CN101835892B - Cdca1肽和包含cdca1肽的药剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供如下(A)或(B)的肽和使用所述肽的方法：(A)包括SEQ IDNO：1或2的氨基酸序列的肽，(B)包括SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸，并且其中所述肽显示杀伤T细胞诱导活性。

Description

CDCA1肽和包含CDCA1肽的药剂
技术领域
本发明涉及有效作为针对高表达细胞分裂周期相关1(cell division cycleassociated 1)(CDCA1)的癌症(如肺癌和胆管细胞癌)的疫苗的新肽，和包括这些肽的用于治疗和预防肿瘤的药物。
背景技术
近年来，肺癌患者的人数在全世界持续增加，而且目前全世界每年大约有一百万人死于肺癌。而且在日本，肺癌死亡越来越多，估计于2015年将达到123,000人。肺癌在男性中更普遍：男性-女性比例为三比一。在1993年，肺癌超越胃癌成为男性中癌症死亡的首要原因。此外，随着女性吸烟者数目逐渐增加，预期女性患者的人数会有所增加。自2000年来，肺癌已经成为癌症死亡的首要原因，而且随着社会老龄化，预期患者数在未来会进一步增加。吸烟被认为是肺癌发生的最大原因，其他原因有吸入石棉、空气污染等。早期检测和立即治疗对于肺癌治疗来说是很重要的。然而，近来有人指出，体检中实施的简单胸部X-光和痰液测试对肺癌的早期检测无效，而且它们并不能导致癌症死亡的减少。由于预期肺癌死亡的数目在未来持续增加，开发新的治疗策略是一项紧迫的任务。
在日本，胆管癌死亡的数目正在增加，在2005年，有16,586人死于胆管癌。在大多数胆管癌病例中，在早期未发现主观症状。与消化道腔体中形成的癌症(如胃癌和结肠癌)相比，胆管癌在早期难以发现和诊断。因此，在许多病例中，当发现胆管癌时，癌症已经发展并且不能切除。除手术治疗之外，放疗和化疗也被用于胆管癌，但它们疗效不佳，需要建立新的治疗方法。
在另一个方面，分子生物学和肿瘤免疫学的近期发展阐明，细胞毒性(杀伤)T细胞和辅助T细胞可识别癌细胞中特异性高表达的蛋白质降解所产生的肽，且这些细胞经由HLA分子被呈递到癌细胞或抗原呈递细胞的表面并引起免疫反应以破坏癌细胞。此外，已经鉴定了源自这些细胞的刺激所述免疫反应以攻击癌症的许多肿瘤抗原蛋白质和肽，而且抗原特异性肿瘤免疫治疗正在得到临床应用。
HLA I类分子在身体的所有有核细胞的表面上表达。它结合于细胞质或细胞核中产生的蛋白质在胞内降解所产生的肽，并表达在细胞表面。在正常细胞的表面，源自正常自体蛋白质的肽结合于HLA I类分子，并且不被免疫系统的T细胞识别和破坏。在另一个方面，在形成癌症的过程中，癌细胞有时大量表达在正常细胞中几乎不表达或略微表达的蛋白质。此时HLA I类分子结合于癌细胞内特异性高表达的蛋白质胞内降解而产生的肽，然后在癌细胞的表面上表达肽，于是杀伤T细胞识别并仅破坏癌细胞。通过将所述癌症-特异性抗原或肽施用于个体，可破坏癌细胞且可抑制癌生长而不伤害正常细胞。这称为使用癌症-特异性抗原的癌症免疫疗法。HLA II类分子主要在抗原呈递细胞的表面上表达。所述分子结合于源自癌症-特异性抗原的肽，其通过胞内降解由细胞外并入抗原-呈递细胞的癌症-特异性的抗原而产生，然后在细胞的表面上表达肽。识别它们的辅助T细胞被活化，并通过产生活化其他免疫活性细胞的多个细胞因子来诱导或增强针对肿瘤的免疫反应。
因此，如果开发靶向在癌症中特异性高表达的抗原的免疫疗法，这样的疗法可有效地仅仅消灭癌症，而不引起对正常自体组织的任何有害事件。还期望的是疗法可用于其他治疗均无能为力的任何末期癌症患者。此外，通过将癌症特异性抗原和肽作为疫苗预先施用于具有发生癌症的高风险的个体，可预防癌症的发生。
虽然存在对肺癌的多种治疗方法，但与其他癌症相比肺癌的预后不良，而且它是一种难治性的癌症。其原因是，例如，进展快速，在很多病例中，在发现时癌症已经是晚期。此外，由于外科手术是高度侵袭性的，适于手术的患者是有限的，并且通过放疗或化疗难以完全治愈。如果能开发出靶向在肺癌中特异性高表达的抗原的免疫疗法，则通过这样的治疗方法可以仅消除癌症而不对正常自体组成造成任何损伤。此外，预期这样的治疗方法可适用于任何晚期癌症患者，和由于极度肺功能恶化而无法实施其他治疗的患者。此外，由于在吸烟者中肺癌发生的风险高，免疫疗法可适用于在肺癌的高危人群中预防肺癌。
本发明人先前通过使用cDNA微阵列的全基因组基因表达分析，在非小细胞肺癌的37个临床病例中，在胚胎组织中，和在不同的正常成人组织中检查了27,648个人类基因的表达谱(expression profile)。结果，本发明人发现CDCA1(细胞分裂周期相关1，也称为Nuf2的人同源物(hNuf2))(GenBank登录号NM_145697)在许多肺癌病例中高度表达，而在胚胎的肝脏或者除了在从免疫系统分离的睾丸中之外的正常成人组织中几乎不表达。此外，CDCA1在胆管细胞癌、膀胱癌和肾细胞癌的所有病例中高度表达。还在前列腺癌、慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)、子宫颈癌(cervical cancer)、骨肉瘤、乳癌、软组织肉瘤和结肠癌的40％或更多病例的癌组织中观察到高CDCA1表达。此事实说明CDCA1在很多癌症中可作为癌症-特异性抗原。
HLA-A2无论在哪个种族的人群中都经常出现，而且大约30％的日本人具有它。因此，如果能够鉴定由HLA-A2呈递于细胞毒性(杀伤)T细胞的癌症抗原肽，那么可将它不仅广泛应用于日本人，而且应用于白种人(Caucasian)等。因此，鉴定通过HLA-A2呈递于杀伤T细胞的癌症抗原肽是一项重要的任务。如果这样的癌症抗原肽可应用于在全世界具有高发病率和死亡率的肺癌的免疫治疗，这将是非常有益的。
与本发明有关的现有技术文件显示如下。
[非专利文件1]DeLuca J.G.，Moree，B.，Hickey，J.M.，Kilmartin，J.V.，和Salmon，E.D.，hNuf2 inhibition blocks stable kinetochore-microtubule attachment和induces mitotic cell death in HeLa cell J.Cell Biol.159：549-555，2002.
[非专利文件2]DeLuca，J.G.，Dong，Y.，Hergert，P，Strauss，J.，Hickey，J.M.，Salmon，E.D.，McEwen，B.F.，Hec 1and Nuf2 Are Core Components of theKinetochore Outer Plate Essential for Organizing Microtubule Attachment Sites.，Mol.Biol.Cell 16：519-531，2005.
[非专利文件3]Hayama，S.，Daigo，Y.，Kato，T.，Ishikawa，N.，Yamabuki，T.，Miyamoto，M.，Ito，T.，Tsuchiya，E.，Kondo，S.，和Nakamura，Y.，Activation ofCDCA1-KNTC2，Members of Centromere Protein Complex，Involved inPulmonary Carcinogenesis.，Cancer Res.66：10339-10348，2006.
[非专利文件4]Liu，S.T.，Rattner，J.B.，Jablonski，S.A.，和Yen，T.J.，Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminarkinetochore plates in human cell.，J.Cell Biol.175：41-53，2006.
[非专利文件5]DeLuca，J.G.，Howell，B.J.，Canman，J.C.，Hickey，J.M.，Fang，G.，和Salmon，E.D.，等Nuf2和Hec1 Are Required for Retention of theCheckpoint protein Mad1和Mad2 to Kinetochores.，Current Biology 13：2103-2109，2003.
[非专利文件6]Liu，D.，Ding，D.，Du，J.，Cai，Xin.，Huang，Y.，Ward，T.，Shaw，A.，Yang，Y.，Hu，R.，Jin，C.，和Yao，X.，Human NUF2 Interacts withCentromere-associated Protein E and Is Essential for a Stable SpindleMicrotubule-Kinetochore Attachment.J.Biol.Chem.282：21415-21424，2007.
