BRPI0815578B1 - peptídeo de cdca1, seu uso e composição imunogênica compreendendo o mesmo para induzir imunidade, tratar e/ou prevenir o câncer, bem como método in vitro para induzir uma célula apresentadora de antígeno e uma célula t citotóxica (killer) - Google Patents
peptídeo de cdca1, seu uso e composição imunogênica compreendendo o mesmo para induzir imunidade, tratar e/ou prevenir o câncer, bem como método in vitro para induzir uma célula apresentadora de antígeno e uma célula t citotóxica (killer) Download PDFInfo
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Abstract
peptídeo de cdca1, seu uso e composição imunogênica compreendendo o mesmo para induzir imunidade, tratar e/ou prevenir o câncer, bem como método in vitro para induzir uma célula apresentadora de antígeno e uma célula t citotóxica (killer) a presente invenção refere-se a um peptídeo de (a) ou (b)abaixo, e métodos de uso do peptídeo: (a) um peptídeo incluindo a sequência de aminoácido da seq id no: 1 ou 2, (b) um peptídeo que inclui a sequência de aminoácido da seq id no: 1 ou 2, em que um, dois, ou vários aminoácidos são substituídos, suprimidos, inseridos, e/ou adicionados, e em que o peptídeo mostra atividade de indução de célula t killer.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PEPTÍDEO DE CDCA1, SEU USO E COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA COMPREENDENDO O MESMO PARA INDUZIR IMUNIDADE, TRATAR E/OU PREVENIR O CÂNCER, BEM COMO MÉTODO IN VITRO PARA INDUZIR UMA CÉLULA APRESENTADORA DE ANTÍGENO E UMA CÉLULA T CITOTÓXICA (KILLER).
Campo Técnico [0001] A presente invenção refere-se a novos peptídeos que são eficazes como vacinas contra cânceres que altamente expressam ciclo de divisão celular associado 1 (CDCA1), tais como câncer pulmonar e carcinoma colangiocelular, e produtos farmacêuticos que incluem estes peptídeos para o tratamento e prevenção de tumores.
Antecedentes da Técnica [0002] Nos anos recentes, o número de pacientes com câncer pulmonar continua a aumentar por todo o mundo, e aproximadamente um milhão de pessoas estão correntemente morrendo de câncer pulmonar no mundo inteiro a cada ano. Também no Japão, mortes por câncer pulmonar estão aumentando, e estimou-se atingir 123.000 em 2015. Câncer pulmonar é mais prevalecente entre homens, e a razão homem-mulher é de três para um. Câncer pulmonar ultrapassou câncer estomacal em 1993 por ser a causa principal de morte por câncer entre os homens. Além disso, com um número crescente de fumantes femininas, o número de pacientes femininas é esperado elevar. Câncer pulmonar tem sido a causa principal de morte por câncer desde 2000, e com a sociedade em envelhecimento, o número de pacientes é esperado aumentar ainda mais no futuro. O fumo é considerado ser a maior causa de desenvolvimento de câncer pulmonar, e outras causas são inalação de asbesto, poluição do ar, e assim por diante. A detecção precoce e tratamento imediato são importantes para a terapia para câncer pulmonar. Entretanto, foi recentemente indicado que raio X do tórax simples e teste de esputo realizados durante um exame
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2/57 médico não são eficazes para a detecção precoce de câncer pulmonar, e os mesmos não levam à redução das mortes por câncer. Visto que o número de mortes por câncer pulmonar é esperado continuar elevando no futuro, é uma tarefa urgente para desenvolver novas estratégias terapêuticas.
[0003] No Japão, o número de mortes por câncer do trato biliar está em alta, e em 2005, 16.586 pessoas morreram de câncer do trato biliar. Na maioria dos casos de câncer do trato biliar, nenhum sintoma subjetivo é encontrado nos estágios iniciais. Comparado a cânceres que se formam no lúmen do trato digestivo, tais como câncer estomacal e câncer de cólon, o câncer do trato biliar é difícil para descobrir e diagnosticar nos estágios iniciais. Portanto, em muitos casos, o câncer já progrediu e é incapaz de ser removido por cirurgia quando o mesmo é descoberto. Além da terapia cirúrgica, terapia com radiação e quimioterapia são realizadas para câncer do trato biliar, mas as mesmas não são terapeuticamente eficazes, e é necessário estabelecer novo método terapêutico.
[0004] Por outro lado, o desenvolvimento recente na biologia molecular e imunologia tumoral esclareceu que células T citotóxicas (killer) e células T auxiliares reconhecem peptídeos gerados por degradação de proteínas que são específica e altamente expressadas em células câncerosas, e que são apresentadas na superfície de células câncerosas ou células apresentadoras de antígeno por intermédio de moléculas de HLA e fazem com que a imunorreação destrua as células câncerosas. Além disso, muitas proteínas antigênicas de tumor e peptídeos derivados destas, que estimulam tal imunorreação para atacar o câncer, foram identificadas, e a imunoterapia para tumor específica de antígeno está sendo clinicamente aplicada.
[0005] A molécula de HLA classe I é expressada na superfície de todas as células nucleadas do corpo. A mesma liga-se a um peptídeo
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3/57 gerado por degradação intracelular de proteínas produzidas no citoplasma ou núcleo, e expressa o peptídeo na superfície celular. Na superfície de uma célula normal, peptídeos derivados de proteínas autólogas normais ligam-se a moléculas de HLA classe I, e não são reconhecidas e destruídas por células T do sistema imune. Por outro lado, no processo de se tornar um câncer, as células câncerosas algumas vezes expressam uma grande quantidade de proteínas que são difícil ou levemente expressadas em células normais. Quando moléculas de HLA classe I ligam-se a peptídeos gerados por degradação intracelular de proteínas específica e altamente expressadas em células câncerosas, e depois expressam os peptídeos na superfície de células câncerosas, células T citotóxicas (killers) reconhecem e destroem apenas as células câncerosas. Administrando-se tais antígenos ou peptídeos específicos de câncer a um indivíduo, células câncerosas podem ser destruídas e o crescimento do câncer pode ser suprimido sem danificar células normais. Isto é chamado imunoterapia para o câncer usando antígenos específicos do câncer. Moléculas de HLA classe II são principalmente expressadas na superfície de células apresentadoras de antígeno. As moléculas ligam-se a peptídeos derivados de antígenos específicos do câncer, que são gerados por degradação intracelular de antígenos específicos do câncer incorporados em células apresentadoras de antígeno a partir do lado de fora das células, e depois expressam os peptídeos na superfície das células. Células T auxiliares que os reconhecem são ativadas, e induzem ou realçam a imunorreação contra tumores produzindo-se várias citocinas que ativam outras células imunocompetentes.
[0006] Consequentemente, se uma imunoterapia que direciona antígenos específica e altamente expressados em cânceres for desenvolvida, uma tal terapia pode eliminar eficazmente cânceres sozinhos sem causar nenhum evento prejudicial em órgãos autólogos
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4/57 normais. Também é esperado que a terapia possa ser usada para quaisquer pacientes com câncer terminal a quem outros tratamentos não podem ser aplicados. Além disso, administrando-se um antígeno e peptídeo específicos do câncer como uma vacina antecipadamente a indivíduos com um alto risco de desenvolver cânceres, o desenvolvimento do câncer pode ser prevenido.
[0007] Embora existam vários métodos terapêuticos para câncer pulmonar, o câncer pulmonar resulta em prognóstico deficiente comparado a outros cânceres, e o mesmo é um dos cânceres intratáveis. A razão é, por exemplo, progressão rápida, e em muitos casos, o câncer avançou pelo tempo que o mesmo é descoberto. Além disso, visto que a cirurgia é altamente invasiva, pacientes que são aplicáveis com a cirurgia são limitados, e a cura completa por terapia com radiação ou quimioterapia é difícil. Se uma imunoterapia que direciona antígenos que são alta e especificamente expressados em câncer pulmonar for desenvolvida, o câncer sozinho pode ser eficazmente eliminado por tal método terapêutico sem nenhum dano sobre os órgãos autólogos normais. Além disso, tal método terapêutico é esperado ser aplicável a qualquer paciente com câncer terminal, e pacientes que não são aplicáveis com outros tratamentos devido à função pulmonar extremamente deficiente. Além disso, visto que o risco para o desenvolvimento de câncer pulmonar é alto entre os fumantes, a imunoterapia pode ser aplicável para a prevenção de câncer pulmonar em um grupo de alto risco de câncer pulmonar.
[0008] Por análise da expressão genética de genoma amplo usando microarranjos de cDNA, os presentes inventores examinaram o perfil de expressão de 27.648 genes humanos em 37 casos clínicos de câncer pulmonar de célula não pequena e em órgãos embrionários, e vários órgãos adutos normais. Como um resultado, os inventores descobriram que CDCA1 (ciclo de divisão celular associado 1, também
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5/57 conhecido como homólogos humanos de Nuf2 (hNuf2)) (Acesso no GenBank N° NM_145697) foi altamente expressado em muitos casos de câncer pulmonar, enquanto ele foi dificilmente expressado no fígado embrionário ou órgãos adultos normais exceto no testículo isolado do sistema imune. Além disso, CDCA1 foi altamente expressado em todos os casos de carcinoma colangiocelular, câncer de bexiga, e carcinoma de célula renal. A expressão de CDCA1 elevada também foi observada nos tecidos câncerosos de 40 % ou mais casos de câncer de próstata, leucemia mieloide crônica, linfoma maligno, câncer cervical, osteosarcoma, câncer de mama, sarcoma de tecido macio, e câncer de cólon. Este fato sugere que CDCA1 pode servir como um antígeno específico do câncer em muitos carcinomas.
[0009] HLA-A2 é frequentemente observado em populações humanas não obstante da raça, e é possuído por cerca de 30 % dos Japoneses. Portanto, se uma pessoa pode identificar um peptídeo antigênico do câncer que é apresentado às células T citotóxicas (killers) por HLA-A2, o mesmo pode ser amplamente aplicado não apenas aos Japoneses mas também Caucasianos e assim por diante. Consequentemente, é uma tarefa importante identificar peptídeos antigênicos do câncer que são apresentados a células T killers por HLA-A2. Seria altamente benéfico se tais peptídeos antigênicos do câncer fossem aplicáveis à imunoterapia para câncer pulmonar, que têm alta morbidez e mortalidade por todo o mundo.
[00010] Documentos da técnica anterior relacionados à presente invenção são mostrados abaixo.
Documento não-patente 1
DeLuca J.G., Moree, B., Hickey, J.M., Kilmartin, J.V., e Salmon, E.D., hNuf2 inhibition blocks stable kinetochore-microtubule attachment and induces mitotic cell death in HeLa cells J. Cell Biol. 159: 549-555, 2002.
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Documento não-patente 2
DeLuca, J.G., Dong, Y., Hergert, P, Strauss, J., Hickey, J.M., Salmon, E.D., McEwen, B.F., Hec1 and Nuf2 Are Core Components of the Kinetochore Outer Plate Essential for Organizing Microtubule Attachment Sites., Mol. Biol. Cell 16: 519-531,2005.
Documento não-patente 3
Hayama, S., Daigo, Y., Kato, T., Ishikawa, N., Yamabuki, T., Miyamoto, M., Ito, T., Tsuchiya, E., Kondo, S., e Nakamura, Y., Activation of CDCA1-KNTC2, Members of Centromere Protein Complex, Involved in Pulmonary Carcinogenesis., Câncer Res. 66: 10339-10348, 2006. Documento não-patente 4
Liu, S.T., Rattner, J.B., Jablonski, S.A., e Yen, T.J., Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells., J. Cell Biol. 175: 41-53, 2006.
Documento não-patente 5
DeLuca, J.G., Howell, B.J., Canman, J.C., Hickey, J.M., Fang, G., e Salmon, E.D., et al. Nuf2 and Hec1 Are Required for Retention of the Checkpoint Proteins Mad1 and Mad2 to Kinetochores., Current Biology 13: 2103-2109, 2003.
Documento não-patente 6
Liu, D., Ding, D., Du, J., Cai, Xin., Huang, Y., Ward, T., Shaw, A., Yang, Y., Hu, R., Jin, C., e Yao, X., Human NUF2 Interacts with Centromere-associated Protein E and Is Essential for a Stable Spindle Microtubule-Kinetochore Attachment. J. Biol. Chem. 282: 21415-21424, 2007.
Descrição da Invenção
Problemas a serem Resolvidos pela Invenção [00011] Um objetivo a ser obtido pela presente invenção é desenvolver meios para implementar a imunoterapia que suprime o crescimento do câncer aumentando a imunidade de pacientes com câncer
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7/57 contra o câncer, como um método terapêutico para cânceres metastáticos ou intratáveis que são difíceis para serem tratados por terapia cirúrgica, quimioterapia, e radioterapia para tratar câncer pulmonar, câncer do trato biliar, etc. Os presentes inventores identificaram peptídeos que são derivados de proteínas específicas e altamente expressadas em câncer, e que são apresentadas a células T killers por HLA-A2, deste modo permitindo que a imunoterapia seja aplicável a cerca de 30 % de pacientes Japoneses com vários cânceres que altamente expressam CDCA1.
