RU2558294C1 - Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека - Google Patents
Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2558294C1 RU2558294C1 RU2014137218/10A RU2014137218A RU2558294C1 RU 2558294 C1 RU2558294 C1 RU 2558294C1 RU 2014137218/10 A RU2014137218/10 A RU 2014137218/10A RU 2014137218 A RU2014137218 A RU 2014137218A RU 2558294 C1 RU2558294 C1 RU 2558294C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nerve
- vegf
- codon
- regeneration
- peripheral nerve
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 title claims abstract description 36
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 title claims abstract description 31
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 title abstract description 3
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 title 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract 3
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 16
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 11
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 abstract description 57
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 51
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 20
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 17
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 16
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 14
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 14
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 210000001617 median nerve Anatomy 0.000 description 10
- 210000000658 ulnar nerve Anatomy 0.000 description 10
- 208000010886 Peripheral nerve injury Diseases 0.000 description 9
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 9
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 9
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 9
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 8
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 8
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 8
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 7
- 230000003872 anastomosis Effects 0.000 description 6
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 208000014306 Trophic disease Diseases 0.000 description 5
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 5
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 230000035900 sweating Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 3
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 206010039670 Sciatic nerve injury Diseases 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000002567 electromyography Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 230000001096 hypoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000037152 sensory function Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108010080379 Fibrin Tissue Adhesive Proteins 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101100372762 Rattus norvegicus Flt1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 2
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 2
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 2
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100381481 Caenorhabditis elegans baz-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- 208000025962 Crush injury Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150019331 FGF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 208000004221 Multiple Trauma Diseases 0.000 description 1
- 208000023637 Multiple injury Diseases 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000001738 Nervous System Trauma Diseases 0.000 description 1
- 208000005890 Neuroma Diseases 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010003882 axonal neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000010442 axonal sprouting Effects 0.000 description 1
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 239000007376 cm-medium Substances 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 230000009519 contusion Effects 0.000 description 1
- 210000005226 corpus cavernosum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009986 erectile function Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 101150016624 fgfr1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000004705 lumbosacral region Anatomy 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 210000001107 musculocutaneous nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000011505 plaster Substances 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007832 reinnervation Effects 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008536 thermal pain sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
- A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к генной инженерии, а также к медицине, а именно к нейрохирургии и травматологии. Описана геннотерапевтическая конструкция, кодирующая эндотелиальный сосудистый фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов (FGF-2). В основе геннотерапевтической конструкции, кодирующей оба фактора, используется кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида. Введение геннотерапевтической конструкции может осуществляться как непосредственно в поврежденный нерв, так и в параневральные ткани, как интраоперационно, так и в послеоперационном периоде. Изобретение может быть использовано для стимуляции регенерации нервов. Изобретение значительно улучшает результаты реконструктивного лечения повреждений периферических нервов. 3 н.п. ф-лы, 15 ил.
Description
Предшествующий уровень техники
По разным данным, частота встречаемости повреждений периферических нервов различной этиологии составляет 3-10% [1-3]. Актуальность разработки дополнительных методов лечения, способных повысить качество стандартных, обусловлена длительностью восстановительного периода (год и более) и значительным снижением качества жизни пациентов трудоспособного возраста и высокой частотой инвалидизации. Травма периферического нерва является частой причиной потери профессии. Выбор способа восстановления целостности периферического нерва обусловлен рядом особенностей повреждения в каждом конкретном случае: механизм травмы, время, прошедшее от момента получения травмы до выполнения хирургического пособия, протяженность дефекта периферического нерва и т.д. Одним из видов реконструктивного лечения является сшивание культей пересеченного нерва за счет создания анастомоза конец-в-конец. Однако часто травма периферического нерва сопровождается образованием дефекта различной протяженности, вследствие чего такой подход невозможен. В этой ситуации "золотым стандартом" восстановления целостности нерва является использование аутонервной вставки для устранения протяженного дефекта. В качестве аутовставки может быть использован функционально менее значимый нерв. В качестве альтернативы могут быть использованы различные кондуиты, которые представляют собой тубулированные структуры, предназначение которых заключается в устранении протяженного дефекта тканей и создании благоприятных условий для регенерации периферического нерва.
Степень восстановления функции иннервируемой конечности после хирургического восстановления целостности периферического нерва зависит от множества факторов: время, прошедшее с момента травмы до операции, протяженность дефекта, расстояние от места травмы периферического нерва до иннервируемой области и т.д. Однако, несмотря на развитие техники восстановления целостности нерва, даже при самых благоприятных условиях, как правило, происходит лишь частичное восстановление функции иннервируемой конечности. Это побуждает к поиску новых методов лечения, которые позволили бы улучшить результаты стандартного реконструктивного лечения и качество жизни пациентов в целом.
Одним из таких направлений является применение факторов роста с целью индукции регенерации периферического нерва. Данная концепция появилась в результате накопления данных о значимой роли факторов роста в естественном процессе регенерации периферических нервов [4].
Одним из наиболее хорошо изученных факторов роста, влияющих на восстановление периферических нервов, является сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). VEGF является одним из основных регуляторов ангиогенеза и васкулогенеза. VEGF - это димерный 34-42 кДа дисульфид-связанный гликопротеин. VEGF-A является специфичным митогеном для эндотелиальных клеток (ЭК). VEGF индуцирует пролиферацию ЭК, их активацию, дифференцировку и формирование ими капиллярных трубочек, ремоделирующихся в дальнейшем в зрелые сосуды. Он также является мощным фактором повышения выживаемости ЭК, так как индуцирует экспрессию антиапоптозных белков. Делеции генов, кодирующих VEGF, приводят к серьезным дефектам и неправильному развитию сердечно-сосудистой системы, что несовместимо с жизнью.
Ген VEGF человека расположен в хромосомном локусе 6р21.3. Кодирующая область охватывает около 14 т.п.н. VEGF существует в нескольких изоформах: VEGF 121, VEGF 145, VEGF 148, VEGF 165, VEGF 183, VEGF 189, VEGF 206, образуемых в результате альтернативного сплайсинга мРНК, которая состоит из 8-ми экзонов. Каждой изоформе VEGF соответствует определенная внеклеточная локализация, основанная на их биохимических различиях в способности связывать гепарин- и гепаран-сульфат. Так, все транскрипты гена VEGF-A у человека содержат экзоны 1-5 и 8, различия же обусловлены альтернативным сплайсингом экзонов 6 и 7.