发明内容
[本发明要解决的问题]
本发明要实现的目标是开发一种手段，用来实施通过增强癌症患者的抗癌免疫力来抑制癌症生长的免疫治疗，作为一种新型治疗方法来治疗难以通过外科手术治疗、化疗和放疗等作为肺癌、胆管癌等的治疗方法治疗的转移性或难治性癌症。本发明人鉴定了如下的肽，其源自在癌症中特异性高表达的蛋白质，且通过HLA-A2呈递于杀伤T细胞，从而能够使免疫治疗可施用于大约30％的患有多种高表达CDCA1的癌症的日本患者。
[解决问题的手段]
本发明人通过对肺癌组织的cDNA微阵列分析鉴定了在肺癌中高表达的CDCA1基因(GenBank登录号NM_145697)。在正常组织中，CDCA1的表达仅仅在与免疫系统隔离的睾丸中观察到。为了检查抗肿瘤免疫力是否被CDCA1特异性杀伤T细胞诱导，使用了HLA-A2转基因小鼠，其表达大约30％的日本人所具有的HLA-A2。特别地，在此，本发明人检查了当使用源自小鼠骨髓的、经过具有HLA-A2结合基序的人CDCA1肽冲激的(pulsed)树突细胞来免疫HLA-A2转基因小鼠时，HLA-A2限制性肽特异性杀伤T细胞是否被诱导。杀伤T细胞识别通过HLA-A2呈递的肽而活化，并产生γ-干扰素(IFN-γ)，通过使用ELISPOT测定法检测这样的γ-干扰素来检查CDCA1肽特异性杀伤T细胞在免疫小鼠的脾细胞中是否被诱导出来。结果，鉴定了两种类型的新CDCA1肽，它们能够应用于靶向HLA-A2阳性癌症患者的免疫治疗。此外还证实，源自癌症患者的和源自健康供体的、由这些肽活化的CTL，均显示针对表达CDCA1的细胞的细胞溶解活性。就是说，预期所述肽可被HLA-A2限制性人杀伤T细胞所识别，并可适用于HLA-A2阳性癌症患者的癌症免疫治疗。
更具体地，本发明提供了如下：
[1]下面(A)或(B)的肽：
(A)包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的肽；
(B)包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸，并且其中所述肽显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性。
[2][1]的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。
[3][1]的肽，其中C-末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
[4]一种用于诱导针对癌症的免疫力的试剂，其包含一种或多种[1]的肽作为活性成分。
[5]一种用于治疗和/或预防癌症的药剂，其包含一种或多种[1]的肽作为活性成分。
[6]一种用于诱导显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的药剂，其中所述药剂包含一种或多种[1]的肽作为活性成分。
[7]一种用于诱导显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的药剂，其中所述药剂包含一种或多种编码[1]的肽的多核苷酸作为活性成分。
[8]一种用于诱导细胞毒性(杀伤)T细胞的药剂，其中所述药剂包含一种或多种[1]的肽作为活性成分。
[9]针对[1]的肽的抗体。
[10]使用[1]的肽诱导的辅助T细胞、细胞毒性(杀伤)T细胞或包含它们的免疫细胞群体。
[11]一种抗原呈递细胞，其呈递包含[1]的肽及HLA抗原的复合物。
[12][11]的抗原呈递细胞，其是通过[6]或[7]的药剂诱导的。
[13]一种外来体，其呈递包含[1]的肽及HLA抗原的复合物。
[14][13]的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA-A2*0201)。
[15]一种诱导显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法，其包括使抗原呈递细胞与[1]的肽接触的步骤。
[16]一种诱导显示细胞毒性(杀伤)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法，其包括将编码[1]的肽的多核苷酸导入抗原呈递细胞的步骤。
[17]一种诱导细胞毒性(杀伤)T细胞的方法，其包括使T细胞与[1]的肽接触的步骤。
[18]一种诱导针对癌症的免疫力的方法，其包括将[1]的肽施用于受试者的步骤。
[19]一种治疗和/或预防癌症的方法，其包括将[1]的肽施用于受试者的步骤。
[20][1]的肽用于制备诱导针对癌症的免疫力的试剂的用途。
[21][1]的肽用于制备治疗和/或预防癌症的药剂的用途。
[22][1]的肽，用于诱导针对癌症的免疫力。
[23][1]的肽，用于治疗和/或预防癌症。
附图简述
图1A显示用于鉴定由HLA-A2限制性杀伤T细胞识别的CDCA1肽的规程。从免疫的小鼠收集脾细胞的当天记为“第0天”。图1B显示ELISPOT测定结果。使用ELISPOT测定法检查获得自免疫小鼠的杀伤T细胞是否特异性地响应于经CDCA1肽冲激的细胞并产生IFN-γ。结果，被CDCA1-1或CDCA1-4肽诱导的杀伤T细胞特异性地识别经CDCA1肽冲激的T2A2细胞并产生IFN-γ。然而，对于被其他肽诱导的杀伤T细胞，没有观察到CDCA1特异性的杀伤T细胞免疫反应。因此，确定了CDCA1-1和CDCA1-4肽是能够诱导CDCA1特异性HLA-A2限制性杀伤T细胞的表位肽。图1B中显示的CDCA1肽的编号对应于表1的“肽位置”下显示的肽的编号，但与本申请所述的序列ID号不同。
图2显示用于检测特异性识别CDCA1肽而活化的杀伤T细胞产生的IFN-γ的ELISPOT测定法的结果。图2A显示用源自HLA-A2转基因小鼠骨髓、经CDCA165-73(No.1)(SEQ ID NO：1)肽冲激的树突细胞进行刺激，诱导杀伤T细胞的结果。当使用CDCA1肽冲激的T2A2细胞作为刺激细胞时，斑点计数和总斑点面积均显著大于使用HLA-A2阳性非CDCA1冲激的T2A2细胞作为刺激细胞的情况。因而，确定了CDCA1-1肽是能够诱导HLA-A2限制性杀伤T细胞的表位肽。图2B显示通过用源自HLA-A2转基因小鼠骨髓、经CDCA1351-359(No.4)(SEQ ID NO：2)肽冲激的树突细胞进行刺激，诱导杀伤T细胞的结果。当使用经CDCA1肽冲激的T2A2细胞作为刺激细胞时，斑点计数和总斑点面积显著大于当使用HLA-A2阳性非CDCA1冲激的T2A2细胞作为刺激细胞的情况。因而，确定了CDCA1351-359(No.4)肽是能够诱导HLA-A2限制性杀伤T细胞的表位肽。
图3显示从健康供体诱导的CTL的CDCA1特异性免疫反应。图3A显示用于从PBMC诱导CDCA1特异性CTL的规程。自健康供体分离PBMC，使用微珠分离CD8+T细胞和CD14+细胞。然后，产生肽反应性CD8+CTL，并通过在GM-CSF和IL-4存在的条件下培养五天从CD14阳性细胞产生DC。将DC在β2微球蛋白的存在下37℃培养四小时，用HLA-A2结合肽进行冲激。然后辐射照射经肽冲激的DC并将其与自体CD8阳性T细胞以1∶20的比例混合。将细胞培养在含有补充有IL-7的2％自体血清的AIM-V中。三天后，将IL-2加入培养基。在第12和19天，用经肽冲激的自体DC再刺激T细胞。DC在使用时制备。在第三次肽刺激五天和六天后进行IFN-γELISPOT测定和Cr释放测定。图3B和3C显示：将靶细胞与分别使用CDCA165-73(No.1)肽和CDCA1351-359(No.4)肽自供体诱导的CTL共培养后，进行ELISPOT测定的结果。针对肽冲激的T2细胞的IFN-γ产生显著高于针对非肽冲激的T2细胞。图3D显示由癌症患者供体1和健康供体1的PBMC诱导的CTL针对经CDCA1肽冲激的T2细胞的细胞毒性。图3E显示由CDCA1351-359肽诱导的源自健康供体1的CTL的剂量-依赖性反应。CTL响应于用0.2μg/mL以上的肽E/T比例5冲激的T2细胞而产生大量的IFN-γ。
图4显示由健康供体诱导的CTL针对CDCA1阳性癌细胞的特异性细胞毒活性。图4A显示将CDCA1基因表达载体引入COLO201细胞时在该细胞中的表达。使用慢病毒感染癌细胞系(COLO201)三次，所述慢病毒中CDCA1-HA表达在EF-1α启动子和CMV启动子控制下被诱导；所述COLO201表达HLA-A2而不表达CDCA1。使用抗-HA抗体(中间)或抗-CDCA1抗体(上部)对细胞裂解物进行Western印迹分析。图4B、4C和4D显示针对COLO201/CDCA1的IFN-γ产生。经转化的COLO201癌细胞系的IFN-γ产生显著高于未转化的COLO201。此外，针对内源表达CDCA1和HLA-A2两者的PANC1的IFN-γ产生，显著高于针对既不表达CDCA1也不表达HLA-A2的A549。图4E和4F显示将从供体诱导的CTL与靶细胞共培养时51Cr释放测定的结果。观察到了针对PANC1(CDCA1+，HLA-A2+)的细胞毒性，而未观察到针对A549(CDCA1+，HLA-A2-)和COLO201(CDCA1-，HLA-A2+)的细胞毒性。图4G显示：CDCA1肽反应性CTL与CD8阳性细胞中的HLA-A2-CDCA1四聚体阳性CTL之间的关联。左图显示使用肽冲激过的T2细胞作为靶细胞，E/T比例为5的ELISPOT测定。右图显示FACS分析的结果。左图中分析的细胞是源自健康供体1的用肽冲激过的DC进行三次PBMC刺激的CTL。右图中分析的细胞是由健康供体1的PBMC分离的初始(
Figure GPA00001105941700081
)CD8阳性细胞。
[实施本发明的方式]
除非另外限定，本申请中使用的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。
