BR112019014406A2 - métodos de tratar esclerose múltipla usando células t autólogas - Google Patents

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Khanna Rajiv
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Abstract

fornecidos aqui são métodos compreendendo células t citotóxicas autólogas expressando receptor de células t que especificamente liga-se a um vírus epstein barr (ebv) ou expressando cd107a, tnf, ifn-gama ou il-2 para o tratamento de esclerose múltipla em um indivíduo ou selecionar um indivíduo a adotar imunoterapia.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ’’MÉTODOS DE TRATAR ESCLEROSE MÚLTIPLA USANDO CÉLULAS T AUTÓLOGAS”.
PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido de Patente Provisório dos EUA, número de série 62/448707, depositado em 20 de janeiro de 2017 e Pedido de Patente Provisório dos EUA, número de série 62/576349, depositado em 24 de outubro de 2017, cada um deles incorporado por referência em sua totalidade.
ANTECEDENTE [002] Doenças autoimunes, tal como esclerose múltipla (EM), são patologias decorrentes de resposta imune anormal contra o próprio tecido do corpo. A EM é caracterizada pela degradação da mielina, uma casca lipídica protetora que envolve as fibras nervosas, pelas próprias células imunológicas do corpo.
[003] Vírus Epstein Barr (EBV), também conhecido como herpesvirus humano 4, é um vírus de herpes onipresente. Recentemente, foi demonstrado que a exposição ao EBV pode predispor ou de outra maneira desempenhar um papel na patogênese das doenças autoimunes, incluindo a EM. Por exemplo, estudos recentes mostraram que indivíduos diagnosticados com EM apresentam níveis mais elevados de proteínas relacionadas ao EBV em células B agregadas no tecido nervoso do que indivíduos saudáveis. Hipotetiza-se que um aumento de células B infectadas por EBV e / ou a eliminação defeituosa de tais células possam predispor os indivíduos à esclerose múltipla.
SUMÁRIO [004] Fornecidos aqui são métodos para o tratamento de EM (por exemplo, EM remitente recorrente, EM progressiva secundária, EM progressiva primária ou EM progressivamente recorrente), compreendendo a administração a um indivíduo células T autólogas (por exem
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2/54 pio, células T citotóxicas ou CTLs) expressando um Receptor de célula T que especificamente liga-se a um peptídeo EBV apresentado em um MHC (por exemplo, um MHC de classe I). Em algumas modalidades, a EM é EM progressiva primária. Em algumas modalidades, os métodos compreendem melhorar ou estabilizar um sintoma de EM em um indivíduo administrando-se ao indivíduo células T autólogas (por exemplo, CTLs) expressando um receptor de células T que especificamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC de classe I. Da mesma forma fornecidos aqui são métodos de redução dos níveis de IgG anti-EBV no CSF de um indivíduo com EM administrando-se ao indivíduo células T autólogas (por exemplo, CTLs) expressando um receptor de células T que especificamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em uma Molécula de MHC de classe I.
[005] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, ou pelo menos 20% dos CTLs expressam CD107a, IFNy, TNF ou IL-2. Em algumas modalidades, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, ou pelo menos 80% dos CTLs expressam CD107a, IFNy, TNF e IL-2. Pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, ou pelo menos 30% dos CTLs têm reatividade de EBV.
[006] Em algumas modalidades, o peptídeo EBV compreende um peptídeo LMP1 ou um fragmento do mesmo, um peptídeo LMP2A ou um fragmento do mesmo, e / ou um peptídeo EBNA1 ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o peptídeo EBV compreende uma sequência listada na Tabela 1. Em certos aspectos, fornecidos aqui são métodos de tratamento da esclerose múltipla (por exemplo, EM remitente-recorrente, EM progressiva secundária, EM progressiva primária ou EM progressivamente recorrente), compreendendo isolar uma amostra compreendendo células T (por exemplo, CTLs) do indiví
Petição 870190065331, de 11/07/2019, pág. 32/109
3/54 duo, gerando células T que expressam um receptor de célula T que especiflcamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC (por exemplo, um MHC de classe I) e depois administrar as célula T a um indivíduo. Em algumas modalidades, as células T são geradas incubando-se uma amostra compreendendo célula T autólogas (por exemplo, uma amostra de PBMC) com células apresentadoras de antígenos (APCs) apresentando um peptídeo de EBV em um MHC (por exemplo, um MHC de classe I), desse modo induzindo proliferação célula T específicas de peptídeo (por exemplo, CTL autólogas específicos de peptídeo) na amostra. Em algumas modalidades, as APCs são feitas para apresentar o peptídeo de EBV por incubação com um construtor de ácido nucleico (por exemplo, AdE1-LMPpoli) codificando para o peptídeo de EBV, desse modo induzindo as APCs apresentar o peptídeo de EBV. Em algumas modalidades, as APCs podem ser células B, células T apresentadoras de antígeno, células dendríticas ou células apresentadoras de antígeno artificiais (por exemplo, uma linha celular que expressa CD80, CD83, 41BB-L e / ou CD86, tal como células K562). Em algumas modalidades, o método também compreende analisar a expressão de CD107a, IFNy, TNF ou IL-2 pelos CTL autólogas específicos de peptídeos proliferados e, se pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, a pelo menos 15%, ou pelo menos 20% dos CTL autólogas específicos de peptídeos proliferados expressam CD107a, IFNy, TNF ou IL-2, administrando os CTL autólogas específicos de peptídeos ao indivíduo. Em algumas modalidades, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, ou pelo menos 80% dos CTL autólogas específicos do peptídeo expressam CD107a, IFNy, TNF e IL-2. Os CTL autólogas específicos de peptídeo podem ter pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20% ou pelo menos 30% dos CTLs autólogos
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4/54 específicos de peptídeo tem reatividade ao EBV.
[007] Em algumas modalidades, o peptídeo de EBV compreende um peptídeo LMP1 ou um fragmento do mesmo, um peptídeo LMP2A ou um fragmento do mesmo, e / ou um peptídeo EBNA1 ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o peptídeo de EBV compreende uma sequência listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, a EM é EM progressiva primária.
[008] Em algumas modalidades, 5 x 10®, 1 x 107, 1,5 x 107 ou 2 x 107 células (por exemplo, CTLs) são administradas ao indivíduo. Em algumas modalidades, uma dose inicial de célula T (por exemplo, CTLs autólogos) é administrada, e uma ou mais doses adicionais de célula T (por exemplo, CTLs autólogos) são subsequentemente administradas, por exemplo, em doses crescentes ao longo do tratamento. Em algumas modalidades, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais doses são administradas. A quantidade de célula T (por exemplo, CTLs autólogos) pode variar desde a dose inicial até doses adicionais. Por exemplo, uma dose mais baixa pode ser administrada inicialmente, seguido por uma dose maior. Em algumas modalidades, pelo menos um, pelo menos 2, pelo menos 3 pelo menos 4 ou pelo menos 5 doses são administradas ao indivíduo. As doses podem ser administradas semanalmente ou quinzenalmente. Em algumas modalidades, o indivíduo não experimenta quaisquer efeitos adversos como resultado da administração de célula T (por exemplo, CTL autóloga). Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração de quatro doses de números de CTLs sucessivamente mais elevados. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração de uma primeira dose de 5 x 106 CTL, uma segunda dose de 1 x 107 CTL, uma terceira dose de 1,5 x 107 CTL e uma quarta dose de2x107 CTLs.
[009] Em alguns aspectos, o método também compreende avaliar
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5/54 a eficácia de adotar imunoterapia em um indivíduo com esclerose múltipla, obtendo uma primeira amostra de fluido espinal cerebral (CSF) do indivíduo, analisando a quantidade de IgG anti-EBV no CSF na primeira amostra, preferencialmente antes da administração de CTL e, após um período de tempo, para obter uma segunda amostra de CSF do indivíduo, preferencialmente após administração de CTL, analisando a quantidade relativa de IgG anti-EBV no CSF na segunda amostra e se a quantidade de IgG anti-EBV na segunda amostra é inferior à primeira amostra, a doença estabilizou e / ou não progrediu. Um período de tempo pode ser de uma semana, duas semanas, três semanas, quatro semanas, cinco semanas, seis semanas, três meses, seis meses ou um ano.
[0010] Em algumas modalidades, ao indivíduo é dado um teste diagnóstico, tal como um teste de EDSS. Em algumas modalidades, o indivíduo recebe um escore de EDSS antes e após a administração de célula T. O escore de EDSS pode permanecer o mesmo, ou o escore de EDSS pode diminuir (por exemplo, pelo menos 0,5 ou pelo menos 1,0) após a administração de célula T.
[0011] Em alguns aspectos, fornecidos aqui são métodos de seleção de um indivíduo para adotar imunoterapia, obtendo uma amostra compreendendo célula T (por exemplo, CTLs) do indivíduo, isolando as célula T autólogas, determinando a reatividade de EBV das célula T autólogas na amostra, e se pelo menos uma porcentagem limite (por exemplo, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13% , 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30 %, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%) das célula T autólogas são reativas ao EBV, selecionando o indivíduo para adotar imunoterapia.
[0012] Em alguns aspectos, fornecidos aqui são métodos de seleção de um indivíduo para adotar imunoterapia, obtendo uma amostra
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6/54 compreendendo célula T (por exemplo, CTLs) do indivíduo, isolando as célula T autólogas, determinando a expressão de CD107a, IFNy, TNF e / ou IL-2 das célula T autólogas, e se pelo menos uma porcentagem limite (por exemplo, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% , 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27 %, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%) das célula T autólogas expressam CD107a, IFNy, TNF e / ou IL-2, selecionando o indivíduo para adotar imunoterapia. Em algumas modalidades, o indivíduo tem EM (por exemplo, EM remitente-recorrente, EM progressiva secundária, EM progressiva primária ou EM progressivamente recorrente).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0013] Figura 1 tem dois painéis (A-B) e mostra o CSF antes e depois da terapia com célula T específica de EBV autóloga no paciente original após o primeiro ciclo de tratamento há 4 anos e após o re~ tratamento este ano no presente estudo. (A) índice de IgG CSF, com linha horizontal pontilhada indicando o limite superior da faixa normal. (B) A produção de IgG intratecal (IgG (loc)) foi calculada pela fórmula de Reiber e Felgenhauer (ref. 16): IgG (loc) (mg / L) = {(IgG CSF + IgG de soro) - [0,8 χ ( á ((albumina de CSF albumina de soro) 2 + 15))] + 1,8} x IgG de soro. Linhas verticais indicam infusões de célula T sucessivas de 5 x 106, 1 x 107, 1,5 x 107 e 2 χ 107 células.
[0014] Figura 2 tem duas partes (A-B) e mostra correlações entre a reatividade da célula T CD8+ específica para EBV do produto de célula Tea resposta clínica à terapia com célula T.
