TWI523660B - Cell cycle associated with a peptide and a medicament containing it - Google Patents
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Description
本發明係關於作為對抗肺癌、膽管細胞癌等高度表現細胞週期關聯1胜肽(cell division cycle associated 1，簡稱CDCA1)之癌症疫苗的有效新穎胜肽，及含該胜肽之治療及預防的癌症醫藥。
近年來，世界各國中，肺癌持續增加，現在世界上一年約有100萬人因肺癌而死亡。日本因肺癌死亡之人亦持續增加，有人認為於2015年，會達到12萬3000人。男女比為3：1以男性為多，在男性之癌症死亡中，於1993，肺癌已超過胃癌成為第1位。又，隨著女性吸煙者數增加，女性患者數亦被認為在增加中。肺癌從2000年已成為因癌症死亡原因之第1位，今後，隨高齡化社會進展，被認為患者數會愈來愈增加。肺癌發生要因，以吸煙被認為是最大原因，但是其他態樣之吸引、大氣污染醫學檢查實施之單純胸部X光攝影及咳痰檢查，欠缺肺癌早期發現相關的效果，近年來有人指摘對於減少癌症死亡之結果沒有關聯，考慮到今後因肺癌而死亡者之數目會增加，因此新治療策略之開發為緊急課題。
於日本，膽道癌之死亡者數有增加傾向，於2005年有16,586人死於膽道癌。膽道癌在初期時幾乎沒有自覺症狀，相較於胃癌或大腸癌之發生在消化管內腔的癌症，早
期發現癌症並治療有所困難。因此，常常發現時癌症已進行而常已不能切除。膽道癌之治療，除了外科療法以外，尚有放射線療法、化學療法，但其缺乏治療效果，必需確立新的治療法。
另一方面，由於近年分子生物學及腫瘤免疫學之發展，瞭解到：胞毒型T細胞及輔助T細胞，識別在癌細胞或抗原呈現細胞之表面透過HLA分子而被呈現之在癌細胞專一性高表現之蛋白質分解產生的胜肽，並且顯示破壞癌細胞之免疫反應。再者，已鑑定出多數刺激此種癌症之免疫反應的腫瘤抗原蛋白質，及來源於此等的胜肽，抗原專一性腫瘤免疫療法之臨床應用進展當中。
HLA第I類分子，在身體所有之有核細胞之表面表現，與細胞質或細胞核產生之蛋白質在細胞內受分解而生之胜肽結合，並表現在細胞表面。正常細胞之表面上，正常之自身蛋白質所由來之胜肽與HLA第I類分子結合，其並不會被免疫系T細胞識別而破壞。另一方面，癌細胞在成為癌症之過程中，有時在正常細胞幾乎不表現或僅少量表現之蛋白質會大量表現。此種在癌細胞中專一性地高度表現之蛋白質於細胞質內受分解而生之胜肽，若與HLA第I類分子結合而表現在癌細胞之表面，則胞毒型T細胞會識別並僅破壞癌細胞。又，藉由將此種癌症專一性抗原或胜肽對於個體投予，不會對於正常細胞造成危害，能破壞癌細胞而抑制癌症增殖。此稱為使用癌症專一性抗原之癌免疫療法。又，HLA第II類分子主要表現在抗原呈現細胞之
表面，與抗原呈現細胞從細胞外攝入，在細胞內受分解而生之癌症專一性抗原來源之胜肽結合，而在細胞表面表現。識別此之輔助T細胞，被活化以外並產生活化其他免疫擔當細胞的各種細胞介素，誘導或增強對抗腫瘤免疫反應。
因此，若能開發以該等癌症中專一性地高度表現之抗原作為標靶之免疫療法，則可能不損及自己之正常臟器，而成為僅將癌症有效排除之治療法。又，亦能期待成為無法實施其他治療之任何末期癌患者均能使用之治療法。又，亦可能事先對於發生此種癌症之風險高的人類，以癌症專一性抗原及胜肽作為疫苗投予，而預防癌症發生。
肺癌之治療法儘管有多種，但是相較於其他癌症，預後差，成為一種難治性癌症。就其原因而言，例如：進行快，當發現時常已經為進行相當程度的狀態。又，因為手術侵襲大，適於手術之患者受限，有時以放射線或化學療法被認為難以根治。若能開發於肺癌專一性高表現之抗原作為標靶的免疫療法，則可能成為不對於自己的正常臟器造成妨礙，而僅將癌症有效地排除的治療法。又，亦能期待成為任何末期癌患者，甚至肺功能太差而無法實施其他治療之患者，亦能使用之治療法。又，由於肺癌以吸煙者的發生風險高，因此關於此種肺癌高風險群的肺癌預防，亦有適用免疫療法之可能性。
本案發明人等先前藉由利用cDNA微陣列解析之含27,648種人類基因之全基因體之基因表現解析，探討37
症例之非小細胞肺癌及胎生期臟器及各種成人正常臟器之中，該等基因表現概況。結果發現到，細胞週期關聯1胜肽(cell division cycle associated 1，簡稱CDCA1，別名hNuf2；human homologous of Nuf2)(GeneBank Accession No.NM_145697)，在胎生期之肝臟及在成人正常臟器中，除了從免疫系隔離的睪丸以外，幾乎不表現，但相對於此，觀察到在許多的肺癌中高度表現。再者，CDCA1，被認為在膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌等的所有症例高度表現，在前列腺癌、慢性骨髓性白血病、惡性淋巴腫瘤、子宮頸癌、骨肉腫瘤、乳癌、軟組織肉瘤、大腸癌中，認為有40%以上的症例的癌組織中高度表現。此事實暗示，CDCA1在許多癌腫瘤中，可成為癌症專一性抗原。
HLA-A2不論人種，在人類群體中以高頻度被觀察到，日本人亦有約30%具有。因此，若能鑑別利用HLA-A2對於胞毒型T細胞提示之癌抗原胜肽，則不僅日本人，歐美白人等亦能應用。因此，鑑別利用HLA-A2對於胞毒型T細胞呈現之癌抗原胜肽，為重要課題。若將此種癌抗原胜肽，應用在對抗全世界中罹患率、死亡率高的肺癌的免疫療法，被認為是非常有益的。
又，以下顯示本發明之先前技術文獻。
【非專利文獻1】DeLuca J.G., Moree, B., Hickey, J. M., Kilmartin, J.V., and Salmon, E. D., hNuf2 inhibition blocks stable kinetochore-microtubule attachment and induces mitotic cell death in Hela cells J. Cell. Biol.
159：549－555,2002.
【非專利文獻2】DeLuca,J.G.,Dong,Y.,Hergert,P.Strauss,J.,Hickey,J.M.,Salmon,E.D.,McEwan,B.F.,Hec1 and Nuf2 Are Core Components of the Kinetochore Outer Plate Essential for Organizing Microtubule Attachment Sites.,Mol.Biol,Cell 16：519－531,2005.
【非專利文獻3】Hayama,S.,Diago,Y.,Kato,T.,Ishikawa,N.,Yamabuki,T.,Miyamoto,M.,Ito,T.,Tsuchiya,E.,Kondo,S.,and Nakamura,Y.,Activation of CDCA1－KNTC2,Members of Centromere Protein Complex,Involved in Pulmonary Carcinogenesis.,Cancer Res.66：10339－10348,2006.
【非專利文獻4】Liu,S.T.,Rattner,J.B.,Jablonski,S.A.,and Yen,T.J.,Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells.,J.Cell Biol.175：41－53,2006
【非專利文獻5】DeLuca,J.G.,Howell,B.J.,Canman,J.C.,Hickey,J.M.,Fang,G.,and Salmon,E.D.,et al.Nuf2 and Hec1 Are Required for Retention of the Checkpoint ProteinsMad1 and Mad2 to Kinetochore.,Current Biology 13：2103－2109,2003.
【非專利文獻6】Liu,D.,Ding,D.,Du,J.,Cai,Xin.,Huang,Y.,Ward,T.,Shaw,A.,Yang,Y.,Hu,R.,Jin,
C., and Yao, X., Human NUF2 Interacts with Centromere-associated Protein E and is Essential for a Stable Spindle Microtubule-Kinetochore Attachment. J. Biol. Chem. 282:21416-21424, 2007.