本发明的肽是限制于HLA-A2的表位，HLA-A2为常见于日本人群和白种人群的HLA等位基因。特别地，使用与HLA-A2的结合亲和力作为指标，选择了源自CDCA1的候选HLA-A2结合肽。对于选择的肽，评价了在HLA-A2转基因小鼠体内杀伤T细胞是否被用所述肽冲激的源自HLA-A2转基因小鼠骨髓细胞的树突细胞(BM-DC)所诱导。在HLA-A2转基因小鼠体内，细胞毒性(杀伤)T细胞被CDCA1-1(YMMPVNSEV(SEQ ID NO：1))和CDCA1-4(KLATAQFKI(SEQ ID NO：2))所诱导。由这些肽诱导的杀伤T细胞显示对用这些肽冲激的T2A2细胞免疫应答反应。然而，这些杀伤T细胞对未经肽冲激的T2A2细胞未显示免疫应答反应。此外，源自癌症患者和源自健康供体的、使用CDCA1-1和CDCA1-4诱导的CTL，显示了针对表达CDCA1的细胞系的细胞裂解活性。这些结果证明了源自CDCA1的肽可用作诱导针对CDCA1呈递细胞的免疫反应的肽，而且源自CDCA1的肽是HLA-A2限制性表位肽。已显示CDCA1在肺癌、胆管细胞癌、膀胱癌、肾细胞癌、前列腺癌、慢性髓细胞性白血病、恶性淋巴瘤、宫颈癌、骨肉瘤、乳癌、软组织肉瘤和结肠癌的大多数病例中在癌组织中高表达。由这些事实，认为CDCA1可用作多种癌症的免疫治疗靶标。
(1)本发明的肽和诱导针对癌症的免疫力的包含所述肽的试剂
本发明的肽是下述(A)至(D)中的任一个。
(A)包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的肽。
(B)包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加了一个、两个或数个氨基酸，并且其中所述肽显示细胞毒性(杀伤)T细胞-诱导活性。
(C)(B)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。
(D)(B)的肽，其中C-末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
在本申请中，“显示诱导杀伤T细胞的活性的肽”是指“具有刺激杀伤T细胞(细胞毒性T细胞/CTL)的T细胞诱导活性的肽”。
本发明的肽是具有少于约40个氨基酸，优选少于约20个氨基酸，更优选少于约15个氨基酸，且包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列，并显示诱导杀伤T细胞的活性的表位肽。此外，本发明的肽(表位肽)可包括这样的肽，其包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列，其中取代、缺失、插入和/或添加了一个、两个或数个氨基酸，只要其保留诱导杀伤T细胞的能力即可。取代、缺失、插入和/或添加的残基数目通常为五个氨基酸或更少，优选四个氨基酸或更少，更优选三个氨基酸或更少，甚至更优选一个氨基酸或两个氨基酸。
已知变体肽(即，包含通过取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基修饰原始氨基酸序列而获得的氨基酸序列的肽)可保留原来的生物活性(Mark DF等，(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6；Zoller MJ和Smith M，(1982)Nucleic Acids Res 10：6487-500；Dalbadie-McFarland G等(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13)。氨基酸修饰优选保留原始氨基酸侧链的性质。氨基酸侧链的性质的实例包括：疏水氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)；亲水氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)；和共同具有如下官能团或性质的侧链：脂族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱侧链(R，K，H)；和含芳环侧链(H，F，Y，W)。括号中的字母显示氨基酸的单字母代码。
在一个优选的实施方案中，本发明的肽(免疫原性肽)是九肽(9-聚物)或十肽(10-聚物)。
为了获得具有高结合亲和性和杀伤T细胞诱导活性的肽，可通过取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸来修饰天然存在的CDCA1的部分肽的氨基酸序列。在本申请中，术语“数个”指五个以下，优选三个以下，更优选两个以下。此外，由于与HLA抗原具有高亲和性的肽序列的规律性是已知的(Kubo RT，等，(1994)J.Immunol.，152，3913-24；Rammensee HG，等，(1995)Immunogenetics.41：178-228；Kondo A，等(1995)J.Immunol.155：4307-12)，可基于所述规律性修饰本发明的肽(表位肽)，从而增强它们与HLA抗原的亲和性。例如，可通过用赖氨酸或甲硫氨酸取代自N末端起第二个氨基酸来获得具有高HLA-A2结合亲和性的肽。类似地，还可通过用缬氨酸或亮氨酸取代C-末端氨基酸来获得具有高HLA-A2结合亲和性的肽。
当表位肽的序列与具有不同功能的内源或外源蛋白的氨基酸序列的某个部分相同时，可引起副作用如自身免疫病或针对特定物质的变态反应症状。为了避免这样的副作用，修饰的表位肽不应与已知蛋白质的氨基酸序列相同。为此，需要使用可用的数据库进行同源性检索，以确认不存在与修饰的表位肽显示100％同源性的具有不同功能的内源或外源蛋白质。通过此步骤，可以避免由上述用于增加与HLA抗原的结合亲和性和/或用于增加杀伤T细胞诱导活性的氨基酸序列修饰引起的风险。
虽然上述与HLA抗原具有高结合亲和性的肽预期可以非常有效地作为癌症疫苗，但需要检查使用高结合亲和性作为指标选择的候选肽是否实际上具有杀伤T细胞诱导活性。杀伤T细胞诱导活性可通过如下确认：诱导具有人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如，B淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞)，更具体地，诱导源自人外周血单核白细胞的树突细胞；用目标肽刺激它们；然后将它们与CD8阳性细胞混合；然后测量对于靶细胞的细胞毒活性。作为反应系统，可使用表达人HLA抗原的转基因动物(如在，例如，BenMohamed L，等(2000)Hum.Immunol.61(8)：764-79，Related Articles，Books，和Linkout中所描述的)。例如，为了测量细胞毒活性，用51Cr等放射标记靶细胞。可通过在具有固定化肽的抗原呈递细胞存在的条件下测量由杀伤T细胞产生和释放的IFN-γ；并使用抗-IFN-γ单克隆抗体在培养基中显现IFN-γ产生区域，从而检查对靶细胞的细胞毒活性。
如实施例所示，检查肽的杀伤T细胞诱导活性的结果显示与HLA抗原具有高结合亲和性的肽不一定具有高杀伤T细胞诱导活性。然而，含有CDCA1-1的氨基酸序列(YMMPVNSEV(SEQ ID NO：1))和CDCA1-4的氨基酸序列(KLATAQFKI(SEQ ID NO：2))的肽显示特别高的杀伤T细胞诱导活性。
如上所述，本发明提供显示杀伤T细胞诱导活性的肽，更具体地，包括SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列和其变体(即，取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸的氨基酸序列)的肽。优选地，包括SEQ ID NO：1或2的九个氨基酸或其变体的肽的氨基酸序列与其他内源蛋白质的氨基酸序列不同。特别地，具有高HLA-A2结合亲和性的肽可通过如下获得：用亮氨酸或甲硫氨酸取代自N末端起的第二个氨基酸，和/或用缬氨酸或亮氨酸取代C-末端氨基酸。
本发明的肽可包括修饰如糖基化、侧链氧化和磷酸化，只要所述的肽不丢失它们的杀伤T细胞诱导活性。其它修饰包括，例如，D-氨基酸和其它氨基酸类似物，其可用于增加肽的血清半衰期。
用于获得和产生本发明的肽的方法没有特定的限制。化学合成的肽或通过基因重组技术产生的重组肽是可以使用的。
本发明的化学合成的肽可根据化学合成方法如Fmoc方法(芴甲氧羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl)方法)和t-Boc方法(叔丁氧羰基(t-butyloxycarbonyl)方法)来合成。本发明的肽还可以利用多种商业上可得到的肽合成仪来合成。
可通过获得具有编码肽的核苷酸序列的DNA，或其变体或同源物，并将它们引入合适的表达系统，来产生本发明的肽作为重组蛋白质。
使用的表达载体可优选为任何能够在宿主细胞中自主复制、或可整合入宿主细胞的染色体、并含有位于合适位置的启动子以允许表达编码肽的基因的载体。可通过将上述表达载体引入宿主来产生具有编码本发明的肽的基因的转化体。宿主可为任何细菌、酵母、动物细胞和昆虫细胞，且可根据宿主的不同使用已知技术将表达载体引入宿主。
在本发明中，可通过培养如上所述制备的转化体，在培养物中产生并积累肽，并由培养物收集本发明的肽，从而分离重组肽。
当转化体是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)或真核细胞如酵母时，用于这些微生物的培养基可为天然或合成培养基，只要它包含碳源、氮源、矿物质等，使得被微生物利用，并允许有效培养转化体。培养条件可为常规用于培养微生物的条件。培养后，可使用用于肽分离和纯化的常规方法来从转化体的培养物中分离和纯化本发明的肽。
本领域的技术人员基于关于编码SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的DNA核苷酸序列的信息可适当地产生或获得包含在SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加一个、两个或数个氨基酸的氨基酸序列的肽。具体地说，编码包含在SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸的氨基酸序列并显示杀伤T细胞诱导活性的肽的基因可通过本领域的技术人员已知的任何方法产生，如化学合成、遗传工程技术和诱变。例如，作为一种遗传工程技术的定点诱变方法是有用的，因为它可将特定的突变引入特定的位置。其可根据MolecularCloning：A laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY.，1989(下文中称为Molecular Cloning，第2版)和CurrentProtocols in Molecular Biology，Supplement 1-38，John Wiley & Sons(1987-1997)(下文中称为Current Protocols in Molecular Biology)等中描述的方法来进行。