Долгое время после открытия VEGF фактор рассматривался лишь как индуктор ангиогенеза и потенциальный терапевтический агент для лечения различных заболеваний, сопровождающихся ишемией тканей. Однако с течением времени были получены данные о его нейропротективных свойствах в отношении как нейронов периферической нервной системы, так и центральной [5, 6]. VEGF индуцирует пролиферацию Шванновских клеток, астроцитов, микроглии, нейронов коры головного мозга [7-10]. На модели травмы с пересечением седалищного нерва у крысы было показано значительное увеличение экспрессии VEGF и Flt-1 (рецептор VEGF II типа) в спинном мозге на уровне поясничного отдела позвоночника в ответ на повреждение [11]. Таким образом, появились предпосылки для применения данного фактора роста в качестве дополнительного терапевтического компонента реконструктивного лечения повреждений периферических нервов. Применение VEGF в составе матригеля, заполняющего кондуит, индуцирует спрутинг аксонов, что проявляется увеличением количества аксонов в кондуите на единицу площади поперечного среза [12]. Использование гранул полимолочной кислоты с VEGF в графте, выполненном из аутовены, на модели травмы с протяженным дефектом малоберцового и большеберцового нервов, достоверно улучшает функциональный индекс нервов и увеличение количества миелиновых волокон в графте [13]. VEGF в эксперименте индуцирует деление и миграцию Шванновских клеток в графте в дистальном направлении, что коррелирует с увеличением количества капилляров и миелиновых волокон [14]. Введение VEGF в комбинации с BDNF в кавернозные тела, на модели травмы кавернозного нерва крысы, приводило к восстановлению утраченной иннервации и эректильной функции [15].
Другим фактором, обладающим свойствами индуктора нейрогенеза, является FGF. FGF индуцирует деление, пролиферацию и миграцию Шванновских клеток при травме периферического нерва [16]. В эксперименте на животных было показано, что блокирование рецепторов к FGF, Fgfr1 и Fgfr2, приводит к нейропатии немиелиновых сенсорных волокон и значительному снижению температурной чувствительности [17]. Применение стволовых клеток костного мозга на модели травмы периферического нерва демонстрировало увеличение экспрессии FGF, что, по мнению авторов, индуцировало миграцию и пролиферацию Шванновских клеток [18]. На модели травмы спинного мозга на уровне грудного отдела, использование FGF в составе графта, выполненного из седалищного нерва, способствовало восстановлению двигательной функции верхних конечностей [19]. Таким образом, основываясь на экспериментальных данных, можно предполагать, что использование данных факторов роста в составе комплексной терапии при реконструкции повреждений периферических нервов может быть эффективно.
Однако, как известно, применение факторов роста с терапевтической целью имеет ряд ограничений. При их введении в область повреждения они подвергаются быстрому разрушению, ввиду чего нет возможности поддержания постоянной концентрации для достижения желаемого терапевтического эффекта [20]. В связи с этим вырос интерес к применению генной терапии. По механизму трансфера гена, кодирующего терапевтический агент, можно выделить два основных направления - использование вирусных векторов и невирусных. Однако использование вирусных векторов в клинике, несмотря на высокую трансфекционную активность, ограничено ввиду опасности развития инсерционного мутагенеза, воспалительного ответа и токсичности. Более безопасным методом осуществления генного трансфера является применение плазмидной ДНК. На модели реконструкции кожно-мышечного нерва путем создания анастомоза конец-в-конец и конец-в-бок интраоперационное введение плазмиды, содержащей последовательность гена VEGF, в дистальную культю приводило к достоверному увеличению количества миелиновых волокон на единицу площади поперечного среза участка дистальнее места анастомоза, что коррелировало со значительным увеличением концентрации VEGF в Шванновских клетках [21]. Геннотерапевтическая конструкция может также вводиться параневрально. На модели травмы седалищного нерва plVEGF вводилась внутримышечно и использовалась в комбинации с пленками гиалуроновой кислоты, которыми покрывался анастомоз с целью уменьшения выраженности рубцового процесса. Внутримышечное введение препарата сопровождалось достоверным увеличением амплитуды мышечного ответа и увеличения количества миелиновых волокон дистальнее анастомоза относительно использования их по отдельности [22]. В исследовании Wang F. et al. был показан дозозависимый эффект plVEGF при введении геннотерапевтической конструкции интраневарально после сшивания культей седалищного нерва конец-в-конец. При применении большей дозировки был получен наиболее выраженный прирост нейрофизиологических показателей, меньшее снижение индекса массы икроножной мышцы [23]. Был выявлен синергизм в действии некоторых факторов. Так комбинированное применение плазмиды, кодирующей ген VEGF, и плазмиды, кодирующей ген C-CSF, на модели травмы седалищного нерва продемонстрировало более выраженное увеличение количества миелиновых волокон и капилляров в участке дистальнее анастомоза конец-в-конец, сохранение большего количества нейронов в спинномозговом ганглии, а также раннее восстановление двигательной функции [24]. Однако при использовании геннотерапевтических препаратов in vivo только часть клеток трансфицируется плазмидной ДНК. Вследствие этого шанс того, что клетка будет одновременно трансфицированна двумя разными геннотерапевтическими конструкциями, снижается. Таким образом, является целесообразным объединение генетических последовательностей двух факторов, обладающих синергизмом действия, в составе одной плазмиды. Эффективность использования данного подхода уже была продемонстрирована на животных с моделью контузионной травмы спинного мозга. В ходе данного эксперимента было показано, что на фоне прямого введения в спинной мозг 40 мкг плазмиды, содержащей гены VEGF и FGF2, определяется достоверное увеличение количества капилляров на срезах, сделанных на расстоянии 1,5 см от эпицентра травмы. Также по данным поведенческого теста определялось достоверное улучшение восстановления двигательной функции относительно животных группы сравнения, которые не получали плазмиду с генами VEGF и FGF2. На основании полученных результатов исследователями был сделан вывод, что применение данной двухкассетной плазмиды улучшает васкуляризацию спинного мозга и уменьшает площадь деструкции серого и белого вещества спинного мозга [25]. Однако данные результаты не дают никакого представления о возможной эффективности применения двухкассетной плазмиды с генами VEGF и FGF2 при повреждениях периферических нервов. Это обусловлено тем, что механизм контузионной травмы значительно отличается по патогенезу, степени тяжести от травмы, сопровождающейся невротмезисом, которая наиболее характерна для периферических нервов и преобладает в общей структуре их повреждений. Но самое главное отличие заключается в разном регенеративном потенциале спинного мозга и периферических нервов. Таким образом, необходимо определить, возможно ли применение плазмид с генами факторов роста для эффективного улучшения регенерации периферических нервов.