本發明待解決之課題在於，就對於肺癌、膽道癌等而實行之外科療法、化學療法、放射線療法難以治療的轉移性癌或難治性癌的治療方法而言，藉增強癌患者對癌症之免疫力，開發達成抑制癌增殖之免疫療法的方法。本發明藉由鑑別來自於癌專一性地高度表現之蛋白質，且利用HLA-A2而對於胞毒型T細胞提示之胜肽，而可能達成一種免疫療法，能以日本人中高度表現CDCA1之各種癌患者之約30%為個體。
本案發明人等藉由肺癌組織中之cDNA微陣列解析，鑑別出在肺癌中高度表現之基因CDCA1(GenBank Accession No.NM_145697)。正常組織之中CDCA1之表現，僅在從免疫系隔離的睪丸被發現到。為了探討有無CDCA1專一性的胞毒型T細胞誘導抗腫瘤免疫，利用表現日本人約30%具有之HLA-A2的HLA-A2基因轉殖小鼠。即，這次，將負荷具有HLA-A2結合結構域之人類CDH3胜肽的小鼠骨髓來源樹狀細胞，對於HLA-A2基因轉殖小鼠免疫，藉此探討
HLA-A2結合性之胜肽專一性胞毒型T細胞是否受誘導。藉由以ELISPOT法檢測，識別利用HLA-A2呈現之胜肽而活化之胞毒型T細胞所產生的γ-干擾素(IFN-γ)，來探討經免疫之小鼠脾細胞中有無誘導對於CDCA1胜肽專一性的胞毒型T細胞。結果鑑別出可應用在對於HLA-A2陽性癌患者為個體之免疫療法的2種新穎CDCA1胜肽。再者，確認使用此等胜肽活化之癌症患者及健康正常人來源的CTL對於CDCA1表現細胞顯示細胞溶解活性。因此，可期待：亦能應用在為HLA-A2限制性人類胞毒型T細胞識別，對於HLA-A2陽性的癌症患者的癌症免疫療法。
亦即，依照本發明，提供以下發明。
(1)以下(A)或(B)之胜肽。
(A)含序列編號1或2之胺基酸序列的胜肽。
(B)於含序列編號1或2之胺基酸序列的胜肽中，1個、2個或數個胺基酸經取代、缺失、插入、及/或加成，且具胞毒型T細胞誘導活性之胜肽。
(2)如(1)之胜肽，其中N末端起第2個胺基酸為白胺酸或甲硫胺酸。
(3)如(1)之胜肽，其中C末端胺基酸為纈胺酸或白胺酸。
(4)一種對抗癌症之免疫誘導劑，含一種以上(1)之胜肽作為有效成分。
(5)一種用於治療及/或預防癌症之藥劑，含一種以上(1)之胜肽作為有效成分。
(6)一種誘導呈現胞毒型T細胞之誘導活性的抗原呈現細胞的藥劑，含一種以上(1)之胜肽作為有效成分。
(7)一種誘導呈現胞毒型T細胞之誘導活性的抗原呈現細胞的藥劑，含一種以上編碼為(1)之胜肽之聚核苷酸作為有效成分。
(8)一種誘導胞毒型T細胞之藥劑，含一種以上(1)之胜肽作為有效成分。
(9)一種抗體，係對抗(1)之胜肽。
(10)一種輔助T細胞、胞毒型T細胞、或含該等之免疫細胞群體，係使用(1)之胜肽所誘導。
(11)一種抗原呈現細胞，呈現含(1)之胜肽及HLA抗原之複合體。
(12)如(11)之抗原呈現細胞，係利用(6)或(7)之藥劑所誘導。
(13)一種外吐小體，呈現含(1)之胜肽及HLA抗原之複合體。
(14)如(13)之外吐小體，其中，HLA抗原為HLA-A2(HLA-A*0201)。
(15)一種誘導呈現胞毒型T細胞之誘導活性之抗原呈現細胞的方法，包含使抗原呈現細胞與(1)之胜肽接觸之步驟。
(16)一種誘導呈現胞毒型T細胞之誘導活性之抗原呈現細胞的方法，包含使編碼為(1)之胜肽之聚核苷酸導入抗原呈現細胞之步驟。
(17)一種誘導胞毒型T細胞之方法，包含使T細胞與(1)之胜肽接觸之步驟。
(18)一種誘導對抗癌症之免疫之方法，包含使(1)之胜肽對於個體投予之步驟。
(19)一種治療及/或預防癌症之方法，包含使(1)之胜肽對於個體投予之步驟。
(20)一種(1)之胜肽使用，用於製造對抗癌之免疫誘導劑。
(21)一種(1)之胜肽使用，用於製造用於治療及/或預防癌症之藥劑。
(22)如(1)之胜肽，係用於誘導對抗癌症之免疫。
(23)如(1)之胜肽，係用於治療及/或預防癌症。
若無其他定義，則本說明書使用之所有技術用語及科學用語，意指本發明所屬技術領域之人士一般理解者為相同涵意。
本發明之胜肽，為以日本人及白人群體中高頻度表現的HLA等位基因HLA-A2所限制的抗原決定基。具體而言，就對於HLA-A2之結合親和性作為指標而言，選擇CDCA1來源之HLA-A2結合胜肽候選者。關於經選擇之胜肽，利用帶有經選擇胜肽之HLA-A2基因轉殖小鼠骨髓細胞來源之樹狀細胞(BM-DC)，來評價在HLA-A2基因轉殖小鼠活體內是否誘導胞毒型T細胞。利用CDCA1-1(YMMPVNSEV(序列編
號：1))、CDCA1-4(KLATAQFK1(序列編號：2))，在HLA-A2基因轉殖小鼠活體內誘導胞毒型T細胞。該等胜肽所誘導之胞毒型T細胞，對於添加了該等胜肽之T2A2，呈現免疫反應。然而，該等胞毒型T細胞，對於未添加胜肽之T2A2，不呈現免疫反應。又，使用CDCA-1及CDCA-4誘導之癌症患者及健康正常人捐出者來源的CTL，對於表現CDCA-1的細胞株，顯示細胞溶解反應。此結果實證了：CDCA1來源之胜肽可作為誘導呈現CDCA1細胞之免疫反應的胜肽，且CDCA1來源之胜肽為利用HLA-A2所限制之抗原決定基胜肽。CDCA1被認為在肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性骨髓性白血病、惡性淋巴腫瘤、子宮頸癌、骨肉腫瘤、乳癌、軟組織肉瘤、大腸癌中之癌組織的大部分症例之中，被高度表現。從此事實，可知CDCA1在許多癌腫瘤中，作為免疫療法之標靶為有用。
(1)本發明之胜肽、及含本發明胜肽之對抗癌症之免疫誘導劑。
本發明之胜肽為以下其中之一的胜肽。
(A)一種胜肽，含序列編號1或2之胺基酸序列。
(B)含序列編號1或2之胺基酸序列之胜肽，其中，1個、2個或數個胺基酸經取代、缺失、插入及/或加成，且為具胞毒型T細胞之誘導活性的胜肽。
(C)如(B)之胜肽，其中，自N末端起第2個胺基酸為白胺酸或甲硫胺酸。
(D)如(B)之胜肽，其中，C末端胺基酸為纈胺酸或白胺酸。
本說明書中所指呈現胞毒型T細胞之誘導活性的胜肽，意指具刺激胞毒型T細胞(胞毒型T細胞/CTL)之T細胞誘導活性的胜肽。
本發明之胜肽，呈現胞毒型T細胞之誘導活性，為含少於40個胺基酸、較佳為少於20個胺基酸、更佳為少於15個胺基酸，且序列編號：1或2之胺基酸序列的抗原決定基胜肽。或，本發明之胜肽(抗原決定基胜肽)只要保持著胞毒型T細胞之誘導活性，可為1個、2個或數個胺基酸可經取代、缺失、插入、及/或加成，且含序列編號：1或2之胺基酸序列的胜肽。經取代、缺失、插入、及/或加成之殘基數，一般而言，為5個以下胺基酸，較佳為4個以下胺基酸，又更佳為3個以下胺基酸，再更佳為1個胺基酸或2個胺基酸。
變異體胜肽(亦即，含有對原本之胺基酸序列，施加1個、2個或數個胺基酸殘基之取代、缺失、插入、及/或加成而改變之胺基酸序列的胜肽)，已知保持著原本的生物活性(Mark DF et al.,(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6；Zoller MJ and Smith M,(1982)Nucleic Acids Res 10：6487-500；Dalbadie-McFarland G et al.,(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13)。胺基酸改變，較佳為保存原本胺基酸側鏈之性質。胺基酸側鏈性質之例，有：疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性
胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，及共通具以下官能基或特性之側鏈：脂肪族側鏈(G、A、V、L、I、P)；含羥基之側鏈(S、T、Y)；含硫原子之側鏈(C、M)；含羧酸及醯胺之側鏈(D、N、E、Q)；含鹼基之側鏈(R、K、H)；及含芳香族之側鏈(H、F、Y、W)。其中，括弧中之文字，表示胺基酸之單字母記號。
較佳態樣中，本發明之胜肽(免疫原性胜肽)，為九胜肽(9-mer)或十胜肽(10-mer)。
再者，為了得到呈現高結合親和性及胞毒型T細胞誘導活性之胜肽，亦可在天然存在之CDCA1之部分胜肽的胺基酸序列，施加1個、2個、或數個胺基酸之取代、除去或加成所致之改變。本說明書中，「數個」的用語，意指5個以下、較佳為3個以下，較佳為2個以下。再者，由於對於HLA抗原呈現高親和性之胜肽序列的規則性為已知(Kubo RT,et al.,(1994)J.Immunol.,152,3913-24；Rammensee HG,et al.,(1995)Immunogenetics.41：178-228；Kondo A,et al.,(1995)J.Immunol.155：4307-12)，因此可依據此規則性，改變本發明之胜肽(抗原決定基胜肽)，來提高對於HLA抗原之親和性。例如，藉由將N末端起第2位的胺基酸取代成白胺酸或甲硫胺酸，能得到呈現高HLA-2結合親和性之胜肽。同樣地，將C末端胺基酸取代為纈胺酸或白胺酸，亦能得到呈現高HLA-2結合親和性之胜肽。
抗原決定基胜肽序列，於與帶有不同功能之內因性或
外因性蛋白質之胺基酸序列有一部分相同時，可能對於特定物質產生自體免疫異常或過敏症狀這類副作用。為避免此種副作用，在改變抗原決定基胜肽時，必需使用可利用之資料庫進行相同性檢索，確認與改變後之抗原決定基胜肽呈現100%相同性之具不同功能的內因性或外因性蛋白質不存在，以使得不與習知蛋白質之胺基酸序列一致。藉由實施此程序，能避免由於使與HLA抗原之結合親和性增加及/或使胞毒型T細胞誘導活性增加之上述胺基酸序列改變所致危險性。
像上述對於HLA抗原具高結合親和性之胜肽，作為癌症疫苗高度期待有效果，但是以高結合親和性之存在為指標並因應於此而選擇之候選胜肽，必需檢查實際上胞毒型T細胞誘導活性之存在。胞毒型T細胞誘導活性，可藉由誘導具人類MHC抗原之抗原呈現細胞(例如B淋巴球、巨噬體、及樹狀細胞)，或更具體而言，誘導人類末梢血液單核白血球來源之樹狀細胞，並以一個體之胜肽刺激後，與CD8陽性細胞混合，測定對於標靶細胞之細胞傷害活性而確認。反應系統，可利用以表現人類HLA抗原之方式所製作之基因轉殖動物(例如，BenMohamed L,et al.,(2000)Hum.Immunol.61(8)：764-79 Related Articles,Books,Linkout中所記載者)。例如，標靶細胞可利用51Cr等進行放射標記，細胞傷害活性可計算從標靶細胞放出之放射能量。或該標靶細胞，可藉由在具固定化胜肽之抗原呈現細胞存在下，測定由胞毒型T細胞產生及放出之IFN-γ，並