[0015] Figura 3 mostra a atividade da doença em uma ressonância magnética do cérebro.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Geral [0016] Fornecidos aqui são métodos de tratamento da esclerose
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7/54 múltipla (por exemplo, EM reincidente-remitente, EM secundária progressiva, EM progressiva primária ou EM progressivamente recorrente) em um indivíduo usando célula T autólogas (por exemplo, CTLs) que reconhecem um ou mais epítopos de EBV (por exemplo, um epítopo de EBV descrito aqui). Em algumas modalidades, o método compreende ainda isolar amostra compreendendo células T do indivíduo, incubar as células T com APC apresentando um pepitídeo de EBV (por exemplo, um pepitídeo de EBV descrito aqui), desse modo gerando células T que reconhecem um pepitídeo de EBV apresentado em um MHC. Da mesma forma fornecidos aqui são métodos para avaliar a eficácia de adotar imunoterapia em um indivíduo com esclerose múltipla, obtendo amostras do fluido espinal cerebral (CSF) do indivíduo antes e após a administração de célula T, e analisando a quantidade relativa de IgG anti-EBV no CSF.
Definições [0017] Por conveniência, alguns termos empregados na especificação, exemplos e reivindicações anexas são coletados aqui.
[0018] Os artigos “um” e “uma” são usados aqui para se referir a um ou mais do que um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.
[0019] Quando aqui utilizado, o termo administrar significa proporcionar um agente farmacêutico ou composição a um indivíduo, e inclui, porém não está limitado a, administrar por um profissional médico e autoadministrar. Tal agente pode conter, por exemplo, peptídeo descrito aqui, uma célula apresentadora de antígeno fornecida aqui e / ou uma célula T fornecida aqui.
[0020] O termo aminoácido destina-se a abranger todas as moléculas, sejam naturais ou sintéticas, que incluem tanto uma funcionalidade de amino como uma funcionalidade de ácido e podem ser inclu
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8/54 idas em um polímero de aminoácidos de ocorrência natural. Exemplos de aminoácidos incluem aminoácidos de ocorrência natural; análogos, derivados e congêneres dos mesmos; análogos de aminoácidos tendo cadeias laterais variantes; e todos os estereoisômeros de qualquer um dos anteriores.
[0021] O termo “ligação” ou “interação” refere-se a uma associação, que pode ser uma associação estável, entre duas moléculas, por exemplo, entre um TOR e um peptídeo / MHC, devido, por exemplo, a eletrostática, hidrofóbica, iônica e / ou interações de ligação de hidrogênio sob condições fisiológicas.
[0022] O termo “amostra biológica”, “amostra de tecido” ou simplesmente “amostra” refere-se a uma coleção de células obtidas a partir de um tecido de um indivíduo. A fonte da amostra de tecido pode ser tecido sólido, a partir de um órgão fresco, congelado e / ou preservado, amostra de tecido, biópsia ou aspirado; sangue ou quaisquer componentes do sangue, soro, sangue; fluidos corporais tais como fluido cerebral espinal, líquido amniótico, fluido peritoneal ou fluido intersticial, urina, saliva, fezes, lágrimas; ou células de qualquer momento da gestação ou desenvolvimento do indivíduo.
[0023] Quando aqui utilizado, o termo citocina refere-se a qualquer polipeptideo segregado que afeta as funções das células e é uma molécula que modula as interações entre células na resposta imunitária, inflamatória ou hematopoiética. Uma citocina inclui, porém não é limitada a monocinas e linfocinas, independentemente de quais células as produzem. Por exemplo, uma monocina é geralmente referida como sendo produzida e segregada por uma célula mononuclear, tal como um macrófago e / ou monócito. No entanto, muitas outras células da mesma forma produzem monocinas, tais como células exterminadoras naturais, fibroblastos, basófilos, neutrófilos, células endoteliais, astrócitos cerebrais, células estromais da medula óssea, queratinócitos epi
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9/54 dérmicos e linfócitos B. Linfocinas são geralmente referidas como sendo produzidas por células linfocltárias. Exemplos de citocinas incluem, porém não são limitados a, lnterleucina-1 (IL-1), lnterleucina-2 (IL-2), lnterleucina-6 (IL-6), lnterleucina-8 (IL-8), Fator-alfa de Necrose Tumoral (TNFa) e Fator beta de Necrose Tumoral (ΤΝΕβ).
[0024] O termo epítopo significa um determinante proteico capaz de se ligar especificamente a um anticorpo ou TCR. Os epítopos geralmente consistem em agrupamentos quimicamente tensoativos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar. Certos epítopos podem ser definidos por uma sequência particular de aminoácidos à qual um anticorpo é capaz de se ligar.
[0025] Quando aqui utilizado, a frase “farmaceuticamente aceitável” refere-se aqueles agentes, compostos, materiais, composições e / ou formas de dosagem que estão, dentro do escopo do julgamento médico, adequado para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação benefício / risco razoável.
[0026] Quando aqui utilizada, a frase “veículo farmaceuticamente aceitável” significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como uma carga líquida ou sólida, diluente, excipiente ou material de encapsulação de solvente, envolvido no carregamento ou transporte de um agente de um órgão ou parte do corpo, para outro órgão ou parte do corpo. Cada veículo deve ser aceitável no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial ao paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tais como lactose, glucose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose;
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10/54 (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tais como propilenoglicol; (11) polis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; (12) ésteres, tais como oieato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirogênio; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tamponadas de pH; (21) poliésteres, policarbonatos e / ou polianidridos; e (22) outras substâncias compatíveis não tóxicas utilizadas em formulações farmacêuticas. [0027] Os termos “polinucleotídeo” e “ácido nucleico” são usados de alternadamente. Referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: regiões de codificação ou não codificação de um gene ou fragmento de gene, loci (locus) definido a partir de análise de ligação, éxons, introns, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossómico, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, piasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metliados e análogos de nucleotídeos. Se presentes, modificações na estrutura de nucleotídeos podem ser conferidas antes ou depois da reunião do polímero. Um polinucleotídeo pode ser também modificado, tal como por conjugação com um componente de rotulagem. Em todas as sequências de ácido nucleico fornecidas aqui,
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11/54 os nucleotídeos U são alternáveis com os nucleotídeos T.
[0028] Quando aqui utilizado, um terapêutico que previne uma condição refere-se a um composto que, quando administrado a uma amostra estatística antes do início do distúrbio ou condição, reduz a ocorrência do distúrbio ou condição na amostra tratada em relação a uma amostra de controle não tratada, ou atrasa o início ou reduz a gravidade de um ou mais sintomas do distúrbio ou condição em relação à amostra de controle não tratada.
[0029] Quando aqui utilizado, “ligação específica” refere-se à capacidade de um TCR se ligar a um peptídeo apresentado em um MHC (por exemplo, MHC de classe I ou MHC de classe II). Tipicamente, um TCR liga-se especificamente ao seu peptídeo / MHC com uma afinidade de pelo menos um Kd de cerca de 10~4 M ou menos, e se liga ao antígeno predeterminado / parceiro de ligação com uma afinidade (expressa por Kd) que é pelo menos 10 vezes menos, pelo menos 100 vezes inferior ou pelo menos 1000 vezes inferior à sua afinidade para ligação a um complexo peptídeo / MHC não específico e não relacionado (por exemplo, um compreendendo um peptídeo de BSA ou um peptídeo de caseína).
[0030] Quando aqui utilizado, o termo indivíduo significa um animal humano ou não humano selecionado para tratamento ou terapia.
[0031] As frases quantidade terapeuticamente eficaz e quantidade eficaz quando aqui utilizadas significam a quantidade de um agente que é eficaz para produzir o efeito terapêutico desejado em pelo menos uma subpopulação de células em um indivíduo com uma razão benefício / risco razoável aplicável a qualquer tratamento médico.
[0032] Quando aqui utilizado, o termo “tratar uma doença em um indivíduo ou “tratamento” de um indivíduo tendo ou suspeito de ter uma doença refere-se a submeter o Indivíduo a um tratamento farmacêutico, por exemplo, a administração de uma CTL aqui descrita, tal
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12/54 que pelo menos um sintoma da doença é diminuído ou impedido de piorar.
[0033] O termo vetor refere-se aos meios pelos quais um ácido nucléico pode ser propagado e / ou transferido entre organismos, células ou componentes celulares. Os vetores incluem plasmídeos, vírus, bacteriófagos, pró-vírus, fagomídeos, transposons e cromossomas artificiais e similar, que podem ou não ser capazes de se replicarem autonomamente ou integrar em um cromossoma de uma célula hospedeira.
Peptídeos [0034] Em certos aspectos, são fornecidos aqui métodos de tratamento da esclerose múltipla (por exemplo, EM remitente recorrente, EM progressiva secundária, EM progressiva primária ou EM progressivamente recorrente) usando céiula T autólogas (por exemplo, CTLs) expressando TCRs que especificamente iigam-se a peptídeos compreendendo epítopos de EBV apresentados no MHC (por exemplo, MHC de classe I). Em algumas modalidades, fornecidos aqui são métodos gerando tais célula T autólogas, por exemplo, incubando-se uma amostra compreendendo célula T (isto é, célula T autólogas) com células apresentadoras de antígeno (APCs) que apresentam um ou mais dos epítopos de EBV descritos aqui (por exemplo, APCs que apresentam um peptídeo descrito aqui compreendendo um epítopo de EBV em um complexo de MHC de classe I).
[0035] Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos aqui compreendem uma sequência de qualquer proteína viral de EBV (por exemplo, uma sequência de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos contíguos de qualquer proteína EBV). Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos aqui contêm não mais do que 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 aminoácidos contíguos da proteína viral de EBV.
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13/54 [0036] Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos aqui compreendem uma sequência de LMP1 (por exemplo, uma sequência de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos contíguos de LMP1). Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos aqui contêm não mais do que 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 aminoácidos contíguos de LMP1. Uma sequência exemplificative de aminoácidos de LMP1 apresentada abaixo (SEQ ID NO: 1):
Figure BR112019014406A2_D0001
L.J. .:.1.1 1&.3.3.13*11 y Sá3 .Vt3:1.
ai tl 3.11 ali-ml. say-y: 1 ylv láífqallvl
Lsâ .111 l i.-s.a3.yl qasa<-:; 1 i ··;;· ·3»11;J 1 ai. U a :Sssh.γ,a.sy-ss.sskA3,si. va-y ayüíSyy s.Çííy st ddngphdplp qdpdmxteg pqdpdstdds ís. ggd: ppy.-aw dygyqdyhl.p· tl 11yt ;-?· [0037] Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos aqui compreendem uma sequência de LMP2A (por exemplo, uma sequência de pelo menos 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos contíguos de LMP2A). Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos aqui contêm não mais do que 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 aminoácidos contíguos de LMP2A. Uma sequência exemplar de aminoácidos LIVIP2A é fornecida abaixo (SEQ ID NO: 2):
Figure BR112019014406A2_D0002
y d;.s:.i.yi.ai ar< ayaa-slyr-p;; à Mcftas¥3t 3-vta.bislalss a-ap-yl a.:sl 11 ;·: 11 a a a a y 1 q ís sy. aa aaa:: wsraic. 3 tptpwdàss .: áISà a;: V
Figure BR112019014406A2_D0003
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W allllassáli sisas.:i;-at a 1 ks.J :sát at.; y ;ai ;lasal 11v ss.iyllfllss.il tsyyyssgs;as;y ••I.s gyyf;:;.?3y:.:l 1 astaaaysaa 1 ivsstasã 11 sss wàlãagjslàã liafal la a: íscc.ssyacyyc áf 1 irlyseatpy· tyytrsiv [0038] Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos aqui compreendem uma sequência de EBNA1 (por exemplo, uma sequên
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14/54 da de pelo menos 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoáddos contíguos de EBNA1). Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos aqui contêm não mais do que 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 aminoácidos contíguos de EBNA1. Uma sequência exemplar de aminoáddos EBNA1 é fornecida abaixo (SEQ ID NO: 3):
yfeylgs-pgp dgepdv^p^a isqgpsddpy
d-gkh.jzgqgg vsgv+vyggs à v .$ A. ν' 5.1^» ,
1 srS.pxgv sp^ygpgpgp 1 d® yflqph j.f vlkdsth
kvtvss £ddg vdlppvsíppis gridgdsggdg
[0039] Em algumas modalidades, o peptídeo compreende a sequência de um epítopo listado na Tabela 1.