Перечень иллюстраций
Рис. 1. Повторный доступ. Визуализируется целостный седалищный нерв с аутонервной вставкой.
Рис. 2. Показан вид конечности до операции. По передней и заднебоковой поверхности нижней, средней и верхней трети правого плеча видны посттравматические и послеоперационные втянутые, неправильной формы рубцы.
Рис. 3. Приведен снимок, показывающий отсутствие активных движений в средних фалангах 2-5 пальцев кисти.
Рис. 4. Показано нарушение функции схвата всех пальцев кисти.
Рис. 5. Демонстрация выраженной гипотрофии мышц кисти в зоне иннервации срединного и локтевого нерва, возможность противопоставления 1 пальца только 2 пальцу.
Рис. 6. На фотографии демонстрируется введение рекомбинантной плазмиды рBud(Kan)-coVEGF-coFGF2 в реконструированный нерв (пояснения в тексте).
Рис. 7. На фотографии демонстрируется нанесение фибринового клея с целью избегания вытекания рекомбинантной плазмиды.
Рис. 8. На фотографии демонстрируется атрофия мышц кисти и предплечья.
в) изменения ногтей: гипопластическое;
г) секреторная функция (потоотделение): понижено.
Рис. 9. Захват крючок (ручка сумки).
Рис. 10. Захват в кулак.
Рис. 11. Кончиковый захват (I-III палец).
Рис. 12. Кончиковый захват (I-III палец).
Рис. 13. Кончиковый захват (I-IV палец).
Рис. 14. Приведена диаграмма, отражающая данные электромиографии по мышцам группы тенар.
Рис. 15. Данные электромиографии по мышцам группы гипотенар.
Подробное описание настоящего изобретения
Изобретение относиться к медицине, преимущественная область его применения - нейрохирургия и травматология, лечение травм периферических нервов.
Задачей настоящего изобретения является улучшение результатов реконструктивного лечения при помощи геннотерапевтической конструкции. Основным компонентом двухкассетной оптимизированной рекомбинантной плазмиды pBud(Kan)-coVEGF-coFGF2 является генетическая последовательность генов VEGF и FGF-2.
Сущность изобретения заключается в достижении заявленного технического результата, заключающегося в восстановлении двигательной и чувствительной функции поврежденного нерва при значительном сокращении сроков лечения, в том числе и на отдаленных сроках после травмы, за счет использования с целью индукции регенерации периферического нерва препарата кодон-оптимизированной рекомбинантной плазмиды pBud(Kan)-coVEGF-coFGF2, представленной на SEQ №1.
В качестве ближайшего аналога принят патент RU 3459630 С1 «Способ стимулирования нейрогенерации с помощью генетических конструкций», который описывает способ посттравматической регенерации спинного мозга крысы путем введения двухкассетной плазмиды pBud(Kan)-VEGF-FGF2. Настоящее изобретение направлено на защиту следующих объектов.
Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида pBud(Kan)-coVEGF-coFGF2, содержащая гены, кодирующие VEGF и FGF2, отличающаяся последовательностью нуклеотидов, представленной SEQ №1, для регенерации периферического нерва;
Способ стимуляции регенерации периферического нерва путем введения интра-, пери- и параневрально кодон-оптимизированной рекомбинантной плазмиды pBud(Kan)-coVEGF-coFGF2, представленной последовательностью SEQ №1, интраоперационно или в послеоперационном периоде;
Способ лечения поврежденного нерва человека путем введения в поврежденный участок эффективного количества плазмиды pBud(Kan)-coVEGF-coFGF2 по п. 1.
Наша исследовательская группа, основываясь на опыте разработок геннотерапевтических препаратов, была нацелена на создание эффективного средства для лечения пациентов с повреждениями периферических нервов у человека. Для этого нами были разработаны различные геннотерапевтические конструкции, различающиеся между собой по количеству кодируемых трансгенов, по самим трансгенам, а также нуклеотидным последовательностям одних и тех же трансгенов.
Опыт применения геннотерапевтичеких конструкций с целью улучшения восстановления периферических нервов уже был представлен нами ранее [26]. При оценке эффективности применения плазмиды, кодирующей одновременно гены VEGF и FGF2, на модели травмы периферического нерва с диастазом препарат вводился непосредственно в дистальный, проксимальный конец, а также в аутонервную вставку в равном объеме в суммарной дозе 45 мкг. В качестве экспериментальных животных использовались крысы, которые были разделены на три группы: интактная, исследуемая группа, в которой использовалась геннотерапевтическая конструкция, а также группа сравнения, где вместо исследуемого препарата вводился фосфатный буферный раствор. В качестве критериев оценки динамики регенерации периферического нерва использовались нейрофизиологические показатели, такие как скорость проведения импульса и амплитуда мышечного ответа, а также данные гистологического исследования - количество миелиновых волокон и плотность капиллярной сети. На 56 сутки после введения плазмидной конструкции нейрофизиологические показатели в исследуемой группе были лучше, чем в группе сравнения, однако значительно хуже, чем у животных интактной группы. По данным гистологического исследования количество миелиновых волокон на единицу площади поперечного среза было достоверно больше в исследуемой группе, по сравнению с группой сравнения, однако, несмотря на это, эффективного восстановления функции конечности не наблюдалось. Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что применение плазмидных конструкций, содержащих генетические последовательности факторов роста, оказывает стимулирующее влияние на регенерацию периферического нерва, однако выраженность эффекта недостаточна. По нашему мнению, это связано, в первую очередь, с недостатками самой плазмиды, используемой в представленном исследовании. С целью улучшения свойств геннотерапевтической конструкции был выполнен ряд важных изменений ее структуры. Во-первых, вектор был модифицирован: были удалены последовательности тэгов и заменен ген антибиотикоустойчивости на канамицин. Во-вторых, с целью увеличения эффективности экспрессии были использованы кодон-оптимизированные последовательности кДНК генов VEGF и FGF2 (SEQ №1). После этого нами вновь был проведен ряд экспериментальных исследований на модели травмы периферического нерва с применением кодон-оптимизированной плазмиды. Геннотерапевтические конструкции вводились интраневрально непосредственно после восстановления целостности периферического нерва. Результаты оценивались спустя 60 суток после проведения оперативного вмешательства и введения препарата (Рис. 1).
