RU2769474C2 - Способы лечения рассеянного склероза с использованием аутологичных т-клеток - Google Patents

Способы лечения рассеянного склероза с использованием аутологичных т-клеток Download PDF

Info

Publication number
RU2769474C2
RU2769474C2 RU2019124454A RU2019124454A RU2769474C2 RU 2769474 C2 RU2769474 C2 RU 2769474C2 RU 2019124454 A RU2019124454 A RU 2019124454A RU 2019124454 A RU2019124454 A RU 2019124454A RU 2769474 C2 RU2769474 C2 RU 2769474C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
peptide
ifnγ
cd107a
ctl
Prior art date
Application number
RU2019124454A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2019124454A3 (ru
RU2019124454A (ru
Inventor
Раджив КХАННА
Кори СМИТ
Блэйк Толу АФТАБ
Original Assignee
Атара Байотерапьютикс, Инк.
Дзе Каунсил Оф Дзе Квинсленд Инститьют Оф Медикал Рисерч
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Атара Байотерапьютикс, Инк., Дзе Каунсил Оф Дзе Квинсленд Инститьют Оф Медикал Рисерч filed Critical Атара Байотерапьютикс, Инк.
Publication of RU2019124454A publication Critical patent/RU2019124454A/ru
Publication of RU2019124454A3 publication Critical patent/RU2019124454A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2769474C2 publication Critical patent/RU2769474C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/217—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • C07K14/05—Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к способам лечения или профилактики рассеянного склероза (РС) у пациента, а также применениям аутологичных цитотоксических T-клеток (CTL), для получения лекарственного средства для лечения или профилактики рассеянного склероза. Указанные способы и применения относятся к использованию аутологичных CTL, экспрессирующих T-клеточный рецептор, специфически связывающийся с пептидом EBV, презентированным на MHC класса I, где по меньшей мере 7% CTL экспрессируют ИФНγ. Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств для лечения такого аутоимунного заболевания, как рассеянный склероз. 4 н. и 30 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр., 3 ил.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США № 62/448707, поданной 20 января 2017 года, и временной заявки на патент США № 62/576349, поданной 24 октября 2017 года, каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Аутоиммунные заболевания, такие как рассеянный склероз (РС), являются патологиями, возникающими в результате аномального иммунного ответа на ткань самого организма. РС отличается деградацией миелина, защитной липидной оболочки, окружающей нервные волокна, под действием иммунных клеток самого организма.
Вирус Эпштейна-Барр (EBV), также известный как герпесвирус 4 человека, является убиквитарным вирусом герпеса. Недавно показано, что воздействие EBV может предрасполагать к аутоиммунным заболеваниям, включая РС, или иным образом играть роль в патогенезе этих заболеваний. Например, недавние исследования показали, что пациенты с диагностированным РС имели более высокие уровни ассоциированных с EBV белков в B-клетках, скапливающихся в нервной ткани, чем здоровые пациенты. Предполагают, что повышение инфицированных EBV B-клеток и/или неправильная элиминация таких клеток могут вызывать предрасположенность пациентов к рассеянному склерозу.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам лечения РС (например, рецидивирующе-ремиттирующего РС, вторично-прогрессирующего РС, первично-прогрессирующего РС или прогрессирующе-ремиттирующего РС), включающим введение пациенту аутологичных T-клеток (например, цитотоксических T-клеток или CTL), экспрессирующих T-клеточный рецептор, специфически связывающийся с пептидом EBV, презентированным на MHC (например, MHC класса I). В некоторых вариантах осуществления РС является первично-прогрессирующим РС. В некоторых вариантах осуществления способы включают улучшение или стабилизацию симптома РС у пациента посредством введения пациенту аутологичных T-клеток (например, CTL), экспрессирующих T-клеточный рецептор, специфически связывающийся с пептидом EBV, презентированным на MHC класса I. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам снижения уровней IgG против EBV в CSF пациента с РС посредством введения пациенту аутологичных T-клеток (например, CTL), экспрессирующих T-клеточный рецептор, специфически связывающийся с пептидом EBV, презентированным на MHC класса I молекула.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 20% CTL экспрессируют CD107a, ИФНγ, ФНОα или ИЛ-2. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80% CTL экспрессируют CD107a, ИФНγ, ФНОα и ИЛ-2. По меньшей мере 5%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20% или по меньшей мере 30% CTL имеют реактивность в отношении EBV.
В некоторых вариантах осуществления пептид EBV включает пептид LMP1 или его фрагмент, пептид LMP2A или его фрагмент и/или пептид EBNA1 или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления пептид EBV содержит последовательность, приведенную в таблице 1.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам лечения рассеянного склероза (например, рецидивирующе-ремиттирующего РС, вторично-прогрессирующего РС, первично-прогрессирующего РС или прогрессирующе-ремиттирующего РС), включающим выделение образца, содержащего T-клетки (например, CTL) пациента, получение T-клеток, экспрессирующих T-клеточный рецептор, специфически связывающийся с пептидом EBV, презентированным на MHC (например, MHC класса I), а затем введение T-клеток пациенту. В некоторых вариантах осуществления T-клетки получают посредством инкубации образца, содержащего аутологичные T-клетки (например, образец PBMC), с антигенпрезентирующими клетками (АПК), презентирующими пептид EBV на MHC (например, MHC класса I), и, таким образом, индуцирования пролиферации пептид-специфических T-клеток (например, пептид-специфических аутологичных CTL) в образце. В некоторых вариантах осуществления АПК получают для презентации пептида EBV посредством их инкубации с конструкцией нуклеиновой кислоты (например, AdE1-LMPpoly), кодирующей пептид EBV, и, таким образом, индуцирования АПК для презентации пептида EBV. В некоторых вариантах осуществления АПК могут являться B-клетками, антигенпрезентирующими T-клетками, дендритными клетками или искусственными антигенпрезентирующими клетками (например, линией клеток, экспрессирующих CD80, CD83, 41BB-L и/или CD86, такой как клетки aK562). В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии CD107a, ИФНγ, ФНОα или ИЛ-2 пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными CTL и, если по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 20% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL экспрессируют CD107a, ИФНγ, ФНОα или ИЛ-2, введение пациенту пептид-специфических аутологичных CTL. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80% пептид-специфических аутологичных CTL экспрессируют CD107a, ИФНγ, ФНОα и ИЛ-2. Пептид-специфические аутологичные CTL могут содержать по меньшей мере 5%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20% или по меньшей мере 30% пептид-специфических аутологичных CTL, имеющих реактивность в отношении EBV.
В некоторых вариантах осуществления пептид EBV содержит пептид LMP1 или его фрагмент, пептид LMP2A или его фрагмент и/или пептид EBNA1 или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления пептид EBV содержит последовательность, приведенную в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления РС является первично-прогрессирующим РС.
В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят 5×106, 1×107, 1,5×107 или 2×107 клеток (например, CTL). В некоторых вариантах осуществления вводят начальную дозу T-клеток (например, аутологичных CTL), а затем вводят одну или более дополнительных доз T-клеток (например, аутологичных CTL), например, с повышением доз в ходе лечения. В некоторых вариантах осуществления вводят две или более, три или более, четыре или более или пять или более доз. Количество T-клеток (например, аутологичных CTL) может варьировать от начальной дозы до дополнительных доз. Например, сначала можно вводить меньшую дозу, а затем более высокую дозу. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере одну, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 доз. Дозы можно вводить еженедельно или раз в две недели. В некоторых вариантах осуществления пациент не испытывает какие-либо неблагоприятные воздействия в результате введения T-клеток (например, аутологичных CTL). В некоторых вариантах осуществления способы включают введение четырех доз последовательно повышающихся количеств CTL. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение первой дозы 5×106 CTL, второй дозы 1×107 CTL, третьей дозы 1,5×107 CTL и четвертой дозы 2×107 CTL.
В некоторых аспектах способ дополнительно включает оценку эффективности адоптивной иммунотерапии пациента с рассеянным склерозом посредством получения первого образца спинномозговой жидкости (CSF) пациента, анализа количества IgG против EBV в CSF в первом образце, предпочтительно, до введения CTL и, через некоторый период времени, получения второго образца CSF пациента, предпочтительно, после введения CTL, анализа относительного количества IgG против EBV в CSF во втором образце, и, если количество IgG против EBV во втором образце меньше, чем в первом образце, заболевание стабилизировано и/или не прогрессирует. Период времени может составлять одну неделю, две недели, три недели, четыре недели, пять недель, 6 недель, три месяца, шесть месяцев или один год.
В некоторых вариантах осуществления пациента подвергают диагностическому тесту, такому как тест EDSS. В некоторых вариантах осуществления пациента подвергают тесту EDSS до и после введения T-клеток. Баллы EDSS могут оставаться прежними или могут снижаться (например, по меньшей мере на 0,5 или по меньшей мере 1,0) после введения T-клеток.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам выбора пациента для адоптивной иммунотерапии посредством получения образца, содержащего T-клетки (например, CTL) пациента, выделения аутологичных T-клеток, определения реактивности аутологичных T-клеток в образце в отношении EBV и, если аутологичные T-клетки в количестве по меньшей мере порогового значения процентной доли (например, по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80%) являются EBV-реактивными, выбора пациента для адоптивной иммунотерапии.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам выбора пациента для адоптивной иммунотерапии посредством получения образца, содержащего T-клетки (например, CTL) пациента, выделения аутологичных T-клеток, определения экспрессии CD107a, ИФНγ, ФНОα и/или ИЛ-2 аутологичными T-клетками и, если аутологичные T-клетки в количестве по меньшей мере порогового значения процентной доли (например, по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80%) экспрессируют CD107a, ИФНγ, ФНОα, и/или ИЛ-2, выбора пациента для адоптивной иммунотерапии. В некоторых вариантах осуществления пациент имеет РС (например, рецидивирующе-ремиттирующий РС, вторично-прогрессирующий РС, первично-прогрессирующий РС, или прогрессирующе-ремиттирующий РС).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 включает две панели (A-B), и на ней показана CSF до и после терапии аутологичными EBV-специфическими T-клетками у исходного пациента после первого курса лечения 4 года назад и после повторного лечения в этом году в ходе настоящего исследования. (A) Индекс IgG CSF, при этом горизонтальной пунктирной линией показан верхний предел нормального диапазона. (B) Интратекальную продукцию IgG (IgG(loc)) вычисляли по формуле Reiber и Felgenhauer (ссылка 16): IgG(loc) (мг/л)={(IgG CSF ÷ IgG сыворотки) - [0,8×(√((альбумин CSF ÷ сывороточный альбумин)2+15))]+1,8}×IgG сыворотки. Вертикальными линиями указаны последовательные инфузии T-клеток в количестве 5×106, 1×107, 1,5×107 и 2×107 клеток.
