ES2537323T3 - Péptido CDCA1 y agente farmacéutico que lo comprende - Google Patents
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Abstract
Un péptido aislado de menos de 15 aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en: (A) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; (B) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, en la que uno o dos aminoácidos están sustituidos, suprimidos, insertados, y/o añadidos, y en el que el péptido muestra actividad inductora de linfocitos T citotóxicos (asesinos); y (C) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2.
Description
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Los péptidos de la presente invención son epítopos restringidos a HLA-A2, que es un alelo de HLA encontrado frecuentemente en las poblaciones japonesa y caucásica. Específicamente, usando como índice la afinidad de unión a HLA-A2, se seleccionaron péptidos candidatos que se unen a HLA-A2 derivados de CDCA1. Para los péptidos seleccionados, se evaluó si se indujeron o no linfocitos T asesinos en el cuerpo de ratones transgénicos para HLA-A2 mediante células dendríticas derivadas de células de médula ósea de ratón transgénico para HLA-A2 (BM-DCs) pulsadas con los péptidos seleccionados. Se indujeron in vivo linfocitos T citotóxicos (asesinos) en ratones transgénicos para HLA-A2 mediante CDCA1-1 (YMMPVNSEV (SEC ID NO: 1)) y CDCA1-4 (KLATAQFKI (SEC ID NO: 2)). Los linfocitos T asesinos inducidos por estos péptidos mostraron reacción de respuesta inmunitaria a células T2A2 pulsadas con estos péptidos. Sin embargo, estos linfocitos T asesinos no mostraron reacción de respuesta inmunitaria a células T2A2 no pulsadas con el péptido. Además, los CTLs derivados de pacientes con cáncer y derivados de donantes sanos que se indujeron usando CDCA1-1 y CDCA1-4 mostraron actividad citolítica frente a estirpes celulares que expresan CDCA1.
Estos resultados demuestran que los péptidos derivados de CDCA1 son útiles como péptidos que inducen inmunorreacción frente a células que presentan CDCA1, y que los péptidos derivados de CDCA1 son péptidos epitópicos restringidos a HLA-A2. Se ha mostrado que CDCA1 está muy expresado en tejidos cancerosos en la mayoría de los casos de cáncer de pulmón, carcinoma colangiocelular, cáncer de vejiga, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, leucemia mielogenosa crónica, linfoma maligno, cáncer de cuello uterino, osteosarcoma, cáncer de mama, sarcoma de tejidos blandos, y cáncer de colon. A partir de estos hechos, se considera que CDCA1 es útil como una diana inmunoterapéutica para diversos cánceres.
(1) Péptidos de la presente invención y agentes para inducir inmunidad frente a cáncer que contienen los péptidos
El péptido de la presente invención es uno cualquiera de (A) a (D) a continuación.
- (A)
- un péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2.
- (B)
- Un péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, en el que uno o dos aminoácidos están sustituidos, suprimidos, insertados y/o añadidos, y en el que el péptido muestra actividad inductora de linfocitos T citotóxicos (asesinos).
- (C)
- El péptido de (B), en el que el segundo aminoácido del término N es leucina o metionina.
- (D)
- El péptido de (B), en el que el aminoácido C-terminal es valina o leucina.
Aquí, “un péptido que muestra una actividad inductora de linfocitos T asesinos” significa “un péptido que tiene actividad inductora de linfocitos T que estimula linfocitos T asesinos (linfocitos T citotóxicos/CTLs)”.
El péptido de la presente invención es un péptido epitópico que tiene menos de alrededor de 15 aminoácidos, y que incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, y que muestra una actividad inductora de linfocitos T asesinos. Además, los péptidos de la presente invención (péptidos epitópicos) pueden incluir un péptido que incluya la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, en el que uno o dos aminoácidos están sustituidos, suprimidos, insertados, y/o añadidos, en tanto que se retenga la capacidad para inducir linfocitos T asesinos. El número de restos sustituidos, suprimidos, insertados, y/o añadidos es un aminoácido o dos aminoácidos.
Se sabe que péptidos variantes (es decir, péptidos que incluyen secuencias de aminoácidos obtenidas modificando las secuencias de aminoácidos originales mediante sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno, dos, o varios restos de aminoácidos) retienen la actividad biológica original (Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6; Zoller MJ y Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500; Dalbadie-McFarland G et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13). La modificación de aminoácidos retiene preferiblemente las propiedades de las cadenas laterales de aminoácidos originales. Los ejemplos de las propiedades de cadenas laterales de aminoácidos incluyen: aminoácido hidrófobo (A, I, L, M, F, P, W, Y, V); aminoácido hidrófilo (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T); y cadenas laterales que tienen los siguientes grupos funcionales o propiedades en común: cadenas laterales alifáticas (G, A, V, L, I, P); cadenas laterales que contienen grupos hidroxi (S, T, Y); cadenas laterales que contienen átomos de azufre (C, M); cadenas laterales que contienen ácido carboxílico y amida (D, N, E, Q); cadenas laterales que contienen bases (R, K, H); y cadenas laterales que contienen anillos aromáticos (H, F, Y, W). Los caracteres en los paréntesis muestran códigos de aminoácidos un caracter.
En una realización preferida, los péptidos de la presente invención (péptidos inmunógenos) son nonapéptidos (9mero) o decapéptidos (10-mero).
A fin de obtener péptidos con afinidad de unión elevada y actividad inductora de linfocitos T asesinos, la secuencia de aminoácidos de un péptido parcial de CDCA1 de origen natural se puede modificar mediante sustitución, supresión, inserción, y/o adición de uno, dos, o varios aminoácidos. Aquí, el término “varios” se refiere a cinco o menos, preferiblemente tres o menos, más preferiblemente dos o menos. Además, puesto que la regularidad de las secuencias peptídicas que tienen afinidad elevada por antígenos HLA es conocida (Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24; Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228; Kondo A, et al. (1995) J. Immunol. 155:4307-12), los péptidos de la presente invención (péptidos epitópicos) se pueden modificar en base a la
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bacterianas, de levadura, de animales, y células de insectos, y el vector de expresión se puede introducir en el hospedante usando técnicas conocidas dependiendo del hospedante.
En la presente invención, los péptidos recombinantes se pueden aislar cultivando un transformante preparado como se describe anteriormente, produciendo y acumulando los péptidos en el cultivo, y recogiendo los péptidos de la presente invención a partir del cultivo.
Cuando el transformante es una procariota tal como E. coli o una eucariota tal como levadura, el medio de cultivo para estos microorganismos puede ser medio natural o sintético, en tanto que contenga fuente de carbono, fuente de nitrógeno, minerales, y de forma que se pueda utilizar por los microorganismos, y permita el cultivo eficaz del transformante. Las condiciones de cultivo pueden ser las usadas convencionalmente para cultivar los microorganismos. Después del cultivo, los péptidos de la presente invención se pueden aislar y purificar a partir del cultivo del transformante usando métodos convencionales para el aislamiento y purificación de péptidos.