Из всех плазмидных ДНК, используемых нами, наилучшие результаты показала кодон-оптимизированная двухкассетная плазмида, содержащая генетические последовательности FGF-2 и VEGF.
Основываясь на доклинических данных об эффективности применения геннотерапевтических конструкций pBud(Kan)-VEGF-FGF2 с целью улучшения регенерации периферического нерва, нами был инициировано клиническое исследование, результаты которого представлены ниже.
Пациент Б., 1985 г.р., поступил в травмцентр РКБ МЗ РТ 04.04.11 г. с диагнозом: последствия повреждения срединного и локтевого нерва в средней трети правого плеча (Рис. 2).
Из анамнеза: в 2009 году пациент порезал стеклом плечо на уровне средней трети, при этом были повреждены срединный и локтевой нервы. Незамедлительно был выполнен прямой шов срединного и локтевого нервов, однако в ближайший послеоперационный период как двигательная, так и чувствительная функции полностью отсутствовали. Курс реабилитационной терапии видимых результатов не дал. Далее, спустя 7 месяцев, в 2010 году, в связи с отсутствием положительной динамики восстановления двигательной и чувствительной функций, был выполнен невролиз срединного и локтевого нервов. Наблюдение в послеоперационном периоде показало слабую динамику регенерации, а именно полное отсутствие чувствительности, однако наблюдалось появление двигательной функции, которая характеризовалась незначительным сгибанием пальцев и кисти, в связи с чем было решено выполнить оперативное лечение.
До операции, 21.04.2011 г., пациенту было проведено обследование со следующими результатами:
Трофические нарушения:
а) состояние кожных покровов: окраска обычная, температура пальцев снижена, повышенная зябкость;
б) атрофия мышц кисти и предплечья по сравнению со здоровой рукой: выраженная степень - больше 2 см (рис. 2-3);
в) изменение ногтей: гипопластическое;
г) секреторная функция (потоотделение): понижено.
Исследование двигательной функции
Исследование чувствительности у пациента в автономной зоне иннервации нерва:
Виды захватов кисти: все виды захватов кисти отсутствуют (рис. 3-4).
Диагноз: Повреждение срединного и локтевого нервов в средней трети плеча 2-летней давности. Состояние после шва и невролиза срединного и локтевого нервов (Рис. 5).
26.04.11 произведена операция: невролиз срединного и локтевого нервов с интраневральным введением плазмидной ДНК, кодирующей сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов-2 (FGF2).
Ход операции: Под проводниковой анестезией, после трехкратной обработки операционного поля, произведен дугообразный разрез по внутренней поверхности правого плеча. С техническими трудностями выделены срединный и локтевой нервы. Найдены линии швов. Признаков невромы не обнаружено, однако нервы вовлечены в рубцовый процесс и спаяны с окружающей тканью. Инсулиновой иглой произведено интраневральное введение рекомбинантной плазмиды, содержащей VEGF и FGF-2 по 250 микрограмм в каждый нерв в физиологическом растворе, объемом 2,5 мл. Инъекция осуществлена в зону швов, а также проксимально и дистально на протяжении 10 см (рис. 6). После чего на выделенные нервы нанесен двухкомпонентный фибриновый клей «Тиссукол» объемом 2 мл (Рис. 7). Гемостаз. Ушивание раны. Установлены резиновые выпускники. Асептическая повязка. Наложена гипсовая лонгета. Через месяц после операции пациенту проведено повторное обследование.
Данные объективного исследования 25.05.2011 г.:
Трофические нарушения:
а) состояние кожных покровов: окраска обычная;
б) атрофия мышц кисти и предплечья по сравнению со здоровой рукой в см - выраженная степень - больше 2 см (рис.8);
в) изменения ногтей: гипопластическое;
г) секреторная функция (потоотделение): понижено.
Исследование чувствительности пациента в автономной зоне инерции нерва:
Исследование двигательной функции
Виды захватов кисти: все виды захватов кисти отсутствуют.
Через 6 месяцев после операции пациенту проведено очередное обследование. Данные объективного исследования 15.11.2012 г.:
Трофические нарушения:
а) состояние кожных покровов: окраска обычная;
б) атрофия мышц кисти и предплечья по сравнению со здоровой рукой в см - средней степени 1-2 см выраженная степень - больше 2 см;
в) изменения ногтей: соответствует норме;
г) секреторная функция (потоотделение): нормальное.
Исследование чувствительности пациента в автономной зоне иннервации нерва:
Исследование двигательной функции
Виды захватов кисти:
1) цилиндрический захват - ДА
2) сферический захват - ДА
3) захват крючок (ручка сумки) - ДА
4) захват в кулак - ДА
5) кончиковый захват
а) терминальная оппозиция - ДА,
б) (субтерминальная опозиция - Нет)
6) боковой захват
а) ключевой захват - Нет,
б) (ножничный захват - «сигарета») - Нет.
Через 1 год после операции пациенту проведено очередное обследование. Данные объективного исследования 20.04.2012 г.:
Трофические нарушения:
а) состояние кожных покровов: окраска обычная;
б) атрофия мышц кисти и предплечья по сравнению со здоровой рукой в см - средняя степень 1-2 см;
в) изменения ногтей: соответствует норме;
г) секреторная функция: соответствует норме.
Исследование чувствительности пациента в автономной зоне иннервации нерва:
Исследование двигательной функции
Виды захватов кисти:
1) цилиндрический захват - ДА
2) сферический захват - ДА
3) захват крючок - ДА (рис. 9)
4) захват в кулак - ДА (рис. 10)
5) кончиковый захват: (рис. 11-13)
а) терминальная оппозиция - ДА,
б) субтерминальная опозиция - ДА
6) боковой захват
а) ключевой захват - ДА,
б) ножничный захват - ДА.