Meios para Resolver os Problemas [00012] Os presentes inventores identificaram o gene de CDCA1 (Acesso no GenBank N° NM_145697), que é altamente expressado em câncer pulmonar, a partir de análise de microarranjo de cDNA de tecidos com câncer pulmonar. A expressão de CDCA1 em tecidos normais é observada apenas no testículo isolado do sistema imune. De modo a examinar se ou não a imunidade antitumor é induzida por células T killers específicas de CDCA1, camundongos transgênicos de HLA-A2 que expressam HLA-A2 que é possuído por aproximadamente 30 % dos Japoneses foram usados. Especificamente, aqui, os inventores examinaram se ou não células T killers específicas de peptídeo restritas de HLA-A2 são induzidas quando camundongos transgênicos de HLA-A2 são imunizados com células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongo pulsadas com peptídeos de CDCA1 humanos tendo um motivo de ligação de HLA-A2. Se células T killers específicas de peptídeo de CDCA1 são induzidas nas células do baço de camundongos imunizados ou não foi examinado usando o ensaio ELISPOT para detectar γ-interferon (IFN-γ) produzido por células T killers ativadas de peptídeos de reconhecimento apresentados por HLA-A2. Como um resultado, dois tipos de novos peptídeos de CDCA1 que podem ser aplicados à imunoterapia que direciona pacientes com câncer HLA-A2
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8/57 positivos foram identificados. Além disso, foi confirmado que CTLs derivados de paciente com câncer e derivados de doador saudável ativados por estes peptídeos mostram atividade citolítica contra células que expressam CDCA1. Isto é, espera-se que os peptídeos sejam reconhecidos por células T killers humanas restritas de HLA-A2 e aplicáveis à imunoterapia para o câncer para pacientes com câncer HLA-A2 positivos.
[00013] Mais especificamente, a presente invenção fornece o seguinte:
(1) um peptídeo de (A) ou (B) abaixo:
(A) um peptídeo incluindo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2;
(B) um peptídeo que inclui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2, em que um, dois, ou vários aminoácidos são substituídos, suprimidos, inseridos, e/ou adicionados, e em que o peptídeo mostra atividade de indução de célula T citotóxica (killer);
(2) o peptídeo de (1), em que o segundo aminoácido do término N é leucina ou metionina;
(3) o peptídeo de (1), em que o aminoácido de terminal C é valina ou leucina;
(4) um agente para induzir imunidade contra o câncer, que inclui um ou mais peptídeos de (1) como um ingrediente ativo;
(5) um agente para tratar e/ou prevenir câncer, que inclui um ou mais peptídeos de (1) como um ingrediente ativo;
(6) um agente para induzir uma célula apresentadora de antígeno que mostra atividade de indução de célula T citotóxica (killer), em que o dito agente inclui um ou mais peptídeos de (1) como um ingrediente ativo;
(7) um agente para induzir uma célula apresentadora de antígeno que mostra atividade de indução de célula T citotóxica (killer),
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9/57 em que o dito agente inclui um ou mais polinucleotídeos que codificam os peptídeos de (1) como um ingrediente ativo;
(8) um agente para induzir uma célula T citotóxica (killer), em que o dito agente inclui um ou mais peptídeos de (1) como um ingrediente ativo;
(9) um anticorpo contra o peptídeo de (1);
(10) uma célula T auxiliar, uma célula T citotóxica (killer), ou uma população de imunócito que as incluam, que é induzida usando o peptídeo de (1);
(11) uma célula apresentadora de antígeno que apresenta um complexo incluindo o peptídeo de (1) e um antígeno de HLA;
(12) a célula apresentadora de antígeno de (11), que é induzida pelo agente de (6) ou (7);
(13) um exossomo que apresenta um complexo incluindo o peptídeo de (1) e um antígeno de HLA;
(14) o exossomo de (13), em que o antígeno de HLA é HLA-A2 (HLA-A2*0201);
(15) um método para induzir uma célula apresentadora de antígeno que mostra atividade de indução de célula T citotóxica (killer), que inclui a etapa de contatar uma célula apresentadora de antígeno com o peptídeo de (1);
(16) um método para induzir uma célula apresentadora de antígeno que mostra atividade de indução de célula T citotóxica (killer), que inclui a etapa de introduzir um polinucleotídeo que codifica o peptídeo de (1) em uma célula apresentadora de antígeno;
(17) um método para induzir uma célula T citotóxica (killer), que inclui a etapa de contatar uma célula T com o peptídeo de (1);
(18) um método para induzir imunidade contra o câncer, que inclui a etapa de administrar o peptídeo de (1) a um paciente;
(19) um método para tratar e/ou prevenir câncer, que inclui a
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10/57 etapa de administrar o peptídeo de (1) a um paciente;
(20) uso do peptídeo de (1) para a produção de um agente para induzir imunidade contra o câncer;
(21) uso do peptídeo de (1) para a produção de um agente para tratar e/ou prevenir câncer;
(22) o peptídeo de (1), para indução de imunidade contra o câncer;
(23) o peptídeo de (1), para o tratamento e/ou prevenção do câncer.
Breve Descrição dos Desenhos [00014] A figura 1A mostra o protocolo para identificar peptídeos de CDCA1 reconhecidos por células T killers restritas de HLA-A2. O dia quando células do baço foram coletadas de camundongos imunizados é designado como o Dia 0. A figura 1B mostra os resultados do ensaio ELISPOT. O ensaio ELISPOT foi usado para examinar se ou não as células T killers obtidas de camundongos imunizados respondem especificamente a células pulsadas com peptídeo de CDCA1 e produzem IFN-γ. Como um resultado, células T killers induzidas com o peptídeo de CDCA1-1 ou CDCA1-4 especificamente reconheceram células T2A2 pulsadas com peptídeo de CDCA1 e produziram IFN-γ. Entretanto, nenhuma resposta imune de célula T killer específica de CDCA1 foi observada em células T killers induzidas com outros peptídeos. Portanto, foi determinado que os peptídeos de CDCA1-1 e CDCA1-4 são peptídeos epítopos capazes de induzir células T killers restritas de HLA-A2 específicas de CDCA1. Os números do peptídeo de CDCA1 mostrado na figura 1B correspondem aos números de peptídeo mostrados sob a POSIÇÃO DE PEPTÍDEO da Tabela 1, mas não aos números de sequência ID descritos aqui.
[00015] A figura 2 mostra o resultado do ensaio ELISPOT para detectar IFN-γ produzido por células T killers ativadas como um resultado
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11/57 do reconhecimento específico de peptídeos de CDCA1. A figura 2A mostra o resultado da indução de célula T killer por estimulação com células dendríticas pulsadas com peptídeo de CDCA165-73 (N° 1) (SEQ ID NO: 1) derivadas da medula óssea de camundongos transgênicos de HLA-A2. Quando células T2A2 pulsadas com peptídeo de CDCA1 foram usadas como as células estimuladoras, a contagem de manchas e a área total de manchas foram significativamente maiores do que aquelas quando células T2A2 pulsadas que não de CDCA1 HLA-A2 positivas foram usadas como as células estimuladoras. Assim, foi determinado que o peptídeo de CDCA1-1 é um peptídeo epítopo capaz de induzir células T killers restritas de HLA-A2. A figura 2B mostra o resultado da indução de célula T killer por estimulação com células dendríticas pulsadas com peptídeo de CDCA1351-359 (N° 4) (SEQ ID NO: 2) derivadas da medula óssea de camundongos transgênicos de HLA-A2. Quando células T2A2 pulsadas com peptídeo de CDCA1 foram usadas como as células estimuladoras, a contagem de manchas e a área total de manchas foram significativamente maiores do que aquelas quando células T2A2 pulsadas que não de CDCA1 HLA-A2 positivas foram usadas como as células estimuladoras. Assim, foi determinado que o peptídeo de CDCA1351-359 (N° 4) é um peptídeo epítopo capaz de induzir células T killers restritas de HLA-A2.
[00016] A figura 3 mostra a resposta imune específica de CDCA1 de CTLs induzidos a partir de um doador saudável. A figura 3A mostra o protocolo para indução de CTLs específicos de CDCA1 a partir de PBMCs. PBMCs foram isolados de um doador saudável, e células T CD8+ e células CD14+ foram separadas usando micropérolas. Depois, CTLs CD8+ reativos de peptídeo foram produzidos, e DCs foram produzidas a partir de células CD14 positivas cultivando-se durante cinco dias na presença de GM-CSF e IL-4. DCs foram cultivadas na presença de β2 microglobulina a 37°C durante quatro horas, e pulsadas com
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12/57 peptídeos de ligação de HLA-A2. As DCs pulsadas com peptídeo depois foram irradiadas e misturadas com células T autólogas CD8 positivas em razão de 1:20. As células foram cultivadas em AIM-V contendo 2 % autosoro suplementado com IL-7. Depois de três dias, IL-2 foi adicionada ao meio de cultura. Nos dias 12 e 19, as células T foram reestimuladas com DCs autólogas pulsadas com peptídeo. As DCs foram preparadas no uso. O ensaio ELISPOT de IFN-γ e o ensaio de liberação de Cr foram realizados cinco e seis dias depois da terceira estimulação do peptídeo. As figuras 3B e C mostram os resultados do ensaio ELISPOT realizado depois de cocultivar células-alvo com CTLs induzidos a partir de um doador usando o peptídeo de CDCA165-73 (N° 1) e o peptídeo de CDCA1351-359 (N° 4), respectivamente. A produção de IFN-γ contra células T2 pulsadas com peptídeo foi significativamente mais alta do que aquela contra células T2 não-pulsadas com peptídeo. A figura 3D mostra a citotoxicidade de CTLs induzidas a partir de PBMCs de paciente doador com câncer 1 e doador saudável 1 contra células T2 pulsadas com peptídeo de CDCA1. A figura 3E mostra a resposta dependente de dose de CTLs derivados de doador saudável 1 induzida pelo peptídeo de CDCA1351-359. Os CTLs produziram uma grande quantidade de IFN-γ em resposta a células T2 pulsadas com o peptídeo em 0,2 pg/mL ou mais em uma razão de E/T de 5.
[00017] A figura 4 mostra a atividade citotóxica específica de CTLs induzidos a partir de um doador saudável contra células câncerosas CDCA1 positivas. A figura 4A mostra a expressão em células COLO201 quando um vetor de expressão de gene de CDCA1 foi introduzido nas células. Um lentivírus em que a expressão de CDCA1-HA é induzida sob o promotor de EF-1a e promotor de CMV foi usado para infectar a linhagem de célula câncerosa (COLO201), que expressa HLA-A2 mas não CDCA1, três vezes. O lisato celular foi submetido à análise de Western blot usando um anticorpo anti-HA (intermediário) ou anticorpo
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13/57 anti-CDCAI (superior). As figuras 4B, C, e D mostram produção de IFN-γ contra COLO201/CDCA1. A produção de IFN-γ foi significativamente mais alta para uma linhagem de célula câncerosa COLO201 transformada do que para COLO201 não transformada. Além disso, a produção de IFN-γ contra PANC1 endogenamente expressando tanto CDCA1 quanto HLA-A2 foi significativamente maior do que aquela contra A549 não expressando nem CDCA1 ou HLA-A2. As figuras 4E e F mostram os resultados do ensaio de liberação de 51Cr quando CTLs induzidos por doador e células-alvo foram cocultivados. A citotoxicidade foi observada para PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+), mas não para A549 (CDCA1+, HLA-A2-) e COLO201 (CDCA1-, HLA-A2+). A figura 4G mostra a correlação entre os CTLs reativos com peptídeo de CDCA1 e os CTLs positivos de tetrâmero HLA-A2-CDCA1 entre as células CD8 positivas. O diagrama esquerdo mostra o ensaio ELISPOT usando células T2 pulsadas com peptídeo como as células-alvo, e a razão de E/T foi 5. O diagrama direito mostra o resultado da análise de FACS. As células analisadas no diagrama esquerdo são CTLs derivados de doador saudável 1 submetidos a três vezes de estimulação de PBMC com DCs pulsadas com peptídeo. As células analisadas no diagrama direito são células CD8 positivas ingênuas de PBMCs de doador saudável 1. Modo para Realizar a Invenção [00018] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e os científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual a presente invenção pertence.
[00019] Os peptídeos da presente invenção são epítopos restritos a HLA-A2, que é um alelo de HLA frequentemente encontrado nas populações Japonesas e Caucasianas. Especificamente, usando a afinidade de ligação a HLA-A2 como um índice, peptídeos de ligação de HLA-A2 candidatos derivados de CDCA1 foram selecionados. Para os
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14/57 peptídeos selecionados, se ou não células T killers foram induzidas no corpo de camundongos transgênicos de HLA-A2 por células dendríticas derivadas de célula da medula óssea de camundongo transgênico de HLA-A2 (BM-DCs) pulsadas com os peptídeos selecionados foi avaliado. Células T citotóxicas (killers) foram induzidas in vivo em camundongos transgênicos de HLA-A2 por CDCA1-1 (YMMPVNSEV (SEQ ID NO: 1)) e CDCA1-4 (KLATAQFKI (SEQ ID NO: 2)). Células T killers induzidas por estes peptídeos mostraram reação de resposta imune a células T2A2 pulsadas com estes peptídeos. Entretanto, estas células T killers não mostraram reação de resposta imune a células T2A2 não-pulsadas com peptídeo. Além disso, CTLs derivados de paciente com câncer e derivados de doador saudável que foram induzidos usando CDCA1-1 e CDCA1-4 mostraram atividade citolítica contra linhagens celulares que expressam CDCA1. Estes resultados demonstram que os peptídeos derivados de CDCA1 são úteis como peptídeos que induzem imunorreação contra células apresentadoras de CDCA1, e que os peptídeos derivados de CDCA1 são peptídeos epítopos restritos de HLA-A2. Foi mostrado que CDCA1 é altamente expressado em tecidos câncerosos na maioria dos casos de câncer pulmonar, carcinoma colangiocelular, câncer de bexiga, carcinoma de célula renal, câncer de próstata, leucemia mieloide crônica, linfoma maligno, câncer cervical, osteosarcoma, câncer de mama, sarcoma de tecido macio, e câncer de cólon. A partir destes fatos, CDCA1 é considerado ser útil como um alvo imunoterapêutico para vários cânceres.
(1) Peptídeos da presente invenção e agentes para induzir imunidade contra o câncer que contêm os peptídeos [00020] O peptídeo da presente invenção é qualquer um de (A) a (D) abaixo.
(A) Um peptídeo incluindo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2.