Фиг. 2 включает две части (A-B), и на ней показана корреляция реактивности EBV-специфических CD8 + T-клеток из T-клеточного продукта и клинического ответа на терапию T-клетками.
На фиг. 3 показана активность заболевания на МРТ головного мозга.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Общие сведения
Настоящее изобретение относится к способам лечения рассеянного склероза (например, рецидивирующе-ремиттирующего РС, вторично-прогрессирующего РС, первично-прогрессирующего РС или прогрессирующе-ремиттирующего РС) у пациента с использованием аутологичных T-клеток (например, CTL), распознающих один или более эпитопов EBV (например, эпитоп EBV, представленный в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение образца, содержащего T-клетки пациента, инкубацию T-клеток с АПК, презентирующими пептид EBV (например, пептид EBV, представленный в настоящем описании), и, таким образом, получение T-клеток, распознающих пептид EBV, презентируемый на MHC. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам оценки эффективности адоптивной иммунотерапии пациента с рассеянным склерозом посредством получения образцов спинномозговой жидкости (CSF) пациента до и после введения T-клеток и анализа относительного количества IgG против EBV в CSF.
Определения
Для удобства здесь собраны конкретные термины, используемые в описании, примерах и формуле изобретения.
В настоящем описании термины в единственном числе используют для обозначения одного или более (т.е. по меньшей мере одного) грамматического объекта. В качестве примера, термин "элемент" означает один элемент или несколько элементов.
В рамках изобретения термин "введение" означает предоставление фармацевтического средства или композиции пациенту и включает, в качестве неограничивающих примеров, введение медицинским работником и самостоятельное введение. Такое средство может содержать, например, пептид, представленный в настоящем описании, антигенпрезентирующую клетку, представленную в настоящем описании, и/или T-клетку, представленную в настоящем описании.
Термин "аминокислота" включает все молекулы, природные или синтетические, имеющие функциональность аминогруппы и функциональность кислоты, которые можно включать в полимер природных аминокислот. Примеры аминокислот включают природные аминокислоты, их аналоги, производные и родственные соединения, аналоги аминокислот, содержащие варианты боковых цепей, и все стереоизомеры любых из приведенных выше соединений.
Термины "связывание" или "взаимодействие" относятся к ассоциации, которая может являться стабильной ассоциацией, между двумя молекулами, например, между TCR и пептидом/MHC, благодаря, например, электростатическим, гидрофобным, ионным и/или водородным взаимодействиям в физиологических условиях.
Каждый из терминов "биологический образец", "образец ткани" или просто "образец" относится к совокупности клеток, полученных из ткани пациента. Источником образца ткани может являться солидная ткань, например, из свежего, замороженного и/или консервированного органа, образец ткани, биоптат или аспират; кровь или любые компоненты крови, сыворотка; физиологические жидкости, такие как спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость, перитонеальная жидкость или интерстициальная жидкость, моча, слюна, стул, слезы; или клетки любой стадии развития пациента.
В рамках изобретения термин "цитокин" относится к любому секретируемому полипептиду, влияющему на функции клеток и представляющему собой молекулу, модулирующую взаимодействия между клетками при иммунном, воспалительном или гемопоэтическом ответе. Цитокины включают, в качестве неограничивающих примеров, монокины и лимфокины, независимо от того, какие клетки их продуцируют. Например, монокин, как правило, обозначают как продуцируемый и секретируемый мононуклеарной клеткой, такой как макрофаг и/или моноцит. Однако монокины также продуцируют многие другие клетки, такие как естественные киллеры, фибробласты, базофилы, нейтрофилы, эндотелиальные клетки, астроциты головного мозга, стромальные клетки костного мозга, эпидермальные кератиноциты и B-лимфоциты. Лимфокины, как правило, обозначают как продуцируемые лимфоцитами. Неограничивающие примеры цитокинов включают интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерлейкин-6 (ИЛ-6), интерлейкин-8 (ИЛ-8), фактор некроза опухоли альфа (ФНОα) и фактор некроза опухоли бета (ФНОβ).
Термин "эпитоп" означает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом или TCR. Как правило, эпитопы состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров. Конкретные эпитопы можно определять по конкретной последовательности аминокислот, с которой может связываться антитело.
В рамках изобретения фраза "фармацевтически приемлемый" относится к средствам, соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые с медицинской точки зрения пригодны для использования в контакте с тканями людей и животных без избыточной токсичности, раздражения, аллергического ответа или других проблем или осложнений в соответствии с разумным соотношением пользы и риска.
В рамках изобретения фраза "фармацевтически приемлемый носитель" означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, дилюент, эксципиент или материал для инкапсуляции растворителя, участвующий в переносе или транспорте средства от одного органа или части тела к другому органу или части тела. Каждый носитель должен быть "приемлемым" в том смысле, что он должен быть совместимым с другими ингредиентами состава и не причинять вред пациенту. Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошок трагакантовой камеди; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) эксципиенты, такие как масло какао и воски для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, сезамовое масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как этил олеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные средства, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) воду, несодержащую пирогены; (17) изотонический физиологический раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) pH-буферные растворы; (21) полиэфиры, поликарбонаты и/или полиангидриды; и (22) другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических составах.
Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используют взаимозаменяемо. Они относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, или их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру и могут осуществлять любую функцию. Далее представлены неограничивающие примеры полинуклеотидов: кодирующие или некодирующие области гена или фрагмента гена, локусы (локус), определенные при анализе сцепления, экзоны, интроны, матричная РНК (мРНК), транспортная РНК, рибосомная РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды нуклеиновой кислоты и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. В случае их наличия, модификации структуры нуклеотидов можно вносить до или после сборки полимера. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать, например, посредством конъюгации с компонентом-меткой. Во всех последовательностях нуклеиновой кислоты, представленных в настоящем описании, U-нуклеотиды взаимозаменяемы с T-нуклеотидами.
В рамках изобретения терапевтическое средство для "профилактики" состояния относится к соединению, которое при введении статистической выборке до дебюта нарушения или состояния снижает частоту нарушения или состояния в выборке, подвергаемой лечению, относительно контрольной выборки, не подвергаемой лечению, или задерживает дебют или снижает тяжесть одного или более симптомов нарушения или состояния относительно контрольной выборки, не подвергаемой лечению.
В рамках изобретения термин "специфическое связывание" относится к способности TCR связываться с пептидом, презентированном на MHC (например, MHC класса I или MHC класса II). Как правило, TCR специфически связывается с пептидом/MHC с аффинностью с по меньшей мере KD приблизительно 10-4 M или менее и связывается с заранее определенным антигеном/партнером по связыванию с аффинностью (выраженной как KD), составляющей по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере 100 раз или по меньшей мере 1000 раз меньше, чем его аффинность для связывания с неспецифическим и неродственным комплексом пептид/MHC (например, комплексом, содержащим пептид BSA или пептид казеина).
В рамках изобретения термин "пациент" означает человека или не являющегося человеком животного, выбранного для лечения или терапии.
В рамках изобретения фразы "терапевтически эффективное количество" и "эффективное количество" означают количество средства, являющееся эффективным для достижения желаемого терапевтического эффекта по меньшей мере в субпопуляции клеток пациента при разумном соотношении пользы и риска, подходящем для какого-либо лечения.
В рамках изобретения термин "лечение" заболевания у пациента или "лечение" пациента, имеющего или, как предполагают, имеющего заболевание, относится к подверганию пациента медикаментозному лечению, например, введению CTL, представленных в настоящем описании, таким образом, что уменьшают по меньшей мере один симптом заболевания или предотвращают его ухудшение.
Термин "вектор" относится к средствам, с помощью которых нуклеиновую кислоту можно репродуцировать и/или переносить между организмами, клетками или клеточными компонентами. Векторы включают плазмиды, вирусы, бактериофаг, провирусы, фагмиды, транспозоны, искусственные хромосомы и т.п., которые могут реплицироваться или не реплицироваться автономно или интегрироваться в хромосому клетки-хозяина.
Пептиды
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам лечения рассеянного склероза (например, рецидивирующе-ремиттирующего РС, вторично-прогрессирующего РС, первично-прогрессирующего РС или прогрессирующе-ремиттирующего РС) с использованием аутологичных T-клеток (например, CTL), экспрессирующих TCR, специфически связывающиеся с пептидами, содержащими эпитопы EBV, презентированные на MHC (например, MHC класса I). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам получения таких аутологичных T-клеток, например, посредством инкубации образца, содержащего T-клетки (т.е. аутологичные T-клетки), с антигенпрезентирующими клетками (АПК), презентирующими один или более из эпитопов EBV, представленных в настоящем описании (например, АПК, презентирующими пептид, представленный в настоящем описании, содержащий эпитоп EBV, на комплексе MHC класса I).
В некоторых вариантах осуществления пептиды, представленные в настоящем описании, содержат последовательность любого белка вируса EBV (например, последовательность по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных аминокислот любого белка EBV). В некоторых вариантах осуществления пептиды, представленные в настоящем описании, содержат не более 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 смежных аминокислот белка вируса EBV.