Tabela 1: Epítopos de proteína viral de EBV exemplificativos
Sequência de Epítopo Restrição de HLA SEQ ID NO.
CLGGLLTMV À*02 4
FLYALALLL A*02 5
YLQQNWWTL A*02, A*68, A*69 6
YLLEMLWRL A*02 7
ALLVLYSFA A*02 8
LLSAWILTA A*0203 9
LTAGFLIFL A*0206 10
SSCSSCPLSKI A*11 11
PYLFWLAA A*23, A*24, A*30 12
TYGPVFMCL A*24 13
VMSNTLLSAW A*25 14
CPLSKILL B*08 15
RRRWRRLTV B*27 16
IEDPPFNSL B*40 17
IALYLQQNW B*57, B*58 18
MSNTLLSAW B*58 19
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15/54
VLKDAIKDL A*0203 20
RPQKRPSCI B*07 21
IPQCRLTPL B*07 22
YNLRRGTAL B*08 23
HPVGEADYFEY ET 3 5 24
LSRLPFGMA B*57 25
FVYGGSKTSL Cw*03 26
[0040] Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos aqui compreendem dois ou mais epítopos de EBV. Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos aqui compreendem pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 epítopos de EBV. Por exemplo, em algumas modalidades, o peptídeo fornecido aqui compreende dois ou mais epítopos de EBV ligados por ligantes (por exemplo, ligantes polipeptídicos).
[0041] Em algumas modalidades, a sequência dos peptídeos compreende uma sequência proteica viral de EBV exceto 1 ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) modificações de sequência conservadora. Quando aqui utilizado, o termo “modificações de sequência conservadora” pretende referir-se a modificações de aminoácidos que não afetam significativamente ou alteram a interação entre um TCR e um peptídeo contendo a sequência de aminoácidos apresentada em um MHC. Tais modificações conservadoras incluem substituições de aminoácidos, adições (por exemplo, adições de aminoácidos ao terminal N ou C do peptídeo) e deleções (por exemplo, deleções de aminoácidos do terminal N ou C do peptídeo). As substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias de base laterais (por exemplo, Usina,
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16/54 arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagína, glutamina, serina, treonina, tírosína, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Desse modo, um ou mais resíduos de aminoácidos dos peptídeos descritos aqui podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeias laterais e o peptídeo alterado pode ser testado para retenção da ligação de TCR utilizando métodos conhecidos na técnica. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo através de técnicas-padrão conhecidas na técnica, tais como mutagênese dirigida ao local e mutagênese mediada por PCR.
[0042] Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos aqui compreendem uma sequência que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica a uma sequência de proteína viral de EBV (por exemplo, a sequência de um fragmento de uma proteína viral de EBV). Para determinar a porcentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ideais (por exemplo, as lacunas podem ser introduzidas em uma ou ambas de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos para alinhamento ideal e sequências não idênticas podem ser desconsideradas para propósitos de comparação). Os resíduos de aminoácidos nas correspondentes posições de aminoácidos são em seguida comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido que a posição correspondente na segunda sequência, em seguida as moléculas são idênticas nessa posição. A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma
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17/54 função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências, tendo em conta o número de intervalos e o comprimento de cada intervalo, que necessitam ser introduzidos para o alinhamento ideal das duas sequências.
[0043] Em algumas modalidades, o peptídeo é um peptídeo quimérico ou de fusão. Quando aqui utilizado, um “peptídeo quimérico” ou “peptídeo de fusão” compreende um peptídeo possuindo uma sequência fornecida aqui ligada a um peptídeo distinto tendo sequência à qual não está ligado na natureza. Por exemplo, o peptídeo distinto pode ser fundido ao terminal N ou ao terminal C do peptídeo fornecido aqui diretamente, através de uma ligação peptídica, ou indiretamente através de um ilgante químico. Em algumas modalidades, o peptídeo fornecido aqui está ligado a outro peptídeo compreendendo um epítopo distinto de EBV. Em algumas modalidades, o peptídeo fornecido aqui está ligado a peptídeos compreendendo epítopos de outras doenças virais e / ou infecciosas.
[0044] Um peptídeo quimérico ou de fusão fornecido aqui pode ser produzido por técnicas convencionais de DNA recombinante. Por exemplo, os fragmentos de DNA que codificam as diferentes sequências peptídicas são iigados juntos de acordo com técnicas convencionais, por exemplo, empregando extremidades de extremidades cegas ou com extremidades trancadas para ligação, digestão com enzima de restrição para proporcionar terminais apropriados, preenchimento de extremidades coesivas, quando apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar união indesejada e ligação enzimática. Em outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores automáticos de DNA. Alternativamente, a amplificação por PCR de fragmentos de genes pode ser realizada utilizando iniciadores de ancoragem que dão origem a saliências complementares entre dois fragmentos de genes consecutivos que
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18/54 podem subsequentemente ser anelados e novamente amplificados para gerar uma sequência de gene quimérica (veja, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outro, Eds., John Wiley & Sons: 1992). Além disso, muitos vetores de expressão estão comercialmente disponíveis que já codificam uma porção de fusão.
[0045] Os peptídeos fornecidos aqui podem ser isolados a partir de células ou fontes de tecidos por um esquema de purificação apropriado utilizando técnicas de purificação de proteína convencionais e podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante e / ou podem ser quimicamente sintetizados utilizando técnicas padrões de síntese de peptídeos. Os peptídeos aqui descritos podem ser produzidos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas por expressão de nucleotídeos que codificam um peptídeo(s) da presente invenção. Alternativamente, esses peptídeos podem ser sintetizados por métodos químicos. Os métodos para expressão de peptídeos heterólogos em hospedeiros recombinantes, a síntese química de peptídeos e a tradução in vitro são bem conhecidos na técnica e são ainda descritos em Maniatis e outro, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2a Ed., Cold Spring Harbor, NY; Berger e Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif .; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91: 501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser et al. (1989) Science 243: 187; Merrifield, B. (1986) Science 232: 342; Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57: 957; e Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, que estão aqui incorporados por referência.
[0046] Em certos aspectos, fornecidas aqui são moléculas de ácido nucleico que codificam os peptídeos descritos aqui. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é um vetor. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é um vetor viral, tal como
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19/54 um vetor de expressão com base em adenovirus, compreendendo as moléculas de ácido nucleico descritas aqui. Em algumas modalidades, o vetor fornecido aqui codifica uma pluralidade de epítopos fornecidos aqui (por exemplo, como um poliepítopo). Em algumas modalidades, o vetor aqui fornecido codifica pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 epítopos, fornecidos aqui (por exemplo, epítopos fornecidos na Tabela 1).
[0047] Em algumas modalidades, o vetor é AdE1-LMPpoly. O vetor AdE1-LMPpoly codifica um poliepítopo de epítopos de CTL definidos a partir de LMP1 e LMP2 fundidos a uma sequência de EBNA1 depietada por repetição de Gly-Ala. O vetor AdEI-LMPpoly é descrito, por exemplo, em Smith e outro, Cancer Research 72: 1116 (2012); Duraiswamy e outro, Cancer Research 64: 1483-9 (2004); e Smith e outro, J. Immunol 117: 4897-906, cada dos quais está incorporado aqui por referência.
[0048] Quando aqui utilizado, o termo vetor refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nudeico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um plasmídeo, que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem de replicação bacteriana, vetores mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epíssomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, desse modo, ser replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes. Tais vetores são aqui referidos como vetores de expressão recombinantes (ou
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20/54 simplesmente vetores de expressão). Em algumas modalidades, fornecidos aqui são ácidos nucleicos operacionalmente ligados a uma ou mais sequências reguladoras (por exemplo, um promotor) em um vetor de expressão. Em algumas modalidades, a célula transcreve o ácido nucleico aqui fornecido e, desse modo, expressa um peptídeo aqui descrito. A molécula de ácido nucleico pode ser integrada no genoma da célula ou pode ser extracromossômica.
[0049] Em algumas modalidades, fornecidas aqui são células que contêm um ácido nucleico aqui descrito (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um peptídeo aqui descrito). A célula pode ser, por exemplo, procariótica, eucariótica, mamífera, aviária, murina e / ou humana. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula é uma APC (por exemplo, uma célula T apresentadora de antígeno, uma célula dendrítlca, uma célula B ou uma célula aK562). Nos presentes métodos, um ácido nucleico aqui descrito pode ser administrado à célula, por exemplo, como ácido nucleico sem veículo de liberação, em combinação com um reagente de liberação. Em algumas modalidades, qualquer método de liberação de ácido nucleico conhecido na técnica pode ser utilizado nos métodos descritos aqui. Reagentes de administração adequados incluem, porém não estão limitados a, por exemplo, o reagente lipofílico Mirus Transit TKO; lipofectina; lipofectamina; celfectina; policátions (por exemplo, polilisina), atelocolágeno, nanoplexos e lipossomas. Em algumas modalidades dos métodos descritos aqui, os lipossomas são utilizados para liberar um ácido nucleico a uma célula ou indivíduo. Os lipossomas adequados para utilização nos métodos descritos aqui podem ser formados a partir de lipídios formadores de vesículas padrões, que geralmente incluem fosfolipídios neutros ou negativamente carregados e um esterol, tal como colesterol. A seleção de lipídios é geralmente guiada pela consideração de fatores tais como o tamanho do
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21/54 lipossoma desejado e a semivida dos lipossomas na corrente sanguínea. Uma variedade de métodos é conhecida para a preparação de lipossomas, por exemplo, como descrito em Szoka e outro (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467; e Pat. U.S. Números 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 e 5,019,369, as descrições totais das quais estão aqui incorporadas por referência.
Célula T Autólogas [0050] Fornecidos aqui são métodos de tratamento da esclerose múltipla (por exemplo, EM remitente-recorrente, EM progressiva secundária, EM progressiva primária ou EM progressivamente recorrente) administrando-se aos indivíduos célula T autólogas (por exemplo, CTLs) expressando um receptor de célula T que especificamente ligase a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC. Em algumas modalidades, o MHC é um MHC de classe I. Em algumas modalidades, o MHC é um MHC de classe II.
[0051] Em algumas modalidades, fornecidas aqui são APC que apresentam um peptídeo aqui descrito (por exemplo, um peptídeo compreendendo uma sequência de epítopo de LMP1, LMP2A ou EBNA1). Em algumas modalidades, as APC são células B, célula T apresentadoras de antígeno, células dendríticas ou células apresentadoras de antígeno artificiais (por exemplo, células aK562).