本发明的上述肽可诱导针对癌症的免疫力，如下面在实施例中所示。因此，本发明提供包含本发明的肽的用于诱导针对癌症的免疫力的试剂。
本发明诱导免疫力的试剂可制备成与两种以上表位肽组合的混合制剂。通过组合多种类型的肽配制的诱导免疫力的试剂可以是鸡尾酒(cocktail)，或者也可以是通过标准技术相互结合的。要组合的表位肽可以是这样的肽，它们具有源自相同基因的不同氨基酸序列，或者具有源自不同基因的氨基酸序列。当施用本发明的肽时，施用的肽被以高密度呈递给抗原呈递细胞的HLA抗原，随后，诱导出能够与由施用的肽和HLA抗原形成的复合物特异性反应的杀伤T细胞。或者，通过将由受试者收集的树突细胞与本发明的肽接触(即，用本发明的肽冲激由受试者收集的树突细胞)，可获得将本发明的肽呈递于其细胞表面的抗原呈递细胞。通过将这些抗原呈递细胞再施用回受试者，可在受试者体内诱导杀伤T细胞，结果，可增强呈递本发明的肽的靶细胞的免疫反应。
当体外或体内(优选体外)使用时，本发明用于诱导针对癌症的免疫力的试剂可诱导辅助T细胞、杀伤T细胞或包括这些细胞的免疫细胞群体，从而提供针对癌症的免疫力。
(2)本发明用于治疗和/或预防癌症的试剂(癌症疫苗)
实施例中显示，本发明的肽可在体内诱导癌细胞特异性的杀伤T细胞。在另一方面，先前的发明显示，CDCA1在肺癌、胆管细胞癌、膀胱癌、肾细胞癌、前列腺癌、慢性髓细胞性白血病、恶性淋巴瘤、宫颈癌、骨肉瘤、乳癌、软组织肉瘤和结肠癌等的大多数病例中高表达。因此，包括一种或多种本发明的肽作为活性成分的诱导免疫力的试剂预期有效地作为用于治疗和/或预防癌的试剂。就是说，预期可通过将本发明的肽连同合适的佐剂注入体内，或通过用肽冲激抗原呈递细胞如树突细胞，然后将它们注入体内，来诱导和活化能攻击肿瘤的杀伤T细胞。从而可预期抗癌效果。此外，可将编码本发明的肽的基因整合到合适的载体中。用重组DNA转化的细菌如BCG结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和人抗原呈递细胞(树突细胞等)，或具有在其基因组整合了编码本发明的肽的DNA的病毒如牛痘病毒，可以有效地用作用于治疗和/或预防人癌症的活疫苗。用于癌症疫苗的剂量和施用方法与用于常规天花疫苗和BCG疫苗的那些相同。
在本发明中，术语“疫苗”(又称“免疫原性组合物”)指当施用于动物时诱导抗肿瘤免疫力或抑制多种癌症的物质。根据本发明，显示包括SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的肽是HLA-A2限制性表位肽，其可诱导针对CDCA1呈递细胞的强而特异性的免疫反应。因此，本发明也包括用于通过使用包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列或其包括取代、缺失或添加一个、两个或数个氨基酸的变体的肽来诱导抗肿瘤免疫力的方法。通常，抗肿瘤免疫力包括如下免疫应答：
(1)诱导针对含有CDCA1表达细胞的肿瘤的杀伤T细胞，
(2)诱导识别含有CDCA1表达细胞的肿瘤的抗体，和
(3)诱导抗肿瘤细胞因子产生。
当特定的肽通过接种于动物来诱导这些免疫反应中的任一种时，确定该肽具有抗肿瘤免疫力-诱导作用。通过肽诱导抗肿瘤免疫力可通过观察宿主中的免疫系统对于肽的体内或体外应答来进行检测。
例如，用于检测诱导杀伤T细胞的方法是熟知的。侵入活体的外源物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用呈递于T细胞和B细胞。T细胞响应于通过抗原呈递细胞以抗原特异性方式呈递的抗原，通过抗原的刺激分化成杀伤T细胞(又称细胞毒性T淋巴细胞或CTL)，然后增殖。在本申请中，此过程被称为T细胞的“活化”。特定的肽对杀伤T细胞的诱导作用，可通过使用经过该肽冲激的抗原呈递细胞将该肽呈递于T细胞，然后检测杀伤T细胞的诱导来进行评价。此外，抗原呈递细胞具有活化CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞(eosinophil)和NK细胞的作用。由于CD4+T细胞在抗肿瘤免疫力方面也是重要的，因此肽的诱导抗肿瘤免疫力的作用可使用对于活化这些细胞的影响作为指标来进行评价。
使用树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞诱导的杀伤T细胞的诱导效果的评价方法是本领域公知的。在抗原呈递细胞中，DC具有最强的杀伤T细胞-诱导效果。在此方法中，首先，使测试肽与DC接触，然后使DC与T细胞接触。从与DC接触后的T细胞中检测出对靶细胞具有细胞毒作用的T细胞。如果T细胞显示针对靶细胞的细胞毒活性，这意味着测试肽具有诱导细胞毒T细胞的活性。例如，可使用51Cr-标记的肿瘤细胞的裂解作为指标，检测杀伤T细胞针对靶细胞如肿瘤的活性。或者，肿瘤细胞损害的程度可使用3H-胸腺嘧啶摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指标来评价。
通过这些方法证实具有杀伤T细胞诱导活性的测试肽是具有DC-活化作用和随后的杀伤T细胞诱导活性的肽。因此，诱导针对肿瘤细胞的杀伤T细胞的肽可用作针对呈现CDCA1的癌症的疫苗。此外，已通过与肽接触而获得了诱导针对癌症的杀伤T细胞的能力的抗原呈递细胞可用作针对癌症的疫苗。此外，作为通过抗原呈递细胞呈递肽的结果而获得了细胞毒性的杀伤T细胞还可用作针对癌症呈递CDCA1的疫苗。利用依靠抗原呈递细胞和杀伤T细胞的抗肿瘤免疫来治疗癌症的方法称为细胞免疫疗法(cytoimmunotherapy)。
通常，当使用肽进行细胞免疫疗法时，可通过组合具有不同结构的多个肽来增强诱导杀伤T细胞的效率。因此，当用蛋白质片段刺激DC时，有利的是使用多个类型的肽片段的混合物。
通过肽诱导抗肿瘤免疫力还可通过观察针对肿瘤的抗体产生的诱导来评价。例如，当通过用肽免疫实验室动物来诱导针对肽的抗体，而且它们抑制肿瘤细胞的生长、增殖和/或转移时，确定的是肽诱导抗肿瘤免疫力。
可通过施用本发明的疫苗来诱导抗肿瘤免疫力，而为治疗和/或预防癌症提供可能。治疗癌症和/或预防癌症发生的效果可包括抑制癌细胞生长、癌细胞的退行(regression)和癌细胞产生的抑制。患癌症的个体的死亡率降低、血中的肿瘤标志物减少、和与癌症有关的可检测症状的减少也包括在治疗和/或预防癌症的效果中。优选地，疫苗针对癌症的治疗和/或预防效果与无疫苗施用的对照的情况相比是统计学上显著的。例如，优选效果是以5％以下的显著性水平观察到的。统计学方法如Student t-检验、Mann-Whitney U检验、ANOVA等可用于确定统计显著性。
在本发明中，受试者优选是哺乳动物。哺乳动物的实例包括人、非人灵长类(non-human primate)、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛(cattle)，但不限于此。
本发明的肽可体内或回体(ex vivo)施用于受试者。此外，为了产生用于治疗和/或预防癌症的免疫原性组合物，可使用本发明的免疫原性肽，也就是，选自SEQ ID NOs：1和2的氨基酸序列的九肽和其突变肽。
更具体地，本发明提供用于治疗肿瘤和/或预防肿瘤生长、转移等的药剂，其包括一种或多种本发明的肽作为活性成分。本发明的肽特别有用于治疗肿瘤如肺癌、胆管细胞癌、膀胱癌、肾细胞癌、前列腺癌、慢性髓细胞性白血病、恶性淋巴瘤、子宫颈癌、骨肉瘤、乳癌、软组织肉瘤和结肠癌。
本发明的肽可作为通过常规配制方法配制的药剂直接施用于受试者。这样的制剂除了本发明的肽之外，可根据需要包含可药用的载体、赋形剂等。本发明的药剂可用于治疗和/或预防多种肿瘤。
此外，为了有效地建立细胞免疫力，包含一种或多种本发明的肽作为活性成分的用于治疗和/或预防肿瘤的药剂中可混入佐剂。所述药剂可与其他活性成分(如抗肿瘤剂)一起共施用。适当的制剂还包括颗粒。适当的佐剂描述于文献(Johnson AG.(1994)Clin.Microbiol.Rev.，7：277-89)中。佐剂的实例包括弗氏不完全佐剂、BCG、海藻糖二霉酚酸酯(trehalose dimycolate)(TDM)、脂多糖(LPS)、硫酸铝钾佐剂、硅石佐剂、磷酸铝、氢氧化铝和明矾(alum)，但不限于此。此外，可方便地使用脂质体配制物、其中药物结合于具有数微米直径的珠子的颗粒制剂和其中脂质结合于上述肽的制剂。施用方法可为口服施用、皮内注射、皮下注射、静脉注射等，并可包括全身施用(systemicadministration)和靶肿瘤附近的局部施用。
本发明的肽的剂量可根据要治疗的疾病、患者的年龄和体重、施用方法等而适当地调节。剂量通常为0.001mg至1000mg，优选0.01mg至100mg，更优选0.1mg至10mg。优选地，几天一次到几个月一次进行施用，但本领域的技术人员可容易地选择适当的剂量和施用方法；而且这些参数的选择和优化完全在常规技术的范围内。制剂的形式没有特定的限制，可以是为通过加入赋形剂(如糖)而粒化的或冷冻干燥的。
可加入本发明的药剂用于增加杀伤T细胞诱导活性的助剂(auxiliaryagent)包括：BCG细菌等的菌体组分，包括胞壁酰二肽(MDP)；Nature，vol.344，p873(1990)中描述的ISCOM；J.Immunol.vol.148，p1438(1992)中描述的皂苷系列(saponin series)的QS-21；脂质体和氢氧化铝等。此外，还可使用免疫刺激物(immunostimulant)如香菇多糖(lentinan)、西佐喃(sizofiran)和溶链菌(picibanil)作为助剂。还可以使用增强T细胞的生长和分化的细胞因子等，如IL-2、IL-4、IL-12、IL-1、IL-6和TNF，以及活化NK-T细胞的α-半乳糖基神经酰胺，以及通过结合于Toll-样受体来活化天然免疫系统的脂多糖(LPS)和CpG，等等，作为助剂。
本发明的疫苗组合物包含引发杀伤T细胞的组分。脂质已被鉴定为用于针对病毒抗原进行体内初次刺激(priming)的物质。例如，可将棕榈酸残基结合于赖氨酸残基的ε-氨基和α-氨基，然后与本发明的免疫原性肽连接。脂质化的肽可通过掺入胶束或颗粒，或封装入脂质体，或在佐剂中乳化来直接施用。脂质初次刺激的另一个实例是用大肠杆菌脂蛋白如三棕榈酰-S-甘油基-半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸(tripalmitoyl-S-glyceryl-cysteinyl-seryl-serine)(P3CSS)当将其共价结合于合适的肽时进行引发(Deres K.，等，(1989)Nature342：561-4)。