В некоторых вариантах осуществления пептиды, представленные в настоящем описании, содержат последовательность LMP1 (например, последовательность по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных аминокислот LMP1). В некоторых вариантах осуществления пептиды, представленные в настоящем описании, содержат не более 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 смежных аминокислот LMP1. Пример аминокислотной последовательности LMP1 представлен ниже (SEQ ID NO: 1):
1 mdldlergpp gprrpprgpp lssyialall llllallfwl yiimsnwtgg allvlyafal
61 mlviiiliif ifrrdllcpl galcllllmi tlllialwnl hgqalylgiv lfifgcllvl
121 giwvyfleil wrlgatiwql lafflaffld illliialyl qqnwwtllvd llwlllflai
181 liwmyyhgqr hsdehhhdds lphpqqatdd ssnhsdsnsn egrhhllvsg agdapplcsq
241 nlgapgggpd ngpqdpdntd dngpqdpdnt ddngphdplp qdpdntddng pqdpdntddn
301 gphdplphnp sdsagndggp pnlteevenk ggdrgppsmt dggggdphlp tlllgtsgsg
361 gddddphgpv qlsyyd
В некоторых вариантах осуществления пептиды, представленные в настоящем описании, содержат последовательность LMP2A (например, последовательность по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных аминокислот LMP2A). В некоторых вариантах осуществления пептиды, представленные в настоящем описании, содержат не более 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 смежных аминокислот LMP2A. Пример аминокислотной последовательности LMP2A представлен ниже (SEQ ID NO: 2):
1 mgslemvpmg agppspggdp dgddggnnsq ypsasgsdgn tptppndeer esneeppppy
61 edldwgngdr hsdyqplgnq dpslylglqh dgndglpppp ysprddssqh iyeeagrgsm
121 npvclpviva pylfwlaaia ascftasvst vvtatglals llllaavass yaaaqrkllt
181 pvtvltavvt ffaicltwri edppfnsllf allaaagglq giyvlvmlvl lilayrrrwr
241 rltvcggimf lacvlvlivd avlqlspllg avtvvsmtll llafvlwlss pgglgtlgaa
301 lltlaaalal laslilgtln lttmfllmll wtlvvllics scsscpltki llarlflyal
361 allllasali aggsilqtnf kslsstefip nlfcmllliv agilfilail tewgsgnrty
421 gpvfmclggl ltmvagavwl tvmtntllsa wiltagflif ligfalfgvi rccryccyyc
481 ltleseerpp tpyrntv
В некоторых вариантах осуществления пептиды, представленные в настоящем описании, содержат последовательность EBNA1 (например, последовательность по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных аминокислот EBNA1). В некоторых вариантах осуществления пептиды, представленные в настоящем описании, содержат не более 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 смежных аминокислот EBNA1. Пример аминокислотной последовательности EBNA1 представлен ниже (SEQ ID NO: 3):
1 pffhpvgead yfeylqeggp dgepdvppga ieqgpaddpg egpstgprgq gdggrrkkgg
61 wfgkhrgqgg snpkfeniae glrvllarsh vertteegtw vagvfvyggs ktslynlrrg
121 talaipqcrl tplsrlpfgm apgpgpqpgp lresivcyfm vflqthifae vlcdaikdlv
181 mtkpaptcni kvtvcsfddg vdlppwfppm vegaaaegdd gddgdeggdg degeegqe
В некоторых вариантах осуществления пептид содержит последовательность эпитопа, приведенного в таблице 1.
Таблица 1: Примеры эпитопов вирусных белков EBV
Последовательность эпитопа Рестрикция по HLA SEQ ID NO
CLGGLLTMV A*02 4
FLYALALLL A*02 5
YLQQNWWTL A*02, A*68, A*69 6
YLLEMLWRL A*02 7
ALLVLYSFA A*02 8
LLSAWILTA A*0203 9
LTAGFLIFL A*0206 10
SSCSSCPLSKI A*11 11
PYLFWLAA A*23, A*24, A*30 12
TYGPVFMCL A*24 13
VMSNTLLSAW A*25 14
CPLSKILL B*08 15
RRRWRRLTV B*27 16
IEDPPFNSL B*40 17
IALYLQQNW B*57, B*58 18
MSNTLLSAW B*58 19
VLCDAIKDL A*0203 20
RPQKRPSCI B*07 21
IPQCRLTPL B*07 22
YNLRRGTAL B*08 23
HPVGEADYFEY B*35 24
LSRLPFGMA B*57 25
FVYGGSKTSL Cw*03 26
В некоторых вариантах осуществления пептиды, представленные в настоящем описании, содержат два или более из эпитопов EBV. В некоторых вариантах осуществления пептиды, представленные в настоящем описании, содержат по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 эпитопов EBV. Например, в некоторых вариантах осуществления пептид, представленный в настоящем описании, содержит два или более из эпитопов EBV, соединенных линкерами (например, полипептидными линкерами).
В некоторых вариантах осуществления последовательности пептидов содержат последовательность белка вируса EBV, за исключением 1 или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) консервативных модификаций последовательности. В рамках изобретения термин "консервативные модификации последовательности" предназначен для обозначения модификаций аминокислот, не влияющих или изменяющих значимо взаимодействие между TCR и пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, презентированную на MHC. Такие консервативные модификации включают замены аминокислот, инсерции (например, инсерции аминокислот на N- или C-конце пептида) и делеции (например, делеции аминокислот на N- или C-конце пептида). Консервативные аминокислотные замены являются заменами, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. В этой области определены семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков в пептидах, представленных в настоящем описании, можно заменять другими аминокислотными остатками из семейства со схожей боковой цепью и можно тестировать измененный пептид на сохранение связывания TCR известными в этой области способами. Модификации в антитело можно вносить стандартными способами, известными в этой области, такими как сайт-специфический мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез.
В некоторых вариантах осуществления пептиды, представленные в настоящем описании, содержат последовательность, являющуюся на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичной последовательности белка вируса EBV (например, последовательности фрагмента белка вируса EBV). Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей, их выравнивают в целях оптимального сравнения (например, для оптимального выравнивания в одну или обе из первой и второй аминокислотной последовательности можно вносить пропуски и можно не учитывать неидентичные последовательности). Затем сравнивают аминокислотные остатки в соответствующих положениях аминокислот. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в этом положении. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей, с учетом количества пропусков и длины каждого пропуска, который необходимо вносить для оптимального выравнивания двух последовательностей.
В некоторых вариантах осуществления пептид является химерным или слитым пептидом. В рамках изобретения "химерный пептид" или "слитый пептид" содержит пептид, имеющий последовательность, представленную в настоящем описании, соединенный с отличающимся пептидом, имеющим последовательность, с которой он не соединен в природе. Например, отличающийся пептид можно подвергать слиянию с N-концом или C-концом пептида, представленного в настоящем описании, напрямую через пептидную связь или косвенно через химический линкер. В некоторых вариантах осуществления пептид, представленный в настоящем описании, соединяют с другим пептидом, содержащим отличающиеся эпитопы EBV. В некоторых вариантах осуществления пептид, представленный в настоящем описании, соединяют с пептидами, содержащими эпитопы, ассоциированные с другими вирусными и/или инфекционными заболеваниями.
Химерный или слитый пептид, представленный в настоящем описании, можно получать стандартными способами рекомбинантной ДНК. Например, фрагменты ДНК, кодирующие разные пептидные последовательности, лигируют в рамке считывания общепринятыми способами, например, с использованием тупых концов или липких концов для лигирования, посредством расщепления рестрикционными ферментами для получения подходящих концов, заполнения липких концов, при необходимости, обработки щелочной фосфатазой во избежание нежелательного соединения, ферментативного лигирования. В другом варианте осуществления слитый ген можно синтезировать общепринятыми способами, включая использование автоматизированных ДНК-синтезаторов. Альтернативно, можно осуществлять ПЦР-амплификацию фрагментов гена с использованием якорных праймеров, получая комплементарные липкие концы между двумя последовательными фрагментами гена, которые затем можно отжигать и повторно амплифицировать для получения последовательности химерного гена (см., например, Current Protocols in Molecular biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons: 1992). Кроме того, коммерчески доступными являются многие экспрессирующие векторы, уже кодирующие слитую молекулу.
Пептиды, представленные в настоящем описании, можно выделять из клеточных или тканевых источников с помощью подходящей схемы очистки с использованием стандартных способов очистки белка и можно получать их способами рекомбинантной ДНК и/или химически синтезировать с использованием стандартных способов пептидного синтеза. Пептиды, представленные в настоящем описании, можно получать в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах посредством экспрессии нуклеотидов, кодирующих пептиды по настоящему изобретению. Альтернативно, такие пептиды можно синтезировать химическими способами. Способы экспрессии гетерологичных пептидов в рекомбинантных хозяевах, химического синтеза пептидов и трансляции in vitro хорошо известны в этой области и описаны в Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N. Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255; Kaiser et al. (1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232:342; Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957; и Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, включенных в настоящее описание в качестве ссылки.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим пептиды, представленные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления молекулой нуклеиновой кислоты является вектор. В некоторых вариантах осуществления молекулой нуклеиновой кислоты является вирусный вектор, такой как экспрессирующий вектор на основе аденовируса, содержащий молекулы нуклеиновой кислоты, представленные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления вектор, представленные в настоящем описании, кодирует множество эпитопов, представленных в настоящем описании (например, в виде полиэпитопа). В некоторых вариантах осуществления вектор, представленный в настоящем описании, кодирует по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 эпитопов, представленных в настоящем описании (например, эпитопов, приведенных в таблице 1).
В некоторых вариантах осуществления вектор является AdE1-LMPpoly. Вектор AdE1-LMPpoly кодирует полиэпитоп из определенных эпитопов CTL из LMP1 и LMP2, слитых с последовательностью EBNA1 со сниженным количеством повторов Gly-Ala. Вектор AdE1-LMPpoly описан, например, в Smith et al., Cancer Research 72:1116 (2012); Duraiswamy et al., Cancer Research 64:1483-9 (2004); и Smith et al., J. Immunol 117:4897-906, каждая из которых, таким образом, включена в настоящее описание в качестве ссылки.