[0052] Células dendríticas para uso no processo podem ser preparadas tirando-se PBMCs de uma amostra de paciente e colando-a em plástico. Geralmente, a população de monócito cola e todas as outras células podem ser lavadas. A população aderente é em seguida diferenciada com IL-4 e GM-CSF para produzir células dendríticas derivadas de monócitos. Estas células podem ser maturadas pela adição de IL-Ιβ, IL-6, PGE-1 e TNF-o (que regulam as moléculas coestimuladoras importantes na superfície da célula dendrítica) e são em seguida transduzidas com um ou mais os peptídeos fornecidos
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22/54 aqui.
[0053] Em algumas modalidades, a APC é uma célula apresentadora de antígeno artificial, tal como uma célula aK562. Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígeno artificial são projetadas para expressar CD80, CD83, 41BB-L e / ou CD86. Células apresentadoras de antígeno artificiais exemplares, incluindo células aK562, são descritas em Pub. de Pat. U.S. No. 2003/0147869, que está incorporada aqui por referência.
[0054] Em certos aspectos, fornecidos aqui são métodos de geração de APCs que apresentam um ou mais dos epítopos de EBV descritos aqui compreendendo o contato de uma APC com um peptídeo compreendendo um epítopo de EBV e / ou com um ácido nucléico que codifica um epítopo de EBV. Em algumas modalidades, as APCs são irradiadas. Em algumas modalidades, as APCs que apresentam um peptídeo descrito aqui (por exemplo, um peptídeo compreendendo uma sequência de epítopo de LMP1, LMP2A ou EBNA1). Uma célula apresentando um peptídeo descrito aqui pode ser produzida por técnlcas-padrão conhecidas na técnica. Por exemplo, uma célula pode ser pulsada para encorajar a captação do peptídeo. Em algumas modalidades, as células são transfectadas com um ácido nucleico codificando um peptídeo fornecido aqui. Fornecidos aqui são métodos de produção de células apresentadoras de antígeno (APCs), compreendendo a pulsação de uma célula com os peptídeos descritos aqui. Exemplos exemplificativos de produção de células apresentadoras de antígeno podem ser encontrados em W02013088114, aqui incorporados em sua totalidade.
[0055] Em algumas modalidades, fornecidas aqui são célula T (por exemplo, células T CD4 e / ou células T CD8) que expressam um TCR (por exemplo, um TCR αβ ou um TCR γδ) que reconhece um peptídeo aqui descrito apresentado em um MHC. Em algumas modalidades, a
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23/54 célula T é uma célula T CD8 (por exemplo, um CTL) que expressa um TCR que reconhece um peptídeo aqui descrito apresentado em um MHC de classe I. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T CD4 (por exemplo, uma célula T auxiliar) que reconhece um peptídeo aqui descrito apresentado em um MHC de classe II.
[0056] Em algumas modalidades, fornecidos aqui são métodos de gerar, ativar e / ou induzir a proliferação de célula T (por exemplo, CTL autólogas) que reconhecem um ou mais dos epítopos de EBV descritos aqui. Em algumas modalidades, uma amostra compreendendo células T autólogas (por exemplo, uma amostra de PBMC) é incubada em cultura com uma APC aqui fornecida (por exemplo, uma APC que apresenta um peptídeo compreendendo um epítopo de EBV em um complexo de MHC de classe I). Em algumas modalidades, as APCs são autólogas ao indivíduo de quem as células T foram obtidas. Em algumas modalidades, as APCs não são autólogas ao indivíduo de quem as células T foram obtidas. Em algumas modalidades, a amostra contendo células T é incubada 2 ou mais vezes com APCs aqui fornecidas. Em algumas modalidades, as células T são incubadas com as APCs na presença de pelo menos uma citocina. Em algumas modalidades, a citocina é IL-4, IL-7 e / ou IL-15. Métodos exemplares para induzir a proliferação de células T utilizando APCs são fornecidos, por exemplo, em Pub. de Pat U.S. No. 2015/0017723, que está aqui incorporado por referência.
[0057] Em algumas modalidades, fornecidas aqui são composições (por exemplo, composições terapêuticas) compreendendo células T e / ou APCs fornecidas aqui usadas para tratar e / ou prevenir uma doença autoimune em um indivíduo, administrando ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição. Em alguns aspectos, fornecidos aqui são métodos de tratamento de esclerose múltipla utilizando uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica, tais compo
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24/54 sições compreendendo CTLs autólogas). Em algumas modalidades, a composição inclui uma combinação de múltiplas (por exemplo, duas ou mais) CTLs fornecidas aqui.
Métodos Terapêuticos [0058] Em algumas modalidades, fornecidos aqui são métodos de tratamento de EM (por exemplo, EM progressiva primária) em um indivíduo administrando-se ao indivíduo células T autólogas (por exemplo, CTL autólogas) fornecidas aqui. Em algumas modalidades, a EM é EM remitente-recorrente, EM progressiva secundária, EM progressiva primária ou EM progressivamente recorrente. Em algumas modalidades, as células T autólogas são isoladas a partir de uma amostra de sangue mononuclear periférico. A expressão de biomarcadores pelas células T autólogas pode ser avaliada por qualquer método adequado, tal como citometria de fluxo. Em algumas modalidades, as células T autólogas são estimuladas por um vetor compreendendo peptídeos virais de EBV (por exemplo, AdE1-LMPpoly). Em algumas modalidades, as células T autólogas são estimuladas por um vetor viral e separadas através de citometria de fluxo. Por exemplo, as células T autólogas podem sofrer manchamento de superfície de acordo com os protocolos exemplificados no Exemplo 2. Em algumas modalidades, as células T autólogas são incubadas com um ou mais anticorpos específicos para CD107A e subsequentemente selecionadas por citometria de fluxo. Em algumas modalidades, as células T autólogas são incubadas com um ou mais anticorpos que se ligam a citocinas intracelulares, tais como anticorpos específicos para IFN-γ, IL-2 e / ou TNF. Em algumas modalidades, as células T autólogas são incubadas com anticorpos para citocinas Intracelulares e, subsequentemente, separadas por citometria de fluxo.
[0059] Em alguns aspectos, fornecidos aqui são métodos de seleção de um indivíduo para adotar imunoterapia, obtendo uma amostra
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25/54 de PMBC do indivíduo, isolando as células T autólogas, determinando a reatividade de EBV das células T autólogas, e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% , 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% das células T autólogas são reativas ao EBV, selecionando o indivíduo para adotar imunoterapia.
[0060] Em alguns aspectos, fornecidos aqui são métodos de seleção de um indivíduo para adotar imunoterapia, obtendo uma amostra compreendendo células T (por exemplo, CTLs) do indivíduo, isolando as células T autólogas e determinando a expressão de CD107A das células T autólogas, e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60% , 70% ou 80% das células T autólogas expressam CD107A, selecionando o indivíduo para adotar imunoterapia.
[0061] Em alguns aspectos, fornecidos aqui são métodos de seleção de um indivíduo para adotar imunoterapia, obtendo uma amostra compreendendo células T (por exemplo, CTLs) do indivíduo, isolando as células T autólogas, determinando a expressão de IFN das células T autólogas, e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60% , 70% ou 80% das células T autólogas expressam IFN, selecionando o sujeito para adotar imunoterapia.
[0062] Em alguns aspectos, fornecidos aqui são métodos de seleção de um indivíduo para adotar imunoterapia, obtendo uma amostra compreendendo células T (por exemplo, CTLs) do indivíduo, isolando as células T autólogas, determinando a expressão de TNF das células T autólogas, e se a menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%,
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10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17 %, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% das células T autólogas expressam TNF, selecionando o indivíduo para adotar imunoterapia.
[0063] Em alguns aspectos, fornecidos aqui são métodos de seleção de um indivíduo para adotar imunoterapia, obtendo uma amostra compreendendo células T (por exemplo, CTLs) do indivíduo, isolando as células T autólogas, determinando a expressão de IL-2 das células T autólogas e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16% , 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70% ou 80% das células T autólogas expressam H-2, selecionando o indivíduo para adotar imunoterapia.
[0064] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda obter uma amostra compreendendo as células T do indivíduo (por exemplo, obtendo uma amostra de PBMC do indivíduo). Em algumas modalidades, as células T autólogas (por exemplo, células T CD4 + ou células T CD8 +) são isoladas da amostra. Em algumas modalidades, a amostra é composta principalmente ou completamente de células T autólogas.
[0065] Fornecidos aqui são métodos de tratamento ou prevenção da esclerose múltipla (MS) em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo células T citotóxicas autólogas (CTLs) expressando um receptor de células T que especificamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC de classe I. Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70% ou 80% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam CD107A. Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%,
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8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70% ou 80% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam IFN-γ. Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70% ou 80% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam TNF. Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70% ou 80% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam IL-2.
[0066] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32 %, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam CD107A e IFN-γ.
[0067] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32 %, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou
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90% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam CD107AeTNF.
[0068] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32 %, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam CD107Ae IL-2.
[0069] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32 %, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam IFN-ye TNF.
[0070] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32 %, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou
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90% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam IFN-γ e IL-2.
[0071] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32 %, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam TNF e IL-2.
[0072] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32 %, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam IFN-γ, TNF e IL-2.
[0073] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32 %, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou
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90% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam CD107A, TNF e IL-2.
[0074] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32 %, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam CD107A, IFN-γ e IL-2.
[0075] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32 %, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam CD107A, IFN-γ e TNF.
[0076] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32 %, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou
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90% das células T (por exemplo, CTLs) na amostra expressam CD107A, IFN-γ, TNF e IL-2.
[0077] Em algumas modalidades, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16 %, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%,
32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%,
44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% , 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%,
56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66 %, 67%,
68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%,
80% 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T (por exemplo, CTLs) são reativas ao EBV.
[0078] A expressão de biomarcador de células T / e reatividade de EBV pode ser medida e / ou analisada antes ou depois de expansão de célula T com um construtor de ácido nucleico descrito aqui, polipeptídeo descrito aqui ou uma APC.
[0079] Em alguns aspectos, fornecidos aqui são métodos de tratamento ou prevenção de EM em um indivíduo por incubação de células apresentadoras de antígeno (APCs) com um construtor de ácido nucleico codificando para um peptídeo de EBV, desse modo induzindo as APCs a apresentarem um peptídeo de EBV, induzindo proliferação de células T específicas de peptídeo (por exemplo, CTL) incubando-se uma amostra compreendendo células T autólogas (por exemplo, CTLs) com as células apresentadoras de antígeno (APCs), desse modo induzindo as células T autólogas (por exemplo, CTLs) a proliferar e administrar as células T autólogas específicas de peptídeo (por exemplo, CTLs) ao indivíduo. Em algumas modalidades, a reatividade de EBV e a expressão de biomarcador são quantificadas antes do estímulo das células T autólogas com um vetor viral (por exemplo, um vetor viral descrito aqui) e / ou APCs (por exemplo, APCs divulgados aqui). Alternativamente ou adicionalmente, a reatividade de EBV e a expres
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32/54 são de biomarcadores podem ser quantificadas após o estímulo das céluias T autóiogas com um vetor viral (por exemplo, um vetor viral descrito aqui) e / ou APCs (por exemplo, uma APC transfectada com um vetor viral descrito aqui). Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida através da quantificação da porcentagem de células T na amostra que expressa CD107A. Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida através da quantificação da porcentagem de células T na amostra que expressa IFN-γ. Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida através da quantificação da porcentagem de células T na amostra que expressa TNF. Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida através da quantificação da porcentagem de células T em uma amostra que expressa IL-2. Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida como uma porcentagem de células T que expressam biomarcadores múltiplos (por exemplo, dois ou mais de CD107A, IFN-γ, TNF e IL-2, preferencialmente todos os quatro). Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é calculada quantificando a porcentagem de células T autóiogas em uma amostra que expressa CD107A, IFN-γ, TNF e IL-2. As células T podem ser isoladas a partir de uma amostra (por exemplo, uma amostra de PBMC ou uma amostra compreendendo células T) antes ou após a quantificação da porcentagem de reatividade de EBV. Consequentemente, em algumas modalidades, a reatividade de EBV é a porcentagem de células T que têm as características desejadas em uma amostra que compreende principalmente células T.
