RU2811302C1 - Способ восстановления нерва с помощью имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шелка, в эксперименте - Google Patents

Способ восстановления нерва с помощью имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шелка, в эксперименте Download PDF

Info

Publication number
RU2811302C1
RU2811302C1 RU2023128004A RU2023128004A RU2811302C1 RU 2811302 C1 RU2811302 C1 RU 2811302C1 RU 2023128004 A RU2023128004 A RU 2023128004A RU 2023128004 A RU2023128004 A RU 2023128004A RU 2811302 C1 RU2811302 C1 RU 2811302C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
nerve
silk fibroin
sutured
artificial
experiment
Prior art date
Application number
RU2023128004A
Other languages
English (en)
Inventor
Владимир Петрович Орлов
Юлия Александровна Нащекина
Алексей Юрьевич Ништ
Павел Геннадьевич Толкач
Борис Леонтьевич ГАВРИЛЮК
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) filed Critical Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА)
Application granted granted Critical
Publication of RU2811302C1 publication Critical patent/RU2811302C1/ru

Links

Abstract

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к нейрохирургии, тканевой инженерии. Перед проведением хирургических манипуляций крысам выполняют неингаляционную анестезию путём введения раствора золетила. Затем в области левого бедра выполняют разрез кожи длиной 1,0см. После этого тупым и острым путем выделяют седалищный нерв. Пересекают левый седалищный нерв на уровне середины бедра, концы его подшивают к концам искусственного нерва в виде полимерной трубки из поликапролактона, заполненной коллагеновым гелем и нитями фиброина шелка длиной 10 мм, двумя швами. Затем рану послойно ушивают, а прорастание нерва контролируют через 1,5 и 3,0 месяца. Способ позволяет восстановить нерв, с помощью искусственного имплантата, который увеличивает уровень прорастания нерва до 70-80%, что в свою очередь обеспечивает быстрое восстановление активных движений в конечности и отсутствие выраженных трофических нарушений. 4 ил., 1 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности, к моделированию тканезаместительной терапии и тканевой инженерии, а также нейрохирургии.
Травматическое повреждение периферических нервов до сих пор остается одной из значимых проблем современной нейрохирургии из-за высоких цифр неудовлетворительных результатов лечения. В России ежегодно до 7 тысяч пациентов нуждаются в хирургическом вмешательстве по поводу травмы периферической нервной системы. Исходы этого лечения оставляют желать лучшего. Пациенты зачастую выписываются из стационара с грубым неврологическим дефицитом, что приводит в последующем к инвалидизации. Например, уровень благоприятного результата хирургического лечения при травме седалищного нерва, не смотря на значимый прогресс в медицине, до сих пор остается в пределах 20%.
Известно, что периферическая нервная система обладает хорошим посттравматическим регенераторным потенциалом, однако проблема высокой степени инвалидизации больных до сих пор не решена [Lee S . K ., Wolfe S .W . Peripheral nerve injury and repair . J . Am . Acad . Orthop . Surg . 2000; 8(4): 243-52 . Navarro X . Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview . Eur . J . Neurosci . Epub ahead of print . 2015 .]. В значительной степени это связано с нерешенностью задачи преодоления протяженных диастазов нерва.
Неудовлетворительные результаты лечения травм периферических нервов, связаны с изменениями, описанными еще в 1850 г. A. Waller. Сразу после повреждения нерва запускаются процессы его дегенерации. Основной проблемой при регенерации нерва является формирование грубой рубцовой ткани в месте повреждения нерва, соединительная ткань полностью блокирует прорастание нервных волокон из проксимального конца нерва в дистальный.
С целью предотвращения прорастания соединительной ткани между концами повреждённого нерва активно разрабатываются кондуиты нерва из биосовместимых материалов, которые предназначены для направления и поддержания регенерации нервных волокон.
Среди тубулированных тканеинженерных конструкций кондуит из поли (е-капролактона) (PCL) обладает оптимальными механическими свойствами и способностью к биодеградации [ Николаев С. И., Галлямов А. Р., Мамин Г. В. и др. Кондуит нерва на основе поли(е-капролактона) и локальная доставка генов vegf и fgf2 стимулируют нейрорегенерацию . Клеточные технологии в биологии и медицине 2014; 1: 44-49. Chang С. J. The effect of pulse-released nerve growth factor from genipin-crosslinked gelatin in schwann cell-seeded polycaprolactone conduits on large-gap peripheral nerve regeneration. Tissue Eng. Part A. 2009; 15(3): 547-57. ]