使用抗IFN-γ單株抗體將培養基上之IFN-γ產生區予以可見化來檢查。
如實施例所示，檢查胜肽之胞毒型T細胞之誘導活性，結果發現對於HLA抗原具高結合親和性之胜肽，不一定具高誘導活性。然而，含有CDCA1-1(YMMPVNSEV(序列編號：1))、CDCA1-4(KLATAQFK1(序列編號：2))所示胺基酸序列之胜肽，顯示尤高的胞毒型T細胞誘導活性。
如上所述，本發明提供具胞毒型T細胞之誘導活性的胜肽，亦即含序列編號：1或2之胺基酸序列或此等之變異體(亦即1個、2個、或數個胺基酸經取代、缺失、插入、及/或加成之胺基酸序列)的胜肽。含序列編號：1或2所示9個胺基酸的胜肽或此等之變異體，較佳為與其他內因性蛋白質的胺基酸序列不一致。尤其，藉由將N末端起第2位之胺基酸取代為白胺酸或甲硫胺酸，或/及將C末端胺基酸取代為纈胺酸或白胺酸，能得到具高HLA-2結合親和性的胜肽。
本發明之胜肽，只要不因改變而失去胞毒型T細胞之誘導活性，可包含像糖化、側鏈氧化或磷酸化的改變。其他改變例如使胜肽之血清半衰期增加之目的可使用的D-胺基酸或其他胺基酸類似物。
本發明之胜肽之取得‧製造方法不特別限定，可為化學合成胜肽，亦可為利用基因重組技術製作之重組胜肽任一者。
取得化學合成胜肽之情形，例如可依照Fmoc法(茀基
甲氧基羰基法)、tBoc法(第三丁氧基羰基法)等化學合成法而合成本發明之胜肽。又，可利用各種市售胜肽合成機器，而合成本發明之胜肽。
本發明之胜肽以重組蛋白質之形式產生時，可取得具編碼為該胜肽之鹼基序列的DNA，或其變異體或相同體，並導入適當表現系，以製造本發明之胜肽。
表現載體，較佳為使用在寄主細胞可自主複製，或可以併入寄主細胞之染色體中，在能表現編碼為胜肽之基因的位置，含有啟動子者。又，具編碼為本發明胜肽之基因的轉形體，可藉由將上述表現載體導入寄主而製作。寄主可為細菌、酵母、動物細胞、昆蟲細胞其中之一，又，表現載體對寄主之導入，可利用因應各寄主之公知手法實施即可。
本發明中，將如上所述製作之轉形體培養，並使培養物中產生堆積本發明之胜肽，藉由從該培養物採取本發明之胜肽，可以將重組胜肽離析。
轉形體為大腸菌等原核生物、酵母菌等真核生物時，培養該等微生物之培養基，只要是含該微生物能同化之碳源、氮源、無機鹽類等，且可有效率進行轉形體培養之培養基即可，可為天然培養基、合成培養基任一者。又，培養條件可以使用通常培養該微生物的條件。培養後，從轉形體之培養物將本發明之胜肽離析精製，使用通常胜肽之離析、精製法即可。
又，序列編號1或2之胺基酸序列中有1個、2個或
數個胺基酸經取代或加成之胺基酸序列所構成之胜肽，依據編碼為序列編號1或2之胺基酸序列的DNA序列的鹼基序列資訊，只要是該技術領域之人士，均能適當製造或取得。亦即，編碼為由序列編號1或2之胺基酸序列中，1個、2個或數個胺基酸經取代、缺失、插入、及/或加成之胺基酸序列所構成，具胞毒型T細胞之誘導活性之胜肽的基因，可利用化學合成、基因工程的手法或突變誘發等該技術領域之人士已知的任意方法製作。例如，為基因工程手法之一的點專一性變異誘發法，因為是能在特定位置導入特定變異之方法，故為有用，可依Molecular Cloning：A laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY.,1989(以下簡稱Molecular Cloning第2版)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1~38,John Wiley & Sons(1987-1997)(以下，簡稱Current Protocols in Molecular Biology)等記載之方法實施。
上述本發明之胜肽，如後述實施例亦顯示者，能誘導對抗癌症之免疫。因此，依照本發明，提供含本發明之胜肽之對抗癌症之免疫誘導劑。
本發明之免疫誘導劑，亦可製備成2種以上之抗原決定基胜肽組合之混合劑。組合了多數種類胜肽之免疫誘導劑，可為混合物(cocktail)，亦可為使用標準技術彼此結合者。組合抗原決定基胜肽，可為具同一基因來源之不同胺基酸序列的胜肽或不同基因來源之胺基酸序列的胜肽。
若投予本發明胜肽，則所投予之胜肽在抗原呈現細胞之HLA抗原上以高密度呈現，接著，誘導出對於在所投予之胜肽與HLA抗原之間所形成的複合體具專一性地反應的胞毒型T細胞。或者，藉使從受測體採取之樹狀細胞與本發明胜肽接觸(或使從受測體攝入之樹狀細胞帶有本發明之胜肽)，可得到將本發明之胜肽呈現在細胞表面上之抗原呈現細胞。藉由對於各受測體再次投予該等抗原呈現細胞，於受測者體內誘導胞毒型T細胞，其結果能使得對於呈現本發明胜肽之標靶細胞的免疫回應增強。
本發明之對抗癌症之免疫誘導劑，藉由在體外或體內使用，較佳為在體外使用，能夠誘導輔助T細胞、胞毒型T細胞，或含該等輔助T細胞、胞毒型T細胞之免疫細胞群體，藉此能賦予對抗癌症之免疫。
(2)本發明之癌症治療及/或預防用的藥劑(癌症疫苗)
實施例中顯示，本發明之胜肽在活體內能誘導癌細胞專一性胞毒型T細胞。再者，之前的發明顯示CDCA1在肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性骨髓性白血病、惡性淋巴腫瘤、子宮頸癌、骨肉腫瘤、乳癌、軟組織肉瘤、大腸癌中等大部分症例中為高度表現。因此，含本發明胜肽1種以上作為有效成分之免疫誘導劑，能期待作為癌症治療，及/或預防劑之效果。亦即，將本發明之胜肽與適當佐劑一起，或將胜肽負荷於樹狀細胞等抗原呈現細胞後，注入體內，能將腫瘤攻撃性胞毒型T細胞誘導及活化，結果能期待抗腫瘤效果。又，將編碼為本發明胜
肽之基因併入適當載體，並以此重組DNA轉形之人類之抗原呈現細胞(樹狀細胞等)、BCG結核菌等細菌，或將編碼為本發明胜肽之DNA併入基因體之牛痘(vaccinia)病毒等病毒，可有效利用在人類癌症之治療‧預防用活疫苗。又，癌症疫苗之投予量及投予法，與通常之種痘或BCG疫苗為同樣。
在本發明中，「疫苗」之用語(亦稱為免疫原性組成物)，意指藉對於動物接種，而誘導抗腫瘤免疫或抑制各種癌症之物質。依照本發明，含序列編號：1或2之胺基酸序列的胜肽，暗示為能對於呈現CDCA1之細胞誘導強力且專一性免疫回應之HLA-A2限制性抗原決定基胜肽。因此，本發明尚包含使用含序列編號1或2之胺基酸序列或此等之變異體(亦即，含1個、2個或數個胺基酸之取代、除去或加成)之胜肽誘導抗腫瘤免疫之方法。一般而言，抗腫瘤免疫包含如以下之免疫回應：(1)誘導胞毒型T細胞，該胞毒型T細胞對抗含表現CDCA1之細胞的腫瘤，(2)誘導抗體，該抗體識別表現CDCA1之細胞的腫瘤，(3)誘導抗腫瘤性細胞介素產生。
將特定胜肽藉由對動物接觸而誘導該等免疫回應其中任一時，判定該胜肽具抗腫瘤免疫誘導效果。利用胜肽之抗腫瘤免疫誘導，可利用在體內或體外觀察寄主中免疫系對於胜肽之回應而檢測。
例如，為了檢測胞毒型T細胞之誘導的方法為周知。
入侵活體之異物，由於抗原呈現細胞(APC)之作用，向T細胞及B細胞呈現。以抗原專一性的樣式對於抗原呈現細胞所呈現之抗原予以回應之T細胞，藉著抗原刺激，分化為胞毒型T細胞(亦稱胞毒型T淋巴球或CTL)，之後增殖；此過程在本說明書中，稱為T細胞之「活化」。利用特定胜肽之胞毒型T細胞誘導，可藉由帶有胜肽之抗原呈現細胞，將胜肽向T細胞呈現，並檢測胞毒型T細胞之誘導而評價。再者，抗原呈現細胞’具活化CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、巨噬體、嗜酸球及NK細胞之效果。CD4+ T細胞亦在抗腫瘤免疫中為重要，因此，胜肽之抗腫瘤免疫誘導作用，可將該等細胞之活化效果作為指標予以評價。
用於評價使用樹狀細胞(DC)作為抗原呈現細胞而誘導胞毒型T細胞之誘導作用的方法，在該技術領域為周知。DC在抗原呈現細胞中具最強之胞毒型T細胞誘導作用。該方法之中，最初使試驗胜肽與DC接觸之後，使該DC與T細胞接觸。關於與DC接觸之T細胞，係檢測對於標靶細胞具細胞傷害性效果之T細胞。該T細胞對標靶細胞呈現細胞傷害活性，亦即試驗胜肽顯示具誘導細胞傷害性T細胞之活性。對於標靶細胞例如腫瘤之胞毒型T細胞之活性，例如可使用51Cr標記腫瘤細胞之溶解作為指標檢測。或，可以用3H-胸腺嘧啶攝入活性或LDH(乳糖去氫激酶)放出作為指標，來評價腫瘤細胞損傷程度。
利用該等方法確認具胞毒型T細胞誘導活性的試驗胜肽，為具DC活化效果及之後之胞毒型T細胞誘導活性的胜
肽。也因此，對抗腫瘤細胞而誘導胞毒型T細胞之胜肽，作為對於呈現CDCA1之癌症的疫苗為有用。再者，藉由與胜肽接觸而獲得對於癌症具胞毒型T細胞誘導能力之抗原呈現細胞，作為對抗癌症之疫苗為有用。再者，利用抗原呈現細胞之胜肽呈現而獲得細胞傷害性之胞毒型T細胞，尚能利用作為對抗提示CDCA1之癌症的疫苗。利用抗原呈現細胞及胞毒型T細胞之抗腫瘤免疫之癌症治療方法，稱為細胞免疫療法。
一般而言，為了細胞免疫療法使用胜肽時，能藉由將具不同構造之多數胜肽組合，而使胞毒型T細胞誘導之效率增加。因此，以蛋白質片段進行DC刺激時，使用多數胜肽片段之混合物為有利。
利用胜肽進行抗腫瘤免疫之誘導，尚能藉由觀察對抗腫瘤之抗體產生誘導而進行評價。例如，對抗胜肽之抗體，於經胜肽免疫之實驗動物被誘導時，及腫瘤細胞之成長、增殖、及/或轉移受到此等抗體所抑制時，則判定胜肽誘導抗腫瘤免疫。
抗腫瘤免疫可藉由投予本發明之疫苗而誘導抗腫瘤免疫，能治療及預防癌症。對於癌症之治療或癌症發病預防之效果，可包含癌細胞成長抑制、癌細胞之退縮、及癌細胞之發生之抑制。具癌症個體之死亡率減少、血液中癌症標記減少、伴隨癌可檢測症狀之減輕等，亦包含在癌症治療或預防之效果內。如此種治療或預防效果，相較於未投予疫苗之對照組，疫苗對於癌症之治療或預防效果在統計
