CN1977168A - 治疗肺癌的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抑制癌细胞生长的方法，其是通过将所述细胞与PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1 siRNA的组合物相接触。本发明还包括治疗癌症的方法。本发明还涉及产品，包括核酸序列和载体以及包含它们的组合物，可用于提供的方法中。本发明还提供抑制肿瘤细胞，例如肺癌细胞，特别是NSCLC的方法。

Description

治疗肺癌的组合物和方法
本申请要求2004年3月24日提交的美国临时申请系列号60/555,757的权益，在此将其全部内容并入作为参考。
技术领域
本发明涉及生物科学领域，更具体地涉及癌症研究领域。特别地，本发明涉及包含能够抑制PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1表达的核酸的组合物。在一些实施方案中，所述核酸是对应于来自这些基因的亚序列的小干扰RNA(siRNA)。
背景技术
肺癌是世界上最常见的癌症。非小细胞肺癌(NSCLC)到目前为止是最常见的形式，几乎占肺癌的80％(American Cancer Society.Cancer Facts andfigures 2001(Am.Chem.Soc.Atlanta).2001)。尽管近来在多种形式疗法上有所进步，整体上10年存活率仍低为10％，因为大多数NSCLCs都是到晚期(advanced stage)才诊断出来(Fry，W.A.，Phillips，J.L.，和Menck，H.R.Ten-year survey of lung cancer treatment and survival in hospitals in the UnitedStates：a national cancer data base report，Cancer.86：1867-76，1999.)。尽管基于铂的化疗方案被认为是治疗NSCLC的参照标准，但那些药物只能将NSCLC晚期患者的存活延长大约六周(Chemotherapy in non-small cell lung cancer：ameta-analysis using updated data on individual patients from 52randomisedclinical trials.Non-small Cell Lung Cancer Collaborative Group，Bmj.311：899-909，1995.)。正在研究这种疾病的许多靶向疗法，包括酪氨酸激酶抑制剂，但到目前为止只在有限数目的患者中获得预期结果并且一些受体发生严重的副反应(Kris M，N.R.，Herbst RS A phase II trial of ZDl 839(′Iressa′)inadvanced non-small cell lung cancer(NSCLC)patients who had failed platinum-and docetaxel-based regimens(IDEAL 2)，Proc Am Soc Clin Oncol.21：292a(A1166)，2002.)。所以发展高效化疗药物和预防策略越来越迫切。
发明内容
本发明是基于令人吃惊的发现，即抑制PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的表达对于抑制各种癌细胞的细胞生长有效，包括那些涉及NSCLC的细胞。本申请中描述的发明是部分基于这一发现。
本发明提供抑制细胞生长的方法。提供的方法是那些包括将细胞与组合物接触的方法等，所述组合物包含抑制PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1表达的小干扰RNA(siRNA)。本发明还提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法。这些方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含特异性地与来自PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的序列杂交的小干扰RNA(siRNA)。本发明的另一方面提供在生物学样品的细胞中抑制PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因表达的方法。所述基因的表达可以通过向细胞中导入足以抑制PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因表达的量的双链核糖核酸(RNA)而得以抑制。本发明的另一方面涉及包括核酸序列和载体的产品以及涉及包含它们的组合物，可用于，例如，提供的方法中。提供的产品是当导入到表达所述基因的细胞中时具有抑制PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因表达特性的siRNA分子等。这些分子是包含有义链和反义链的分子等，其中有义链包含对应于PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1靶序列的核苷酸序列，并且其中反义链包含与所述有义链互补的核苷酸序列。所述分子的有义链和反义链彼此杂交以形成双链分子。
如本文所用的，术语“生物”指由至少一个细胞组成的任何活的实体。活的生物可以简单如，例如，单一真核细胞或复杂如哺乳动物，包括人。
如本文所用的，术语“生物学样品”指完整的生物或其组织、细胞或组成部分(例如体液，包括但不限于血液，粘液，淋巴液，滑液，脑脊液，唾液，羊水，羊膜脐带血(cord blood)，尿液，阴道液和精液)的亚组。“生物学样品”另外指由完整生物或它的细胞、组织或组成部分的亚组制备的匀浆，裂解物，提取物，细胞培养物或组织培养物，或其级分，片段或部分。最后，“生物学样品”指其中已经增殖了生物的培养基，如营养肉汤或凝胶，其包含细胞组分，如蛋白质或核酸分子。
本发明涉及抑制细胞生长的方法。通过将细胞与PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的小干扰RNA(siRNA)的组合物相接触来抑制细胞生长。将细胞进一步与转染增强剂相接触。在体外，体内或离体提供细胞。受试者是哺乳动物，例如，人，非人灵长类，小鼠，大鼠，狗，猫，马，或牛。所述细胞是肺细胞。或者，所述细胞是肿瘤细胞(即，癌细胞)如非小细胞癌细胞。例如，所述细胞是非小细胞型肺癌细胞。术语“抑制细胞生长”意为经处理的细胞以较低的速率增殖或具有比未经处理的细胞降低的生活力。通过本领域已知的增殖测定法来测定细胞生长。
术语″siRNA″意为一种双链RNA分子，其阻碍靶mRNA的翻译。使用将siRNA导入细胞中的标准技术，包括那些其中DNA是RNA转录模板的技术。所述siRNA包括有义PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1核酸序列，反义PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1核酸序列或二者都包括。所述siRNA可以包含两个互补分子或可以这样构建，从而使得单一转录本具有来自靶基因，例如，发夹结构的有义和互补反义序列，其在一些实施方案中，导致微RNA(miRNA)的产生。
使用所述方法改变细胞中的基因表达，在所述细胞中，例如，作为细胞恶性转化的结果，PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的表达上调。SiRNA结合靶细胞中的PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1转录本导致细胞产生PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1减少。寡核苷酸的长度至少大约10个核苷酸并且可以与天然存在的PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1转录本一样长。优选地，所述寡核苷酸为大约19到大约25个核苷酸长。最优选地，所述寡核苷酸小于大约100，大约75，大约50，或大约25个核苷酸和。在哺乳动物细胞中抑制PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1表达的PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的siRNA寡核苷酸的例子包括含有靶序列，例如，SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的核苷酸的寡核苷酸。
设计具有抑制靶细胞中基因表达的双链RNA的方法是已知的。(见例如，美国专利号6,506,559，在此并入其全部内容作为参考)。例如，设计siRNAs的计算机程序可在Ambion网站(http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)上获得。所述计算机程序基于下列方案选择核苷酸序列用于siRNA合成。
siRNA靶位点的选择
1.从转录本的AUG起始密码子开始，扫描下游寻找AA二核苷酸序列。记录每次AA的出现并且3’邻近的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶位点。Tuschl等，Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro.genesDev 13(24)：3191-7(1999)，并不推荐将siRNA设计至5′和3′非翻译区(UTRs)以及起始密码子附近的区域(75个碱基之内)，因为这些可能在调控蛋白结合位点上富集。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干预siRNA核酸内切酶复合物的结合。
2.将潜在靶位点与适当的基因组数据库(人，小鼠，大鼠，等)比较并且排除与其它编码序列具有显著同源性的任何靶序列。建议使用BLAST，其能够在NCBI服务器上找到：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
3.选择合乎标准的靶序列进行合成。一般顺着基因的长度选择几种靶序列。
本发明还包括分离的核酸分子，其包括靶序列的核酸序列，例如，SEQID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的核苷酸，或与SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的核苷酸的核酸序列互补的核酸分子。如本文所用的，“分离的核酸”是由其原始环境(例如，如果是天然发生的则为天然环境)分离的核酸并且因而，综合性地有别于其天然状态。在本发明中，分离的核酸包括DNA，RNA，及其衍生物。当分离的核酸是RNA或其衍生物时，在核苷酸序列中碱基“t”应当用“u”替代。如本文所用的，术语“互补的”指核酸分子的核苷酸单位之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语“结合”意为两种核酸或化合物或关联的核酸或化合物或其组合。互补的核酸序列在合适的条件下杂交以形成稳定的双螺旋，包含少许或没有错配。为了本发明的目的，具有5个或更少错配的两种序列被认为是互补的。另外，本发明的分离核酸的有义链和反义链，能够通过杂交形成双链核苷酸或发夹环结构。在优选的实施方案中，这些双螺旋对于每10个配对来说包含小于1个错配。在特别优选的实施方案，双螺旋的链完全互补，这些双螺旋不包含错配。对于PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1来说，核酸分子分别小于2831，2003，2307，1419，2539或5071个核苷酸。例如，所述核酸分子小于大约500，大约200，或大约75个核苷酸长。本发明还包括含有一种或多种本文所述核苷酸的载体，以及含有所述载体的细胞。本发明的分离的核酸可用于针对PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的siRNA，或编码siRNA的DNA。当所述核酸用于siRNA或其编码DNA时，有义链优选长于大约19个核苷酸，更加优选长于大约21个核苷酸。
本发明是基于这样的发现，即与非癌性肺组织相比，编码PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的基因在非小细胞型肺癌(NSCLC)中过表达。PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的cDNA长度分别是2831，2003，2307，1419，2539或5071个核苷酸。PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的核酸序列显示于SEQ ID NOs：1，3，5，7，9和11中。这些核苷酸序列分别在编码SEQ ID NOs：2，4，6，8，10和12的氨基酸序列的位置75..2468(NM_007183)，299..1693(NM_145697)，114..956(NM_018101)，195..1064(BC006226)，134..1819(NM_173514)和139..1431(NM_002522)上包含编码序列。序列数据也可通过下列登录号获得。
PKP3：NM_007183
CDCA1：AI015982，NM_45697
CDCA8(FLJ10468)：NM_018101
DLX5：AI278397，BC006226
URLC11(FLJ90709)：AB105188，NM_73514
NPTX1：NM_002522
包含SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的siRNAs的转染导致NSCLC细胞系的生长抑制。
抑制细胞生长的方法
本发明涉及抑制细胞生长，即，通过抑制PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的表达抑制癌细胞生长。PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的表达被，例如，小干扰RNA(siRNA)所抑制，所述小干扰RNA特异性靶向PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因。PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1靶标包括，例如，SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的核苷酸。在非哺乳动物细胞中，已经显示双链RNA(dsRNA)对基因表达发挥强烈和特异性的沉默作用，这叫作RNA干扰(RNAi)(Sharp P A.RNAi anddouble-strand RNA.genes Dev.1999Jan 15；13(2)：139-41.)。通过包含RNA酶III基序的酶将dsRNA加工成20-23个核苷酸的dsRNA，叫作小干扰RNA(siRNA)。所述siRNA特异性靶向互补性mRNA与多组分核酸酶复合物(Hammond SM et al.An RNA-directed nuclease mediatespost-transcriptional gene silencing Drosophila cells.Nature.2000Mar 16；404(6775)：293-6.，Hannon GJ.RNA interference.Nature.2002Jul11；418(6894)：244-51.)。在哺乳动物细胞中，已经显示具有19个互补核苷酸和3’末端非互补性胸腺嘧啶或尿嘧啶二聚体的，由20或21-mer dsRNA组成的siRNA，具有基因特异性敲除(knock down)作用，而不会诱导基因表达的整体变化(Elbashir SM等，Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells.Nature.2001May 24；411(6836)：494-8.)。此外，包含小核RNA(snRNA)U6或聚合酶III H1-RNA启动子的质粒有效地产生RNA聚合酶III的这种III类短RNA复原型(recruiting)并且因而能够组成性地抑制其靶mRNA(Miyagishi M等，U6promoter-drivensiRNAs with four uridine 3’overhangs efficiently suppress targeted geneexpression in mammalian cells.Nat Biotechnol.2002 May；20(5)：497-500.，Brummelkamp TR等，A System for Stable Expression of Short Interfering RNAsin Mammalian Cells.Science.Science.296(5567)；550-553，April 19，2002.)。
通过将细胞与包含PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的siRNA的组合物相接触来抑制细胞的生长。将细胞进一步与转染剂相接触。合适的转染剂是本领域已知的。术语“细胞生长的抑制”意为与未暴露所述组合物的细胞相比细胞以较低的速率增殖或生活力降低。通过本领域已知的方法测量细胞生长，如，MTT细胞增殖测定。
PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的siRNA针对PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因序列的单一靶标。或者，所述siRNA针对PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因序列的多个靶标。例如，所述组合物包含针对两种，三种，四种，或五种或更多PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1靶序列的PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的siRNA。术语“PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1靶序列”意为与PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因的部分相同的核苷酸序列。所述靶序列可以包括人PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因的5’非翻译(UT)区，开放阅读框(ORF)或3’非翻译区。或者，所述siRNA是与PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因的上游或下游调节子互补的核酸序列。上游或下游调节子的例子包括，结合PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因启动子的转录因子，与PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1多肽相互作用的激酶或磷酸酶，PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1启动子或增强子。
通过与正常情况下为单链的mRNA转录本关联，由此干扰蛋白质的翻译并且因而干扰其表达，与靶mRNA杂交的PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的siRNA减少或抑制由PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因编码的PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1多肽产物的生产。因而，本发明的siRNA分子可以通过它们与mRNA或cDNA特异性杂交的能力来进行定义，所述mRNA或cDNA来自PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因。为了本发明的目的将术语“杂交”或“特异性杂交”用来指两种核酸分子在“严格杂交条件”下杂交的能力。短语“严格杂交条件”指核酸分子将会杂交到其靶序列上，但对于其它序列不能检测到杂交的条件，所述杂交一般是在核酸的复合混合物中。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境下将有所不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。对于核酸杂交的广泛指导见Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicProbes，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays”(1993)。一般，在限定的离子强度pH下对于特异序列选择比热熔点温度(Tm)低约5-10℃的严格条件。Tm是50％的与靶标互补的探针平衡杂交(因为靶序列过量存在，于Tm下，50％的探针被平衡占据)到靶序列上的温度(在限定的离子强度，pH，和核酸浓度下)。严格条件也可以通过加入去稳定剂如甲酰胺来获得。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景的两倍，优选是背景杂交的10倍。例示性的严格杂交条件可以如下：50％甲酰胺，5xSSC，和1％SDS，于42℃下孵育，或，5x SSC，1％SDS，于65℃下孵育，在0.2xSSC，和0.1％SDS中于50℃洗涤。
本发明的siRNA长度小于大约500，大约200，大约100，大约50，或大约25个核苷酸。优选地所述siRNA为大约19到大约25个核苷酸长。生产PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1siRNA的例示性核酸包括SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72作为靶序列的核苷酸序列。另外，为了增强siRNA的抑制活性，可以将核苷酸“u”加到靶序列反义链的3’末端。添加的“u”的数目为至少大约2，一般大约为2到大约10，优选大约2到大约5。添加的“u”在siRNA的反义链3’末端形成单链。
所述细胞是表达或过表达PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的任何细胞。所述细胞为肺细胞。或者，所述细胞为肿瘤细胞如癌、腺癌、胚细胞瘤、白血病、骨髓瘤，或肉瘤。所述细胞是非小细胞肺癌细胞。
将PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的siRNA以能够结合到mRNA转录本上的形式直接导入细胞中。或者，编码PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的siRNA的DNA在载体中。
例如通过将PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1靶序列克隆入表达载体可操作连接的调控序列中来生产载体，所述调控序列以允许两条链表达(通过DNA分子的转录)的方式位于PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1序列侧翼(Lee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，and Rossi，J.(2002)Expression of smallinterfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.NatureBiotechnology 20：500-505.)。通过第一启动子(例如，克隆DNA3’的启动子序列)转录与PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1mRNA反义的RNA分子，并通过第二启动子(例如，克隆DNA5’的启动子序列)转录作为PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1mRNA有义链的RNA分子。有义链和反义链在体内杂交以生成siRNA构建体用于使PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因沉默。或者，利用两种构建体生成siRNA构建体的有义链和反义链。克隆的PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1能够编码具有二级结构，例如，发夹的构建体，其中单个转录本具有来自靶基因的有义和互补反义序列。可以将任何核苷酸序列组成的环序列位于有义和反义序列之间以便形成发夹环结构。因而，本发明还提供具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的siRNA，其中[A]是对应与来自PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因的mRNA或cDNA杂交的序列的核糖核苷酸序列。在优选的实施方案中，[A]是对应于选自核苷酸SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的序列的核糖核苷酸序列，
[B]是由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，而[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。[A]区与[A’]杂交，随后形成由[B]区组成的环。所述环序列可以优选为大约3到大约23个核苷酸长。所述环序列，例如，可以选自下列序列( http：//www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。另外，由23个核苷酸组成的环序列还提供活性siRNA(Jacque，J.-M.，Triques，K.，and Stevenson，M.(2002)Modulation of HIV-1replication by RNA interference.Nature 418：435-438.)。CCC，CCACC或CCACACC：Jacque，J.M，Triques，K.，和Stevenson，M(2002)Modulation of HIV-1replication by RNA interference.Nature，Vol.418：435-438。UUCG：Lee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsari，A.，Salvaterra，P.，和Rossi，J.(2002)Expression of small interfering RNAs targeted againstHIV-1rev transcripts in human cells.Nature Biotechnology 20：500-505.Fruscoloni，P.，Zamboni，M.，and Tocchini-Valentini，G.P.(2003)Exonucleolyticdegradation of double-stranded RNA by an activity in Xenopus laevis germinalvesicles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(4)：1639-1644。UUCAAGAGA：Dykxhoorn，D.M.，Novina，C.D.，and Sharp，P.A.(2002)Killing the messenger：Short RNAs that silence gene expression.Nature ReviewsMolecular Cell Biology 4：457-467。