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15/57 (B) Um peptídeo que inclui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2, em que um, dois, ou vários aminoácidos são substituídos, suprimidos, inseridos e/ou adicionados, e em que o peptídeo mostra atividade de indução de célula T citotóxica (killer).
(C) O peptídeo de (B), em que o segundo aminoácido do término N é leucina ou metionina.
(D) O peptídeo de (B), em que o aminoácido de terminal C é valina ou leucina.
[00021] Aqui, um peptídeo que mostra uma atividade de induzir células T killers significa um peptídeo tendo atividade de indução de célula T que estimula células T killers (células T citotóxicas/CTLs).
[00022] O peptídeo da presente invenção é um peptídeo epítopo tendo menos do que cerca de 40 aminoácidos, preferivelmente menos do que cerca de 20 aminoácidos, mais preferivelmente menos do que cerca de 15 aminoácidos, e incluindo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2, e mostrando uma atividade de induzir células T killers. Além disso, os peptídeos da presente invenção (peptídeos epítopos) podem incluir um peptídeo incluindo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2, em que um, dois, ou vários aminoácidos são substituídos, suprimidos, inseridos, e/ou adicionados, contanto que a capacidade para induzir células T killers seja retida. O número de resíduos substituídos, suprimidos, inseridos, e/ou adicionados é geralmente de cinco aminoácidos ou menos, preferivelmente quatro aminoácidos ou menos, mais preferivelmente três aminoácidos ou menos, ainda mais preferivelmente um aminoácido ou dois aminoácidos.
[00023] Peptídeos variantes (isto é, peptídeos incluindo sequências de aminoácido obtidas modificando-se as sequências de aminoácido originais por substituição, supressão, inserção, e/ou adição de um, dois, ou vários resíduos de aminoácido) são conhecidos para reter a atividade biológica original (Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA
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81:5662-6; Zoller MJ e Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500; Dalbadie-McFarland G et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13). A modificação de aminoácido preferivelmente retém as propriedades das cadeias laterais de aminoácido originais. Exemplos das propriedades de cadeias laterais de aminoácido incluem: aminoácido hidrofóbico (A, I, L, M, F, P, W, Y, V); aminoácido hidrofílico (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T); e as cadeias laterais tendo os seguintes grupos funcionais ou propriedades em comum: cadeias laterais alifáticas (G, A, V, L, I, P); cadeias laterais contendo grupo hidróxi (S, T, Y); cadeias laterais contendo átomo de enxofre (C, M); cadeias laterais contendo ácido carboxílico e amida (D, N, E, Q); cadeias laterais contendo base (R, K, H); e cadeias laterais contendo anel aromático (H, F, Y, W). As letras nos parênteses mostram códigos de uma letra de aminoácidos. [00024] Em uma modalidade preferida, os peptídeos da presente invenção (peptídeos imunogênicos) são nonapeptídeos (9-mer) ou decapeptídeos (10-mer).
[00025] De modo a obter peptídeos com alta afinidade de ligação e atividade de indução de célula T killer, a sequência de aminoácido de um peptídeo parcial de CDCA1 que ocorre naturalmente pode ser modificada por substituição, supressão, inserção, e/ou adição de um, dois, ou vários aminoácidos. Aqui, o termo vários refere-se a cinco ou menos, preferivelmente três ou menos, mais preferivelmente dois ou menos. Além disso, visto que a regularidade das sequências de peptídeo que têm alta afinidade para antígenos de HLA é conhecida (Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24; Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228; Kondo A, et al. (1995) J. Immunol. 155:4307-12), os peptídeos da presente invenção (peptídeos epítopos) podem ser modificados com base na regularidade de modo a aumentar sua afinidade para antígenos de HLA. Por exemplo, peptídeos com alta afinidade de ligação de HLA-A2 podem ser obtidos substituindo-se o
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17/57 segundo aminoácido do término N com leucina ou metionina. Similarmente, peptídeos com alta afinidade de ligação de HLA-A2 também podem ser obtidos substituindo-se o aminoácido de terminal C com valina ou leucina.
[00026] Quando a sequência de um peptídeo epítopo é idêntica a uma porção da sequência de aminoácido de uma proteína endógena ou exógena tendo uma função diferente, efeitos colaterais tais como distúrbios autoimunes ou sintomas alérgicos contra uma substância específica podem ser causados. De modo a evitar tais efeitos colaterais, um peptídeo epítopo modificado não deveria ser idêntico às sequências de aminoácido de proteínas conhecidas. Para este propósito, é necessário realizar pesquisa de homologia usando bases de dados disponíveis para confirmar que não existe nenhuma proteína endógena ou exógena com uma função diferente que mostra 100 % de homologia com o peptídeo epítopo modificado. Por este procedimento, riscos causados pela sequência de modificação de aminoácido mencionada acima para aumentar a afinidade de ligação a antígenos de HLA e/ou para aumentar a atividade de indução de célula T killer podem ser evitados.
[00027] Embora os peptídeos mencionados acima tendo alta afinidade de ligação a antígenos de HLA sejam esperados serem altamente eficazes como vacinas contra o câncer, peptídeos candidatos selecionados usando alta afinidade de ligação como um índice precisam ser examinados se os mesmos realmente têm atividade de indução de célula T killer. A atividade de indução de célula T killer pode ser confirmada: induzindo-se células apresentadoras de antígeno tendo o antígeno de MHC humano (por exemplo, linfócitos B, macrófagos, e células dendríticas), mais especificamente, induzindo-se células dendríticas derivadas de leucócitos mononucleares de sangue periférico humano; estimulando-as com um peptídeo de interesse; depois mistu
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18/57 rando-as com células CD8 positivas; e medindo a atividade citotóxica para células-alvo. Como um sistema de reação, animais transgênicos que expressam o antígeno de HLA humano (como descrito em, por exemplo, BenMohamed L, et al. (2000) Hum. Immunol. 61(8):764-79, Related Articles, Books, and Linkout) podem ser usados. Por exemplo, para medir a atividade citotóxica, células-alvo são radiorrotuladas com 51Cr ou semelhante. A atividade citotóxica em células-alvo pode ser examinada medindo-se IFN-γ produzido e liberado por células T killers na presença das células apresentadoras de antígeno tendo um peptídeo imobilizado; e visualizando a zona de produção de IFN-γ no meio de cultura usando um anticorpo monoclonal anti-IFN-γ.
[00028] Como mostrado nos Exemplos, o resultado de examinar a atividade de indução de célula T killer de peptídeos mostrou que peptídeos tendo alta afinidade de ligação ao antígeno de HLA não necessariamente têm alta atividade de indução de célula T killer. Entretanto, os peptídeos contendo as sequências de aminoácido de CDCA1-1 (YMMPVNSEV (SEQ ID NO: 1)) e CDCA1-4 (KLATAQFKI (SEQ ID NO: 2)) mostraram atividade de indução de célula T killer particularmente alta.
[00029] Como descrito acima, a presente invenção fornece peptídeos mostrando atividade de indução de célula T killer, mais especificamente, peptídeos incluindo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2, e variantes desta (isto é, sequências de aminoácido em que um, dois, ou vários aminoácidos são substituídos, suprimidos, inseridos e/ou adicionados). Preferivelmente, as sequências de aminoácido dos peptídeos incluindo os nove aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou 2, ou variantes destas não são idênticas àquelas de outras proteínas endógenas. Especialmente, peptídeos com alta afinidade de ligação de HLA-A2 podem ser obtidos substituindo-se o segundo aminoácido do término N com leucina ou metionina, e/ou substituindo-se o aminoácido
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19/57 de terminal C com valina ou leucina.
[00030] Os peptídeos da presente invenção podem incluir modificações tais como glicosilação, oxidação de cadeia lateral, e fosforilação, a menos que os peptídeos percam sua atividade de indução de célula T killer. Outras modificações incluem, por exemplo, D-aminoácidos e outros análogos de aminoácido que podem ser usados para aumentar a meia-vida sérica dos peptídeos.
[00031] Métodos para obter e produzir os peptídeos da presente invenção não são particularmente limitados. Peptídeos quimicamente sintetizados ou peptídeos recombinantes produzidos por técnicas de recombinação genética estão disponíveis.
[00032] Peptídeos quimicamente sintetizados da presente invenção podem ser sintetizados de acordo com métodos de síntese química tais como o método de Fmoc (método de fluorenilmetiloxicarbonila) e o método de t-Boc (método de t-butiloxicarbonila). Os peptídeos da presente invenção também podem ser sintetizados utilizando vários sintetizadores de peptídeo comercialmente disponíveis.
[00033] Os peptídeos da presente invenção podem ser produzidos como proteínas recombinantes obtendo-se DNAs tendo as sequências de nucleotídeo que codificam os peptídeos, ou variantes ou homólogos destes, e introduzindo-os em um sistema de expressão adequado.
[00034] Vetores de expressão usados podem ser preferivelmente quaisquer vetores que podem ser autonomamente duplicados em células hospedeiras, ou podem ser incorporados no cromossomo de células hospedeiras, e contêm um promotor em uma posição adequada para permitir a expressão de um gene que codifica peptídeo. Transformantes tendo um gene que codifica o peptídeo da presente invenção podem ser produzidos introduzindo-se o vetor de expressão mencionado acima em um hospedeiro. O hospedeiro pode ser qualquer um de bactérias, levedura, células animais, e células de inseto, e o vetor de
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20/57 expressão pode ser introduzido no hospedeiro usando técnicas conhecidas dependendo do hospedeiro.
[00035] Na presente invenção, os peptídeos recombinantes podem ser isolados cultivando-se um transformante preparado como descrito acima, produzindo e acumulando os peptídeos na cultura, e coletando os peptídeos da presente invenção da cultura.
[00036] Quando o transformante é um procariota tal como E. coli ou um eucariota tal como levedura, o meio de cultura para estes micro-organismos pode ser meio natural ou sintético, contanto que o mesmo contenha fonte de carbono, fonte de nitrogênio, minerais, e tal que possa ser utilizado pelos micro-organismos, e permita cultura eficiente do transformante. As condições de cultura podem ser aquelas convencionalmente usadas para cultivar os micro-organismos. Depois da cultura, os peptídeos da presente invenção podem ser isolados e purificados da cultura do transformante usando métodos convencionais para isolamento e purificação de peptídeo.
[00037] Peptídeos incluindo uma sequência de aminoácido em que um, dois, ou vários aminoácidos são substituídos, suprimidos, inseridos, ou adicionados na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2 podem ser apropriadamente produzidos ou obtidos por uma pessoa versada na técnica com base na informação sobre a sequência de nucleotídeo de DNA que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2. Especificamente, um gene que codifica um peptídeo incluindo uma sequência de aminoácido em que um, dois, ou vários aminoácidos são substituídos, suprimidos, inseridos e/ou adicionados na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2, e mostrando atividade de indução de célula T killer pode ser produzido por quaisquer métodos conhecidos a pessoas versadas na técnica, tais como síntese química, técnicas de engenharia genética, e mutagênese. Por exemplo, o método de mutagênese sítio-dirigida, que é uma das técnicas de
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21/57 engenharia genética, é útil visto que ele pode introduzir uma mutação específica em uma posição específica. O mesmo pode ser realizado de acordo com os métodos descritos em Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989 (em seguida referido como Molecular Cloning, 2a Ed.) e Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) (em seguida referido como Current Protocols in Molecular Biology), etc.
[00038] Os peptídeos descritos acima da presente invenção podem induzir imunidade contra o câncer, como mostrado abaixo nos Exemplos. Portanto, a presente invenção fornece agentes para induzir imunidade contra o câncer incluindo os peptídeos da presente invenção.
[00039] Os agentes que induzem imunidade da presente invenção podem ser preparados como uma formulação mista combinada a dois ou mais peptídeos epítopos. Agentes que induzem imunidade formulados combinando-se tipos múltiplos de peptídeos podem ser um coquetel, ou podem ser mutuamente ligados usando técnicas-padrão. Os peptídeos epítopos a serem combinados podem ser peptídeos tendo diferentes sequências de aminoácido derivadas do mesmo gene, ou podem ser peptídeos tendo sequências de aminoácido derivadas de diferentes genes. Quando os peptídeos da presente invenção são administrados, os peptídeos administrados são apresentados em antígenos de HLA de células apresentadoras de antígeno em uma densidade alta, e subsequentemente, células T killers que reagem especificamente aos complexos formados com os peptídeos administrados e os antígenos de HLA são induzidas. Alternativamente, contatando-se células dendríticas coletadas de um paciente com os peptídeos da presente invenção (isto é, pulsando-se células dendríticas coletadas de um paciente com os peptídeos da presente invenção), células apresentadoras de antígeno que apresentam os peptídeos da presente invenção
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22/57 em sua superfície celular podem ser obtidas. Administrando-se estas células apresentadoras de antígeno de volta ao paciente, células T killers podem ser induzidas no corpo do paciente, e como um resultado, a resposta imune a células-alvo que apresentam os peptídeos da presente invenção pode ser realçada.
[00040] Quando usado in vitro ou in vivo, preferivelmente in vitro, os agentes para induzir imunidade contra o câncer da presente invenção podem induzir células T auxiliares, células T killers, ou populações de imunócito incluindo estas células, deste modo fornecendo imunidade contra o câncer.