[0080] Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida quantificando a porcentagem de linfócitos CD8 + na amostra que expressa CD107A. Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida através da quantificação da porcentagem de linfócitos CD8+ na amostra que expressa IFN-γ. Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida através da quantificação da porcentagem de
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33/54 linfócitos CD8 + na amostra que expressa TNF, Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida através da quantificação da porcentagem de linfócitos CD8+ em uma amostra que expressa IL-2. Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida como uma porcentagem de linfócitos CD8+ que expressa biomarcadores múltiplos (por exemplo, dois ou mais de CD107A, IFN-γ, TNF e IL-2, preferencialmente todos os quatro). Os linfócitos CD8+ podem ser isolados a partir de uma amostra (por exemplo, uma amostra de PBMC ou uma amostra de linfócitos CD8+) antes ou depois da quantificação da porcentagem de reatividade de EBV. Consequentemente, em algumas modalidades, a reatividade de EBV a porcentagem de linfócitos CD8+ com a(s) característica(s) desejada(s) em uma amostra que compreende principalmente linfócitos CD8+.
[0081] Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida através da quantificação da porcentagem de linfócitos CD3+ na amostra que expressa CD107A. Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida através da quantificação da porcentagem de linfócitos CD3+ na amostra que expressa IFN-γ. Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida através da quantificação da porcentagem de linfócitos CD3+ na amostra que expressa TNF. Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida através da quantificação da porcentagem de linfócitos CD3 + em uma amostra que expressa IL-2. Em algumas modalidades, a reatividade de EBV é medida como uma porcentagem de linfócitos CD3 + que expressa biomarcadores múltiplos (por exemplo, dois ou mais de CD107A, IFN-γ, TNF e IL-2, preferencialmente todos os quatro). Os linfócitos CD3 + podem ser isolados a partir de uma amostra (por exemplo, uma amostra de PBMC ou uma amostra de linfócitos CD3 +) antes ou depois da quantificação da porcentagem de reatividade de EBV. Consequentemente, em algumas modalidades, a reatividade de EBV é a porcentagem de linfócitos CD3
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34/54 + com as características desejadas em uma amostra que compreende principalmente linfócitos CD3 +.
[0082] Em algumas modalidades, o método da mesma forma compreende a análise da expressão de CD107a, IFN-γ, TNF ou IL-2 pelas células T autólogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTLs), e se pelo menos 1%, 2%, 3% 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 %, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53% , 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70 %, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87 %, 88%, 89% ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeos proliferadas (por exemplo, CTLs) expressam CD107a, IFN-γ, TNF ou IL-2, administrando as células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs ) ao indivíduo.
[0083] Em algumas modalidades, o método da mesma forma compreende analisar a expressão de CD107a e TNF pelas células T autólogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTLs), e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6 %, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%,
24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%,
36%, 37%, 38%, 39% , 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%,
48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56 %, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%,
72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%,
84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTL) expressam CD107a e TNF, administrando as células T autólogas específicas de peptídeo (por exemplo, CTLs) ao indivíduo.
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35/54 [0084] Em algumas modalidades, o método também compreende analisar a expressão de CD107a e IFN-γ pelas células T autólogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTLs), e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22% , 23%, 24%, 25%,
26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%,
38%, 39 %, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%,
50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%,
62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% 73%,
74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeos proliferadas (por exemplo, CTL) expressam CD107a e IFNγ, administrando as células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs) ao indivíduo.
[0085] Em algumas modalidades, o método da mesma forma compreende analisar a expressão de CD107a e IL-2 pelas células T autólogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTLs), e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5% , 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22 %, 23%,
24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%,
36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%,
48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55% , 56%, 57%, 58%, 59%,
60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, %, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTLs) expressam CD107a e IL-2, administrando as células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs) ao indivíduo.
[0086] Em algumas modalidades, o método da mesma forma compreende analisar a expressão de TNF e IL-2 pelas células T autóPetição 870190065331, de 11/07/2019, pág. 65/109
36/54 iogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTLs) e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5% , 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22 %, 23%, 24%,
25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%,
37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%,
49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55% , 56%, 57%, 58%, 59%, 60%,
61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72 %, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeos proliferadas (por exemplo, CTLs) expressam TNF e IL-2, administrando as células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs) ao indivíduo.
[0087] Em algumas modalidades, o método da mesma forma compreende analisar a expressão de IFN-ye IL-2 pelas células T autólogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTLs), e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5 %, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% , 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55 %, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeos proliferadas (por exemplo, CTLs) expressam IFN e IL-2, administrando as células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs) ao indivíduo.
[0088] Em algumas modalidades, o método da mesma forma compreende analisar a expressão de IFN-ye TNF pelas células T autólogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTLs) e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%,
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13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22% , 23%, 24%,
25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%,
37%, 38%, 39 %, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%,
49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%,
61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%
73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeos proliferadas (por exemplo, CTLs) expressam IFN e TNF, administrando as células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs) ao indivíduo.
[0089] Em algumas modalidades, o método da mesma forma compreende analisar a expressão de CD107a, IFN-ye TNF pelas células T autólogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTLs), e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21% , 22%,
23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%,
35%, 36%, 37%, 38 %, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%,
47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%,
59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%,
71% , 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% , 89% ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeos proliferadas (por exemplo, CTL) expressam CD107a, IFN-ye TNF, administrando as células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs) ao indivíduo.
[0090] Em algumas modalidades, o método da mesma forma compreende a análise da expressão de CD107a, IFN-γ e IL-2 pelas células T autólogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTLs), e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4 %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%,
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35%, 36%, 37% , 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54 %, 55%, 56%, 57%, 58%,
59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%,
71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%,
83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeos proliferadas (por exemplo, CTLs) expressam CD107a, IFN-γ e IL-2, administrando as células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs) ao indivíduo.
[0091] Em algumas modalidades, o método da mesma forma compreende analisar a expressão de CD107a, IL-2 e TNF pelas células T autólogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTLs), e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4% 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21 %, 22%,
23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%,
35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%,
47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54% , 55%, 56%, 57%, 58%,
59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89% ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeos proliferadas (por exemplo, CTLs) expressam CD107a, IL-2 e TNF, administrando as células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs) ao indivíduo.
[0092] Em algumas modalidades, o método da mesma forma compreende analisar a expressão de IFN-γ, IL-2 e TNF pelas células T autólogas específicas de peptídeo proliferadas (por exemplo, CTLs), e se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4 %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%,
24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%,
36%, 37% , 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%,
48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54 %, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%,
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60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeos proliferadas (por exemplo, CTLs) expressam IFN-γ, IL-2 e TNF, administrando as células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs) ao indivíduo .
[0093] Em algumas modalidades, se pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15 %, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48% , 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65 %, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs) expressam CD107a, IFN-γ, TNF e IL- 2, as células T autólogas (por exemplo, CTLs) são administradas ao indivíduo.
[0094] As células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs) podem ter pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12 %, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45% , 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62 %, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90% das células T autólogas específicas de peptídeos (por exemplo, CTLs) têm reatividade de EBV.
[0095] Em algumas modalidades, cerca de 1 χ 105 a cerca de 1 x 108 células T são administradas ao indivíduo por dose de células T.
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Em algumas modalidades, cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 107 células T são administradas ao indivíduo por dose de células T. Em algumas modalidades, 5 x 10®, 1 χ 107, 1,5 χ 107 ou 2 χ 107 células T (por exemplo, CTLs) são administradas ao indivíduo. Múltiplas doses podem ser administradas ao indivíduo. Em algumas modalidades, uma dose inicial de células T (por exemplo, CTLs autólogas) é administrada, e uma ou mais doses adicionais de células T (por exemplo, CTLs autólogas) são administradas, por exemplo, em doses crescentes ao longo do curso da terapia. Em algumas modalidades, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais doses são administradas. O indivíduo pode receber doses adicionais iguais ou diferentes da dose inicial. Por exemplo, uma dose mais baixa pode ser administrada, seguida de uma dose maior. As doses podem ser administradas diariamente, duas vezes por semana, semanalmente, quinzenalmente, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses ou uma vez a cada seis meses. Em algumas modalidades, o indivíduo não experimenta quaisquer efeitos adversos como resultado da administração de células T (por exemplo, CTL autóloga).
[0096] Em alguns aspectos, o método da mesma forma compreende avaliar a eficácia de adotar imunoterapia em um indivíduo com esclerose múltipla, obtendo uma primeira amostra de fluído espinal cerebral (CSF) do indivíduo, analisando a quantidade de IgG anti-EBV no CSF no indivíduo primeira amostra (preferencialmente antes de uma administração de CTL) e, após um período de tempo, obter uma segunda amostra de CSF do indivíduo (de preferência após uma administração de CTL), analisando a quantidade de IgG anti-EBV no CSF na segunda amostra, e se a quantidade de IgG anti-EBV na segunda amostra for inferior à primeira amostra, a doença estabilizou e / ou não progrediu. Amostras adicionais de CTF podem ser obtidas e compara
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41/54 das com amostras anteriores. Da mesma forma fornecidos aqui são métodos de redução dos níveis de IgG anti-EBV no CSF em um indivíduo com EM admínistrando-se ao indivíduo céluias T autólogas (por exemplo, CTLs) expressando um receptor de células T que especificamente iiga-se a um peptídeo de EBV apresentado em uma classe I MHC. Uma redução nos níveis de IgG anti-EBV no CSF pode ser medida por um índice de IgG no CSF. Em algumas modalidades, os níveis de igG do CSF podem ser calculados pela fórmula de Reiber e Felgenhauer (isto é, ver Figura 1). Os níveis de IgG anti-EBV podem ser reduzidos em pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% após a administração de células T.
[0097] Em algumas modalidades, os métodos compreendem melhorar ou estabilizar um sintoma (por exemplo, perda de visão, perda de acuidade visual, perda ou redução na destreza manual, aumento da fadiga e / ou incontinência urinária) de EM em um indivíduo, administrando ao indivíduo células T autólogas (por exemplo, CTLs, tais como os CTLs autólogas específicas de peptídeos descritas aqui) que expressam um receptor de células T que especificamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC de classe I. Da mesma forma fornecidos aqui são métodos para melhorar a acuidade visual, melhorar a visão das cores ou estabilizar a perda de visão em um indivíduo com EM compreendendo a administração ao indivíduo de células T autólogas (por exemplo, CTLs, tais como os CTLs autólogas específicas de peptídeos descritas aqui). Em algumas modalidades, fornecidos aqui são métodos para melhorar as habilidades motoras, equilíbrio ou destreza manual em um indivíduo com EM, compreendendo a administração ao indivíduo de células T autólogas descritas aqui. Da mesma forma fornecidos aqui são métodos que melhoram o sono em um indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo de células
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T autólogas (por exemplo, CTLs, tais como os CTLs autólogas específicas de peptídeos descritas aqui).