學為顯著，例如5%或觀察到低於5%之顯著水平較佳。統計學手法，例如Student－t檢定、Mann－Whitney U檢定、或ANOVA，可用在決定統計學之顯著性。
本發明中，受測體較佳為哺乳動物。例示的哺乳動物不限定，例如包含人類、非人類靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、或牛。
本發明之胜肽可於體內或體外(ex vivo)對於受測體投予。又，為了製造治療或預防癌症用之免疫原性組成物，可以使用本發明之免疫原性胜肽，亦即序列編號：1或2之胺基酸序列或此等之變異體胜肽選出之九胜肽。
更具體而言，本發明提供含有1種以上本發明之胜肽作為有效成分，用於治療腫瘤、或預防腫瘤增殖、轉移等之藥劑。本發明之胜肽，尤其在像肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性骨髓性白血病、惡性淋巴腫瘤、子宮頸癌、骨肉腫瘤、乳癌、軟組織肉瘤、大腸癌之腫瘤治療為有用。
本發明之胜肽可藉由通常製劑方法製劑為藥劑，而對於受測體直接投予。如此種製劑，除了本發明胜肽以外，亦可視需要包含藥學上可容許之擔體、賦形劑等。本發明之藥劑(免疫原性組成物)，可用在各種腫瘤之治療及/或預防。
再者，為了有效確立細胞性免疫，可在包含1種以上本發明胜肽作為有效成分之腫瘤處置及/或預防用藥劑中混合佐劑。或者，可以將該組成物與如抗腫瘤劑的其他活
性成分一起投予。適當製劑亦包含顆粒。適當佐劑，記載於文獻(Johnson AG.(1994)Clin.Microbiol.Rev.,7：277－89)。例示的佐劑，包含佛洛依德之不完全佐劑、BCG、海藻糖黴菌酸酯(trehalose
dimycolate，簡稱TDM)、脂多糖(LPS)、明礬佐劑、氧化矽佐劑、磷酸鋁、氫氧化鋁、及明礬，但不限於此。再者、微脂體製劑、藥物結合直徑數μm顆粒之顆粒製劑、及脂質結合於前述胜肽之製劑，可以便利地使用。投予方法可為經口投予、皮內注射、皮下注射、靜脈內注射等，包含在全身投予或標靶腫瘤附近局部投予。
本發明胜肽之用量，可視待處置之疾病、患者年齡、體重、投予方法等適當調整。用量，普通為0.001mg~1000mg、較佳為0.01mg~100mg、更佳為0.1mg~10mg，較佳為數日投予1次至數月投予1次，該技術領域之人士可輕易地選擇適當用量及投予方法，該等參數之選擇及最適化，為充分通常之技術範圍內。製劑形態亦不特別限定，可為凍結乾燥者，或加入糖等賦形劑而使顆粒化者。
可添加在本發明藥劑之用於提高腫瘤反應性T細胞誘導活性的輔助劑，例如：胞壁醯雙肽(muramyl dipeptide，簡稱MDP)以外之BCG菌等菌體成分、Nature,vol.344,p873(1990)所記載之ISCOM、J.Immunol.vol.148,p1438(1992)所記載之皂苷系之QS－21、微脂體、氫氧化鋁等。又，香菇多醣(Lentinan)、西佐糖(Sizofiran)、Picibanil等免疫活化劑亦可作為輔助劑使用。又，IL－2、
IL-4、IL-12、IL-1、IL-6、TNF等增強T細胞之增殖、分化之細胞介素等，及活化NKT細胞之α半乳糖神經醯胺脂(galactosylceramide)或結合於類Toll受體而活化自然免疫系之CpG、脂多糖(LPS)等，亦可作為輔助劑使用。
本發明之疫苗組成物，包含將胞毒型T細胞進行首次抗原刺激之成分。脂質在活體內被鑑別為對抗病毒抗原而首次抗原刺激的物質。例如棕櫚酸殘基與、離胺酸殘基之ε-胺基及α-胺基結合，之後可與本發明之免疫原性胜肽連結。將脂質化胜肽注入膠束或粒子並包裝在微脂體，或乳化於佐劑中其中任一方式，可直接投予。脂質首次抗原刺激之又一例，於對於適當胜肽共價結合時，可以利用像三棕櫚醯基-S-甘胺醯基半胱胺醯絲胺醯基-絲胺酸(P3CSS)之大腸菌(E.coli)脂蛋白質進行首次抗原刺激(Deres K,et al.,(1989)Nature 342：561-4)。
本發明之免疫原性胜肽，尚可藉由病毒載體或細菌載體表現。適當表現載體之例，包含牛痘或雞痘之弱毒性病毒寄主。例如、可以使用牛痘病毒作為表現編碼為胜肽之核苷酸序列的載體。藉由將寄主細胞導入經重組的牛痘病毒，使免疫原性胜肽表現，並藉此誘導免疫回應。使用牛痘病毒載體之免疫化方法，例如記載於美國專利第4,722,848號。再者，亦可使用BCG(Bacille Calmette Guerin))。BCG載體，記載於Stover CK,et al.,(1991)Nature 31：456-60。治療投予或免疫化有用的廣泛種類的其他載體，例如腺病毒及腺病毒伴隨病毒載體、反轉錄病
毒載體、傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhi)載體、解毒化炭疽毒素載體等，在該技術領域中為公知。例如，參照Shata MT,et al.,(2000)Mol.Med.Today 6：66-71；Shedlock DJ and Weiner DB.,et al.,(2000)J.Leukoc.Biol.68：793-806；及Hipp JD,et al.,(2000)In Vivo 14：571-85。
又，對於從患者採取之細胞或共有一部分HLA等位基因之其他人(異體)細胞中，在試管內加入該抗原胜肽，進行抗原程現後，對於患者血管內或腫瘤局部等投予，亦能在患者體內有效誘導胞毒型T細胞。又，亦可藉由在患者末梢血液淋巴球中，在試管內加入該胜肽並培養，於試管內誘導胞毒型T細胞後，對於患者血管內或腫瘤局部等投予。像此種細胞移入的治療，已實施作為癌症治療法，在該技術領域之人士間，為充分知悉的方法。
本發明之中，癌症種類不特別限定，具體例例如：肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性骨髓性白血病、惡性淋巴腫瘤、子宮頸癌、骨肉腫瘤、乳癌、軟組織肉瘤、大腸癌等。適於應用本發明之癌症例，例如肺癌。
(3)本發明之抗體
本發明亦關於將上述本發明胜肽之一部分或全部作為抗原決定基(抗原)識別之抗體、及使用該蛋白質或胜肽在體外刺激所誘導之胞毒型T細胞。一般而言，胞毒型T細胞較抗體顯示更強的抗腫瘤活性。
又，本發明之抗體，與本發明胜肽同樣地，只要能抑制癌抗原CDCA1之活性，則作為表現CDCA1之癌症之預防及/或治療劑為有用。實際使用法，可以將本發明之胜肽或抗體直接，或與醫藥上可容許之擔體及/或稀釋劑一同，視需要尚加入輔助劑，以注射劑之形式投予，亦可以噴霧等方法從黏膜以經皮吸收等方式投予。又，此處所述擔體，為例如：人類血清白蛋白，又稀釋劑，例如：PBS、蒸餾水等。
本發明之抗體可為多株抗體亦可為單株抗體，其製作可利用該技術領域之人士公知方法實行。
例如，多株抗體可藉由將本發明之胜肽作為抗原將哺乳動物或鳥類進行免疫感作，從該哺乳動物或鳥類採取血液，並從採取之血液將抗體分離、精製而得到。例如可對於小鼠、倉鼠、天竺鼠、雞、大鼠、兔、犬、山羊、綿羊、牛等哺乳動物或鳥類進行免疫。免疫感作之方法為該技術領域之人士所公知，例如將抗原以7~30日間隔投予2~3次即可。投予量，每1次例如抗原約0.05~2mg左右。投予路徑亦不特別限定，可適當選擇皮下投予、皮內投予、腹膜腔內投予、靜脈內投予、肌肉內投予等。又，亦可將抗原溶解於適當緩衝液，例如含完全佛洛依德佐劑或氫氧化鋁等通常使用之佐劑的緩衝液後使用。
將經免疫之哺乳動物或鳥類飼育一定期間後，若抗體價開始上升，可使用例如100 μ g~1000 μ g之抗原進行追加免疫。從最後投予起1~2個月後，從經免疫之哺乳動物或鳥類採曲血液，並將該血液進行例如離心分離、使用硫
酸銨或聚乙二醇沈澱、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和性層析等層析等常法，進行分離、精製，可得到多株抗血清形式之識別本發明胜肽的多株抗體。
另一方面，單株抗體可以製備融合瘤得到。例如，可藉由將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞株進行細胞融合，得融合瘤。產生本發明之單株抗體的融合瘤，可利用如以下細胞融合法得到。
抗體產生細胞，使用來自於經免疫動物之脾細胞、淋巴節細胞、B淋巴球等。抗原使用發明之胜肽。免疫動物可使用小鼠、大鼠等，對於該等動物投予抗原，依照常法實施。例如藉由將完全佛洛依德佐劑、不完全佛洛依德佐劑等佐劑與為抗原之本發明胜肽之懸浮液或乳化液，對於動物之靜脈、皮下、皮內、腹腔內等進行數次投予，而將動物免疫化。從經免疫化之動物取得作為抗體產生細胞之例如脾細胞，並與骨髓瘤細胞以公知方法(G.Kohler et al.,Nature,256 495(1975))融合，可製作融合瘤。
細胞融合使用之骨髓瘤細胞株，例如小鼠為P3 X 63Ag8、P3U1株、Sp2/0株等。細胞融合時，亦使用聚乙二醇、仙台病毒等融合促進劑，並且細胞融合後之融合瘤選擇，依常法使用次黃嘌呤．胺基喋呤．胸腺嘧啶(HAT)培養基。將細胞融合所得到之融合瘤，利用極限稀釋法等選殖。又，視需要可使用本發明胜肽之酵素免疫測定法進行篩選，得到單株抗體產生細胞株，其單株抗體能夠專一性地識別本發明胜肽。
上述方法以外，可藉由將EB病毒感染淋巴球等人類淋巴球，使用本發明之胜肽、表現胜肽之細胞、或此等之溶解物，在體外刺激，來調節免疫化細胞。藉將此經免疫化之淋巴球與U266等人類來源之骨髓細胞融合，亦可得到與本發明之胜肽結合之人類抗體(日本特開昭63－17688號)。
從依此方式得到之融合瘤製造目的單株抗體，可利用通常之細胞培養法或腹水形成法培養該融合瘤，並從培養上清或腹水精製該單株抗體即可。從培養上清或腹水精製單株抗體，可利用常法進行。例如，可將硫安區分、凝膠過濾、離子交換層析、親和性層析等適當組合使用。
再者，可利用本發明之胜肽、表現胜肽之細胞、或此等之溶解物，將具人類抗體基因群之基因轉殖動物免疫化。從經免疫化基因轉殖動物採取抗體產生細胞，並使與上述骨髓瘤細胞株融合，得到融合瘤，從該融合瘤可製造目的單株抗體(WO92－03918、WO94－02602、WO94－25585、WO94－33735、WO96－34096)。