Среди полимеров природного происхождения особый интерес представляют такие белки внеклеточного матрикса, как коллаген и фибрин, а также белок природного происхождения фиброин шелка (ФШ). Наиболее интенсивно используемым фиброином в тканевой инженерии является шелк, полученный от тутового шелкопряда Bombyx mori, для которого характерно высокое содержание глицина и аланина (77 %), а также серина и тирозина (11 %) (Кричевский, 2001). Молекулярная масса ФШ колеблется от 25 кДа для «легких» цепей до 350 кДа для «тяжелых», которые связаны между собой дисульфидными связями (Altman, 2003).
Известен токопроводящий полимерный композит, состоящий из поликапролактонового фумарата и полипиррола (электропроводящего полимера), предназначенный для регенерации нерва. При пропускании сквозь нерв тока в присутствии упомянутого композита наблюдалось восстановление нервного волокна в направлении приложенного тока (US 2013331869 A1, A61F 2/04, 12.12.2013).
Ограничение в использовании описанного композита заключается в том, что по нему не может регенерировать поврежденный нерв, так как нет субстрата, по которому могут прорастать аксоны и его нельзя использовать в качестве больших (больше 5см) отсутствующих участков нерва, принимающих или передающих сигнал органам.
Известен медицинский искусственный трансплантат ствола нерва, включающий оболочку или оболочку со вставленным в нее строительным волокном, при этом оболочка содержит множество микропор, и оболочка и/или строительное волокно содержат фиброин шелка (ЕР 1938774 A1, A61F 2/04, 02.07.2008).
Ограничение в использовании описанного трансплантата заключается в отсутствии биодеградации его составляющих, а также внутри кондуита нет содержимого.
Золотым стандартом замещения больших дефектов нервных стволов в настоящее время является аутотрансплантат подкожного нерва голени. К сожалению, эта операция более травматичная, трудоемкая, с дополнительным косметическим дефектом (при взятии аутотрансплантатов), не найдено универсального и достоверного способа идентификации одноименных пучков на обоих концах нерва. Окончательно не доказано, что лучше для исхода - выполнить микрохирургический эпиневральный и межпучковый шов ценой обширной мобилизации, приданием соответствующего положения в суставах конечности или прибегнуть к межпучковой аутопластике? Но главным является не полное восстановление функции нерва.
В основу изобретения положена задача создания способа применения медицинского искусственного имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шёлка, в эксперименте, который позволяет более точно определить возможность применения данного вида трансплантата.
Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе применения медицинского искусственного имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шёлка, в эксперименте, перед проведением хирургических манипуляций крысам выполняют неингаляционную анестезию путём введения раствора 20 % золетила, затем в области левого бедра выполняют разрез кожи длиной 1,0см, затем тупым и острым путем выделяют седалищный нерв, левый седалищный нерв на уровне середины бедра пересекают, концы его подшивают к концам искусственного нерва в виде полимерной трубки из поликапролактона, заполненной коллагеновым гелем и нитями фиброина шелка длиной 10 мм двумя швами, затем рану послойно ушивают; прорастание нерва контролируют через 1,5 и 3,0 месяца.
Применение нами нитей фиброина шёлка (аналог лент Бюгнера) внутри имплантата даёт возможность аксонам проксимального конца нерва по ним, как по направляющим прорастать к дистальному концу этого нерва, в результате чего увеличивается возможность восстановления нерва около 70-80% по сравнению с «золотым стандартом» эпиневральным швом который предполагает прорастание нерва до 50%.