例如，下列显示本发明的具有发夹环结构的优选siRNA。在下列结构中，所述环序列可以选自，CCC，UUCG，CCACC，CCACACC，和UUCAAGAGA。优选的环序列为UUCAAGAGA(在DNA中为“ttcaagaga”)。
ccuguggcaguacaacaag-[b]-cuuguuguacugccacagg(SEQ ID NO：58的靶序列)
ugccagacaagaaguggug-[b]-caccacuucuugucuggca(SEQ ID NO：59的靶序列)
gaugcugcugaaagggaga-[b]-ucucccuuucagcagcauc(SEQ ID NO：60的靶序列)
cagcagaagcuauucagac-[b]-gucugaauagcuucugcug(SEQ ID NO：61的靶序列)
gguguccuccauccaagaa-[b]-uucuuggauggaggacacc(SEQ ID NO：62的靶序列)
gccgugcuaacacuguuac-[b]-guaacaguguuagcacggc(SEQ ID NO：63的靶序列)
gaagcucuccaaccgucuc-[b]-gagacgguuggagagcuuc(SEQ ID NO：64的靶序列)
gacucaguaccucgccuug-[b]-caaggcgagguacugaguc(SEQ ID NO：65的靶序列)
gguuucagaagacucagua-[b]-uacugagucuucugaaacc(SEQ ID NO：66的靶序列)
gugcagccagcucaaucaa-[b]-uugauugagcuggcugcac(SEQ ID NO：67的靶序列)
gagaauucauuacuacagc-[b]-gcuguaguaaugaauucuc(SEQ ID NO：68的靶序列)
ggauauuccugcuguucca-[b]-uggaacagcaggaauaucc(SEQ ID NO：69的靶序列)
gauauucaggagcagcaug-[b]-caugcugcuccugaauauc(SEQ ID NO：70的靶序列)
ggagaccauccugagccag-[b]-cuggcucaggauggucucc(SEQ ID NO：71的靶序列)
guggaccuucgaggccugu-[b]-acaggccucgaagguccac(SEQ ID NO：72的靶序列)
在PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1序列侧翼的调控序列是相同或不同的，从而使得它们的表达可以独立地进行调节，或以时间或空间的方式进行调节。通过将PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因模板克隆入载体中来在细胞内转录siRNA，所述载体包含，例如，来自小核RNA(snRNA)U6或人H1RNA启动子的RNA聚合酶III转录单元。为了将载体导入细胞中，可以使用转染增强剂。FuGENE(RocheDiagnostices)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，Oligofectamine(Invitrogen)，和Nucleofector(Wako pure Chemical)可以用作转染增强剂。
根据标准方法在体外对PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1mRNA各部分的寡核苷酸及其互补寡核苷酸测试其减少PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1在肿瘤细胞(例如，使用NSCLC细胞系如A549，LC319或LC176)中的生产的能力。与不存在候选组合物时培养的细胞相比，利用PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1特异性抗体或其它检测策略检测在接触候选siRNA组合物的细胞中PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因产物的减少。随后在体外基于细胞的或无细胞的测定法中对减少PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1产生的序列测试其对细胞生长的抑制作用。对于在体外基于细胞的测定法中抑制细胞生长的序列，在体内于大鼠或小鼠中进行测试以确认在患有恶性瘤的动物中PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1生产减少并且肿瘤细胞生长减少。
治疗恶性肿瘤的方法
通过施用PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的siRNA来治疗特征为过表达PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的肿瘤患者。利用siRNA疗法抑制患有，或者有发展成，例如，非小细胞肺癌细胞危险的患者中PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的表达。这些患者通过特定肿瘤类型的标准方法进行鉴定。通过例如，计算机X射线断层摄影，胸腔镜检查，胸腔X射线，唾液细胞学，TBB(贯穿支气管活组织检查)，MRI(磁共振成像)或FDG-PET(18F-荧光脱氧葡萄糖-正电子发射断层摄影)来诊断非小细胞肺癌细胞。
如果治疗带来临床益处如，PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1表达的减弱，或受试者中肿瘤的大小、流行，或转移潜力的减小，则治疗是有效的。当预防性应用治疗时，“有效的”意为所述治疗阻止或预防肿瘤形成或预防或减轻肿瘤的临床症状。结合诊断或治疗特定肿瘤类型的任何已知方法确定有效性。
通过编码本发明的siRNAs的标准载体和/或基因递送系统如通过递送合成的siRNA分子向患者施用siRNA来实施siRNA疗法。一般，将合成的siRNA分子进行化学稳定以防止体内核酸酶降解。制备化学稳定RNA分子的方法是本领域公知的。一般，这些分子包含经修饰的主链和核苷酸以防止核糖核酸酶的作用。其它的修饰也是可能的，例如，胆固醇缀合的siRNAs已经显示改良的药学特性。(Song等，Nature Med.9：347-351(2003))：合适的基因递送系统可以包括脂质体，受体介导的递送系统，或病毒性载体如疱疹病毒、反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等等。将治疗性核酸组合物配制在可药用的载体中。治疗性组合物还可以包括如上所述的基因递送系统。可药用的载体为生物相容性媒介物，其适于向动物给药，例如，生理盐水。治疗上有效量的化合物是能够产生药学预期结果的量，如PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因产物的产生减少，细胞生长，例如，增殖的减少，或在被治疗动物中肿瘤生长的减少。
可以使用胃肠外给药，如静脉内，皮下，肌内，和腹膜内递送途径来递送PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的siRNA组合物。为了治疗肺部肿瘤，可以使用气管给药，CT引导下注射或用胸腔镜检查。
对任何一位患者的剂量都依赖于许多因素，包括患者的体格大小、体表面积、待施用的特定核酸、性别、给药时间和途径、一般健康状况，和同时给药的其它药物。核酸的静脉给药剂量为从大约106到1022个拷贝的核酸分子。
通过标准方法施用多核苷酸，如通过注射入诸如肌肉或皮肤的组织的间质空间，导入循环系统或导入体腔，或通过吸入或吹入。以可药用的液体载体，例如，水性或部分水性的液体载体，将多核苷酸注射或者递送给动物。所述多核苷酸与脂质体(例如，阳离子或阴离子脂质体)。所述多核苷酸包括靶细胞表达所必需的遗传信息，如启动子。
除非另外指定，本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的意义相同。尽管在本发明的实践和检验中可以使用与本文所述相类或等同的方法和材料，下面描述适合的方法和材料。将本文提及的所有出版物、专利申请、专利，和其它参考文献的全部内容并入作为参考。在出现冲突的情况下，本说明书，包括定义，将进行控制。此外，所述材料，方法，和实施例仅仅是说明性的，并不是限制性的。
附图简述
图1描述了PKP3的表征。图1a显示了说明在正常组织样品中PKP3表达的Northern印迹照片。图1b和1c显示了照片，它显示了PKP3的siRNA对PKP3mRNA的抑制。图1d和1e显示了柱状图(MTT测定)，其显示PKP3的siRNA对细胞生长的抑制。在对照siRNA中，(EGFP)显示了用EGFP的siRNA转染的NSCLC细胞；(LUC)，用荧光素酶-GL2的siRNA转染的NSCLC细胞；和(SCR)，Scramble的siRNA转染的NSCLC细胞。图1f是显示当用c-myc-His标记的PKP3表达质粒转染COS-7细胞时，通过免疫细胞化学分析进行PKP3的亚细胞定位的照片。(左面)：用抗-c-myc-罗丹明抗体检测的PKP3，(中间)：用缀合到FITC上的抗-PKP3抗体检测的PKP3，(右面)：包括DAPI染色的MERGE图像。PKP3/c-myc-His蛋白主要在核周和细胞质膜中进行检测。图1g显示了Matrigel侵入测定，表明当人PKP3表达质粒转染时(Giemsa染色)促进在Matrigel基质中COS-7细胞侵入性质。
图2描述了CDCA1的表征。图2a显示了说明在正常组织样品中CDCA1表达的Northern印迹照片。图2b显示了照片，它显示了CDCA1的siRNA对CDCA1mRNA的抑制。图2c是柱状图(MTT测定)，其显示CDCA1的siRNA对细胞生长的抑制。在对照siRNA中，(EGFP)显示了用EGFP的siRNA转染的NSCLC细胞；(LUC)，用荧光素酶-GL2的siRNA转染的NSCLC细胞；和(SCR)，Scramble的siRNA转染的NSCLC细胞。
图3描述了CDCA8的表征。图3a显示了说明在正常组织样品中CDCA8表达的Northern印迹照片。图3b显示了照片，它显示了CDCA8的siRNA对CDCA8mRNA的抑制。在对照siRNA中，(EGFP)显示了用EGFP的siRNA转染的NSCLC细胞；(LUC)，用荧光素酶-GL2的siRNA转染的NSCLC细胞；和(SCR)，Scramble的siRNA转染的NSCLC细胞。
图4描述了DLX5的表征。图4a显示了说明在正常组织样品中DLX5表达的Northern印迹照片。图4b显示了照片，它显示了DLX5的siRNA对DLX5mRNA的抑制。图4c是柱状图(MTT测定)，其显示DLX5的siRNA对细胞生长的抑制。在对照siRNA中，(EGFP)显示了用EGFP的siRNA转染的NSCLC细胞；(LUC)，用荧光素酶-GL2的siRNA转染的NSCLC细胞；和(SCR)，Scramble的siRNA转染的NSCLC细胞。
图5描述了URLC11的表征。图5a显示了照片，它显示了URLC11的siRNA对URLC11mRNA的抑制。图5b是柱状图(MTT测定)，其显示URLC11的siRNA对细胞生长的抑制。在对照siRNA中，(EGFP)显示了用EGFP的siRNA转染的NSCLC细胞；(LUC)，用荧光素酶-GL2的siRNA转染的NSCLC细胞；和(SCR)，Scramble的siRNA转染的NSCLC细胞。
图6描述了NPTX1的表征。图6a和6b显示了照片，它显示了NPTX1的siRNA对NPTX1mRNA的抑制。图6c和6d是柱状图(MTT测定)，其显示NPTX1的siRNA对细胞生长的抑制。在对照siRNA中，(EGFP)显示了用EGFP的siRNA转染的NSCLC细胞；(LUC)，用荧光素酶-GL2的siRNA转染的NSCLC细胞；和(SCR)，用Scramble的siRNA转染的NSCLC细胞。
实施发明的最佳方式
将在下列实施例中对本发明作进一步描述，所述实施例并不限制在权利要求书中所述的本发明的范围。
[实施例1]一般性方法
细胞系和组织样本
将二十一种人NSCLC细胞系单层生长于合适的培养基中，所述培养基添加了5或10％的胎牛血清(见表1)。
表1
  细胞系名称   培养基
  腺癌(ADC)
  A549   RPMI-1640(10％FBS)
  NCI-H23   RPMI-1640(10％FBS)
  NCI-H522   RPMI-1640(10％FBS)
  LC174   RPMI-1640(10％FBS)
  LC176   RPMI-1640(10％FBS)
  LC319   RPMI-1640(10％FBS)
  PC-3   DMEM(10％FBS)
  PC-9   DMEM(10％FBS)
  PC14   RPMI-1640(10％FBS)
  PC14-PE6   RPMI-1640(10％FBS)
  NCI-H1373   RPMI-1640(10％FBS)
  NCI-H1435   F12+DMEM(5％FB S)+EGF(+)
  NCI-H1793   F12+DMEM(5％FBS)+G1u
  SK-LU-1   DMEM(10％FBS)
 BAC   NCI-H358   RPMI-1640(10％FBS)
 BAC   NCI-H1650   RPMI-1640(10％FBS)
 BAC   SW1573   Leibovitz′s L-15(10％FBS)
  鳞状细胞癌(SCC)
  RERF-LC-AI   DMEM(10％FBS)
  SW-900   Leibovitz′s L-15(10％FBS)
  SK-MES-1   DMEM(10％FBS)
 adenosquamous   NCI-H596   RPMI-1640(10％FBS)
通过利用cDNA微阵列分离NSCLC细胞中的过表达基因
已经描述过cDNA微阵列载玻片的制作(Ono K，Tanaka T，Tsunoda T，Kitahara O，Kihara C，Okamoto A，Ochiai K，Takagi.T.and Nakamura Y.CancerRes.，60：5007-5011，2000)。对于表达模式的每次分析都准备双套的包含大约23,040 DNA斑点的cDNA微阵列载玻片，以减少实验波动。简言之，从NSCLC细胞中纯化总RNA。实施基于T7的RNA扩增以获得足够的RNA用于微阵列实验。作为对照探针，以相同方式扩增正常的人肺多[A]RNA(CLONTEC)。分别用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP(Amersham Biosciences)的反转录来标记等份的由NSCLC细胞和正常肺细胞扩增的RNA。如上所述进行杂交，洗涤，和检测(Ono K，Tanaka T，Tsunoda T，Kitahara O，Kihara C，Okamoto A，Ochiai K，Takagi T，and Nakamura Y.Cancer Res.，60：5007-5011，2000)。随后，在上调的基因中，注意集中到六种基因上，PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11和NPTX1。
RNA制备和RT-PCR
根据生产商的方案使用Tizol试剂(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD，USA)从培养的细胞和临床组织中抽提总RNA。用DNA酶I(RocheDiagnostics，Basel，Switzerland)处理抽提的RNA并以SuperscriptII反转录酶(Life Technologies，Inc.)利用寡(dT)12-18引物反转录成单链cDNAs。通过监测作为量化对照的β-肌动蛋白(ACTB)或β-2-微球蛋白基因(B2M)来制备每种单链cDNA的适当稀释液用于随后的PCR扩增。所有反应者包括开始于94℃变性2min，后接18(对于ACTB或B2M来说)或25-30个循环(对于本发明的每种基因来说)在GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems)上于94℃30s，58-62℃30s和72℃45s。下面列出引物序列：对于PKP3
正向；5′-ATGCAGGACGGTAACTTCCTGC-3′(SEQ ID NO：73)
反向；5′-TGGGCCCAGGAAGTCCTCCTT-3′(SEQ ID NO：74)
对于CDCA1
正向；5′-GAGAAACTGAAGTCCCAGGAAAT-3′(SEQ ID NO：75)
反向；5′-CTGATACTTCCATTCGCTTCAAC-3′(SEQ ID NO：76)
对于CDCA8
正向；5′-CATCTGGCATTTCTGCTCTCTAT-3′(SEQ ID NO：77)
反向；5′-CTCAGGGAAAGGAGAATAAAAGAAC-3′(SEQ ID NO：78)
对于DLX5
正向；5′-GGGACTACTGTGTTTTGCTGTTC-3′(SEQ ID NO：79)
反向；5′-TGAGGTCATAGATTTCAAGGCAC-3′(SEQ ID NO：80)
对于URLC11
正向；5′-CTAGGAAGAAATCATGCTGGGTT-3′(SEQ ID NO：81)
反向；5′-GTATTTGGCTTACTGTCCCAAAC-3′(SEQ ID NO：82)
对于NPTX1
正向；5′-TAACCTTGATAGAAGAACCTTGG-3′(SEQ ID NO：83)
反向；5′-GCAAATGAGACAAAATTGGGAC-3′(SEQ ID NO：84)
Northern印迹分析
将32P-标记的PCR产物与人多组织斑点(BD Biosciences Clontech)杂交。根据供应商的推荐进行预杂交，杂交和洗涤。将斑点于-80℃在强化屏上进行放射自显影96-168小时。
为了确定组织分布和每种基因的大小，利用人cDNA作为探针进行人多组织RNA斑点印迹分析。
psiH1BX3.0质粒的构建
为了制备表达短干扰RNA(siRNA)的质粒载体，利用一组引物，5’-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3’(SEQ  ID  NO；85)，和5’-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3’(SEQ ID NO；86)以及人胎盘DNA作为模板，通过PCR扩增包含其启动子区的H1RNA基因的基因组片段。根据供应商的方案(Invitrogen)使用TA克隆试剂盒将产物纯化并克隆入pCR2.0质粒载体中。将包含H1RNA的BamHI和XhoI片段克隆入pcDNA3.1(+)核苷酸1257-56，利用
5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQ ID NO；87)和5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQ ID NO；88)通过PCR扩增该片段。
连接的DNA成为模板用于以下列引物进行PCR扩增，
5’-
TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3’(SEQ ID NO；89)和
5’-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3’(SEQ ID NO；90)。
用HindIII消化产物，随后自连接以产生psiH1BX3.0载体质粒，其具有SEQ ID NO：91中所示的核苷酸序列。
将编码siRNA的DNA片段于核苷酸489-492上插入GAP中，如下列质粒序列(SEQ ID NO：91)中所示(-)。
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAAT
CTGCTCTGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGGCTT
GGTAGCCAAGTGCAGGTTATAGGGAGCTGAAGGGAAGGGGGTCACAG
TAGGTGGCATCGTTCCTTTCTGACTGCCCGCCCCCCGCATGCCGTCCCG
CGATATTGAGCTCCGAACCTCTCGCCCTGCCGCCGCCGGTGCTCCGTCG
CCGCCGCGCCGCCATGGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCC
AAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCG
TGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCC
TGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTG
AAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTCTT
TCCC---
-TTTTTGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGAAACCGGGCCGGGC
GCGGTGGTTCACGCCTATAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGG
CGGATCACAAGGTCAGGAGGTCGAGACCATCCAGGCTAACACGGTGA
AACCCCCCCCCATCTCTACTAAAAAAAAAAAATACAAAAAATTAGCCA
TTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTATAATCCCAGCTACTTGGGAGG
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GAGATCGCGCCGACTGCATTCCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGTCTCAA
AAAAAAAACCGAGTGGAATGTGAAAAGCTCCGTGAAACTGCAGAAAC
CCAAGCCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGTG
AGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCC
TGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTG
ACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCC
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GGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCC
AAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGAT
AGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGG
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TTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGA
GCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTC
AGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGC
AAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAG
GCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAG
CAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCC
CAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATG
CAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAG
GAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTT
GTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCG
CATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGT
GGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTC
TGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTT
TGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGG
CAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTG
TGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCG
AAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGA
AAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCC
GGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGC
ACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGA
AGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGG
CGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCT
GCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGA
CTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGC
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CCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTC
TATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAAT
GACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCAC
CGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGC
CGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCC
CACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAG
CATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTG
GTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACC
TCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAA
ATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAA
GTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCG
TTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTG
CATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGG
CGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGC
TGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCA
CAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAG
CAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCAT
AGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAG
AGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCT
GGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGAT
ACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTC
ACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGC
TGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGT
AACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTG
GCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGT
GCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGA
ACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAA
GAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTT
TTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAG
AAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAA
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CTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATAT
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACC
TATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCG
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ATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAAC
TTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAA
GTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGG
CATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGT
TCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAA
GCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCG
CAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTC
ATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGT
CATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTC
AATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATC
ATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTG
TTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAG
CATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC
AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATA
CTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGT
CTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAG
GGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
通过将双链寡核苷酸克隆入psiH1BX载体的Bbs1位点来制备siRNA表达载体。
表达siRNA的构建体
利用可由Ambion网站( http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)获得的siRNA设计计算机程序来设计siRNAs的核苷酸序列。简言之，利用下列方案选择用于siRNA合成的核苷酸序列。
SiRNA靶向位点的选择：
1.以每种基因转录本的AUG起始密码子开始，进行下游扫描AA双核苷酸序列。将每次AA和3’邻近19个核苷酸记录作为潜在的siRNA靶向位点。Tuschl等不推荐将siRNA指定于5’和3’非翻译区(UTRs)以及起始密码子附近(75个碱基之内)的区域，因为这些可能在调控蛋白结合位点中富集。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可以干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。
2.将所述潜在靶向位点与适合的基因组数据库(人，小鼠，大鼠，等)比较以排除与其它编码序列具有显著同源性的靶序列。
3.选择合格的靶序列进行合成。沿着基因的长度选择几个靶序列进行评估。下面显示对于PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC 11或NPTX1的siRNAs所用的寡核苷酸。每个寡核苷酸都是靶序列的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列的组合。发夹环结构的核苷酸序列和siRNAs的靶序列分别显示于SEQ ID NO：43到SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58到SEQ ID NO：72中(从每个发夹环结构序列中除去了核酸内切酶识别位点)。另外，发夹环结构的核苷酸序列和对照siRNAs(psiH1BX-EGFP，psiH1BX-LUC或psiH1BX-SCR(Scramble))的靶序列分别显示于SEQ ID NO：98到SEQ IDNO：100和SEQ ID NO：101到SEQ ID NO：103中。PKP3的siRNA表达载体的插入序列；
siRNA2：
5′-TCCCCCTGTGGCAGTACAACAAGTTCAAGAGACTTGTTGTACTGCCACAGG-3′(SEQ ID NO：13)和
5′-AAAACCTGTGGCAGTACAACAAGTCTCTTGAACTTGTTGTACTGCCACAGG-3′(SEQ ID NO：14)
CDCA1的siRNA表达载体的插入序列；
siRNA1：
5′-TCCCTGCCAGACAAGAAGTGGTGTTCAAGAGACACCACTTCTTGTCTGGCA-3′(SEQ ID NO：15)和
5′-AAAATGCCAGACAAGAAGTGGTGTCTCTTGAACACCACTTCTTGTCTGGCA-3′(SEQ ID NO：16)
siRNA2：
5′-TCCCGATGCTGCTGAAAGGGAGATTCAAGAGATCTCCCTTTCAGCAGCATC-3′(SEQ ID NO：17)和
5′-AAAAGATGCTGCTGAAAGGGAGATCTCTTGAATCTCCCTTTCAGCAGCATC-3′(SEQ ID NO：18)
CDCA8的siRNA表达载体的插入序列；
siRNA1：
5′-TCCCCAGCAGAAGCTATTCAGACTTCAAGAGAGTCTGAATAGCTTCTGCTG-3′(SEQ ID NO：19)和
5′-AAAACAGCAGAAGCTATTCAGACTCTCTTGAAGTCTGAATAGCTTCTGCTG-3′(SEQ ID NO：20)
siRNA2：
5′-TCCCGGTGTCCTCCATCCAAGAATTCAAGAGATTCTTGGATGGAGGACACC-3′(SEQ ID NO：21)和
5′-AAAAGGTGTCCTCCATCCAAGAATCTCTTGAATTCTTGGATGGAGGACACC-3′(SEQ ID NO：22)
siRNA3：
5′-TCCCGCCGTGCTAACACTGTTACTTCAAGAGAGTAACAGTGTTAGCACGGC-3′(SEQ ID NO：23)和
5′-AAAAGCCGTGCTAACACTGTTACTCTCTTGAAGTAACAGTGTTAGCACGGC-3′(SEQ ID NO：24)
siRNA4：
5′-TCCCGAAGCTCTCCAACCGTCTCTTCAAGAGAGAGACGGTTGGAGAGCTTC-3′(SEQ ID NO：25)和
5′-AAAAGAAGCTCTCCAACCGTCTCTCTCTTGAAGAGACGGTTGGAGAGCTTC-3′(SEQ ID NO：26)
DLX5的siRNA表达载体的插入序列；
siRNA2：
5′-TCCCGACTCAGTACCTCGCCTTGTTCAAGAGACAAGGCGAGGTACTGAGTC-3′(SEQ ID NO：27)和
5′-AAAAGACTCAGTACCTCGCCTTGTCTCTTGAACAAGGCGAGGTACTGAGTC-3′(SEQ ID NO：28)
siRNA6：
5′-
TCCCGGTTTCAGAAGACTCAGTATTCAAGAGATACTGAGTCTTCTGAAACC-3′(SEQ ID NO：29)和
5′-
AAAAGGTTTCAGAAGACTCAGTATCTCTTGAATACTGAGTCTTCTGAAACC-3′(SEQ ID NO：30)
siRNA7：
5′-
TCCCGTGCAGCCAGCTCAATCAATTCAAGAGATTGATTGAGCTGGCTGCAC-3′(SEQ ID NO：31)和
5′-
AAAAGTGCAGCCAGCTCAATCAATCTCTTGAATTGATTGAGCTGGCTGCAC-3′(SEQ ID NO：32)
URLC11的siRNA表达载体的插入序列；
siRNA1：
5′-TCCCGAGAATTCATTACTACAGCTTCAAGAGAGCTGTAGTAATGAATTCTC-3′(SEQ ID NO：33)和
5′-AAAAGAGAATTCATTACTACAGCTCTCTTGAAGCTGTAGTAATGAATTCTC-3′(SEQ ID NO：34)
siRNA3：
5′-TCCCGGATATTCCTGCTGTTCCATTCAAGAGATGGAACAGCAGGAATATCC-3′(SEQ ID NO：35)和
5′-AAAAGGATATTCCTGCTGTTCCATCTCTTGAATGGAACAGCAGGAATATCC-3′(SEQ ID NO：36)
siRNA4：
5′-TCCCGATATTCAGGAGCAGCATGTTCAAGAGACATGCTGCTCCTGAATATC-3′(SEQ ID NO：37)和
5′-AAAAGATATTCAGGAGCAGCATGTCTCTTGAACATGCTGCTCCTGAATATC-3′(SEQ ID NO：38)
NPTX1的siRNA表达载体的插入序列；
siRNA1：
5′-TCCCGGAGACCATCCTGAGCCAGTTCAAGAGACTGGCTCAGGATGGTCTCC-3′(SEQ ID NO：39)和
5′-AAAAGGAGACCATCCTGAGCCAGTCTCTTGAACTGGCTCAGGATGGTCTCC-3′(SEQ ID NO：40)
siRNA2：
5′-TCCCGTGGACCTTCGAGGCCTGTTTCAAGAGAACAGGCCTCGAAGGTCCAC-3′(SEQ ID NO：41)和
5′-AAAAGTGGACCTTCGAGGCCTGTTCTCTTGAAACAGGCCTCGAAGGTCCAC-3′(SEQ ID NO：42)
对照siRNA表达载体的插入序列
psiH1BX-EGFP(EGFPsi)
5’-
CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO；92)和
5’-
AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO；93)
psiH1BX-LUC(LUCsi)
TCCCCGTACGCGGAATACTTCGATTCAAGAGATCGAAGTATTCCGCGTACG(SEQ ID NO；94)和
AAAACGTACGCGGAATACTTCGATCTCTTGAATCGAAGTATTCCGCGTACG(SEQ ID NO；95)
psiH1BX-SCR(SCRsi)
TCCCGCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC(SEQ ID NO；96)和
AAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGTCTCTTGAACGAATCCTACAAAGCGCGC(SEQ ID NO；97)
每个序列的序列编号列于表2中。
基因 siRNA   插入序列SEQ IDNO.   插入序列SEQID NO. 发夹siRNA 靶序列 位置
  PKP3   Si2   13   14  43   58   2393-2411
  CDCA1   Si1   15   16  44   59   1099-1117
  Si2   17   18  45   60   1526-1544
  CDCA8   Si1   19   20  46   61   412-430
  Si2   21   22  47   62   544-562
  Si3   23   24  48   63   607-625
  Si4   25   26  49   64   902-920
  DLX5   Si2   27   28  50   65   668-686
  Si6   29   30  51   66   658-676
  Si7   31   32  52   67   979-997
  URLC11   Si1   33   34  53   68   331-349
  Si3   35   36  54   69   1464-1482
  Si4   37   38  55   70   1653-1671
  NPTX1   Si1   39   40  56   71   339-357
  Si2   41   42  57   72   1398-1416
  对照   EGFPsi   92   93  98   101
  对照   LUCsi   94   95  99   102
  对照   SCRsi   96   97  100   103
RNA干扰测定
利用在哺乳动物细胞中指导小干扰RNAs(siRNAs)合成的基于载体的RNAi系统，psiH1BX3.0来抑制NSCLC细胞中每种内源基因的表达。利用Lipofectamine2000试剂(Invitrogene，Carlsbad，CA，USA)将载体转染入NSCLC细胞系中，这导致具有大于60-90％转染效率的转染。在合适浓度geneticin(G418)的存在下将细胞培养5-9天。在一式三份Giemsa染色和/或MTT测定后确定细胞数目或细胞生存力。
免疫细胞化学分析
为了制备c-myc-His标记的蛋白质，构建包含编码每种蛋白质C末端c-myc-His抗原表位序列(LDEESILKQE-HHHHHH)的质粒，pcDNA3.1(+)/c-myc-His，并转染入COS-7细胞中。用包含4％聚甲醛的PBS固定重铺于chamber slides上的瞬时转染的COS-7细胞，随后用包含0.1％TritonX-100的PBS于4℃处理3min使其具有渗透性。将细胞于室温覆以封闭溶液(2％BSA于PBS中)30min以封闭非特异性抗体结合位点。随后将细胞与小鼠抗-c-myc抗体(于封闭溶液中稀释1∶800)一起孵育。将该抗体用缀合了FITC的羊抗小鼠二抗进行染色以便在ECLIPSE E800显微镜(Nikon)下观察。具体地对于PKP3来说，用小鼠抗-c-myc-罗丹明抗体(在封闭溶液中稀释1：800)，或缀合了FITC的抗-PKP3抗体对细胞进行染色以便在ECLIPSEE800显微镜(Nikon)下观察它们。
3-(4，5-二甲基噻嗪2-基)-2，5-二苯基四唑溴(MTT)测定
用psiH1BX3.0-siRNAs或对照质粒转染细胞并维持在添加了优选浓度的geneticin的培养基中。在转染后六到十二天，用包含500μg/ml的MTT(3-(4，5-二甲基噻嗪-2-基)-2，5-二苯基四唑溴)(Sigma)的新鲜培养基替换培养基并将培养权在37℃孵育四小时。随后，通过加入1ml的0.01N HCl/10％SDS裂解细胞并在570nm的测试波长上(参照，630nm)用ELISA板读取器测量裂解物的吸光度。细胞生活力由与对照细胞相比较的吸光度所表示。
Matrigel侵入测定
在包含10％胎牛血清的DMEM中将以表达PKP3的质在或mock质粒瞬时转染的COS-7细胞生长至接近汇合。通过胰蛋白酶化作用收集细胞并随后在DMEM中洗涤而无需加入血清或蛋白酶抑制剂。将细胞以1×105/ml悬浮于DMEM中。在制备细胞悬浮液之前，用DMEM将干燥的Matrigel基质(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA，USA)层于室温重新水化2小时。将包含10％胎牛血清的DMEM(0.75ml)加入到24-孔Matrigel侵入槽的每个下层槽中，并将0.5ml(5×104细胞)的细胞悬浮液加入到上层槽的插入部分中。将插入部分的板在37℃孵育22小时。在孵育后对所述槽进行处理并固定穿过Matrigel涂布的插入部分侵入的细胞并如供应商(BectonDickinson)指导的那样进行Giemsa染色。
[实施例2]结果
先前通过包含23,040个基因的cDNA微阵列进行了上调基因的筛选(Kikuchi，T.，Daigo，Y.，Katagiri，T.，Tsunoda，T.，Okada，K.，Kakiuchi，S.，Zembutsu，H.，Furukawa，Y.，Kawamura，M.，Kobayashi，K.，Imai，K.，和Nakamura，Y.Expression profiles of non-small cell lung cancers on cDNAmicroarrays：identification of genes for prediction of lymph-node metastasis andsensitivity to anti-cancer drugs，Oncogene.22：2192-205，2003.)。通过继续进行这种策略，在很大部分的临床NSCLC和细胞系中鉴定了六种基因的过量表达。在本发明中，揭示了六种基因：plakophilin 3(PKP3)，细胞分裂周期相关型1(CDCA1)，细胞分裂周期相关型8(CDCA8)，distal-less homeo box 5(DLX5)，URLC11和神经元pentraxin 1(NPTX1)为潜在的分子靶标用于治疗肺癌。
(1)PKP3：(Genbank编号NM_007183)
Northern印迹
利用人PKP3cDNA作为探针的Northern印迹分析检测了在心、胎盘、胰、前列腺、小肠、胃、甲状腺和气管中3kb的转录本(图1a)。
RNAi
为了评估PKP3对于肺癌细胞的生长或存活是否是必需的，我们设计并构建了质粒表达针对PKP3的siRNA(si2)，和三种不同的对照质粒(EGFP，荧光素酶(LUC)，或Scramble(SCR)的siRNAs)，并将它们转染入A549和LC319细胞中以抑制内源性PKP3的表达。与用任何三种对照siRNAs转染的细胞相比用si2转染的细胞中PKP3转录本的量显著降低(图1b，1c)；通过MTT(图1d，1e)和集落形成测定法(数据未显示)测量，si2的转染还导致细胞生活力和集落数的显著降低。
免疫细胞化学分析
为了确定由这种基因编码的蛋白质的亚细胞定位，用c-myc-His标记的PKP3表达质粒转染COS-7细胞。通过免疫细胞化学分析我们主要在核周和细胞质膜中检测到PKP3/c-myc-His蛋白(图1f)。
Matrigel侵入测定
用COS-7-PKP3细胞进行Matrigel侵入测定。与转染了mock质粒的对照细胞相比，穿过Matrigel的COS-7-PKP3细胞的侵入得到显著提高(图1g)。
(2)CDCA1：(Genbank编号NM_145697)
Northern印迹
利用人CDCA1cDNA作为探针的Northern印迹分析检测了在睾丸中2.4kb的转录本(图2a)。
RNAi
为了评估CDCA1对于肺癌细胞的生长或存活是否是必需的，我们设计并构建了质粒表达针对CDCA1的siRNA(si1，si2)，和三种不同的对照质粒(EGFP，LUC，或SCR的siRNAs)，并将它们转染入LC319细胞中以抑制内源性CDCA1的表达。与用任何三种对照siRNAs转染的细胞相比用si1和si2转染的细胞中CDCA1转录本的量显著降低(图2b)；通过MTT测量(图2c)和集落形成测定法(数据未显示)测量，si1和si2的转染还导致细胞生活力和集落数的显著降低。
免疫细胞化学分析
为了确定由这种基因编码的蛋白质的亚细胞定位，用c-myc-His标记的CDCA1表达质粒转染COS-7细胞。通过免疫细胞化学分析我们主要在核和细胞质中检测到CDCA1/c-myc-His蛋白(数据未显示)。
(3)CDCA8：(Genbank编号N_ 018101)
利用人CDCA8 cDNA作为探针的Northern印迹分析检测了在睾丸中2.4kb的转录本(图3a)。
RNAi
为了评估CDCA8对于肺癌细胞的生长或存活是否是必需的，我们设计并构建了质粒表达针对CDCA8的siRNA(si1，si2，si3，si4)，和三种不同的对照质粒(EGFP，LUC，或SCR的siRNAs)，并将它们转染入LC319(数据未显示)和A549细胞中以抑制内源性CDCA8的表达。与用任何三种对照siRNAs转染的细胞相比用si1，si2，si3和si4转染的细胞中CDCA8转录本的量显著降低(图3b)；通过集落形成测定法(数据未显示)测量，si1，si2，si3和si4的转染还导致集落数的显著降低。
免疫细胞化学分析
为了确定由这种基因编码的蛋白质的亚细胞定位，用c-myc-His标记的CDCA8表达质粒转染COS-7细胞。通过免疫细胞化学分析我们主要在核和细胞质中检测到CDCA8/c-myc-His蛋白(数据未显示)。
(4)DLX5：(Genbank编号BC006226)
Northern印迹
利用人DLX5 cDNA作为探针的Northern印迹分析检测了在胎盘中1.5kb的转录本(图4a)。
RNAi
为了评估DLX5对于肺癌细胞的生长或存活是否是必需的，我们设计并构建了质粒表达针对DLX5的siRNA(si2，si6，si7)，和三种不同的对照质粒(EGFP，LUC，或SCR的siRNAs)，并将它们转染入LC319细胞中以抑制内源性DLX5的表达。与用对照siRNA转染的细胞相比用si2，si6和si7转染的细胞中DLX5转录本的量显著降低(图4b)；通过MTT测量(图4c)和集落形成测定法(数据未显示)测量，si2，si6和si7的转染还导致细胞生活力和集落数的显著降低。
(5)URLC11：(Genbank Accession NO.AB105188)
RNAi
为了评估URLC11对于肺癌细胞的生长或存活是否是必需的，我们设计并构建了质粒表达针对URLC11的siRNA(si1，si3，si4)，和三种不同的对照质粒(EGFP，LUC，或SCR的siRNAs)，并将它们转染入A549细胞中以抑制内源性URLC11的表达。与用任何三种对照siRNAs转染的细胞相比用si1，si3和si4转染的细胞中URLC11转录本的量显著降低(图5a)；通过MTT测量(图5b)和集落形成测定法(数据未显示)测量，si1，si3和si4的转染还导致细胞生活力和集落数的显著降低。
(6)NPTX1：(Genbank编号NM_002522)
RNAi
为了评估NPTX1对于肺癌细胞的生长或存活是否是必需的，我们设计并构建了质粒表达针对NPTX1的siRNA(si1，si2)，和三种不同的对照质粒(EGFP，LUC，或SCR的siRNAs)，并将它们转染入A549和LC176细胞中以抑制内源性NPTX1的表达。与用任何三种对照siRNAs转染的细胞相比用si1和si2转染的细胞中NPTX1转录本的量显著降低(图6a，6b)；通过MTT测量(图6c，6d)和集落形成测定法(数据未显示)测量，si1和si2的转染还导致细胞生活力和集落数的显著降低。
工业应用性
本发明人显示通过抑制PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因的表达抑制了细胞生长。特别地，作为这些基因的特异性靶标的小干扰RNA(siRNA)可以有效抑制细胞生长。因而，这种新型siRNAs对于发展抗癌药物来说是有用的靶标。例如，阻抑PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的表达或阻碍其活性的试剂可以用作抗癌剂，特别是治疗肺癌，如NSCLC的抗癌剂。
尽管本发明已经对于其具体的实施方案进行了详细描述，但显而易见对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对其进行各种改变和改进。
序列表
<110>肿瘤疗法科学股份有限公司
<120>治疗肺癌的组合物和方法
<130>ONC-A0405P
<150>US 60/555,757
<151>2004-03-24
<160>103
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2831
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
gaattccgga caggacgtga agatagttgg gtttggaggc ggccgccagg cccaggcccg    60
gtggacctgc cgccatgcag gacggtaact tcctgctgtc ggccctgcag cctgaggccg    120
gcgtgtgctc cctggcgctg ccctctgacc tgcagctgga ccgccggggc gccgaggggc    180
cggaggccga gcggctgcgg gcagcccgcg tccaggagca ggtccgcgcc cgcctcttgc    240
agctgggaca gcagccgcgg cacaacgggg ccgctgagcc cgagcctgag gccgagactg    300