或，亦可將免疫化淋巴球等產生抗體之免疫細胞利用癌症基因使不死化，並用於單株抗體製備。
依此方式得到之單株抗體，亦可使用基因操作技術製備(Borrbaeck and Larrick,(1990)Therapeutic Monoclonal Antibodies)。例如，從融合瘤或免疫化淋巴球等抗體產生細胞選殖編碼為抗體之DNA，並且插入適當載體後，導入寄主細胞，可製備重組抗體。
又，本發明之抗體，只要結合於本發明之胜肽，則可為抗體之片段或修飾抗體。抗體片段，可為Fab、F(ab’)2、Fv、或H及L鏈來源之Fv片段利用適當連結子連結之單鏈Fv(scFv)(Huston et al.,(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：5879－83)。更具體而言，可將抗體以木瓜酵素或胰蛋白酶等酵素處理，而製備成抗體片段(Co et al.,(1994)J Immunol 152：2968－76、Better and Horwitz,(1989)Methods Enzymol 178：476－96、Pluckthun and Skerra,(1989)Methods Emzymol 178：497－515、Lamoyi(1986)Methods Enzymol 121：652－63、Rousseaux et al.,(1986 Methods Enzymol 121：663－9、Bird and Walker,(1991)Trends Biotech 9：132－7)。
本發明之抗體，包含使與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合得到之修飾抗體。抗體之修飾，可利用該技術領域慣用之化學修飾方法進行。
本發明之抗體，尚包含具非人類抗體來源之可變區域與人類抗體來源之不變區域的嵌合抗體，或具非人類抗體來源之互補性決定區域(CDR)及人類抗體來源之框架區域(FR)及人類抗體來源之不變區域的人類化抗體。此種抗體，可利用該技術領域慣用之方法製備。人類化抗體，可藉由將人類抗體之CDR序列區域取代為具所望結合活性之囓齒類之CDR區域而得到(Verhoeyen et al.,(1988)Science 239：1534－6)。因此，人類化抗體，相較於嵌合抗體，為將人類抗體之較狹小區域取代為非人類來源之對應
區域的抗體。
亦可製作除了人類框架區域及不變區域以外尚具人類可變區域之完全人類抗體。例如，於體外法，可使用使噬菌體上呈現人類抗體片段之重組庫進行篩選(Hoogenboom and Winter,(1992)J Mol Biol 227：381－8)。同樣地，可藉由對於將內因性免疫球蛋白基因部分或完全不活化之基因轉殖動物導入人類免疫球蛋白座位，以製作人類抗體(美國專利第6,150,584號、第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號)。
如上所述得到之抗體，可利用該技術領域中慣例方法精製成達均勻之程度。例如可使用一般的蛋白質分離．精製方法。可藉組合親和性層析等管柱層析、過濾膜、超過濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等，能將抗體分離、精製，但不限於該等方法(Antibodies：A Laboratory Manual,Ed Harlow and David Lane,(1988)Cold Spring Harbor Laboratory)。親和性管柱，例如可使用蛋白質A管柱及蛋白質G管柱。蛋白質A管柱，包含例如：D、POROS、及Sepharose F.F(Pharmacia)。
親和性層析以外之層析，例如包含：離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.et al.)。層析亦可利用HPLC及FPLC等液層層析實施。
為了測定本發明之抗體之抗原結合性，例如可使用吸光度測定、酵素結合免疫吸附分析(ELISA)、酵素免疫分析法(EIA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫螢光檢查法，但不限於該等。ELISA之情形，將本發明之抗體固定化在平盤上，添加本發明胜肽，其次添加含抗體產生細胞之培養上清或精製抗體之試樣。接著，識別經測定抗原結合性之抗體，並添加具可檢測標記之二次抗體。洗滌平盤後，添加用於檢測二次抗體之標記的試藥，並測定吸光度等。例如，二次抗體之標記可使用鹼性磷解酶等酵素，用於檢測之試藥可使用對硝基苯基磷酸等酵素基質。又，抗體之活性評價亦可使用BIAcore(Pharmacia)。
本發明之抗體，可以檢測樣本中所含本發明之胜肽。亦即，藉由將本發明之抗體例如暴露在癌組織活檢體，能確認癌組織中本發明胜肽之存在。
使用本發明之胜肽進行治療及/或預防癌症之處置前，藉由使用本發明之抗體確認治療個體癌症正表現本發明之胜肽，能夠在治療開始以前預測可期待此受試個體的效果。
再者。本發明之抗體，由於識別在多種癌細胞中表現亢進之CDCA1的胜肽片段，故不僅診斷，在治療方面的應用亦受期待。
(4)輔助T細胞、胞毒型T細胞、或含該等之免疫細胞群體
本發明尚關於使用本發明之胜肽利用體外刺激所誘導
之輔助T細胞、胞毒型T細胞、或含該等之免疫細胞群體。例如，將末梢血液淋巴球或腫瘤浸潤淋巴球使用為本發明之胜肽，於體外進行刺激，則腫瘤反應性活化T細胞受到誘導，該經活化之T細胞能有效用在授受免疫療法。又，使本發明之胜肽負載於為強力抗原呈現細胞之樹狀細胞，或藉基因導入使表現本發明之胜肽，並使用該等於體內或體外刺激T細胞，能誘導抗腫瘤免疫回應。
較佳為，使用本發明之胜肽及免疫活化劑進行體外刺激，能誘導輔助T細胞、胞毒型T細胞、或含該等之免疫細胞群體。此處使用之免疫活化劑，例如細胞增殖因子或細胞介素等。
藉由將如上所述得到之輔助T細胞、胞毒型T細胞、或含該等之免疫細胞群體移入體內，能抑制腫瘤，可預防及/或治療癌症。
又，藉由使用本發明之胜肽，如上述能製作可抑制腫瘤之輔助T細胞、胞毒型T細胞、或含該等之免疫細胞群體。因此依照本發明，提供含本發明胜肽之細胞培養液。藉使用此細胞培養液，能製作可抑制腫瘤之輔助T細胞、胞毒型T細胞、或含該等之免疫細胞群體。再者，依照本發明，尚提供一種細胞培養套組，包含上述細胞培養液及細胞培養容器，用於製作輔助T細胞、胞毒型T細胞、或含該等之免疫細胞群體。
(5)呈現抗原之外吐小體
本發明尚提供稱為外吐小體之細胞內小胞器，將本發
明之胜肽與HLA抗原之間所形成之複合體呈現在其表面上。外吐小體可藉由例如日本平11-510507號及日本2000-512161號公開之日文翻譯詳細記載之方法製備，較佳為使用從用以治療及/或預防之標靶受測體得到之抗原呈現細胞製備。本發明之外吐小體，與本發明之胜肽同樣，可作為癌症疫苗接種。
本發明中使用之HLA抗原型，必需與處置及/或預防所必要之受測體之HLA抗原型為一致。例如HLA-A2，較佳為HLA-A2(HLA-A*0201)。HLA-A*0201中，「HLA-A2」代表蛋白質，「HLA-A*0201」代表將該蛋白質細分化之基因(現在，因沒有表示經細分化蛋白質之記號，故如上所述記載)。
(6)抗原呈現細胞、胞毒型T細胞之誘導方法
本發明提供使用本發明之1或多數胜肽來誘導抗原呈現細胞之方法。在從末梢血液單核球誘導出之樹狀細胞上帶有本發明之1或多數胜肽，藉刺激能誘導抗原呈現細胞。將本發明之胜肽對受測體投予時，可在受測體之活體內誘導細胞表面上呈現有本發明胜肽之抗原呈現細胞。或，可使用體外法(ex vivo)，使本發明之胜肽與抗原呈現細胞接觸後(或將本發明之胜肽負荷於抗原呈現細胞後)，以該細胞作為疫苗，對於受測體投予。例如，體外法(ex vivo)投予可包含以下步驟：(1)從受測體收集抗原呈現細胞，及(2)使步驟(1)之抗原呈現細胞與本發明之胜肽接觸(或使步驟(1)之抗原呈現細胞上帶有本發明之胜肽)。
由步驟(2)得到之抗原呈現細胞，可以作為疫苗對受測體投予。
本發明尚提供一種用於誘導帶有高水平胞毒型T細胞誘導活性之抗原呈現細胞的方法。該方法包含於體外，將含編碼為本發明之1或多數胜肽之聚核苷酸的基因導入抗原呈現細胞之步驟。導入之基因，可為DNA或RNA。導入方法，可適當使用例如脂染法(lipofection)、電穿孔法，及磷酸鈣法般之該領域通常實行之各樣方法，但不限該等。更具體而言轉染可以Reeves ME,et al.,(1996)Cancer Res.,56：5672-7；Butterfield LH,et al.,(1998)J.Immunol.,161：5607-13；Boczkowski D,et al.,(1996)J Exp.Med.,184：465-72；國際公開第2000-509281號所公開之日文翻譯記載之方式實施。藉將基因移入抗原呈現細胞，基因在細胞中接受轉錄、轉譯等，之後，得到之蛋白質利用MHC第I類或第II類路徑加工處理，並通過抗原呈現路徑，而以部分胜肽之形式呈現在抗原呈現細胞表面。
本發明尚提供用於使用本發明之1或多數胜肽誘導胞毒型T細胞之方法。藉由將本發明之1或多數胜肽對於受測體投予，自受測體之活體內誘導胞毒型T細胞，能夠增強腫瘤組織之中以呈現CDCA1之癌細胞作為標靶之免疫系。或，使本發明之1或多數胜肽與受測體來源之抗原呈現細胞及CD8陽性細胞於體外接觸，再使末梢血液單核白血球與抗原呈現細胞於體外接觸、刺激，能誘導經活化之胞毒型T細胞。體外(ex vivo)治療法中，藉由使該經活化
之胞毒型T細胞返回受測體，能增強受測體之中以腫瘤組織中呈現CDCA1之癌細胞作為標靶之免疫系。例如，方法可包含以下步驟：(1)從受測體收集抗原呈現細胞，(2)使步驟(1)之抗原呈現細胞與本發明之胜肽接觸(或在步驟(1)之抗原呈現細胞上帶有本發明之胜肽)，(3)為了誘導胞毒型T細胞，使步驟(2)之抗原呈現細胞與CD8+ T細胞混合並共同培養，及(4)從步驟(3)之共同培養物收集CD8+ T細胞。
步驟(4)所得之具細胞傷害活性之CD8+ T細胞，可作為疫苗對於受測體投予。