Таким образом, результаты клинического исследования свидетельствуют о том, что функция конечности значимо улучшилась спустя год после проведения процедуры интраневрального введения геннотерапевтической конструкции. Улучшение функционального состояния конечности выражалось в снижении выраженности трофических нарушений, появлении всех видов чувствительности в зоне иннервации срединного и локтевого нервов, а также достоверном улучшении двигательной функции. По представленным результатам электромиографии амплитуда мышечного ответа группы мышц тенара в течение 1 года возросла с 0 мВ до 5 мВ и практически достигла показателя на контрлатеральной конечности (рис. 14 и 15).
Эффективность применения двухкассетной плазмиды обусловлена возможностью проведения одновременного трансфера двух генов, VEGF и FGF2, что позволяет эффективнее индуцировать регенерацию периферического нерва. Изменения, внесенные в структуру кодон-оптимизированной плазмиды, позволяют значительно увеличить экспрессию кодируемых генов, благодаря чему создается необходимая терапевтическая концентрация данных факторов роста в эпицентре травмы, что позволяет увеличить эффективность восстановления периферического нерва. Таким образом, мы предполагаем, что достигнутый клинический эффект при применении плазмиды pBud(Kan)-coVEGF-coFGF2 был достигнут благодаря комбинации этих двух факторов и оптимизации их кодонной последовательности.
К сожалению, на данном этапе мы не можем достоверно определить механизм индуцирования регенерации периферического нерва посредством вышеописанной геннотерапевтической конструкции, для этого нам необходимо проведение дальнейших исследований. Однако эффективность применения их с целью улучшения результатов оперативного лечения травм периферических нервов была выявлена и продемонстрирована в условиях эксперимента и клинического наблюдения.
Список ссылочной литературы
1. Hudso, A.R. Timing of peripheral nerve repair: important local and neuropathological factors / A.R. Hudson // Clinical Neurosurgery. - 1977. - Vol. 24. - C. 391-405.
2. Deitch, E.A. Experience with 112 shotgun wounds of the extremities/ E.A. Deitch, W.R. Grimes // J Trauma. - 1984. - Vol. 24. - P. 600-603.
3. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries / C.A. Munro // J. Trauma. - 1998. - Vol. 45. - P. 116-122.
4. Terenghi, G. Peripheral nerve regeneration and neurotrophic factors / G. Terenghi // J. Anat. - 1999. - Vol. 194. - P.
5. Vascular endothelial growthfactor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth, enhancing cell survival and Schwann cell proliferation in the peripheral nervous system / M. Sondell, M. Kanje. G. Lundborg // J Neurosci. - 1999. - Vol. 19, №14 - P. 5731-40.
6. VEGF-A165b is an endogenous neuroprotective splice isoform of vascular endothelial growth factor A in vivo and in vitro / N. Beazley-Long [et al.] // J Pathol. - 2013. - Vol. 183, №3 - P. 918-29.
7. Sondell, M. Vascular endothelial growth factor stimulates Schwann cell invasion and neovascularisation of acelular nerve grafts / M. Sondell, G. Lundborg, M. Kanje // Brain Res. - 1999. - Vol. 846 - P. 219-228.
8. Vascular, glial and neuronal effects of vascular endothelial growth factor in mesencephalic expiants cultures / W.F. Silverman [et al.] // Neuroscience. - 1999. - Vol. 90 - P. 1529-1541.
9. Forstreuter, F. Vascular endothelial growth factor induces chemotaxis and proliferation of microglial cells / F. Forstreuter, R. Lucius, R. Mentlein // J. Neuroimmunol. - 2002. - Vol. 132 - P. 93-98.
10. Zhu, Y. Vascular endothelial growth factor promotes proliferation of cortical neuron precursors by regulating E2F expression / Y. Zhu [et al.] // J FASEB. - 2003. Vol. 17 - P. 186-193.
11. Induction of VEGF and its Flt-1 receptor after sciatic nerve crush injury / R.R. Islamov [et al.] // Neuroreport. - 2004. Vol. 15, №13 - P. 2117-21.
12. Effects of vascular endothelial growth factor on nerve regeneration in acellular nerve grafts / J.M. Rovak [et al.] // J Reconstr Microsurg. - 2004. Vol. 20, №1 - P. 53-58.
13. Vascular endothelial growth factor-loaded poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres-induced lateral axonal sprouting into the vein graft bridging two healthy nerves: nerve graft préfabrication using controlled release system / H. Karagoz [et al.] // J Microsurgery. - 2012. Vol. 32, №8 - P. 635-41.
14. Sondell, M. Vascular endothelial growth factor stimulates Schwann cell invasion and neovascularization of acellular nerve grafts // M. Sondell, G. Lundborg, M. Kanje // Brain Res. - 1999. Vol. 846, №2 - P. 219-28.
15. The effect of vascular endothelial growth factor and brain-derived neurotrophic factor on cavernosal nerve regeneration in a nerve-crush rat model / PS. Hsieh [et al.] // BJU Int. - 2003. Vol. 92, №4 - P. 470-5.
16. Grothe, C. Physiological function and putative therapeutic impact of the FGF-2 system in peripheral nerve regeneration-lessons from in vivo studies in mice and rats / K. Haastert, J. Jungnickel, C. Grothe // Brain Res Rev. - 2006. Vol. 51 - P. 293-299.
17. Furushol, M. Disruption of Fibroblast growth factor receptor signaling in non-myelinating Schwann cells causes sensory axonal neuropathy and impairment of thermal pain sensitivity / М. Furushol [et al.] // J Neurosci. - 2009. Vol. 29, №6 - P. 1608-1614.
18. Tulio, V.R. Bone marrow-derived fibroblast growth factor-2 induces glial cell proliferation in the regenerating peripheral nervous system / V.R. Tulio [et al.] // Molecular Neurodegeneration. - 2012. Vol. 7, №34 - P. 1-17.
19. Sciatic nerve grafting and inoculation of FGF-2 promotes improvement of motor behavior and fiber regrowth in rats with spinal cord transaction / F.P. Guzen, [et al.] // Restorative Neurology and Neuroscience. - 2012. Vol. 30 - P. 265-275.
20. Zeng, W. Ionically cross-linked chitosan microspheres for controlled release of bioactive nerve growth factor / W. Zeng [et al.] // Int J Pharm. - 2011. Vol. 421 - P. 283-290.