ccagaggcac atccaggggg cagtaccaca ccctgcaggc tggcttcagc tctcgctctc    360
agggcctgag tggggacaag acctcgggct tccggcccat cgccaagccg gcctacagcc    420
cagcctcctg gtcctcccgc tccgccgtgg atctgagctg cagtcggagg ctgagttcag    480
cccacaatgg gggcagcgcc tttggggccg ctgggtacgg gggtgcccag cccacccctc    540
ccatgcccac caggcccgtg tccttccatg agcgcggtgg ggttgggagc cgggccgact    600
atgacacact ctccctgcgc tcgctgcggc tggggcccgg gggcctggac gaccgctaca    660
gcctggtgtc tgagcagctg gagcccgcgg ccacctccac ctacagggcc tttgcgtacg    720
agcgccaggc cagctccagc tccagccggg caggggggct ggactggccc gaggccactg    780
aggtttcccc gagccggacc atccgtgccc ctgccgtgcg gaccctgcag cgattccaga    840
gcagccaccg gagccgcggg gtaggcgggg cagtgccggg ggccgtcctg gagccagtgg    900
ctcgagcgcc atctgtgcgc agcctcagcc tcagcctggc tgactcgggc cacctgccgg    960
acgtgcatgg gttcaacagc tacggtagcc accgaaccct gcagagactc agcagcggtt    1020
ttgatgacat tgacctgccc tcagcagtca agtacctcat ggcttcagac cccaacctgc    1080
aggtgctggg agcggcctac atccagcaca agtgctacag cgatgcagcc gccaagaagc    1140
aggcccgcag ccttcaggcc gtgcctaggc tggtgaagct cttcaaccac gccaaccagg    1200
aagtgcagcg ccatgccaca ggtgccatgc gcaacctcat ctacgacaac gctgacaaca    1260
agctggccct ggtggaggag aacgggatct tcgagctgct gcggacactg cgggagcagg    1320
atgatgagct tcgcaaaaat gtcacaggga tcctgtggaa cctttcatcc agcgaccacc    1380
tgaaggaccg cctggccaga gacacgctgg agcagctcac ggacctggtg ttgagccccc    1440
tgtcgggggc tgggggtccc cccctcatcc agcagaacgc ctcggaggcg gagatcttct    1500
acaacgccac cggcttcctc aggaacctca gctcagcctc tcaggccact cgccagaaga    1560
tgcgggagtg ccacgggctg gtggacgccc tggtcacctc tatcaaccac gccctggacg    1620
cgggcaaatg cgaggacaag agcgtggaga acgcggtgtg cgtcctgcgg aacctgtcct    1680
accgcctcta cgacgagatg ccgccgtccg cgctgcagcg gctggagggt cgcggccgca    1740
gggacctggc gggggcgccg ccgggagagg tcgtgggctg cttcacgccg cagagccggc    1800
ggctgcgcga gctgcccctc gccgccgatg cgctcacctt cgcggaggtg tccaaggacc    1860
ccaagggcct cgagtggctg tggagccccc agatcgtggg gctgtacaac cggctgctgc    1920
agcgctgcga gctcaaccgg cacacgacgg aggcggccgc cggggcgctg cagaacatca    1980
cggcaggcga ccgcaggtgg gcgggggtgc tgagccgcct ggccctggag caggagcgta    2040
ttctgaaccc cctgctagac cgtgtcagga ccgccgacca ccaccagctg cgctcactga    2100
ctggcctcat ccgaaacctg tctcggaacg ctaggaacaa ggacgagatg tccacgaagg    2160
tggtgagcca cctgatcgag aagctgccag gcagcgtggg tgagaagtcg cccccagccg    2220
aggtgctggt caacatcata gctgtgctca acaacctggt ggtggccagc cccatcgctg    2280
cccgagacct gctgtatttt gacggactcc gaaagctcat cttcatcaag aagaagcggg    2340
acagccccga cagtgagaag tcctcccggg cagcatccag cctcctggcc aacctgtggc    2400
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gcccataggt gaagccttct ggaggagaag gtgacgtggc ccagcgtcca agggacagac    2520
tcagctccag gctgcttggc agcccagcct ggaggagaag gctaatgacg gaggggcccc    2580
tcgctggggc ccctgtgtgc atctttgagg gtcctgggcc accaggaggg gcagggtctt    2640
atagctgggg acttggcttc cgcagggcag ggggtggggc agggctcaag gctgctctgg    2700
tgtatggggt ggtgacccag tcacattggc agaggtgggg gttggctgtg gcctggcagt    2760
atcttgggat agccagcact gggaataaag atggccatga acagtcacaa aaaaaaaaaa    2820
aaaaggaatt c                                                         2831
<210>2
<211>797
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Gln Asp Gly Asn Phe Leu Leu Ser Ala Leu Gln Pro Glu Ala Gly
1               5                   10                  15
Val Cys Ser Leu Ala Leu Pro Ser Asp Leu Gln Leu Asp Arg Arg Gly
            20                  25                  30
Ala Glu Gly Pro Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Ala Arg Val Gln Glu
        35                  40                  45
Gln Val Arg Ala Arg Leu Leu Gln Leu Gly Gln Gln Pro Arg His Asn
    50                  55                  60
Gly Ala Ala Glu Pro Glu Pro Glu Ala Glu Thr Ala Arg Gly Thr Ser
65                  70                  75                  80
Arg Gly Gln Tyr His Thr Leu Gln Ala Gly Phe Ser Ser Arg Ser Gln
                85                  90                  95
Gly Leu Ser Gly Asp Lys Thr Ser Gly Phe Arg Pro Ile Ala Lys Pro
            100                 105                 110
Ala Tyr Ser Pro Ala Ser Trp Ser Ser Arg Ser Ala Val Asp Leu Ser
        115                 120                 125
Cys Ser Arg Arg Leu Ser Ser Ala His Asn Gly Gly Ser Ala Phe Gly
    130                 135                 140
Ala Ala Gly Tyr Gly Gly Ala Gln Pro Thr Pro Pro Met Pro Thr Arg
145                 150                 155                 160
Pro Val Ser Phe His Glu Arg Gly Gly Val Gly Ser Arg Ala Asp Tyr
                165                 170                 175
Asp Thr Leu Ser Leu Arg Ser Leu Arg Leu Gly Pro Gly Gly Leu Asp
            180                 185                 190
Asp Arg Tyr Ser Leu Val Ser Glu Gln Leu Glu Pro Ala Ala Thr Ser
        195                 200                 205
Thr Tyr Arg Ala Phe Ala Tyr Glu Arg Gln Ala Ser Ser Ser Ser Ser
    210                 215                 220
Arg Ala Gly Gly Leu Asp Trp Pro Glu Ala Thr Glu Val Ser Pro Ser
225                 230                 235                 240
Arg Thr Ile Arg Ala Pro Ala Val Arg Thr Leu Gln Arg Phe Gln Ser
                245                 250                 255
Ser His Arg Ser Arg Gly Val Gly Gly Ala Val Pro Gly Ala Val Leu
            260                 265                 270
Glu Pro Val Ala Arg Ala Pro Ser Val Arg Ser Leu Ser Leu Ser Leu
        275                 280                 285
Ala Asp Ser Gly His Leu Pro Asp Val His Gly Phe Asn Ser Tyr Gly
    290                 295                 300
Ser His Arg Thr Leu Gln Arg Leu Ser Ser Gly Phe Asp Asp Ile Asp
305                 310                 315                 320
Leu Pro Ser Ala Val Lys Tyr Leu Met Ala Ser Asp Pro Asn Leu Gln
                325                 330                 335
Val Leu Gly Ala Ala Tyr Ile Gln His Lys Cys Tyr Ser Asp Ala Ala
            340                 345                 350
Ala Lys Lys Gln Ala Arg Ser Leu Gln Ala Val Pro Arg Leu Val Lys
        355                 360                 365
Leu Phe Asn His Ala Asn Gln Glu Val Gln Arg His Ala Thr Gly Ala
    370                 375                 380
Met Arg Asn Leu Ile Tyr Asp Asn Ala Asp Asn Lys Leu Ala Leu Val
385                 390                 395                 400
Glu Glu Asn Gly Ile Phe Glu Leu Leu Arg Thr Leu Arg Glu Gln Asp
                405                 410                 415
Asp Glu Leu Arg Lys Asn Val Thr Gly Ile Leu Trp Asn Leu Ser Ser
            420                 425                 430
Ser Asp His Leu Lys Asp Arg Leu Ala Arg Asp Thr Leu Glu Gln Leu
        435                 440                 445
Thr Asp Leu Val Leu Ser Pro Leu Ser Gly Ala Gly Gly Pro Pro Leu
    450                 455                 460
Ile Gln Gln Asn Ala Ser Glu Ala Glu Ile Phe Tyr Asn Ala Thr Gly
465                 470                 475                 480
Phe Leu Arg Asn Leu Ser Ser Ala Ser Gln Ala Thr Arg Gln Lys Met
                485                 490                 495
Arg Glu Cys His Gly Leu Val Asp Ala Leu Val Thr Ser Ile Asn His
            500                 505                 510
Ala Leu Asp Ala Gly Lys Cys Glu Asp Lys Ser Val Glu Asn Ala Val
        515                 520                 525
Cys Val Leu Arg Asn Leu Ser Tyr Arg Leu Tyr Asp Glu Met Pro Pro
    530                 535                 540
Ser Ala Leu Gln Arg Leu Glu Gly Arg Gly Arg Arg Asp Leu Ala Gly
545                 550                 555                 560
Ala Pro Pro Gly Glu Val Val Gly Cys Phe Thr Pro Gln Ser Arg Arg
                565                 570                 575
Leu Arg Glu Leu Pro Leu Ala Ala Asp Ala Leu Thr Phe Ala Glu Val
            580                 585                 590
Ser Lys Asp Pro Lys Gly Leu Glu Trp Leu Trp Ser Pro Gln Ile Val
        595                 600                 605
Gly Leu Tyr Asn Arg Leu Leu Gln Arg Cys Glu Leu Asn Arg His Thr
    610                 615                 620
Thr Glu Ala Ala Ala Gly Ala Leu Gln Asn Ile Thr Ala Gly Asp Arg
625                 630                 635                 640
Arg Trp Ala Gly Val Leu Ser Arg Leu Ala Leu Glu Gln Glu Arg Ile
                645                 650                 655
Leu Asn Pro Leu Leu Asp Arg Val Arg Thr Ala Asp His His Gln Leu
            660                 665                 670
Arg Ser Leu Thr Gly Leu Ile Arg Asn Leu Ser Arg Asn Ala Arg Asn
        675                 680                 685
Lys Asp Glu Met Ser Thr Lys Val Val Ser His Leu Ile Glu Lys Leu
    690                 695                 700
Pro Gly Ser Val Gly Glu Lys Ser Pro Pro Ala Glu Val Leu Val Asn
705                 710                 715                 720
Ile Ile Ala Val Leu Asn Asn Leu Val Val Ala Ser Pro Ile Ala Ala
                725                 730                 735
Arg Asp Leu Leu Tyr Phe Asp Gly Leu Arg Lys Leu Ile Phe Ile Lys
            740                 745                 750
Lys Lys Arg Asp Ser Pro Asp Ser Glu Lys Ser Ser Arg Ala Ala Ser
        755                 760                 765
Ser Leu Leu Ala Asn Leu Trp Gln Tyr Asn Lys Leu His Arg Asp Phe
    770                 775                 780
Arg Ala Lys Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Phe Leu Gly Pro
785                 790                 795
<210>3
<211>2003
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
ggaatggggc gggacttcca gtaggaggcg gcaagtttga aaagtgatga cggttgacgt    60
ttgctgattt ttgactttgc ttgtagctgc tccccgaact cgccgtcttc ctgtcggcgg    120
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ccatcccaag gcgcgggcag gtgccgggac gctgggcctg gcggtgtttt cgtcgtgctc    240
agcggtggga ggaggcggaa gaaaccagag cctgggagat taacaggaaa cttccaagat    300
ggaaactttg tctttcccca gatataatgt agctgagatt gtgattcata ttcgcaataa    360
gatcttaaca ggagctgatg gtaaaaacct caccaagaat gatctttatc caaatccaaa    420
gcctgaagtc ttgcacatga tctacatgag agccttacaa atagtctatg gaattcgact    480
ggaacatttt tacatgatgc cagtgaactc tgaagtcatg tatccacatt taatggaagg    540
cttcttacca ttcagcaatt tagttactca tctggactca tttttgccta tctgccgggt    600
gaatgacttt gagactgctg atattctatg tccaaaagca aaacggacaa gtcggttttt    660
aagtggcatt atcaacttta ttcacttcag agaagcatgc cgtgaaacgt atatggaatt    720
tctttggcaa tataaatcct ctgcggacaa aatgcaacag ttaaacgccg cacaccagga    780
ggcattaatg aaactggaga gacttgattc tgttccagtt gaagagcaag aagagttcaa    840
gcagctttca gatggaattc aggagctaca acaatcacta aatcaggatt ttcatcaaaa    900
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gcgtttgaat gaactaaaat tgttggtggt ttctttgaaa gaaatacaag agagtttgaa    1020
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caaaagactg atgattgtga agaaggaaaa acttgccaca gcacaattca aaataaataa    1380
gaagcatgaa gatgttaagc aatacaaacg cacagtaatt gaggattgca ataaagttca    1440
agaaaaaaga ggtgctgtct atgaacgagt aaccacaatt aatcaagaaa tccaaaaaat    1500
taaacttgga attcaacaac taaaagatgc tgctgaaagg gagaaactga agtcccagga    1560
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tttctattta gaaagaaaag ttgaagcgaa tggaagtatc agaagtacca aataatgttg    1800
gcttcatcag tttttataca ctctcataag tagttaataa gatgaattta atgtaggctt    1860
ttattaattt ataattaaaa taacttgtgc agctattcat gtctctactc tgccccttgt    1920
tgtaaatagt ttgagtaaaa caaaactagt tacctttgaa atatatatat ttttttctgt    1980
taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa                                            2003
<210>4
<211>464
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Met Glu Thr Leu Ser Phe Pro Arg Tyr Asn Val Ala Glu Ile Val Ile
1               5                   10                  15
His Ile Arg Asn Lys Ile Leu Thr Gly Ala Asp Gly Lys Asn Leu Thr
            20                  25                  30
Lys Asn Asp Leu Tyr Pro Asn Pro Lys Pro Glu Val Leu His Met Ile
        35                  40                  45
Tyr Met Arg Ala Leu Gln Ile Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe
    50                  55                  60
Tyr Met Met Pro Val Asn Ser Glu Val Met Tyr Pro His Leu Met Glu
65                  70                  75                  80
Gly Phe Leu Pro Phe Ser Asn Leu Val Thr His Leu Asp Ser Phe Leu
                85                  90                  95
Pro Ile Cys Arg Val Asn Asp Phe Glu Thr Ala Asp Ile Leu Cys Pro
            100                 105                 110
Lys Ala Lys Arg Thr Ser Arg Phe Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe Ile
        115                 120                 125
