CN110430886A - 使用自体t细胞治疗多发性硬化的方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供用于在受试者中治疗多发性硬化或者选择用于过继性免疫疗法的受试者的包括自体细胞毒性T细胞的方法，所述自体细胞毒性T细胞表达与EB病毒(EBV)特异性结合的T细胞受体或者表达CD107a、TNF、IFN‑γ或IL‑2。
Description
相关申请
本申请要求于2017年1月20日提交的美国临时专利申请序列号62/448707和于2017年10月24日提交的美国临时专利申请序列号62/576349的优先权的权益，其中的每个通过引用被整体并入本文。
背景
自身免疫疾病(如多发性硬化(MS))是由针对身体自身组织的异常免疫应答引起的病理。MS的特征在于由身体自身的免疫细胞降解髓鞘(一种围绕神经纤维的保护性脂质壳)。
EB病毒(EBV)(也称为人疱疹病毒4)是一种普遍存在的疱疹病毒。最近，已经表明，暴露于EBV可以在自身免疫疾病(包含MS)的发病机理中易感染或以另外的方式发挥作用。例如，最近的研究已经表明，相比于健康个体，被诊断患有MS的个体在神经组织中聚集的B细胞中显示出更高水平的EBV相关蛋白。据推测，EBV感染的B细胞的增加和/或这样的细胞的有缺陷的消除可能使个体易患多发性硬化。
概述
本文提供用于治疗MS(例如，复发缓解型MS、继发进展型MS、原发进展型MS、或进展复发型MS)的方法，所述方法包括向受试者施用表达T细胞受体的自体T细胞(例如，细胞毒性T细胞或CTL)，所述T细胞受体与MHC(例如，I类MHC)上呈递的EBV肽特异性结合。在一些实施方案中，MS是原发进展型MS。在一些实施方案中，方法包括通过向受试者施用表达与I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合的T细胞受体的自体T细胞(例如，CTL)来在受试者中改善或稳定MS的症状的操作。本文还提供通过向受试者施用表达与I类MHC分子上呈递的EBV肽特异性结合的T细胞受体的自体T细胞(例如，CTL)来降低患有MS的受试者的CSF中抗EBV IgG水平的方法。
在一些实施方案中，至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、或至少20％的CTL表达CD107a、IFNγ、TNF或IL-2。在一些实施方案中，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％的CTL表达CD107a、IFNγ、TNF和IL-2。至少5％、至少7％、至少8％、至少10％、至少15％、至少20％、或至少30％的CTL具有EBV反应性。
在一些实施方案中，EBV肽包括LMP1肽或LMP1肽的片段、LMP2A肽或LMP2A肽的片段、和/或EBNA1肽或EBNA1肽的片段。在一些实施方案中，EBV肽包括表1中列出的序列。在某些方面，本文提供治疗多发性硬化(例如，复发缓解型MS、继发进展型MS、原发进展型MS、或进展复发型MS)的方法，所述方法包括从受试者分离包括T细胞(例如，CTL)的样品、生成表达与MHC(例如，I类MHC)上呈递的EBV肽特异性结合的T细胞受体的T细胞、以及然后向受试者施用T细胞。在一些实施方案中，通过将包括自体T细胞的样品(例如，PBMC样品)与在MHC(例如，I类MHC)上呈递EBV肽的抗原呈递细胞(APC)孵育，从而诱导样品中肽特异性T细胞(例如，肽特异性自体CTL)的增殖，来生成T细胞。在一些实施方案中，通过将APC与编码EBV肽的核酸构建体(例如，AdE1-LMPpoly)孵育，从而诱导APC呈递EBV肽，来使APC呈递EBV肽。在一些实施方案中，APC可以是B细胞、抗原呈递T细胞、树突状细胞、或人工抗原呈递细胞(例如，表达CD80、CD83、41BB-L和/或CD86的细胞系(如aK562细胞))。在一些实施方案中，方法还包括分析增殖的肽特异性自体CTL的CD107a、IFNγ、TNF或IL-2的表达，如果至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、或至少20％的增殖的肽特异性自体CTL表达CD107a、IFNγ、TNF或IL-2，则向受试者施用肽特异性自体CTL。在一些实施方案中，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％的肽特异性自体CTL表达CD107a、IFNγ、TNF和IL-2。肽特异性自体CTL可以具有至少5％、至少7％、至少8％、至少10％、至少15％、至少20％、或至少30％的具有EBV反应性的肽特异性自体CTL。
在一些实施方案中，EBV肽包括LMP1肽或LMP1肽的片段、LMP2A肽或LMP2A肽的片段、和/或EBNA1肽或EBNA1肽的片段。在一些实施方案中，EBV肽包括表1中列出的序列。在一些实施方案中，MS是原发进展型MS。
在一些实施方案中，向受试者施用5×106、1×107、1.5×107或2×107个细胞(例如，CTL)。在一些实施方案中，在治疗的过程中，施用初始剂量的T细胞(例如，自体CTL)，并且随后例如以渐增的剂量施用一个或更多个附加剂量的T细胞(例如，自体CTL)。在一些实施方案中，施用两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个剂量。T细胞(例如，自体CTL)的量可以从初始剂量到附加剂量变化。例如，可以初始施用较低剂量，随后施用较高剂量。在一些实施方案中，向受试者施用至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个剂量。可以每周一次或每两周一次施用剂量。在一些实施方案中，受试者不会由于T细胞(例如，自体CTL)施用而经历任何不良反应。在一些实施方案中，方法包括施用四个剂量的依次更高数量的CTL。在一些实施方案中，方法包括施用第一剂量的5×106个CTL、第二剂量的1×107个CTL、第三剂量的1.5×107个CTL、以及第四剂量的2×107个CTL。
在一些方面，方法还包括通过从受试者获得脑脊液(CSF)的第一样品、优选地在CTL施用之前分析第一样品中CSF中抗EBV IgG的量、以及优选地在CTL施用之后的一段时间后从受试者获得CSF的第二样品、分析第二样品中CSF中抗EBV IgG的相对量，如果第二样品中抗EBV IgG的量小于第一样品，则疾病已经稳定和/或未进展，来评估过继性免疫疗法在患有多发性硬化的受试者中的功效。一段时间可以是一周、两周、三周、四周、五周、六周、三个月、六个月、或一年。
在一些实施方案中，给予受试者诊断测试(如EDSS测试)。在一些实施方案中，在T细胞施用之前和在T细胞施用之后给予受试者EDSS评分。在T细胞施用之后，EDSS评分可以保持不变，或者EDSS评分可以减小(例如，减小至少0.5或至少1.0)。
在一些方面，本文提供通过从受试者获得包括T细胞(例如，CTL)的样品、分离自体T细胞、测定样品中自体T细胞的EBV反应性，如果至少阈值百分比(例如，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)的自体T细胞是EBV反应性的，则选择受试者用于过继性免疫疗法，来选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法。
在一些方面，本文提供通过从受试者获得包括T细胞(例如，CTL)的样品，分离自体T细胞，测定自体T细胞的CD107a、IFNγ、TNF和/或IL-2的表达，如果至少阈值百分比(例如，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)的自体T细胞表达CD107、IFNγ、TNF和/或IL-2，则选择受试者用于过继性免疫疗法，来选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法。在一些实施方案中，受试者患有MS(例如，复发缓解型MS、继发进展型MS、原发进展型MS、或进展复发型MS)。
附图的简要说明
图1具有两幅图片(A-B)，并且示出4年前第一疗程之后和当前试验中今年再治疗之后在原始患者中自体EBV特异性T细胞疗法之前和自体EBV特异性T细胞疗法之后的CSF。(A)CSF IgG指数，其中水平虚线表示正常范围的上限。(B)通过Reiber和Felgenhauer的公式(参考文献16)：IgG(loc)(mg/L)＝{(CSF IgG÷血清IgG)-[0.8×(√((CSF白蛋白÷血清白蛋白)2+15))]+1.8}×血清IgG来计算鞘内IgG产生(IgG(loc))。垂直线表示5×106、1×107、1.5×107和2×107个细胞的连续T细胞输注。
图2具有两个部分(A-B)，并且示出T细胞产物的EBV特异性CD8+T细胞反应性与T细胞疗法的临床反应之间的相关性。
图3在脑的MRI上示出疾病活动性。
详细说明
综述
本文提供使用识别一个或更多个EBV表位(例如，本文公开的EBV表位)的自体T细胞(例如，CTL)来在受试者中治疗多发性硬化(例如，复发缓解型MS、继发进展型MS、原发进展型MS、或进展复发型MS)的方法。在一些实施方案中，方法还包括从受试者分离包括T细胞的样品、将T细胞与呈递EBV肽(例如，本文公开的EBV肽)的APC孵育，从而生成识别MHC上呈递的EBV肽的T细胞。本文还提供通过在T细胞施用之前和在T细胞施用之后从受试者获得脑脊液(CSF)样品、并且分析CSF中抗EBV IgG的相对量来评估过继性免疫疗法在患有多发性硬化的受试者中的功效的方法。
定义
为了方便起见，此处收集了说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。
本文中使用冠词“一(a)”和“一(an)”指所述冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一要素”意指一个要素或多于一个要素。
如本文所使用的，术语“施用”意指向受试者提供药剂或药物组合物，并且包含(但不限于)由医疗技术人员施用和自我施用。这样的药剂可以含有例如本文所描述的肽、本文提供的抗原呈递细胞和/或本文提供的T细胞。
术语“氨基酸”旨在包括包含氨基官能性和酸官能性两者、并且能够被包含在天然存在的氨基酸的聚合物中的全部分子(无论是天然的还是合成的)。示例性氨基酸包含天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物和同源物；具有变体侧链的氨基酸类似物；以及前述中任何一种的全部立体异构体。
术语“结合”或“相互作用”指由于例如生理条件下的静电相互作用、疏水相互作用、离子相互作用和/或氢键相互作用而在两个分子之间(例如，TCR与肽/MHC之间)的缔合(其可以是稳定的缔合)。
术语“生物样品”、“组织样品”或简单地“样品”各自指从受试者的组织获得的细胞的集合。组织样品的来源可以是如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样品、活组织检查、或抽出物的实体组织；血液或任何血液成分、血清、血液；体液，如脑脊液、羊水、腹膜液或间质液、尿液、唾液、粪便、眼泪；或来自受试者的妊娠或发育的任何时间的细胞。