21. Enhancement of musculocutaneous nerve reinnervation after vascular endothelial growthfactor (VEGF) gene therapy / P. Haninec [et al.] // BMC Neuroscience. - 2012. Vol. 13, № 57 - P.
22. Effect of VEGF gene therapy and hyaluronic acid film sheath on peripheral nerve regeneration / F. Zor [et al.] // - 2014. Vol. 34, №3 - P. 209-16.
23. Favorable effect of local VEGF gene injection on axonal regeneration in the rat sciatic nerve / C. Fu [et al.] // J Huazhong University Scince Technology. - 2007. Vol. 2 - P. 186-9.
24. Double gene therapy with granulocyte colony-stimulating factor and vascular endothelial growth factor acts synergistically to improve nerve regeneration and functional outcome after sciatic nerve injury in mice / F. Pereira Lopes [et al.] // Neuroscience. - 2013. Vol. 230 - P. 184-97.
25. Пат. 2459630 РФ, МПК A61K 48/00, A61P 25/28, C12N 15/79, C1. Способ стимулирования нейрогенерации с помощью генетических конструкций / Ю.А. Челышев; Федеральное государственное автономное образовательное Учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет". - №2011116853/10; 27.04.2011; опубл. 27.10.2009, Бюл. №30. - 11 с.
26. Стимуляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы с помощью плазмиды, экспрессирующей сосудистый эндотелиальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов. / Р.Ф. Масгутов [и др.] // Клеточные технологии и тканевая инженерия. - 2011. - 6(3): 67-70.
Последовательность двухкассетной плазмиды pBud(Kan)-coVEGF165-coFGF2 SEQ №1:
<110> ООО «НекстГен», OOO «NextGen»
<120> Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<211> 5701
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> expression plasmid
gcgcgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattag | 60 |
ttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggct | 120 |
gaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgc | 180 |
caatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttgg | 240 |
cagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaat | 300 |
ggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtaca | 360 |
tctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggc | 420 |
gtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatggga | 480 |
gtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccat | 540 |
tgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggc | 600 |
taactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggaga | 660 |
cccaagcttacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaccatggcagccgggagcatcacca | 720 |
cgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgccttcccgcccggccacttcaagg | 780 |
accccaagcggctgtactgcaaaaacgggggcttcttcctgcgcatccaccccgacggcc | 840 |
gagttgacggggtccgggagaagagcgaccctcacatcaagctacaacttcaagcagaag | 900 |
agagaggagttgtgtctatcaaaggagtgtgtgctaaccgttacctggctatgaaggaag | 960 |
atggaagattactggcttctaaatgtgttacggatgagtgtttcttttttgaacgattgg | 1020 |
aatctaataactacaatacttaccggtcaaggaaatacaccagttggtatgtggcactga | 1080 |
aacgaactgggcagtataaacttggatccaaaacaggacctgggcagaaagctatacttt | 1140 |
ttcttccaatgtctgctaagagctgaacccagctttcttgtacaaagtggtgtttgatcc | 1200 |
ccgggaattcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgc | 1260 |
agtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccatta | 1320 |
taagctgcaataaacaagttggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctgg | 1380 |
aggatcatccagccggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcg | 1440 |
gcggtggaatcgaaatctcgtagcacgtggtctgacgctcagtggaacgacgcgtaactc | 1500 |
acgttaagggattttggtcatgagcttgcgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctctgc | 1560 |
cagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaac | 1620 |
tgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaat | 1680 |
gaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcg | 1740 |
attccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggtta | 1800 |
tcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgc | 1860 |
atttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgca | 1920 |
tcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctg | 1980 |
ttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgca | 2040 |
tcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgtttttccg | 2100 |
gggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtc | 2160 |
ggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattg | 2220 |
gcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaag | 2280 |
cgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaa | 2340 |
tcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgacgtttcccgttgaatatggctcata | 2400 |
acaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatattatt | 2460 |
ttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacgggccagagctgctcgtcgagc | 2520 |
tagcttcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccg | 2580 |
agaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaa | 2640 |
actgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgt | 2700 |
atataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacac | 2760 |
aggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcg | 2820 |
tgccttgaattacttccacctggctccagtacgtgattcttgatcccgagctggagccag | 2880 |
gggcgggccttgcgctttaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgg | 2940 |
gcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcga | 3000 |
taagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaaga | 3060 |
tagtcttgtaaatgcgggccaggatctgcacactggtatttcggtttttgggcccgcggc | 3120 |
cggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcg | 3180 |
gccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcct | 3240 |
cgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgc | 3300 |
gtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctccagggggctcaaaatggaggacgcg | 3360 |
gcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctc | 3420 |
agccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagtt | 3480 |
ctggagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtt | 3540 |
tccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctc | 3600 |
gttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggt | 3660 |
tcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaacacgtggtcgcggccgcaagcttca | 3720 |
ccatgaactttctgctgtcttgggtgcattggagccttgccttgctgctctacctccacc | 3780 |
atgccaagtggtcccaggctgcacccatggcagaaggaggagggcagaatcatcacgaag | 3840 |
tggtgaagttcatggatgtctatcagcgcagctactgccatccaatcgagaccctggtgg | 3900 |
acatcttccaggagtaccctgatgagatcgagtacatcttcaagccatcctgtgtgcccc | 3960 |
tgatgcgatgcgggggctgctgcaatgacgagggcctggagtgtgtgcccactgaggagt | 4020 |
ccaacatcaccatgcagattatgcggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagaga | 4080 |
tgagcttcctacagcacaacaaatgtgaatgcagaccaaagaaagatagagcaagacaag | 4140 |
aaaatccctgtgggccttgctcagagcggagaaagcatttgtttgtacaagatccgcaga | 4200 |
cgtgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaggcgaggcagcttgagttaa | 4260 |
acgaacgtacttgcagatgtgacaagccgaggcggtgatctagagtttaaacccgctgat | 4320 |
cagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgcctt | 4380 |
ccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat | 4440 |
cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagg | 4500 |
gggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctg | 4560 |
aggcggaaagaaccagtggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcagga | 4620 |
aagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctg | 4680 |
gcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcag | 4740 |
aggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctc | 4800 |
gtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcg | 4860 |
ggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgtt | 4920 |
cgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc | 4980 |
ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagcc | 5040 |
actggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtgg | 5100 |
tggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagcca | 5160 |
gttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagc | 5220 |
ggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagat | 5280 |
cctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggatt | 5340 |
ttggtcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgt | 5400 |
ttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgt | 5460 |
ctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcggg | 5520 |
tgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatata | 5580 |
tgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgc | 5640 |
cattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgcc | 5700 |
a |
Основные элементы вектора:
Ген устойчивости к канамицину- 1469-2511
кДНК гена FGF2 (оптимизированная по кодонному составу) - 699-1166
кДНК гена VEGF165 (оптимизированная по кодонному составу) - 3723-4297
Последовательность Козак - 695-698 и 3719-3722.