His Phe Arg Glu Ala Cys Arg Glu Thr Tyr Met Glu Phe Leu Trp Gln
    130                 135                 140
Tyr Lys Ser Ser Ala Asp Lys Met Gln Gln Leu Asn Ala Ala His Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ala Leu Met Lys Leu Glu Arg Leu Asp Ser Val Pro Val Glu Glu
                165                 170                 175
Gln Glu Glu Phe Lys Gln Leu Ser Asp Gly Ile Gln Glu Leu Gln Gln
            180                 185                 190
Ser Leu Asn Gln Asp Phe His Gln Lys Thr Ile Val Leu Gln Glu Gly
        195                 200                 205
Asn Ser Gln Lys Lys Ser Asn Ile Ser Glu Lys Thr Lys Arg Leu Asn
    210                 215                 220
Glu Leu Lys Leu Leu Val Val Ser Leu Lys Glu Ile Gln Glu Ser Leu
225                 230                 235                 240
Lys Thr Lys Ile Val Asp Ser Pro Glu Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Glu
                245                 250                 255
Lys Met Lys Asp Thr Val Gln Lys Leu Lys Asn Ala Arg Gln Glu Val
            260                 265                 270
Val Glu Lys Tyr Glu Ile Tyr Gly Asp Ser Val Asp Cys Leu Pro Ser
        275                 280                 285
Cys Gln Leu Glu Val Gln Leu Tyr Gln Lys Lys Ile Gln Asp Leu Ser
    290                 295                 300
Asp Asn Arg Glu Lys Leu Ala Ser Ile Leu Lys Glu Ser Leu Asn Leu
305                 310                 315                 320
Glu Asp Gln Ile Glu Ser Asp Glu Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Thr
            325                 330                 335
Glu Glu Asn Ser Phe Lys Arg Leu Met Ile Val Lys Lys Glu Lys Leu
        340                 345                 350
Ala Thr Ala Gln Phe Lys Ile Asn Lys Lys His Glu Asp Val Lys Gln
    355                 360                 365
Tyr Lys Arg Thr Val Ile Glu Asp Cys Asn Lys Val Gln Glu Lys Arg
370                 375                 380
Gly Ala Val Tyr Glu Arg Val Thr Thr Ile Asn Gln Glu Ile Gln Lys
                385                 390                 395                 400
Ile Lys Leu Gly Ile Gln Gln Leu Lys Asp Ala Ala Glu Arg Glu Lys
            405                 410                 415
Leu Lys Ser Gln Glu Ile Phe Leu Asn Leu Lys Thr Ala Leu Glu Lys
        420                 425                 430
Tyr His Asp Gly Ile Glu Lys Ala Ala Glu Asp Ser Tyr Ala Lys Ile
    435                 440                 445
Asp Glu Lys Thr Ala Glu Leu Lys Arg Lys Met Phe Lys Met Ser Thr
450                 455                 460
<210>5
<211>2307
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
gtgactgtgg agtttgaatt gggtggcggt tgactgtaga gccgctctct ctcactggca    60
cagcgaggtt ttgctcagcc cttgtctcgg gaccgcagcc tccgccgagc gccatggctc    120
ctaggaaggg cagtagtcgg gtggccaaga ccaactcctt acggaggcgg aagctcgcct    180
cctttctgaa agacttcgac cgtgaagtgg aaatacgaat caagcaaatt gagtcagaca    240
ggcagaacct cctcaaggag gtggataacc tctacaacat cgagatcctg cggctcccca    300
aggctctgcg cgagatgaac tggcttgact acttcgccct tggaggaaac aaacaggccc    360
tggaagaggc ggcaacagct gacctggata tcaccgaaat aaacaaacta acagcagaag    420
ctattcagac acccctgaaa tctgccaaaa cacgaaaggt aatacaggta gatgaaatga    480
tagtggaaga ggaagaagaa gaagaaaatg aacgtaagaa tcttcaaact gcaagagtca    540
aaaggtgtcc tccatccaag aagagaactc agtccataca aggaaaagga aaagggaaaa    600
ggtcaagccg tgctaacact gttaccccag ccgtgggccg attggaggtg tccatggtca    660
aaccaactcc aggcctgaca cccaggtttg actcaagggt cttcaagacc cctggcctgc    720
gtactccagc agcaggagag cggatttaca acatctcagg gaatggcagc cctcttgctg    780
acagcaaaga gatcttcctc actgtgccag tgggcggcgg agagagcctg cgattattgg    840
ccagtgactt gcagaggcac agtattgccc agctggatcc agaggccttg ggaaacatta    900
agaagctctc caaccgtctc gcccaaatct gcagcagcat acggacccac aaatgagaca    960
ccaaagttga caggatggac ttttaatggg cacttctggg accctgaaga gacttcttcc    1020
cttcaggctt attgtttgag tgtgaagttc cagagcaagg agccatgttc ctctaaggga    1080
attcaggaat tcagacgtgc tagtcccaca ccagttaggt agagctgtct gttcaccctc    1140
ccatcccagc tgatcccagt cactgcttgc tggggccatg ccatggaagc ttcccatcag    1200
tctcccagct gaatcctccc tgctctctga gctgctgcct tttgcctcct gcaactcaac    1260
atcctcttca ccctgccctg cctgcagttg agggggcgaa gaagaaccct gtgttctcag    1320
gaagactgcc tccaccaccg ctacccagag aacctctgca tctggcattt ctgctctcta    1380
tgcttgagac cgggaggttt aggctcagat aagtgagctc tgggccatga gagggtaggt    1440
ccagaaggtg gggggaactg tacagatcag cagagcagga cagttggcag cagtgacctc    1500
agtagggaac atgtccgtct accctctcgc actcatgaca cctcccccta ccagccctcc    1560
tcttcctcct cctcctcctc ctgtgggagg tggtcagtgg gacttaggga tctttcacct    1620
gctgtgccca gtagttctga agtctgcttg tggagcagtg ttttatgttt atccctgttt    1680
actgaagacc aaatactggt ttggagacaa cttccatgtc ttgctcttct acctccctag    1740
ttagtggaaa tttggataag ggaactgtag ggcccagatt ctggaggttt tatgtcattg    1800
gccacagaat aactgtctct aagctatcca tggtccagtg gtccctgcca agtctgtaga    1860
cttcagagag cacttctctc ttatggggtt catgggaaca ggggcgggtg tgacttgctt    1920
ggtggcctca ttccatgtgt gcctgtgcct ggggcatgga ctttgttaag cagagtcagc    1980
agtgaggtcc tcattctcca gccagcctct ctgccctgga gaatcatgtg ctatgttcta    2040
agaatttgag aactagagtc ctcatcccca ggcttgaagg cacatggctt tctcatgtag    2100
ggctctctgt ggtatttgtt attattttgc aacaagacca ttttagtaaa acagtcctgt    2160
tcaagttgta ttcttttaag ttcttttatt ctcctttccc tgaga tttttgtatatattg    2220
ttctgagtaa tggtatcttt gagctgattg ttctaatcag agctggtacc tactttcaat    2280
aaattctggt  tttgtgtttt cttctgt                                       2307
<210>6
<211>280
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>6
Met Ala Pro Arg Lys Gly Ser Ser Arg Val Ala Lys Thr Asn Ser Leu
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Lys Leu Ala Ser Phe Leu Lys Asp Phe Asp Arg Glu Val
            20                  25                  30
Glu Ile Arg Ile Lys Gln Ile Glu Ser Asp Arg Gln Asn Leu Leu Lys
        35                  40                  45
Glu Val Asp Asn Leu Tyr Asn Ile Glu Ile Leu Arg Leu Pro Lys Ala
    50                  55                  60
Leu Arg Glu Met Asn Trp Leu Asp Tyr Phe Ala Leu Gly Gly Asn Lys
65                  70                  75                  80
Gln Ala Leu Glu Glu Ala Ala Thr Ala Asp Leu Asp Ile Thr Glu Ile
                85                  90                  95
Asn Lys Leu Thr Ala Glu Ala Ile Gln Thr Pro Leu Lys Ser Ala Lys
            100                 105                 110
Thr Arg Lys Val Ile Gln Val Asp Glu Met Ile Val Glu Glu Glu Glu
        115                 120                 125
Glu Glu Glu Asn Glu Arg Lys Asn Leu Gln Thr Ala Arg Val Lys Arg
    130                 135                 140
Cys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Thr Gln Ser Ile Gln Gly Lys Gly Lys
145                 150                 155                 160
Gly Lys Arg Ser Ser Arg Ala Asn Thr Val Thr Pro Ala Val Gly Arg
                165                 170                 175
Leu Glu Val Ser Met Val Lys Pro Thr Pro Gly Leu Thr Pro Arg Phe
            180                 185                 190
Asp Ser Arg Val Phe Lys Thr Pro Gly Leu Arg Thr Pro Ala Ala Gly
        195                 200                 205
Glu Arg Ile Tyr Asn Ile Ser Gly Asn Gly Ser Pro Leu Ala Asp Ser
    210                 215                 220
Lys Glu Ile Phe Leu Thr Val Pro Val Gly Gly Gly Glu Ser Leu Arg
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Ser Asp Leu Gln Arg His Ser Ile Ala Gln Leu Asp Pro
                245             250                     255
Glu Ala Leu Gly Asn Ile Lys Lys Leu Ser Asn Arg Leu Ala Gln Ile
            260             265                     270
Cys Ser Ser Ile Arg Thr His Lys
           275                         280
<210>7
<211>1419
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>7
cggagacaga gacttcacga ctcccagtct cctcctcgcc gcggccgccg cctcctcctt    60
ctctcctcct cctcttcctc ctcctccctc gctcccacag ccatgtctgc ttagaccaga    120
gcagccccac agccaactag ggcagctgcc gccgccacaa cagcaaggac agccgctgcc    180
gccgcccgtg agcgatgaca ggagtgtttg acagaagggt ccccagcatc cgatccggcg    240
acttccaagc tccgttccag acgtccgcag ctatgcacca tccgtctcag gaatcgccaa    300
ctttgcccga gtcttcagct accgattctg actactacag ccctacgggg ggagccccgc    360
acggctactg ctctcctacc tcggcttcct atggcaaagc tctcaacccc taccagtatc    420
agtatcacgg cgtgaacggc tccgccggga gctacccagc caaagcttat gccgactata    480
gctacgctag ctcctaccac cagtacggcg gcgcctacaa ccgcgtccca agcgccacca    540
accagccaga gaaagaagtg accgagcccg aggtgagaat ggtgaatggc aaaccaaaga    600
aagttcgtaa acccaggact atttattcca gctttcagct ggccgcatta cagagaaggt    660
ttcagaagac tcagtacctc gccttgccgg aacgcgccga gctggccgcc tcgctgggat    720
tgacacaaac acaggtgaaa atctggtttc agaacaaaag atccaagatc aagaagatca    780
tgaaaaacgg ggagatgccc ccggagcaca gtcccagctc cagcgaccca atggcgtgta    840
actcgccgca gtctccagcg gtgtgggagc cccagggctc gtcccgctcg ctcagccacc    900
accctcatgc ccaccctccg acctccaacc agtccccagc gtccagctac ctggagaact    960
ctgcatcctg gtacacaagt gcagccagct caatcaattc ccacctgccg ccgccgggct    1020
ccttacagca cccgctggcg ctggcctccg ggacactcta ttagatgggc tgctctctct    1080
tactctcttt tttgggacta ctgtgttttg ctgttctaga aaatcataaa gaaaggaatt    1140
catatgggga agttcggaaa actgaaaaag attcatgtgt aaagcttttt tttgcatgta    1200
agttattgca tttcaaaaga cccccccttt ttttacagag gacttttttt gcgcaactgt    1260
ggacactttc aatggtgcct tgaaatctat gacctcaact tttcaaaaga cttttttcaa    1320
tgttatttta gccatgtaaa taagtgtaga tagaggaatt aaactgtata ttctggataa    1380
ataaaattat ttcgaccathg aaaaaaaaa aaaaaaaaa                           1419
<210>8
<211>289
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>8
Met Thr Gly Val Phe Asp Arg Arg Val Pro Ser Ile Arg Ser Gly Asp
1               5                   10                  15
Phe Gln Ala Pro Phe Gln Thr Ser Ala Ala Met His His Pro Ser Gln
            20                  25                  30
Glu Ser Pro Thr Leu Pro Glu Ser Ser Ala Thr Asp Ser Asp Tyr Tyr
        35                  40                  45
Ser Pro Thr Gly Gly Ala Pro His Gly Tyr Cys Ser Pro Thr Ser Ala
    50                  55                  60
Ser Tyr Gly Lys Ala Leu Asn Pro Tyr Gln Tyr Gln Tyr His Gly Val
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ser Ala Gly Ser Tyr Pro Ala Lys Ala Tyr Ala Asp Tyr Ser
                85                  90                  95
Tyr Ala Ser Ser Tyr His Gln Tyr Gly Gly Ala Tyr Asn Arg Val Pro
            100                 105                 110
Ser Ala Thr Asn Gln Pro Glu Lys Glu Val Thr Glu Pro Glu Val Arg
        115                 120                 125
Met Val Asn Gly Lys Pro Lys Lys Val Arg Lys Pro Arg Thr Ile Tyr
    130                 135                 140
Ser Ser Phe Gln Leu Ala Ala Leu Gln Arg Arg Phe Gln Lys Thr Gln
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Ala Leu Pro Glu Arg Ala Glu Leu Ala Ala Ser Leu Gly Leu
                165                 170                 175
Thr Gln Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ser Lys Ile
            180                 185                 190
Lys Lys Ile Met Lys Asn Gly Glu Met Pro Pro Glu His Ser Pro Ser
        195                 200                 205
Ser Ser Asp Pro Met Ala Cys Asn Ser Pro Gln Ser Pro Ala Val Trp
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Gly Ser Ser Arg Ser Leu Ser His His Pro His Ala His
225                 230                 235                 240
Pro Pro Thr Ser Asn Gln Ser Pro Ala Ser Ser Tyr Leu Glu Asn Ser
                245                 250                 255
Ala Ser Trp Tyr Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ile Asn Ser His Leu Pro
            260                 265                 270
Pro Pro Gly Ser Leu Gln His Pro Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Leu
        275                280                  285
Tyr
<210>9
<211>2539
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>9
atccttatct tctcgtctag ttctccgagg ttgaaggctc ggcctgctca gagaaggaaa    60
ctgaggtcca ccgagttgga gaaacctact caacaccagg actaacttct tcagtgctta    120
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agatcatgaa agagatcctg gacctatgaa tatccagttt gagccatcgg atctaagatc    240
caaaaggcct ttctgtatag agcccacaaa catcgtgaat gtgaatcatg tcattcagag    300
ggttagtgac catgcctctg ccatgaacaa gagaattcat tactacagcc ggctcaccac    360
tcctgcagac aaggcactga ttgccccaga ccatgtagtt ccagctccag aagagtgcta    420
tgtgtatagt ccattgggct ctgcttataa acttcaaagt tacactgaag gatacggtaa    480
