms of autoimmune hepatitis
Degroot et al. The causes of autoimmune thyroid disease
JP4052524B2 (ja) Ｔ細胞における抗原特異性アポトーシスの誘導のためのリガンド
CN1127351C (zh) 诱导抗原特异性ｔ细胞耐受的方法
Horst et al. Antigen presentation, autoantibody production, and therapeutic targets in autoimmune liver disease
US7887798B2 (en) Methods of treating cancer by administering antibodies to CD200
CN102439035A (zh) 治疗和/或预防动脉粥样硬化的免疫调节方法和系统，以及相关蛋白、肽和组合物
JPH0272197A (ja) 自己免疫疾患の処置としての抗―ｔ細胞レセプター決定基
US8673300B2 (en) Therapeutic compositions and methods for the prevention of autoimmune diseases
Pomié et al. Murine CD8+ regulatory T lymphocytes: the new era
Fuchs et al. Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG): from immunochemical characterization to therapeutic approaches
Drutskaya et al. Experimental models of arthritis in which pathogenesis is dependent on TNF expression
CA2110055C (en) T cell receptor peptides as therapeutics for immune-related disease
JPH07506563A (ja) 特異的ｔ細胞群による病原応答に起因する疾患に対してのワクチン接種および方法
Popov et al. Breakdown of CTL tolerance to self HLA-B* 2705 induced by exposure to Chlamydia trachomatis
JP2013540753A (ja) アテローム性動脈硬化の治療及び／又は予防のための免疫調節方法及びシステム、並びに関連するタンパク質、ペプチド及び組成物
WO2008118792A2 (en) Gamma delta t cells and methods of treatment of interleukin-17 related conditions
CN102388063B (zh) 5c8Mab和调节性CD8+T细胞直接诱导在建立持久和特异性移植耐受中的用途
Shoenfeld The kaleidoscope of autoimmunity
JPH06298662A (ja) 自己免疫疾患の予防治療剤
Steinman et al. Therapy of Autoimmune Diseases with Antibody to Immune Response Gene Products or to T‐Cell Surface Markers a
Chiang et al. A novel peptide mimotope identified as a potential immunosuppressive vaccine for organ transplantation
JP2008524116A (ja) 移植片拒絶反応の抑制のための方法及び物質
WO2009111889A1 (en) Lymphocyte control of obesity and insulin resistance
Sheikh et al. Immunogenetic surveillance to histocompatibility

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: CARDIO WAX CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: FORSKARPATENT I SYD AB

Effective date: 20120327

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20120327

Address after: American Torrance

Applicant after: Cadio Vaks LLC

Address before: Longde, Sweden

Applicant before: Forskarpatent I. Syd AB

C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120502