(2) Agentes para o tratamento e/ou prevenção de câncer da presente invenção (vacinas contra o câncer) [00041] Foi mostrado nos Exemplos que os peptídeos da presente invenção podem induzir células T killers específicas de célula câncerosa in vivo. Por outro lado, foi mostrado na invenção prévia que CDCA1 foi altamente expressado na maioria dos casos de câncer pulmonar, carcinoma colangiocelular, câncer de bexiga, carcinoma de célula renal, câncer de próstata, leucemia mieloide crônica, linfoma maligno, câncer cervical, osteosarcoma, câncer de mama, sarcoma de tecido macio, câncer de cólon, e assim por diante. Consequentemente, os agentes que induzem imunidade incluindo um ou mais dos peptídeos da presente invenção como um ingrediente ativo são esperados serem eficazes como agentes para o tratamento e/ou prevenção de câncer. Isto é, indução e ativação de células T killers que atacam o tumor podem ser esperadas injetando-se os peptídeos da presente invenção juntamente com um adjuvante adequado no corpo, ou pulsando-se células apresentadoras de antígeno tais como células dendríticas com os peptídeos, e depois injetando-as no corpo. Assim, como um resultado, efeitos anticâncer podem ser esperados. Além disso, um gene que codifica um peptídeo da presente invenção pode ser incorporado em um vetor
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23/57 adequado. Células apresentadoras de antígeno humanas (células dendríticas, etc.) e bactérias tais como Mycobacterium tuberculosis de BCG que são transformadas com o DNA recombinante, ou vírus tais como vírus da varíola que têm um DNA que codifica o peptídeo da presente invenção incorporado em seu genoma, podem ser usados eficazmente como vacinas vivas para o tratamento e/ou prevenção de câncer humano. As dosagens e os métodos de administração para as vacinas contra o câncer são os mesmos como aqueles para vacinas contra varíola convencionais e vacinas BCG.
[00042] Na presente invenção, o termo vacina (também chamada composição imunogênica) refere-se a uma substância que induz imunidade antitumor ou suprime vários cânceres quando inoculada a um animal. De acordo com a presente invenção, foi sugerido que o peptídeo incluindo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2 é um peptídeo epítopo restrito de HLA-A2 que pode induzir resposta imune forte e específica contra células apresentadoras de CDCA1. Consequentemente, a presente invenção também inclui métodos para induzir imunidade antitumor usando-se os peptídeos incluindo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2, ou variantes desta que incluem substituição, supressão, ou adição de um, dois, ou vários aminoácidos. Em geral, a imunidade antitumor inclui as seguintes respostas imunes:
(1) indução de células T killers contra tumores contendo células que expressam CDCA1, (2) indução de anticorpos que reconhecem tumores contendo células que expressam CDCA1, e (3) indução da produção de citocina antitumor.
[00043] Quando um peptídeo particular induz qualquer uma destas respostas imunes através de inoculação a um animal, o peptídeo é determinado para ter efeito de indução de imunidade antitumor. A in
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24/57 dução de imunidade antitumor pelo peptídeo pode ser detectada observando-se resposta in vivo ou in vitro do sistema imune em um hospedeiro ao peptídeo.
[00044] Por exemplo, métodos para detectar a indução de células T killers são bem-conhecidos. Uma substância estranha que invade um corpo vivo é apresentada a células T e células B pela ação de células apresentadoras de antígeno (APCs). células T que respondem a antígenos apresentados por células apresentadoras de antígeno em uma maneira específica de antígeno diferenciam em células T killers (também chamadas linfócitos T citotóxicos ou CTLs) através da estimulação por antígenos, e depois proliferam. Aqui, este processo é chamado ativação de células T. A indução de células T killers por um peptídeo específico pode ser avaliada apresentando-se o peptídeo a células T usando células apresentadoras de antígeno pulsadas com peptídeo, e depois detectando a indução de células T killers. Além disso, células apresentadoras de antígeno têm um efeito de ativar células T CD4+, células T CD8+, macrófagos, eosinófilos, e células NK. Visto que células T CD4+ também são importantes em imunidade antitumor, a ação de indução de imunidade antitumor do peptídeo pode ser avaliada usando o efeito sobre a ativação destas células como um índice.
[00045] Um método para avaliar o efeito de induzir células T killers que são induzidas usando células dendríticas (DCs) como células apresentadoras de antígeno é bem-conhecido na técnica. Entre as células apresentadoras de antígeno, DCs têm o efeito de indução de célula T killer mais forte. Neste método, primeiro, um peptídeo de teste é contatado com DCs, e depois as DCs são contatadas com células T. As células T que têm efeito citotóxico sobre células-alvo são detectadas a partir das células T contatadas com DCs. Se as células T mostram atividade citotóxica contra as células-alvo, significa que o peptídeo de teste tem a atividade para induzir células T citotóxicas. A atividade de
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25/57 células T killers contra células-alvo tais como tumores pode ser detectada, por exemplo, usando lise de células tumorosas rotuladas com 51Cr como um índice. Alternativamente, o grau de dano de célula tumorosa pode ser avaliado usando atividade de captação de 3H-timidina ou liberação de LDH (lactose desidrogenase) como um índice.
[00046] Peptídeos de teste confirmados por estes métodos para ter atividade de indução de célula T killer são peptídeos que têm efeito de ativação de DC e atividade de indução de célula T killer subsequente. Portanto, os peptídeos que induzem células T killers contra células tumorosas são úteis como vacinas contra cânceres apresentando CDCA1. Além disso, células apresentadoras de antígeno que adquiriam a capacidade para induzir células T killers contra cânceres através de contato com os peptídeos são úteis como vacinas contra cânceres. Além disso, células T killers que adquiriram citotoxicidade como um resultado da apresentação dos peptídeos por células apresentadoras de antígeno também podem ser usadas como vacinas contra cânceres apresentando CDCA1. Métodos de tratamento do câncer usando imunidade antitumor por células apresentadoras de antígeno e células T killers são chamados citoimunoterapia.
[00047] Em geral, quando do uso de peptídeos para citoimunoterapia, a eficiência de induzir células T killers pode ser realçada combinando-se peptídeos múltiplos tendo estruturas diferentes. Portanto, quando da estimulação de DCs com fragmentos de proteína, é vantajoso usar uma mistura de tipos múltiplos de fragmentos de peptídeo.
[00048] A indução de imunidade antitumor por peptídeos também pode ser avaliada observando-se a indução de produção de anticorpo contra tumores. Por exemplo, quando anticorpos são induzidos contra peptídeos imunizando-se animais de laboratório com os peptídeos, e eles suprimem o crescimento, proliferação, e/ou metástase de células tumorosas, é determinado que os peptídeos induzem imunidade antiPetição 870200001172, de 03/01/2020, pág. 36/77
26/57 tumor.
Imunidade antitumor pode ser induzida administrando-se uma vacina da presente invenção, e a indução de imunidade antitumor permite tratamento e/ou prevenção de cânceres. Efeitos do tratamento do câncer e/ou prevenção de desenvolvimento do câncer podem incluir inibição de crescimento de célula câncerosa, regressão de células câncerosas, e supressão do desenvolvimento de célula câncerosa. A diminuição na taxa de mortalidade de indivíduos com câncer, diminuição nos marcadores tumorais no sangue, e redução de sintomas detectáveis associados a câncer também são incluídos nos efeitos do tratamento e/ou prevenção do câncer. Os efeitos terapêuticos ou preventivos de uma vacina contra câncer são preferivelmente estatisticamente significantes comparados àqueles de um controle sem administração da vacina. Por exemplo, os efeitos são preferivelmente observados em um nível de significância de 5 % ou menos. Métodos estatísticos tais como teste t de Student, teste U de Mann-Whitney, e ANOVA podem ser usados para determinar a significância estatística.
[00049] Na presente invenção, o paciente é preferivelmente um mamífero. Exemplos de mamíferos incluem seres humanos, primatas não humanos, camundongos, ratos, cachorros, gatos, cavalos, e gado, mas não são limitados a estes.
[00050] Os peptídeos da presente invenção podem ser administrados a um paciente in vivo ou ex vivo. Além disso, para produzir uma composição imunogênica para o tratamento e/ou prevenção de câncer, os peptídeos imunogênicos da presente invenção, isto é, nonapeptídeos selecionados das sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 1 e 2, e peptídeos mutantes destes, podem ser usados.
[00051] Mais especificamente, a presente invenção fornece agentes farmacêuticos para o tratamento de tumor e/ou prevenção do crescimento do tumor, metástase, e assim por diante, que incluem um ou mais
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27/57 dos peptídeos da presente invenção como um ingrediente ativo. Os peptídeos da presente invenção são particularmente úteis para o tratamento de tumores tais como câncer pulmonar, carcinoma colangiocelular, câncer de bexiga, carcinoma de célula renal, câncer de próstata, leucemia mieloide crônica, linfoma maligno, câncer cervical, osteosarcoma, câncer de mama, sarcoma de tecido macio, e câncer de cólon.
[00052] Os peptídeos da presente invenção podem ser administrados diretamente a um paciente como agentes farmacêuticos formulados por métodos de formulação convencionais. Tais formulações podem conter, além dos peptídeos da presente invenção, portadores farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, e assim por diante, conforme necessário. Os agentes farmacêuticos da presente invenção podem ser usados para o tratamento e/ou prevenção de vários tumores.
[00053] Além disso, para estabelecer eficazmente imunidade celular, adjuvantes podem ser misturados em composições imunogênicas para o tratamento e/ou prevenção de tumores incluindo um ou mais dos peptídeos da presente invenção como um ingrediente ativo. Os agentes podem ser coadministrados com outros ingrediente ativos tais como agentes antitumor. Formulações apropriadas também incluem grânulos. Adjuvantes apropriados são descritos na literatura (Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89). Exemplos de adjuvantes incluem adjuvante incompleto de Freund, BCG, dimicolato de trealose (TDM), lipopolissacarídeo (LPS), adijuvante de sulfato de alumínio potássico, adjuvante de sílica, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, e alume, mas não são limitados a estes. Além disso, formulações lipossômicas, formulações granulares em que um medicamento é ligado a pérolas tendo um diâmetro de vários micrômetros, e formulações em que lipídeos são ligados aos peptídeos anteriormente mencionados podem ser convenientemente usadas. Métodos de administração podem ser administração oral, injeção intradérmica, injeção subcutânea, injeção in
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28/57 travenosa, ou semelhante, e podem incluir administração sistêmica e administração local perto do tumor-alvo.
[00054] A dose dos peptídeos da presente invenção pode ser ajustada apropriadamente dependendo da doença a ser tratada, idade e peso corporal do paciente, método de administração, e assim por diante. A dose é usualmente 0,001 mg a 1000 mg, preferivelmente 0,01 mg a 100 mg, e mais preferivelmente 0,1 mg a 10 mg. Preferivelmente, a administração é realizada uma vez a cada tantos dias a alguns meses, mas aqueles versados na técnica podem selecionar facilmente a dose e método de administração apropriados; e seleção e otimização destes parâmetros estão completamente dentro do escopo de técnicas convencionais. A forma das formulações não é particularmente limitada, e as mesmas podem ser secas por congelamento, ou granuladas adicionando-se excipientes tais como açúcar.
[00055] Agentes auxiliares que podem ser adicionados aos agentes farmacêuticos da presente invenção para aumentar a atividade de indução de célula T killer incluem componentes bacterianos de bactérias de BCG e assim por diante incluindo muramil dipeptídeo (MDP), ISCOM descrito em Nature, vol. 344, p873 (1990), QS-21 da série saponina descrita em J. Immunol. vol. 148, p1438 (1992), lipossoma, e hidróxido de alumínio. Além disso, imunoestimulantes tais como lentinan, sizofiran, e picibanil também podem ser usados como agentes auxiliares. Citocinas e assim por diante que realçam o crescimento e diferenciação de células T, tais como IL-2, IL-4, IL-12, IL-1, IL-6, e TNF, assim como α-galactosilceramida que ativa células T NK, e CpG e lipopolissacarídeos (LPS) que ativam o sistema imune natural ligando-se a receptores do tipo a Toll, e assim por diante, também podem ser usados como agentes auxiliares.
[00056] Composições de vacina da presente invenção contêm um componente que prepara células T killers. Lipídeos foram identificados
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29/57 como uma substância para preparar contra antígenos virais in vivo. Por exemplo, resíduos de ácido palmítico podem ser ligados ao grupo ε-amino e grupo α-amino de um resíduo de lisina, e depois ligados a um peptídeo imunogênico da presente invenção. Os peptídeos lipidados podem ser diretamente administrados incorporando-os em uma micela ou partícula, ou encapsulando-os em um lipossoma, ou emulsificando-os em um adjuvante. Um outro exemplo de preparação de lipídeo é preparação com uma lipoproteína de E. coli tal como tripalmitoil-S-gliceril-cisteinilseril-serina (P3CSS) quando covalentemente ligada a um peptídeo adequado (Deres K., et al., (1989) Nature
342:561-4).
[00057] Os peptídeos imunogênicos da presente invenção podem ser expressados por vetores virais ou vetores bacterianos. Exemplos de vetores de expressão apropriados incluem hospedeiros virais avirulentos tais como varíola e epitelioma contagioso. Por exemplo, um vírus da varíola pode ser usado como um vetor para expressar uma sequência de nucleotídeo que codifica o peptídeo. Introduzindo-se o vírus da varíola recombinante em células hospedeiras, os peptídeos imunogênicos são expressados, evocando a resposta imune. O método de imunização usando vetores da varíola é descrito, por exemplo, na Patente U.S. N° 4.722.848. Bacille Calmette-Guerin (BCG) também pode ser usado. Vetores de BCG são descritos em Stover CK, et al., (1991) Nature 31:456-60. Uma ampla variedade de outros vetores úteis para a administração terapêutica ou imunização, incluindo vetores adenovirais e vetores virais adeno-associados, vetores retrovirais, vetores de bacilo tifoide (Salmonella typhi), e vetores da toxina do antraz desentoxicados, são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Shata MT, et al., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ e Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; e Hipp JD, et al., (2000) In vivo 14:571-85.
[00058] Células T killers podem ser eficazmente induzidas no corpo
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30/57 de um paciente adicionando-se um peptídeo antigênico in vitro a células coletadas do paciente ou células de um outro indivíduo que compartilha um pouco dos alelos de HLA (células alogênicas), e apresentando o antígeno, e depois administrando as células ao paciente intravascularmente, localmente ao tumor, ou semelhante. Alternativamente, depois da indução in vitro de células T killers adicionando-se o peptídeo aos linfócitos do sangue periférico do paciente e cultivando-os in vitro, as células podem ser administradas ao paciente intravascularmente, localmente ao tumor, ou semelhante. Tal tratamento de transferência celular já foi realizado como terapia para o câncer, e é um método bem-conhecido entre aqueles versados na técnica.