Los péptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos en la que uno o dos aminoácidos están sustituidos, suprimidos, insertados o añadidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 se pueden producir u obtener apropiadamente por una persona experta en la técnica basándose en la información sobre la secuencia nucleotídica de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2. Específicamente, un gen que codifica un péptido que incluye una secuencia de aminoácidos en la que uno o dos aminoácidos están sustituidos, suprimidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, y que muestra actividad inductora de linfocitos T asesinos, se puede producir mediante cualesquiera métodos conocidos por las personas expertas en la técnica, tales como síntesis química, técnicas de manipulación genéticamente mediante ingeniería, y mutagénesis. Por ejemplo, el método de mutagénesis dirigida al sitio, que es una de las técnicas de ingeniería genética, es útil puesto que puede introducir una mutación específica en una posición específica. Se puede llevar a cabo según los métodos descritos en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (en lo sucesivo denominado Molecular Cloning, 2ª Ed.) y Current Protocols in Molecular Biology, Suplemento 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) (en lo sucesivo denominado Current Protocols in Molecular Biology), etc.
Los péptidos de la presente invención descritos anteriormente pueden inducir inmunidad frente a cáncer, como se muestra más abajo en los Ejemplos. Por lo tanto, la presente invención proporciona agentes para inducir inmunidad frente a cáncer, que incluyen los péptidos de la presente invención.
Los agentes de la presente invención inductores de inmunidad se pueden preparar como una formulación mixta combinada con dos o más péptidos epitópicos. Los agentes inductores de inmunidad formulados combinando múltiples tipos de péptidos pueden ser un cóctel, o se pueden unir mutuamente usando técnicas estándar. Los péptidos epitópicos a combinar pueden ser péptidos que tienen diferentes secuencias de aminoácidos derivadas del mismo gen, o pueden ser péptidos que tienen secuencias de aminoácidos derivadas de genes diferentes. Cuando se administran los péptidos de la presente invención, los péptidos administrados se presentan en antígenos HLA de células presentadoras de antígeno a una densidad elevada, y subsiguientemente se inducen linfocitos T asesinos que reaccionan específicamente frente a los complejos formados con los péptidos administrados y los antígenos HLA. Como alternativa, poniendo en contacto células dendríticas recogidas de un sujeto con los péptidos de la presente invención (es decir, pulsando células dendríticas recogidas de un sujeto con los péptidos de la presente invención), se pueden obtener células presentadoras de antígeno que presentan los péptidos de la presente invención sobre su superficie celular. Administrando estas células presentadoras de antígeno nuevamente al sujeto, se pueden inducir en el cuerpo del sujeto linfocitos T asesinos, y como resultado, se puede potenciar la respuesta inmunitaria a células diana que presentan los péptidos de la presente invención.
Cuando se usan in vitro o in vivo, preferiblemente in vitro, los agentes para inducir inmunidad frente al cáncer de la presente invención pueden inducir linfocitos T cooperadores, linfocitos T asesinos, o poblaciones inmunocíticas que incluyen estas células, proporcionando de ese modo inmunidad frente al cáncer.
(2) Agentes para el tratamiento y/o prevención de cáncer de la presente invención (vacunas contra el cáncer)
Se mostró en los Ejemplos que los péptidos de la presente invención pueden inducir in vivo linfocitos T asesinos específicos de las células cancerosas. Por otro lado, se mostró en la invención previa que CDCA1 estaba altamente expresado en la mayoría de los casos de cáncer de pulmón, carcinoma colangiocelular, cáncer de vejiga, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, leucemia mielogenosa crónica, linfoma maligno, cáncer de cuello uterino, osteosarcoma, cáncer de mama, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de colon, y demás. En consecuencia, se espera que los agentes inductores de inmunidad, que incluyen uno o más de los péptidos de la presente invención como ingrediente activo, sean eficaces como agentes para el tratamiento y/o prevención de cáncer. Esto es, se puede esperar inducción y activación de linfocitos T asesinos que atacan el tumor al inyectar en el cuerpo los péptidos de la presente invención junto con un adyuvante adecuado, o pulsando células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas, con los péptidos, e inyectándolas entonces en el cuerpo. De este modo, como resultado, se pueden esperar efectos contra el cáncer. Además, se puede incorporar en un vector adecuado un gen que codifica un péptido de la presente invención. Las células presentadoras de antígeno humanas (células dendríticas, etc.) y las bacterias tales como BCG Mycobacterium tuberculosis que se transforman con el ADN
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recombinante, o los virus tales como los virus de la vacuna que tienen un ADN que codifica el péptido de la presente invención incorporado en su genoma, se pueden usar de forma eficaz como vacunas vivas para el tratamiento y/o prevención de cáncer humano. Las dosis y los métodos de administración para las vacunas contra el cáncer son las mismas que aquellas para las vacunas contra la viruela y vacunas de BCG convencionales.
En la presente invención, el término “vacuna” (también denominado “composición inmunógena”) se refiere a una sustancia que induce inmunidad antitumoral o suprime diversos cánceres cuando se inocula a un animal. Según la presente invención, se sugirió que el péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 es un péptido epitópico restringido a HLA-A2 que puede inducir una respuesta inmunitaria fuerte y específica frente a células presentadoras de CDCA1. En consecuencia, la presente invención también incluye métodos para inducir inmunidad antitumoral usando los péptidos que incluyen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, o sus variantes que incluyen sustitución, supresión, o adición de uno, dos o varios aminoácidos. En general, la inmunidad antitumoral incluye las siguientes respuestas inmunitarias:
- (1)
- inducción de linfocitos T asesinos frente a tumores que contienen células que expresan CDCA1,
- (2)
- inducción de anticuerpos que reconocen tumores que contienen células que expresan CDCA1, y
- (3)
- inducción de la producción de citocinas antitumorales.
Cuando un péptido particular induce una cualquiera de estas respuestas inmunitarias a través de la inoculación a un animal, se determina que el péptido tiene efecto inductor de inmunidad antitumoral. La inducción de la inmunidad antitumoral por el péptido se puede detectar observando in vivo o in vitro la respuesta del sistema inmunitario en un hospedante frente al péptido.