aaacaccagt ttagtaacca tttttatgat ttggaatacc atgatgggaa catctatact    540
aagcattcct tggggcataa aacaggctgg atttactact ggaatgtgtg tcatcatact    600
gatgggcctt ttaacacttt attgctgcta cagagtagtg aaatcacgga ctatgatgtt    660
ttcattggat accactacct gggaatatcc agatgtctgc agacattatt tcggctcctt    720
tgggcagtgg tcgagtctcc tcttctcctt ggtgtctctc attggagcaa tgatagttta    780
ttgggtgctt atgtcaaatt ttctttttaa tactggaaag tttattttta attttattca    840
tcacattaat gacacagaca ctatactgag taccaataat agcaaccctg tgatttgtcc    900
aagtgccggg agtggaggcc atcctgacaa cagctctatg attttctatg ccaatgacac    960
aggagcccaa cagtttgaaa agtggtggga taagtccagg acagtcccct tttatcttgt    1020
agggctcctc ctcccactgc tcaatttcaa gtctccttca tttttttcaa aatttaatat    1080
cctaggcaca gtgtctgtcc tttatttgat tttccttgtc acctttaagg ctgttcgctt    1140
gggatttcat ttggaatttc attggtttat accaacagaa ttttttgtac cagagataag    1200
atttcagttt ccacagctga ctggagtgct tacccttgct ttttttattc ataattgtat    1260
catcacactc ttgaagaaca acaagaaaca agaaaacaat gtgagggact tgtgcattgc    1320
ttatatgctg gtgacattaa cttatctcta tattggagtc ctggtttttg cttcatttcc    1380
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tgacaccctg tccttcattg caaggatatt cctgctgttc cagatgatga ctgtataccc    1500
actcttaggc tacctggctc gtgtccagct tttgggccat atcttcggtg acatttatcc    1560
tagcattttc catgtgctga ttcttaatct aattattgtg ggagctggag tgatcatggc    1620
ctgtttctac ccaaacatag gagggatcat aagatattca ggagcagcat gtggactggc    1680
ctttgtattc atatacccat ctctcatcta tataatttcc ctccaccaag aagagcgtct    1740
gacatggcct aaattaatct tccacgtttt catcatcatt ttgggcgtgg ctaacctgat    1800
tgttcagttt tttatgtgaa atacctcaac tgtttttttc aagagctctc atgatatttt    1860
gagccttgac aacagttcta tataaattca cttgtaaatg ctgctgttgt gtaattctaa    1920
atattttcta agataatttg aaagcaaggg aaatagtggc cccttaatga gtattttttt    1980
attggggtgg ggaaaggggc aaaaagaatg atcttagtgt ctttaccttt ctcatattaa    2040
ctcacctctt tattctgtgg tcttttctga atagaaatgt atgccctagg aagaaatcat    2100
gctgggtttt gcttttagag ataaaaggtg gtggatttat tttgcctgca gtaaagattc    2160
tcagggtgtc agagcagcat attgtcaaat cctgcttctg ttttatgttt cagtgtattc    2220
actttcattt tcttacttac tagaccattt ctgcagtttg cccaaacctc tactgtttgg    2280
gacagtaagc caaatacctc atttttaaaa agaagttttc atggcatcag tgttaataaa    2340
gtacattttt aactgagtct taatctctat ttgaagaaaa agtagagaca aaagtaatgt    2400
caatgtaatc cccaggatca tgaaatgtat acaaaataaa taaagtagga gagtttgttg    2460
ctgtctaact cctcttttat ttctaatcca gtaccagtga cttagatcga aattacagtt    2520
ccccaagcca  gactttgca                                                2539
<210>10
<211>561
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>10
Met Ala Asn Met Asn Ser Asp Ser Arg His Leu Gly Thr Ser Glu Val
1               5                   10                  15
Asp His Glu Arg Asp Pro Gly Pro Met Asn Ile Gln Phe Glu Pro Ser
            20                  25                  30
Asp Leu Arg Ser Lys Arg Pro Phe Cys Ile Glu Pro Thr Asn Ile Val
        35                  40                  45
Asn Val Asn His Val Ile Gln Arg Val Ser Asp His Ala Ser Ala Met
    50                  55                  60
Asn Lys Arg Ile His Tyr Tyr Ser Arg Leu Thr Thr Pro Ala Asp Lys
65                  70                  75                  80
Ala Leu Ile Ala Pro Asp His Val Val Pro Ala Pro Glu Glu Cys Tyr
                85                  90                  95
Val Tyr Ser Pro Leu Gly Ser Ala Tyr Lys Leu Gln Ser Tyr Thr Glu
            100                 105                 110
Gly Tyr Gly Lys Asn Thr Ser Leu Val Thr Ile Phe Met Ile Trp Asn
        115                 120                 125
Thr Met Met Gly Thr Ser Ile Leu Ser Ile Pro Trp Gly Ile Lys Gln
    130                 135                 140
Ala Gly Phe Thr Thr Gly Met Cys Val Ile Ile Leu Met Gly Leu Leu
145                 150                 155                 160
Thr Leu Tyr Cys Cys Tyr Arg Val Val Lys Ser Arg Thr Met Met Phe
                165                 170                 175
Ser Leu Asp Thr Thr Thr Trp Glu Tyr Pro Asp Val Cys Arg His Tyr
            180                 185                 190
Phe Gly Ser Phe Gly Gln Trp Ser Ser Leu Leu Phe Ser Leu Val Ser
        195                 200                 205
Leu Ile Gly Ala Met Ile Val Tyr Trp Val Leu Met Ser Asn Phe Leu
    210                 215                 220
Phe Asn Thr Gly Lys Phe Ile Phe Asn Phe Ile His His Ile Asn Asp
225                 230                 235                 240
Thr Asp Thr Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ser Asn Pro Val Ile Cys Pro
                245                 250                 255
Ser Ala Gly Ser Gly Gly His Pro Asp Asn Ser Ser Met Ile Phe Tyr
            260                 265                 270
Ala Asn Asp Thr Gly Ala Gln Gln Phe Glu Lys Trp Trp Asp Lys Ser
        275                 280                 285
Arg Thr Val Pro Phe Tyr Leu Val Gly Leu Leu Leu Pro Leu Leu Asn
    290                 295                 300
Phe Lys Ser Pro Ser Phe Phe Ser Lys Phe Asn Ile Leu Gly Thr Val
305                 310                 315                 320
Ser Val Leu Tyr Leu Ile Phe Leu Val Thr Phe Lys Ala Val Arg Leu
                325                 330                 335
Gly Phe His Leu Glu Phe His Trp Phe Ile Pro Thr Glu Phe Phe Val
            340                 345                 350
Pro Glu Ile Arg Phe Gln Phe Pro Gln Leu Thr Gly Val Leu Thr Leu
        355                 360                 365
Ala Phe Phe Ile His Asn Cys Ile Ile Thr Leu Leu Lys Asn Asn Lys
    370                 375                 380
Lys Gln Glu Asn Asn Val Arg Asp Leu Cys Ile Ala Tyr Met Leu Val
385                 390                 395                 400
Thr Leu Thr Tyr Leu Tyr Ile Gly Val Leu Val Phe Ala Ser Phe Pro
                405                 410                 415
Ser Pro Pro Leu Ser Lys Asp Cys Ile Glu Gln Asn Phe Leu Asp Asn
            420                 425                 430
Phe Pro Ser Ser Asp Thr Leu Ser Phe Ile Ala Arg Ile Phe Leu Leu
        435                 440                 445
Phe Gln Met Met Thr Val Tyr Pro Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Arg Val
    450                 455                 460
Gln Leu Leu Gly His Ile Phe Gly Asp Ile Tyr Pro Ser Ile Phe His
465                 470                 475                 480
Val Leu Ile Leu Asn Leu Ile Ile Val Gly Ala Gly Val Ile Met Ala
                485                 490                 495
Cys Phe Tyr Pro Asn Ile Gly Gly Ile Ile Arg Tyr Ser Gly Ala Ala
            500                 505                 510
Cys Gly Leu Ala Phe Val Phe Ile Tyr Pro Ser Leu Ile Tyr Ile Ile
        515                 520                 525
Ser Leu His Gln Glu Glu Arg Leu Thr Trp Pro Lys Leu Ile Phe His
    530                 535                 540
Val Phe Ile Ile Ile Leu Gly Val Ala Asn Leu Ile Val Gln Phe Phe
545                 550                 555                 560
Met
<210>11
<211>5071
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>11
ggcctgatag cgcggcgtgt ggaccggccg aagagcgcgc ccagagcggc gccgtcgcga    60
gccacagccc gagccggtcc cagccgagcc gagccccagc cgagccgagc cggcccgagc    120
gctccggtgc ccgcagccat gccggccggc cgcgcgcgca cctgtgcgct gctcgccctc    180
tgcctcctgg ggccccagga tttcgggccg acgcgcttca tctgcacttc ggtgccggtg    240
gacgccgaca tgtgtgccgc gtccgtggcc gcgggcggcg cggaggagct ccggagcagc    300
aatgtgctgc agctccggga gaccgtgctg cagcagaagg agaccatcct gagccagaag    360
gagaccatcc gcgagctgac cgccaagctg ggccgctgcg agagccagag cacgctggac    420
cccggagccg gcgaggcccg ggcgggcggc ggccgcaagc agccgggctc gggcaagaac    480
accatgggcg acctgtcccg gacaccggcc gccgagacgc tcagccaact cgggcaaact    540
ttgcaatcgc tcaaaacccg cctggagaac ctcgagcagt acagccgcct caattcctcc    600
agccagacca acagcctcaa ggatctgctg cagagcaaga tcgatgagct ggagaggcag    660
gtgctgtccc gggtgaacac cctggaggag ggeaaggggg ggcccaagaa cgacaccgag    720
gagagggtca agatcgagac cgccctgacc tccctgcacc agcggatcag cgagctcgag    780
aaaggtcaga aagacaaccg ccctggagac aagttccagc tcacattccc actgcggacc    840
aactatatgt atgccaaggt gaagaagagc ctgccagaga tgtacgcctt cactgtctgc    900
atgtggctca agtccagcgc cacgccaggt gtgggcacgc ccttctccta cgctgtgccc    960
ggccaggcca acgagctggt cctcattgag tggggcaaca accccatgga gatcctcatc    1020
aatgacaagg tggccaagct gccttttgtc atcaatgatg gcaagtggca ccacatctgt    1080
gtcacctgga ccacccggga cggggtctgg gaggcctacc aggatggcac gcagggtggc    1140
agtggcgaga acttggcgcc ctatcacccc atcaagcccc agggcgtgct ggtgctgggc    1200
caggagcagg acactctggg tggtgggttt gatgccaccc aggcatttgt gggtgagctg    1260
gcccact tcaacatctggga ccgcaagctg acccccgggg aggtgtacaa cctggccacc    1320
tgcagcacca aggctctgtc cggcaatgtc atcgcctggg ctgaatccca catcgagatc    1380
tacggcgggg ccaccaagtg gaccttcgag gcctgtcgcc agatcaactg agcacggcag    1440
gccaggctga gccgcccgcc ctcgccccct gcttgtgcgg cgatgatctg tttgtgcgtc    1500
tcttctctcc cttttcccca ggaatgaacc gaggccgtcg ccctgcacac gcacacgcac    1560
acagcctggt tttgtcctca tgcacacgaa gcagcccctg ctcccatctg tccctgagga    1620
agccccactt ctctgtagga gcccggactc tctcagcatg ccccattcac agctgaagtg    1680
ggtgctgcaa cgtcttgaac aaggcagaag ttggtgagag gatctgtgtg tgcgtgtcta    1740
catgtgtgtg tctacgtgtg tgcgtgcgtg gctgggggag gccttttctt tgaggacgta    1800
cctcatttcc ttctttcttc tggctttgga aaaatctcat gatgaaaatt catatttgcc    1860
aactttgtta gctgcgtgcg tgctttgggg ttggtgcaac ctcagtacac gcatttgtct    1920
ttgtttgcaa acctttctca gagcgacata tctttatatt gatgtaataa atgtctttta    1980
gtggtttgtc aaaggccggg ggcgggggct ctctacagag aatttttatt ttgtaataga    2040
agtgaactgt ctctgaaggt gaaggcaggc cgtcctggga tggtaccctg tgctctcccg    2100
tggaggagag gggatggctg aggacactgg cccttaccca gggcgaacag catccatccc    2160
tgctgtttgc atcttgagag cagcatgggg cctgggaggt cggcctgtgt gcccagctca    2220
gctagctctg ccccaggacg gccctgccct cgaccttccc acctcctcag atcctgcaag    2280
gctgggtctg cccctccctt ctcacctctg gagctgtgct gcactgcttc ccagagaggg    2340
ccctgagaga ggagcgtgcc acccaccagg gaagccgggc cccagcaccc ctctcctttg    2400
gcctcccgga gtgcagacca gaggggacct tttaaggaaa gaagccgtgt ttcgatgaag    2460
acctggccac atggggcact gggacttcaa cccagcccat cggtgggaag gtcctttttg    2520
ggggactttg acagccatat ccctcccagc acaccaggcg ccaggtgagc tggttcagac    2580
ccctccaggg tactccagag acctcacgtg tggagccagg cctggccagg caggggcctg    2640
aaacccactc ctccatctca tgggctcacg gcctacacga gcccacaagc tgccactggc    2700
cggcgacact gacacctgag cagtgtccag aacctttttg cctttttttg ttccccgtga    2760
aaagcaacat ggacatttcc ttctagtcct tccaaggagg ggagagaagt gtatgtgcat    2820
ttgtgtgtgt gtgtgtgtgt tgtgtgtgtg tgtgcgctaa gtgagaaaga gagcaggctc    2880
gggaggccct gcccagggta ggaggagctt cctgctttgc accatctggt ggtcgcaccc    2940
tggagggcac cccgactctg tctccaggag tctcatcagc aaaccgctga caagtctttc    3000
tagaaattct actgcactgc ctggctcagc tgcacgctgc agacatttct gcaggaggag    3060
caggtgtttc tgtcttctgt tccttctagg gccacctgtc cccttaaaca caggtccacg    3120
ttgtgtcaag aacctagtgc atctgtgtgt gtctgtcagt gtctctgtgt cagtgttctc    3180
gtgggtgtct gcacggtacc ggcccgcctt ctgcaatcat cactcccgca gagggggtgc    3240
agatcaggcg ccgtgctgcg gttgttgttc aacagtgctt tttcttagat agcgtcttcc    3300
tcagcgcccg tcggttgtgg catccttgat ctcagggatc ttctccgttt gcatgtcctc    3360
ggagtggcgt gttccttctc cctgggtccg acatgtgttc ccgcacctgc atggactgcc    3420
ccggttctgt gttgtgtgcc gagtgecgcc cagtgttctg tgaccacccg tgtagctact    3480
gaaaatggct gggtaagcaa gtcaagggtg ttggaggagg tcaagagaga gctcagtttc    3540
cctctccccc tccccaaaca caccaagaag catttttaac gtgtaggttg agaacaagcc    3600
taaaggattc ccacagctgg gagccagcaa gagagcttgg agtcgcctct ctagaccaga    3660
tctagcccca ccctcactcc agccatctcg gagcccttgt gtaggcaacg ccggtgcgcg    3720
gctgtgtggg gtgctccctg ccagcacctc cggccagccc cgcccctgcc gatctactgg    3780
accgcagacc accttctgcc cccgtggcca ggtgggagct gtccgttcag gaccatgagc    3840
catcctctgc cctgactagc gaggggcaga gcacacccca gtgcttacgc ctccacccct    3900
gcagcctcct ggcccgctca ccttcctcac ccctcctctg acccacccat ggtgccaggg    3960
ccgaagctga cctttagctc cctcctgccc ttgctagggt ctgagccaag cccctcgact    4020
cctcactgtg ttgacacttg gcactttgct ggccccgaga aggtcgatga cacagccgca    4080
aatctaatcc acgtagttcc catttactcc ttaatctgat tgatgttccc tcttgcactg    4140
aataatacat gcctctctca ggtaagccat tttataaaac aagaagataa aaagcactgt    4200
tgaggcagtg tttgcttttg ccgagctggt gtccgacagc tccctgggtg tccggggtgg    4260
gagagctgtt gacagaagct ctccgggcct cagggcttag atcccacttg agtcgtaagc    4320
cttcttgctt ttgataacac agtattattt ctcttactgt agaagaaaaa gtttattacc    4380