[00059] O tipo de cânceres na presente invenção não é particularmente limitado, e exemplos específicos incluem câncer pulmonar, carcinoma colangiocelular, câncer de bexiga, carcinoma de célula renal, câncer de próstata, leucemia mieloide crônica, linfoma maligno, câncer cervical, osteosarcoma, câncer de mama, sarcoma de tecido macio, câncer de cólon, etc. Exemplos de cânceres para os quais a aplicação da presente invenção é adequada incluem câncer pulmonar.
(3) Anticorpos da presente invenção [00060] A presente invenção também refere-se a anticorpos que reconhecem uma porção de ou o peptídeo inteiro da presente invenção mencionado acima como um epítopo (antígeno), e refere-se a células T killers que são induzidas por estimulação in vitro usando as proteínas ou peptídeos. Em geral, as células T killers demonstram atividade antitumor mais potente do que os anticorpos.
[00061] Além disso, similarmente aos peptídeos da presente invenção, os anticorpos da presente invenção são úteis como agentes profiláticos e/ou terapêuticos contra cânceres expressando CDCA1, contanto que os mesmos possam inibir a atividade do antígeno de CDCA1 contra o câncer. Em um uso prático, os peptídeos ou anticorpos da
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31/57 presente invenção podem ser administrados como eles são, ou por injeção com um portador e/ou diluente farmaceuticamente aceitáveis, juntamente com um adjuvante conforme necessário. Alternativamente, eles podem ser administrados por absorção transdérmica através de membranas mucosas pelo método de pulverização ou semelhante. Mais especificamente, aqui, a albumina sérica humana é um exemplo de portadores; e PBS, água destilada, e assim por diante são exemplos de diluentes.
[00062] Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais, e podem ser produzidos por métodos conhecidos àqueles versados na técnica.
[00063] Por exemplo, anticorpos policlonais podem ser obtidos imunizando-se mamíferos ou espécies aviárias com um peptídeo da presente invenção como um antígeno, e coletando o sangue dos mamíferos ou espécies aviárias, e separando e purificando anticorpos a partir do sangue coletado. Por exemplo, mamíferos tais como camundongo, hamster, porquinho-da-índia, frango, rato, coelho, cachorro, cabra, ovelha, e bovino, ou espécies aviárias podem ser imunizados. Métodos de imunização são conhecidos àqueles versados na técnica, e o antígeno pode ser administrado, por exemplo, duas ou três vezes em um intervalo de 7 a 30 dias. A dosagem pode ser, por exemplo, aproximadamente 0,05 mg a 2 mg de antígeno por administração. A via de administração não é particularmente limitada, e pode ser adequadamente selecionada de administração subcutânea, administração intradérmica, administração intraperitoneal, administração intravenosa, administração intramuscular, e assim por diante. Além disso, o antígeno pode ser usado depois de dissolvê-lo em um tampão adequado, por exemplo, um tampão contendo um adjuvante convencional tal como adjuvante completo de Freund e hidróxido de alumínio.
[00064] Mamíferos ou espécies aviárias imunizados podem ser cri
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32/57 ados durante um certo período de tempo, e, quando o título do anticorpo aumentou, eles podem ser adicionalmente imunizados com, por exemplo, 100 pg a 1000 pg do antígeno. Sangue pode ser coletado dos mamíferos ou espécies aviárias imunizados um a dois meses depois da administração final, e o sangue pode ser separado e purificado por métodos convencionais tais como centrifugação, precipitação usando sulfato de amônio ou polietileno glicol, cromatografia tal como cromatografia de filtração em gel, cromatografia de troca de íon, cromatografia de afinidade, e assim por diante, para obter os anticorpos policlonais que reconhecem os peptídeos da presente invenção como um antissoro policlonal.
[00065] Por outro lado, anticorpos monoclonais podem ser obtidos preparando-se hibridomas. Por exemplo, hibridomas podem ser obtidos por fusão celular de células que produzem anticorpo com linhagens de célula de mieloma. Hibridomas que produzem anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser obtidos por métodos de fusão celular tais como aqueles indicados abaixo.
[00066] Células do baço, células de linfonodo, linfócitos B, e assim por diante a partir de animais imunizados são usados como células que produzem anticorpo. Os peptídeos da presente invenção são usados como antígenos. Animais tais como camundongo e rato podem ser usados como animais imunizados, e a administração de antígenos a estes animais é realizada por métodos convencionais. Por exemplo, animais são imunizados administrando-se uma suspensão ou emulsão de um peptídeo da presente invenção, que é um antígeno, com um adjuvante tal como adjuvante completo de Freund e adjuvante incompleto de Freund, aos animais várias vezes intravenosa, subcutânea, intradérmica, intraperitonealmente, ou semelhante. Células que produzem anticorpo tais como células do baço são obtidas dos animais imunizados, e podem ser fundidas com células de mieloma por métodos
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33/57 conhecidos (G. Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975)) para gerar hibridomas.
[00067] Para camundongos, exemplos de linhagens de célula de mieloma usados para fusão celular incluem, por exemplo, as linhagens P3X63Ag8, P3U1, Sp2/0, etc. Um agente promotor de fusão tal como polietileno glicol e vírus de Sendai é usado para a fusão celular, e o meio de hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT) é usado para selecionar hibridomas por um método convencional depois da fusão celular. Hibridomas obtidos por fusão celular são clonados pelo método de diluição limitante ou semelhante. Conforme necessário, linhagens celulares produzindo anticorpos monoclonais que especificamente reconhecem os peptídeos da presente invenção podem ser obtidas usando-se os peptídeos da presente invenção em triagem com um método de imunoensaio enzimático.
[00068] Além dos métodos mencionados acima, células imunizadas podem ser moduladas estimulando-se linfócitos humanos tais como linfócitos infectados com vírus EB in vitro usando os peptídeos da presente invenção, células expressando os peptídeos, ou lisatos destas. Anticorpos humanos que ligam-se aos peptídeos da presente invenção podem ser obtidos fundindo-se os linfócitos imunizados com células da medula óssea derivadas de ser humano tais como U266 (Publicação do Pedido de Patente Japonês Kokai N° (JP-A) S63-17688 (Pedido de Patente Japonês publicado, não-examinado)).
[00069] De modo a produzir anticorpos monoclonais de interesse a partir de hibridomas assim obtidos, os hibridomas podem ser cultivados por métodos de cultura convencionais ou métodos de formação de ascite, e os anticorpos monoclonais podem ser purificados a partir do sobrenadante de cultura ou ascite. A purificação de anticorpos monoclonais a partir de sobrenadantes de cultura ou ascite pode ser realizada por métodos convencionais. Por exemplo, fracionamento em sulfato de
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34/57 amônio, filtração em gel, cromatografia de troca de íon, cromatografia de afinidade, e assim por diante podem ser adequadamente combinados e usados.
[00070] Animais transgênicos que têm um grupo de genes de anticorpo humano podem ser imunizados usando os peptídeos da presente invenção, células expressando os peptídeos, ou lisatos destas. Células que produzem anticorpo podem ser coletadas dos animais transgênicos imunizados, e fundidas com as linhagens de célula de mieloma descritas acima para obter hibridomas. Anticorpos monoclonais de interesse depois podem ser produzidos a partir dos hibridomas (WO92/03918; WO94/02602; WO94/25585; WO94/33735;
WO96/34096).
[00071] Além disso, células imunes que produzem anticorpo tais como linfócitos imunizados podem ser imortalizadas usando oncogenes, e usadas para a preparação de anticorpos monoclonais.
[00072] Anticorpos monoclonais assim obtidos também podem ser modulados usando técnicas de manipulação genética (Borrbaeck e Larrick, (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies). Por exemplo, anticorpos recombinantes podem ser preparados clonando-se um DNA que codifica um anticorpo a partir de células que produzem anticorpo tais como hibridomas e linfócitos imunizados, e inserindo-o em um vetor adequado, e introduzindo-o em células hospedeiras.
[00073] Os anticorpos da presente invenção podem ser fragmentos de anticorpo ou anticorpos modificados, contanto que os mesmos liguem-se aos peptídeos da presente invenção. Os fragmentos de anticorpo podem ser Fab, F(ab')2, Fv, ou um Fv de cadeia única (scFv) em que fragmentos Fv derivados de cadeias H e L são ligados juntamente com um ligador adequado (Huston et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83). Mais especificamente, os fragmentos de anticorpo podem ser preparados tratando-se anticorpos com uma enzima tal como paPetição 870200001172, de 03/01/2020, pág. 45/77
35/57 paína e pepsina (Co et al., (1994) J Immunol 152:2968-76; Better e Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178: 476-96; Pluckthun e Skerra, (1989) Methods Emzymol 178:497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol 121:652-63; Rousseaux et al., (1986) Methods Enzymol
121:663-9; Bird e Walker, (1991) Trends Biotech 9:132-7).
[00074] Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos modificados obtidos ligando-se anticorpos a várias moléculas tais como polietileno glicol (PEG). Os anticorpos podem ser modificados por métodos de modificação química convencionais conhecidos na técnica.
[00075] Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos quiméricos incluindo uma região variável derivada de um anticorpo não humano e uma região constante derivada de um anticorpo humano, e anticorpos humanizados incluindo uma região determinante de complementaridade (CDR) derivada de um anticorpo não humano, uma região de estrutura (FR) derivada de um anticorpo humano, e uma região constante derivada de um anticorpo humano. Tais anticorpos podem ser preparados por métodos convencionais conhecidos na técnica. Anticorpos humanizados podem ser obtidos substituindo-se a região de sequência de CDR de um anticorpo humano com uma região CDR de roedor tendo atividade de ligação desejada (Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-6). Consequentemente, comparados aos anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados são anticorpos em que uma região menor de um anticorpo humano é substituída com uma região correspondente de origem não humana.
[00076] Um anticorpo humano completo tendo uma região variável humana além de regiões de estrutura e constantes humanas também pode ser produzido. Por exemplo, em um método in vitro, a triagem pode ser realizada usando uma biblioteca recombinante de bacteriófagos nos quais fragmentos de anticorpo humanos são exibidos (Hoogenboom e Winter, (1992) J Mol Biol 227:381-8). Similarmente, anti
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36/57 corpos humanos podem ser produzidos introduzindo-se locos de imunoglobulina humana em animais transgênicos cujos genes de imunoglobulina endógenos foram parcial ou completamente inativados (Patentes U.S. N°s 6.150.584, 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, e 5.661.016).
[00077] Os anticorpos obtidos como descrito acima podem ser purificados à homogeneidade por métodos convencionais na técnica. Por exemplo, métodos comuns de separação e purificação de proteína podem ser usados. Os anticorpos podem ser separados e purificados por uma combinação de cromatografia em coluna tal como cromatografia de afinidade, filtração, ultrafiltração, coagulação, diálise, eletroforese em gel de poliacrilamida SDS, focagem isoelétrica, e assim por diante; entretanto, métodos de separação e purificação não são limitados a estes (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory). Colunas de proteína A e colunas de proteína G podem ser usadas para colunas de afinidade. Exemplos de colunas de proteína A incluem HyperD, POROS, e Sepharose F.F (Pharmacia).
[00078] Exemplos de cromatografia exceto cromatografia de afinidade incluem cromatografia de troca de íon, cromatografia hidrofóbica, filtração em gel, cromatografia de fase reversa, cromatografia de adsorção, e assim por diante (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. et al.). Cromatografia líquida tal como HPLC e FPLC também podem ser usadas para cromatografia.
[00079] A afinidade de ligação de antígeno dos anticorpos da presente invenção pode ser medida usando, por exemplo, medição de absorbância, ensaio imonossorvente ligado à enzima (ELISA), imunoensaio enzimático (EIA), radioimunoensaio (RIA), e ensaio de imunofluorescência; entretanto, os métodos não são limitados a estes. Em
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ELISA, os anticorpos da presente invenção são imobilizados sobre uma placa, e os peptídeos da presente invenção são adicionados, depois uma amostra contendo um sobrenadante de cultura de células que produzem anticorpo ou anticorpos purificados é adicionada. Subsequentemente, um anticorpo secundário que tem um rótulo detectável e reconhece o anticorpo cuja afinidade de ligação de antígeno deve ser medida, é adicionado. Depois de lavar a placa, reagentes para detectar o rótulo do anticorpo secundário são adicionados e a absorbância ou tal é medida. Por exemplo, enzimas tais como fosfatase alcalina podem ser usadas como um rótulo para o anticorpo secundário, e substratos de enzima tais como fosfato de p-nitrofenila podem ser usados como um reagente para detecção. BIAcore (Pharmacia) também pode ser usado para avaliar a atividade dos anticorpos.
[00080] Os anticorpos da presente invenção podem detectar os peptídeos da presente invenção contidos nas amostras. Especificamente, a presença dos peptídeos da presente invenção em tecidos com câncer pode ser confirmada, por exemplo, contatando-se biópsias de tecido com câncer com os anticorpos da presente invenção.
[00081] Antes de usar os peptídeos da presente invenção em terapia para o tratamento e/ou prevenção do câncer, é possível prognosticar se o efeito é promissor para um paciente de teste antes do início do tratamento avaliando-se a expressão dos peptídeos da presente invenção no câncer a ser tratado usando os anticorpos da presente invenção.
[00082] Além disso, visto que os anticorpos da presente invenção reconhecem fragmentos de peptídeo de CDCA1, cuja expressão é aumentada em várias células câncerosas, sua aplicação é esperada ser aplicável não apenas em diagnose mas também para o tratamento.