Por ejemplo, los métodos para detectar la inducción de linfocitos T asesinos son bien conocidos. Una sustancia extraña que invada un organismo vivo es presentada a linfocitos T y linfocitos B mediante la acción de células presentadoras de antígeno (APCs). Los linfocitos T que responden a antígenos presentados por células presentadoras de antígeno de una manera específica del antígeno se diferencian en linfocitos T asesinos (también denominados linfocitos T citotóxicos o CTLs) a través de la estimulación por los antígenos, y después proliferan. Aquí, este proceso se denomina “activación” de linfocitos T. La inducción de linfocitos T asesinos por un péptido específico se puede evaluar presentando el péptido a linfocitos T usando células presentadoras de antígeno pulsadas con el péptido, y detectando entonces la inducción de linfocitos T asesinos. Además, las células presentadoras de antígeno tienen un efecto sobre la activación de linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, macrófagos, eosinófilos, y células NK. Puesto que los linfocitos T CD4+ también son importantes en la inmunidad antitumoral, la acción del péptido inductora de la inmunidad antitumoral se puede evaluar usando como índice el efecto sobre la activación de estas células.
Un método para evaluar el efecto de la inducción de linfocitos T asesinos que son inducidos usando células dendríticas (DCs) como células presentadoras de antígeno es bien conocido en la técnica. Entre las células presentadoras de antígeno, las DCs tienen el efecto inductor de linfocitos T asesinos más potente. En este método, en primer lugar, un péptido de ensayo se pone en contacto con DCs, y entonces las DCs se ponen en contacto con linfocitos T. Los linfocitos T que tienen efecto citotóxico sobre células diana se detectan a partir de los linfocitos T puestos en contacto con DCs. Si los linfocitos T muestran actividad citotóxica frente a las células diana, significa que el péptido de ensayo tiene la actividad para inducir linfocitos T citotóxicos. La actividad de linfocitos T asesinos frente a células diana, tales como tumores, se puede detectar, por ejemplo, usando como índice la lisis de células tumorales marcadas con 51Cr. Como alternativa, el grado de daño celular tumoral se puede evaluar usando como índice la actividad de captación de 3H-timidina o la liberación de LDH (lactosa deshidrogenasa).
Los péptidos de ensayo que mediante estos métodos se confirma que tienen actividad inductora de linfocitos T asesinos son péptidos que tienen efecto activador de DCs y la subsiguiente actividad inductora de linfocitos T asesinos. Por lo tanto, los péptidos que inducen linfocitos T asesinos frente a células tumorales son útiles como vacunas frente a cánceres que presentan CDCA1. Además, las células presentadoras de antígeno que tienen adquirida la capacidad para inducir linfocitos T asesinos frente a cánceres a través del contacto con los péptidos son útiles como vacunas frente a cánceres. Además, los linfocitos T asesinos que tienen citotoxicidad adquirida como resultado de la presentación de los péptidos por células presentadoras de antígeno también se pueden usar como vacunas frente a cánceres que presentan CDCA1. Los métodos de tratamiento del cáncer usando inmunidad antitumoral por células presentadoras de antígeno y linfocitos T asesinos se denominan citoinmunoterapia.
En general, cuando se usan péptidos para citoinmunoterapia, la eficiencia de la inducción de linfocitos T asesinos se puede potenciar combinando múltiples péptidos que tienen diferentes estructuras. Por lo tanto, cuando se estimulan DCs con fragmentos proteicos, es ventajoso usar una mezcla de múltiples tipos de fragmentos peptídicos.
La inducción de la inmunidad antitumoral por péptidos se puede evaluar también observando la inducción de la producción de anticuerpos frente a los tumores. Por ejemplo, cuando se inducen anticuerpos frente a péptidos inmunizando animales de laboratorio con los péptidos, y suprimen el crecimiento, proliferación, y/o metástasis de células tumorales, se determina que los péptidos inducen inmunidad antitumoral.
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entonces se pueden enlazar a un péptido inmunógeno de la presente invención. Los péptidos lipidados se pueden administrar directamente incorporándolos en una micela o partícula, o encapsulándolos en un liposoma, o emulsionándolos en un adyuvante. Otro ejemplo de cebado lipídico es el cebado con una lipoproteína de E. coli, tal como tripalmitoil-S-gliceril-cisteinilseril-serina (P3CSS) cuando se une covalentemente a un péptido adecuado (Deres K., et al., (1989) Nature 342:561-4).
Los péptidos inmunógenos de la presente invención se pueden expresar mediante vectores víricos o vectores bacterianos. Los ejemplos de vectores de expresión apropiados incluyen hospedantes víricos avirulentos, tales como la vacuna y la viruela aviar. Por ejemplo, un virus de la vacuna se puede usar como un vector para expresar una secuencia nucleotídica que codifica el péptido. Introduciendo el virus de la vacuna recombinante en células hospedantes, se expresan los péptidos inmunógenos, provocando la respuesta inmunitaria. El método de inmunización usando vectores vacunales se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 4.722.848. También se puede usar el bacilo Calmette-Guerin (BCG). Los vectores del BCG se describen en Stover CK, et al., (1991) Nature 31:456-60. En la técnica se conoce una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o la inmunización, incluyendo vectores adenovíricos y vectores de virus adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores del bacilo tifoide (Salmonella typhi), y vectores de la toxina del carbunco destoxificado. Véanse, por ejemplo, Shata MT, et al., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ y Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; y Hipp JD, et al., (2000) In Vivo 14:571-85.
Los linfocitos T asesinos pueden ser inducidos eficazmente en el cuerpo de un paciente añadiendo in vitro un péptido antigénico a células recogidas del paciente o células procedentes de otro individuo que comparte algunos de los alelos de HLA (células alogeneicas), y que presentan el antígeno, y administrando entonces intravascularmente las células al paciente, localmente al tumor, etc. Como alternativa, tras la inducción in vitro de linfocitos T asesinos añadiendo el péptido a linfocitos de sangre periférica del paciente y cultivándolos in vitro, las células se pueden administrar intravascularmente al paciente, localmente al tumor, etc. Tal tratamiento de transferencia celular ya se ha llevado a cabo como terapia contra el cáncer, y es un método bien conocido entre aquellos expertos en la técnica.
El tipo de cánceres en la presente invención no está particularmente limitado, y los ejemplos específicos incluyen cáncer de pulmón, carcinoma colangiocelular, cáncer de vejiga, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, leucemia mielogenosa crónica, linfoma maligno, cáncer de cuello uterino, osteosarcoma, cáncer de mama, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de colon, etc. Los ejemplos de cánceres para los cuales es adecuada la aplicación de la presente invención incluyen cáncer de pulmón.
(3) Anticuerpos de la presente invención
La presente invención también se refiere a anticuerpos que reconocen una porción de o todo el péptido de la presente invención mencionado anteriormente como un epítopo (antígeno), y se refiere a linfocitos T asesinos que son inducidos mediante estimulación in vitro usando las proteínas o péptidos. En general, los linfocitos T asesinos demuestran actividad antitumoral más potente que los anticuerpos.