本發明尚提供一種胞毒型T細胞，係使用本發明之1或多數胜肽所誘導、離析而得。本發明之方法所誘導之胞毒型T細胞，較佳為來自於處置及/或預防之標靶受測體。可以與含呈現本發明之1或多數胜肽之抗原呈現細胞或外吐小體之其他藥物組合投予。得到之胞毒型T細胞，對於呈現與誘導時使用之胜肽為相同胜肽的標靶細胞，具專一性。標靶細胞，為內因表現CDCA1之細胞，或經轉染CDCA1基因之細胞。利用本發明胜肽之刺激，而將本發明之胜肽呈現在細胞表面上之細胞，例如肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性骨髓性白血病、惡性淋巴腫瘤、子宮頸癌、骨肉腫瘤、乳癌、軟組織肉瘤、大腸癌等來源之癌細胞，能成為攻撃標靶。
(7)T細胞受體(TCR)
本發明尚提供一核酸及其使用法，該核酸編碼為形成識CDCA－1及CDCA－4之T細胞受體(TCR)之次單元之多胜肽。TCR由至少7個穿膜蛋白質構成。以雙硫鍵連結的(α、β)異二聚體形成clonotype抗原識別單位，另外，由ε、γ、δ、ξ及η鏈構成之CD3之非變異鏈，在信號傳遞路徑上結合到配體鍵，結果產生T細胞活化及細胞性免疫回應。以此方式負責識別抗原的α β次單元，對於使T細胞獲得識別特定標靶之專一性為必要的。
因此，為合成專一性識別本發明胜肽的TCR，使用本發明之胜肽所誘導之CTL來源的TCR次單元，即α及β之核酸序列，可利用該技術領域之人士所知的方法鑑別(WO2007/032255及Morgan et al.,J Immunol,171,3288(2003))。從鑑別的TCR次單元形成的TCR由於能結合於呈現CDCA1胜肽的標靶細胞，因此，藉由導入具殺細胞效果的細胞，能顯示其有用性。
因此，可將編碼為該TCR次單元之核酸併入適當載體(例如反轉錄病毒載體)。該載體為可利用該技術領域之人士已知的方法製作。併入有該TCR次單元的載體可用在導入T細胞。尤其，藉由將患者來源的T細胞轉形，可得到專一性識別CDCA1表現細胞並攻擊的T細胞(CTL)。以此方式得到之TCR導入CTL可以用一般方法培養並使增殖(Kawakami et al.,J.Immunol.,142,3452－3461(1989))。以上方法得到之CTL可以用在細胞免疫治療。
本發明尚提供一種抗原呈現細胞，其呈現在HLA抗原
與本發明之1或多數胜肽間的複合體。於本發明之1或多數胜肽或表現編碼為該種胜肽之核苷酸接觸的抗原呈現細胞，較佳為從處置及/或預防之個體受測體所採取之抗原呈現細胞。本發明之胜肽、呈現胜肽之抗原呈現細胞、外吐小體、或活性型胞毒型T細胞，可以與其他藥物組合而作為疫苗投予。
又，本說明書中引用的所有先前技術文獻，納入本說明書中作為參考。
以下實施例對本發明更進一步說明，但本發明不限於該等實施例。
將人類CDCA1之胺基酸序列以BIMAS系統檢索，從所推定與HLA-A2之結合親和性(binding affinity)以高至低的順序，選擇41種(表1)。
[表1-1]
[表1－2]
本發明所鑑別之HLA-A2限制性胞毒型T細胞抗原決定基，以底線表示。
使用先前報告之方法(Komori H等人，Clinical Cancer Research 12：2689-2697,2006)，首先從HLA-A2基因轉殖小鼠之骨髓細胞誘導樹狀細胞(DC)。於此方式得到之BM-DC中，添加CDCA1胜肽(10μM)，並以每隻HLA-A2基因轉殖小鼠5×105之個數，對腹腔內投予。隔1週間隔，同樣投予2次，將小鼠免疫後，回收小鼠脾細胞，用於胞毒型T細胞之檢測。為了嚴格探討CD8+ T細胞來源之胞毒型T細胞之誘導，採取脾臟後，使用從脾細胞以MACS顆粒除去CD4+ T細胞者。
圖1A顯示，於HLA-A2基因轉殖小鼠中，直到識別HLA-A2限制性胞毒型T細胞之CDCA1胜肽決定為止的實驗
步驟。(從經免疫之小鼠回收脾細胞之日，定為Day0)
Day-21(1)在HLA-A2基因轉殖小鼠之骨髓細胞中加入GM-CSF，開始誘導骨髓來源之樹狀細胞(以下BM-DC)。
Day-14(2)於經誘導之BM-DC中添加4種CDCA1胜肽之混合物，2小時後以每隻5×105個對腹腔內進行投予。
每週重複(1)、(2)步驟2次。
Day 0將經免疫之HLA-A2基因轉殖小鼠之脾細胞回收，再將BM-DC與CDH3胜肽溫育2小時者共同培養後，培養6日。
Day 6為了檢測專一性地識別CDCA1胜肽之胞毒型T細胞，於抗原刺激後，將產生γ干擾素(INF-γ)之T細胞，利用ELISPOT法進行定量。就標靶細胞而言，使用在BM-DC負荷及未負荷CDCA1胜肽者。
利用ELISPOT法探討CDCA1專一性胞毒型T細胞活性
利用ELISPOT法，檢測於該等誘導之胞毒型T細胞之中，是否存在確實與CDCA1專一性地反應而產生IFN-γ者。IFN-γ之檢測，使用Mouse IFN-γ ELISPOT set(BD公司)進行。若胞毒型T細胞(效應子)對於刺激細胞(標靶)反應並產生IFN-γ，則各檢測到為紅點。標靶細胞，使用HLA-A2陽性且不表現CDCA-1之T2A2細胞，及帶有CDCA1胜肽之T2A2細胞。T2A2細胞係在TAP基因表現缺損的小鼠T2細胞株，導入有HLA-A2之細胞株。從理研細胞庫購入。此細胞，由於TAP缺損，僅在從外部添加之胜肽具與HLA-A2分子結合之性質時，方將HLA-A2分子與胜肽之複
合體表現在細胞表面。首先，將抗小鼠IFN-γ抗體於ELISPOT平盤(BD Bioscience公司)進行18小時包覆。之後，以10%FCS/RPMI進行2小時阻斷。將效應子細胞(100μL/well)與標靶細胞(100μL/well)混合，於37℃培養22小時。效應子/標靶比(E/T比)，以5：1進行實驗。之後，將平盤以滅菌水洗滌，與生物素化抗小鼠IFN-γ抗體反應2小時，再與鏈黴親和素(streptavidin)-HRP反應1小時，於基質溶液中檢測IFN-γ陽性之點。點計數，使用MINERVA TECH公司自動解析軟體進行。胜肽No.1~20之結果如圖1B所示。利用同樣的實驗，在41個胜肽之中，以CDCA165-73(No.1)(序列編號：1)、CDCA1351-359(No.4)(序列編號：2)胜肽所誘導之胞毒型T細胞中，觀察到CDCA1專一性殺手細胞之免疫回應(圖2)。
以CDCA165-73(No.1)(序列編號：1)胜肽所誘導之胞毒型T細胞的解析結果如圖2A所示，以CDCA1351-359(No.4)(序列編號：2)胜肽所誘導之殺手細胞之解析結果如圖2B所示。
NSCLC患者來源之血液試樣，係得到告知後同意之後，從日常診斷得到。CDCA1陰性人類大腸癌細胞株COL0201由健康科學研究資源庫提供。此等試樣之中，HLA-A2表現係使用HLA-A2單株抗體BB7.2(One Lambda Inc.,Canoga Park,CA)，以流動細胞計數器確認。
導入慢病毒(Lentivirus)基因。
經由慢病毒載體之基因導入，使用記述於Tahara－hanaoka S,et al.Exp Hematol 2002；30：11－7之方法。簡言之，使用17 μ g之含CDCA1 cDNA的CSII－CMV－RfA與CSIIEF－RfA自體不活化載體(Miyoshi H,et al.J Virol 1998；72：8150－7)及10 μ g的pCMV－VSV－G－RSV－Rev及pHIVgp在293T細胞(Lipofectamine 2000(Invitrogen corporation,Carlsbad,CA,USA)，在10cm培養皿上轉形，60小時後，回收培養液，將病毒粒子以超離心(50,000xg，2小時)丸粒化。將此丸粒懸浮於RPMI 1640溶液，將10 μ l的病毒懸浮液，加入已裝有5x104
個的COLO201的U底96井盤的各井中。經轉形的CDCA1基因的表現，以西方墨點法確認。
CDCA1反應性人類CTL之誘導
將單核球來源之DC細胞作為抗原呈現細胞，誘導對於HLA呈現胜肽應答之CTL。DC以先前報告之體外方法(Suda T,et al.Cancer Sci 2007.,Nakahara S.et al.Cancer Res 2003；63：4112－8)得到。簡言之，將HLA－A*0201陽性健康正常自願者或NSCLC患者使用Ficoll plaque溶液(GE Healthcare UK Ltd.,Buckingham，UK)，從單離的末稍血單核球(PMBC)使用微顆粒(Miltenyi Biotec.Bergisch Gladbach,Germany)，選別CD8陽性CD14陽性的集團。為得到DC，將CD14陽性集團於含2%自體血漿之AIM－V(Invitrogen)中，於100ng/ml之顆粒球－巨噬體群落
刺激因子(GM－CDF)與10ng/ml介白素(IL)－4(PeproTec Inc.,紐澤西州，美國)存在下進行培養。培養4日後，為配製成熟DC，將OK－432加入培養皿中。細胞激素誘導DC之培養開始5日後，將20 μ g/mL之HLA－A2結合性胜肽，於4 μ g/mL之β 2－微球蛋白(Sigma－Aldrich，聖路易，密蘇里州，美國)存在下，於37℃、2小時使負荷於AIM－V中。將該等胜肽負載於DC，施以放射線照射(3,500cGy)，以1：50的比例使用抗CD8微顆粒(Miltenyi Biotec)，與從PMBC得到之自體CD8陽性T細胞混合。培養以48井盤進行，各井調整為在0.5mL之含2%自體血漿之AIM中，有1x104
個帶有胜肽的DC、5x105
個CD陽性T細胞及10ng/mL的人類IL－7(Wako，大阪，日本)的條件。培養3日後，加入人類IL－2(PeproTec Inc.)使成為20IU/mL的濃度。於第12日及第19日，再將T細胞以胜肽負荷自體DC刺激。DC適當以上法製備。CTL之抗原專一性回應，於第25日之第3次胜肽刺激後6日，以IFN－γ．ELISPOT法及鉻(Cr)放出試驗評價。
對於標靶細胞之CTL回應
CTL與作為標靶細胞之各癌細胞株或帶有或無帶有胜肽之T2細胞，以各效應子細胞/標靶細胞比共同培養。51