如本文所使用的，术语“细胞因子”指影响细胞功能，并且是调控免疫应答、炎症应答或造血反应中细胞之间的相互作用的分子的任何分泌的多肽。细胞因子包含(但不限于)单核因子和淋巴因子，无论哪种细胞产生其。例如，单核因子通常被称为由单核细胞(如巨噬细胞和/或单核细胞)产生和分泌。然而，许多其他细胞也产生单核因子，如天然杀伤细胞、成纤维细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、脑星形细胞、骨髓基质细胞、表皮角质形成细胞和B淋巴细胞。淋巴因子通常被称为由淋巴细胞产生。细胞因子的实例包含(但不限于)白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和肿瘤坏死因子β(TNFβ)。
术语“表位”意为能够与抗体或TCR特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成。某些表位可以由抗体能够结合的氨基酸的特定序列限定。
如本文所使用的，短语“药学上可接受的”指在合理的医学判断范围内适合于与人类和动物的组织接触，而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些药剂、化合物、材料、组合物和/或剂量。
如本文所使用的，短语“药学上可接受的载体”意为药学上可接受的材料、组合物或运载体(vehicle)(如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、或溶剂包封材料)，其涉及将药剂从器官、或身体的一部分携带或转运至另一器官、或身体的一部分。每种载体在与制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包含：(1)糖(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)；(2)淀粉(如玉米淀粉和马铃薯淀粉)；(3)纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素)；(4)粉状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂(如可可脂和栓剂蜡)；(9)油类(如花生油、棉籽油、红花子油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)；(10)二醇类(如丙二醇)；(11)多元醇(如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)；(12)酯类(如油酸乙酯和十二烷酸乙酯)；(13)琼脂；(14)缓冲剂(如氢氧化镁和氢氧化铝)；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及(22)药物制剂中采用的其他无毒相容物质。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换地被使用。它们指任何长度的核苷酸的聚合体形式，脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座(loci)(基因座(locus))、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、运载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物的组装之前或之后被赋予。多核苷酸可以被进一步修饰，如通过与标记组件偶联。在本文提供的全部核酸序列中，U核苷酸与T核苷酸是可互换的。
如本文所使用的，“预防”病况的治疗剂指化合物，当在紊乱或病况的发作之前被施用至统计样品时，相对于未经处理的对照样品，所述化合物降低经处理的样品中的紊乱或病况的发生，或相对于未经处理的对照样品，所述化合物延迟紊乱或病况的一种或更多种症状的发作或降低紊乱或病况的一种或更多种症状的严重性。
如本文所使用的，“特异性结合”指TCR与MHC(例如，I类MHC或II类MHC)上呈递的肽结合的能力。通常，TCR以至少约10-4M或更小的KD的亲和力与其肽/MHC特异性结合，并且以比其对于与非特异性和无关的肽/MHC复合物(例如，包括BSA肽或酪蛋白肽的肽/MHC复合物)结合的亲和力小至少10倍、小至少100倍、或小至少1000倍的亲和力(如由KD表示的)与预定抗原/结合配偶体结合。
如本文所使用的，术语“受试者”意为被选择用于治疗或疗法的人类或非人类动物。
如本文所使用的，短语“治疗有效量”和“有效量”意为以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比在受试者中的至少一个细胞亚群中对于产生期望的治疗效果有效的药剂的量。
如本文所使用的，在受试者中“治疗”疾病或“治疗”患有或被怀疑患有疾病的受试者指使受试者经受药物治疗(例如，施用本文所描述的CTL)，使得疾病的至少一种症状被减轻或防止恶化。
术语“运载体”指工具(means)，通过所述工具，核酸可以在生物体、细胞或细胞组分之间繁殖和/或转移。运载体包含质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转位子和人工染色体等，其可能或可能不能够自主复制或整合到宿主细胞的染色体中。
肽
在某些方面，本文提供使用表达TCR的自体T细胞(例如，CTL)治疗多发性硬化(例如，复发缓解型MS、继发进展型MS、原发进展型MS、或进展复发型MS)的方法，所述TCR与MHC(例如，I类MHC)上呈递的包括EBV表位的肽特异性结合。在一些实施方案中，本文提供例如通过将包括T细胞(即，自体T细胞)的样品与呈递本文所描述的EBV表位中的一种或更多种的抗原呈递细胞(APC)(例如，呈递I类MHC复合体上的包括EBV表位的本文所描述的肽的APC)孵育来生成这样的自体T细胞的方法。
在一些实施方案中，本文提供的肽包括任何EBV病毒蛋白的序列(例如，任何EBV蛋白的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个邻接的氨基酸的序列)。在一些实施方案中，本文提供的肽包括EBV病毒蛋白的不超过25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个邻接的氨基酸。
在一些实施方案中，本文提供的肽包括LMP1的序列(例如，LMP1的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个邻接的氨基酸的序列)。在一些实施方案中，本文提供的肽包括LMP1的不超过25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个连续氨基酸。下文提供示例性LMP1氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
在一些实施方案中，本文提供的肽包括LMP2A的序列(例如，LMP2A的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个邻接的氨基酸的序列)。在一些实施方案中，本文提供的肽包括LMP2A的不超过25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个邻接的氨基酸。下文提供示例性LMP2A氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
在一些实施方案中，本文提供的肽包括EBNA1的序列(例如，EBNA1的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个邻接的氨基酸的序列)。在一些实施方案中，本文提供的肽包括EBNA1的不超过25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个邻接的氨基酸。下文提供示例性EBNA1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
在一些实施方案中，肽包括表1中列出的表位的序列。
表1：示例性EBV病毒蛋白表位
| 表位序列 | HLA限制 | SEQ ID NO. |
| CLGGLLTMV | A*02 | 4 |
| FLYALALLL | A*02 | 5 |
| YLQQNWWTL | A*02,A*68,A*69 | 6 |
| YLLEMLWRL | A*02 | 7 |
| ALLVLYSFA | A*02 | 8 |
| LLSAWILTA | A*0203 | 9 |
| LTAGFLIFL | A*0206 | 10 |
| SSCSSCPLSKI | A*11 | 11 |
| PYLFWLAA | A*23,A*24,A*30 | 12 |
| TYGPVFMCL | A*24 | 13 |
| VMSNTLLSAW | A*25 | 14 |
| CPLSKILL | B*08 | 15 |
| RRRWRRLTV | B*27 | 16 |
| IEDPPFNSL | B*40 | 17 |
| IALYLQQNW | B*57,B*58 | 18 |
| MSNTLLSAW | B*58 | 19 |
| VLKDAIKDL | A*0203 | 20 |
| RPQKRPSCI | B*07 | 21 |
| IPQCRLTPL | B*07 | 22 |
| YNLRRGTAL | B*08 | 23 |
| HPVGEADYFEY | B*35 | 24 |
| LSRLPFGMA | B*57 | 25 |
| FVYGGSKTSL | Cw*03 | 26 |
在一些实施方案中，本文提供的肽包括EBV表位中的两个或更多个。在一些实施方案中，本文提供的肽包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个EBV表位。例如，在一些实施方案中，本文提供的肽包括通过连接体(例如，多肽连接体)连接的EBV表位中的两个或更多个。
在一些实施方案中，除一个或更多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)保守序列修饰之外，肽的序列包括EBV病毒蛋白序列。如本文所使用的，术语“保守序列修饰”旨在指不显著地影响或改变TCR与含有MHC上呈递的氨基酸序列的肽之间的相互作用的氨基酸修饰。这样的保守修饰包含氨基酸置换、添加(例如，向肽的N末端或C末端添加氨基酸)和缺失(例如，从肽的N末端或C末端缺失氨基酸)。保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包含具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支化侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本文所描述的肽的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本领域已知的方法测试改变的肽的TCR结合的保留。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入抗体。