Además, de forma similar a los péptidos de la presente invención, los anticuerpos de la presente invención son útiles como agentes profilácticos y/o terapéuticos frente a cánceres que expresan CDCA1, en tanto que puedan inhibir la actividad del antígeno canceroso CDCA1. En un uso práctico, los péptidos o anticuerpos de la presente invención se pueden administrar como tales, o mediante inyección con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable, junto con un adyuvante según sea necesario. Como alternativa, se pueden administrar mediante absorción transdérmica a través de membranas mucosas por el método de pulverización, etc. Más específicamente, aquí, la seroalbúmina humana es un ejemplo de vehículos; y PBS, agua destilada, etc., son ejemplos de diluyentes.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales, y se pueden producir mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, los anticuerpos policlonales se pueden obtener inmunizando mamíferos o especies aviares con un péptido de la presente invención como antígeno, y recogiendo sangre de los mamíferos o especies aviares, y separando y purificando anticuerpos de la sangre recogida. Por ejemplo, se pueden inmunizar mamíferos tales como ratón, hámster, cobaya, pollo, rata, conejo, perro, cabra, oveja, y bóvido, o especies aviares. Los métodos de inmunización son conocidos por los expertos en la técnica, y el antígeno se puede administrar, por ejemplo, dos o tres veces a un intervalo de 7 a 30 días. La dosis puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0,05 mg a 2 mg de antígeno por administración. La vía de administración no está particularmente limitada, y se puede seleccionar adecuadamente a partir de la administración subcutánea, administración intradérmica, administración intraperitoneal, administración intravenosa, administración intramuscular, etc. Además, el antígeno se puede usar tras disolverlo en un tampón adecuado, por ejemplo un tampón que contiene un adyuvante convencional tal como adyuvante completo de Freund e hidróxido de aluminio.
Los mamíferos o especies aviares inmunizados se pueden criar durante cierto período de tiempo, y, cuando el título de anticuerpos ha aumentado, se pueden inmunizar adicionalmente con, por ejemplo, 100 g a 1000 g del antígeno. La sangre se puede recoger de los mamíferos o especies aviares inmunizados 1 a 2 meses tras la administración final, y la sangre se puede separar y purificar por métodos convencionales tales como centrifugación,
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precipitación usando sulfato de amonio o polietilenglicol, cromatografía tal como cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, etc., para obtener los anticuerpos policlonales que reconocen los péptidos de la presente invención como un antisuero policlonal.
Por otro lado, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener preparando hibridomas. Por ejemplo, los hibridomas se pueden obtener mediante fusión celular de células productoras de anticuerpos con estirpes celulares de mieloma. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden obtener mediante métodos de fusión celular tales como los indicados más abajo.
Como células productoras de anticuerpos se usan células del bazo, células de los ganglios linfáticos, linfocitos B, etc., procedentes de animales inmunizados. Los péptidos de la presente invención se usan como antígenos. Los animales tales como ratón y rata se pueden usar como animales inmunizados, y la administración de antígenos a estos animales se lleva a cabo mediante métodos convencionales. Por ejemplo, los animales se inmunizan administrando una suspensión o emulsión de un péptido de la presente invención, que es un antígeno, con un adyuvante tal como adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund, a los animales varias veces intravenosamente, subcutáneamente, intradérmicamente, intraperitonealmente, etc. Las células productoras de anticuerpos tales como células del bazo se obtienen de los animales inmunizados, y se pueden fusionar con células de mieloma mediante métodos conocidos (G. Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975)) para generar hibridomas.
Para ratones, los ejemplos de estirpes celulares de mieloma usadas para fusión celular incluyen, por ejemplo, las estirpes P3X63Ag8, P3U1, Sp2/0, etc. Para la fusión celular se usa un agente que promueve la fusión, tal como polietilenglicol y el virus de Sendai, y para seleccionar hibridomas mediante un método convencional tras la fusión celular, se usa un medio de hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT). Los hibridomas obtenidos mediante fusión celular se clonan mediante el método de dilución limitante u otro. Según sea necesario, las estirpes celulares productoras de anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente los péptidos de la presente invención se pueden obtener usando los péptidos de la presente invención en el cribado con un método de inmunoensayo enzimático.
Además de los métodos mencionados anteriormente, las células inmunizadas se pueden modular estimulando in vitro linfocitos humanos, tales como linfocitos infectados con el virus de EB, usando los péptidos de la presente invención, células que expresan los péptidos, o sus lisados. Los anticuerpos humanos que se unen a los péptidos de la presente invención se pueden obtener fusionando los linfocitos inmunizados con células de médula ósea derivadas de ser humano, tales como U266 (Publicación de Solicitud de Patente Japonesa Kokai nº (JP-A) S6317688 (sin examinar, solicitud de patente japonesa publicada)).
A fin de producir anticuerpos monoclonales de interés a partir de los hibridomas así obtenidos, los hibridomas se pueden cultivar mediante métodos de cultivo convencionales o métodos formadores de ascitis, y los anticuerpos monoclonales se pueden purificar a partir del sobrenadante de cultivo o de la ascitis. La purificación de los anticuerpos monoclonales a partir de sobrenadantes de cultivo o ascitis se puede llevar a cabo mediante métodos convencionales. Por ejemplo, se pueden combinar adecuadamente y se pueden usar el fraccionamiento con sulfato de amonio, la filtración en gel, la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, etc.
Los animales transgénicos que tienen un grupo de genes de anticuerpos humanos se pueden inmunizar usando los péptidos de la presente invención, células que expresan los péptidos, o sus lisados. Las células productoras de anticuerpos se pueden recoger de los animales transgénicos inmunizados, y se pueden fusionar con las estirpes celulares de mieloma descritas anteriormente para obtener hibridomas. Los anticuerpos monoclonales de interés se pueden producir entonces a partir de los hibridomas (documentos WO92/03918; WO94/02602; WO94/25585; WO94/33735; WO96/34096).
Además, las células inmunitarias productoras de anticuerpos, tales como linfocitos inmunizados, se pueden inmortalizar usando oncogenes, y se pueden usar para la preparación de anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales así obtenidos también se pueden modular usando técnicas de manipulación génica (Borrbaeck y Larrick, (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies). Por ejemplo, los anticuerpos recombinantes se pueden preparar clonando un ADN que codifica un anticuerpo procedente de células productoras de anticuerpos tales como hibridomas y linfocitos inmunizados, e insertándolo en un vector adecuado, e introduciendo éste en células hospedantes.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser fragmentos de anticuerpos o anticuerpos modificados, en tanto que se unan a los péptidos de la presente invención. Los fragmentos de anticuerpos pueden ser Fab, F(ab’)2, Fv, o un Fv monocatenario (scFv) en el cual los fragmentos Fv derivados de las cadenas H y L están enlazados juntos con un ligador adecuado (Huston et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83). Más específicamente, los fragmentos de anticuerpos se pueden preparar tratando anticuerpos con una enzima tal como papaína y pepsina (Co et al., (1994) J Immunol 152:2968-76; Better y Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178: 476-96; Pluckthun y Skerra, (1989) Methods Emzymol 178:497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol 121:652-63; Rousseaux et al., (1986) Methods Enzymol 121:663-9; Bird y Walker, (1991) Trends Biotech 9:132-7).
Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos modificados obtenidos uniendo anticuerpos a diversas
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moléculas tales como polietilenglicol (PEG). Los anticuerpos se pueden modificar mediante métodos de modificación química convencionales conocidos en la técnica.
Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos que incluyen una región variable derivada de un anticuerpo no humano y una región constante derivada de un anticuerpo humano, y anticuerpos humanizados que incluyen una región determinante de la complementariedad (CDR) derivada de un anticuerpo no humano, una región de marco (FR) derivada de un anticuerpo humano, y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Tales anticuerpos se pueden preparar por métodos convencionales conocidos en la técnica. Los anticuerpos humanizados se pueden obtener sustituyendo la región de secuencia de CDR de un anticuerpo humano por una región de CDR de roedor que tiene actividad de unión deseada (Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-6). En consecuencia, comparados con los anticuerpos quiméricos, los anticuerpos humanizados son anticuerpos en los que una región más pequeña de un anticuerpo humano se sustituye por una región correspondiente de origen no humano.
También se puede producir un anticuerpo humano completo que tiene una región variable humana además de las regiones de marco y constante humanas. Por ejemplo, en un método in vitro, se puede llevar a cabo el cribado usando una librería recombinante de bacteriófagos en la que se presentan fragmentos de anticuerpos humanos (Hoogenboom y Winter, (1992) J Mol Biol 227:381-8). De forma similar, los anticuerpos humanos se pueden producir introduciendo loci de inmunoglobulinas humanas en animales transgénicos cuyos genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado parcial o completamente (patentes U.S. nos 6.150.584, 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, y 5.661.016).
Los anticuerpos obtenidos como se describe anteriormente se pueden purificar hasta homogeneidad por métodos convencionales en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar métodos habituales de separación y purificación de proteínas. Los anticuerpos se pueden separar y purificar mediante una combinación de cromatografía en columna, tal como cromatografía de afinidad, filtración, ultrafiltración, desalación, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, enfoque isoeléctrico, y demás; sin embargo, los métodos de separación y purificación no están limitados a estos (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow y David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory). Para las columnas de afinidad, se pueden usar columnas de proteína A y columnas de proteína G. Los ejemplos de columnas de proteína A incluyen HyperD, POROS, y Sepharose F.F (Pharmacia).
Los ejemplos de cromatografía distinta de la cromatografía de afinidad incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de adsorción, y demás (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. et al.). Para la cromatografía, también se puede usar cromatografía de líquidos, tal como HPLC y FPLC.
La afinidad de unión a antígeno de los anticuerpos de la presente invención se puede medir usando, por ejemplo, medida de la absorbancia, ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA), inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), y ensayo de inmunofluorescencia; sin embargo, los métodos no están limitados a ellos. En ELISA, los anticuerpos de la presente invención se inmovilizan sobre una placa, y se añaden los péptidos de la presente invención, después se añade una muestra que contiene un sobrenadante de cultivo de células productoras de anticuerpos o anticuerpos purificados. Subsiguientemente, se añade un anticuerpo secundario que tiene un marcador detectable y reconoce el anticuerpo cuya afinidad de unión a antígeno se va a medir. Tras lavar la placa, se añaden los reactivos para detectar el marcador del anticuerpo secundario, y se mide la absorbancia o demás. Por ejemplo, las enzimas tales como fosfatasa alcalina se pueden usar como un marcador para el anticuerpo secundario, y los sustratos enzimáticos tales como fosfato de p-nitrofenilo se pueden usar como reactivo para la detección. También se puede usar BIAcore (Pharmacia) para evaluar la actividad de los anticuerpos.
Los anticuerpos de la presente invención pueden detectar los péptidos de la presente invención contenidos en las muestras. Específicamente, la presencia de los péptidos de la presente invención en tejidos cancerosos se puede confirmar, por ejemplo, poniendo en contacto biopsias de tejidos cancerosos con los anticuerpos de la presente invención.
Antes de usar los péptidos de la presente invención en terapia para tratamiento y/o prevención de cáncer, es posible predecir si el efecto es prometedor para un sujeto de ensayo antes del inicio del tratamiento evaluando la expresión de los péptidos de la presente invención en el cáncer a tratar usando los anticuerpos de la presente invención.
Además, puesto que los anticuerpos de la presente invención reconocen fragmentos de péptido CDCA1, cuya expresión está aumentada en diversas células cancerosas, se espera que su aplicación sea aplicable no solamente en el diagnóstico sino también para el tratamiento.
(4) Linfocitos T cooperadores, linfocitos T asesinos, o poblaciones inmunocíticas que los incluyen
La presente invención también se refiere a linfocitos T cooperadores y a linfocitos T asesinos inducidos mediante estimulación in vitro usando los péptidos de la presente invención, así como a poblaciones inmunocíticas que incluyen los linfocitos T cooperadores y los linfocitos T asesinos. Por ejemplo, los linfocitos T activados de respuesta a tumor son inducidos cuando linfocitos de sangre periférica o linfocitos que se infiltran en el tumor se estimulan in vitro usando los péptidos de la presente invención, y estos linfocitos T activados se pueden usar eficazmente para
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documento WO99/08521. Cuando los genes se transfectan en células presentadoras de antígeno, se transcriben y traducen en las células. Las proteínas resultantes se procesan subsiguientemente vía las rutas del MHC clase I y clase II, y se presentan sobre la superficie de células presentadoras de antígeno como péptidos parciales a través de la ruta de presentación de antígeno.
La presente invención también proporciona métodos para inducir linfocitos T asesinos usando uno o más de los péptidos de la presente invención. Al administrar uno o más de los péptidos de la presente invención a un sujeto, se pueden inducir linfocitos T asesinos en el cuerpo del sujeto, aumentando así el sistema inmunitario que se dirige contra células cancerosas que presentan CDCA1 en tejidos tumorales. Como alternativa, los linfocitos T asesinos activados se pueden inducir poniendo en contacto células presentadoras de antígeno y células CD8 positivas procedentes del sujeto con uno o más de los péptidos de la presente invención in vitro, y poniendo en contacto leucocitos mononucleares de sangre periférica con células presentadoras de antígeno in vitro para estimular las células. En métodos terapéuticos ex vivo, el sistema inmunitario que se dirige contra células cancerosas que presentan CDCA1 en tejidos tumorales en un sujeto se puede aumentar devolviendo los linfocitos T asesinos activados al cuerpo del sujeto. Por ejemplo, los métodos incluyen las etapas de:
- (1)
- recoger células presentadoras de antígeno procedentes de un sujeto; y
- (2)
- poner en contacto las células presentadoras de antígeno de la etapa (1) con un péptido de la presente invención (pulsando las células presentadoras de antígeno de la etapa (1) con un péptido de la presente invención);
- (3)
- mezclando y cocultivando las células presentadoras de antígeno de la etapa (2) con linfocitos T CD8+ para inducir linfocitos T citotóxicos; y
- (4)
- recoger linfocitos T CD8+ procedentes del cocultivo de la etapa (3).