(4) Células T auxiliares, células T killer, ou populações de
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38/57 imunócito que as incluam [00083] A presente invenção também refere-se a células T auxiliares e células T killers induzidas por estimulação in vitro usando os peptídeos da presente invenção, assim como populações de imunócito incluindo as células T auxiliares e células T killers. Por exemplo, células T ativadas por resposta do tumor são induzidas quando linfócitos do sangue periférico ou linfócitos infiltrantes do tumor são estimulados in vitro usando os peptídeos da presente invenção, e estas células T ativadas pode ser efetivamente usadas para imunoterapia adotiva. Alternativamente, células dendríticas que são células apresentadoras de antígeno potentes podem ser pulsadas com os peptídeos da presente invenção ou geneticamente transformadas para expressar os peptídeos, e a resposta imune antitumor pode ser induzida estimulando-se células T in vivo ou in vitro usando as células dendríticas.
[00084] Células T auxiliares, células T killers, ou populações de imunócito que as incluam podem ser preferivelmente induzidas por estimulação in vitro usando os peptídeos da presente invenção e um adjuvante. Os adjuvantes usados aqui incluem fatores de crescimento celular e citocinas.
[00085] Tumores podem ser suprimidos e cânceres podem ser prevenidos e/ou tratados por transfusão das células T auxiliares, células T killers, ou populações de imunócito que as incluam assim obtidas em um paciente com câncer intravascularmente, localmente ao tumor, ou similares.
[00086] Células T auxiliares, células T killers, ou populações de imunócito que as incluam que são capazes de suprimir tumores como descrito acima podem ser produzidas usando os peptídeos da presente invenção. Portanto, a presente invenção fornece meio de cultura celular contendo os peptídeos da presente invenção. Células T auxiliares, células T killers, ou populações de imunócito que as incluam capazes de
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39/57 suprimir tumores podem ser preparadas usando o meio de cultura celular. Além disso, a presente invenção fornece um kit de cultura celular incluindo o meio de cultura celular mencionado acima e um vaso de cultura celular para a produção de células T auxiliares, células T killers, ou populações de imunócito que as incluam.
(5) Exossomos que apresentam antígeno [00087] A presente invenção fornece ainda uma vesícula endocítica chamada exossomo que apresenta em sua superfície um complexo formado entre um peptídeo da presente invenção e um antígeno de HLA. Exossomos podem ser preparados, por exemplo, pelos métodos descritos em detalhe nas traduções Japonesas da Publicação do Pedido de Patente Japonês Kohyo N° (JP-A) H11-510507 (publicação de fase nacional Japonesa não-examinada correspondendo a uma publicação internacional não-Japonesa) e JP-A (Kohyo) 2000-512161. Preferivelmente, exossomos são preparados usando células apresentadoras de antígeno obtidas de um paciente de tratamento e/ou prevenção. Exossomos da presente invenção podem ser injetados como uma vacina contra o câncer em uma maneira similar como os peptídeos da presente invenção.
[00088] O tipo antigênico de HLA usado na presente invenção deveria corresponder ao tipo antigênico de HLA de um paciente em necessidade do tratamento e/ou prevenção. Por exemplo, o tipo antigênico de HLA é HLA-A02, e preferivelmente, HLA-A2 (HLA-A*0201). HLA-A2 significa uma proteína enquanto (HLA-A*0201) significa um gene correspondendo a um segmento da proteína, por causa da falta de terminologia para expressar segmentos da proteína no momento.
(6) Métodos para induzir células apresentadoras de antígeno e células T killers [00089] A presente invenção fornece métodos para induzir células
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40/57 apresentadoras de antígeno usando um ou mais dos peptídeos da presente invenção. Células apresentadoras de antígeno podem ser induzidas contatando-se células dendríticas induzidas de monócitos do sangue periférico com um ou mais dos peptídeos da presente invenção para estimular as células dendríticas. Quando os peptídeos da presente invenção são administrados em um paciente, células apresentadoras de antígeno apresentando os peptídeos da presente invenção em sua superfície podem ser induzidas no corpo do paciente. Alternativamente, um método ex vivo pode ser usado, em que células apresentadoras de antígeno são pulsadas com os peptídeos da presente invenção, e depois as células são administradas a um paciente como uma vacina. Por exemplo, a administração ex vivo pode incluir as etapas de:
(1) coletar células apresentadoras de antígeno de um paciente; e (2) contatar as células apresentadoras de antígeno da etapa (1) com um peptídeo da presente invenção (pulsando as células apresentadoras de antígeno da etapa (1) com um peptídeo da presente invenção).
[00090] As células apresentadoras de antígeno obtidas na etapa (2) podem ser administradas em um paciente como uma vacina.
[00091] A presente invenção também fornece métodos para induzir células apresentadoras de antígeno que mostram um nível alto de atividade de indução de célula T killer. Os métodos incluem a etapa de transfectar células apresentadoras de antígeno in vitro com um gene incluindo um polinucleotídeo que codifica um ou mais dos peptídeos da presente invenção. O gene a ser transfectado pode ser um DNA ou RNA. Para a transfecção, vários métodos convencionalmente realizados na técnica, tais como lipofecção, eletroporação, e um método de fosfato de cálcio podem ser adequadamente usados, mas os métodos não são limitados a estes. Mais especificamente, a transfecção pode ser realiPetição 870200001172, de 03/01/2020, pág. 51/77
41/57 zada como descrito em Reeves ME, et al., (1996) Câncer Res.,
56:5672-7; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161:5607-13; Boczkowski D, et al., (1996) J Exp. Med., 184:465-72; e WO99/08521. Quando os genes são transfectados em células apresentadoras de antígeno, eles são transcritos e traduzidos nas células. As proteínas resultantes são subsequentemente processadas por intermédio das vias de MHC classe I e classe II, e são apresentadas na superfície das células apresentadoras de antígeno como peptídeos parciais através da via de apresentação de antígeno.
[00092] A presente invenção também fornece métodos para induzir células T killers usando um ou mais dos peptídeos da presente invenção. Administrando-se um ou mais dos peptídeos da presente invenção a um paciente, células T killers podem ser induzidas no corpo do paciente, assim aumentando o sistema imune que direciona células câncerosas apresentando CDCA1 em tecidos tumorosos. Alternativamente, células T killers ativadas podem ser induzidas contatando-se células apresentadoras de antígeno e células CD8 positivas do paciente com um ou mais dos peptídeos da presente invenção in vitro, e contatando-se leucócitos mononucleares do sangue periférico com as células apresentadoras de antígeno in vitro para estimular as células. Em métodos terapêuticos ex vivo, o sistema imune que direciona células câncerosas apresentando CDCA1 em tecidos tumorosos em um paciente pode ser aumentado devolvendo-se as células T killers ativadas no corpo do paciente. Por exemplo, os métodos incluem as etapas de:
(1) coletar células apresentadoras de antígeno de um paciente;
(2) contatar as células apresentadoras de antígeno da etapa (1) com um peptídeo da presente invenção (pulsando as células apresentadoras de antígeno da etapa (1) com um peptídeo da presente in-
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42/57 venção);
(3) misturar e cocultivar as células apresentadoras de antígeno da etapa (2) com células T CD8+ para induzir células T citotóxicas; e (4) coletar células T CD8+ da cocultura da etapa (3).
[00093] Células T CD8+ tendo atividade citotóxica obtidas na etapa (4) podem ser administradas a um paciente como uma vacina.
[00094] A presente invenção também fornece células T killers isoladas induzidas usando um ou mais dos peptídeos da presente invenção. Preferivelmente, células T killers induzidas pelo método da presente invenção são derivadas de um paciente que recebe o tratamento e/ou prevenção. As células podem ser administradas em combinação com outros agentes contendo células apresentadoras de antígeno ou exossomos apresentando um ou mais dos peptídeos da presente invenção. As células T killers obtidas são específicas para células-alvo apresentando o mesmo peptídeo usado para indução. As células-alvo são células que expressam endogenamente CDCA1, ou células transfectadas com o gene de CDCA1. Por estimulação com um peptídeo da presente invenção, células apresentando o peptídeo da presente invenção em sua superfície, tais como células câncerosas do câncer pulmonar, carcinoma colangiocelular, câncer de bexiga, carcinoma de célula renal, câncer de próstata, leucemia mieloide crônica, linfoma maligno, câncer cervical, osteosarcoma, câncer de mama, sarcoma de tecido macio, câncer de cólon, e assim por diante, podem tornar-se alvos para o ataque.
(7) Receptores de célula T (TCR) [00095] A presente invenção fornece ainda ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos que formam as subunidades de receptores de célula T (TCRs) que reconhecem CDCA1-1 e CDCA1-4, e métodos para seu uso. TCR contém pelo menos sete proteínas de trans
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43/57 membrana. Um heterodímero ligado à ligação de dissulfeto (α, β) forma a unidade de reconhecimento de antígeno clonotípica, enquanto as cadeias CD3 invariantes que consistem em cadeias ε, γ, δ e ζ, e η unem a ligação do ligando com a via de sinalização, deste modo causando ativação de célula T e resposta imune celular. As subunidades α e β, que são responsáveis pelo reconhecimento de antígeno como mencionado acima, são necessárias para que células T adquiram a especificidade de reconhecimento para um alvo particular. Portanto, para sintetizar TCRs que especificamente reconhecem os peptídeos da presente invenção, as sequências de ácido nucleico de α e β que são subunidades de TCR derivadas de CTLs induzidos usando os peptídeos da presente invenção podem ser identificadas por métodos conhecidos àquelas versados na técnica (WO2007/032255; e Morgan et al., J. Immunol., 171, 3288 (2003)). Visto que TCRs formados a partir das subunidades de TCR identificadas podem ligar-se a células-alvo que apresentam peptídeo de CDCA1, os TCRs são úteis quando introduzidos em células tendo efeito de morte celular.
[00096] Ácidos nucleicos que codificam as subunidades de TCR podem ser incorporados em vetores adequados (por exemplo, vetores retrovirais). Os vetores podem ser produzidos por métodos conhecidos àqueles versados na técnica. Os vetores incorporados em subunidade de TCR podem ser usados para a introdução em células T. Em particular, transformando-se células T derivadas de paciente, células T (CTLs) que especificamente reconhecem e atacam células que expressam CDCA1 podem ser obtidas. CTLs introduzidas em TCR assim obtidas podem ser cultivadas e desenvolvidas por métodos comuns (Kawakami et al., J. Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). CTLs obtidos pelo método mencionado acima podem ser usados para imunoterapia celular.
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44/57 [00097] A presente invenção também fornece células apresentadoras de antígeno apresentando um complexo formado com um antígeno de HLA e um ou mais dos peptídeos da presente invenção. As células apresentadoras de antígeno, com as quais um ou mais dos peptídeos da presente invenção ou nucleotídeos que codificam tais peptídeos são contatados, são preferivelmente coletadas de um paciente que recebe o tratamento e/ou prevenção. Os peptídeos da presente invenção, células apresentadoras de antígeno apresentando os peptídeos, exossomos, ou células T killers ativadas podem ser administrados como uma vacina em combinação com outros fármacos.
[00098] Todas as referências da técnica anterior citadas no presente relatório descritivo são incorporadas aqui por referência.
[00099] A presente invenção será descrita ainda com referência aos exemplos abaixo; entretanto, ela não deve ser interpretada como sendo limitada a isto.
Exemplos
Exemplo 1 (1) Seleção de um repertório de peptídeo de CDCA1 que mostra afinidade a HLA-A2 [000100] A sequência de aminoácido de CDCA1 humano foi examinada usando o sistema BIMAS, e 41 tipos de peptídeos foram selecionados na ordem descendente da afinidade de ligação estimada a HLA-A2 (tabela 1).
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Tabela 1-1
| No. | Posição do Peotídeo | Sequência de Aminoácido | Fator de Afinidade à Ligação | Número ID das Sequências |
| 1 | 65-73 | YMMPVNSEV | 855 | SEQ IP NO: 1 |
| 2 | 120-128 | FLSGIINFI | 607 | SEQ ID NO: 3 |
| 3 | 222-230 | RLNELKLLV | 285 | SEQ ID NO: 4 |
| 4 | 351-359 | KLATAQFKI | 211 | SEQ IP NO: 2 |
| 5 | 182-190 | QLSDGIQEL | 201 | SEQ ID NO: 5 |
| 6 | 141-149 | FLWQYKSSA | 190 | SEQ ID NO: 6 |
| 7 | 3-11 | TLSFPRYNV | 69.6 | SEQ ID NO: 7 |
| 8 | 285-293 | CLPSCQLEV | 69.6 | SEQ ID NO: 8 |
| 9 | 386-394 | AVYERVTTI | 27.5 | SEQ ID NO: 9 |
| 10 | 372-380 | TVIEDCNKV | 25.0 | SEQ ID NO: 10 |
| 11 | 243-251 | KIVDSPEKL | 20.7 | SEQ ID NO: 11 |
| 12 | 257-265 | KMKDTVQKL | 17.8 | SEQ ID NO: 12 |
| 13 | 88-96 | LVTHLDSFL | 17.5 | SEQ ID NO: 13 |
| 14 | 447-455 | KIDEKTAEL | 16.9 | SEQ ID NO: 14 |
| 15 | 358-366 | KINKKHEDV | 16.4 | SEQ ID NO: 15 |
| 16 | 416-424 | KLKSQEIFL | 14.4 | SEQ ID NO: 16 |
| 17 | 82-90 | FLPFSNLVT | 14.1 | SEQ ID NO: 17 |
| 18 | 344-352 | LMIVKKEKL | 12.9 | SEQ ID NO: 18 |
| 19 | 109-117 | ILCPKAKRT | 12.9 | SEQ ID NO: 19 |
| 20 | 44-52 | VLHMIYMRA | 12.7 | SEQ ID NO: 20 |
| 21 | 228-236 | LLVVSLKEI | 40.8 | SEQ ID NO: 21 |
| 22 | 227-236 | KLLVVSLKEI | 311 | SEQ ID NO: 22 |
| 23 | 222-231 | RLNELKLLVV | 269 | SEQ ID NO: 23 |
| 24 | 294-303 | QLYQKKIQDL | 157 | SEQ ID NO: 24 |
| 25 | 87-96 | NLVTHLDSFL | 117 | SEQ ID NO: 25 |
| 26 | 181-190 | KQLSDGIQEL | 64.5 | SEQ ID NO: 26 |
| 27 | 47-56 | MIYMRALQIV | 49.1 | SEQ ID NO: 27 |
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46/57
Tabela 1-2
| 28 | 402-411 | KLGIQQLKDA | 40.0 | SEQ ID NO: 28 |
| 29 | 343-352 | RLMIVKKEKL | 38.7 | SEQ ID NO: 29 |
| 30 | 309-318 | KLASILKESL | 36.6 | SEQ ID NO: 30 |
| 31 | 22-31 | ILTGADGKNL | 36.3 | SEQ ID NO: 31 |
| 32 | 193-202 | SLNQDFHQKT | 28.3 | SEQ ID NO: 32 |
| 33 | 52-61 | ALQIVYGIRL | 21.4 | SEQ ID NO: 33 |
| 34 | 44-53 | VLHMIYMRAL | 16.7 | SEQ ID NO: 34 |
| 35 | 35-44 | DLYPNPKPEV | 16.7 | SEQ ID NO: 35 |
| 36 | 165-174 | KLERLDSVPV | 15.6 | SEQ ID NO: 36 |
| 37 | 65-74 | YMMPVNSEVM | 12.3 | SEQ ID NO: 37 |
| 38 | 154-163 | QLNAAHQEAL | 10.5 | SEQ ID NO: 38 |
| 39 | 60-69 | RLEHFYMMPV | 10.2 | SEQ ID NO: 39 |
| 40 | 344-353 | LMIVKKEKLA | 6.1 | SEQ ID NO: 40 |
| 41 | 453-462 | AELKRKMFKM | 4.8 | SEQ ID NO: 41 |
[000101] Os epítopos de célula T killer restritos de HLA-A2 identificados na presente invenção são sublinhados.