Cr放出試驗及IFN－γ．ELISPOT法以習知方法(Komori H,et al.Clin Cancer Res 2006；12：2689－97.,Makita M,et al.Clin Cancer Res 2002；8：2626－31.,Yokomine K et al,Cancer Sci 2007；98：1930－5.)進行。簡言之，將標靶細胞
使用3.7KBq Na2 51
Cr4
(Perkin Elmer Life Sciences)，於37℃、於CO2
培養箱中花費1小時進行標記。沖洗經標記的標靶細胞3次，於37℃，與20 μ g/ml的胜肽一起溫育3小時，以製備帶有胜肽之標靶細胞。將標靶細胞與效應子細胞混合，使在平底微滴定盤的用量成為200 μ l，並且溫育。溫育6小時後，從各井回收上清50 μ l，以蓋氏計數器定量放射線活性。專一性細胞傷害活性，以既有方法(Suda T,et al.,Cancer Sci 2007；98；1803－8)以專一性的51
Cr放出比例計算並且評價。ELISPOT法亦使用既存方法(Komori H,et al.Clin Cancer Res 2006；12：2689－97)進行。
從HLA－A2陽性健康正常捐出者來源之PMBC誘導CDCA1回應性CTL
從HLA－A2(A*0201)陽性健康正常捐出者，將PMBC單離，與CD8＋T細胞及帶有CDCA165－72
(No.1)(序列編號：1)胜肽或CDCA1351－359
(No.4)(序列編號：2)胜肽之單核球來源的DC共同培養，每週3次進行CD8＋T細胞之刺激(圖3A)。
將癌症患者或健康正常捐出者所誘導之CTL與標靶細胞共同培養，並以經帶有CDCA165－72
(No.1)(序列編號：1)胜肽或CDCA1351－359
(No.4)(序列編號：2)胜肽之T2細胞作為標靶，進行ELISPOT法及51
Cr放出試驗。如圖3B所示，癌症患者捐出者1中，以帶有CDCA165－72
(No.1)(序列編號：1)胜肽之T2刺激後CTL之的IFN－γ之產生，相較於未負荷的T2，顯著較多。從健康正常捐出者1誘導之CTL，對於經
帶有CDCA1351－359
(No.4)(序列編號：2)胜肽之T2細胞，產生多量的IFN－γ(每一井300點以上)(圖3C)。再者，癌症患者捐出者1及健康正常捐出者1來源的CTL，在51
Cr放出試驗，對於具有CDCA165－72
(No.1)(序列編號：1)胜肽或CDCA1351－359
(No.4)(序列編號：2)胜肽之T2細胞，顯示細胞傷害活性(圖3D)。如圖3E所示，若以帶有各濃度之CDCA1胜肽的T2細胞刺激CTL，則CTL會用量依存地，對於帶有CDCA1胜肽之T2細胞反應。相較於未有胜肽之T2細胞或帶有HLA－A2結合性之HIV來源胜肽的T2細胞的反應，可知CTL對於帶有0.2 μ g/ml以上濃度之胜肽的T2細胞反應並產生大量的IFN－γ。上述結果顯示，此等CTL具有對胜肽專一性的細胞傷害活性。
探討以導入有CDCA1之COL0201(COL0201/CDCA1、CDCA1＋、HLA－A2＋；圖4A)作為標靶細胞，CTL之CDCA1專一性免疫反應。如圖4B所示，相較於未表現CDCA1之COL0201/空載體導入細胞，以CDCA165－72
(No.1)(序列編號：1)胜肽刺激之健康正常捐出者來源的CTL對於COL0201/CDCA1產生多量IFN－γ。以CDCA1351－359
(No.4)(序列編號：2)胜肽刺激之健康正常捐出者來源的CTL，亦對於COL0201/CDCA1顯示專一性免疫反應(圖4C)。再者，該CTL對於PANC1細胞(CDCA1＋、HLA－A2＋)顯示免疫反應，對於A549細胞(CDCA1＋、HLA－2－)則無免疫反應(圖4D)。
CDCA1來源胜肽在癌症免疫療法之應用，可考慮：該等CDCA1胜肽回應性CTL對於內在表現CDCA1之腫瘤細胞顯
示專一性細胞傷害性，為最為重要者。如圖4E所示，癌症患者捐出者1中，從CDCA165－72
(No.1)(序列編號：1)胜肽得到之CDCA1反應性CTL，對於PANC1細胞(CDCA1＋、HLA－2＋)顯示細胞傷害活性，對於A549細胞或COL0201細胞(CDCA1＋、HLA－2－)不顯示。同樣地，從CDCA1351－359
(No.4)(序列編號：2)胜肽刺激之健康正常捐出者來源的CTL，亦對於PANC1細胞(CDCA1＋、HLA－2＋)顯示細胞傷害活性，對於A549細胞或COL0201細胞(CDCA1＋、HLA－2－)不顯示。該等結果，顯示該等胜肽在癌細胞中自然加工，與HLA－A2一起呈現在癌細胞表面，而可由CTL識別。
為檢測HLA－A2限制性CDCA1專一性CTL，從醫學生物學研究所(Medical&Biological Laboratories Co,Ltd.)(名古屋，日本)購入使CDCA1351－359
胜肽結合的PE標記HLA－A*0201四聚體。如圖4G所示，於CD8陽性T細胞中，可見到CDCA1351－359
胜肽反應性CTL與四聚體陽性CTL之間強烈相關。此結果證明：本研究使用之CD8陽性T細胞中，存在HLA－A2限制性CDCA1胜肽專一性CTL。
討論
自然加工並呈現於腫瘤細胞之TAA誘導胜肽的鑑定，對於依據胜肽之癌症免疫療法確立是重要的。使用NSCLC與正常組織之cDNA微陣列分析，鑑定出為新穎癌症睪丸抗原的CDCA1。CDCA1在NSCLC及正常睪丸強力表現，但是在檢查的其他正常組織中，未有mRNA與蛋白質一起表現。睪丸為從免疫系隔離的組織，因此CDCA1回應性CTL，被認
為僅會攻擊NSCLC。因此，NSCLC患者之免疫療法之中，選擇CDCA1作為TAA。
就免疫誘導治療之結果引起之癌細胞之免疫逃避，可使TAA之缺損、變異或表現降低之風險成為最小限而言，因此，希望就免疫療法之標靶而言，鑑定NSCLC之增殖或生存所必須的TAA(Yoshitake Y,et al.Clin Cancer Res 2004；10：6437－48.)。據報告：CDCA1之功能為紡錘體微小管與中心體之結合，在細胞週期維持有重要作用(DeLuca JG,et alk.J Cell Biol 2002；159：549－55)。再者，CDCA1尚在有絲分裂時，適當的染色體分離具重要作用，為跨種高度保守的核分裂週期(NDC)複合體之構成要素(DeLuca JG,et al.,Curr Biol 2003；13：2103－9)。CDCA1在Hela細胞中，中心體蛋白質E(CENP－E)之中心體局部分散所必要，利用SiRNA抑制CDCA1表現，會遮斷有絲分裂，造成異常的染色體分離，而接續引發細胞死亡(Liu D,et al.J Biol Chem 2007；282；21415－24.)。該從有絲分裂之異常逸脫，具細胞凋零及劇變(castatrophe)的特徵(DeLuca JG,et al.J Cell Biol 2002；159：549－55)。由以上，CDCA1為細胞機能所必需，在癌細胞之增殖及生存發揮重要作用。
再者，CDCA1與kinetochore associated2(KNT2)為進化中保守的中心體蛋白質複合體的一員(Hayama S,et al.Cancer Res 2006；66：10339－48)。其表現之上升利用免疫染色，已知參與與NSCLC患者之不良預後(Hayama S et al.Cancer Res 2006：66：10339－48)。因此，NSCLC組織
中，CDCA1之表現水平，為用以預測外科手術用之患者預後的有用標記。於NSCLC進行中，暗示CDCA1之參與。由以上，可認為：以CDCA1作為標靶之免疫療法，對於預後不良的NSCLC患者為有效。
本發明中，利用HLA－A2基因轉殖小鼠，鑑定出促進HLA－A2限制性小鼠CTL產生之2個HLA－A2限制性CDCA1抗原決定基胜肽。再者，CDCA1回應性CTL可在經刺激該等之胜肽的健康正常捐出者中，從PMBC製得。該等CDCA1胜肽專一性CTL株，以HLA－A2限制樣式，殺傷表現CDCA1之癌細胞(圖4)。
利用BIMAS軟體，選出預測對於HLA－A0201分子具高親和性的CDCA1來源胜肽，但是有一些胺基酸序列在人類與小鼠CDCA1並非保守的。於CDCA165－72
(No.1)胜肽中，人類與小鼠之間，有2個胺基酸序列不同(人：YMMPV
NS
EC/小鼠：YMMPMNIEV)，CDCA1351－359
(No.4)中，觀察到1個不同(人類KLATAQFKI/小鼠KLATAR
FKI)。但是，本發明中，確認從健康正常捐出者，誘導上述抗原決定基胜肽回應性CTL。
於體外使用CDCA1胜肽刺激健康正常捐出者之PMBC，誘導CDCA1回應性CTL。利用胜肽呈現DC所誘導的CTL，以HLA－A2限制性地對於CDCA表現癌細胞顯示細胞傷害活性。來自於健康正常捐出者之CDCA1專一性CTL之誘導，在進一步探求TAA方面，具有意義。再者，目前正在嘗試從NSCLC、小細胞癌、膽管細胞癌、膀胱癌及腎細胞癌之患者單離的PMBC，誘導CDCA1回應性CTL。有胜肽或蛋白
質之疫苗(Rosenberg SA,et al.Nat Med 1998；4；321-7.)、以帶有胜肽、蛋白質或腫瘤溶解物之樹狀細胞免疫(Kugler A,et al.Nat Med 2000；6：332-6)及體外(ex vivo)的腫瘤專一性CTL株，進行授受性移植等的一些細胞媒介癌症免疫療法(Falkenburg JH,et al.Blood 1999；94：1201-8)。本發明所鑑定之CDCA1胜肽被認為可以用在該等免疫療法。
使用本發明所鑑定之經由HLA-A2而對於胞毒型T細胞呈現之胜肽，若在探索醫療顯示癌症免疫療法之安全性與有效性，則可能在歐美白人亦能臨床應用。又，鑑定利用不僅是日本人，歐美白人中陽性者的頻度亦高的HLA-A2對於胞毒型T細胞呈現之胜肽，開發出可應用在日本人及歐美白人之肺癌患者之30%的癌症免疫療法藥物可能性高。
HLA-A2，係在日本人集團中約30%的人具有的HLA第1類對等基因。本發明之個體CDCA1胜肽，能誘導破壞表現該胜肽與HLA-A2分子之複合體之癌細胞的人類胞毒型T細胞。因此，本發明個體胜肽，可應用在具有HLA-A2之肺癌、膽管細胞癌、膀胱癌、腎細胞癌、前列腺癌、慢性骨髓性白血病、惡性淋巴腫瘤、子宮頸癌、骨肉腫瘤、乳癌，軟組織腫瘤及大腸癌患者之免疫療法。因此，在開發抑制此等癌症之增殖或進展用的治療劑為有用。