本发明的免疫原性肽可通过病毒载体或细菌载体表达。适当表达载体的实例包括无毒力的病毒宿主如牛痘(vaccinia)和禽痘(fowlpox)。例如，可以使用痘苗病毒作为载体来表达编码所述肽的核苷酸序列。将重组牛痘病毒引入宿主细胞，表达出免疫原性肽，引发免疫应答。也可以使用例如在美国专利No.4,722,848中描述过的使用牛痘载体的免疫方法。也可以使用卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)(BCG)。Stover CK等，(1991)Nature 31：456-60中描述了BCG载体。其他多种可用于治疗性施用或免疫的载体在本领域内是已知的，这些载体包括腺病毒载体和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒样杆菌(伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi))载体和脱毒的炭疽毒素载体。参见，例如，Shata MT等，(2000)Mol.Med.Today 6：66-71；Shedlock DJ和WeinerDB等，(2000)J.Leukoc.Biol.68：793-806；和Hipp JD等，(2000)In Vivo 14：571-85。
可通过如下方式在患者体内有效地诱导杀伤性T细胞：在体外将抗原肽添加至从患者收集的细胞或来自另一个与之共有部分HLA等位基因的个体的细胞(同种异体细胞(allogeneic cell))，并呈递抗原，然后将这些细胞血管内施用给患者或局部施用到肿瘤处等。或者，通过将肽添加至患者的外周血淋巴细胞并在体外培养它们而在体外诱导杀伤T细胞，而后可将这些细胞可以血管内施用给患者或局部施用到肿瘤处等。这样的细胞转移治疗已经被实施作为癌症治疗，并且是本领域技术人员中熟知的一种方法。
本发明的癌症类型无特别限制，具体的例子包括肺癌、胆管细胞癌、膀胱癌、肾细胞癌、前列腺癌、慢性髓细胞性白血病、恶性淋巴瘤、子宫颈癌、骨肉瘤、乳癌、软组织肉瘤和结肠癌等。适合应用本发明的癌症的实例包括肺癌。
(3)本发明的抗体
本发明还涉及能够识别作为表位(抗原)的本发明上述的肽的一部分或完整的肽的抗体，并涉及通过使用该蛋白或该肽体外刺激而诱导的杀伤T细胞。通常，杀伤T细胞显示出比抗体更强的抗肿瘤活性。
此外，与本发明的肽相似，本发明抗体可用作针对表达CDCA1的癌症的预防剂和/或治疗剂，只要这些抗体能抑制CDCA1癌症抗原的活性即可。在实际应用中，本发明的肽或抗体可以按原样施用，或通过与可药用载体和/或稀释剂，视需要加上佐剂，一起注射施用。或者，它们可以通过喷雾方法等经粘膜通过透皮吸收施用。更具体地，在本申请中，人血清白蛋白是载体的实例；而PBS、无菌水等是稀释剂的实例。
本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并可以用本领域技术人员已知的方法来生产。
例如，多克隆抗体可通过如下获得：用本发明的肽作为抗原免疫哺乳动物或鸟类物种，并从哺乳动物或鸟类物种收集血液，从收集的血液中分离和纯化抗体。例如，可免疫哺乳动物，如小鼠、仓鼠、豚鼠、家禽(chicken)、大鼠、兔、狗、山羊、绵羊和牛、或鸟类物种。免疫的方法是本领域技术人员已知的，抗原可例如在例如7到30天的间隔施用2到3次。剂量可以是，例如，每次施用约0.05毫克到2毫克的抗原。对施用途径没有特定限制，且可以合适地选自皮下施用、皮内施用、腹膜内施用、静脉内施用、肌肉内施用等。此外，抗原可以在溶解于适当的缓冲液，例如，含常规的佐剂如弗氏完全佐剂或氢氧化铝的缓冲液后施用。
将经免疫的哺乳动物或鸟类物种饲养一段时间后，当抗体效价增加时，可将另外用例如100微克到1000微克的抗原对它们进行免疫。最后施用后一到两个月，可从经免疫的哺乳动物或鸟类物种收集血液，血液可以通过常规方法来分离，来获得识别本发明肽的多克隆抗体作为多克隆抗血清，所述的常规方法如离心、用硫酸铵或聚乙二醇沉淀、层析如凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
在另一方面，单克隆抗体可以通过制备杂交瘤获得。例如，杂交瘤细胞可以通过将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞系的细胞融合而获得。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以通过细胞融合获得，如下文所示的方法。
使用来自于经免疫动物的脾细胞、淋巴结细胞、B淋巴细胞等作为产生抗体的细胞。将本发明的肽用作抗原。可用小鼠和大鼠等动物作为免疫动物，将抗原施用于这些动物可通过常规方法来进行。例如，通过将作为抗原的本发明的肽的悬浮液或乳剂与佐剂如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂以静脉内、皮下、皮内、腹膜内等施用于动物几次来免疫动物。从经免疫动物中获得产生抗体的细胞，如脾细胞，并可以通过已知方法(G.Kohler等，Nature，256，495(1975))将它们与骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤。
对于小鼠，用于细胞融合的杂交瘤细胞系的实例包括，例如，P3X63Ag8、P3U1、Sp2/0等。将融合促进剂如聚乙二醇和仙台病毒用于细胞融合，而且在细胞融合后将次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶(HAT)培养基用于通过常规方法选择杂交瘤。通过细胞融合获得的杂交瘤可以通过有限稀释法等进行克隆。根据需要，产生特异识别本发明肽的单克隆抗体的细胞系可以通过使用本发明的肽在以酶免疫测定方法的筛选中获得。
除上述方法之外，可以通过使用本发明的肽、表达所述肽的细胞、或其裂解物体外刺激人淋巴细胞(如感染了EB病毒的淋巴细胞)来调节免疫细胞。可与本发明的肽结合的人抗体可以通过将经免疫的淋巴细胞与人来源的骨髓瘤细胞如U266(特开昭63-17688(未审查、已公开的日本专利申请))进行融合来获得。
为了从这样获得的杂交瘤产生需要的单克隆抗体，可以用常规培养方法或腹水形成方法培养杂交瘤，并可以从培养物上清液或腹水中纯化单克隆抗体。从培养物上清液或腹水中纯化单克隆抗体可以通过常规方法进行。例如，可将硫酸铵分级、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等合适地组合和使用。
可以使用本发明肽，表达所述肽的细胞、或其裂解物来免疫具有一组人抗体基因的转基因动物。可以从经免疫的转基因动物中收集产生抗体的细胞，并将它们与上述骨髓瘤细胞系融合以获得杂交瘤。然后可以从杂交瘤中产生需要的单克隆抗体(WO92/03918；WO94/02602；WO94/25585；WO94/33735；WO96/34096)。
此外，也可以使用癌基因使产生抗体的免疫细胞(如经免疫的淋巴细胞)永生化，并用来制备单克隆抗体。
这样获得的单克隆抗体也可以使用基因操作技术(Borrbaeck和Larrick，(1990)Therapeutic Monoclonal Antibodies)进行调节。例如，可通过从产生抗体的细胞(如杂交瘤和经免疫的淋巴细胞)克隆编码抗体的DNA，将其插入合适的载体，和将后者引入宿主细胞来制备重组抗体。
本发明的抗体还可以是抗体片段或修饰的抗体，只要它们可与本发明的肽结合即可。抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv、或单链Fv(scFv)，其中scFv中源自H和L链的Fv片段以合适的接头连接在一起(Huston等，(1998)ProcNatl Acad Sci USA 85：5879-83)。更具体地，可通过用酶如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶(Co等，(1994)J Immunol 152：2968-76；Better和Horwitz，(1989)MethodsEnzymol 178：476-96；Pluckthun和Skerra，(1989)Methods Emzymol 178：497-515；Lamoyi(1986)Methods Enzymol 121：652-63；Rousseaux等，(1986)Methods Enzymol 121：663-9；Bird和Walker，(1991)Trends Biotech 9：132-7)处理抗体来制备抗体片段。
本发明的抗体包括通过将抗体与多种分子如聚乙二醇(PEG)结合而获得的修饰抗体。可通过本技术领域已知的常规的化学修饰方法来进行修饰抗体。
本发明的抗体包括嵌合抗体和人源化抗体，嵌合抗体包含源自非人抗体的可变区和源自人抗体的恒定区，人源化抗体包括源自非人抗体的互补决定区(CDR)、源自人抗体的框架区(FR)和源自人抗体的恒定区。这样的抗体可以用本技术领域已知的常规方法制备。人源化抗体可通过用具有需要的结合活性的啮齿动物的CDR区取代人抗体的CDR序列区而获得(Verhoeyen等，(1988)Science 239：1534-6)。因此，与嵌合抗体相比，人源化抗体是其中人抗体的较小区域被非人来源的相应区域取代的抗体。
还可以制备除人的框架区和恒定区外还具有人可变区的完整人抗体。例如，在一种体外方法中，可以使用展示人抗体片段的噬菌体重组文库来进行筛选(Hoogenboom和Winter，(1992)J Mol Biol 227：381-8)。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的转基因动物来产生人抗体(US6,150,584、US5,545,807、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425和US5,661,016)。