В рамках изобретения термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним из типов векторов является "плазмида", представляющая собой кольцевую петлю двухцепочечной ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном. Конкретные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их встраивают (например, бактериальные векторы, содержащие бактериальный участок начала репликации, эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут интегрироваться в геном клетки-хозяина после встраивания в клетку-хозяина и, таким образом, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы могут регулировать экспрессию генов. Такие векторы обозначают в настоящем описании как "рекомбинантные экспрессирующие векторы" (или просто "экспрессирующие векторы"). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, функционально связанным с одной или более регуляторным последовательностям (например, промотором) в экспрессирующем векторе. В некоторых вариантах осуществления клетка транскрибирует нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем описании и, таким образом, экспрессирует пептид, представленный в настоящем описании. Молекула нуклеиновой кислоты может интегрироваться в геном клетки или может являться экстрахромосомной.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам, содержащим нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем описании (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, представленный в настоящем описании). Клетка может являться, например, прокариотической клеткой, эукариотической клеткой, клеткой млекопитающего, птиц, мыши и/или человека. В некоторых вариантах осуществления клетка является клеткой млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления клетка является АПК (например, антигенпрезентирующей T-клеткой, дендритной клеткой, B-клеткой или клеткой aK562). В способах по изобретению нуклеиновую кислоту, представленную в настоящем описании, можно вводить в клетку, например, в виде нуклеиновой кислоты без носителя, в комбинации с реагентом для доставки. В некоторых вариантах осуществления в способах, представленных в настоящем описании, можно использовать любой способ доставки нуклеиновых кислот, известный в этой области. Подходящие реагенты для доставки включают, в качестве неограничивающих примеров, например, липофильный реагент Mirus Transit TKO, липофектин, липофектамин, селлфектин, поликатионы (например, полилизин), ателоколлаген, наноплексы и липосомы. В некоторых вариантах осуществления способов, представленных в настоящем описании, липосомы используют для доставки нуклеиновой кислоты в клетку или введения пациенту. Липосомы, которые можно использовать в способах, представленных в настоящем описании, можно получать из стандартных везикулообразующих липидов, как правило, включающих нейтральные или отрицательно заряженные фосфолипиды и стерин, такой как холестерин. При выборе липидов, как правило, руководствуются такими факторами, как желаемый размер липосом и время полужизни липосом в кровотоке. Известно множество способов получения липосом, например, как описано в Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 и патентах США №№ 4235871, 4501728, 4837028 и 5019369, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Аутологичные T-клетки
Настоящее изобретение относится к способам лечения рассеянного склероза (например, рецидивирующе-ремиттирующего РС, вторично-прогрессирующего РС, первично-прогрессирующего РС или прогрессирующе-ремиттирующего РС) посредством введения пациенту аутологичных T-клеток (например, CTL), экспрессирующих T-клеточный рецептор, специфически связывающийся с пептидом EBV, презентированным на MHC. В некоторых вариантах осуществления MHC является MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления MHC является MHC класса II.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к АПК, презентирующим пептид, представленный в настоящем описании (например, пептид, содержащий последовательность эпитопа LMP1, LMP2A или EBNA1). В некоторых вариантах осуществления АПК являются B-клетками, антигенпрезентирующими T-клетками, дендритными клетками или искусственными антигенпрезентирующими клетками (например, клетками aK562).
Дендритные клетки для использования в способе можно получать посредством получения PBMC из образца пациента и их адгезии к пластику. Как правило, популяция моноцитов прикрепляется, а все другие клетки можно вымывать. Затем прикрепившуюся популяцию подвергают дифференцировке с использованием ИЛ-4 и ГМ-КСФ для получения дендритных клеток моноцитарного происхождения. Эти клетки можно подвергать созреванию посредством добавления ИЛ-1β, ИЛ-6, PGE-1 и ФНОα (положительно регулирующего важные костимуляторные молекулы на поверхности дендритной клетки), а затем трансдуцировать с использованием одного или более пептидов, представленных в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления АПК является искусственной антигенпрезентирующей клеткой, такой как клетка aK562. В некоторых вариантах осуществления искусственные антигенпрезентирующие клетки конструируют для экспрессии CD80, CD83, 41BB-L и/или CD86. Примеры искусственных антигенпрезентирующих клеток, включая клетки aK562, описаны в патентной публикации США № 2003/0147869, включенной, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам получения АПК, презентирующих один или более из эпитопов EBV, представленных в настоящем описании, включающим приведение АПК в контакт с пептидом, содержащим эпитоп EBV, и/или нуклеиновой кислотой, кодирующей эпитоп EBV. В некоторых вариантах осуществления АПК облучают. В некоторых вариантах осуществления АПК презентируют пептид, представленный в настоящем описании (например, пептид, содержащий последовательность эпитопа LMP1, LMP2A или EBNA1). Клетку, презентирующую пептид, представленный в настоящем описании, можно получать стандартными способами, известными в этой области. Например, клетку можно активировать для стимуляции захвата пептида. В некоторых вариантах осуществления клетки трансфицируют с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, представленный в настоящем описании. Настоящее изобретение относится к способам получения антигенпрезентирующих клеток (АПК), включающих активацию клетки пептидами, представленными в настоящем описании. Примеры получения антигенпрезентирующих клеток можно найти в WO2013088114, включенном, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к T-клеткам (например, CD4 T-клеткам и/или CD8 T-клеткам), экспрессирующим TCR (например, αβ TCR или γδ TCR), распознающий пептид, представленный в настоящем описании, презентированный на MHC. В некоторых вариантах осуществления T-клетка является CD8 T-клеткой (например, CTL), экспрессирующей TCR, распознающий пептид, представленный в настоящем описании, презентированный на MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления T-клетка является CD4 T-клеткой (например, хелперной T-клеткой), распознающей пептид, представленный в настоящем описании, презентированный на MHC класса II.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам получения, активации и/или индуцирования пролиферации T-клеток (например, аутологичных CTL), распознающих один или более из эпитопов EBV, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления образец, содержащий аутологичные T-клетки (например, образец PBMC), инкубируют в культуре с АПК, представленными в настоящем описании (например, АПК, презентирующими пептид, содержащий эпитоп EBV, на комплексе MHC класса I). В некоторых вариантах осуществления АПК являются аутологичными для пациента, из которого получают T-клетки. В некоторых вариантах осуществления АПК не являются аутологичными для пациента, из которого получают T-клетки. В некоторых вариантах осуществления образец, содержащий T-клетки, инкубируют 2 или более раз с АПК, представленными в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления T-клетки инкубируют с АПК в присутствии по меньшей мере одного цитокина. В некоторых вариантах осуществления цитокин является ИЛ-4, ИЛ-7 и/или ИЛ-15. Примеры способов индуцирования пролиферации T-клеток с использованием АПК представлены, например, в патентной публикации США № 2015/0017723, включенной, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям (например, терапевтическим композициям), содержащим T-клетки и/или АПК, представленные в настоящем описании, используемым для лечения и/или профилактики аутоиммунного заболевания у пациента посредством введения пациенту эффективного количества композиции. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам лечения рассеянного склероза с использованием композиции (например, фармацевтической композиции, такой как композиции, содержащие аутологичные CTL). В некоторых вариантах осуществления композиция включает комбинацию множества (например, двух или более) CTL, представленных в настоящем описании.
Терапевтические способы
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения РС (например, первично-прогрессирующего РС) у пациента посредством введения пациенту аутологичных T-клеток (например, аутологичных CTL), представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления РС является рецидивирующе-ремиттирующим РС, вторично-прогрессирующим РС, первично-прогрессирующим РС или прогрессирующе-ремиттирующим РС. В некоторых вариантах осуществления аутологичные T-клетки выделяют из образца мононуклеарных клеток периферической крови. Экспрессию биомаркеров аутологичными T-клетками можно анализировать любым подходящим способом, таким как проточная цитометрия. В некоторых вариантах осуществления аутологичные T-клетки стимулируют вектором, содержащим пептиды вируса EBV (например, AdE1-LMPpoly). В некоторых вариантах осуществления аутологичные T-клетки стимулируют вирусным вектором и сортируют посредством проточной цитометрии. Например, аутологичные T-клетки можно подвергать поверхностному окрашиванию способами, описанными в примере 2. В некоторых вариантах осуществления аутологичные T-клетки инкубируют с одним или более антителами, специфическими для CD107a, а затем сортируют посредством проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления аутологичные T-клетки инкубируют с одним или более антителами, связывающимися с внутриклеточными цитокинами, такими как антитела, специфические для ИФНγ, ИЛ-2 и/или ФНОα. В некоторых вариантах осуществления аутологичные T-клетки инкубируют с антителами против внутриклеточных цитокинов, а затем сортируют посредством проточной цитометрии.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам выбора пациента для адоптивной иммунотерапии посредством получения образца PMBC пациента, выделения аутологичных T-клеток, определения реактивности аутологичных T-клеток в отношении EBV и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% аутологичных T-клеток являются реактивными в отношении EBV, выбора пациента для адоптивной иммунотерапии.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам выбора пациента для адоптивной иммунотерапии посредством получения образца, содержащего T-клетки (например, CTL) пациента, выделения аутологичных T-клеток и определения экспрессии CD107a аутологичными T-клетками и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% аутологичных T-клеток экспрессируют CD107a, выбора пациента для адоптивной иммунотерапии.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам выбора пациента для адоптивной иммунотерапии посредством получения образца, содержащего T-клетки (например, CTL) пациента, выделения аутологичных T-клеток, определения экспрессии ИФНγ аутологичными T-клетками и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% аутологичных T-клеток экспрессируют ИФНγ, выбора пациента для адоптивной иммунотерапии.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам выбора пациента для адоптивной иммунотерапии посредством получения образца, содержащего T-клетки (например, CTL) пациента, выделения аутологичных T-клеток, определения экспрессии ФНОα аутологичными T-клетками и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% аутологичных T-клеток экспрессируют ФНОα, выбора пациента для адоптивной иммунотерапии.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам выбора пациента для адоптивной иммунотерапии посредством получения образца, содержащего T-клетки (например, CTL) пациента, выделения аутологичных T-клеток, определения экспрессии ИЛ-2 аутологичными T-клетками и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% аутологичных T-клеток экспрессируют ИЛ-2, выбора пациента для адоптивной иммунотерапии.
В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают получение образца, содержащего T-клетки пациента (например, получение образца PBMC пациента). В некоторых вариантах осуществления аутологичные T-клетки (например, CD4+ T-клетки или CD8+ T-клетки) выделяют из образца. В некоторых вариантах осуществления образец, главным образом или полностью, состоит из аутологичных T-клеток.
Настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики рассеянного склероза (РС) у пациента, включающий введение пациенту аутологичных цитотоксических T-клеток (CTL), экспрессирующих T-клеточный рецептор, специфически связывающийся с пептидом EBV, презентированным на MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют CD107a. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют ИФНγ. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют ФНОα. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют ИЛ-2.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют CD107a и ИФНγ.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют CD107a и ФНОα.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют CD107a и ИЛ-2.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют ИФНγ и ФНОα.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют ИФНγ и ИЛ-2.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют ФНОα и ИЛ-2.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют ИФНγ, ФНОα и ИЛ-2.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют CD107a, ФНОα и ИЛ-2.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют CD107a, ИФНγ и ИЛ-2.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют CD107a, ИФНγ и ФНОα.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% T-клеток (например, CTL) в образце экспрессируют CD107a, ИФНγ, ФНОα и ИЛ-2.
В некоторых вариантах осуществления 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% T-клеток (например, CTL) являются реактивными в отношении EBV.
Экспрессию биомаркеров T-клетками и/или реактивность в отношении EBV можно измерять и/или анализировать до или после экспансии T-клеток с использованием конструкции нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем описании, полипептида, представленного в настоящем описании, или АПК.