Изобретение поясняется фиг.1, на котором представлено фото внешнего вида искусственного имплантата. а) трубка из поликапролактона с коллагеновым гелем; б) волокна фиброина – щелка. На фиг.2 показано фото раны крысы в эксперименте поэтапного замещения дефекта нервного ствола биорезорбируемой полимерной матрицей; на фиг.2а показан выделенный участок седалищного нерва крысы, на фиг.2б показано иссечение фрагмента седалищного нерва, на фиг.2в показан искусственный нерв, вшитый в дефект нерва. На фиг.3 представлена подготовка и взятие седалищного нерва на гистологическое исследование; на фиг.3а представлено фото проросшего нерва и кондуита в ране, на фиг.3б показано фото проросшего нерва подготовленного к гистологическому исследованию. На фиг.4 представлены данные гистологического исследования, показывающие полное прорастание нерва; на фиг.4а показан проксимальный участок нерва, поперечный срез Х100 окраска (гематоксилин-эозин), на фиг.4б показан дистальный участок нерва, поперечный срез Х400 окраска (гематоксилин-эозин), на фиг.4в показан проксимальный участок нерва в кондуите, продольный срез Х100 окраска (гематоксилин-эозин), на фиг.4г показан дистальный участок нерва в кондуите, продольный срез Х100 окраска (гематоксилин-эозин), на фиг.4д показан дистальный участок нерва в кондуите, продольный срез Х400 окраска по (Маллори), на фиг.4е показан дистальный участок нерва в кондуите, продольный срез Х100 окраска по (Маллори).
В своих экспериментах мы применяли созданный нами искусственный нерв. Искусственный нерв представляет собой полимерную трубку, заполненную коллагеновым гелем и нитями фиброина шелка. Полимерную трубку готовили по ранее запатентованной методике (Нащекина Ю.А., Юдинцева Н.М., Никонов П.О., Блинова М.И., Нащекин А.В., Москалюк О.О., Юдин В.Е., Михайлова Н.А. патент на изобретение «Способ получения биорезорбируемого сосудистого протеза малого диаметра» RU 2 709 621 C1 от 19.12.2019). Она изготавливалась из поли (ε-капролактона) со средней молекулярной массой (Sigma, США). Диаметр полимерной трубки, возможно, варьировать в зависимости от потребностей. Толщина трубки составила 50-100 мкм. Длина полимерной трубки также может варьировать в зависимости от размера повреждения нерва. В полимерную трубку вводятся нативные нити фиброина шелка тутового шелкопряда. Диаметр нитей фиброина шелка составляет порядка 10 мкм (Нащекина Ю.А., Никонов П.О., Юдинцева Н.М., Нащекин А.В., Лихачёв А.И., Москалюк О.А., Юдин В.Е., Блинова М.И. «Взаимодействие мезенхимных клеток костного мозга с нативными волокнами фиброина шёлка», Цитология, 2016, Том 58, № 11, стр. 843-849.). Трубки с нитями заполняли раствором коллагена с концентрацией 2 мг/мл. Раствор полимеризовался в гель внутри трубки. Все процедуры проводили в стерильных условиях с предварительно простерилизованными полимерными трубками и нитями фиброина шелка. Готовую конструкцию можно использовать как сразу после приготовления, так и спустя 1-3 месяц после приготовления. При длительном хранении коллагеновый гель высыхает, но при выдерживании в физиологическом растворе повторно частично набухает, что позволяет создавать аксонам благоприятную среду для миграции (Фиг.1).
Способ экспериментального применения искусственного нерва
Исследование проводили на крысах-самцах (n= 5) массой 180-220 грамм, полученных из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» (пос. Рапполово Ленинградской обл.).
В работе руководствовались требованиями нормативно-правовых актов о порядке экспериментальной работы с использованием животных, в том числе по гуманному отношению к ним [1, 2]. Перед проведением хирургических манипуляций крысам выполняли неингаляционную анестезию путём введения раствора золетила («Virbac S.A.», Франция). Для введения в анестезию внутрибрюшинно вводили раствор золетила в дозе 20 мг/кг, при этом состояние седации развивалось через 6-7 мин. Для поддержания анестезии золетил вводили однократно подкожно в дозе 10 мг/кг. В области левого бедра выполняли раз кожи длиний 1,0см, затем тупым и острым путем выделяли седалищный нерв. Левый седалищный нерв на уровне середины бедра пересекали, концы его подшивали к концам искусственного нерва длинной 10 мм двумя швами. (Фиг.2а,б,в). Рану послойно ушивали. Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму. Контроль прорастания нерва контролировали через 1,5 и 3,0 месяца. Во время наблюдения за крысами отмечалось быстрое восстановление активных движений в конечности и отсутствие выраженных трофических нарушений. Кроме того через 1,5 месяца при ЭНМГ регистрировался М-ответ икроножной мышцы, равный 50% аналогичного ответа с контрольной (здоровой стороны). Через 3 месяца животных выводили из эксперимента и готовили препараты для гистологического исследования (Фиг.3а,б). Результаты гистологического исследования представлены на Фиг.4а-е.
1. ГОСТ 33044-2014 Принципы лабораторной практики GLP. – М. : Стандартинформ, 2015. – 16 с.
2. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях НП объединение специалистов по работе с лабораторными животными. – СПб.: Rus–LASA, 2012. – 48 с.