aaacaagagt atttttatga aagaaaagga caaacctata aattaactca acctatatct    4440
cccttgaaaa tactttcagg ctccaccaaa acgtagaact gaaagcatgt attttggaag    4500
aaagagatac attttgtatg ctttcttttc cttttgtaga ttcccagttt attttctaag    4560
actgcaaaga tcactttgtc accagccctg ggacctgaga ccaagggggt gtcttgtggg    4620
cagtgagggg gtgaggagag gctggcatga ggttcagtca ttccagtgag ctccaaagag    4680
gggccacctg ttctcaaaag catgttgggg accaggaggt aaaactggcc atttatggtg    4740
aacctgtgtc ttggagctga cttactaagt ggaatgagcc gaggatttga atatcagttc    4800
taaccttgat agaagaacct tgggttacat gtggttcaca ttaagaggat agaatccttt    4860
ggaatcttat ggcaaccaaa tgtggcttga cgaagtcgtg gtttcatctc ttaaacacag    4920
tgtgtaaatt tattcaacta acgatgggaa atgtattact tctgtacaca gtggactgaa    4980
gtgcaatttg ttgaaaggga acaagtcatt gaagagaaaa aaaaaaagcc caatacttag    5040
agtcccaatt  ttgtctcatt  tgccaaaaaa a                                 5071
<210>12
<211>430
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>12
Met Pro Ala Gly Arg Ala Arg Thr Cys Ala Leu Leu Ala Leu Cys Leu
1               5                   10                      15
Leu Gly Pro Gln Asp Phe Gly Pro Thr Arg Phe Ile Cys Thr Ser Val
            20                  25                      30
Pro Val Asp Ala Asp Met Cys Ala Ala Ser Val Ala Ala Gly Gly Ala
        35                  40                      45
Glu Glu Leu Arg Ser Ser Asn Val Leu Gln Leu Arg Glu Thr Val Leu
    50                  55                      60
Gln Gln Lys Glu Thr Ile Leu Ser Gln Lys Glu Thr Ile Arg Glu Leu
65                  70                      75              80
Thr Ala Lys Leu Gly Arg Cys Glu Ser Gln Ser Thr Leu Asp Pro Gly
                85                  90                  95
Ala Gly Glu Ala Arg Ala Gly Gly Gly Arg Lys Gln Pro Gly Ser Gly
            100                 105                 110
Lys Asn Thr Met Gly Asp Leu Ser Arg Thr Pro Ala Ala Glu Thr Leu
        115                 120                 125
Ser Gln Leu Gly Gln Thr Leu Gln Ser Leu Lys Thr Arg Leu Glu Asn
    130                 135                 140
Leu Glu Gln Tyr Ser Arg Leu Asn Ser Ser Ser Gln Thr Asn Ser Leu
145                 150                 155                 160
Lys Asp Leu Leu Gln Ser Lys Ile Asp Glu Leu Glu Arg Gln Val Leu
                165                 170                 175
Ser Arg Val Asn Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly Gly Pro Lys Asn Asp
            180                 185                 190
Thr Glu Glu Arg Val Lys Ile Glu Thr Ala Leu Thr Ser Leu His Gln
        195                 200                 205
Arg Ile Ser Glu Leu Glu Lys Gly Gln Lys Asp Asn Arg Pro Gly Asp
    210                 215                 220
Lys Phe Gln Leu Thr Phe Pro Leu Arg Thr Asn Tyr Met Tyr Ala Lys
225                 230                 235                 240
Val Lys Lys Ser Leu Pro Glu Met Tyr Ala Phe Thr Val Cys Met Trp
                245                 250                 255
Leu Lys Ser Ser Ala Thr Pro Gly Val Gly Thr Pro Phe Ser Tyr Ala
            260                 265                 270
Val Pro Gly Gln Ala Asn Glu Leu Val Leu Ile Glu Trp Gly Asn Asn
        275                 280                 285
Pro Met Glu Ile Leu Ile Asn Asp Lys Val Ala Lys Leu Pro Phe Val
    290                 295                 300
Ile Asn Asp Gly Lys Trp His His Ile Cys Val Thr Trp Thr Thr Arg
305                 310                 315                 320
Asp Gly Val Trp Glu Ala Tyr Gln Asp Gly Thr Gln Gly Gly Ser Gly
                325                 330                 335
Glu Asn Leu Ala Pro Tyr His Pro Ile Lys Pro Gln Gly Val Leu Val
            340                 345                 350
Leu Gly Gln Glu Gln Asp Thr Leu Gly Gly Gly Phe Asp Ala Thr Gln
        355                 360                 365
Ala Phe Val Gly Glu Leu Ala His Phe Asn Ile Trp Asp Arg Lys Leu
    370                 375                 380
Thr Pro Gly Glu Val Tyr Asn Leu Ala Thr Cys Ser Thr Lys Ala Leu
385                 390                 395                 400
Ser Gly Asn Val Ile Ala Trp Ala Glu Ser His Ile Glu Ile Tyr Gly
                405                 410                 415
Gly Ala Thr Lys Trp Thr Phe Glu Ala Cys Arg Gln Ile Asn
            420                 425             430
<210>13
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>13
tccccctgtg gcagtacaac aagttcaaga gacttgttgt actgccacag g          51
<210>14
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>14
aaaacctgtg gcagtacaac aagtctcttg aacttgttgt actgccacag g           51
<210>15
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>15
tccctgccag acaagaagtg gtgttcaaga gacaccactt cttgtctggc a           51
<210>16
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>16
aaaatgccag acaagaagtg gtgtctcttg aacaccactt cttgtctggc a           51
<210>17
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>17
tcccgatgct gctgaaaggg agattcaaga gatctccctt tcagcagcat c           51
<210>18
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>18
aaaagatgct gctgaaaggg agatctcttg aatctccctt tcagcagcat c           51
<210>19
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>19
tccccagcag aagctattca gacttcaaga gagtctgaat agcttctgct g           51
<210>20
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>20
aaaacagcag aagctattca gactctcttg aagtctgaat agcttctgct g           51
<210>21
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>21
tcccggtgtc ctccatccaa gaattcaaga gattcttgga tggaggacac c           51
<210>22
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>22
aaaaggtgtc ctccatccaa gaatctcttg aattcttgga tggaggacac c           51
<210>23
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>23
tcccgccgtg ctaacactgt tacttcaaga gagtaacagt gttagcacgg c           51
<210>24
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>24
aaaagccgtg ctaacactgt tactctcttg aagtaacagt gttagcacgg c           51
<210>25
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>25
tcccgaagct ctccaaccgt ctcttcaaga gagagacggt tggagagctt c           51
<210>26
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>26
aaaagaagct ctccaaccgt ctctctcttg aagagacggt tggagagctt c           51
<210>27
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>27
tcccgactca gtacctcgcc ttgttcaaga gacaaggcga ggtactgagt c           51
<210>28
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>28
aaaagactca gtacctcgcc ttgtctcttg aacaaggcga ggtactgagt c           51
<210>29
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>29
tcccggtttc agaagactca gtattcaaga gatactgagt cttctgaaac c           51
<210>30
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>30
aaaaggtttc agaagactca gtatctcttg aatactgagt cttctgaaac c           51
<210>31
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>31
tcccgtgcag ccagctcaat caattcaaga gattgattga gctggctgca c           51
<210>32
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>32
aaaagtgcag ccagctcaat caatctcttg aattgattga gctggctgca c           51
<210>33
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>33
tcccgagaat tcattactac agcttcaaga gagctgtagt aatgaattct c           51
<210>34
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>34
aaaagagaat tcattactac agctctcttg aagctgtagt aatgaattct c           51
<210>35
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>35
tcccggatat tcctgctgtt ccattcaaga gatggaacag caggaatatc c           51
<210>36
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>36
aaaaggatat tcctgctgtt ccatctcttg aatggaacag caggaatatc c           51
<210>37
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>37
tcccgatatt caggagcagc atgttcaaga gacatgctgc tcctgaatat c           51
<210>38
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>38
aaaagatatt caggagcagc atgtctcttg aacatgctgc tcctgaatat c           51
<210>39
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>39
tcccggagac catcctgagc cagttcaaga gactggctca ggatggtctc c           51
<210>40
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>40
aaaaggagac catcctgagc cagtctcttg aactggctca ggatggtctc c           51
<210>41
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>41
tcccgtggac cttcgaggcc tgtttcaaga gaacaggcct cgaaggtcca c           51
<210>42
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>42
aaaagtggac cttcgaggcc tgttctcttg aaacaggcct cgaaggtcca c           51
<210>43
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列(hairpin)设计
<400>43
cctgtggcag tacaacaagt tcaagagact tgttgtactg ccacagg                47
<210>44
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>44
tgccagacaa gaagtggtgt tcaagagaca ccacttcttg tctggca                47
<210>45
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>45
gatgctgctg aaagggagat tcaagagatc tccctttcag cagcatc                47
<210>46
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>46
cagcagaagc tattcagact tcaagagagt ctgaatagct tctgctg                47
<210>47
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>47
ggtgtcctcc atccaagaat tcaagagatt cttggatgga ggacacc                47
<210>48
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>48
gccgtgctaa cactgttact tcaagagagt aacagtgtta gcacggc                47
<210>49
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>49
gaagctctcc aaccgtctct tcaagagaga gacggttgga gagcttc                47
<210>50
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>50
gactcagtac ctcgccttgt tcaagagaca aggcgaggta ctgagtc                47
<210>51
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>51
ggtttcagaa gactcagtat tcaagagata ctgagtcttc tgaaacc                47
<210>52
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>52
gtgcagccag ctcaatcaat tcaagagatt gattgagctg gctgcac                47
<210>53
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>53
gagaattcat tactacagct tcaagagagc tgtagtaatg aattctc                47
<210>54
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>54
ggatattcct gctgttccat tcaagagatg gaacagcagg aatatcc                47
<210>55
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>55
gatattcagg agcagcatgt tcaagagaca tgctgctcct gaatatc                47
<210>56
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>56
ggagaccatc ctgagccagt tcaagagact ggctcaggat ggtctcc                47
<210>57
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>57
gtggaccttc gaggcctgtt tcaagagaac aggcctcgaa ggtccac                47
<210>58
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>58
cctgtggcag tacaacaag                                               19
<210>59
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>59
tgccagacaa gaagtggtg                                               19
<210>60
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>60
gatgctgctg aaagggaga                                               19
<210>61
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>61
cagcagaagc tattcagac                                               19
<210>62
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>62
ggtgtcctcc atccaagaa                                               19
<210>63
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>63
gccgtgctaa cactgttac                                               19
<210>64
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>64
gaagctctcc aaccgtctc                                               19
<210>65
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>65
gactcagtac ctcgccttg                                               19
<210>66
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>66
ggtttcagaa gactcagta                                               19
<210>67
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>67
gtgcagccag ctcaatcaa                                               19
<210>68
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>68
gagaattcat tactacagc                                               19
<210>69
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>69
ggatattcct gctgttcca                                               19
<210>70
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>70
gatattcagg agcagcatg                                               19
<210>71
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>71
ggagaccatc ctgagccag                                               19
<210>72
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>72
gtggaccttc gaggcctgt                                               19
<210>73
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>73