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики РС у пациента посредством инкубации антигенпрезентирующих клеток (АПК) с конструкцией нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид EBV, и, таким образом, индуцирования презентации пептида EBV АПК, индуцирования пролиферации пептид-специфических T-клеток (например, CTL) посредством инкубации образца, содержащего аутологичные T-клетки (например, CTL), с антигенпрезентирующими клетками (АПК) и, таким образом, индуцирования пролиферации аутологичных T-клеток (например, CTL) и введения пациенту пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL). В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV и экспрессию биомаркеров количественно анализируют перед стимуляцией аутологичных T-клеток вирусным вектором (например, вирусным вектором, представленным в настоящем описании) и/или АПК (например, АПК, представленными в настоящем описании). Альтернативно или дополнительно, реактивность в отношении EBV и экспрессию биомаркеров можно количественно анализировать после стимуляции аутологичных T-клеток вирусным вектором (например, вирусным вектором, представленным в настоящем описании) и/или АПК (например, АПК, трансфицированными с использованием вирусного вектора, представленного в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют посредством количественного анализа процентной доли T-клеток, экспрессирующих CD107a, в образце. В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют посредством количественного анализа процентной доли T-клеток, экспрессирующих ИФНγ, в образце. В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют посредством количественного анализа процентной доли T-клеток, экспрессирующих ФНОα, в образце. В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют посредством количественного анализа процентной доли T-клеток, экспрессирующих ИЛ-2, в образце. В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют как процентную долю T-клеток, экспрессирующих множество биомаркеров (например, двух или более из CD107a, ИФНγ, ФНОα и ИЛ-2, предпочтительно - всех четырех). В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV вычисляют посредством количественного анализа процентной доли аутологичных T-клеток, экспрессирующих CD107a, ИФНγ, ФНОα и ИЛ-2, в образце. T-клетки можно выделять из образца (например, образца PBMC или образца, содержащего T-клетки) до или после количественного анализа процентной доли клеток, реактивных в отношении EBV. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV представляет собой процентную долю T-клеток, имеющих желаемые характеристики, в образце, содержащем, главным образом, T-клетки.
В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют посредством количественного анализа процентной доли CD8+ лимфоцитов, экспрессирующих CD107a, в образце. В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют посредством количественного анализа процентной доли CD8+ лимфоцитов, экспрессирующих ИФНγ, в образце. В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют посредством количественного анализа процентной доли CD8+ лимфоцитов, экспрессирующих ФНОα, в образце. В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют посредством количественного анализа процентной доли CD8+ лимфоцитов, экспрессирующих ИЛ-2, в образце. В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют как процентную долю CD8+ лимфоцитов, экспрессирующих множество биомаркеров (например, двух или более из CD107a, ИФНγ, ФНОα и ИЛ-2, предпочтительно - всех четырех). CD8+ лимфоциты можно выделять из образца (например, образца PBMC или образца CD8+ лимфоцитов) до или после количественного анализа процентной доли клеток, реактивных в отношении EBV. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV представляет собой процентную долю CD8+ лимфоцитов, имеющих желаемые характеристики, в образце, содержащем, главным образом, CD8+ лимфоциты.
В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют посредством количественного анализа процентной доли CD3+ лимфоцитов, экспрессирующих CD107a, в образце. В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют посредством количественного анализа процентной доли CD3+ лимфоцитов, экспрессирующих ИФНγ, в образце. В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют посредством количественного анализа процентной доли CD3+ лимфоцитов, экспрессирующих ФНОα, в образце. В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют посредством количественного анализа процентной доли CD3+ лимфоцитов, экспрессирующих ИЛ-2, в образце. В некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV измеряют как процентную долю CD3+ лимфоцитов, экспрессирующих множество биомаркеров (например, двух или более из CD107a, ИФНγ, ФНОα и ИЛ-2, предпочтительно - всех четырех). CD3+ лимфоциты можно выделять из образца (например, образца PBMC или образца CD3+ лимфоцитов) до или после количественного анализа процентной доли клеток, реактивных в отношении EBV. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления реактивность в отношении EBV представляет собой процентную долю CD3+ лимфоцитов, имеющих желаемые характеристики, в образце, содержащем, главным образом, CD3+ лимфоциты.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии CD107a, ИФНγ, ФНОα или ИЛ-2 пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными T-клетками (например, CTL) и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL) экспрессируют CD107a, ИФНγ, ФНОα или ИЛ-2, введение пациенту пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL).
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии CD107a и ФНОα пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными T-клетками (например, CTL) и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL) экспрессируют CD107a и ФНОα, введение пациенту пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL).
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии CD107a и ИФНγ пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными T-клетками (например, CTL) и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL) экспрессируют CD107a и ИФНγ, введение пациенту пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL).
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии CD107a и ИЛ-2 пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными T-клетками (например, CTL) и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL) экспрессируют CD107a и ИЛ-2, введение пациенту пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL).
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии ФНОα и ИЛ-2 пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными T-клетками (например, CTL) и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL) экспрессируют ФНОα и ИЛ-2, введение пациенту пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL).
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии ИФНγ и ИЛ-2 пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными T-клетками (например, CTL) и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL) экспрессируют ИФНγ и ИЛ-2, введение пациенту пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL).
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии ИФНγ и ФНОα пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными T-клетками (например, CTL) и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL) экспрессируют ИФНγ и ФНОα, введение пациенту пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL).
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии CD107a, ИФНγ и ФНОα пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными T-клетками (например, CTL) и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL) экспрессируют CD107a, ИФНγ и ФНОα, введение пациенту пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL).
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии CD107a, ИФНγ и ИЛ-2 пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными T-клетками (например, CTL) и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL) экспрессируют CD107a, ИФНγ и ИЛ-2, введение пациенту пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL).
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии CD107a, ИЛ-2 и ФНОα пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными T-клетками (например, CTL) и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL) экспрессируют CD107a, ИЛ-2 и ФНОα, введение пациенту пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL).
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии ИФНγ, ИЛ-2 и ФНОα пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными T-клетками (например, CTL) и, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL) экспрессируют ИФНγ, ИЛ-2 и ФНОα, введение пациенту пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL).
В некоторых вариантах осуществления, если по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTLs) экспрессируют CD107a, ИФНγ, ФНОα и ИЛ-2, пациенту вводят аутологичные T-клетки (например, CTL).
Пептид-специфические аутологичные T-клетки (например, CTL) могут содержать по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% пептид-специфических аутологичных T-клеток (например, CTL), имеющих реактивность в отношении EBV.
В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят от приблизительно 1×105 до приблизительно 1×108 T-клеток на дозу T-клеток. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят от приблизительно 1×106 до приблизительно 1×107 T-клеток на дозу T-клеток. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят 5×106, 1×107, 1,5×107 или 2×107 T-клеток (например, CTL). Пациенту можно вводить множество доз. В некоторых вариантах осуществления вводят начальную дозу T-клеток (например, аутологичных CTL) и одну или более дополнительных доз T-клеток (например, аутологичных CTL), например, с повышением доз в ходе терапии. В некоторых вариантах осуществления вводят две или более, три или более, четыре или более, пять или более, шесть или более, семь или более, восемь или более, девять или более или десять или более доз. Пациенту можно вводить дополнительные дозы, являющиеся такими же, как начальная доза, или отличающиеся от нее. Например, можно вводить более низкую дозу, а затем более высокую дозу. Дозы можно вводить ежесуточно, дважды в неделю, еженедельно, раз в две недели, раз в месяц, раз в два месяца, раз в три месяца или раз в шесть месяцев. В некоторых вариантах осуществления пациент не испытывает какие-либо неблагоприятные воздействия в результате введения T-клеток (например, аутологичных CTL).
В некоторых аспектах способ дополнительно включает оценку эффективности адоптивной иммунотерапии у пациента с рассеянным склерозом посредством получения первого образца спинномозговой жидкости (CSF) пациента, анализа количества IgG против EBV в CSF в первом образце (предпочтительно, до введения CTL) и, через некоторый период времени, получения второго образца CSF пациента (предпочтительно, после введения CTL), анализа количества IgG против EBV в CSF во втором образце и, если количество IgG против EBV во втором образце меньше количества в первом образце, заболевание стабилизировано и/или не прогрессирует. Дополнительные образцы CTF можно получать и сравнивать с полученными ранее образцами. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам снижения уровней IgG против EBV в CSF пациента с РС посредством введения пациенту аутологичных T-клеток (например, CTL), экспрессирующих T-клеточный рецептор, специфически связывающийся с пептидом EBV, презентированным на MHC класса I. Снижение уровней IgG против EBV в CSF можно измерять с помощью индекса IgG CSF. В некоторых вариантах осуществления уровни IgG в CSF можно вычислять с помощью формулы Reiber и Felgenhauer (т.е. см. фиг. 1). Уровни IgG против EBV могут снижаться по меньшей мере на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% после введения T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления способы включают улучшение или стабилизацию симптома (например, потери зрения, потери остроты зрения, потери или снижения ловкости рук, повышенной утомляемости и/или императивного недержания мочи) РС у пациента посредством введения пациенту аутологичных T-клеток (например, CTL, таких как пептид-специфические аутологичные CTL, представленные в настоящем описании), экспрессирующих T-клеточный рецептор, специфически связывающийся с пептидом EBV, презентированным на MHC класса I. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения остроты зрения, улучшения цветного зрения или стабилизации потери зрения у пациента с РС, включающим введение пациенту аутологичных T-клеток (например, CTL, таких как пептид-специфические аутологичные CTL, представленные в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам улучшения двигательных навыков, равновесия или ловкости рук у пациента с РС, включающим введение пациенту аутологичных T-клеток, представленных в настоящем описании. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам улучшения сна у пациента, включающим введение пациенту аутологичных T-клеток (например, CTL, таких как пептид-специфические аутологичные CTL, представленные в настоящем описании).
В некоторых вариантах осуществления пациента подвергают диагностическому тесту, такому как EDSS. В некоторых вариантах осуществления пациента подвергают тесту EDSS и приписывают баллы EDSS до и/или после введения T-клеток. Баллы EDSS могут оставаться прежними или могут снижаться (например, по меньшей мере на 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 или 5,0) после введения T-клеток.