Exemplo 2 [000102] Primeiro, as células dendríticas (DCs) foram induzidas de células da medula óssea de camundongos transgênicos de HLA-A2 usando um método previamente relatado (Komori H et al. Clinical Câncer Research 12: 2689-2697, 2006). BM-DCs assim obtidas foram pulsadas com um peptídeo de CDCA1 (10 μΜ), e depois administradas intraperitonealmente a camundongos transgênicos de HLA-A2 em 5 x 105 células por camundongo. Os camundongos foram imunizados duas vezes em intervalo de uma semana pelo mesmo método de administração, depois suas células do baço foram coletadas e usadas para a detecção de células T killers. De modo a examinar rigorosamente a indução de células T killers derivadas de células T CD8+, células T CD4+ foram eliminadas das células do baço usando pérolas de MACS depois
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47/57 da remoção do baço, e as células remanescentes foram usadas. [000103] A figura 1A mostra o protocolo para determinar os peptídeos de CDCA1 reconhecidos por células T killers restritas de HLA-A2 em camundongos transgênicos de HLA-A2. O dia quando células do baço foram coletadas dos camundongos imunizados é designado como Dia 0. [000104] Dia -21: (1) Indução de células dendríticas derivadas da medula óssea (aqui abaixo, referidas como BM-DCs) foi iniciada adicionando-se GM-CSF às células da medula óssea de camundongos transgênicos de HLA-A2.
[000105] Dia -14: (2) Uma mistura de quatro tipos de peptídeos de CDCA1 foi adicionada às BM-DCs induzidas, e depois de duas horas, esta foi administrada intraperitonealmente em 5 x 105 células por camundongo.
[000106] (1) e (2) foram repetidos duas vezes em intervalo de uma semana.
[000107] Dia 0: Células do baço foram coletadas dos camundongos transgênicos de HLA-A2 imunizados, e cocultivadas com BM-DCs que foram incubadas com peptídeos de CDCA1 durante dois horas. Isto foi subsequentemente cultivado durante seis dias.
[000108] Dia 6: Para detectar células T killers que especificamente reconhecem peptídeos de CDCA1, células T que produzem interferon gama depois da estimulação antigênica foram quantificadas por ensaio ELISPOT. Como células-alvo, BM-DCs pulsadas com cada peptídeo de CDCA1 individual e BM-DCs não-pulsadas foram usadas.
Avaliação da atividade de células T killers específicas de CDCA1 por ensaio ELISPOT:
[000109] Foi determinado pelo ensaio ELISPOT se células T killers que especificamente reagem com CDCA1 para produzir IFN-γ realmente existem entre as células T killers induzidas. IFN-γ foi detectado usando um Conjunto ELISPOT de IFN-γ de Camundongo (BD Biosci
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48/57 ences). Quando células T killers (efetoras) respondem a células estimuladoras (alvos) e produzem IFN-γ, elas são detectadas como manchas vermelhas. Como células-alvo, células T2A2 HLA-A2 positivas que não expressam CDCA1 e células T2A2 pulsadas com peptídeo de CDCA1 foram usadas. Células T2A2, uma linhagem celular produzida introduzindo-se o gene de HLA-A2 na linhagem de célula T2 de camundongo deficiente na expressão do gene de TAP, foram adquiridas do RIKEN Cell Bank. Devido à deficiência de TAP nestas células, complexos formados entre moléculas de HLA-A2 e peptídeos exogenamente adicionados são expressados na superfície celular apenas quando os peptídeos têm a capacidade de ligar às moléculas de HLA-A2. Primeiro, placas ELISPOT (BD Biosciences) foram revestidas com um anticorpo de IFN-γ anticamundongo durante 18 horas. Subsequentemente, as placas foram bloqueadas com 10 % de FCS/RPMI durante duas horas. Células efetoras (100 pL/poço) e células-alvo (100 pL/poço) foram misturadas e cultivadas durante 22 horas a 37°C. O experimento foi conduzido em uma razão efetora/alvo (razão E/T) de 5:1. As placas depois foram lavadas com água esterilizada, e reagidas com um anticorpo de IFN-γ anticamundongo biotinilado durante duas horas, e reagidas ainda com estreptavidina-HRP durante uma hora. Manchas positivas de IFN-γ foram detectados usando uma solução de substrato. Um software de análise automática da MINERVA TECH foi usado para contar as manchas. Os resultados para os Números de Peptídeo 1 a 20 são mostrados na figura 1B. A partir de experimentos similares, a resposta imune de célula T killer específica de CDCA1 foi observada em células T killers induzidas com o peptídeo de CDCA165-73 (N° 1) (SEQ ID NO: 1) ou CDCA1 351-359 (N° 4) (SEQ ID NO: 2) entre os 41 peptídeos (figura 2).
[000110] Os resultados da análise de células T killers induzida com o peptídeo de CDCAW73 (N° 1) (SEQ ID NO: 1) ou CDCA1351-359 (N° 4)
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49/57 (SEQ ID NO: 2) são mostrados nas figuras 2A e 2B, respectivamente. Exemplo 3
Pacientes, amostras de sangue, e linhagens celulares:
[000111] Amostras de sangue derivadas de pacientes com NSCLC foram coletadas durante examinações diagnósticas de rotina com consentimento informado. A linhagem celular de câncer de cólon humano CDCA1 negativa COLO201 foi fornecida pelo Health Science Research Resources Bank. A expressão de HLA-A2 nestas amostras foi confirmada por citometria de fluxo usando o anticorpo monoclonal de HLA-A2 BB7.2 (One Lambda Inc., Canoga Park, CA).
Transferência de gene lentiviral:
[000112] A transferência de gene mediada por vetor lentiviral foi realizada usando o método descrito em Tahara-Hanaoka S, et al. Exp. Hematol. 2002; 30:11-17. Brevemente, 17 pg de vetores autoinativantes de CSII-CMV-RfA e CSIIEF-RfA que portam cDNA de CDCA1 (Miyoshi H, et al. J. Virol. 1998; 72:8150-8157) e 10 pg de pCMV-VSV-G-RSV-Rev e pHIVgp foram transfectados em 293 células T em uma placa de cultura de 10 cm usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). Depois de 60 horas, o meio de cultura foi coletado e as partículas virais foram peletizadas por ultracentrifugação (50.000 x g, duas horas). A pelota foi colocada em suspensão em 50 pL de solução de RPMI 1640, e 10 pL da suspensão viral foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em U contendo 5 x 104 células COLO201 por poço. A expressão do gene de CDCA1 transfectado foi confirmada por análise de Western blot.
Indução de CTLs humanas reativas de CDCA1:
[000113] Células DC derivadas de monócito foram usadas como células apresentadoras de antígeno para indução de CTLs em resposta a peptídeos apresentados com HLA. DCs foram obtidas por métodos in vitro previamente relatados (Suda T, et al. Câncer Sci. 2007; Nakahara
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S, et al. Câncer Res. 2003; 63:4112-8). Brevemente, monócitos do sangue periférico (PBMCs) isolados de voluntários saudáveis HLA-A*0201 positivos e pacientes com NSCLC usando uma solução de Ficoll-Paque (GE Healthcare UK, Ltd., Buckinghamshire, UK) foram triados quanto a populações CD8 positivas CD14 positivas usando MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha). Para obter DCs, a população CD14 positiva foi cultivada em AIM-V (Invitrogen) contendo 2 % de plasma autólogo na presença de 100 ng/mL de fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF) e 10 ng/mL de interleucina (IL)-4 (PeproTec Inc., New Jersey, EUA). Quatro dias depois da incubação, OK-432 foi adicionado à placa para preparar DCs maduras. Cinco dias depois do início da cultura para DCs induzidas por citocina, as células foram pulsadas com 20 pg/mL de um peptídeo de ligação de HLA-A2 durante duas horas a 37°C em AMI-V na presença de 4 pg/mL de p2-microglobulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Estas DCs pulsadas com peptídeo foram irradiadas (3.500 cGy) e misturadas em uma razão 1:50 com células T autólogas CD8 positivas obtidas de PBMCs usando MicroBeads anti-CD8 (Miltenyi Biotec). A incubação foi realizada usando placas de 48 poços, que foram preparadas para conter 0,5 mL de AIM-V contendo em cada poço 2 % de plasma autólogo, 1 x 104 DCs pulsadas com peptídeo, 5 x 105 células T CD8 positivas, e 10 ng/mL de IL-7 humana (Wako, Osaka, Japão). Três dias depois da incubação, IL-2 humana (PeproTec Inc.) foi adicionada em uma concentração de 20 IU/mL. Além disso, as células T foram reestimuladas com DCs autólogas pulsadas com peptídeo nos dias 12 e
19. DCs foram adequadamente preparadas pelo método mencionado acima. Seis dias depois da terceira estimulação com peptídeo no dia 25, a resposta de CTL específico de antígeno foi avaliada por ensaio de liberação de Cromo (Cr) e ensaio ELISPOT de IFN-γ.
Resposta de CTL a células-alvo:
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51/57 [000114] CTLs foram cocultivados em várias razões de célula efetora/célula-alvo com células-alvo que são várias linhagens de célula câncerosa e células T2 com ou sem pulsação com peptídeo, e ensaio de liberação de 51Cr e ensaio ELISPOT de IFN-γ foram conduzidos usando métodos convencionais (Komori H, et al., Clin. Câncer Res. 2006; 12:2689-2697; Makita M, et al. Clin. Câncer Res. 2002;
8:2626-31; Yokomine K, et al. Câncer Sci. 2007; 98:1930-5). Brevemente, as células-alvo foram rotuladas usando 3,7 KBq de Na2 51Cr4 (Perkin Elmer Life Sciences) a 37°C durante uma hora em uma incubadora de CO2. As células-alvo rotuladas foram enxaguadas três vezes, e células-alvo pulsadas com peptídeo foram preparadas incubando-se as células com 20 pg/mL de um peptídeo durante três horas a 37°C. As células-alvo foram misturadas com células efetoras a um volume final de 200 pL em uma placa microtituladora de fundo plano, e depois incubadas. Seis horas depois da incubação, 50 pL do sobrenadante foram coletados de cada poço, e a radioatividade foi quantificada usando um contador gama. A atividade citotóxica específica foi avaliada calculando-se a taxa de liberação de 51Cr específica de acordo com um método existente (Suda T, et al. Câncer Sci. 2007; 98:1803-8). O ensaio
ELISPOT também foi realizado de acordo com um método existente (Komori H, et al. Clin. Câncer Res. 2006; 12:2689-97).
Indução de CTLs responsivos em CDCA1 a partir de PBMCs derivadas de doadores saudáveis HLA-A2 positivos:
[000115] PBMCs foram isoladas de doadores saudáveis HLA-A2 (A*0201) positivos. As células T CD8+ foram cocultivadas com DCs derivadas de monócito pulsadas com o peptídeo de CDCAW73 (N° 1) (SEQ ID NO: 1) ou CDCAW359 (N° 4) (SEQ ID NO: 2), e as células T CD8+ foram estimuladas três vezes por semana (figura 3A).