如上所述获得的抗体可通过本领域的常规方法纯化至均质。例如，可以使用普通的蛋白质分离和纯化方法。可通过柱层析法如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等的组合来分离和纯化抗体；然而，分离和纯化方法不限于此(Antibodies：A Laboratory Manual，EdHarlow和David Lane，(1988)Cold Spring Harbor Laboratory)。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。蛋白A柱用的实例包括HyperD、POROS和Sepharose F.F(Pharmacia)。
除了亲和层析外，层析的实例包括离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.等)。层析也可以使用液相层析如HPLC和FPLC。
本发明抗体的抗原结合亲和力可使用，例如，吸光度测量、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射性免疫测定法(RIA)和免疫荧光测定法来测量；然而，方法不限于此。在ELISA中，将本发明的抗体固定在平板上，加入本发明的肽，然后加入含有产生抗体的细胞的培养物上清液或纯化抗体的样本。随后，加入具有可检测标记且能够识别抗原结合亲和力待测的抗体的第二抗体。洗涤平板后，加入用于检测第二抗体的标记的试剂，并测量吸光度等。例如，酶如碱性磷酸酶可以用作第二抗体的标记，酶底物如磷酸对硝基苯酯可用作检测试剂。BIAcore(Pharmacia)也可以用于评估抗体活性。
本发明的抗体可检测包含在样品中的本发明的肽。具体地，例如，可通过将癌组织的活检样本与本发明的抗体接触来确认本发明的肽在癌组织中的存在。
在将本发明肽用于癌症的治疗性和/或预防性处理之前，可能的是通过使用本发明的抗体评价本发明肽在将待治疗的癌症中的表达，在治疗开始前预测效果在测试受试者中是否有希望。
此外，由于本发明抗体可识别CDCA1肽的片段，而该肽的表达在多种癌细胞中增加，所以预期它们的应用不仅可用于诊断中而且还用于治疗。
(4)辅助T细胞，杀伤T细胞，或包含它们的免疫细胞群
本发明还涉及通过用本发明的肽体外刺激诱导的杀伤T细胞和辅助T细胞，或包含杀伤T细胞和辅助T细胞的免疫细胞群。例如，当使用本发明肽在体外刺激外周血淋巴细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞时，可诱导出肿瘤反应性的活化T细胞，这些活化T细胞可有效地用于过继免疫治疗(adoptiveimmunotherapy)。或者，作为强力的抗原呈递细胞，树突细胞也可以用本发明肽进行冲激或经遗传转化以表达所述肽，并可通过使用这些树突细胞在体内或体外刺激T细胞来诱导抗肿瘤免疫应答。
优选地，可通过使用本发明的肽和佐剂进行体外刺激，来诱导辅助T细胞、杀伤T细胞或包含它们的免疫细胞群。本申请使用的佐剂包括细胞生长因子或细胞因子。
可通过输注由此获得的辅助T细胞、杀伤T细胞或包含它们的免疫细胞群，包括将它们向癌症患者血管内、向肿瘤局部输注等，来抑制肿瘤并且预防和/或治疗癌症。
如上所述可抑制肿瘤的杀伤T细胞、辅助T细胞，或包含它们的免疫细胞群，可使用本发明的肽来产生。因此，本发明提供含有本发明肽的细胞培养基。可使用细胞培养基制备能抑制肿瘤的杀伤T细胞、辅助T细胞，或包含它们的免疫细胞群。此外，本发明提供用于生成杀伤T细胞、辅助T细胞，或包含它们的免疫细胞群的细胞培养试剂盒，包括上述细胞培养基和细胞培养容器。
(5)抗原呈递外来体
本发明进一步提供一种称为“外来体”(exosome)的细胞内小泡，该外来体将在本发明肽和HLA抗原之间形成的复合物呈递到其表面。外来体可以使用例如在第平11-510507号(对应于非日语国际公布的未审查的日本国家阶段公布)和第2000-512161号中公开的日语译文中详细描述的方法进行制备。优选地，可使用从治疗和/或预防的受试者获得的抗原呈递细胞来制备外来体。可将本发明的外来体以与本发明肽相似的方式作为癌症疫苗进行注射。
在本发明中使用的HLA抗原类型应该与需要治疗和/或预防的受试者的HLA抗原类型相匹配。例如HLA抗原类型是HLA-A02，并优选为HLA-A2(HLA-A*0201)。“HLA-A2”表示蛋白，“HLA-A*0201”表示与该蛋白的区段相对应的基因(因为目前没有表示该蛋白区段的术语)。
(6)诱导抗原呈递细胞和杀伤T细胞的方法
本发明提供使用一种或多种本发明的肽诱导抗原呈递细胞的方法。可以使一种或多种本发明的肽接触从外周血单核细胞诱导的树突细胞，以刺激该树突细胞，从而诱导出抗原呈递细胞。当对受试者施用本发明的肽时，可以在受试者体内诱导出在其表面呈递本发明的肽的抗原呈递细胞。或者，可使用回体方法，其中用本发明的肽冲激抗原呈递细胞，然后将这样的细胞作为疫苗施用于受试者。例如，回体施用方法可包括如下步骤：
(1)从受试者收集抗原呈递细胞；和
(2)使步骤(1)中的抗原呈递细胞接触本发明的肽(用本发明肽冲激步骤(1)的抗原呈递细胞)。
步骤(2)中获得的抗原呈递细胞可作为疫苗施用于受试者。
本发明还提供诱导具有高水平的杀伤T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法。这种方法包括用包含编码一种或多种本发明肽的多核苷酸的基因体外转染抗原呈递细胞的步骤。要转染的基因可以是DNA或RNA。对于转染，可合适地使用本领域常规进行的多种方法，如脂转染、电穿孔和磷酸钙方法，但所述方法不限于此。更具体地，转染可如Reeves ME等，(1996)Cancer Res.，56：5672-7；Butterfield LH等，(1998)J.Immunol.，161：5607-13；Boczkowski D等，(1996)J Exp.Med.，184：465-72；和WO99/08521中所述进行。当基因转染入抗原呈递细胞时，它们在细胞内被转录和翻译。随后所得的蛋白质经由MHC I型或II型途径进行加工，并经过抗原呈递途径作为部分肽呈递在抗原呈递细胞的表面。
本发明还提供使用一种或多种本发明肽诱导杀伤T细胞的方法。通过将一种或多种本发明肽施用于受试者，可在受试者体内诱导出杀伤T细胞，从而加强靶向肿瘤组织中呈递CDCA1的癌细胞的免疫系统。或者，可通过在体外使来自受试者的抗原呈递细胞和CD8阳性细胞与一种或多种本发明肽接触，并通过在体外使外周血单核白细胞与抗原呈递细胞接触来刺激细胞，从而诱导活化的杀伤T细胞。在回体治疗方法中，可通过将活化的杀伤T细胞回输(return)入受试者体内来增强靶向受试者癌组织中呈递CDCA1的癌细胞的免疫系统。例如，此方法包括如下步骤：
(1)从受试者收集抗原呈递细胞；
(2)使步骤(1)中的抗原呈递细胞接触本发明的肽(用本发明的肽冲激步骤(1)的抗原呈递细胞)；
(3)将步骤(2)中的抗原呈递细胞与CD8+T细胞混合并共培养来诱导细胞毒性T细胞；和
(4)从步骤(3)的共培养物中收集CD8+T细胞。
从步骤(4)中获得的具有细胞毒活性的CD8+T细胞可以作为疫苗施用于受试者。
本发明还提供用一种或多种本发明的肽诱导的分离的杀伤T细胞。优选地，通过本发明的方法诱导的杀伤T细胞源自接受治疗和/或预防的受试者。可将所述细胞与其他包含呈递本发明一种或多种肽的抗原呈递细胞或外来体的试剂组合施用。获得的杀伤T细胞对于呈递与诱导所用的肽相同的肽的靶细胞是特异性的。靶细胞是内源性表达CDCA1的细胞或者是用CDCA1基因转染的细胞。通过用本发明的肽进行刺激，在其表面呈递本发明的肽的细胞，如来自肺癌、胆管细胞癌、膀胱癌、肾细胞癌、前列腺癌、慢性髓细胞性白血病、恶性淋巴瘤、子宫颈癌、骨肉瘤、乳癌、软组织肉瘤、结肠癌等的癌细胞，可成为攻击的目标。
(7)T细胞受体(TCR)
本发明还提供编码多肽的核酸，所述多肽形成识别CDCA1-1和CDCA1-4的T细胞受体(TCRs)的亚基，和使用所述核酸的方法。TCR包含至少七个跨膜蛋白。一个二硫键连接的(α，β)异源二聚体形成克隆型抗原识别单元，而由ε、γ、δ和ζ，和η链组成的不变的CD3链偶联与信号传导途径结合的配体，由此引起T细胞活化和细胞免疫反应。如上所述，负责抗原识别的α和β亚基对于T细胞获取识别特定靶物的特异性是必需的。因此，为了合成特异性地识别本发明肽的TCR，可通过本领域的技术人员已知的方法鉴定源自使用本发明肽诱导的CTL的TCR亚基α和β的核酸序列(WO2007/032255；和Morgan等，J.Immunol.，171，3288(2003))。由鉴定的TCR亚基所形成的TCR可结合于呈递CDCA1肽的靶细胞，所以将该TCR引入具有细胞杀伤作用的细胞时可显示出其用处。
可将编码TCR亚基的核酸整合入合适的载体(例如，逆转录病毒载体)。载体可通过本领域的技术人员已知的方法生成。整合了TCR亚基的载体可用于导入T细胞。具体地，通过转化源自患者的T细胞，可获得特异性识别并攻击表达CDCA1的细胞的T细胞(CTL)。可通过普通方法(Kawakami等，J.Immunol.，142，3452-3461(1989))培养和生长由此获得的导入了TCR的CTL。通过上述方法获得的CTL可用于细胞免疫治疗。
本发明还提供呈递由HLA抗原和一种或多种本发明肽形成的复合物的抗原呈递细胞。与一种或多种本发明的肽或编码这些肽的核苷酸接触的抗原呈递细胞优选从接受治疗和/或预防的受试者收集。本发明的肽、呈递此肽的抗原呈递细胞、外来体、或活化的杀伤T细胞，可以与其他药剂组合作为疫苗施用。
本说明书中引用的所有现有技术参考文件均通过提述并入本文。
将参考下面的实施例进一步说明本发明；然而，本发明不应理解为受限于这些实施例。
实施例
[实施例1]
(1)显示与HLA-A2有结合性的CDCA1肽库(repertoire)的选择
使用BIMAS系统搜索人CDCA1的氨基酸序列，并按估计的与HLA-A2结合亲和性的降序选择了41种肽(表1)。
[表1-1]
Figure GPA00001105941700241
Figure GPA00001105941700251
[表1-2]
Figure GPA00001105941700261
在本发明中鉴定的HLA-A2限制性杀伤T细胞表位以下划线表示。
[实施例2]
首先，利用先前报道的方法(Komori H等Clinical Cancer Research 12：2689-2697，2006)从HLA-A2转基因小鼠的骨髓细胞中诱导树突细胞(DC)。将由此获得的BM-DC用CDCA1肽(10μM)冲激，然后以5×105个细胞/小鼠在腹膜内施用于HLA-A2转基因小鼠。以相同的施用方法以一周为间隔免疫小鼠两次，然后收集它们的脾细胞用于检测杀伤T细胞。为了能够严格地检查源自CD8+T细胞的杀伤T细胞的诱导，在去除脾脏后利用MACS珠从脾细胞中去除CD4+T细胞，使用余下的细胞。