在一些实施方案中，本文提供的肽包括与EBV病毒蛋白质序列(例如，EBV病毒蛋白的片段的序列)至少80％、85％、90％、95％或100％一致的序列。为了测定两个氨基酸序列的百分比一致性，序列被比对以用于最优比较目的(例如，可以在第一氨基酸序列和第二氨基酸序列中的一个或两个中引入空位以用于最优比对，并且可以忽略非一致序列以用于比较目的)。然后比较相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置处是一致的。考虑到空位的数量和每个空位的长度(其需要被引入以用于两个序列的最优比对)，两个序列之间的百分比一致性是序列共有的一致位置的数量的函数。
在一些实施方案中，肽是嵌合肽或融合肽。如本文所使用的，“嵌合肽”或“融合肽”包括具有连接至不同的肽(具有本文提供的序列的肽在自然界中不连接至所述不同的肽的序列)的本文提供的序列的肽。例如，不同的肽可以通过肽键直接地融合至本文提供的肽的N-末端或C-末端或通过化学连接体间接地融合至本文提供的肽的N-末端或C-末端。在一些实施方案中，本文提供的肽被连接至包括不同EBV表位的另一肽。在一些实施方案中，本文提供的肽被连接至包括来自其他病毒和/或感染性疾病的表位的肽。
可以通过标准重组DNA技术产生本文提供的嵌合肽或融合肽。例如，根据常规技术，例如，通过采用平端末端或交错端末端以用于连接、限制酶消化以提供适当的末端、酌情补平粘性端、碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接、以及酶促连接，将编码不同肽序列的DNA片段在框内连接在一起。在另一个实施方案中，可以通过常规技术(包含自动DNA合成仪)合成融合基因。可替代地，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续基因片段之间产生互补突出端，其随后可以退火并且再扩增以生成嵌合基因序列(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds.,JohnWiley&Sons:1992)。此外，许多表达运载体是商业可获得的，所述表达运载体已经编码融合部分。
本文提供的肽可以使用标准蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从细胞来源或组织来源分离，并且可以通过重组DNA技术产生，和/或可以使用标准肽合成技术以化学方法合成。可以通过编码本发明的一种或多种肽的核苷酸的表达，在原核宿主细胞或真核宿主细胞中产生本文所描述的肽。可替代地，可以通过化学方法合成这样的肽。用于在重组宿主中表达异源肽的方法、肽的化学合成的方法和体外翻译的方法是本领域公知的，并且被进一步在Maniatis et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(1989),2nd Ed.,Cold Spring Harbor,N.Y.；Berger and Kimmel,Methods in Enzymology,Volume 152,Guide to Molecular Cloning Techniques(1987),Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.；Merrifield,J.(1969)J.Am.Chem.Soc.91:501；Chaiken I.M.(1981)CRCCrit.Rev.Biochem.11:255；Kaiser et al.(1989)Science 243:187；Merrifield,B.(1986)Science 232:342；Kent,S.B.H.(1988)Annu.Rev.Biochem.57:957；以及Offord,R.E.(1980)Semisynthetic Proteins,Wiley Publishing中描述，其通过引用被并入本文。
在某些方面，本文提供编码本文所描述的肽的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是运载体。在一些实施方案中，核酸分子是病毒运载体(如基于腺病毒的表达运载体)，所述病毒运载体包括本文所描述的核酸分子。在一些实施方案中，本文提供的运载体编码本文提供的多个表位(例如，如多表位)。在一些实施方案中，本文提供的运载体编码本文提供的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个表位(例如，表1中提供的表位)。
在一些实施方案中，运载体是AdE1-LMPpoly。AdE1-LMPpoly运载体编码来自LMP1和LMP2的限定的CTL表位的多表位，所述LMP1和LMP2被融合至Gly-Ala重复缺失的EBNA1序列。AdE1-LMPpoly运载体描述于，例如，Smith et al.,Cancer Research 72:1116(2012)；Duraiswamy et al.,Cancer Research 64:1483-9(2004)；以及Smith et al.,J.Immunol117:4897-906中，其中的每个特此通过引用被并入。
如本文所使用的，术语“运载体”指能够转运已经与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的运载体是“质粒”，其指环状双链DNA环，附加的DNA区段可以连接至所述环状双链DNA环中。另一种类型的运载体是病毒运载体，其中附加的DNA区段可以连接至病毒基因组中。某些运载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌运载体、游离型哺乳动物运载体)。其他运载体(例如，非游离型哺乳动物运载体)在被引入宿主细胞时可以被整合到宿主细胞的基因组中，并且从而与宿主基因组一起被复制。此外，某些运载体能够指导基因的表达。这样的运载体在本文中被称为“重组表达运载体”(或简单地“表达运载体”)。在一些实施方案中，本文提供被可操作地连接至表达运载体中的一个或更多个调控序列(例如，启动子)的核酸。在一些实施方案中，细胞转录本文提供的核酸，并且从而表达本文所描述的肽。核酸分子可以被整合到细胞的基因组中，或其可以在染色体外。
在一些实施方案中，本文提供含有本文所描述的核酸(例如，编码本文所描述的肽的核酸)的细胞。细胞可以是，例如，原核的、真核的、哺乳动物的、禽的、鼠的和/或人的。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是APC(例如，抗原呈递T细胞、树突状细胞、B细胞或aK562细胞)。在本发明的方法中，本文所描述的核酸可以例如以核酸无需递送运载体(vehicle)被施用至细胞、与递送试剂组合被施用至细胞。在一些实施方案中，本领域已知的任何核酸递送方法可以被用于本文所描述的方法中。合适的递送试剂包含(但不限于)例如，Mirus Transit TKO亲脂性试剂；转化脂(lipofectin)；阳离子脂质体(lipofectamine)；细胞转染剂(cellfectin)；聚阳离子(例如，聚赖氨酸)、缺端胶原、纳米颗粒系统(nanoplexe)和脂质体。在本文所描述的方法的一些实施方案中，脂质体被用于将核酸递送至细胞或受试者。适合于在本文所描述的方法中使用的脂质体可以由标准囊泡形成脂类形成，所述标准囊泡形成脂类通常包含中性的或带负电的磷脂和甾醇(如胆甾醇)。通常由考虑因素(如期望的脂质体尺寸和脂质体在血流中的半衰期)来指导脂类的选择。已知用于制备脂质体的各种各样的方法，例如，如Szoka et al.(1980),Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467；和美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述的，其全部公开内容通过引用被并入本文。
自体T细胞
本文提供通过向受试者施用表达与MHC上呈递的EBV肽特异性结合的T细胞受体的自体T细胞(例如，CTL)来治疗多发性硬化(例如，复发缓解型MS、继发进展型MS、原发进展型MS或进展复发型MS)的方法。在一些实施方案中，MHC是I类MHC。在一些实施方案中，MHC是II类MHC。
在一些实施方案中，本文提供呈递本文中所描述的肽(例如，包括LMP1、LMP2A或EBNA1表位序列的肽)的APC。在一些实施方案中，APC是B细胞、抗原呈递T细胞、树突状细胞、或人工抗原呈递细胞(例如，aK562细胞)。
可以通过从患者样品中取出PBMC并且将其粘附至塑料来制备用于在过程中使用的树突状细胞。通常，单核细胞群体粘着，并且全部其他细胞可以被清洗掉。然后用IL-4和GM-CSF分化粘附的群体以产生单核细胞来源的树突状细胞。这些细胞可以通过添加IL-1β、IL-6、PGE-1和TNF-α(其上调树突状细胞的表面上的重要的共刺激分子)来成熟化，并且然后用本文提供的肽中的一种或更多种转导。
在一些实施方案中，APC是人工抗原呈递细胞(如aK562细胞)。在一些实施方案中，将人工抗原呈递细胞工程化以表达CD80、CD83、41BB-L和/或CD86。示例性人工抗原呈递细胞(包含aK562细胞)描述于美国专利公布号2003/0147869中，其特此通过引用并入。
在某些方面，本文提供生成呈递本文所描述的EBV表位中的一个或更多个的APC的方法，所述方法包括使APC与包括EBV表位的肽和/或与编码EBV表位的核酸接触。在一些实施方案中，APC被照射。在一些实施方案中，APC呈递本文所描述的肽(例如，包括LMP1、LMP2A或EBNA1表位序列的肽)。可以通过本领域已知的标准技术来产生呈递本文所描述的肽的细胞。例如，细胞可以被施以脉冲以促进肽摄取。在一些实施方案中，用编码本文提供的肽的核酸转染细胞。本文提供产生抗原呈递细胞(APC)的方法，所述方法包括用本文所描述的肽对细胞施以脉冲。产生抗原呈递细胞的示例性实例可以在WO2013088114(其特此被整体并入)中找到。
在一些实施方案中，本文提供T细胞(例如，CD4T细胞和/或CD8T细胞)，所述T细胞(例如，CD4T细胞和/或CD8T细胞)表达识别MHC上呈递的本文所描述的肽的TCR(例如，αβTCR或γδTCR)。在一些实施方案中，T细胞是CD8T细胞(CTL)，所述CD8 T细胞(例如，CTL)表达识别I类MHC上呈递的本文所描述的肽的TCR。在一些实施方案中，T细胞是CD4 T细胞(例如，辅助性T细胞)，所述CD4 T细胞(例如，辅助性T细胞)识别II类MHC上呈递的本文所描述的肽。
在一些实施方案中，本文提供生成T细胞(例如，自体CTL)、激活T细胞(例如，自体CTL)和/或诱导T细胞(例如，自体CTL)的增殖的方法，所述T细胞(例如，自体CTL)识别本文所描述的EBV表位中的一种或更多种。在一些实施方案中，将包括自体T细胞的样品(即，PBMC样品)在培养基中与本文提供的APC(例如，呈递I类MHC复合物上的包括EBV表位的肽的APC)孵育。在一些实施方案中，APC对于从其获得T细胞的受试者是自体的。在一些实施方案中，APC对于从其获得T细胞的受试者不是自体的。在一些实施方案中，将含有T细胞的样品与本文提供的APC孵育2次或更多次。在一些实施方案中，在存在至少一种细胞因子的情况下将T细胞与APC孵育。在一些实施方案中，细胞因子是IL-4、IL-7和/或IL-15。例如，美国专利公布号2015/0017723(其特此通过引用被并入)中提供用于使用APC诱导T细胞增殖的示例性方法。