Los linfocitos T CD8+ que tienen actividad citotóxica obtenidos en la etapa (4) se pueden administrar a un sujeto como una vacuna.
La presente invención también proporciona linfocitos T asesinos aislados inducidos usando uno o más de los péptidos de la presente invención. Preferiblemente, los linfocitos T asesinos inducidos por el método de la presente invención derivan de un sujeto que recibe el tratamiento y/o prevención. Las células se pueden administrar en combinación con otros agentes que contienen células presentadoras de antígeno o exosomas que presentan uno o más de los péptidos de la presente invención. Los linfocitos T asesinos obtenidos son específicos para células diana que presentan el mismo péptido usado para la inducción. Las células diana son células que expresan de forma endógena CDCA1, o células transfectadas con el gen de CDCA1. Mediante estimulación con un péptido de la presente invención, las células que presentan el péptido de la presente invención sobre su superficie, tales como células cancerosas de cáncer de pulmón, carcinoma colangiocelular, cáncer de vejiga, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, leucemia mielogenosa crónica, linfoma maligno, cáncer de cuello uterino, osteosarcoma, cáncer de mama, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de colon, y demás, se pueden convertir en dianas para el ataque.
(7) Receptores de linfocitos T (TCR)
La presente invención proporciona además ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que forman las subunidades de receptores de linfocitos T (TCRs) que reconocen CDCA1-4, y métodos para su uso. TCR contiene al menos siete proteínas transmembránicas. Un heterodímero enlazado (a, ) mediante enlace de disulfuro forma la unidad de reconocimiento de antígeno clonotípica, mientras que las cadenas de CD3 invariantes que consisten en cadenas , , y y acoplan la unión al ligando con la ruta de señalización, provocando de ese modo la activación de linfocitos T y la respuesta inmunitaria celular. Las subunidades y , que son responsables del reconocimiento antigénico como se menciona anteriormente, son necesarias para que los linfocitos T adquieran la especificidad de reconocimiento para una diana particular. Por lo tanto, para sintetizar TCRs que reconocen específicamente los péptidos de la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos de y que son subunidades de TCR derivadas de CTLs inducidos usando los péptidos de la presente invención se pueden identificar mediante métodos conocidos por aquellos de pericia en la técnica (documento WO2007/032255; y Morgan et al., J. Immunol., 171, 3288 (2003)). Puesto que los TCRs formados a partir de las unidades de TCR identificadas se pueden unir a células diana presentadoras del péptido CDCA1, los TCRs son útiles cuando se introducen en células que tienen un efecto exterminador de células.
Los ácidos nucleicos que codifican las subunidades de TCR se pueden incorporar en vectores adecuados (por ejemplo, vectores retrovíricos). Los vectores se pueden producir por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los vectores a los que se les han incorporado las subunidades de TCR se pueden usar para la introducción en linfocitos T. En particular, transformando linfocitos T derivados de pacientes, se pueden obtener linfocitos T (CTLs) que reconocen específicamente y atacan a células que expresan CDCA1. Los CTLs así obtenidos a los que se les han introducido los TCRs se pueden cultivar y se pueden hacer crecer mediante métodos habituales (Kawakami et al., J. Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). Los CTLs obtenidos por el método mencionado anteriormente se pueden usar para la inmunoterapia celular.
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[Tabla 1-2] 28 402-411 KLGIQQLKDA 40,0 SEC ID NO: 28 29 343-352 RLMIVKKEKL 38,7 SEC ID NO: 29 30 309-318 KLASILKESL 36,6 SEC ID NO: 30 31 22-31 ILTGADGKNL 36,3 SEC ID NO: 31 32 193-202 SLNQDFHQKT 28,3 SEC ID NO: 32 33 52-61 ALQIVYGIRL 21,4 SEC ID NO: 33 34 44-53 VLHMIYMRAL 16,7 SEC ID NO: 34 35 35-44 DLYPNPKPEV 16,7 SEC ID NO: 35 36 165-174 KLERLDSVPV 15,6 SEC ID NO: 36 37 65-74 YMMPVNSEVM 12,3 SEC ID NO: 37 38 154-163 QLNAAHQEAL 10,5 SEC ID NO: 38 39 60-69 RLEHFYMMPV 10,2 SEC ID NO: 39 40 344-353 LMIVKKEKLA 6,1 SEC ID NO: 40 41 453-462 AELKRKMFKM 4,8 SEC ID NO: 41
Los epítopos de linfocitos T asesinos restringidos a HLA-A2 identificados en la presente invención están subrayados.
[Ejemplo 2]
En primer lugar, se indujeron células dendríticas (DCs) a partir de células de médula ósea de ratones transgénicos para HLA-A2 usando un método dado a conocer previamente (Komori H et al. Clinical Cancer Research 12: 26892697, 2006). Las BM-DCs así obtenidas se pulsaron con un péptido CDCA1 (10 M), y después se administraron intraperitonealmente a ratones transgénicos para HLA-A2 a 5 x 105 células por ratón. Los ratones se inmunizaron a un intervalo de dos veces por semana mediante el mismo método de administración, después se recogieron sus células del bazo y se usaron para la detección de linfocitos T auxiliares. A fin de examinar de forma rigurosa la inducción de linfocitos T asesinos derivados de linfocitos T CD8+, los linfocitos T CD4+ se eliminaron de las células del bazo usando perlas MACS tras la retirada del bazo, y se usaron las células que quedan.
La Fig. 1A muestra el protocolo para determinar los péptidos CDCA1 reconocidos por linfocitos T asesinos restringidos a HLA-A2 en ratones transgénicos para HLA-A2. El día en el que las células del bazo se recogen a partir de los ratones inmunizados se denomina como “Día 0”.
Día -21: (1) La inducción de células dendríticas derivadas de médula ósea (aquí más abajo denominadas BM-DCs) se inició añadiendo GM-CSF a las células de médula ósea de ratones transgénicos para HLA-A2.