图1A显示用于确定能够被HLA-A2转基因小鼠中的HLA-A2限制性杀伤T细胞识别的CDCA1肽的规程。将从免疫的小鼠中收集脾细胞的日期指定为“第0天”。
第21天：(1)通过向HLA-A2转基因小鼠的骨髓细胞加入GM-CSF来启动源自骨髓的树突细胞(下文称为BM-DC)的诱导。
第14天：(2)向诱导的BM-DC中加入含有四种CDCA1肽的混合物，并在两小时之后将其以5×105个细胞/小鼠腹膜内施用。
以1周的间隔将(1)和(2)再重复两次。
第0天：从经免疫的HLA-A2转基因小鼠中收集脾细胞，并将其与已经和CDCA1肽温育两小时的BM-DC共培养，随后将其培养六天。
第6天：为了检测特异性地识别CDCA1肽的杀伤T细胞，通过ELISPOT测定法对抗原刺激后产生γ干扰素的T细胞进行定量。作为靶细胞，使用以各个CDCA1肽冲激的BM-DC和未冲激的BM-DC。
通过ELISPOT测定法评价CDCA1特异性杀伤T细胞的活性：
通过ELISPOT测定法确定被诱导的杀伤T细胞中是否存在与CDCA1特异地反应而产生IFN-γ的杀伤T细胞。使用Mouse IFN-γELISPOT Set(BDBiosciences)检测IFN-γ。当杀伤T细胞(效应物)响应于刺激细胞(靶物)并生成IFN-γ时，它们可以作为红色斑点被检测到。作为靶细胞，使用不表达CDCA1的HLA-A2阳性T2A2细胞和经CDCA1肽冲激的T2A2细胞。T2A2细胞是通过将HLA-A2基因引入TAP基因表达缺陷的小鼠T2细胞系而产生的细胞系，其购自RIKEN Cell Bank。这些细胞中由于TAP的缺陷，仅当外源添加的肽具有结合于HLA-A2分子的性质时，才会在细胞表面上表达肽与HLA-A2分子之间形成的复合物。首先，用抗-小鼠IFN-γ抗体包被ELISPOT板(BD Biosciences)18个小时，随后，将板用10％FCS/RPMI封闭2小时。将效应物细胞(100微升/孔)和靶细胞(100微升/孔)混合，并在37℃培养22小时。该实验以效应物/靶比例(E/T比)5∶1进行。然后将板用无菌水洗涤并与生物素化的抗小鼠IFN-γ反应两小时，再与链亲合素-HRP反应一小时。使用底物溶液检测出IFN-γ阳性斑点。利用MINERVA TECH的自动化分析软件计数斑点。肽编号1至20的结果示于图1B。通过类似的实验，在41种肽之中，在用CDCA165-73(No.1)(SEQ ID NO：1)或CDCA1351-359(No.4)(SEQID NO：2)肽诱导的杀伤T细胞中观察到了CDCA1特异性杀伤T细胞免疫应答(图2)。
用CDCA165-73(No.1)(SEQ ID NO：1)或CDCA1351-359(No.4)(SEQ IDNO：2)肽诱导的杀伤T细胞的分析结果分别示于图2A和2B。
[实施例3]
患者、血液样本和细胞系：
在日常诊断检查的过程中经知情同意收集源自NSCLC患者的血液样本。CDCA1阴性人结肠癌细胞系COLO201由Health Science ResearchResources Bank提供。使用HLA-A2单克隆抗体BB7.2(One Lambda Inc.，Canoga Park，CA)通过流式细胞术确认这些样本中的HLA-A2表达。
慢病毒基因转移：
使用Tahara-Hanaoka S等Exp Hematol 2002；30：11-17中描述的方法进行慢病毒载体介导的基因转移。简言之，使用Lipofectamine 2000(InvitrogenCorporation，CA，USA)，将携带CDCA1 cDNA的17微克CSII-CMV-RfA和CSIIEF-RfA自灭活载体(Miyoshi H等J Virol 1998；72：8150-8157)与10微克pCMV-VSV-G-RSV-Rev和pHIVgp转染入10厘米培养皿上的293T细胞。60小时后，收集培养基，用超速离心法(50,000xg，2小时)沉淀病毒颗粒。将沉淀悬浮于50微升RPMI 1640溶液中，并将10微升病毒悬液加至每孔含有5×104个COLO201细胞的U型底96孔板的每个孔中。通过Western印迹分析确认转染的CDCA1基因的表达。
CDCA1反应性人CTL的诱导
使用源自单核细胞的DC细胞作为抗原呈递细胞诱导响应HLA呈递的肽的CTL。通过先前报道的体外方法(Suda T，等Cancer Sci.2007；Nakahara S，等Cancer Res.2003；63：4112-8)获得DC。简言之，针对使用Ficoll-Paque溶液(GE Healthcare UK，Ltd.，Buckinghamshire，UK)从HLA-A*0201阳性健康志愿者和NSCLC患者分离的外周血单核细胞(PBMC)，使用MicroBeads(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)筛选CD8阳性CD14阳性群体。为了获得DC，在含有2％自体血浆的AIM-V(Invitrogen)中，存在100ng/mL的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和10ng/mL的白细胞介素(IL)-4(PeproTec Inc.，New Jersey，USA)的条件下，培养CD14阳性群体。温育4天后，皿中添加OK-432以制备成熟DC。开始培养细胞因子诱导的DC五天后，在37℃、AMI-V中存在4μg/mL的β2-微球蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的条件下，将细胞用20μg/mL的HLA-A2结合肽进行冲激2小时。对这些经肽冲激的DC进行辐射照射(3,500cGy)并以1∶50比例与自体CD8阳性T细胞混合；所述自体CD8阳性T细胞是使用抗-CD8微珠(MiltenyiBiotec)从PBMC获得的。使用48孔板进行温育，48孔板准备为每孔包含0.5mL AIM-V，其中含2％自体血浆、1×104个肽冲激的DC、5×105个CD8阳性T细胞和10ng/mL的人IL-7(Wako，Osaka，Japan)。温育三天后，以20IU/mL的浓度加入人IL-2(PeproTec Inc.)。此外，在第12和19天，用经肽冲激的自体DC再刺激T细胞。通过上述方法合适地制备DC。第三次肽刺激的六天后，即第25天，通过铬(Cr)释放测定法和IFN-γELISPOT测定法来评价抗原特异性CTL应答。
对靶细胞的CTL应答：
以不同的效应细胞/靶细胞比例将CTL与靶细胞即多种癌细胞系及经过或未经过冲激的T2细胞共培养，并使用常规方法进行51Cr释放测定和IFN-γELISPOT测定(Komori H，等，Clin.Cancer Res.2006；12：2689-2697；Makita M，等Clin.Cancer Res.2002；8：2626-31；Yokomine K，等Cancer Sci.2007；98：1930-5)。简言之，在37℃的CO2温育器中使用3.7KBq Na2 51Cr4(Perkin Elmer Life Sciences)将靶细胞标记一小时。将标记的靶细胞冲洗三次，并将细胞与20μg/mL的肽一起在37℃温育三小时来制备肽冲激的靶细胞。将靶细胞与效应细胞混合使得平底微量滴定板上的最终体积为200μL，然后温育。温育六小时后，由每个孔收集50μL的上清液，并使用γ粒子计数管(gamma counter)对放射性进行定量。根据现有方法(Suda T，等Cancer Sci.2007；98：1803-8)计算特异性51Cr释放率，来评价特异性细胞毒活性。另根据现有方法(Komori H，等Clin.Cancer Res.2006；12：2689-97)进行ELISPOT测定。
由源自HLA-A2阳性健康供体的PBMC诱导CDCA1反应性CTL：
自HLA-A2(A*0201)阳性健康供体分离PBMC。将CD8+T细胞与经过CDCA165-73(No.1)(SEQ ID NO：1)或CDCA1351-359(No.4)(SEQ ID NO：2)肽冲激的源自单核细胞的DC一起共培养，并将CD8+T细胞每周刺激三次(图3A)。
将来自癌症患者或健康供体的诱导的CTL与靶细胞一起共培养。将用CDCA165-73(No.1)(SEQ ID NO：1)或CDCA1351-359(No.4)(SEQ ID NO：2)肽冲激的T2细胞用作靶物，并进行ELISPOT测定和51Cr释放测定。如图3B所示，对于癌症患者供体1，当用CDCA165-73(No.1)(SEQ ID NO：1)肽冲激过的T2刺激细胞时，CTL的IFN-γ生成显著大于用未经冲激的T2刺激细胞时的情况。来自健康供体1的诱导的CTL响应于CDCA1351-359(No.4)(SEQ ID NO：2)肽冲激过的T2细胞产生大量的IFN-γ(每孔多于300个斑点)(图3C)。此外，在51Cr释放测定中，源自癌症患者供体1和健康供体1的CTL针对用CDCA165-73(No.1)(SEQ ID NO：1)或CDCA1351-359(No.4)(SEQ ID NO：2)肽冲激过的T2细胞显示了细胞毒活性(图3D)。如图3E所示，当以用不同浓度的CDCA1肽冲激过的T2细胞刺激CTL时，CTL以剂量依赖性方式响应于CDCA1肽冲激过的T2细胞。我们发现，与对未经冲激的T2细胞或用源自HIV的HLA-A2结合性肽冲激的T2细胞的应答相比，CTL响应于以0.2μg/mL以上的肽浓度冲激的T2细胞产生更大量的IFN-γ。上述结果显示这些CTL具有肽特异性的细胞毒性。
将其中引入了CDCA1的COLO201(COLO201/CDCA1，CDCA1+，HLA-A2+；图4A)用作靶细胞，检查CTL的CDCA1特异性免疫反应。如图4B所示，用CDCA165-73(No.1)(SEQ ID NO：1)肽刺激的源自健康供体的CTL针对COLO201/CDCA1产生的IFN-γ量大于转染空载体的不表达CDCA1的COLO201。用CDCA1351-359(No.4)(SEQ ID NO：2)肽刺激的源自健康供体2的CTL也显示对COLO201/CDCA1的特异性免疫反应(图4C)。此外，这些CTL显示对PANC1细胞(CDCA1+，HLA-A2+)的免疫反应，而不显示对A549细胞(CDCA1+，HLA-2-)的免疫反应(图4D)。