Claims (3)
1. Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида pBud(Kan)-coVEGF-coFGF2, содержащая гены, кодирующие VEGF и FGF2, отличающаяся последовательностью нуклеотидов, представленной SEQ №1, для регенерации периферического нерва.
2. Способ индукции регенерации периферического нерва путем введения интра-, пери- и параневрально кодон-оптимизированной рекомбинантной плазмиды pBud(Kan)-coVEGF-coFGF2, представленной последовательностью SEQ №1, интраоперационно или в послеоперационном периоде.
3. Способ лечения поврежденного нерва человека путем введения в поврежденный участок эффективного количества плазмиды pBud(Kan)-coVEGF-coFGF2 по п. 1.
Priority Applications (11)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014137218/10A RU2558294C1 (ru) | 2014-09-16 | 2014-09-16 | Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека |
BR112017005310-1A BR112017005310B1 (pt) | 2014-09-16 | 2015-08-27 | Plasmídeo recombinante otimizado para regeneração de nervo periférico |
CA2960371A CA2960371C (en) | 2014-09-16 | 2015-08-27 | Codon-optimized recombinant plasmid encoding vegf and fgf-2 and methods to stimulate peripheral nerve regeneration and treat nerve damage in humans |
PCT/RU2015/000545 WO2016163912A1 (ru) | 2014-09-16 | 2015-08-27 | Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека |
CN201580050094.6A CN107087417A (zh) | 2014-09-16 | 2015-08-27 | 密码子优化的重组质粒、刺激周围神经再生的方法以及治疗人类中的神经损伤的方法 |
JP2017512743A JP6540797B2 (ja) | 2014-09-16 | 2015-08-27 | コドン最適化組み換えプラスミド、末梢神経再生の刺激方法、及び損傷ヒト神経の治療様式 |
EP15888619.2A EP3196307B1 (en) | 2014-09-16 | 2015-08-27 | Codon-optimized recombinant plasmid, containing vegf and fgf2-coding genes, for use in peripheral nerve regeneration |
MX2017003377A MX2017003377A (es) | 2014-09-16 | 2015-08-27 | Plasmido recombinante con codon optimizado, tecnica de estimulacion para regenracion de nervio periferico, modalidad de tratamiento para nervio humano dañado. |
AU2015390821A AU2015390821B2 (en) | 2014-09-16 | 2015-08-27 | Codon-optimized recombinant plasmid, method of stimulating peripheral nerve regeneration, and method of treating nerve damage in humans |
US15/460,668 US20170189488A1 (en) | 2014-09-16 | 2017-03-16 | Codon-optimized recombinant plasmid, method of stimulating peripheral nerve regeneration, and method of treating nerve damage in humans |
US15/652,792 US10434145B2 (en) | 2014-09-16 | 2017-07-18 | Codon-optimized recombinant plasmid, method of stimulating peripheral nerve regeneration, and method of treating nerve damage in humans |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014137218/10A RU2558294C1 (ru) | 2014-09-16 | 2014-09-16 | Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2558294C1 true RU2558294C1 (ru) | 2015-07-27 |
Family
ID=53762789
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014137218/10A RU2558294C1 (ru) | 2014-09-16 | 2014-09-16 | Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20170189488A1 (ru) |
EP (1) | EP3196307B1 (ru) |
JP (1) | JP6540797B2 (ru) |
CN (1) | CN107087417A (ru) |
AU (1) | AU2015390821B2 (ru) |
BR (1) | BR112017005310B1 (ru) |
CA (1) | CA2960371C (ru) |
MX (1) | MX2017003377A (ru) |
RU (1) | RU2558294C1 (ru) |
WO (1) | WO2016163912A1 (ru) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2639175C1 (ru) * | 2016-11-14 | 2017-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" | Способ индукции регенерации периферического нерва |
EA033539B1 (ru) * | 2015-12-18 | 2019-10-31 | Federal State Autonomous Educational Institution Of Higher Professional Education Kazan Volga Region | Способ стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани при ее повреждении методом генной терапии с использованием видоспецифичных генов белковых факторов vegf и fgf2 в ветеринарии и генетическая конструкция для реализации заявленного способа |
RU2762855C1 (ru) * | 2021-04-08 | 2021-12-23 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) | Генно-клеточный везикулярный терапевтический препарат и способ терапии рассеянного склероза посредством трансплантации генно-клеточного везикулярного терапевтического препарата |
RU2769474C2 (ru) * | 2017-01-20 | 2022-04-01 | Атара Байотерапьютикс, Инк. | Способы лечения рассеянного склероза с использованием аутологичных т-клеток |
US11478508B2 (en) | 2016-05-25 | 2022-10-25 | The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research | Methods of immunotherapy |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2459630C1 (ru) * | 2011-04-27 | 2012-08-27 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет" (ФГАОУ ВПО КФУ) | Способ стимулирования нейрогенерации с помощью генетических конструкций |
RU2517117C2 (ru) * | 2012-11-26 | 2014-05-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России) | Способ стимулирования регенерации нерва с помощью наноструктурированного матрикса и генетических конструкций |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2561714A1 (en) * | 2004-04-08 | 2005-10-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treating neuropathic and neurodegenerative conditions |
US9169309B2 (en) * | 2011-03-01 | 2015-10-27 | Humanzyme Inc. | Thermostable variants of fibroblast growth factors |
RU2542385C2 (ru) * | 2012-08-31 | 2015-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" | Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, фармацевтическая композиция, полученная этим способом, и способ лечения ишемии тканей и/или органов человека |
-
2014
- 2014-09-16 RU RU2014137218/10A patent/RU2558294C1/ru active
-
2015
- 2015-08-27 WO PCT/RU2015/000545 patent/WO2016163912A1/ru active Application Filing
- 2015-08-27 BR BR112017005310-1A patent/BR112017005310B1/pt active IP Right Grant
- 2015-08-27 CA CA2960371A patent/CA2960371C/en active Active
- 2015-08-27 MX MX2017003377A patent/MX2017003377A/es unknown