[0098] Em algumas modalidades, o indivíduo é dado um teste diagnóstico, tal como EDSS. Em algumas modalidades, o indivíduo é testado com EDSS e recebe um escore de EDSS antes e / ou após a administração de células T. O escore EDSS pode permanecer o mesmo, ou o escore EDSS pode diminuir (por exemplo, pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 ou 5,0) após a administração de células T.
[0099] Os vários métodos descrito aqui podem ser métodos para melhorar a caminhada, visão, equilíbrio, cognição ou outros sintomas em um indivíduo, tal como um Indivíduo com esclerose múltipla, e / ou métodos para melhorar o composto funcional com esclerose múltipla (MSFC), EDSS ou escores de MSSS em um indivíduo, tal como um indivíduo com esclerose múltipla. Desse modo, em certas modalidades, os métodos de tratamento descritos aqui incluem métodos para estabilizar ou melhorar uma deficiência ou condição (por exemplo, habilidades motoras / equilíbrio / destreza manual, sono, acuidade visual ou visão de cores, fadiga, incontinência urinária) em um paciente, em que o escore de incapacidade do paciente (medido por qualquer um desses testes ou outro teste adequado) após uma semana, duas semanas, quatro semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, três meses, seis meses, um ano ou dois anos de terapia é pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60%. % maior em relação a um escore de EDSS antes da terapia com células T.
[00100] Por exemplo, o escore EDSS de um indivíduo pode ser testado, por exemplo, avaliando o desempenho do indivíduo no teste em diferentes momentos, como 0 meses (baseline), 1 mês, 2 meses, 3
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43/54 meses, 6 meses, 1 ano e 2 anos. Em certas modalidades, se houver uma diminuição documentada no escore de um indivíduo após a administração de células T, então a EM é considerada como tendo estabilizado e / ou não progredido. Em outras modalidades, se não existir um aumento ou diminuição em um escore do indivíduo após administração de células T, então a EM considerada estabilizada e / ou não progrediu. O teste EDSS pode ser repetido a qualquer momento desde o início do tratamento com CTL (por exemplo, uma semana, duas semanas, três semanas, quatro semanas, um mês, dois meses, três meses a partir do início do tratamento com CTL) para avaliar se o tratamento diminuiu ou interrompeu qualquer piora nas habilidades motoras / equilíbrio / destreza manual, melhora do sono, melhora da acuidade visual ou visão das cores, fadiga, incontinência urinária.
[00101] Em algumas modalidades, a progressão de uma incapacidade de andar pode ser testada utilizando um teste de caminhada, por exemplo, avaliando o desempenho do indivíduo em um teste de caminhada de 25 pés em diferentes pontos no tempo. Em certas modalidades, se não houver pioria documentada na caminhada, considera-se que o indivíduo não tem piora progressiva da caminhada. Para um tal paciente que ainda não esteja a receber terapia com células T, o indivíduo que demonstra a deficiência progressiva da caminhada começa o tratamento com células T, por exemplo, CTLs. O teste de caminhada pode ser repetido (por exemplo, uma semana, duas semanas e três semanas, quatro semanas, um mês, dois meses, três meses a partir do Início do tratamento) para avaliar se o tratamento diminuiu ou interrompeu qualquer piora do desempenho da caminhada, por exemplo, medido pelo teste de caminhada.
[00102] Melhorias nos resultados de cognição associados à terapia com MS, se a diminuição do declínio cognitivo, estabilização do declínio cognitivo, ou melhora da função cognitiva, pode ser avaliada usan
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44/54 do o teste de PASAT (por exemplo, PASAT 2 ou PASAT 3) ou SDMT, ou alternativamente teste de COG (ver Erlanger e outro, J Neuro Sci 340: 123-129 (2014)).
[00103] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas fornecidas aqui podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico ao paciente.
[00104] Nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores incluindo a atividade do agente particular utilizado, a rotina de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção ou metabolismo do composto particular a ser utilizado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e / ou materiais utilizados em combinação com o composto particular empregado, a idade, sexo, peso, condição, estado geral de saúde e histórico médico anterior do paciente a ser tratado e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas.
EXEMPLJFICAÇÃQ:
Exemplo 1: Estudo de pacientes com EM e tratamentos múltiplos com terapia com células T específicas de EBVpara EM [00105] Os participantes doaram uma amostra de sangue de 200 a 400 mL. As células mononucleares de sangue periférico desta amostra foram utilizadas para a geração laboratorial de células T autólogas da proteína latente da membrana (LMP1 e 2) / antígeno nuclear do vírus Epstein-Barr 1 (EBNA1) suspensas em solução salina normal de grau clínico. O produto investigacional é produzido por estímulo com células mononucleares de sangue periférico autólogo irradiadas com o vetor adenoviral recombinante AdEI-LMPpoly, um vetor adenoviral codificador de múltiplos epítopos de células T CD8 + do antígeno 1 de EBV nuclear (EBNA1), proteína de membrana latente 1 ( LMP1) e LMP2A.
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As culturas de células T são em seguida avaliadas quanto ao rendimento celular, viabilidade e frequência de células T. Aproximadamente 5 semanas irão geralmente passar entre a coleta da amostra de sangue de 200-400 mL e a primeira administração celular.
[00106] Cada paciente recebeu suas próprias células T estimuladas ex vivo para aumentar a reatividade ao EBNA1, LMP1 e LMP2A, e foi seguido por 26 semanas. Os pacientes receberam a terapia de células T por intravenosamente, em intervalos de quinze dias. Cada dose foi administrada uma vez, sendo a dose inicial de 5 χ 106 células T, seguida por doses de 1 x 107, 1,5 x 107 e 2 x 107 células. Quatro doses totais foram dadas durante um período de 8 semanas. Cada dose de células foi administrada intravenosamente, permitindo a administração lenta de células T no sangue, em vez de um bolo de células.
[00107] Treze pacientes foram incluídos. Três pacientes foram retirados antes de receber terapia celular: um para diagnóstico não relacionado de malignidade e dois para incapacidade de gerar células T específicas para EBV. Os dez pacientes restantes receberam, cada um, quatro infusões de células T por protocolo (Tabela 1, abaixo).
[00108] As EBV-CTLs autólogas foram bem toleradas e não foram observados eventos adversos significativos (EA). Apenas um paciente teve um EA relacionado ou provavelmente relacionado, que foi “gosto alterado” grau 1 transitório julgado ser devido ao solvente de DMSO. Nenhum grau 4 ou 5 de EA foi relatado.
[00109] Seis pacientes experimentaram melhora clínica sintomática e objetiva, que começou 2 a 14 semanas após a primeira infusão (Tabela 1). A redução da fadiga foi uma característica proeminente em pacientes com melhora clínica. Uma correlação entre a reatividade ao EBV e a resposta clínica foi observada. Pacientes que receberam células T com maior reatividade ao EBV apresentaram maior resposta clínica. Seis pacientes no estudo receberam células T com reatividade >
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7% de EBV; cinco desses pacientes experimentaram melhora clínica, com 3 pacientes apresentando melhora no escore de EDSS. Quatro pacientes receberam células T com reatividade < 3% do EVB; apenas um deles apresentou melhora clínica, um apresentou piora do EDSS e dois não relataram mudança. A melhora clínica durante o período de estudo de 6 meses, ou a falta dela, da mesma forma se relacionou com biomarcadores da função das células T específicas para EBV das células T administradas (Figura 2). Em comparação com pacientes sem benefício observado, os pacientes que experimentaram benefício clínico receberam terapia que foi significativamente enriquecida com células T CD8 + específicas para EBV expressando CD107a, IFNy e TNFa. Além disso, o benefício clínico correlatado com a polifuncionalidade das células T administradas (expressão de CD107a, IFNy, TNFa e IL-2).
[00110] A terapia com células T autólogas para pacientes com esclerose múltipla neste estudo foi segura e bem tolerada, sem EA graves, e o único EA relacionado ao tratamento foi disgeusia, provavelmente relacionado ao DMSO na preparação e não às células T.
[00111] As melhorias clínicas nos pacientes SPMS e PPMS foram de uma base relativamente fixa (até 5 anos) e não representavam a resolução de um surto agudo de EM. Dos 6 pacientes que receberam células T com reatividade ao EBV >7%, 5 apresentaram melhora clínica, com 3 pacientes melhorando o escore de EDSS.
[00112] Consistente com o mecanismo hipotético de ação das células T específicas para EBV, parece haver uma correlação de doseresposta entre a reatividade ao EBV do produto de células Tea melhora clínica.
[00113] Redução na fadiga foi uma característica consistente e proeminente em respondedores. A fadiga é o sintoma mais incapacitante da EM e pode preceder o início clínico da EM, muitas vezes por anos.
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47/54 [00114] Os dados aumentam a evidência crescente de um papel patogênico da infecção pelo EBV na EM. Como as células T acedem a todos os compartimentos do SNC, a terapia com células T que visa apenas células B infectadas por EBV é uma nova modalidade de tratamento que pode oferecer segurança favorável e eficácia duradoura.
Exemplo 2: Método exemplificative para Manchamento de Citocinas Intracelulares Multlparamétricas e análise de desgranulação de células T específicas para LMP e EBNA1
1. Diluir a pepmix de LMP / EBNA1 CD8 (100 pg / ml de matériaprima), o pepmix de EBNA1 (matéria -prima de 100 pg / ml) e quaisquer epítopos de peptídeos HLA correspondentes (matéria-prima de 200 pg / ml) a serem testados a 2 pg / ml em RPM11640-10% de FCS (a concentração final no ensaio será 1 pg / mL).
2. Diluir o coquetel de Estímulo Celular 1:50 em RPMI1640-10% de FCS. (Esta será uma diluição final de 1: 100 no ensaio).
Nota: o Coquetel de Estímulo eBioscience é armazenado a -20Ό após a diluição 1 em 5 no RPMI para preparar uma concentração de matéria prima de 100x.
3. Adicionar 100 pL do pepmix apropriado, epítopo peptídico ou coquetel de estímulo celular, ou 100 pl RPM11640-10% de FCS (sem controle peptídico) às cavidades apropriadas de uma placa de base em V de 96 cavidades.
4. Diluir PBMC ou células T a 5x106 células / mL em RPMI1640-10% FCS (isto dará 5x105 células por ensaio).
5. Adicionar GoigiPlug (Brefeldin A) às células para uma taxa final de 2 pL / mL de células (a concentração final de GoigiPlug no ensaio será 1 pL / mL).
6. Adicionar GolgiStop (monensina) às células para uma taxa final de 1,4 μL / mL de células (a concentração final de GolgiStop no ensaio será de 0,7 pL / mL).
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7. Adicionar anti-CD107a conjugado com FITC às células para uma proporção final de 50 pL / mL (a quantidade final de anti-CD107a é 5 pL / teste).