在一些实施方案中，本文提供包括本文提供的T细胞和/或APC的组合物(例如，治疗组合物)，所述组合物被用于通过向受试者施用有效量的组合物来在受试者中治疗和/或预防自身免疫疾病。在一些方面，本文提供使用组合物(例如，药物组合物，包括自体CTL的这样的组合物)治疗多发性硬化的方法。在一些实施方案中，组合物包含本文提供的多种(例如，两种或更多种)CTL的组合。
治疗方法
在一些实施方案中，本文提供通过向受试者施用本文提供的自体T细胞(例如，自体CTL)来在受试者中治疗MS(例如，原发进展型MS)的方法。在一些实施方案中，MS是复发缓解型MS、继发进展型MS、原发进展型MS或进展复发型MS。在一些实施方案中，从外周单核血液样品中分离自体T细胞。可以通过任何合适的方法(如流式细胞术)评估自体T细胞的生物标志物的表达。在一些实施方案中，通过包括EBV病毒肽(例如，AdE1-LMPpoly)的运载体刺激自体T细胞。在一些实施方案中，通过病毒运载体刺激自体T细胞并且经由流式细胞术进行分选。例如，自体T细胞可以根据实施例2中举例说明的方案进行表面染色。在一些实施方案中，将自体T细胞与一个或更多个对CD107A特异性的抗体孵育，并且随后通过流式细胞术进行分选。在一些实施方案中，将自体T细胞与一个或更多个与细胞内细胞因子结合的抗体(如对IFNγ、IL-2和/或TNF特异性的抗体)孵育。在一些实施方案中，将自体T细胞与用于细胞内细胞因子的抗体孵育，并且随后具有流式细胞术进行分选。
在一些方面，本文提供通过从受试者获得PMBC样品、分离自体T细胞、测定自体T细胞的EBV反应性，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的自体T细胞是EBV反应性的，则选择受试者用于过继性免疫疗法，来选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法。
在一些方面，本文提供通过从受试者获得包括T细胞(例如，CTL)的样品、分离自体T细胞、以及测定自体T细胞的CD107A表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的自体T细胞表达CD107A，则选择受试者用于过继性免疫疗法，来选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法。
在一些方面，本文提供通过从受试者获得包括T细胞(例如，CTL)的样品、分离自体T细胞、测定自体T细胞的IFNγ表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的自体T细胞表达IFNγ，则选择受试者用于过继性免疫疗法，来选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法。
在一些方面，本文提供通过从受试者获得包括T细胞(例如，CTL)的样品、分离自体T细胞、测定自体T细胞的TNF表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的自体T细胞表达TNF，则选择受试者用于过继性免疫疗法，来选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法。
在一些方面，本文提供通过从受试者获得包括T细胞(例如，CTL)的样品、分离自体T细胞、测定自体T细胞的IL-2表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的自体T细胞表达IL-2，则选择受试者用于过继性免疫疗法，来选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法。
在一些实施方案中，方法还包括从受试者获得包括T细胞的样品(例如，从受试者获得PBMC样品)。在一些实施方案中，从样品分离自体T细胞(例如，CD4+T细胞或CD8+T细胞)。在一些实施方案中，样品主要包括自体T细胞或完全包括自体T细胞。
本文提供在受试者中治疗或预防多发性硬化(MS)的方法，所述方法包括向受试者施用表达T细胞受体的自体细胞毒性T细胞(CTL)，所述T细胞受体与I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合。在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的T细胞(例如，CTL)表达CD107A。在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的T细胞(例如，CTL)表达IFNγ。在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的T细胞(例如，CTL)表达TNF。在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的T细胞(例如，CTL)表达IL-2。
在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的T细胞(例如，CTL)表达CD107A和IFNγ。
在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的T细胞(例如，CTL)表达CD107A和TNF。
在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的T细胞(例如，CTL)表达CD107A和IL-2。
在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的T细胞(例如，CTL)表达IFNγ和TNF。
在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的T细胞(例如，CTL)表达IFNγ和IL-2。
在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的T细胞(例如，CTL)表达TNF和IL-2。
在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的T细胞(例如，CTL)表达IFNγ、TNF和IL-2。
在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的T细胞(例如，CTL)表达CD107A、TNF和IL-2。
在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的T细胞(例如，CTL)表达CD107A、IFNγ和IL-2。
在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的T细胞(例如，CTL)表达CD107A、IFNγ和TNF。
在一些实施方案中，样品中至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的T细胞(例如，CTL)表达CD107A、IFNγ、TNF和IL-2。
在一些实施方案中，1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的T细胞(例如，CTL)是EBV反应性的。
可以在T细胞扩增之前或T细胞扩增之后用本文公开的核酸构建体、本文公开的多肽、或APC测量和/或分析T细胞生物标志物表达和/或EBV反应性。
在一些方面，本文提供通过将抗原呈递细胞(APC)与编码EBV肽的核酸构建体孵育从而诱导APC呈递EBV肽、通过将包括自体T细胞(例如，CTL)的样品与抗原呈递细胞(APC)孵育来诱导肽特异性T细胞(例如，CTL)增殖从而诱导自体T细胞(例如，CTL)增殖、以及向受试者施用肽特异性自体T细胞(例如，CTL)，在受试者中治疗或预防MS的方法。在一些实施方案中，在用病毒运载体(例如，本文公开的病毒运载体)和/或APC(例如，本文公开的APC)刺激自体T细胞之前量化EBV反应性和生物标志物表达。可替代地或此外，可以在用病毒运载体(例如，本文公开的病毒运载体)和/或APC(例如，用本文公开的病毒运载体转染的APC)刺激自体T细胞之后量化EBV反应性和生物标志物表达。在一些实施方案中，通过量化样品中表达CD107A的T细胞的百分比来测量EBV反应性。在一些实施方案中，通过量化样品中表达IFNγ的T细胞的百分比来测量EBV反应性。在一些实施方案中，通过量化样品中表达TNF的T细胞的百分比来测量EBV反应性。在一些实施方案中，通过量化样品中表达IL-2的T细胞的百分比来测量EBV反应性。在一些实施方案中，将EBV反应性测量为表达多种生物标志物(例如，CD107A、IFNγ、TNF和IL-2中的两种或更多种，优选全部四种)的T细胞的百分比。在一些实施方案中，通过量化样品中表达CD107A、IFNγ、TNF和IL-2的自体T细胞的百分比来计算EBV反应性。可以在EBV反应性百分比量化之前或EBV反应性百分比量化之后从样品(例如，PBMC样品或包括T细胞的样品)分离T细胞。因此，在一些实施方案中，EBV反应性是在主要包括T细胞的样品中具有一种或多种期望的特性的T细胞的百分比。
在一些实施方案中，通过量化样品中表达CD107A的CD8+淋巴细胞的百分比来测量EBV反应性。在一些实施方案中，通过量化样品中表达IFNγ的CD8+淋巴细胞的百分比来测量EBV反应性。在一些实施方案中，通过量化样品中表达TNF的CD8+淋巴细胞的百分比来测量EBV反应性。在一些实施方案中，通过量化样品中表达IL-2的CD8+淋巴细胞的百分比来测量EBV反应性。在一些实施方案中，将EBV反应性测量为表达多种生物标志物(例如，CD107A、IFNγ、TNF和IL-2中的两种或更多种，优选全部四种)的CD8+淋巴细胞的百分比。可以在EBV反应性百分比量化之前或EBV反应性百分比量化之后从样品(例如，PBMC样品或CD8+淋巴细胞的样品)分离CD8+淋巴细胞。因此，在一些实施方案中，EBV反应性是在主要包括CD8+淋巴细胞的样品中具有一种或多种期望的特性的CD8+淋巴细胞的百分比。
在一些实施方案中，通过量化样品中表达CD107A的CD3+淋巴细胞的百分比来测量EBV反应性。在一些实施方案中，通过量化样品中表达IFNγ的CD3+淋巴细胞的百分比来测量EBV反应性。在一些实施方案中，通过量化样品中表达TNF的CD3+淋巴细胞的百分比来测量EBV反应性。在一些实施方案中，通过量化样品中表达IL-2的CD3+淋巴细胞的百分比来测量EBV反应性。在一些实施方案中，将EBV反应性测量为表达多种生物标志物(例如，CD107A、IFNγ、TNF和IL-2中的两种或更多种，优选全部四种)的CD3+淋巴细胞的百分比。可以在EBV反应性百分比量化之前或EBV反应性百分比量化之后从样品(例如，PBMC样品或CD3+淋巴细胞的样品)分离CD3+淋巴细胞。因此，在一些实施方案中，EBV反应性是在主要包括CD3+淋巴细胞的样品中具有一种或多种期望的特性的CD3+淋巴细胞的百分比。