[000116] CTLs induzidos de pacientes com câncer ou doadores saudáveis foram cocultivados com células-alvo. Células T2 pulsadas
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52/57 com o peptídeo CDCA165-73 (N° 1) (SEQ ID NO: 1) ou CDCA1351-359 (N° 4) (SEQ ID NO: 2) foram usadas como o alvo, e o ensaio ELISPOT e o ensaio de liberação de 51Cr foram realizados. Como mostrado na figura 3B, para o paciente doador com câncer 1, a produção de IFN-γ por CTLs foi significativamente maior quando as células foram estimuladas com T2 pulsada com peptídeo de CDCAW-73 (N° 1) (SEQ ID NO: 1) do que com T2 não-pulsada. CTLs induzidas de doador saudável 1 produziram uma grande quantidade de IFN-γ em resposta a células T2 pulsadas com peptídeo de CDCA1351-359 (N° 4) (SEQ ID NO: 2) (mais do que 300 manchas por poço) (figura 3C). Além disso, CTLs derivados de paciente doador com câncer 1 e doador saudável 1 mostraram atividade citotóxica contra células T2 pulsadas com o peptídeo de CDCA165-73 (N° 1) (SEQ ID NO: 1) ou CDCA1351-359 (N° 4) (SEQ ID NO: 2) em ensaio de liberação de 51Cr (figura 3D). Como mostrado na figura 3E, quando CTLs foram estimulados por células T2 pulsadas com o peptídeo de CDCA1 em várias concentrações, os CTLs responderam às células T2 pulsadas com peptídeo de CDCA1 em uma maneira dependente de dose. Comparado à resposta a células T2 não-pulsadas ou a células T2 pulsadas com um peptídeo derivado de HIV de ligação de HLA-A2, CTLs foram descobertos produzir uma quantidade maior de IFN-γ em resposta a células T2 pulsadas em uma concentração de peptídeo de 0,2 pg/mL ou mais. Os resultados mencionados acima mostram que estes CTLs têm citotoxicidade específica de peptídeo.
[000117] COLO201 em que CDCA1 foi introduzido (COLO201/CDCA1, CDCA1+, HLA-A2+; figura 4A) foi usada como células-alvo para examinar a resposta imune específica de CDCA1 de CTLs. Como mostrado na figura 4B, CTLs derivados de doador saudável estimulados com o peptídeo de CDCAW73 (N° 1) (SEQ ID NO: 1) produziram uma quantidade maior de IFN-γ contra COLO201/CDCA1 do que para desocupar COLO201 transfectada com vetor que não expressa
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CDCA1. CTLs derivados de doador saudável 2 estimulados com o peptídeo de CDCA1351-359 (N° 4) (SEQ ID NO: 2) também mostraram resposta imune específica para COLO201/CDCA1 (figura 4C). Além disso, estes CTLs mostraram resposta imune para células PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+), mas não para células A549 (CDCA1+, HLA-2-) (figura 4D).
[000118] Para aplicar peptídeos derivados de CDCA1 à imunoterapia para o câncer, seria mais importante para o peptídeo de CTLs responsivos a CDCA1 ser capazes de mostrar citotoxicidade específica contra células tumorosas que endogenamente expressam CDCA1. Como mostrado na figura 4E, para paciente doador com câncer 1, CTLs reativos de CDCA1 obtidos usando o peptídeo de CDCA165-73 (N° 1) (SEQ ID NO: 1) mostraram atividade citotóxica contra células PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+), mas não para células A549 (CDCA1+, HLA-2-) ou células COLO201 (CDCA1-, HLA-A2+). Similarmente, CTLs derivados de doador saudável 1 estimulados com o peptídeo de CDCA1351-359 (N° 4) (SEQ ID NO: 2) mostraram atividade citotóxica para células PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+), mas não para células A549 (CDCA1+, HLA-2-). Estes resultados mostram que estes peptídeos são naturalmente processados em células cancerosas e apresentados na superfície de células cancerosas juntamente com HLA-A2, e podem ser reconhecidos por CTLs.
[000119] Para a detecção de CTLs específicos de CDCA1 restritos de HLA-A2, o tetrâmero de HLA-A*0201 rotulado com PE ligado ao peptídeo de CDCA1351-359 foi adquirido da Medical & Biological Laboratories Co. Ltd. (Nagoya, Japão). Como mostrado na figura 4G, entre células CD8 positivas, uma correlação forte foi observada entre os CTLs reativos com peptídeo de CDCA1351-359 e os CTLs positivos em tetrâmero. Este resultado prova que CTLs específicos de peptídeo de CDCA1 restritos de HLA-A2 estavam presentes entre as células T CD8 positivas
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54/57 usadas neste estudo.
Debate:
[000120] Identificação de peptídeos derivados de TAA que são naturalmente processados e apresentados em células tumorosas é importante para o estabelecimento de imunoterapia para o câncer com base em peptídeo. CDCA1 que é um novo antígeno de câncer/testículo foi identificado por análise de microarranjo de cDNA usando NSCLC e tecidos normais. CDCA1 é fortemente expressado em NSCLC e testículo normal, mas seu mRNA ou proteína não foi expressado nos outros tecidos normais examinados. Visto que o testículo é um tecido isolado do sistema imune, CTLs responsivos de CDCA1 atacariam apenas NSCLC. Portanto, CDCA1 foi selecionado como um TAA para imunoterapia de pacientes com NSCLC.
[000121] Para minimizar o risco de supressão, mutação, ou expressão diminuída de TAA como meios para a evasão imune por células câncerosas como um resultado de terapia de indução imune, foi desejado identificar TAAs essenciais para a proliferação ou sobrevivência de NSCLC que podem ser usados como alvos para imunoterapia (Yoshitake Y, et al. Clin. Câncer Res. 2004; 10:6437-48). Foi relatado que funções de CDCA1 para agir sobre a ligação entre microtúbulos de fuso e cinetócoros, e tem um papel importante na manutenção do ciclo celular (DeLuca JG, et al. J. Cell Biol. 2002; 159:549-55). Além disso, CDCA1 é um componente do complexo do ciclo de divisão nuclear (NDC), que desempenha um papel importante na segregação cromossômica apropriada durante a mitose, e é altamente conservado não obstante da espécie (DeLuca JG, et al. Curr. Biol. 2003; 13:2103-9). CDCA1 é essencial para a localização por cinetócoro do centrômero da proteína E (CENP-E) em células HeLa. A supressão da expressão de CDCA1 por siRNA causa segregação cromossômica anormal por bloqueio da mitose e indução subsequente de morte celular (Liu D, et al. J.
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Biol. Chem. 2007; 282:21415-24). Esta saída aberrante da mitose tem as características tanto de apoptose quanto catástrofe (DeLuca JG, et al. J. Cell Biol. 2002; 159:549-55). Isto é, CDCA1 é essencial para a função celular e desempenha um papel importante na proliferação e sobrevivência de células câncerosas.
[000122] CDCA1 e cinetócoro associado 2 (KNTC2) são membros do complexo de proteína de centrômero evolucionariamente conservado (Hayama S, et al. Câncer Res 2006; 66:10339-48). O imunomanchamento mostra que sua expressão elevada é associada com um prognóstico deficiente de pacientes com NSCLC (Hayama S, et al. Câncer Res 2006; 66:10339-48). Portanto, o nível de expressão de CDCA1 em tecidos de NSCLC é um marcador útil para prognosticar a prognose de pacientes depois da operação cirúrgica. O envolvimento de CDCA1 na progressão de NSCLC é sugerido. Assim, a imunoterapia que direciona CDCA1 pode ser eficaz para pacientes com NSCLC com um prognóstico deficiente.
[000123] Na presente invenção, dois peptídeos epítopos de CDCA1 restritos de HLA-A2 que promoveram a produção de CTLs de camundongo restritos de HLA-A2 foram identificados usando camundongos transgênicos de HLA-A2. Além disso, CTLs humanos reativos de CDCA1 podem ser preparados a partir de PBMCs derivadas de doador saudável estimuladas com estes peptídeos. Estas linhagens de CTL específicas de peptídeo de CDCA1 mataram células câncerosas que expressam CDCA1 em uma maneira restrita de HLA-A2 (figura 4).
[000124] Peptídeos derivados de CDCA1 prognosticados a terem alta afinidade de ligação à molécula de HLA-A0201 foram selecionados usando o software BIMAS; entretanto, algumas das sequências de aminoácido não são conservadas entre CDCA1 humano e de camundongo. Existem duas diferenças de aminoácido entre as sequências humanas e de camundongo do peptídeo de CDCA165-73 (N° 1) (humana:
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YMMPVNSEV/camundongo: YMMPMNIEV), e uma diferença de aminoácido no peptídeo de CDCA1351-359 (N° 4) (humana KLATAQFKI/camundongo KLATARFKI). Entretanto, na presente invenção, a indução dos CTLs reativos de peptídeo epítopo mencionados acima a partir de doadores saudáveis foi confirmada.
[000125] CTLs reativas de CDCA1 foram induzidas de PBMCs derivadas de doador saudável por estimulação in vitro usando os peptídeos de CDCA1. CTLs induzidos por DCs que apresentam peptídeo mostraram atividade citotóxica contra células câncerosas que expressam CDCA em uma maneira restrita de HLA-A2. A indução de CTLs específicos de CDCA1 derivados de doador saudável é significativa para a continuação de outra pesquisa para TAAs. Além disso, a indução de CTLs reativas de CDCA1 de PBMCs isoladas de pacientes com NSCLC, câncer de célula pequena, carcinoma colangiocelular, câncer de bexiga, e câncer de célula renal está correntemente sendo experimentada. Existem vários métodos de imunoterapia para o câncer mediados por células incluindo vacinação com peptídeo ou proteína (Rosenberg SA, et al. Nat Med 1998; 4:321-7), imunização com células dendríticas pulsadas com peptídeos, proteínas, ou lisatos de tumor (Kugler A, et al. Nat Med 2000; 6:332-6), e transferência adotiva ex vivo usando linhagens de CTL específicas do tumor (Falkenburg JH, et al. Blood 1999; 94:1201-8). Os peptídeos de CDCA1 identificados na presente invenção podem ser aplicados a estas imunoterapias.
[000126] Se a segurança e efetividade da imunoterapia para o câncer usando peptídeos identificados na presente invenção, que são apresentados a células T killers por intermédio de HLA-A2, podem ser mostradas na medicina investigativa, a aplicação clínica a Caucasianos seria possível. Além disso, identificando-se peptídeos apresentados a células T killers por intermédio de HLA-A2 que é frequentemente possuído não apenas pelos Japoneses mas também por Caucasianos,
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57/57 seria altamente possível desenvolver agentes de imunoterapia para o câncer que são aplicáveis a 30% dos pacientes Japoneses e Caucasianos com câncer pulmonar.
Aplicabilidade Industrial [000127] HLA-A2 é um alelo de HLA classe I possuído por aproximadamente 30% da população Japonesa. Os peptídeos de CDCA1 de acordo com a presente invenção podem induzir células T citotóxicas humanas que danificam células câncerosas expressando complexos dos peptídeos e moléculas de HLA-A2. Portanto, os peptídeos de acordo com a presente invenção podem ser aplicados a imunoterapias de câncer pulmonar, carcinoma colangiocelular, câncer de bexiga, carcinoma de célula renal, câncer de próstata, leucemia mieloide crônica, linfoma maligno, câncer cervical, osteosarcoma, câncer de mama, sarcoma de tecido macio, e câncer de cólon, em pacientes HLA-A2 positivos. Assim, os peptídeos são úteis para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para suprimir a proliferação e progressão destes cânceres.
Claims (16)
- REIVINDICAÇÕES1. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, em que o segundo aminoácido do término N é substituído com metionina.
- 2. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, em que o aminoácido de terminal C é substituído com valina ou leucina.
- 3. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aminoácido de terminal C é substituído com valina ou leucina.
- 4. Composição imunogênica para induzir imunidade contra o câncer, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais peptídeos dos seguintes (a) ou (b):(a) peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2; ou (b) peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 como um ingrediente ativo, em combinação com um adjuvante.
- 5. Composição imunogênica para tratar e/ou prevenir câncer, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais peptídeos dos seguintes (a) ou (b):(a) peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2; ou (b) peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 como um ingrediente ativo, em combinação com um adjuvante.
- 6. Composição imunogênica para induzir uma célula apresentadora de antígeno que mostra atividade de indução de célula T citotóxica (killer), caracterizado pelo fato de que a dita composição compreende um ou mais peptídeos dos seguintes (a) ou (b):Petição 870200001172, de 03/01/2020, pág. 69/772/3 (a) peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2; ou (b) peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, como um ingrediente ativo, em combinação com um adjuvante.
- 7. Composição imunogênica para induzir uma célula T citotóxica (killer), caracterizado pelo fato de que a dita composição compreende um ou mais peptídeos dos seguintes (a) ou (b):(a) peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2; ou (b) peptídeo como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 como um ingrediente ativo, em combinação com um adjuvante.
- 8. Método in vitro para induzir uma célula apresentadora de antígeno que mostra atividade de indução de célula T citotóxica (killer), caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contatar uma célula apresentadora de antígeno com o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou o peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.
- 9. Método in vitro para induzir uma célula T citotóxica (killer), caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contatar uma célula T com o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou o peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.
- 10. Uso do peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou o peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma composição imunogênica para induzir imunidade contra o câncer.
- 11. Uso do peptídeo como definido em qualquer uma dasPetição 870200001172, de 03/01/2020, pág. 70/773/3 reivindicações 1 a 3 ou o peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma composição imunogênica para tratar e/ou prevenir câncer.
- 12. Uso do peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou o peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma composição imunogênica para induzir uma célula apresentadora de antígeno que mostra atividade de indução de célula T citotóxica (killer).
- 13. Uso do peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou o peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma composição imunogênica para induzir uma célula T citotóxica (killer).
- 14. Método in vitro para induzir uma célula T citotóxica (killer), caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de co-cultivar uma célula apresentadora de antígeno contatada com o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou o peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, e uma célula CD8+T.
- 15. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula apresentadora de antígeno que apresenta um complexo compreendendo o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou o peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 e um antígeno HLA, com um adjuvante.
- 16. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula T citotóxica (killer), que é induzida usando o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou o peptídeo consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 com um adjuvante.
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| Date | Code | Title | Description |
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| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B07E | Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] |
Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI |
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| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 07/04/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
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| B16C | Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 13/06/2008 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF |
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| B16C | Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE A RPI 2629 DE 25/05/2021, QUANTO AO ITEM (54) TITULO. |