Claims (1)

  1. Способ восстановления нерва с помощью имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шёлка, в эксперименте, отличающийся тем, что перед проведением хирургических манипуляций крысам выполняют неингаляционную анестезию путём введения раствора золетила, затем в области левого бедра выполняют разрез кожи длиной 1,0 см, затем тупым и острым путем выделяют седалищный нерв, левый седалищный нерв на уровне середины бедра пересекают, концы его подшивают к концам искусственного нерва в виде полимерной трубки из поликапролактона, заполненной коллагеновым гелем и нитями фиброина шелка длиной 10 мм двумя швами, затем рану послойно ушивают; прорастание нерва контролируют через 1,5 и 3,0 месяца.
RU2023128004A 2023-10-31 Способ восстановления нерва с помощью имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шелка, в эксперименте RU2811302C1 (ru)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2811302C1 true RU2811302C1 (ru) 2024-01-11

Family

ID=

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018025186A1 (en) * 2016-08-01 2018-02-08 Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies & Therapies A4Tec - Associação Nerve guidance conduits, methods of production and uses thereof
RU2805813C1 (ru) * 2023-05-23 2023-10-24 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук Биорезорбируемый имплантат для регенерации периферических нервов

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018025186A1 (en) * 2016-08-01 2018-02-08 Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies & Therapies A4Tec - Associação Nerve guidance conduits, methods of production and uses thereof
RU2805813C1 (ru) * 2023-05-23 2023-10-24 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук Биорезорбируемый имплантат для регенерации периферических нервов

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
АГАПОВА О.И. Биоинженерные конструкции на основе фиброина шелка и спидроина для регенеративной медицины и тканевой инженерии (обзор). Современные технологии в медицине 2017, том 9 N 2: 190-206. ASSAF K et al, Sciatic nerve repair using poly(ε-caprolactone) tubular prosthesis associated with nanoparticles of carbon and graphene. Brain Behav. 2017 Jun 30;7(8). *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20180132852A1 (en) Use of epineural sheath grafts for neural regeneration and protection
Panagopoulos et al. The present and future for peripheral nerve regeneration
Meyer et al. Chitosan-film enhanced chitosan nerve guides for long-distance regeneration of peripheral nerves
Alluin et al. Functional recovery after peripheral nerve injury and implantation of a collagen guide
Gaudin et al. Approaches to peripheral nerve repair: generations of biomaterial conduits yielding to replacing autologous nerve grafts in craniomaxillofacial surgery
Apel et al. Peripheral nerve regeneration using a keratin-based scaffold: long-term functional and histological outcomes in a mouse model
Shen et al. Large-area irradiated low-level laser effect in a biodegradable nerve guide conduit on neural regeneration of peripheral nerve injury in rats
Barbera et al. Centrocentral anastomosis of the proximal nerve stump in the treatment of painful amputation neuromas of major nerves
Kriebel et al. Cell‐free artificial implants of electrospun fibres in a three‐dimensional gelatin matrix support sciatic nerve regeneration in vivo
Battiston et al. Alternative techniques for peripheral nerve repair: conduits and end-to-side neurorrhaphy
Risitano et al. Autogenous vein and nerve grafts: a comparative study of nerve regeneration in the rat
RU2558294C1 (ru) Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека
Liu et al. bFGF-chitosan scaffolds effectively repair 20 mm sciatic nerve defects in adult rats
RU2811302C1 (ru) Способ восстановления нерва с помощью имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шелка, в эксперименте
RU2347539C1 (ru) Способ лечения повреждения периферического нерва
US8758374B2 (en) Method for connecting nerves via a side-to-side epineurial window using artificial conduits
Ignatiadis et al. Diverse types of epineural conduits for bridging short nerve defects. An experimental study in the rabbit
Arda et al. Can a small intestine segment be an alternative biological conduit for peripheral nerve regeneration?
Rodríguez et al. Improvement of regeneration with predegenerated nerve transplants in silicone chambers
RU2815265C1 (ru) Способ получения биологического аналога периферического нерва в эксперименте
US9724369B2 (en) Methods of maintaining fat volume
RU2824072C1 (ru) Способ изготовления медицинского искусственного имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шелка
Al-Zaidi et al. Efficacy of acellular-lyophilized human umbilical cord ecm-powder guided by bovine urinary bladder matrix conduit for peripheral nerve repair in dogs modEL
Hajosch et al. A novel microsurgical nerve implantation technique preserving outer nerve layers
Midha et al. Technical aspects of nerve repair