圖1A顯示直到鑑定HLA-A2限制性胞毒型T細胞識別之CDCA1胜肽為止的實驗步驟(從經免疫之小鼠回收脾細胞之日，定為Day0)。圖1B顯示ELISPOT解析結果。利用ELISPOT法，檢測從經免疫之小鼠得到之胞毒型T細胞，對於帶有CDCA1胜肽之細胞，是否專一性反應而產生IFN-γ。其結果，以CDCA-1或CDCA-4胜肽所誘導的胞毒型T細胞，會專一性識別添加有CDCA1胜肽之T2A2細胞並產生IFN-γ，但是以其他胜肽誘導之胞毒型T細胞，未觀察到CDCA1專一性的胞毒型T細胞的免疫回應。由以上，判定，CDCA-1及CDCA-4為能誘導CDCA1專一性HLA-A2限制性胞毒型T細胞之抗原決定基胜肽。B記載的CDCA1胜肽之編號，對應於表1之胜肽位置的項目中記載的胜肽編號，與本說明書記載之序列編號不同。
圖2顯示以ELISPOT解析檢測專一性地識別CDCA1胜肽並經活化之胞毒型T細胞產生的IFN-γ結果。A表示以帶有CDCA165-72(No.1)(序列編號：1)胜肽之HLA-A2基因轉殖小鼠之骨髓來源的樹狀細胞刺激所誘導之胞毒型T細胞結果。以帶有CDCA1胜肽之T2A2細胞作為刺激細胞時，相較於以HLA-A2陽性且未負荷之T2A2細胞作為刺激細胞時，點數、點面積總和均顯著較大。藉此，判定CDCA1-1胜肽，為能誘導HLA-A2結合性胞毒型T細胞之抗原決定基胜肽。B表示以帶有CDCA1351-359(No.4)(序列編號：2)胜肽之HLA-A2基因轉殖小鼠之骨髓來源的樹狀細胞刺激所誘導之
胞毒型T細胞結果。以帶有CDCA1胜肽之T2A2細胞作為刺激細胞時，相較於以HLA-A2陽性且未負荷之T2A2細胞作為刺激細胞時，點數、點面積總和均顯著較大。藉此，判定CDCA1351-359(No.4)(序列編號：2)胜肽，為能誘導HLA-A2結合性胞毒型T細胞之抗原決定基胜肽。
圖3顯示從健康正常捐出者誘導之CTL之CDCA1專一性免疫反應。A顯示從PMBC誘導CDCA1專一性CTL之實驗步驟。將PMBC從健康正常捐出者單離，將CD8+及CD14+細胞以微顆粒單離。之後，產生胜肽反應性CD8+CTL，於GM-CSF及IL-4存在下，培養5日，從CD14陽性細胞產生DC。將DC於β 2微球蛋白存在下，於37℃培養4小時，帶有HLA-A2結合胜肽。將帶有胜肽的DC進行放射線照射，與自體CD8陽性T細胞以1：20的比例混合。將細胞在含2%自體血清之AIM-V中添加IL-7並培養。3日後，於培養液中加IL-2。於第12日、第19日，以帶有胜肽之自體DC再刺激T細胞。DC為用時調製。IFN-γ ELISPOT法及Cr放出試驗，於第3次胜肽刺激後，第5日及第6日進行。
B與C，各表示將使用CDCA165-72(No.1)(序列編號：1)胜肽及CDCA1351-359(No.4)(序列編號：2)胜肽從捐出者誘導之CTL與標靶細胞共同培養後的ELISPOT法結果。對於帶有胜肽之T2細胞，IFN-γ產生相較於不帶有胜肽之T2細胞，IFN-γ產生顯著增加。
D顯示從癌症患者捐出者1及健康正常捐出者1的PMBC誘導的CTL，對於經帶有CDCA1胜肽之T2細胞的細胞
傷害性結果。E為CDCA1351－359
胜肽所誘導之CTL，在健康正常捐出者1中之用量依存性反應。CTLE/T比5時，對於帶有0.2 μ g/ml以上胜肽之T2反應，並產生大量IFN－γ。
圖4顯示從健康正常捐出者誘導之CTL，對於CDCA1陽性癌細胞的專一性細胞傷害活性的結果。
A顯示在COL0201細胞中導入CDCA1基因表現載體時的表現結果。以EF1 α起動子及CMV啟動子，將表現會表現誘導CDCA1－HA之慢病毒的HLA－A2但不表現CDCA1之癌細胞株(COL0201)感染3次。將細胞溶解物利用西方點墨法，使用抗HA抗體(中段)或抗CDCA1抗體(上段)分析。
B、C及D顯示對於COL0201/CDCA1產生IFN－γ之結果。相較於未經轉形之癌細胞株COL0201中產生的IFN－γ，對於經轉形的COL0201，IFN－γ的產生顯著增加。再者，對於內在性表現CDCA1及HLA－A2之PANC1，IFN－γ產生相較於未表現CDCA1及HLA－A2之A549，顯著增加。
E及F為顯示將從捐出者誘導之CTL與標靶細胞共同培養時的51
Cr放出試驗的結果。對A549(CDCA1＋、HLA－A2－)或COL0201(CDCA1－、HLA－A2＋)中，未顯示細胞傷害活性，但是對PANC1(CDCA1＋、HLA－A2＋)顯示細胞傷害活性。
G顯示在CD8陽性T細胞中，CDCA1胜肽反應性CTL與HLA－A2－CDCA1四聚體陽性CTL間之相關。左圖顯示以標靶細胞作為帶有胜肽之T2細胞之ELISPOT解析，E/T比為5。右圖表示FACS解析之結果。左圖之解析個體之細胞，為利用帶有胜肽之細胞進行3次PMBC刺激後之健康正常人來源
的CTL，右圖之細胞為從健康正常人捐出者1的PMBC分離的天真(naive)CD8陽性細胞。
<110> 國立大學法人熊本大學 東京大學 腫瘤療法.科學股份有限公司<120> 細胞週期關聯1胜肽與包含其之藥劑<130> ONC－A0712P <150> JP 2007－214000 <151> 2007－08－20 <160> 41 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人工合成之胜肽序列<400> 1<210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人工合成之胜肽序列<400> 2<210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220>
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<400> 40<210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人工合成之胜肽序列<400> 41
Claims (22)
- 一種胜肽，具有15個胺基酸以下，選自由下述(A)及(B)所示之胜肽：(A)含序列編號2之胺基酸序列的胜肽；及(B)於含序列編號2之胺基酸序列的胜肽中，1個或2個胺基酸經取代，且具有胞毒型T細胞誘導活性的胜肽，其中，上述之取代為下述(i)及(ii)任一者或兩者：(i)序列編號2之胺基酸序列的N末端起第2個胺基酸被甲硫胺酸所取代；(ii)序列編號2之胺基酸序列的C末端胺基酸被纈胺酸或白胺酸所取代。
- 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中該胜肽選自由下述(A)及(B)所示之胜肽，：(A)由序列編號2之胺基酸序列所構成的胜肽；及(B)由序列編號2之胺基酸序列所構成的胜肽中，1或2個胺基酸經取代，且具有胞毒型T細胞誘導活性的胜肽，其中，上述之取代為下述(i)及(ii)任一者或兩者：(i)序列編號2之胺基酸序列的N末端起第2個胺基酸被甲硫胺酸所取代；(ii)序列編號2之胺基酸序列的C末端胺基酸被纈胺酸或白胺酸所取代。
- 一種癌症免疫誘導劑，包含一種以上如申請專利範圍第1或2項之胜肽作為有效成分。
- 一種用於治療及/或預防癌症之藥劑，包含一種以上 如申請專利範圍第1或2項之胜肽作為有效成分。
- 一種誘導呈現胞毒型T細胞之誘導活性的抗原呈現細胞的藥劑，包含一種以上如申請專利範圍第1或2項之胜肽作為有效成分。
- 一種誘導呈現胞毒型T細胞之誘導活性的抗原呈現細胞的藥劑，包含一種以上編碼為如申請專利範圍第1或2項之胜肽之聚核苷酸作為有效成分。
- 一種誘導胞毒型T細胞之藥劑，包含一種以上如申請專利範圍第1或2項之胜肽作為有效成分。
- 一種胞毒型T細胞、或含該等之免疫細胞群體，係使用如申請專利範圍第1或2項之胜肽所誘導。
- 一種抗原呈現細胞，呈現含如申請專利範圍第1至或2項之胜肽及HLA抗原之複合體。
- 一種抗原呈現細胞，係利用下述(A)或(B)之藥劑所誘導：(A)誘導呈現胞毒型T細胞之誘導活性的抗原呈現細胞之藥劑，其中該藥劑包含一種以上如申請專利範圍第1或2項之胜肽作為有效成分；(B)誘導呈現胞毒型T細胞之誘導活性的抗原呈現細胞之藥劑，其中該藥劑包含編碼如申請專利範圍第1或2項之胜肽之一種以上的多核苷酸作為有效成分。
- 一種外吐小體，呈現含如申請專利範圍第1或2項之胜肽及HLA抗原之複合體。
- 如申請專利範圍第11項所述之外吐小體，其中HLA 抗原為HLA-A2(HLA-A*0201)。
- 一種體外誘導呈現胞毒型T細胞之誘導活性之抗原呈現細胞的方法，包含使抗原呈現細胞與申請專利範圍第1或2項之胜肽接觸之步驟。
- 一種體外誘導呈現胞毒型T細胞之誘導活性之抗原呈現細胞的方法，包含使編碼如申請專利範圍第1或2項胜肽之聚核苷酸導入抗原呈現細胞之步驟。
- 一種體外誘導胞毒型T細胞之方法，包含下述(A)或(B)之步驟：(A)使T細胞與如申請專利範圍第1或2項之胜肽接觸；(B)使與申請專利範圍第1或2項之胜肽接觸之抗原呈現細胞及CD8+T細胞共同培養。
- 一種如申請專利範圍第1或2項所述之胜肽的使用，用於製造對抗癌症之免疫誘導劑。
- 一種如申請專利範圍第1或2項所述之胜肽的使用，用於製造治療及/或預防癌症之藥劑。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之胜肽，係用於誘導對抗癌症之免疫。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之胜肽，係用於治療及/或預防癌症。
- 一種申請專利範圍第1或2項之胜肽用於製造誘導呈現胞毒型T細胞之誘導活性的抗原呈現細胞之藥劑的用途。
- 一種編碼申請專利範圍第1或2項之胜肽的多核苷酸用於製造誘導呈現胞毒型T細胞之誘導活性的抗原呈現細胞之藥劑的用途。
- 一種申請專利範圍第1或2項之胜肽用於製造誘導胞毒型T細胞之藥劑的用途。
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