Различные способы, представленные в настоящем описании, могут являться способами улучшения ходьбы, зрения, равновесия, когнитивных функций или других симптомов у пациента, такого как пациент с рассеянным склерозом, и/или способам улучшения баллов Комплексной шкалы рассеянного склероза (MSFC), EDSS или MSSS у пациента, такого как пациент с рассеянным склерозом. Таким образом, в определенных вариантах осуществления способы лечения, представленные в настоящем описании, включают способы стабилизации или улучшения нарушения дееспособности или состояния (например, двигательных навыков/равновесия/ловкости рук, сна, остроты зрения или цветного зрения, утомляемости, императивного недержания мочи) у пациента, при этом баллы оценки нарушения дееспособности пациента (измеряемые с помощью любого из этих тестов или другого подходящего теста) через неделю, две недели, четыре недели, 6 недель, 8 недель, 10 недель, три месяца, шесть месяцев, один год или два года терапии являются по меньшей мере на приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 2%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50% или даже по меньшей мере приблизительно 60% более высокими, чем баллы EDSS до терапии T-клетками.
Например, можно определять баллы EDSS пациента, например, оценивая показатели пациента при тестировании в различные моменты времени, такие как 0 месяцев (исходный уровень), 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 1 год и 2 года. В определенных вариантах осуществления, если задокументировано снижение баллов пациента после введения T-клеток, то РС считают стабилизированным и/или непрогрессирующим. В других вариантах осуществления, если не наблюдают повышения или снижения баллов пациента после введения T-клеток, то РС считают стабилизированным и/или непрогрессирующим. Тест EDSS можно повторять в любой момент времени от начала лечения CTL (например, через неделю, две недели, три недели, четыре недели, месяц, два месяца, три месяца после начала лечения CTL) для оценки того, замедлило ли или остановило ли лечение какое-либо дальнейшее ухудшение двигательных навыков/равновесие/ловкость рук, улучшило ли сон, остроту зрения или цветное зрение, утомляемость, императивное недержание мочи.
В некоторых вариантах осуществления прогрессирование нарушения ходьбы можно тестировать с использованием теста с ходьбой, например, оценивая показатели пациента в тесте с ходьбой на 25 футов в различные моменты времени. В определенных вариантах осуществления, если не задокументировано ухудшение ходьбы, то пациента считают неимеющим ухудшение ходьбы. В случае такого пациента, еще не подвергаемого терапии T-клетками, при наблюдении у него прогрессирующего нарушения ходьбы начинают лечение T-клетками, например, CTL. Тест с ходьбой можно повторять (например, через неделю, две недели, три недели, четыре недели, месяц, два месяца, три месяца после начала лечения) для оценки того, замедлило ли или остановило ли лечение какое-либо дальнейшее ухудшение показателей ходьбы, например, измеряемых с помощью теста с ходьбой.
Улучшение когнитивных функций, ассоциированное с терапией РС, представляющее собой замедление снижения когнитивных функций, стабилизацию снижения когнитивных функций или улучшение снижения когнитивных функций, можно оценивать с использованием теста PASAT (например, PASAT 2 или PASAT 3), или теста SDMT, или, альтернативно, теста РС-COG (см. Erlanger et al., J Neuro Sci 340: 123-129 (2014)).
Точные уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях, представленных в настоящем описании, можно варьировать так, чтобы получать количество активного ингредиента, являющееся эффективным для достижения желаемого терапевтического ответа в случае конкретного пациента, композиции и способа введения, но не токсичным для пациента.
Выбранный уровень доз будет зависеть от множества факторов, включая активность конкретного используемого средства, путь введения, время введения, скорость экскреции или метаболизма конкретного используемого соединения, длительность лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, используемых в комбинации с конкретным используемым соединением, возраст, пол, масса тела, состояние, общее состояние здоровья и анамнез пациента, подвергаемого лечению, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Исследование пациентов с РС и многократного лечения с использованием терапии EBV-специфическими T-клетками
Участники исследования сдавали образец крови объемом 200-400 мл. Мононуклеарные клетки периферической крови из этого образца использовали для получения аутологичных, специфических по латентному мембранному белку (LMP1 и 2)/ядерному антигену вируса Эпштейна-Барр 1 (EBNA1) T-клеток, суспендированных в нормальном физиологическом растворе клинической категории, в лабораторных условиях. Исследуемый продукт получают посредством стимуляции гамма-облученными аутологичными мононуклеарными клетками периферической крови, инфицированными рекомбинантным аденовирусным вектором AdE1-LMPpoly, аденовирусным вектором, кодирующим множественные эпитопы CD8+ T-клеток из ядерного антигена EBV-1 (EBNA1), латентного мембранного белка 1 (LMP1) и LMP2A. Затем культуры T-клеток оценивают на выход клеток, жизнеспособность и долю T-клеток. Между получением образца крови объемом 200-400 мл и первым введением клеток, как правило, проходит приблизительно 5 недель.
Каждому пациенту вводили его собственные T-клетки, стимулированные ex vivo для повышения реактивности в отношении EBNA1, LMP1 и LMP2A, а затем наблюдали за ним в течение 26 недель. Пациентам внутривенно вводили T-клеточное терапевтическое средство с двухнедельными интервалами. Каждую дозу вводили однократно, при этом начальная доза составляла 5×106 T-клеток, за ней следовали дозы 1×107, 1,5×107 и 2×107 клеток. За 8 недель вводили всего четыре дозы. Каждую дозу клеток вводили с помощью внутривенной инфузионной капельной системы, делающей возможным медленное введение T-клеток в кровоток, а не болюсное введение клеток.
В исследование включали тринадцать пациентов. Трех пациентов исключали до введения клеточного терапевтического средства: одного по причине диагностики неродственного злокачественного новообразования, а еще двух по причине невозможности получения EBV-специфических T-клеток. Каждого из остальных десяти пациентов подвергали четырем инфузиям T-клеток по протоколу (таблица 1 ниже).
Аутологичные EBV-CTL хорошо переносились, и не наблюдали значительных нежелательных явлений (AE). Только у одного пациента наблюдали связанное, или возможно связанное, с лечением AE, являвшееся временным "изменением вкуса" степени 1, причиной которого посчитали растворитель DMSO. Не наблюдали AE степени 4 или 5.
У шести пациентов наблюдали симптоматическое и объективное клиническое улучшение, начавшееся через 2-14 недель после первой инфузии (таблица 1). Снижение утомляемости было заметной особенностью у пациентов с клиническим улучшением. Наблюдали корреляцию между реактивностью в отношении EBV и клиническим ответом. У пациентов, которым вводили T-клетки с более высокой реактивностью в отношении EBV, наблюдали больший клинический ответ. Шести пациентам в исследовании вводили T-клетки с ≥7% реактивности в отношении EBV; у пяти из этих пациентов наблюдали клиническое улучшение, при этом у 3 пациентов наблюдали улучшение баллов EDSS. Четырем пациентам вводили T-клетки с ≤3% реактивности в отношении EBV; только у одного из них наблюдали клиническое улучшение, у одного наблюдали ухудшение EDSS, а двое сообщали об отсутствии изменений. Клиническое улучшение в течение 6-месячного периода исследования или его отсутствие также коррелировали с биомаркерами EBV-специфической функции вводимых T-клеток (фиг. 2). По сравнению с пациентами без наблюдаемого благоприятного эффекта, пациентам, в случае которых наблюдали клиническую пользу, вводили терапевтическое средство, в значительной степени обогащенное EBV-специфическими CD8+ T-клетками, экспрессирующими CD107a, ИФНγ и ФНОα. Кроме того, клиническая польза коррелировала с многофункциональностью вводимых T-клеток (экспрессией CD107a, ИФНγ, ФНОα и ИЛ-2).
В настоящем исследовании терапия пациентов с РС аутологичными T-клетками являлась безопасной и хорошо переносилась, не наблюдали тяжелых AE, а единственным AE, связанным с лечением, являлась дисгевзия, вероятно, связанная с наличием DMSO в препарате, а не с T-клетками.
У пациентов с SPMS и PPMS наблюдали клиническое улучшение по сравнению с относительно фиксированным исходным уровнем (в течение до 5 лет), и оно не представляло собой разрешение обострения РС. Из 6 пациентов, которым вводили T-клетки с реактивностью в отношении EBV ≥7%, у 5 наблюдали клиническое улучшение, при этом у 3 пациентов улучшались баллы EDSS.
В соответствии с предполагаемым механизмом действия EBV-специфических T-клеток, по-видимому, наблюдали дозозависимую корреляцию между реактивностью T-клеточного продукта в отношении EBV и клиническим улучшением.
Снижение утомляемости являлось стойкой и заметной особенностью у пациентов, ответивших на лечение. Утомляемость является наиболее инвалидизирующим симптомом РС и может предшествовать клиническому дебюту РС, иногда на годы.
Данные, полученные авторами настоящего изобретения, увеличивают доказательства патогенетической роли инфекции EBV при РС. Т.к. T-клетки достигают всех компартментов ЦНС, терапия T-клетками, направленно воздействующими только на инфицированные EBV B-клетки, представляет собой новый вариант лечения, который может обеспечивать подходящую безопасность и длительную эффективность.
Пример 2: Пример способа многопараметрического окрашивания на внутриклеточные цитокины и анализа дегрануляции LMP- и EBNA1-специфических T-клеток
1. Смеси LMP/EBNA1 CD8 PepMix (стоковый раствор 100 мкг/мл), EBNA1 PepMix (стоковый раствор 100 мкг/мл) и любые HLA-совпадающих пептидных эпитопов (стоковый раствор 200 мкг/мл) разводили в RPMI 1640 с 10% FCS до концентрации 2 мкг/мл (конечная концентрация при анализе будет составлять 1 мкг/мл).
2. Смесь для стимуляции клеток разводили в соотношении 1:50 в RPMI 1640 с 10% FCS (конечным разведением при анализе будет 1:100).
Примечание: Смесь для стимуляции клеток eBioscience хранят при -20°C после разведения 1:5 в RPMI для получения 100-кратной стоковой концентрации.
3. В соответствующие лунки 96-луночного планшета с V-образным дном добавляли 100 мкл соответствующей PepMix, смеси пептидных эпитопов или смеси для стимуляции клеток или 100 мкл RPMI 1640 с 10% FCS (контроль без пептидов).
4. PBMC или T-клетки разбавляли в RPMI 1640 с 10% FCS до концентрации 5×106 клеток/мл (получая 5×105 клеток на анализ).
5. К клеткам добавляли GolgiPlug (брефелдин A) до конечного соотношения 2 мкл/мл клеток (конечная концентрация GolgiPlug при анализе будет составлять 1 мкл/мл).
6. К клеткам добавляли GolgiStop (монензин) до конечного соотношения 1,4 мкл/мл клеток (конечная концентрация GolgiStop при анализе будет составлять 0,7 мкл/мл).