8. Adicionar 100 pl de suspensão de células por cavidade às cavidades necessárias da placa de base em V de 96 cavidades.
9. Incubar durante 4 horas a 37°C / 6,5% de CO2.
10. Centrifugar a placa em 2300 rpm durante 2 minutos.
11. Descartar 0 sobrenadante. Lavar as células adicionando 200pL de PBS-2% de FCS por cavidade e centrifugar a placa em 2300rpm durante 2 minutos. Repetir esta etapa
12. Lavar as células duas vezes com PBS-2% de FCS 200pL / lavagem por cavidade, centrifugando os tubos a 1000g (2300 rpm) durante 2 min.
Manchamento de Antígeno de Superfície Celular
13. Ressupender as células em 50 pl / cavidade de PBS-2% de FCS contendo 0,125 pl de anti-CD8 conjugado com perCP-Cy5.5, 0,25 pL de anti-CD4 conjugado com Azul Pacífico e 0,2 μL de IR próximo vivo / morto. Incubar durante 30 minutos a 4°C.
14. Centrifugar a placa em 2300 rpm durante 2 minutos. Descartar 0 sobrenadante. Lavar as células adicionando 200pL de PBS-2% de FCS por cavidade. Centrifugar a placa em 2300 rpm durante 2 minutos. Repetir esta etapa.
15. Ressuspender as células em 100 pL por cavidade de solução de citofix / citoperm BD e incubar a 4°C durante 20 minutos.
16. Centrifugar a placa em 2300 rpm durante 2 minutos. Descartar 0 sobrenadante. Lavar as células adicionando 200pL de BD Perm / Wash por cavidade. Centrifugar a placa em 2300 rpm durante 2 minutos. Repetir esta etapa.
Manchamento de Citocina Intracelular
17. Ressuspender as células fixas / permeabilizadas em 50 pL / cavi
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49/54 dade da solução BD Perm / Wash contendo 1 pL de anti-IL-2 conjugado com PE, 1 pL de anti-IFN-γ conjugado com AF700 e 0,25 pL de antl-TNF conjugado com APC. Incubar durante 30 minutos a 4°C.
18. Centrifugar a placa em 2300 rpm durante 2 minutos. Descartar ο sobrenadante. Lavar as células adicionando 200pL de Perm / Wash por cavidade. Centrifugar a placa em 2300 rpm durante 2 minutos. Repetir esta etapa.
19. Ressuspender as células em 200pL de PBS-paraformaldeído a 2% e armazenar a 4°C.
20. Adquirir células usando o BD Fortessa. Analisar a produção / desgranulação de citocinas usando o software Flow Jo.
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Tabela 2
Resposta clínica específica observada pós-adotar terapia de célula T • Fadiga: escala de severidade de fadiga (FSS)17 59pré-tx ~> 35 na semana 15-* 47 na semana 27 • capacidade de jardinar, pintar, realizar atividades diárias • Equilíbrio melhorado • Romberg positivo -> Romberg negativo pós-tx • índice de CSF IgG 0,69 -» 0,61 (NR < 0,70) • Nenhuma melhoria • índice de CSF IgG 0,90 > 0,88 • Nenhuma melhoria • índice de CSF IgG 0,59 0,50 • Nenhuma melhoria • EDDS aumentou de 6,5 na semana 21 para 7,0 na semana 27 • índice de CSF IgG 0,93 1,08 • FSS 40 na semana 1 -» 12 na semana 27 • Produtividade melhorada • Movimentos voluntários melhorados nos dedos dos pés e tornozelo esquerdo • produção de CSF IgG diminuída (figura 4)
Melhoria clínica observada moderado nenhum nenhum nenhum sim
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Código do paciente CM 9# ♦ 00
não respondedores
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Tabela 2 (cent.)
• Paciente relatou produtividade aumentada, porém histórico pobre • Paciente recusou punções lombares de acompanhamento • Fadiga: (FSS 50 pré-tx 34 na semana 27 (fíg. 5) • QOL: [7 pré-tx -> 9 nas semanas 15 e 27] • Acuidade visual: 6/9 (20/30) biiateralmente -> 6/6 (20/20) bilat pós TX • Visão de cores (placas de Ishihara) • R 13/21 e L 15/21 -a 19/21 bilateralmente pós TX • Destreza manual melhorada com utensílios • incontinência urinária melhorada • Epsódios de noctúria reduzidos 75% • vertigem resolvida • espasmos dos membros inferiores melhorados e clônus sintomático resolvido • índice de CSF IgG 0,89 1,04 • FSS 54 na semana 1 -> 42 na semana 7 45 na semana 15 • Foco, concentração e produtividade melhorados • Equilíbrio e capacidade de andar melhorados de um máximo de 200 metros sem auxílio ou descanso antes do tratamento para 300 metros na semana 7 e 500 metros nas se- manas 11, 15 e 21 • EDSS melhorado: 5,0 na semana 1 4,5 na semana 7 -> 3,5 nas semanas 11, 15, 21
equívoco sim sim
10% 15% 31%
6,5/6,5 | 8,0/8,0 | 5,0/3,5 | !
61 anos/M (SPMS) 49 anos/F (PPMS) 60 anos/M (PPMS)
#3 #4 #9
respondedores
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Tabela 2 (cent.)

Claims (130)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de tratar ou prevenir esclerose múltipla (EM) em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo células T citotóxicas autólogas (CTLs) expressando um receptor de células T que especificamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC de classe I.
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 5% das CTLs expressam CD107a.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10% das CTLs expressam CD 107a.
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 15% das CTLs expressam CD 107a.
  5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 20% das CTLs expressam CD 107a.
  6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos 5% das CTLs expressam IFNy.
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10% das CTLs expressam IFNy.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos 15% das CTLs expressam IFNy.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos 20% das CTLs expressam IFNy.
  10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos 5% das CTLs expressam TNF.
  11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10% das CTLs expressam TNF.
  12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos 15% das CTLs expressam TNF.
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    2/17
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos 20% das CTLs expressam TNF.
  14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos 1% das CTLs expressam IL-2.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos 5% das CTLs expressam IL-2.
  16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10% das CTLs expressam IL-2.
  17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que pelo menos 15% das CTLs expressam IL-2.
  18. 18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 30% das CTLs expressam CD107a, IFNy, TNFa, e IL-2.
  19. 19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 40% das CTLs expressam CD107a, IFNy, TNFa, e IL-2.
  20. 20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 50% das CTLs expressam CD107a, IFNy, TNFa, e IL-2.
  21. 21. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 70% das CTLs expressam CD107a, IFNy, TNFa, e IL-2.
  22. 22. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que as CTLs têm pelo menos 5% de reatividade de EBV.
  23. 23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as CTLs têm pelo menos 7% de reatividade de EBV.
  24. 24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracteriza
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    3/17 do pelo fato de que as CTLs têm pelo menos 10% de reatividade de EBV.
  25. 25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as CTLs têm pelo menos 15% de reatividade de EBV.
  26. 26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as CTLs têm pelo menos 20% de reatividade de EBV.
  27. 27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as CTLs têm pelo menos 30% de reatividade de EBV.
  28. 28. Método de tratar ou prevenir esclerose múltipla (EM) em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende:
    a) isolar uma amostra compreendendo células T citotóxicas (CTLs) expressando um receptor de células T que especificamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC de classe I ao indivíduo;
    b) administrar as CTLs ao indivíduo.
  29. 29. Método de tratar ou prevenir EM em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:
    a) incubar uma amostra compreendendo células T citotóxicas autólogas (CTLs) células apresentadoras de antígeno (APCs) apresentando um peptídeo de EBV, desse modo induzindo proliferação de células T específicas de peptídeo na amostra;
    b) administrar as CTLs autólogas específicas de peptídeo ao indivíduo.
  30. 30. Método de tratar ou prevenir EM em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:
    a) incubar células apresentadoras de antígeno (APCs) com um construtor de ácido nucleico codificando para um peptídeo de
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    4/17
    EBV, desse modo induzindo as APCs a apresentar um peptídeo de EBV;
    b) induzir proliferação de CTI específica de peptídeo para incubar uma amostra compreendendo CTLs autólogas com as células apresentadoras de antígeno (APCs), desse modo induzindo as CTLs autólogas a proliferar; e
    c) administrar as CTLs autólogas específicas de peptídeo ao indivíduo.
  31. 31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o construtor de ácido nucleico é um vetor viral.
  32. 32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é AdE1-LMPpoli.
  33. 33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizado pelo fato de que o método da mesma forma compreende analisar a expressão de CD107a pelas CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas, e, se pelo menos 5% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas expressam CD107a, administrando as CTLs autólogas específicas de peptídeo ao indivíduo.
  34. 34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 10% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas na amostra expressam CD107a.
  35. 35. Método de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 15% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas na amostra expressam CD107a.
  36. 36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 35, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 20% das CTLs autólogas específicas de peptídeo
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    5/17 proliferadas na amostra expressam CD107A.
  37. 37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 36, caracterizado pelo fato de que o método da mesma forma compreende analisar a expressão de IFNy pelas CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas, e, se pelo menos 5% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas expressam IFNyg, administrando as CTLs autólogas específicas de peptídeo ao indivíduo.
  38. 38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 10% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas na amostra expressam IFNy.
  39. 39. Método de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 15% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas na amostra expressam IFNy.
  40. 40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 20% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas na amostra expressam IFNy.
  41. 41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 40, caracterizado pelo fato de que o método da mesma forma compreende analisar a expressão de TNF pelas CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas, e, se pelo menos 5% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas expressam TNF, administrando as CTLs autólogas específicas de peptídeo ao indivíduo.
  42. 42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 10% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas na amostra expressam TNF.
  43. 43. Método de acordo com a reivindicação 41 ou 42, carac
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    6/17 terizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 15% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas na amostra expressam TNF.
  44. 44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 20% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas na amostra expressam TNF.
  45. 45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 44, caracterizado pelo fato de que o método da mesma forma compreende analisar a expressão de IL-2 pelas CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas, e, se pelo menos 1% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas expressam IL-2, administrando as CTLs autólogas específicas de peptídeo ao indivíduo.
  46. 46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 5% das CTLs autólogas específicas de peptídeo na amostra expressam IL-2.
  47. 47. Método de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 10% das CTLs autólogas específicas de peptídeo na amostra expressam IL-2.
  48. 48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 15% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas na amostra expressam IL-2.
  49. 49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizado pelo fato de que o método da mesma forma compreende analisar a expressão de CD107a, TNF, IFNy, e IL-2 pelas CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas, e, se pelo menos 20% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas expressam CD107a, TNF, IFNy, e IL-2, administrando as CTLs autólo
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    7/17 gas específicas de peptídeo ao indivíduo.
  50. 50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 30% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas na amostra expressam CD107a, TNF, IFNy, e IL-2.
  51. 51. Método de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 40% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas na amostra expressam CD107a, TNF, IFNy, e IL-2.
  52. 52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, caracterizado pelo fato de que as CTLs são administradas se pelo menos 50% das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas na amostra expressam CD107a, TNF, IFNy, e IL-2.
  53. 53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 52, caracterizado pelo fato de que o método da mesma forma compreende analisar a reatividade de EBV das CTLs autólogas específicas de peptídeo proliferadas, e, se a reatividade está acima de um limiar pré-determinado, administrando as CTLs autólogas específi cas de peptídeo ao indivíduo.