- 2015-08-27 CN CN201580050094.6A patent/CN107087417A/zh active Pending
- 2015-08-27 JP JP2017512743A patent/JP6540797B2/ja active Active
- 2015-08-27 AU AU2015390821A patent/AU2015390821B2/en active Active
- 2015-08-27 EP EP15888619.2A patent/EP3196307B1/en active Active
-
2017
- 2017-03-16 US US15/460,668 patent/US20170189488A1/en not_active Abandoned
- 2017-07-18 US US15/652,792 patent/US10434145B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2459630C1 (ru) * | 2011-04-27 | 2012-08-27 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет" (ФГАОУ ВПО КФУ) | Способ стимулирования нейрогенерации с помощью генетических конструкций |
RU2517117C2 (ru) * | 2012-11-26 | 2014-05-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России) | Способ стимулирования регенерации нерва с помощью наноструктурированного матрикса и генетических конструкций |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
МАСГУТОВ Р.Ф. "Стимуляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы с помощью плазмиды, экспрессирущей сосудистый эндотелиальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов" том 4, N3, 2011, стр.67-69. * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA033539B1 (ru) * | 2015-12-18 | 2019-10-31 | Federal State Autonomous Educational Institution Of Higher Professional Education Kazan Volga Region | Способ стимуляции репаративного ангиогенеза и регенерации соединительной ткани при ее повреждении методом генной терапии с использованием видоспецифичных генов белковых факторов vegf и fgf2 в ветеринарии и генетическая конструкция для реализации заявленного способа |
US11478508B2 (en) | 2016-05-25 | 2022-10-25 | The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research | Methods of immunotherapy |
RU2639175C1 (ru) * | 2016-11-14 | 2017-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" | Способ индукции регенерации периферического нерва |
RU2769474C2 (ru) * | 2017-01-20 | 2022-04-01 | Атара Байотерапьютикс, Инк. | Способы лечения рассеянного склероза с использованием аутологичных т-клеток |
RU2762855C1 (ru) * | 2021-04-08 | 2021-12-23 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) | Генно-клеточный везикулярный терапевтический препарат и способ терапии рассеянного склероза посредством трансплантации генно-клеточного везикулярного терапевтического препарата |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112017005310A2 (pt) | 2018-02-14 |
US20170319658A1 (en) | 2017-11-09 |
BR112017005310B1 (pt) | 2023-10-03 |
JP2017532021A (ja) | 2017-11-02 |
US10434145B2 (en) | 2019-10-08 |
JP6540797B2 (ja) | 2019-07-10 |
AU2015390821A1 (en) | 2017-05-04 |
CA2960371A1 (en) | 2016-10-13 |
EP3196307B1 (en) | 2018-12-26 |
CA2960371C (en) | 2019-06-25 |
WO2016163912A1 (ru) | 2016-10-13 |
US20170189488A1 (en) | 2017-07-06 |
EP3196307A1 (en) | 2017-07-26 |
MX2017003377A (es) | 2017-11-22 |
CN107087417A (zh) | 2017-08-22 |
AU2015390821B2 (en) | 2018-08-09 |
EP3196307A4 (en) | 2018-04-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Raimondo et al. | Combined delivery of VEGF and IGF-1 promotes functional innervation in mice and improves muscle transplantation in rabbits | |
Lee et al. | Peripheral nerve grafts and aFGF restore partial hindlimb function in adult paraplegic rats | |
RU2558294C1 (ru) | Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека | |
Sun et al. | The effect of collagen-binding NGF-β on the promotion of sciatic nerve regeneration in a rat sciatic nerve crush injury model | |
Ramer et al. | Setting the stage for functional repair of spinal cord injuries: a cast of thousands | |
Cao et al. | The use of laminin modified linear ordered collagen scaffolds loaded with laminin-binding ciliary neurotrophic factor for sciatic nerve regeneration in rats | |
Cao et al. | Induction of rat facial nerve regeneration by functional collagen scaffolds | |
Rochkind | Photobiomodulation in neuroscience: a summary of personal experience | |
KR20190126894A (ko) | 치료법에서 사용하기 위한 보툴리눔 신경독소 | |
Wei et al. | Lumbricus extract promotes the regeneration of injured peripheral nerve in rats | |
Siddiqui et al. | Newly regenerated axons via scaffolds promote sub-lesional reorganization and motor recovery with epidural electrical stimulation | |
Karagoz et al. | Comparison of regeneration results of prefabricated nerve graft, autogenous nerve graft, and vein graft in repair of nerve defects | |
RU2639175C1 (ru) | Способ индукции регенерации периферического нерва | |
Huang et al. | Sensory and motor recovery after repairing transected cervical roots | |
Siddiqui et al. | Newly regenerated axons through a cell-containing biomaterial scaffold promote reorganization of spinal circuitry and restoration of motor functions with epidural electrical stimulation | |
Osbourne | Peripheral nerve injury and repair | |
JP5849109B2 (ja) | 神経保護効果のある化合物 | |
Foo et al. | Photobiomodulation after neurotization (oberlin procedure) in brachial plexus injury: a randomized control trial | |
Dow et al. | Electrical stimulation prior to delayed reinnervation does not enhance recovery in muscles of rats | |
Gunay et al. | The effectiveness of tetanus toxin on sciatic nerve regeneration: a preliminary experimental study in rats | |
RU2811302C1 (ru) | Способ восстановления нерва с помощью имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шелка, в эксперименте | |
RU2663470C2 (ru) | Способ стимулирования ангиогенеза с использованием генетически модифицированных клеток крови пуповины | |
WO2024080311A1 (ja) | 遺伝子導入法、遺伝子治療法、及び組織再生法 | |
Firat et al. | Comparison of the effects of PRP and hyaluronic acid in promoting peripheral nerve regeneration | |
Midha et al. | Technical aspects of nerve repair |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20171116 |