7. К клеткам добавляли конъюгированного с FITC антитела против CD107a до конечного соотношения 50 мкл/мл (конечное количество антитела против CD107a составляет 5 мкл/тест).
8. В необходимые лунки 96-луночного планшета с V-образным дном добавляли 100 мкл клеточной суспензии.
9. Инкубировали в течение 4 часов при 37°C/6,5% CO2.
10. Центрифугировали планшет при 2300 об/мин в течение 2 минут.
11. Выбрасывали супернатант. Промывали клетки посредством добавления 200 мкл PBS с 2% FCS на лунку и центрифугировали планшет при 2300 об/мин в течение 2 минут. Повторяли эту стадию.
12. Клетки дважды промывали PBS с 2% FCS в объеме 200 мкл/промывку на лунку, центрифугируя пробирки при 1000×g (2300 об/мин) в течение 2 мин.
Окрашивание поверхностных антигенов клетки
13. Клетки ресуспендировали в 50 мкл/лунку PBS с 2% FCS, содержащего 0,125 мкл конъюгированного с perCP-Cy5.5 антитела против CD8, 0,25 мкл конъюгированного с Pacific Blue антитела против CD4 и 0,2 мкл реагента Live/Dead® Near IR. Инкубировали в течение 30 минут при 4°C.
14. Планшет центрифугировали при 2300 об/мин в течение 2 минут. Выбрасывали супернатант. Клетки промывали посредством добавления 200 мкл PBS с 2% FCS на лунку. Планшет центрифугировали при 2300 об/мин в течение 2 минут. Повторяли эту стадию.
15. Клетки ресуспендировали в 100 мкл раствора BD Cytofix/Cytoperm на лунку и инкубировали при 4°C в течение 20 минут.
16. Планшет центрифугировали при 2300 об/мин в течение 2 минут. Выбрасывали супернатант. Клетки промывали посредством добавления 200 мкл BD Perm/Wash на лунку. Планшет центрифугировали при 2300 об/мин в течение 2 минут. Повторяли эту стадию.
Окрашивание на внутриклеточные цитокины
17. Фиксированные/пермеабилизованные клетки ресуспендировали в 50 мкл/лунку раствора BD Perm/Wash, содержащего 1 мкл конъюгированного с PE антитела против ИЛ-2, 1 мкл конъюгированного с AF700 антитела против ИФНγ и 0,25 мкл конъюгированного с APC антитела против ФНОα. Инкубировали в течение 30 минут при 4°C.
18. Планшет центрифугировали при 2300 об/мин в течение 2 минут. Выбрасывали супернатант. Клетки промывали посредством добавления 200 мкл раствора Perm/Wash на лунку. Планшет центрифугировали при 2300 об/мин в течение 2 минут. Повторяли эту стадию.
19. Клетки ресуспендировали в 200 мкл PBS с 2% параформальдегида и хранили при 4°C.
20. Клетки анализировали с использованием BD Fortessa. Продукцию цитокинов/дегрануляцию анализировали с использованием программного обеспечения Flow Jo.
Таблица 2
Код пациента Возраст/пол (тип РС) EDSS
Исходный уровень/после лечения		 Реактивность CD8+ T-клеток в отношении EBV Наблюдаемое клиническое улучшение Конкретный клинический ответ, наблюдаемый после адоптивной терапии T-клетками
Пациенты, не ответившие на лечение №1 49 лет/Ж (SPMS) 6,5/6,5 <1% Слабое ⋅ Утомляемость: Шкала тяжести утомляемости (FSS): 59 до лечения → 35 на неделе 15 → 47 на неделе 27
⋅ Возможность заниматься садоводством, рисовать, выполнять повседневную деятельность
⋅ Улучшение равновесия
⋅ Положительная проба Ромберга → отрицательная проба Ромберга после лечения
⋅ Индекс IgG CSF 0,69 → 0,61 (NR<0,70)
№2 54 лет/Ж (SPMS) 6,5/6,5 <1% Нет ⋅ Отсутствие улучшения
⋅ Индекс IgG CSF 0,90 → 0,88
№6 53 лет/М (PPMS) 6,0/6,0 <1% Нет ⋅ Отсутствие улучшения
⋅ Индекс IgG CSF 0,59 → 0,50
№7 42 лет/Ж (PPMS) 6,5/7,0 3% Нет ⋅ Отсутствие улучшения
⋅ EDSS повышался с 6,5 на неделе 21 до 7,0 на неделе 27
⋅ Индекс IgG CSF 0,93 → 1,08
Пациенты, ответившие на лечение №8* 46 лет/М (SPMS) 8,0/8,0 7% Да ⋅ FSS 40 на неделе 1 → 12 на неделе 27
⋅ Повысилась продуктивность
⋅ Улучшились произвольные движения в больших пальцах и левой щиколотке
⋅ Снижение продукции IgG CSF (фигура 4)
№10 55 лет/Ж (PPMS) 5,0/4,5 8% Да ⋅ FSS 62 на неделе 1 → 57 на неделе 7 → 56 на неделе 15
⋅ Улучшение качества сна и письма
⋅ Улучшение показателей ходьбы с максимум 200 метров без посторонней помощи или отдыха до лечения до 300 метров на неделе 15
⋅ Улучшение EDSS: 5,0 на неделе 1 → 4,5 на неделе 15
№3 61 год/М (SPMS) 6,5/6,5 10% Неясное ⋅ Пациент сообщал о повышенной продуктивность, но плохом анамнезе
⋅ Пациент отказался от люмбальных пункций при последующем наблюдении
№4 49 лет/Ж (PPMS) 8,0/8,0 15% Да ⋅ Утомляемость: FSS 50 до лечения → 34 на неделе 27 (фигура 5)
⋅ QOL: 7 до лечения → 9 на неделях 15 и 27
⋅ Острота зрения: 6/9 (20/30) билатерально → 6/6 (20/20) билатерально после лечения
⋅ Цветное зрение (таблицы Ишихары)
⋅ R 13/21 и L 15/21 → 19/21 билатерально после лечения
⋅ Улучшение ловкости рук при обращении со столовыми приборами
⋅ Снижение императивного недержания мочи
⋅ Снижение эпизодов никтурии на 75%
⋅ Уменьшение головокружения
⋅ Улучшение спазмов нижних конечностей и уменьшение симптоматических клонусов
⋅ Индекс IgG CSF 0,89 → 1,04
№9 60 лет/М (PPMS) 5,0/3,5 31% Да ⋅ FSS 44 на неделе 1 → 42 на неделе 7 → 45 на неделе 15
⋅ Улучшение способности фокусировать внимание, концентрации и продуктивности
⋅ Улучшение равновесия и ходьбы с максимум 200 метров без посторонней помощи или отдыха до лечения до 300 метров на неделе 7 и 500 метров на неделях 11, 15 и 21
⋅ Улучшение EDSS: 5,0 на неделе 1 → 4,5 на неделе 7 → 3,5 на неделях 11, 15 и 21
№5 60 лет/Ж (SPMS) 6,5/6,0 47% Да ⋅ Утомляемость: FSS 60 → 9 на неделе 27
⋅ QOL: 7 до лечения → 9 на неделях 7, 15 и 27
⋅ Впервые почувствовала себя хорошо за долгие годы
⋅ Повышение подвижности при использовании ролятора со 100 метров с изнеможением до лечения до 1,5 км после лечения
⋅ Теперь проходит 100 метров с односторонней поддержкой 9улучшение EDSS 6,5 → 6,0
⋅ Улучшение ловкости рук: впервые за долги годы смогла надеть серьги
⋅ Никтурия снизилась на 80% и улучшился сон
⋅ Повысилась продуктивность при всех видах деятельности
⋅ После лечения тонус нижних конечностей стал почти нормальным, сила и коленные рефлексы нормальны впервые за 16 лет
⋅ Ощущения легкого прикосновения и вибрации в нижних конечностях стали нормальными
⋅ Временно нормализовались подошвенные рефлексы
⋅ Координация верхних и нижних конечностей стала нормальной
⋅ Индекс IgG CSF 0,48 → 0,48
* Пациента №8 повторно лечили аутологичными T-клетками. Первое лечение проводили в 2014 году.

Claims (41)

1. Способ лечения или профилактики рассеянного склероза (РС) у пациента, включающий введение пациенту аутологичных цитотоксических T-клеток (CTL), экспрессирующих T-клеточный рецептор, специфически связывающийся с пептидом EBV, презентированным на MHC класса I, где по меньшей мере 7% CTL экспрессируют ИФНγ.
2. Способ по п.1, где по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 20% CTL экспрессируют один или более из CD107a, ИЛ-2 и ФНО, или по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 20% CTL экспрессируют ИФНγ.
3. Способ по п.1, где по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 70% CTL экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
4. Способ по п.1, где по меньшей мере 42% CTL экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
5. Способ по п.1, где по меньшей мере 50% CTL экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
6. Способ по п.1, где по меньшей мере 60% CTL экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
7. Способ лечения или профилактики РС у пациента, включающий:
a) инкубацию образца, содержащего аутологичные цитотоксические T-клетки (CTL), с антигенпрезентирующими клетками (АПК), презентирующими пептид EBV, и, таким образом, индуцирование пролиферации пептид-специфических T-клеток в образце; и
b) введение пациенту пептид-специфических аутологичных CTL, где по меньшей мере 7% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL экспрессируют ИФНγ.
8. Способ по п.7, дополнительно включающий анализ экспрессии одного или более из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными CTL и, если
(а) по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 20% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL экспрессируют один или более из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО, и/или
(b) по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 20% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL экспрессируют ИФНγ,
введение пациенту пептид-специфических аутологичных CTL.
9. Способ по п.7, дополнительно включающий анализ экспрессии ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными CTL и, если по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 50% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО, введение пациенту пептид-специфических аутологичных CTL.
10. Способ по п.7, дополнительно включающий анализ экспрессии ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными CTL и, если по меньшей мере 42% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО, введение пациенту пептид-специфических аутологичных CTL.
11. Способ по п.7, дополнительно включающий анализ экспрессии ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными CTL и, если по меньшей мере 50% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО, введение пациенту пептид-специфических аутологичных CTL.
12. Способ по п.7, дополнительно включающий анализ экспрессии ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными CTL и, если по меньшей мере 60% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО, введение пациенту пептид-специфических аутологичных CTL.
13. Способ по п.7, где АПК включают B-клетки, антигенпрезентирующие T-клетки, дендритные клетки, искусственные антигенпрезентирующие клетки или клетки aK562.