在一些实施方案中，方法还包括分析增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)的CD107a、IFNγ、TNF或IL-2的表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)表达CD107a、IFNγ、TNF或IL-2，则向受试者施用肽特异性自体T细胞(例如，CTL)。
在一些实施方案中，方法还包括分析增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)的CD107a和TNF的表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)表达CD107a和TNF，则向受试者施用肽特异性自体T细胞(例如，CTL)。
在一些实施方案中，方法还包括分析增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)的CD107a和IFNγ的表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)表达CD107a和IFNγ，则向受试者施用肽特异性自体T细胞(例如，CTL)。
在一些实施方案中，方法还包括分析增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)的CD107a和IL-2的表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)表达CD107a和IL-2，则向受试者施用肽特异性自体T细胞(例如，CTL)。
在一些实施方案中，方法还包括分析增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)的TNF和IL-2的表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)表达TNF和IL-2，则向受试者施用肽特异性自体T细胞(例如，CTL)。
在一些实施方案中，方法还包括分析增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)的IFNγ和IL-2的表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)表达IFNγ和IL-2，则向受试者施用肽特异性自体T细胞(例如，CTL)。
在一些实施方案中，方法还包括分析增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)的IFNγ和TNF的表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)表达IFNγ和TNF，则向受试者施用肽特异性自体T细胞(例如，CTL)。
在一些实施方案中，方法还包括分析增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)的CD107a、IFNγ和TNF的表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)表达CD107a、IFNγ和TNF，则向受试者施用肽特异性自体T细胞(例如，CTL)。
在一些实施方案中，方法还包括分析增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)的CD107a、IFNγ和IL-2的表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)表达CD107a、IFNγ和IL-2，则向受试者施用肽特异性自体T细胞(例如，CTL)。
在一些实施方案中，方法还包括分析增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)的CD107a、IL-2和TNF的表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)表达CD107a、IL-2和TNF，则向受试者施用肽特异性自体T细胞(例如，CTL)。
在一些实施方案中，方法还包括分析增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)的IFNγ、IL-2和TNF的表达，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的增殖的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)表达IFNγ、IL-2和TNF，则向受试者施用肽特异性自体T细胞(例如，CTL)。
在一些实施方案中，如果至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)表达CD107a、IFNγ、TNF和IL-2，则向受试者施用自体T细胞(例如，CTL)。
肽特异性自体T细胞(例如，CTL)可以具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、或90％的具有EBV反应性的肽特异性自体T细胞(例如，CTL)。
在一些实施方案中，每剂量的T细胞向受试者施用约1×105至约1×108个T细胞。在一些实施方案中，每剂量的T细胞向受试者施用约1×106至约1×107个T细胞。在一些实施方案中，向受试者施用5×106、1×107、1.5×107或2×107个T细胞(例如，CTL)。可以向受试者施用多剂量。在一些实施方案中，在疗法的过程中，施用初始剂量的T细胞(例如，自体CTL)，并且例如以渐增的剂量施用一个或更多个附加剂量的T细胞(例如，自体CTL)。在一些实施方案中、施用两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或十个或更多个剂量。可以向受试者施加与初始剂量相同或不同的附加剂量。例如，可以施用较低剂量，随后施用较高剂量。可以每天一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、或每六个月一次施用剂量。在一些实施方案中，受试者不会由于T细胞(例如，自体CTL)施用而经历任何不良反应。
在一些方面，方法还包括通过从受试者获得脑脊液(CSF)的第一样品、分析第一样品中CSF中抗EBV IgG的量(优选地在CTL施用之前)、以及在一段时间之后从受试者获得CSF的第二样品(选地在CTL施用之后)、分析第二样品中CSF中抗EBV IgG的量，如果第二样品中抗EBV IgG的量小于第一样品，则疾病已经稳定和/或未进展，来评估过继性免疫疗法在患有多发性硬化的受试者中的功效。可以获得附加的CTF样品并且与先前的样品进行比较。本文还提供通过向受试者施用表达与I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合的T细胞受体的自体T细胞(例如，CTL)来降低患有MS的受试者中CSF中抗EBV IgG水平的方法。可以通过CSF IgG指数测量CSF中抗EBV IgG水平的降低。在一些实施方案中，可以通过Reiber和Felgenhauer公式计算CSF IgG水平(即，参见图1)。在施用T细胞之后，可以将抗EBV IgG水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％。
在一些实施方案中，方法包括通过向受试者施用表达与I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合的T细胞受体的自体T细胞(例如，CTL，如本文所描述的肽特异性自体CTL)来在受试者中改善或稳定MS的症状(例如，视力损失、视敏度损失、手灵活度的损失或降低、增加的疲劳、和/或尿急)。本文还提供在患有MS的受试者中改善视敏度、改善色觉、或者稳定视力损失的方法，方法包括向受试者施用自体T细胞(例如，CTL，如本文所描述的肽特异性自体CTL)。在一些实施方案中，本文提供在患有MS的受试者中改善运动技能、平衡、或手灵活度的方法，方法包括向受试者施用本文所描述的自体T细胞。本文还提供在受试者中改善睡眠的方法，方法包括向受试者施用自体T细胞(例如，CTL，如本文所描述的肽特异性自体CTL)。
在一些实施方案中，给予受试者诊断测试(如EDSS)。在一些实施方案中，受试者进行EDSS测试并且在T细胞施用之前和/或T细胞施用之后给予EDSS评分。在T细胞施用之后，EDSS评分可以保持不变，或者EDSS评分可以减小(例如，减小至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、或5.0)。
本文公开的各种方法可以是用于在受试者(如患有多发性硬化的受试者)中改善行走、视力、平衡、认知、或其他症状的方法，和/或用于在受试者(如患有多发性硬化的受试者)中改善多发性硬化功能复合物(MSFC)评分、EDSS评分、或MSSS评分的方法。因此，在某些实施方案中，本文公开的治疗方法包含用于在患者中稳定或改善伤残或病况(例如，运动技能/平衡/手灵活度、睡眠、视敏度或色觉、疲劳、尿急)的方法，由此在1周、2周、4周、6周、8周、10周、三个月、六个月、一年、或两年的疗法之后患者的伤残评分(如通过这些测试中任一个或另外合适的测试所测量的)相对于T细胞疗法之前的EDSS评分高至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约40％、至少约50％、或甚至至少约60％。
例如，可以测试受试者的EDSS评分，例如，评估受试者在不同时间点时(如在0个月(基线)、1个月、2个月、3个月、6个月、1年和2年时)的测试表现。在某些实施方案中，如果在施用T细胞之后在受试者的评分方面没有记录的减小，则认为MS已经稳定和/或未进展。在其他实施方案中，如果在施用T细胞之后均没有受试者评分的增加或减少，则认为MS已经稳定和/或未进展。可以在从CTL治疗开始的任何时间点处(例如，在从CTL治疗开始的一周、两周、三周、在从CTL治疗开始的四周、在从CTL治疗开始的一个月、两个月、三个月处)重复EDSS测试，以评估是否治疗减慢或者使运动技能/平衡/手灵活度、改善的睡眠、改善的视敏度或色觉、疲劳、尿急中的任何进一步恶化停止。
在一些实施方案中，可以使用行走测试来测试行走伤残的进展，例如，在不同时间点处评估受试者在25英尺行走测试中的表现。在某些实施方案中，如果在行走方面没有记录的恶化，则认为受试者在行走方面没有进行性恶化。对于尚未接受T细胞疗法的这样的患者，表现出进行性行走伤残的受试者开始用T细胞(例如，CTL)治疗。可以重复行走测试(例如，在从治疗开始的一周、两周、三周、在从治疗开始的四周、在从治疗开始的一个月、两个月、三个月时)，以评估是否治疗减慢或者使行走表现(例如，如通过行走测试所测量的)中的任何进一步恶化停止。
可以使用PASAT(例如，PASAT 2或PASAT 3)或SDMT测试、或可替代的MS-COG测试来评估与MS疗法相关的认知结果的改善(无论是认知衰退的减慢、认知衰退的稳定化、还是认知功能的改善)(参见Erlanger et al.,J Neuro Sci 340:123-129(2014))。