atgcaggacg gtaacttcct gc                                           22
<210>74
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>74
tgggcccagg aagtcctcctt                                             21
<210>75
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>75
gagaaactga agtcccagga aat                                          23
<210>76
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>76
ctgatacttc cattcgcttc aac                                          23
<210>77
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>77
catctggcat  ttctgctctc  tat                                        23
<210>78
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>78
ctcagggaaa ggagaataaa agaac                                        25
<210>79
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>79
gggactactg tgttttgctg ttc                                          23
<210>80
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>80
tgaggtcata gatttcaagg cac                                          23
<210>81
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>81
ctaggaagaa atcatgctgg gtt                                          23
<210>82
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>82
gtatttggct tactgtccca aac                                          23
<210>83
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>83
taaccttgat agaagaacct tgg                                          23
<210>84
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>RT-PCR的人工合成的引物序列
<400>84
gcaaatgaga caaaattggg ac                                           22
<210>85
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>85
tggtagccaa gtgcaggtta ta                                           22
<210>86
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>86
ccaaagggtt tctgcagttt ca                                           22
<210>87
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>87
tgcggatcca gagcagattg tactgagagt                                   30
<210>88
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>88
ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca                                    29
<210>89
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>89
tttaagcttg aagaccattt ttggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaac                47
<210>90
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>90
tttaagcttg aagacatggg aaagagtggt  ctca                             34
<210>91
<211>5089
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的质粒序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(489)..(492)
<223>″n″表示GAP。
<400>91
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctggat    60
ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttcggcttgg tagccaagtg caggttatag    120
ggagctgaag ggaagggggt cacagtaggt ggcatcgttc ctttctgact gcccgccccc    180
cgcatgccgt cccgcgatat tgagctccga acctctcgcc ctgccgccgc cggtgctccg    240
tcgccgccgc gccgccatgg aattcgaacg ctgacgtcat caacccgctc caaggaatcg    300
cgggcccagt gtcactaggc gggaacaccc agcgcgcgtg cgccctggca ggaagatggc    360
tgtgagggac aggggagtgg cgccctgcaa tatttgcatg tcgctatgtg ttctgggaaa    420
tcaccataaa cgtgaaatgt ctttggattt gggaatctta taagttctgt atgagaccac    480
tctttcccnn nntttttggg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aacgaaaccg ggccgggcgc    540
ggtggttcac gcctataatc ccagcacttt gggaggccga ggcgggcgga tcacaaggtc    600
aggaggtcga gaccatccag gctaacacgg tgaaaccccc ccccatctct actaaaaaaa    660
aaaaatacaa aaaattagcc attagccggg cgtggtggcg ggcgcctata atcccagcta    720
cttgggaggc tgaagcagaa tggcgtgaac ccgggaggcg gacgttgcag tgagccgaga    780
tcgcgccgac tgcattccag cctgggcgac agagcgagtc tcaaaaaaaa aaccgagtgg    840
aatgtgaaaa gctccgtgaa actgcagaaa cccaagccga attctgcaga tatccatcac    900
actggcggcc gctcgagtga ggcggaaaga accagctggg gctctagggg gtatccccac    960
gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct    1020
acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg    1080
ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt    1140
gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca    1200
tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga    1260
ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa    1320
gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac    1380
gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag    1440
caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc    1500
caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag    1560
tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc    1620
cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc    1680
tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg    1740
gagcttgtat atccattttc ggatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga    1800
ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct    1860
atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc    1920
aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg    1980
acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg    2040
acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc    2100
tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc    2160
ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg    2220
agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc    2280
atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg    2340
aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc    2400
gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag    2460
cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg    2520
tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg    2580
agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc    2640
atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt    2700
ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca    2760
ccccaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt    2820
cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt    2880
atcttatcat gtctgtatac cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata    2940
gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag    3000
cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg    3060
ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca    3120
acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc    3180
gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg    3240
gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa    3300
ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga    3360
cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag    3420
ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct    3480
taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg    3540
ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc    3600
ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt    3660
aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta    3720
tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac    3780
agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc    3840
ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggttttttt gtttgcaagc agcagattac    3900
gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca    3960
gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac    4020
ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac    4080
ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt    4140
tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt    4200
accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt    4260
atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc    4320
cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa    4380
tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg    4440
tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt    4500
gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc    4560
agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt    4620
aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg    4680
gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac    4740
tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc    4800
gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt    4860
tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg  4920
aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag  4980
catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa  5040
acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc              5089
<210>92
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>92
caccgaagcagcacgacttcttcttcaagagagaagaagtcgtgctgcttc                51
<210>93
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>93
aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c           51
<210>94
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>94
tccccgtacg cggaatactt cgattcaaga gatcgaagta ttccgcgtac g           51
<210>95
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>95
aaaacgtacg cggaatactt cgatctcttg aatcgaagta ttccgcgtac g           51
<210>96
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>96
tcccgcgcgc tttgtaggat tcgttcaaga gacgaatcct acaaagcgcg c           51
<210>97
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成序列
<400>97
aaaagcgcgc tttgtaggat tcgtctcttg aacgaatcct acaaagcgcg c           51
<210>98
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>98
gaagcagcac gacttcttct tcaagagaga agaagtcgtg ctgcttc                47
<210>99
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>99
cgtacgcgga atacttcgat tcaagagatc gaagtattcc gcgtacg                47
<210>100
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA发夹序列设计
<400>100
gcgcgctttg taggattcgt tcaagagacg aatcctacaa agcgcgc                47
<210>101
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>101
gaagcagcac gacttcttc                                               19
<210>102
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
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<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>102
cgtacgcgga atacttcga                                               19
<210>103
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>103
gcgcgctttg taggattcg                                               19

Claims (23)

1.一种治疗或预防受试者中肺癌的方法，包括向所述受试者施用包含抑制PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1表达的小干扰RNA(siRNA)的组合物。
2.权利要求1的方法，其中所述siRNA包含与来自PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的序列特异性杂交的有义核酸序列和反义核酸序列。
3.权利要求1的方法，其中肺癌为非小细胞型肺癌(NSCLC)。
4.权利要求2的方法，其中所述siRNA包含相应于选自SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的序列的核糖核苷酸序列作为靶序列。
5.权利要求4的方法，其中所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是相应于选自SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的序列的核糖核苷酸序列。
[B]是由大约3到大约23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，而
[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。
6.权利要求1的方法，其中所述组合物包含转染增强剂。
7.一种包含有义链和反义链的双链分子，其中所述有义链包含对应于选自SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的靶序列的核糖核苷酸序列，并且其中所述反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链彼此杂交以形成所述双链分子，并且其中所述双链分子当导入到表达PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1基因的细胞中时，抑制所述基因的表达。
8.权利要求7的双链分子，其中所述靶序列包含来自选自SEQ ID NOs：1，3，5，7，9或11的核苷酸序列的至少约10个毗连的核苷酸。
9.权利要求8的双链分子，其中所述靶序列包含来自选自SEQ ID NOs：1，3，5，7，9或11的核苷酸序列的大约19到大约25个毗连的核苷酸。
10.权利要求9的双链分子，其中所述双链分子是单一的核糖核苷酸序列转录本，其包含通过单链核糖核苷酸序列连接的有义链和反义链。
11.权利要求8的双链分子，其中所述双链分子是小于大约100个核苷酸长的寡核苷酸。
12.权利要求11的双链分子，其中所述双链分子是小于大约75个核苷酸长的寡核苷酸。
13.权利要求12的双链分子，其中所述双链分子是小于大约50个核苷酸长的寡核苷酸。
14.权利要求13的双链分子，其中所述双链分子是小于大约25个核苷酸长的寡核苷酸。
15.权利要求14的双链多核苷酸，其中所述双链分子是介于大约19和大约25个核苷酸长的寡核苷酸。
16.编码权利要求7的双链分子的载体。
17.权利要求16的载体，其中所述载体编码具有二级结构的转录本并且包含有义链和反义链。
18.权利要求17的载体，其中转录本进一步包含连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。
19.包含含有有义链核酸和反义链核酸的组合的多核苷酸的载体，其中所述有义链核酸包含SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的核苷酸序列，并且所述反义链核酸由与有义链互补的序列组成。
20.权利要求19的载体，其中所述多核苷酸具有通式
5’-[A]-[B]-[A’]-3’
其中[A]是SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的核苷酸序列；[B]是由大约3到大约23个核苷酸组成的核苷酸序列；而[A’]是与[A]互补的核苷酸序列。
21.一种治疗或预防肺癌的药物组合物，其包含药学有效量的作为有效成分抑制PKP3，CDCA1，CDCA8，DLX5，URLC11或NPTX1的表达的小干扰RNA(siRNA)，和可药用的载体。
22.权利要求21的药物组合物，其中所述siRNA包含选自SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的核苷酸序列作为靶序列。
23.权利要求22的组合物，其中所述siRNA具有通式
5’-[A]-[B]-[A’]-3’
其中[A]是对应于SEQ ID NOs：58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71或72的核苷酸序列的核糖核苷酸序列；[B]是由大约3到大约23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列；而[A’]是与[A]互补的核糖核苷酸序列。
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