为了将源自CDCA1的肽施用于癌症免疫疗法，最重要的是CDCA1肽-反应性CTL能够显示针对内源表达CDCA1的肿瘤细胞的特异性细胞毒性。如图4E所示，对于癌症患者供体1，使用CDCA165-73(No.1)(SEQ ID NO：1)肽获得的CDCA1反应性CTL显示针对PANC1细胞(CDCA1+，HLA-A2+)的细胞毒活性，而不显示对A549细胞(CDCA1+，HLA-2-)或COLO201细胞(CDCA1-，HLA-A2+)的细胞毒活性。类似地，用CDCA1351-359(No.4)(SEQ IDNO：2)肽刺激的源自健康供体1的CTL显示对PANC1细胞(CDCA1+，HLA-A2+)的细胞毒活性，而不显示对A549细胞(CDCA1+，HLA-2-)的细胞毒活性。这些结果显示这些肽在癌细胞中天然地被加工，且与HLA-A2一起呈递于癌细胞的表面上，并可被CTL识别。
对于HLA-A2限制性CDCA1特异性的CTL的检测，自Medical &Biological Laboratories Co.Ltd.(Nagoya，Japan)购买结合有CDCA1351-359肽的PE-标记的HLA-A*0201四聚体。如图4G所示，在CD8阳性细胞中，观察到CDCA1351-359肽-反应性CTL和四聚体阳性CTL之间有强的关联。此结果证明，本研究中使用的CD8阳性T细胞之中存在HLA-A2-限制性、CDCA1肽-特异性的CTL。
讨论：
经天然加工并呈递于肿瘤细胞的源自TAA的肽的鉴定，对于建立基于肽的癌症免疫疗法来说是重要的。使用NSCLC和正常组织通过cDNA微阵列分析鉴定了作为新的癌症/睾丸抗原的CDCA1。CDCA1在NSCLC和正常睾丸中强表达，但其mRNA或蛋白质在所检查的其他正常组织中不表达。由于睾丸是与免疫系统隔离的组织，所以CDCA1反应性CTL将仅攻击NSCLC。因此，选择CDCA1作为TAA用于NSCLC患者的免疫治疗。
为了最大程度地减小由于免疫诱导治疗造成TAA缺失、突变或减少表达(它们是癌细胞免疫回避的手段)的风险，期望鉴定出对于NSCLC的增殖或存活而言必不可少的TAA，用作免疫治疗的靶标(Yoshitake Y，等Clin.Cancer Res.2004；10：6437-48)。已报道CDCA1作用于纺缍体微管和动粒(kinetochore)之间的连接，并在细胞周期的维持中起重要作用(DeLuca JG，等J.Cell Biol.2002；159：549-55)。此外，CDCA1是核分裂周期(NDC)复合物的组分，其在有丝分裂期间正确的染色体分离中起重要作用，并且无论物种是高度保守的(DeLuca JG，等Curr.Biol.2003；13：2103-9)。CDCA1对于着丝粒蛋白质E(CENP-E)在HeLa细胞中的动粒定位是必需的。siRNA对CDCA1表达的抑制可导致染色体由于有丝分裂阻断(mitosis block)而分离异常，随后诱导细胞死亡(Liu D，等J.Biol.Chem.2007；282：21415-24)。这种异常的有丝分裂逸出具有凋亡和激变(catastrophe)两者的特征(DeLuca JG，等J.Cell Biol.2002；159：549-55)。也就是说，CDCA1对于细胞功能是必需的，并在癌细胞的增殖和存活中起重要作用。
CDCA1和动粒相关的2(KNTC2)是进化上保守的着丝粒蛋白质复合物的成员(Hayama S，等Cancer Res 2006；66：10339-48)。免疫染色显示它们的表达增加与NSCLC患者的预后不良相关(Hayama S，等Cancer Res 2006；66：10339-48)。因此，CDCA1在NSCLC组织中的表达水平是预测患者外科手术后的预后的有用标记。提示CDCA1牵涉于NSCLC的进程中。因而，靶向CDCA1的免疫疗法对于预后不良的NSCLC患者可能是有效的。
在本发明中，使用HLA-A2转基因小鼠鉴定了两种HLA-A2限制性CDCA1表位肽，它们促进HLA-A2限制性小鼠CTL的生成。此外，可由以这些肽刺激的源自健康供体的PBMC制备CDCA1反应性人CTL。这些CDCA1肽-特异性CTL细胞系杀死以HLA-A2限制性方式表达CDCA1的癌细胞(图4)。
针对预计与HLA-A0201分子具有高结合亲和性的源自CDCA1的肽，使用BIMAS软件加以选择；然而，一些氨基酸序列在人和小鼠CDCA1之间不是保守的。CDCA165-73(No.1)肽的人序列和小鼠序列之间存在两个氨基酸的差异(人：YMMPVNSEV/小鼠：YMMPMNIEV)，而在CDCA1351-359(No.4)肽中存在一个氨基酸差异(人KLATAQFKI/小鼠KLATARFKI)。然而，在本发明中，确认了来自健康供体的上述表位肽-反应性的CTL的诱导。
使用所述CDCA1肽进行体外刺激，由源自健康供体的PBMC诱导出了CDCA1反应性CTL。通过呈递肽的DC诱导出的CTL以HLA-A2限制性方式显示针对表达CDCA的癌细胞的细胞毒活性。源自健康供体的CDCA1特异性CTL的诱导对于持续进一步搜索TAA是有意义的。此外，从分离自NSCLC、小细胞癌、胆管细胞癌、膀胱癌和肾细胞癌患者的PBMC诱导CDCA1反应性CTL目前在尝试中。有几种细胞介导的癌症免疫治疗方法，包括：肽或蛋白质疫苗接种(Rosenberg SA，等Nat Med 1998；4：321-7)，使用经肽、蛋白质或肿瘤裂解物冲激的树突细胞进行免疫(Kugler A，等Nat Med2000；6：332-6)，以及使用肿瘤特异性CTL系的回体过继转移(ex vivo adoptivetransfer)(Falkenburg JH，等Blood 1999；94：1201-8)。本发明中鉴定的CDCA1肽可应用于这些免疫疗法。
如果医学研究能够证明使用本发明中鉴定的肽(其经由HLA-A2被呈递给杀伤T细胞)进行的癌症免疫疗法的安全性和有效性，那么对白种人的临床应用将是可能的。此外，通过鉴定经由HLA-A2被呈递给杀伤T细胞的肽(其不仅是日本人，而且是白种人常有的)，很可能开发可用于30％的日本和白人肺癌患者的癌症免疫治疗剂。
工业实用性
HLA-A2是大约30％的日本人群所具有的HLAI型等位基因。根据本发明的CDCA1肽可诱导人细胞毒性T细胞，它们可损害表达所述肽和HLA-A2分子的复合物的癌细胞。因此，可将本发明的肽应用于HLA-A2阳性患者中的肺癌、胆管细胞癌、膀胱癌、肾细胞癌、前列腺癌、慢性髓细胞性白血病、恶性淋巴瘤、子宫颈癌、骨肉瘤、乳癌、软组织肉瘤、结肠癌的免疫治疗。因此，这些肽对于开发用于抑制这些癌症的增殖和进展的治疗剂是有用的。
序列表
<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE INC.)
<120>CDCA1肽和包含CDCA1肽的药剂
<130>ONC-A0712P
<140>PCT/JP2008/060837
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<151>2007-08-20
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1               5                   10

Claims (20)

1.下面的(A)或(B)的肽：
(A)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的肽；
(B)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成，其中取代了一个或两个氨基酸的肽，并且其中所述肽显示细胞毒性T细胞诱导活性，并且其中自N末端起第二个氨基酸是甲硫氨酸和/或C-末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
2.一种用于诱导针对表达CDCA1的癌症的免疫力的试剂，其包含一种或多种权利要求1的肽作为活性成分。
3.一种用于治疗和/或预防表达CDCA1的癌症的药剂，其包含一种或多种权利要求1的肽作为活性成分。
4.一种用于诱导显示细胞毒性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的药剂，其中所述药剂包含一种或多种权利要求1的肽作为活性成分。
5.一种用于诱导显示细胞毒性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的药剂，其中所述药剂包含编码权利要求1的肽的一种或多种多核苷酸作为活性成分。
6.一种用于诱导细胞毒性T细胞的药剂，其中所述药剂包含一种或多种权利要求1的肽作为活性成分。
7.针对权利要求1的肽的抗体。
8.使用权利要求1的肽诱导的辅助T细胞、细胞毒性T细胞或包含它们的免疫细胞群体。
9.一种抗原呈递细胞，其呈递包含权利要求1的肽及HLA抗原的复合物。
10.权利要求9的抗原呈递细胞，其是通过权利要求4或5的药剂诱导的。
11.一种外来体，其呈递包含权利要求1的肽及HLA-A2的复合物。
12.权利要求11的外来体，其中所述HLA抗原是由HLA A*0201编码的蛋白。
13.一种用于诱导显示细胞毒性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的体外方法，其包括使抗原呈递细胞与权利要求1的肽接触的步骤。
14.一种用于诱导显示细胞毒性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的体外方法，其包括将编码权利要求1的肽的多核苷酸导入抗原呈递细胞的步骤。
15.一种用于诱导细胞毒性T细胞的体外方法，其包括使T细胞与权利要求1的肽接触的步骤。
16.权利要求1的肽用于制备诱导针对表达CDCA1的癌症的免疫力的试剂的用途。
17.权利要求1的肽用于制备治疗和/或预防表达CDCA1的癌症的药剂的用途。
18.权利要求1的肽在制备用于诱导显示细胞毒性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的试剂中的用途。
19.编码权利要求1的肽的多核苷酸在制备用于诱导显示细胞毒性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的试剂中的用途。
20.权利要求1的肽在制备用于诱导细胞毒性T细胞的试剂中的用途。
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