  54. 54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o limiar é 5%.
  55. 55. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o limiar é 7%.
  56. 56. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o limiar é 10%.
  57. 57. Método de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que o limiar é 20%.
  58. 58. Método de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que o limiar é 30%.
  59. 59. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizaPetição 870190065331, de 11/07/2019, pág. 93/109
    8/17 do pelo fato de que o limiar é 50%.
  60. 60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 59, caracterizado pelo fato de que amostra é incubada com uma ou mais citocinas na etapa (a).
  61. 61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 60, caracterizado pelo fato de que o APCs compreende células B.
  62. 62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 61, caracterizado pelo fato de que o APCs compreende células T apresentadoras de antígeno.
  63. 63. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 62, caracterizado pelo fato de que o APCs compreende células dendríticas.
  64. 64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 63, caracterizado pelo fato de que o APCs compreende células apresentadoras de antígeno artificiais.
  65. 65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que as células apresentadoras de antígeno artificiais são células aK562.
  66. 66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 65, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).
  67. 67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 66, caracterizado pelo fato de que também compreende obter a amostra do indivíduo.
  68. 68. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 67, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de EBV compreende uma sequência de aminoácido listada na Tabela 1.
  69. 69. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 67, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de EBV com
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    9/17 preende um peptídeo de LMP1 ou fragmento do mesmo.
  70. 70. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 67, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de EBV compreende um peptídeo de LMP2A ou fragmento do mesmo.
  71. 71. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 67, caracterizado peto fato de que o peptídeo de EBV compreende um peptídeo de EBNA1 ou fragmento do mesmo.
  72. 72. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende administrar cerca de 5 χ 106 CTLs ao indivíduo em uma dose.
  73. 73. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, caracterizado pelo fato de que compreende administrar cerca de 1 χ 107 CTLs ao indivíduo em uma dose.
  74. 74. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, caracterizado pelo fato de que compreende administrar cerca de 1.5 χ 107 CTLs ao indivíduo em uma dose.
  75. 75. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, caracterizado pelo fato de que compreende administrar cerca de 2 χ 107 CTLs ao indivíduo em uma dose.
  76. 76. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que doses múltiplas de CTLs são administradas ao indivíduo, por exemplo, em doses crescentes.
  77. 77. Método de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que as doses são administradas semanaimente.
  78. 78. Método de acordo com a reivindicação 76, caracterizado peto fato de que as doses são administradas quinzenalmente.
  79. 79. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que compreende administrar quarto doses de números sucessivamente maiores de CTLs.
    Petição 870190065331, de 11/07/2019, pág. 95/109
    10/17
  80. 80. Método de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma primeira dose de 5 χ 106 CTLs, uma segunda dose de 1 χ 107 CTLs, uma Terceira dose de
    1.5 χ 107 CTLs, e uma quarta dose de 2 χ 107 CTLs.
  81. 81. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não experimenta efeitos adversos significantes como resultado de administração de CTL.
  82. 82. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, no qual o método da mesma forma compreende avaliar a eficácia de imunoterapia adotiva em um indivíduo com esclerose múltipla, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) obter uma primeira amostra de fluido da medula espinhal (CSF) ao indivíduo, (b) determinar a quantidade de IgG anti-EBV no CSF na primeira amostra antes da administração de CTL, (c) após um período de tempo, obter uma segunda amostra de CSF do indivíduo após administração de CTL, (d) determinar a quantidade de IgG anti-EBV no CSF na segunda amostra, e se a quantidade de IgG anti-EBV na segunda amostra for menor do que a primeira amostra, a doença foi estabilizada e/ou não progrediu.
  83. 83. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a EM é remitenterecorrente, EM progressiva secundária, EM progressiva primária, ou EM progressivamente recorrente.
  84. 84. Método de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a EM é EM progressiva primária.
  85. 85. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que as habilidades motoras / equilíbrio /
    Petição 870190065331, de 11/07/2019, pág. 96/109
    11/17 destreza manual do indivíduo, sono, acuidade visual ou visão de cores, fadiga e / ou incontinência urinária melhoraram após a administração de CTLs.
  86. 86. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o escore do EDSS do indivíduo permanece a mesma após a administração do CTL.
  87. 87. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 85, caracterizado pelo fato de que o escore de EDSS do indivíduo diminui em pelo menos 0,5 após a administração de CTL.
  88. 88. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 85, caracterizado pelo fato de que o escore de EDSS do indivíduo diminui em pelo menos 1,0 após a administração de CTL.
  89. 89. Método de reduzir níveis de IgG anti-EBV no CSF em um indivíduo com EM caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo células T citotóxicas autólogas (CTLs) expressando um receptor de células T que especificamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC de classe I.
  90. 90. Método de melhorar acuidade visual, melhorar visão de cores, ou estabilizar perda de visão em um indivíduo com EM, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo células T citotóxicas autólogas (CTLs) expressando um receptor de células T que especificamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC de classe I.
  91. 91. Método de melhorar habilidades motoras, equilíbrio, ou destreza manual em um indivíduo com EM, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo células T citotóxicas autólogas (CTLs) expressando um receptor de células T que especificamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC de classe I.
  92. 92. Método de melhorar o sono em um indivíduo com EM, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo
    Petição 870190065331, de 11/07/2019, pág. 97/109
    12/17 células T citotóxicas autólogas (CTLs) expressando um receptor de células T que especificamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC de classe I.
  93. 93. Método de tratar ou prevenir fadiga em um indivíduo com EM, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo células T citotóxicas autólogas (CTLs) expressando um receptor de células T que especificamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC de classe I.
  94. 94. Método de tratar ou prevenir incontinência urinária em um indivíduo com EM, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo células T citotóxicas autólogas (CTLs) expressando um receptor de células T que especificamente liga-se a um peptídeo de EBV apresentado em um MHC de classe I.
  95. 95. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a EM é EM remitenterecorrente.
  96. 96. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 94, caracterizado pelo fato de que a EM é EM progressive secundária.
  97. 97. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 94, caracterizado pelo fato de que a EM é EM progressiva primária.
  98. 98. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 94, caracterizado pelo fato de que a EM é EM progressiva primária progressivamente recorrente.
  99. 99. Método de selecionar um indivíduo para adotar imunoterapia, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) obter uma amostra compreendendo células T do indivíduo, (b) isolar as células T autólogas na amostra,
    Petição 870190065331, de 11/07/2019, pág. 98/109
    13/17 (c) determinar a reatividade de EBV das células T autólogas na amostra, e se pelo menos uma porcentagem limite das células T autólogas são reativas, selecionando o indivíduo a adotar imunote rapia.
  100. 100. Método de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que o limiar é 1%.
  101. 101. Método de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que o limiar é 2%.
  102. 102. Método de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que o limiar é 3%.
  103. 103. Método de acordo com a reivindicação 99, caracteri zado pelo fato de que o limiar é 5%.
  104. 104. Método de acordo com a reivindicação 99, caracteri- zado pelo fato de que o limiar é 10%.
  105. 105. Método de acordo com a reivindicação 99, caracteri- zado pelo fato de que o limiar é 20%.
  106. 106. Método de selecionar um indivíduo a adotar imunote- rapia, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) obter uma amostra compreendendo células T do indivíduo, (b) isolar as células T autólogas na amostra, (c) determinar percentual de células T autólogas na amostra que expressam CD107A, e se pelo menos uma certa porcentagem das células T autólogas expressam CD107A, selecionando o indivíduo a adotar imunoterapia.
  107. 107. Método de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 1% das células T autólogas expressam CD107A, selecionando o indivíduo a adotar imunoterapia.
  108. 108. Método de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 3% das células T autólogas ex
    Petição 870190065331, de 11/07/2019, pág. 99/109
    14/17 pressam CD107A, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia,
  109. 109. Método de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 5% das células T autólogas expressam CD107A, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  110. 110. Método de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 10% das células T autólogas expressam CD107A, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  111. 111. Método de selecionar um indivíduo a adotar imunoterapia, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) obter uma amostra compreendendo células T do indivíduo, (b) Isolar as células T autólogas na amostra, (c) determinar percentual de células T autólogas na amostra que expressam TNF, e se pelo menos uma certa porcentagem das células T autólogas expressam TNF, selecionando o indivíduo a adotar imunoterapia.
  112. 112. Método de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 1% das células T autólogas expressam TNF, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  113. 113. Método de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 3% das células T autólogas expressam TNF, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  114. 114. Método de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 5% das células T autólogas expressam TNF, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  115. 115. Método de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 10% das células T autólogas expressam TNF, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  116. 116. Método de selecionar um indivíduo a adotar imunoterapia, caracterizado pelo fato de que compreende:
    Petição 870190065331, de 11/07/2019, pág. 100/109
    15/17 (a) obter uma amostra compreendendo células T ao indivíduo, (b) isolar as células T autólogas na amostra, (c) determinar percentual de células T autólogas na amostra que expressam IFNy, e se pelo menos uma certa porcentagem das células T autólogas expressam IFNy, selecionando o indivíduo a adotar imunoterapia.
  117. 117. Método de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 1% das células T autólogas expressam IFNy, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  118. 118. Método de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 3% das células T autólogas expressam IFNy, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  119. 119. Método de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 5% das células T autólogas expressam IFNy, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  120. 120. Método de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 10% das células T autólogas expressam IFNy, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  121. 121. Método de selecionar um indivíduo a adotar imunoterapia, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) obter uma amostra compreendendo células T ao indivíduo, (b) isolar as células T autólogas na amostra, (c) determinar percentual de células T autólogas na amostra que expressam IL-2, e se pelo menos uma certa porcentagem das células T autólogas expressam IL-2, selecionando o indivíduo a adotar imunoterapia.
  122. 122. Método de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 1% das células T autólogas ex
    Petição 870190065331, de 11/07/2019, pág. 101/109
    16/17 pressam IL-2, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  123. 123. Método de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 3% das células T autólogas expressam IL-2, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  124. 124. Método de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 5% das células T autólogas expressam IL-2, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  125. 125. Método de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 10% das células T autólogas expressam IL-2, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  126. 126. Método de selecionar um indivíduo a adotar imunoterapia, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) obter uma amostra de PMBC do indivíduo, (b) isolar as células T autólogas na amostra, (c) determinar percentual de células T autólogas na amostra que expressam CD107a, IFNy, TNFa, e IL-2, e se pelo menos uma certa porcentagem das células T autólogas expressam CD107a, IFNy, TNFa, e IL-2, selecionando o indivíduo a adotar imunoterapia.
  127. 127. Método de acordo com a reivindicação 126, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 1% das células T autólogas expressam CD107a, IFNy, TNFa, e IL-2, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  128. 128. Método de acordo com a reivindicação 126, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 3% das células T autólogas expressam CD107a, IFNy, TNFa, e IL-2, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
  129. 129. Método de acordo com a reivindicação 126, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 5% das células T autólogas expressam CD107a, IFNy, TNFa, e IL-2, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
    Petição 870190065331, de 11/07/2019, pág. 102/109
    17/17
  130. 130. Método de acordo com a reivindicação 126, caracterizado pelo fato de que se pelo menos 10% das células T autólogas expressam CD107a, IFNy, TNFa, e IL-2, selecionar o indivíduo a adotar imunoterapia.
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