Día -14: (2) Se añadió una mezcla de cuatro tipos de péptidos CDCA1 a las BM-DCs inducidas, y después de dos horas, se administró intraperitonealmente a 5 x 105 células por ratón.
(1) y (2) se repitieron en un intervalo de dos veces por semana.
Día 0: Se recogieron células del bazo procedentes de los ratones transgénicos para HLA-A2 inmunizados, y se cocultivaron con BM-DCs que se habían incubado con péptidos CDCA1 durante dos horas. Subsiguientemente, se cultivaron durante seis días.
Día 6: Para detectar linfocitos T asesinos que reconocen específicamente péptidos CDCA1, los linfocitos T que producen gamma interferón tras la estimulación antigénica se cuantificaron mediante ensayo ELISPOT. Como células diana, se usaron BM-DCs pulsadas con cada péptido CDCA1 individual, y BM-DCs no pulsadas.
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Evaluación de la actividad de linfocitos T asesinos específicos de CDCA1 mediante ensayo ELISPOT:
Se determinó mediante ensayo ELISPOT si los linfocitos T asesinos que reaccionan específicamente con CDCA1 para producir IFN- existen realmente o no entre los linfocitos T asesinos inducidos. IFN- se detectó usando un kit ELISPOT para IFN- de ratón (BD Biosciences). Cuando los linfocitos T asesinos (efectores) responden a células estimuladoras (dianas) y producen IFN-, son detectados como manchas rojas. Como células diana, se usaron células T2A2 positivas para HLA-A2 que no expresan CDCA1, y células T2A2 pulsadas con el péptido CDCA1. Las células T2A2, una estirpe celular producida introduciendo el gen de HLA-A2 en la estirpe celular T2 de ratón deficiente en la expresión del gen TAP, se adquirieron de RIKEN Cell Bank. Debido a la deficiencia de TAP en estas células, los complejos formados entre moléculas de HLA-A2 y péptidos añadidos exógenamente se expresan en la superficie celular solamente cuando los péptidos tienen la capacidad de unirse a las moléculas de HLA-A2. En primer lugar, placas ELISPOT (BD Biosciences) se revistieron con un anticuerpo anti-IFN- de ratón durante 18 horas. Subsiguientemente, las placas se bloquearon con 10% de FCS/RPMI durante dos horas. Las células efectoras (100 l/pocillo) y las células diana (100 l/pocillo) se mezclaron y cultivaron durante 22 horas a 37ºC. El experimento se llevó a cabo a una relación efectora/diana (relación E/T) de 5:1. Las placas se lavaron entonces con agua esterilizada, y se hicieron reaccionar con un anticuerpo biotinilado anti-IFN- de ratón durante dos horas, y se hicieron reaccionar además con estreptavidina-HRP durante una hora. Las manchas positivas a IFN- se detectaron usando una disolución sustrato. Para contar las manchas, se usó un software de análisis automático de MINERVA TECH. En la Fig. 1B se muestran los resultados para los Números 1 a 20 de Péptido. A partir de experimentos similares, se observó respuesta inmunitaria de linfocitos T asesinos específicos de CDCA1 en linfocitos T asesinos inducidos con el péptido CDCA165-73 (No. 1) (SEC ID NO: 1) o CDCA1351-359 (No. 4) (SEC ID NO: 2) entre los 41 péptidos (Fig. 2).
Los resultados del análisis de linfocitos T asesinos inducidos con el péptido CDCA165-73 (No. 1) (SEC ID NO: 1) o CDCA1351-359 (No. 4) (SEC ID NO: 2) se muestran en las Figs. 2A y 2B, respectivamente.
[Ejemplo 3]
Pacientes, muestras de sangre, y estirpes celulares:
Se recogieron muestras de sangre derivadas de pacientes con NSCLC durante exámenes de diagnóstico rutinarios con autorización firmada. La estirpe celular de cáncer de colon humano negativa para CDCA1 COLO201 fue proporcionada por el Health Science Research Resources Bank. La expresión de HLA-A2 en estas muestras se confirmó mediante citometría de flujo usando el anticuerpo monoclonal anti-HLA-A2 BB7.2 (One Lambda Inc., Canoga Park, CA).
Transferencia de gen lentivírico:
Se llevó a cabo la transferencia génica mediada por un vector lentivírico usando el método descrito en Tahara-Hanaoka S, et al. Exp. Hematol. 2002;30:11-17. De forma breve, se transfectaron 17 g de vectores autoinactivantes CSII-CMV-RfA y CSIIEF-RfA que portan ADNc de CDCA1 (Miyoshi H, et al. J. Virol. 1998; 72:8150-8157) y 10 g de pCMV-VSV-G-RSV-Rev y pHIVgp en células 293T en una placa de cultivo de 10 cm usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). Después de 60 horas, el medio de cultivo se recogió, y las partículas víricas se peletizaron mediante ultracentrifugación (50.000 x g, dos horas). El pelete se suspendió en 50 l de disolución RPMI 1640, y se añadieron 10 l de la suspensión vírica a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U que contiene 5 x 104 células COLO201 por pocillo. La expresión del gen de CDCA1 transfectado se confirmó mediante análisis de transferencia Western.
Inducción de CTLs humanos reactivos con CDCA1:
Se usaron células DC derivadas de monocitos como células presentadoras de antígeno para la inducción de CTLs en respuesta a péptidos presentados por HLA. Las DCs se obtuvieron por métodos in vitro dados a conocer previamente (Suda T, et al. Cancer Sci. 2007; Nakahara S, et al. Cancer Res. 2003;63:4112-8). De forma breve, monocitos de sangre periférica (PBMCs) aislados de voluntarios sanos positivos a HLA-A*0201 y pacientes con NSCLC usando una disolución de Ficoll-Paque (GE Healthcare UK, Ltd., Buckinghamshire, UK) se cribaron en busca de poblaciones positivas a CD8 y positivas a CD14 usando MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Para obtener las DCs, la población positiva a CD14 se cultivó en AIM-V (Invitrogen) que contiene 2% de plasma autólogo en presencia de 100 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y 10 ng/ml de interleucina (IL)-4 (PeproTec Inc., New Jersey, USA). Cuatro días después de la incubación, se añadió OK-432 a la placa para preparar DCs maduras. Cinco días después del comienzo del cultivo para DCs inducidas por citocinas, las células se pulsaron con 20 g/ml de un péptido que se une a HLA-A2, durante dos horas a 37ºC en AMI-V en presencia de 4 g/ml de 2-microglobulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Estas DCs pulsadas con el péptido se irradiaron (3.500 cGy) y se mezclaron a una relación 1:50 con linfocitos T CD8 positivos autólogos obtenidos a partir de PBMCs usando anti-CD8 MicroBeads (Miltenyi Biotec). La incubación se llevó a cabo usando placas de 48 pocillos, que se prepararon para que contuviesen 0,5 ml de AIM-V que contiene en cada pocillo 2% de plasma autólogo, 1 x 104 DCs pulsadas con péptido, 5 x 105 linfocitos T CD8 positivos, y 10 ng/ml de IL-7 humana (Wako, Osaka, Japón). Tres días después de la incubación, se añadió IL-2 humana (PeproTec Inc.) a una
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en este estudio.