本文提供的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得活性成分的量，所述活性成分的量对实现特定患者、组合物和施用模式的期望的治疗响应是有效的，而对患者没有毒性。
所选择的剂量水平将取决于各种各样的因素，所述因素包含所采用的特定药剂的活性、施用途径、施用时间、正在被采用的特定化合物的排泄或代谢的速率、治疗的持续时间、与所采用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在被治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、总体健康状况和先前的病史，以及医学领域中众所周知的类似因素。
实施例
实施例1：MS患者和用于MS的采用EBV特异性T细胞疗法的多种治疗的研究
参与者捐献了200-400mL血液样品。将来自该样品的外周血单核细胞用于实验室生成悬浮在临床级生理盐水中的自体潜伏膜蛋白(LMP1和LMP2)/EB病毒核抗原1(EBNA1)特异性T细胞。通过使用用重组腺病毒运载体AdE1-LMPpoly(一种编码来自EBV核抗原-1(EBNA1)、潜伏膜蛋白1(LMP1)和LMP2A的多个CD8+T细胞表位的腺病毒运载体)感染的γ-辐照的自体外周血单核细胞刺激来产生研究产物。然后评估T细胞培养物的细胞产量、活力和T细胞频率。在收集200-400mL血液样品与第一次细胞施用之间通常将经过大约5周。
每个患者接受其自己的经离体刺激的T细胞，以增强对EBNA1、LMP1和LMP2A的反应性，并且随访26周。患者以每两周一次的间隔静脉内接受T细胞疗法。每次给予每个剂量，初始剂量是5×106个T细胞，随后是1×107、1.5×107和2×107个细胞的剂量。在8周的时期内给予四个总剂量。经由静脉注射管滴注施用每个剂量的细胞，允许将T细胞缓慢施用到血液中，而不是单次大剂量的细胞。
招募13个患者。3个患者在接受细胞疗法之前退出：1个患者由于无关的恶性肿瘤的诊断，而2个患者由于无法生成EBV特异性T细胞。剩余的10个患者每个方案接受4次T细胞输注(下文表1)。
自体EBV-CTL耐受性良好，并且未观察到显著的不良事件(AE)。仅1个患者经历了相关或可能相关的AE，所述AE是被判定为由于DMSO溶剂导致的暂时的1级“改变的味觉”。未报告4级AE或5级AE。
6个患者经历了在第一次输注之后2-14周开始的症状临床改善和客观临床改善(表1)。疲劳的降低是具有临床改善的患者中的突出特征。观察到EBV反应性与临床反应之间的相关性。接受具有较高EBV反应性的T细胞的患者经历较大的临床反应。研究中的6个患者接受了具有≥7％的EBV反应性的T细胞；这些患者中的5个患者经历了临床改善，其中3个患者经历了EDSS评分的改善。4个患者接受了具有≤3％的EBV反应性的T细胞；这些患者中只有一个患者具有临床改善，一个患者具有EDSS的恶化，并且两个患者报告无变化。6个月研究期间的临床改善或临床改善的缺乏也与所施用的T细胞的EBV特异性T细胞功能的生物标志物相关(图2)。相比于未观察到受益的患者，经历临床受益的患者接受了显著富含表达CD107a、IFNγ和TNFα的EBV特异性CD8+T细胞的疗法。此外，临床受益与所施用的T细胞的多功能性(CD107a、IFNγ、TNFα和IL-2的表达)相关。
本研究中用于MS患者的自体T细胞疗法安全且耐受性良好，无严重AE，并且唯一与治疗相关的AE是味觉障碍，这可能与制剂中的DMSO有关，而与T细胞无关。
SPMS患者和PPMS患者的临床改善自相对固定的基线起(长达5年)，并且不表示急性MS突发的消退。在接受具有EBV反应性≥7％的T细胞的6个患者中，5个患者显示临床改善，其中3个患者改善其EDSS评分。
与EBV特异性T细胞的假设作用机制一致，T细胞产物的EBV反应性与临床改善之间似乎存在剂量-响应关联。
疲劳的降低是响应者中一致且突出的特征。疲劳是MS最致伤残的症状，并且可能先于临床MS发病(通常先于多年)。
我们的数据为EBV感染在MS中的致病作用增加了越来越多的证据。由于T细胞可进入全部CNS区室，因此仅靶向EBV感染的B细胞的T细胞疗法是一种能够提供有利的安全性和持久功效的新的治疗方式。
实施例2：用于LMP和EBNA1特异性T细胞的多参数细胞内细胞因子染色和脱粒分析的示例性方法
1.将待测试的LMP/EBNA1 CD8 pepmix(100μg/ml原液)、EBNA1 pepmix(100μg/ml原液)和任何HLA匹配的肽表位(200μg/mL原液)在RPMI1640-10％FCS中稀释至2μg/mL(测定中的最终浓度为1μg/mL)。
2.将细胞刺激混合剂以1:50稀释在RPMI1640-10％FCS中。(这将是测定中1:100的最终稀释度)。
注意：eBioscience细胞刺激混合剂在RPMI中稀释1/5后储存在-20℃，以使得成为100×的储存浓度。
3.将100μL适当的pepmix、肽表位或细胞刺激混合剂，或100μL RPMI1640-10％FCS(无肽对照)添加到96孔V形底板的适当的孔中。
4.将PBMC或T细胞在RPMI1640-10％FCS中稀释至5×106个细胞/mL(这将每次测定给予5×105个细胞)。
5.将GolgiPlug(布雷菲德菌素A)添加到细胞中以得到2μL/mL细胞的最终比例(测定中GolgiPlug的最终浓度将为1μL/mL)。
6.将GolgiStop(莫能菌素)添加到细胞中以得到1.4μL/mL细胞的最终比例(测定中GolgiStop的最终浓度将为0.7μL/mL)。
7.将FITC缀合的抗CD107a添加到细胞中以得到50μL/mL的最终比例(抗CD107a的最终量为5μL/测试)。
8.将每孔100μL的细胞悬浮液添加到96孔V形底板的所需孔中。
9.在37℃/6.5％CO2下孵育4小时。
10.将板以2300rpm离心2分钟。
11.丢弃上清液。通过每孔添加200μL的PBS-2％FCS来洗涤细胞，并且将板以2300rpm离心2分钟。重复此步骤。
12.每孔用PBS-2％FCS 200μL/洗涤液洗涤细胞两次，将管以1000g(2300rpm)离心2min。
表面细胞抗原染色
13.将细胞再悬浮于50μL/孔的PBS-2％FCS中，所述PBS-2％FCS含有0.125μLperCP-Cy5.5缀合的抗CD8、0.25μL太平洋蓝(Pacific blue)缀合的抗CD4和0.2μL的Live/Dead Near IR。在4℃孵育30分钟。
14.将板以2300rpm离心2分钟。丢弃上清液。通过每孔添加200μL的PBS-2％FCS来洗涤细胞。将板以2300rpm离心2分钟。重复此步骤。
15.将细胞再悬浮于100μL/孔的BD破膜/固定(BD cytofix/cytoperm)溶液中，并且在4℃孵育20分钟。
16.将板以2300rpm离心2分钟。丢弃上清液。通过每孔添加200μL的BD Perm/Wash来洗涤细胞。将板以2300rpm离心2分钟。重复此步骤。
细胞内细胞因子染色
17.将固定/透化的细胞再悬浮于50μL/孔的BD Perm/Wash溶液中，所述BD Perm/Wash溶液含有1μL PE缀合的抗IL-2、1μL AF700缀合的抗IFNγ和0.25μL APC缀合的抗TNF。在4℃孵育30分钟。
18.将板以2300rpm离心2分钟。丢弃上清液。通过每孔添加200μL的Perm/Wash来洗涤细胞。将板以2300rpm离心2分钟。重复此步骤。
19.将细胞再悬浮于200μL的PBS-2％多聚甲醛中并且在4℃储存。
20.使用BD Fortessa获取细胞。使用Flow Jo软件分析细胞因子产生/脱粒。
表2
*用自体EBV特异性T细胞再治疗患者#8。他的初始治疗在2014年。
Claims (130)
1.一种在受试者中治疗或预防多发性硬化(MS)的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达T细胞受体的自体细胞毒性T细胞(CTL)，所述T细胞受体与I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合。
2.如权利要求1所述的方法，其中至少5％的所述CTL表达CD107a。
3.如权利要求1所述的方法，其中至少10％的所述CTL表达CD107a。
4.如权利要求1所述的方法，其中至少15％的所述CTL表达CD107a。
5.如权利要求1所述的方法，其中至少20％的所述CTL表达CD107a。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中至少5％的所述CTL表达IFNγ。
7.如权利要求6所述的方法，其中至少10％的所述CTL表达IFNγ。
8.如权利要求7所述的方法，其中至少15％的所述CTL表达IFNγ。
9.如权利要求8所述的方法，其中至少20％的所述CTL表达IFNγ。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中至少5％的所述CTL表达TNF。
11.如权利要求10所述的方法，其中至少10％的所述CTL表达TNF。
12.如权利要求11所述的方法，其中至少15％的所述CTL表达TNF。
13.如权利要求12所述的方法，其中至少20％的所述CTL表达TNF。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中至少1％的所述CTL表达IL-2。
15.如权利要求14所述的方法，其中至少5％的所述CTL表达IL-2。
16.如权利要求15所述的方法，其中至少10％的所述CTL表达IL-2。
17.如权利要求16所述的方法，其中至少15％的所述CTL表达IL-2。
18.如权利要求1所述的方法，其中至少30％的所述CTL表达CD107a、IFNγ、TNFa和IL-2。
19.如权利要求1所述的方法，其中至少40％的所述CTL表达CD107a、IFNγ、TNFa和IL-2。
20.如权利要求1所述的方法，其中至少50％的所述CTL表达CD107a、IFNγ、TNFa和IL-2。
21.如权利要求1所述的方法，其中至少70％的所述CTL表达CD107a、IFNγ、TNFa和IL-2。
22.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述CTL具有至少5％的EBV反应性。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述CTL具有至少7％的EBV反应性。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述CTL具有至少10％的EBV反应性。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述CTL具有至少15％的EBV反应性。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述CTL具有至少20％的EBV反应性。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述CTL具有至少30％的EBV反应性。