14. Способ по п.7, где пептид EBV содержит аминокислотную последовательность, приведенную в таблице 1.
15. Способ по любому из пп.1-14, в котором лечение или профилактика РС у пациента снижает уровни IgG против EBV в CSF пациента с РС.
16. Способ по любому из пп.1-14, включающий введение пациенту приблизительно 5 × 106 CTL, приблизительно 1 × 107 CTL, приблизительно 1,5 × 107 CTL или приблизительно 2 × 107 CTL в дозе.
17. Способ по любому из пп.1-14, где РС является рецидивирующе-ремиттирующим РС, вторично-прогрессирующим РС, первично-прогрессирующим РС или прогрессирующе-ремиттирующим РС.
18. Применение аутологичных цитотоксических T-клеток (CTL), экспрессирующих T-клеточный рецептор, специфически связывающийся с пептидом EBV, презентированным на MHC класса I, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики рассеянного склероза (MS) у пациента, где по меньшей мере 7% CTL экспрессируют ИФНγ.
19. Применение по п.18, где по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 20% CTL экспрессируют один или более из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
20. Применение по п.18, где по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 70% CTL экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
21. Применение по п.18, где по меньшей мере 42% CTL экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
22. Применение по п.18, где по меньшей мере 50% CTL экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
23. Применение по п.18, где по меньшей мере 60% CTL экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
24. Применение аутологичных цитотоксических T-клеток (CTL) в получении лекарственного средства для лечения или профилактики РС у пациента, где по меньшей мере 7% CTL в лекарственном средстве экспрессируют ИФНγ, и получение включает:
a) инкубацию образца, содержащего аутологичные цитотоксические T-клетки (CTL), с антигенпрезентирующими клетками (АПК), презентирующими пептид EBV, и, таким образом, индуцирование пролиферации пептид-специфических T-клеток в образце; и
b) подтверждение, что по меньшей мере 7% CTL в лекарственном средстве экспрессируют IFNγ.
25. Применение по п.24, где получение дополнительно включает анализ экспрессии одного или более из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными CTL и подтверждение, что по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 20% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL в лекарственном средстве экспрессируют один или более из CD107a, ИЛ-2 и ФНО, или по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 20% CTL в лекарственном средстве экспрессируют ИФНγ.
26. Применение по п.24, где получение дополнительно включает анализ экспрессии ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными CTL и подтверждение, что по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 50% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL в лекарственном средстве экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
27. Применение по п.24, где получение дополнительно включает анализ экспрессии ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными CTL и подтверждение, что по меньшей мере 42% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL в лекарственном средстве экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
28. Применение по п.24, где получение дополнительно включает анализ экспрессии ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными CTL и подтверждение, что по меньшей мере 50% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL в лекарственном средстве экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
29. Применение по п.24, где получение дополнительно включает анализ экспрессии ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО пролиферирующими пептид-специфическими аутологичными CTL и подтверждение, что по меньшей мере 60% пролиферирующих пептид-специфических аутологичных CTL в лекарственном средстве экспрессируют каждый из ИФНγ, CD107a, ИЛ-2 и ФНО.
30. Применение по п.24, где АПК включают B-клетки, антигенпрезентирующие T-клетки, дендритные клетки, искусственные антигенпрезентирующие клетки или клетки aK562.
31. Применение по п.24, где пептид EBV содержит аминокислотную последовательность, приведенную в таблице 1.
32. Применение по любому из пп.18-31, где лечение или профилактика РС у пациента снижает уровни IgG против EBV в CSF пациента с РС.
33. Применение по любому из пп.18-31, включающее введение пациенту приблизительно 5 × 106 CTL, приблизительно 1 × 107 CTL, приблизительно 1,5 × 107 CTL или приблизительно 2 × 107 CTL в дозе.
34. Применение по любому из пп.18-31, где РС является рецидивирующе-ремиттирующим РС, вторично-прогрессирующим РС, первично-прогрессирующим РС или прогрессирующе-ремиттирующим РС.
RU2019124454A 2017-01-20 2018-01-19 Способы лечения рассеянного склероза с использованием аутологичных т-клеток RU2769474C2 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762448707P 2017-01-20 2017-01-20
US62/448,707 2017-01-20
US201762576349P 2017-10-24 2017-10-24
US62/576,349 2017-10-24
PCT/US2018/014458 WO2018136762A1 (en) 2017-01-20 2018-01-19 Methods of treating multiple sclerosis using autologous t cells

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2019124454A RU2019124454A (ru) 2021-02-20
RU2019124454A3 RU2019124454A3 (ru) 2021-10-01
RU2769474C2 true RU2769474C2 (ru) 2022-04-01

Family

ID=62909271

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019124454A RU2769474C2 (ru) 2017-01-20 2018-01-19 Способы лечения рассеянного склероза с использованием аутологичных т-клеток

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20190350981A1 (ru)
EP (1) EP3570852A4 (ru)
JP (2) JP2020506901A (ru)
KR (1) KR20190124214A (ru)
CN (1) CN110430886A (ru)
AU (1) AU2018210375B2 (ru)
BR (1) BR112019014406A2 (ru)
CA (1) CA3050299A1 (ru)
MX (1) MX2019008460A (ru)
NZ (1) NZ755116A (ru)
RU (1) RU2769474C2 (ru)
SG (1) SG11201906097VA (ru)
TW (1) TW201840327A (ru)
WO (1) WO2018136762A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017271122B2 (en) 2016-05-25 2023-10-26 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Methods of immunotherapy
US20210380657A1 (en) * 2018-10-25 2021-12-09 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research T-Cell Receptors and Uses Thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2558294C1 (ru) * 2014-09-16 2015-07-27 Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020009448A1 (en) * 1997-09-19 2002-01-24 Leslie P. Weiner T-cell vaccination for the treatment of multiple sclerosis
DE60031874D1 (de) * 1999-09-30 2006-12-28 Univ Washington Immunologisch relevante antigene aus herpes simplexvirus
KR100795840B1 (ko) * 2002-08-08 2008-01-17 베일러 칼리지 오브 메디신 Ｔ세포의 분리 및 식별
CN1893971A (zh) * 2003-10-17 2007-01-10 贝勒医学院 用于增强cd8+细胞毒性t细胞应答和用于治疗多发性硬化的方法
US20140044687A1 (en) * 2011-03-25 2014-02-13 Txcell Method for using regulatory t cells in therapy
JP7197979B2 (ja) * 2015-05-28 2022-12-28 カイト ファーマ インコーポレイテッド Ｔ細胞療法のために患者をコンディショニングする方法
AU2017271122B2 (en) * 2016-05-25 2023-10-26 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Methods of immunotherapy
AU2017271134A1 (en) * 2016-05-25 2019-01-03 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Methods of treating autoimmune disease using allogeneic t cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2558294C1 (ru) * 2014-09-16 2015-07-27 Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIELA F. ANGELINI et al., Increased CD8+ T Cell Response to Epstein-Barr Virus Lytic Antigens in the Active Phase of Multiple Sclerosis, PLOS Pathogens, 2013, Vol. 9, Issue 4, e1003220, pp.1-16. *
MANUEL A. FRIESE et al., Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy?, Brain (2005), 128, 1747-1763 doi:10.1093/brain/awh578. *
MICHAEL P PENDER et al., Epstein-Barr virus and multiple sclerosis: potential opportunities for immunotherapy, Clinical & Translational Immunology, 2014, 3, e27; doi:10.1038/cti.2014.25. *
MICHAEL P PENDER et al., Epstein-Barr virus and multiple sclerosis: potential opportunities for immunotherapy, Clinical & Translational Immunology, 2014, 3, e27; doi:10.1038/cti.2014.25. MANUEL A. FRIESE et al., Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy?, Brain (2005), 128, 1747-1763 doi:10.1093/brain/awh578. DANIELA F. ANGELINI et al., Increased CD8+ T Cell Response to Epstein-Barr Virus Lytic Antigens in the Active Phase of Multiple Sclerosis, PLOS Pathogens, 2013, Vol. 9, Issue 4, e1003220, pp.1-16. *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018210375B2 (en) 2024-04-04
EP3570852A1 (en) 2019-11-27
KR20190124214A (ko) 2019-11-04
AU2018210375A1 (en) 2019-07-25
NZ755116A (en) 2024-03-22
EP3570852A4 (en) 2020-08-05
WO2018136762A1 (en) 2018-07-26
TW201840327A (zh) 2018-11-16
JP2020506901A (ja) 2020-03-05
JP2023052033A (ja) 2023-04-11
BR112019014406A2 (pt) 2020-04-28
CA3050299A1 (en) 2018-07-26
SG11201906097VA (en) 2019-08-27
US20190350981A1 (en) 2019-11-21
RU2019124454A3 (ru) 2021-10-01
RU2019124454A (ru) 2021-02-20
CN110430886A (zh) 2019-11-08
MX2019008460A (es) 2019-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220409662A1 (en) Methods of treating autoimmune disease using allogeneic t cells
JP5898260B2 (ja) 併用療法におけるｃｄ８３の使用
US20200407406A1 (en) Peptides and methods for the treatment of diabetes
JP2008500812A (ja) 免疫抑制サイトカイン
JP2023052033A (ja) 自家ｔ細胞を用いた多発性硬化症の処置方法
Komita et al. CD8+ T-cell responses against hemoglobin-β prevent solid tumor growth
KR20220117903A (ko) Cd19-표적화된 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
JP2022512538A (ja) Ｅｂｖ関連がんの処置のための抗ｌｍｐ２ ｔｃｒ－ｔ細胞療法
JP2024517475A (ja) 自己免疫を治療するための操作されたｈｌａ対立遺伝子
EP4251198A1 (en) Combinations of small molecule drug conjugate and car-expressing cytotoxic lymphocytes and methods of treating cancer using the same
CN115916805A (zh) 具有延伸的氧化还原酶基序的免疫原性肽
RU2773831C2 (ru) Способы лечения аутоиммунного заболевания с использованием аллогенных т-клеток
US20160206699A1 (en) Use of interleukin 10 mrna transfected macrophages in anti-inflammatory therapies
WO2024088412A1 (zh) 一种小鼠细胞、人源化小鼠及其构建方法和应用
US20240018213A1 (en) Modulators of notch signaling and methods of use thereof
WO2015090223A1 (zh) 蛋白及其在治疗多发性硬化中的用途
CN109400692B (zh) 特异短肽、表达特异短肽的重组间充质干细胞以及它们的应用
TW202005658A (zh) T細胞受體及表現其之工程化細胞