Discusión:
La identificación de péptidos derivados de TAA que se procesan de forma natural y se presentan en células tumorales es importante para el establecimiento de la inmunoterapia del cáncer a base de péptidos. CDCA1, que es un nuevo antígeno del cáncer/testículo, se identificó mediante análisis de micromatriz de ADNc usando tejidos de NSCLC y tejidos normales. CDCA1 está fuertemente expresado en NSCLC y testículo normal, pero su ARNm o proteína no se expresó en los otros tejidos normales examinados. Puesto que el testículo es un tejido aislado del sistema inmunitario, los CTLs sensibles a CDCA1 atacarían solamente a NSCLC. Por lo tanto, CDCA1 se seleccionó como un TAA para inmunoterapia de pacientes con NSCLC.
Para minimizar el riesgo de supresión, mutación, o expresión disminuida de TAA como medio de evasión inmune por las células cancerosas como resultado de la terapia de inducción inmunitaria, se deseó identificar TAAs esenciales para la proliferación o supervivencia de NSCLC que se pudiesen usar como dianas para inmunoterapia (Yoshitake Y, et al. Clin. Cancer Res. 2004; 10:6437-48). Se ha dado a conocer que CDCA1 funciona actuando sobre la unión entre los microtúbulos del husillo y los cinetocoros, y tiene un papel importante en el mantenimiento del ciclo celular (DeLuca JG, et al. J. Cell Biol. 2002; 159:549-55). Además, CDCA1 es un componente del complejo del ciclo de división nuclear (NDC), que juega un papel importante en la segregación cromosómica apropiada durante la mitosis, y está muy conservado independientemente de la especie (DeLuca JG, et al. Curr. Biol. 2003; 13:2103-9). CDCA1 es esencial para la localización de cinetocoros de la proteína centromérica E (CENP-E) en células HeLa. La supresión de la expresión de CDCA1 mediante ARNpi provoca segregación cromosómica normal por bloqueo de la mitosis e inducción subsiguiente de la muerte celular (Liu D, et al. J. Biol. Chem. 2007; 282:21415-24). Esta salida aberrante de la mitosis tiene las características tanto de apoptosis como de catástrofe (DeLuca JG, et al. J. Cell Biol. 2002; 159:549-55). Esto es, CDCA1 es esencial para la función celular, y juega un papel importante en la proliferación y supervivencia de células cancerosas.
CDCA1 y el péptido asociado al cinetocoro 2 (KNTC2) son miembros del complejo de proteínas del centrómero evolutivamente conservado (Hayama S, et al. Cancer Res 2006; 66:10339-48). La inmunotinción muestra que su expresión elevada está asociada con un mal pronóstico de pacientes con NSCLC (Hayama S, et al. Cancer Res 2006; 66:10339-48). Por lo tanto, el nivel de expresión de CDCA1 en tejidos de NSCLC es un marcador útil para predecir el pronóstico de pacientes tras la operación quirúrgica. Se sugiere la implicación de CDCA1 en la progresión de NSCLC. De este modo, la inmunoterapia que se dirige a CDCA1 puede ser eficaz para pacientes con NSCLC con un mal pronóstico.
En la presente invención, dos péptidos epitópicos CDCA1 restringidos a HLA-A2, que promovieron la producción de CTLs de ratón restringidos a HLA-A2, se identificaron usando ratones transgénicos para HLA-A2. Además, se pudieron preparar CTLs humanos reactivos a CDCA1 a partir de PBMCs derivadas de donantes sanos estimuladas con estos péptidos. Estas estirpes de CTLs específicos del péptido CDCA1 eliminaron células cancerosas que expresan CDCA1 de una manera restringida a HLA-A2 (Fig. 4).
Los péptidos derivados de CDCA1 que se predice que tienen afinidad de unión elevada por la molécula de HLA-A0201 se seleccionaron usando el software BIMAS; sin embargo, algunas de las secuencias de aminoácidos no están conservadas entre CDCA1 humano y CDCA1 de ratón. Hay dos diferencias de aminoácidos entre las secuencias humana y de ratón del péptido CDCA165-73 (No. 1) (humano: YMMPVNSEV/ratón: YMMPMNIEV), y una diferencia de aminoácidos en el péptido CDCA1351-359 (No. 4) (humano KLATAQFKI/ratón KLATARFKI). Sin embargo, en la presente invención, se confirmó la inducción de los CTLs reactivos al péptido epitópico mencionados anteriormente procedentes de donantes sanos.
Se indujeron CTLs reactivos a CDCA1 a partir de PBMCs derivadas de donantes sanos mediante estimulación in vitro usando los péptidos CDCA1. Los CTLs inducidos por DCs presentadoras de péptido mostraron actividad citotóxica frente a células cancerosas que expresan CDCA, de una manera restringida a HLA-A2. La inducción de CTLs específicos de CDCA1 derivados de donantes sanos es significativa para la continuación de la búsqueda posterior de TAAs. Además, actualmente se está intentando la inducción de CTLs reactivos a CDCA1 procedentes de PBMCs aisladas de pacientes con NSCLC, cáncer microcítico, carcinoma colangiocelular, cáncer de vejiga, y cáncer de células renales. Hay varios métodos de inmunoterapia del cáncer mediados por células, incluyendo vacunación de péptidos o proteínas (Rosenberg SA, et al. Nat Med 1998; 4:321-7), inmunización con células dendríticas pulsadas con péptidos, proteínas, o lisados tumorales (Kugler A, et al. Nat Med 2000; 6:332-6), y transferencia adoptiva ex vivo usando estirpes de CTLs específicos del tumor (Falkenburg JH, et al. Blood 1999; 94:1201-8). Los péptidos CDCA1 identificados en la presente invención se podrían aplicar a estas inmunoterapias.
Si la seguridad y eficacia de la inmunoterapia del cáncer usando péptidos identificados en la presente invención, que son presentados a linfocitos T asesinos vía HLA-A2, se pueden mostrar en medicina de investigación, sería posible la aplicación clínica a caucásicos. Además, identificando péptidos presentados a linfocitos T asesinos vía HLA-A2 que se encuentran frecuentemente no sólo en los japoneses sino también en los caucásicos, sería altamente posible desarrollar agentes de inmunoterapia del cáncer que son aplicables al 30% de pacientes japoneses y caucásicos con cáncer de pulmón.
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