28.一种在受试者中治疗或预防多发性硬化(MS)的方法，所述方法包括：
a)从所述受试者分离包括表达T细胞受体的细胞毒性T细胞(CTL)的样品，所述T细胞受体与I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合；
b)向所述受试者施用所述CTL。
29.一种在受试者中治疗或预防MS的方法，所述方法包括：
a)将包括自体细胞毒性T细胞(CTL)的样品与呈递EBV肽的抗原呈递细胞(APC)孵育，从而诱导所述样品中肽特异性T细胞的增殖；
b)向所述受试者施用肽特异性自体CTL。
30.一种在受试者中治疗或预防MS的方法，所述方法包括：
a)将抗原呈递细胞(APC)与编码EBV肽的核酸构建体孵育，从而诱导APC呈递EBV肽；
b)通过将包括自体CTL的样品与所述抗原呈递细胞(APC)孵育来诱导肽特异性CTL增殖，从而诱导所述自体CTL增殖；以及
c)向所述受试者施用肽特异性自体CTL。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述核酸构建体是病毒运载体。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述病毒运载体是AdE1-LMPpoly。
33.如权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述方法还包括分析增殖的肽特异性自体CTL的CD107a的表达，如果至少5％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达CD107a，则向所述受试者施用所述肽特异性自体CTL。
34.如权利要求33所述的方法，其中如果所述样品中至少10％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达CD107a，则施用所述CTL。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中如果所述样品中至少15％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达CD107a，则施用所述CTL。
36.如权利要求33至35中任一项所述的方法，其中如果所述样品中至少20％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达CD107A，则施用所述CTL。
37.如权利要求29至36中任一项所述的方法，其中所述方法还包括分析增殖的肽特异性自体CTL的IFNγ的表达，如果至少5％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达IFNγg，则向所述受试者施用所述肽特异性自体CTL。
38.如权利要求37所述的方法，其中如果所述样品中至少10％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达IFNγ，则施用所述CTL。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中如果所述样品中至少15％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达IFNγ，则施用所述CTL。
40.如权利要求37至39中任一项所述的方法，其中如果所述样品中至少20％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达IFNγ，则施用所述CTL。
41.如权利要求29至40中任一项所述的方法，其中所述方法还包括分析增殖的肽特异性自体CTL的TNF的表达，如果至少5％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达TNF，则向所述受试者施用所述肽特异性自体CTL。
42.如权利要求41所述的方法，其中如果所述样品中至少10％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达TNF，则施用所述CTL。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中如果所述样品中至少15％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达TNF，则施用所述CTL。
44.如权利要求41至43中任一项所述的方法，其中如果所述样品中至少20％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达TNF，则施用所述CTL。
45.如权利要求29至44中任一项所述的方法，其中所述方法还包括分析增殖的肽特异性自体CTL的IL-2的表达，如果至少1％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达IL-2，则向所述受试者施用所述肽特异性自体CTL。
46.如权利要求45所述的方法，其中如果所述样品中至少5％的所述肽特异性自体CTL表达IL-2，则施用所述CTL。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中如果所述样品中至少10％的所述肽特异性自体CTL表达IL-2，则施用所述CTL。
48.如权利要求45至47中任一项所述的方法，其中如果所述样品中至少15％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达IL-2，则施用所述CTL。
49.如权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述方法还包括分析增殖的肽特异性自体CTL的CD107a、TNF、IFNγ和IL-2的表达，如果至少20％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达CD107a、TNF、IFNγ和IL-2，则向所述受试者施用所述肽特异性自体CTL。
50.如权利要求49所述的方法，其中如果所述样品中至少30％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达CD107a、TNF、IFNγ和IL-2，则施用所述CTL。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中如果所述样品中至少40％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达CD107a、TNF、IFNγ和IL-2，则施用所述CTL。
52.如权利要求49至51中任一项所述的方法，其中如果所述样品中至少50％的所述增殖的肽特异性自体CTL表达CD107a、TNF、IFNγ和IL-2，则施用所述CTL。
53.如权利要求29至52中任一项所述的方法，其中所述方法还包括分析增殖的肽特异性自体CTL的EBV反应性，如果所述反应性高于预定的阈值，则向所述受试者施用所述肽特异性自体CTL。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述阈值是5％。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述阈值是7％。
56.如权利要求53所述的方法，其中所述阈值是10％。
57.如权利要求53所述的方法，其中所述阈值是20％。
58.如权利要求53所述的方法，其中所述阈值是30％。
59.如权利要求53所述的方法，其中所述阈值是50％。
60.如权利要求29至59中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，将所述样品与一种或更多种细胞因子孵育。
61.如权利要求29至60中任一项所述的方法，其中所述APC包括B细胞。
62.如权利要求29至61中任一项所述的方法，其中所述APC包括抗原呈递T细胞。
63.如权利要求29至62中任一项所述的方法，其中所述APC包括树突状细胞。
64.如权利要求29至63中任一项所述的方法，其中所述APC包括人工抗原呈递细胞。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述人工抗原呈递细胞是aK562细胞。
66.如权利要求28至65中任一项所述的方法，其中所述样品包括外周血单核细胞(PBMC)。
67.如权利要求1至66中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述受试者获得样品。
68.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述EBV肽包括表1中列出的氨基酸序列。
69.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述EBV肽包括LMP1肽或所述LMP1肽的片段。
70.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述EBV肽包括LMP2A肽或所述LMP2A肽的片段。
71.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述EBV肽包括EBNA1肽或所述EBNA1肽的片段。
72.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括以一个剂量向所述受试者施用约5×106个CTL。
73.如权利要求1至71中任一项所述的方法，所述方法包括以一个剂量向所述受试者施用约1×107个CTL。
74.如权利要求1至71中任一项所述的方法，所述方法包括以一个剂量向所述受试者施用约1.5×107个CTL。
75.如权利要求1至71中任一项所述的方法，所述方法包括以一个剂量向所述受试者施用约2×107个CTL。
76.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中例如以逐渐增加的剂量向所述受试者施用多个剂量的CTL。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述剂量被每周一次施用。
78.如权利要求76所述的方法，其中所述剂量被每两周一次施用。
79.如权利要求78所述的方法，所述方法包括施用四个剂量的依次更高数量的CTL。
80.如权利要求79所述的方法，所述方法包括施用第一剂量的5×106个CTL、第二剂量的1×107个CTL、第三剂量的1.5×107个CTL、以及第四剂量的2×107个CTL。
81.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述受试者不会由于CTL施用而经历显著的不良反应。
82.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述方法还包括评估过继性免疫疗法在患有多发性硬化的受试者中的功效，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得脑脊液(CSF)的第一样品，
(b)在CTL施用之前，测定所述第一样品中所述CSF中抗EBV IgG的量，
(c)在CTL施用之后，在一段时间之后，从所述受试者获得CSF的第二样品，
(d)测定所述第二样品中所述CSF中抗EBV IgG的量，
如果所述第二样品中抗EBV IgG的量小于所述第一样品，则疾病已经稳定和/或未进展。
83.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MS是复发缓解型MS、继发进展型MS、原发进展型MS、或进展复发型MS。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述MS是原发进展型MS。
85.如任一项前述权利要求所述的方法，其中在CTL施用之后，所述受试者的运动技能/平衡/手灵活度、睡眠、视敏度或色觉、疲劳、和/或尿急已经被改善。
86.如任一项前述权利要求所述的方法，其中在CTL施用之后，所述受试者的EDSS评分保持不变。
87.如权利要求1至85中任一项所述的方法，其中在CTL施用之后，所述受试者的EDSS评分减少至少0.5。
88.如权利要求1至85中任一项所述的方法，其中在CTL施用之后，所述受试者的EDSS评分减少至少1.0。
89.一种在患有MS的受试者中降低CSF中的抗EBV IgG水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达T细胞受体的自体细胞毒性T细胞(CTL)，所述T细胞受体与I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合。
90.一种在患有MS的受试者中改善视敏度、改善色觉、或者稳定视力损失的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达T细胞受体的自体细胞毒性T细胞(CTL)，所述T细胞受体与I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合。
91.一种在患有MS的受试者中改善运动技能、平衡或手灵活度的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达T细胞受体的自体细胞毒性T细胞(CTL)，所述T细胞受体与I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合。
92.一种在患有MS的受试者中改善睡眠的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达T细胞受体的自体细胞毒性T细胞(CTL)，所述T细胞受体与I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合。
93.一种在患有MS的受试者中治疗或预防疲劳的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达T细胞受体的自体细胞毒性T细胞(CTL)，所述T细胞受体与I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合。
94.一种在患有MS的受试者中治疗或预防尿急的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达T细胞受体的自体细胞毒性T细胞(CTL)，所述T细胞受体与I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合。
95.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MS是复发缓解型MS。
96.如权利要求1至94中任一项所述的方法，其中所述MS是继发进展型MS。
97.如权利要求1至94中任一项所述的方法，其中所述MS是原发进展型MS。
98.如权利要求1至94中任一项所述的方法，其中所述MS是原发进展进展复发型MS。
99.一种选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得包括T细胞的样品，
(b)分离所述样品中的自体T细胞，
(c)测定所述样品中所述自体T细胞的EBV反应性，如果至少阈值百分比的所述自体T细胞是EBV反应性的，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述阈值是1％。
101.如权利要求99所述的方法，其中所述阈值是2％。
102.如权利要求99所述的方法，其中所述阈值是3％。
103.如权利要求99所述的方法，其中所述阈值是5％。
104.如权利要求99所述的方法，其中所述阈值是10％。
105.如权利要求99所述的方法，其中所述阈值是20％。
106.一种选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得包括T细胞的样品，
(b)分离所述样品中的自体T细胞，
(c)测定所述样品中表达CD107A的自体T细胞的百分比，如果至少一定百分比的所述自体T细胞表达CD107A，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
107.如权利要求106所述的方法，其中如果至少1％的所述自体T细胞表达CD107A，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
108.如权利要求106所述的方法，其中如果至少3％的所述自体T细胞表达CD107A，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
109.如权利要求106所述的方法，其中如果至少5％的所述自体T细胞表达CD107A，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
110.如权利要求106所述的方法，其中如果至少10％的所述自体T细胞表达CD107A，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
111.一种选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得包括T细胞的样品，
(b)分离所述样品中的自体T细胞，
(c)测定所述样品中表达TNF的自体T细胞的百分比，如果至少一定百分比的所述自体T细胞表达TNF，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
112.如权利要求111所述的方法，其中如果至少1％的所述自体T细胞表达TNF，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
113.如权利要求111所述的方法，其中如果至少3％的所述自体T细胞表达TNF，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
114.如权利要求111所述的方法，其中如果至少5％的所述自体T细胞表达TNF，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
115.如权利要求111所述的方法，其中如果至少10％的所述自体T细胞表达TNF，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
116.一种选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得包括T细胞的样品，
(b)分离所述样品中的自体T细胞，
(c)测定所述样品中表达IFNγ的自体T细胞的百分比，如果至少一定百分比的所述自体T细胞表达IFNγ，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
117.如权利要求116所述的方法，其中如果至少1％的所述自体T细胞表达IFNγ，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
118.如权利要求116所述的方法，其中如果至少3％的所述自体T细胞表达IFNγ，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
119.如权利要求116所述的方法，其中如果至少5％的所述自体T细胞表达IFNγ，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
120.如权利要求116所述的方法，其中如果至少10％的所述自体T细胞表达IFNγ，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
121.一种选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得包括T细胞的样品，
(b)分离所述样品中的自体T细胞，
(c)测定所述样品中表达IL-2的自体T细胞的百分比，如果至少一定百分比的所述自体T细胞表达IL-2，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
122.如权利要求116所述的方法，其中如果至少1％的所述自体T细胞表达IL-2，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
123.如权利要求116所述的方法，其中如果至少3％的所述自体T细胞表达IL-2，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
124.如权利要求116所述的方法，其中如果至少5％的所述自体T细胞表达IL-2，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
125.如权利要求116所述的方法，其中如果至少10％的所述自体T细胞表达IL-2，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
126.一种选择用于过继性免疫疗法的受试者的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得PMBC样品，
(b)分离所述样品中的自体T细胞，
(c)测定所述样品中表达CD107a、IFNγ、TNFa和IL-2的自体T细胞的百分比，如果至少一定百分比的所述自体T细胞表达CD107a、IFNγ、TNFa和IL-2，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
127.如权利要求126所述的方法，其中如果至少1％的所述自体T细胞表达CD107a、IFNγ、TNFa和IL-2，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
128.如权利要求126所述的方法，其中如果至少3％的所述自体T细胞表达CD107a、IFNγ、TNFa和IL-2，则选择所述受试者用于过继性免疫疗法。
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